CN114990087A - 一种固定化fad合成酶及用于催化制备黄素腺嘌呤二核苷酸的方法 - Google Patents

一种固定化fad合成酶及用于催化制备黄素腺嘌呤二核苷酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种固定化FAD合成酶及用于催化制备黄素腺嘌呤二核苷酸的方法，公开了一种FAD合成酶突变体E263A，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。本发明中得到了热稳定性提高的突变体，提高了其稳定性，可进行体外催化合成FAD，制备的产物FAD浓度高、杂质少，容易纯化。

Description

一种固定化FAD合成酶及用于催化制备黄素腺嘌呤二核苷酸 的方法
技术领域
本发明属于酶工程技术领域，具体涉及一种固定化FAD合成酶及用于催化制备黄素腺嘌呤二核苷酸的方法。
背景技术
核黄素，即维生素B2，在生物体内主要以黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)和黄素单核苷酸(FMN)的形式存在，并作为黄素酶类的辅酶参与细胞中传递氢的相关代谢，是生命活动过程中必不可少的一种维生素。黄素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide，简称“FAD”)，作为许多黄素蛋白的辅酶，参与体内众多生物氧化还原反应。FAD目前可广泛用于医药和食品行业，有研究证明：FAD补充剂已用于治疗某些遗传性疾病；具有重要的心血管作用，可以调节体内血液动力学反应；可以导致血管扩张，心率降低；可以抑制病理性心肌肥厚和心肌纤维化等。
目前FAD价格高昂，国内生厂商有限，且均通过化学合成法制备FAD，化学合成法以黄素单核苷酸钠(FMN)和5’-腺苷磷酸(5’-AMP)为原料，对二甲苯碳化二亚胺(DPTC)为催化剂，或三苯基磷和二-(2-吡啶基)二硫化物组成的复合试剂或N，N’-亚硫酰-双-2-甲基咪唑为缩合剂合成黄素腺嘌呤二核苷酸二钠盐，前提是对二甲苯碳化二亚胺(DPTC)、三苯基磷和二-(2-吡啶基)二硫化物组成的复合试剂或N，N’-亚硫酰-双-2-甲基咪唑都需要经过无水无氧处理，反应条件比较苛刻，收率为25.6％，产量比较低，副产物多，最后不利于产品的分离纯化，对环境有一定程度的污染。
除化学合成法外还有生物合成法，生物合成法主要包括微生物发酵法和生物酶法合成。微生物发酵是指利用微生物，在适宜条件下，将原料经过自身体内特定的代谢途径转化为人类所需要的产物的过程。随着日本在发酵法的研究日益突出，因此FAD在日本主要是由生物发酵法来合成，但是发酵法一般耗时长，并且所需的原料需要不断补加。
生物酶法合成是利用生物酶为催化剂，在特定反应条件下，催化反应的进行，得到所需产物。FAD合成酶(Bifunctional riboflavin kinase/FMN adenylyltransferase，EC:2.7.1.26/EC:2.7.7.2，简称“FAD合成酶”)在真核生物和原核生物中均有存在，真核生物中的FAD是由两个酶催化合成，原核生物中的FAD由其体内的FAD合成酶催化生成。在原核生物中，FAD合成酶是由一条链编码形成的多肽链，同时具有核黄素激酶和腺苷酰转移酶(FMNadenylyltransferase，FMNAT)活性，能以RF或FMN和ATP为底物合成FAD，因此可以利用生物酶法合成FAD。FAD合成酶的编码基因源自埃希氏菌属、酵母菌属、棒杆菌属、芽孢杆菌属、分歧杆菌属和古菌属中的一种，优选产氨短杆菌属的FAD合成酶(Corynebacteriumammoniagenes，CaFADS)，因为其蛋白C端的核黄素激酶活性与真核生物的单功能RFKs具有一定的相似性，其N端的腺苷酸转移酶活性具有核苷基转移酶家族的典型性。另外直接使用游离酶作为催化剂，具有成本高、酶活力高等特点，但容易受到高温、酸碱等因素影响而导致活性下降，同时游离酶在反应体系中难以回收重复利用，因此在大规模工业化生产中的应用受到限制。
发明内容
本发明的目的是提供一种固定化FAD合成酶及用于催化制备黄素腺嘌呤二核苷酸的方法，得到了热稳定性提高的突变体，提高了其稳定性，可进行体外催化合成FAD，制备的产物FAD浓度高、杂质少，容易纯化。
本发明采用以下技术方案：一种FAD合成酶突变体E263A，其氨基酸序列为SEQ IDNO.2所示。
一种FAD合成酶突变体E263A的编码基因，为上述的一种FAD合成酶突变体E263A的编码基因经大肠杆菌密码子优化表达，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。
一种重组表达载体，其特征在于，由上述的一种FAD合成酶突变体E263A的编码基因构建而成。
一种重组基因工程菌，由上述的一种重组表达载体制备而成。
如上述的一种重组基因工程菌的制备方法，该制备方法如下：
获得突变重组质粒pET-28a-CaFADS(+)(E263A)；
将突变重组质粒体转入大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)，接种，获得单克隆；
培养单克隆，得重组基因工程菌。
一种固定化FAD合成酶，其特征在于，由上述的一种FAD合成酶突变体E263A负载于树脂载体上制备而得。
如上述的一种固定化FAD合成酶在生产黄素腺嘌呤二核苷酸中的应用。
一种制备黄素腺嘌呤二核苷酸的方法，该方法如下：固定化FAD合成酶酶与pH5-10缓冲液混合，加入底物核黄素、ATP和二价金属阳离子构成反应体系，在30～55℃反应完全，将反应液分离纯化，获得黄素腺嘌呤二核苷酸。
上述的一种制备黄素腺嘌呤二核苷酸的方法，二价金属阳离子为Mg2+。
本发明的有益效果是：1.利用半理性设计，得到了热稳定性提高的突变体。设未处理的FAD合成酶及其突变体酶活为100％，45℃孵育0.5h处理后的野生型CaFADS残余酶活为5.72％，而突变体酶E263A为17.61％，热稳定性提高了3倍2.，利用大肠杆菌表达FAD合成酶突变体E263A，使用树脂载体对其进行固定化处理，提高了其稳定性，可进行体外催化合成FAD，制备的产物FAD浓度高、杂质少，容易纯化。另外固定化的突变体酶易回收，对反应条件要求不苛刻，在重复反应4个批次后仍旧有一定的酶活，说明其重复利用率高。
附图说明
图1为SDS-PAGE检测野生型CaFADS的纯化电泳图；
图2为SDS-PAGE检测不同突变体酶上清液的电泳图；
图3为不同突变体酶的热稳定性测定；
图4三种固定树脂的筛选图
图5为HPLC分析的FAD浓度-峰面积标准曲线；
图6为固定化FAD合成酶突变体(E263A)合成FAD的HPLC分析结果图；
图7为固定化FAD合成酶的热稳定性图；
图8为固定化FAD合成酶的最适pH稳定性图；
图9为固定化FAD合成酶的pH稳定性图；
图10为固定化FAD合成酶的操作稳定性图；
图11为固定化FAD合成酶工业化生产FAD图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。
本发明一种FAD合成酶突变体E263A，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示，如下：
SEQ ID NO.2
MDIWYGTAAV PKDLDNSAVT IGVFDGVHRG HQKLINATVE KAREVGAKAI 50
MVTFDPHPVS VFLPRRAPLG ITTLAERFAL AESFGIDGVL VIDFTRELSG 100
TSPEKYVEFL LEDTLHASHV VVGANFTFGE NAAGTADSLR QICQSRLTVD 150
VIDLLDDEGV RISSTTVREF LSEGDVARAN WALGRHFYVT GPVVRGAGRG 200
GKELGFPTAN QYFHDTVALP ADGVYAGWLT ILPTEAPVSG NMEPEVAYAA 250
AISVGTNPTF GDAQRSVESF VLDRDADLYG HDVKVEFVDH VRAMEKFDSV 300
EQLLEVMAKD VQKTRTLLAQ DVQAHKMAPE TYFLQAES 330；
一种FAD合成酶突变体E263A的编码基因，其特征在于，为上述的一种FAD合成酶突变体E263A的编码基因经大肠杆菌密码子优化表达，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，如下：
SEQ ID NO.1：
atggatatct ggtatggtac cgcagcagtt ccgaaagatc tggataacag cgccgttacc 60
attggtgttt ttgatggtgt gcatcgtggt catcagaaac tgattaatgc aactgtggaa 120
aaagcccgtg aagttggcgc aaaagcaatt atggttactt ttgatccaca tccggttagt 180
gtttttctgc cgcgtcgtgc acctctgggt attaccaccc tggcagaacg ctttgcactg 240
gcagaaagtt ttggtattga tggtgtgctg gttattgatt ttacccgtga actgaaaggt 300
acctctcctg aaaaatatgt tgaatttctg ctggaagata cactgcatgc ctcacatgtt 360
gttgttggtg ccaactttac ttttggtgaa aatgcagccg gcaccgcaga tagcctgcgt 420
cagatttgtc agagccgtct gacggttgat gtgattgatc tgctggatga tgaaggtgtt 480
cgtattagta gcacgaccgt gcgtgaattt ctgagtgaag gtgatgttgc acgtgccaat 540
tgggcgctgg gtcgtcattt ttatgttacc ggtccggttg ttcgtggtgc aggtcgtggt 600
ggtaaagaac tgggttttcc taccgccaat cagtattttc atgatacagt tgcactgccg 660
gcagatggtg tttatgccgg ttggctgacg attctgccga ccgaagcacc ggttagtggt 720
aatatggaac cggaagttgc atacgctgca gccattagcg tgggtaccaa tccgactttt 780
ggtgatgagc agcgtagcgt tgaaagtttt gtcctggatc gtgatgcaga tctgtatggt 840
catgatgtta aagttgaatt tgtggatcat gttcgtgcaa tggaaaaatt tgatagcgtt 900
gaacagctgc tggaagttat ggcaaaagat gttcagaaaa cccgtaccct gctggcacag 960
gatgttcagg cacataaaat ggcaccggaa acctattttc tgcaggcgga atca 1014。
FAD合成酶的编码基因源自埃希氏菌属、酵母菌属、棒杆菌属、芽孢杆菌属、分歧杆菌属和古菌属中的一种，优选产氨短杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)。
一种重组表达载体，由上述的一种FAD合成酶突变体E263A的编码基因构建而成。
一种重组基因工程菌，其特征在于，由权利要求3所述的一种重组表达载体制备而成。
上述的一种重组基因工程菌的制备方法，该制备方法如下：
制备FAD合成酶突变体E263A，获得突变重组质粒pET-28a-CaFADS(+)(E263A)；将突变重组质粒转入大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)，接种，获得转化产物；培养转化产物，得重组基因工程菌。
用于培养大肠杆菌的培养基为常规培养基，可市购，也可自制。优选LB液体培养基，终浓度组成为：10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母粉、10g/L NaCl，溶剂为去离子水，pH值自然。LB固体培养基在LB液体培养基中再加入15g/L琼脂。在121℃下灭菌20min。
具体为：(1)将野生型FAD合成酶序列与多个物种的FAD合成酶序列进行多序列比对，分析其B因子和溶剂可及表面积，利用半理性设计构建突变体文库，筛选出热稳定性较好的FAD合成酶的突变体，构建重组表达质粒构建重组表达质粒pET-28a(+)-CaFADS-E263A；(2)将重组质粒转入大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)，接种至LB液体培养基，20～37℃、50～250r/min振荡培养0.5～2h，获得转化产物；(3)将转化产物涂布于含50～100μg/mL卡那霉素的平板，20～37℃培养，筛选获得含重组FAD合成酶编码基因的工程菌。
一种FAD合成固定化酶，由上述的一种FAD合成酶负载于载体上制备而得。
所述FAD合成酶粗酶的固定化按如下方法制备：(1)选取氨基树脂Seplite LX-1000 HA/EA、环氧树脂Seplite LX-1000 EP，用适用于蛋白酶的缓冲液对树脂进行清洗；用合适浓度戊二醛对氨基树脂进行交联活化，戊二醛质量浓度：1％～10％，优选6％，20℃，150rpm，4h振荡固定；用去离子水清洗活化后的树脂数遍，真空干燥，4℃保存备用。(2)称取适量上述活化的树脂，将上述发酵液破碎后的上清，即为重组FAD合成酶粗酶进行固定化，重组FAD合成酶粗酶与树脂载体的比例为5～40mg/g树脂，20℃，150rpm，4h振荡固定，用适用于蛋白酶的缓冲液对固定化酶进行清洗，真空干燥，4℃保存备用。通过测定对比固定化前后酶量，即固定化之后洗脱下来的酶液蛋白含量和固定化之前蛋白含量；前两者之差即为固定上去的蛋白酶量，详细计算公式为：
固定化蛋白含量(mg)＝固定化之前含量(mg)－洗脱蛋白浓度(mg/ml)*洗脱酶液(ml)。
上述的一种FAD合成固定化酶在合成酶在生产黄素腺嘌呤二核苷酸中的应用。
一种制备黄素腺嘌呤二核苷酸的方法，该方法如下：固定化FAD合成酶粗酶与pH5-10缓冲液混合，加入底物核黄素(RF)、ATP和二价金属阳离子构成反应体系，在30～55℃反应完全，将反应液分离纯化，获得黄素腺嘌呤二核苷酸。二价金属阳离子为Mg2+。取反应液进行高效液相色谱检测获得色谱图，根据黄素腺嘌呤二核苷酸标准曲线获得反应液中黄素腺嘌呤二核苷酸含量，将反应液分离纯化，获得黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)；所述反应体系中，核黄素加入终浓度50～300umol/L(优选50uM)，所述ATP加入终浓度2.5～50mmol/L(优选2.5mM)；所述固定化FAD合成酶粗酶的含量为60～300ug。
实施例1
利用基因合成获取产氨短杆菌RibF(GenBank:2500204)，构建重组表达载体pET-28a(+)-CaFADS，基因在载体中的插入位点为：5’NdeI，3’HindⅢ。将重组表达载体转化至大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)，得到表达CaFADS的重组大肠杆菌菌液。取200μL菌液涂布于含有卡那霉素(50μg/mL)抗性的LB平板上，37℃过夜培养，所得菌种即为重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a(+)-CaFADS。将含有pET-28a(+)-CaFADS质粒的重组大肠杆菌划线于含有50μg/mL卡那霉素的固体LB平板上进行活化，挑取单克隆接入LB液体培养基，在37℃、200r/min培养12-16h后，以1％(体积浓度)接种量转入1.6L LB液体培养基中，30℃、200r/min震荡培养至OD600达到0.6，加入诱导剂异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度0.1mM，25℃、200r/min震荡培养24h后，离心取菌体，加入细胞破碎液打匀，经超声破碎后，离心收集上清。
超声破碎条件为：选择35％振幅(额定功率120W)，工作5秒暂停8秒，置于冰浴的每10mL样品破碎10min。
离心收集上清条件为：4℃，4000rpm，30min。
将上清液用0.45μm滤膜过滤后上HisTrap Fast Flow亲和层析柱，使用结合缓冲液(PBS，含30mM咪唑)洗脱杂蛋白，然后使用含300mM咪唑的洗脱缓冲液洗脱目标蛋白(CaFADS)。用装有Sephadex G-25凝胶填料的脱盐柱对含有CaFADS的洗脱液进行脱盐。SDS-PAGE检测CaFADS的纯度达到95％，结果如图1所示，1表示蛋白分子量标准；2表示CaFADS--诱导前；3表示CaFADS--诱导后；4表示CaFADS--上清；5表示CaFADS--沉淀；6表示CaFADS—上清过柱流出液；7表示CaFADS--脱盐后。结果显示其蛋白大小与文献中(Frago S,Martínez-Júlvez M,Serrano A,et al.Structural analysis of FAD synthetase fromCorynebacterium ammoniagenes[J].BMC microbiology,2008,8(1):1-16.)报道的一致，且纯度较高。
实施例2
突变体工程菌的获得：
(1)将野生型FAD合成酶序列与多个物种的FAD合成酶序列进行多序列比对，分析其B因子和溶剂可及表面积，利用半理性设计构建突变体文库，筛选出热稳定性较好的FAD合成酶的突变体。
(2)将野生型FAD合成酶基因进行定点突变，突变体系为:20ul，高保真酶PrimeSTAR Max 10ul，上游引物、下游引物各1ul，模板模板为pET-28a(+)-CaFADS 1ul，ddH2O 7ul；PCR程序：预变性98℃2min；变性98℃10s，退火55℃30s，延伸72℃90s，25个循环；终止延伸72℃5min。得到不同突变重组质粒pET-28a(+)-CaFADS(S99K、G100D、V194H、N257R、F260V、E263A)的PCR产物。
(3)上述产物经DpnI酶切，37℃，1h，转化至大肠杆菌感受态DH5α，测序正确后获得不同突变重组载体pET-28a(+)-CaFADS(S99K、G100D、V194H、N257R、F260V、E263A)。
(4)取100μL大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，置于冰上，完全解冻后轻轻将细胞均匀悬浮。
(5)取1μL不同突变质粒pET-28a(+)-CaFADS(S99K、G100D、V194H、N257R、F260V、E263A)，加入到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中轻轻混匀，冰上静置30min。
(6)42℃热激90s，立即放置冰中静置2min。
(7)加入900μL LB液体培养基，37℃、200r/min震荡培养45min。
(8)取200μL培养液涂布于含有卡那霉素(50μg/mL)抗性的LB平板上，37℃过夜培养，所得菌种即为不同突变重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a(+)(S99K、G100D、V194H、N257R、F260V、E263A)。
(9)将不同突变重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a(+)(S99K、G100D、V194H、N257R、F260V、E263A)划线于含有50μg/mL卡那霉素的固体LB平板上进行活化，挑取单克隆接入LB液体培养基，在37℃、200r/min培养12-16h后，以1％(体积浓度)接种量转入1.6L LB液体培养基中，30℃、200r/min震荡培养至OD600达到0.6，加入诱导剂异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度0.1mM，25℃、200r/min震荡培养24h后，离心取菌体，加入细胞破碎液打匀，经超声破碎后，离心收集上清，SDS-PAGE检测不同突变体表达情况。结果如图2所示，1表示蛋白分子量标准；2表示野生型CaFADS上清；3表示CaFADS—S99K上清；4表示CaFADS—G100D上清；5表示CaFADS—V194H上清；6CaFADS—N257R上清；7CaFADS—F260V上清；8表示CaFADS—E263A。由此可见各种突变体均可以进行可溶性表达，并且蛋白大小与野生型蛋白大小一致。
超声破碎条件为：选择35％振幅(额定功率120W)，工作5秒暂停8秒，置于冰浴的每10mL样品破碎10min。
离心收集上清条件为：4℃，4000rpm，30min。
实施例3
FAD合成酶粗酶的获得：
不同突变酶的热稳定测定：
将实施例2所得的不同突变体酶(S99K、G100D、V194H、N257R、F260V、E263A)粗酶经45℃水浴孵育30min，冰上孵育10min，测定其残余酶活。测定酶活体系为：1ml，RF 50uM，ATP2.5mM,10mM MgCl2，粗酶各350ug。37℃避光反应30min。利用HPLC检测，检测条件为：中国华谱S6000，色谱柱为Kromasil100-5-C18反相柱(4.6×250mm)，流速：1mL/min；检测波长为445nm，柱温为35℃，流动相A为30％甲醇、10Mm NaH2PO4，流动相B为30％甲醇，流动相A：流动相B＝4：6。以未处理的酶活为100％，测定不同突变体酶的残余酶活如图3所示。结果显示，突变体S99K、E263A的热稳定性较为良好，其中E263A的残余酶活为野生型的3倍，因此突变体E263A为后续实验基础。
实施例4
固定化FAD合成酶及三种固定化树脂的筛选：
(1)树脂活化：选取氨基树脂、环氧树脂，用适用于蛋白酶的缓冲液对树脂进行清洗；用合适浓度戊二醛对氨基树脂进行交联活化，戊二醛浓度：1％-10％，优选6％，20℃，150rpm，4h振荡固定；用去离子水清洗活化后的树脂数遍，真空干燥，4℃保存备用。
(2)称取适量上述活化的树脂，将将实施例2所得的突变体E263A上清液，，即为重组FAD合成酶突变体E263A粗酶进行固定化，重组FAD合成酶粗酶与树脂载体的比例为5～40mg/g树脂，20℃，150rpm，4h振荡固定，用适用于蛋白酶的缓冲液对固定化酶进行清洗，真空干燥，4℃保存备用。通过测定对比固定化前后酶量，即固定化之后洗脱下来的酶液蛋白含量和固定化之前蛋白含量；前两者之差即为固定上去的蛋白酶量，详细计算公式为：
固定化蛋白含量(mg)＝固定化之前含量(mg)－洗脱蛋白浓度(mg/mL)＊洗脱酶液(mL)。
(3)三种树脂分别为Seplite LX-1000 EA(短链氨基树脂)、Seplite LX-1000 HA(长链氨基树脂)、Seplite LX-1000 EP(环氧树脂)，固定时间为4h和12h，对三种树脂的蛋白载量以及固定时间进行探究，结果如图4所示，Seplite LX-1000EA(短链氨基树脂)在固定4h后的树脂载量为74mg/g，固定12h后的树脂载量为48mg/g；Seplite LX-1000 HA(长链氨基树脂)在固定4h后的树脂载量为74mg/g，固定12h后的树脂载量为42mg/g；Seplite LX-1000 EP(环氧树脂)在固定4h后的树脂载量为25.4mg/g，固定12h后的树脂载量为18.5mg/g。因此选用Seplite LX-1000 EA(短链氨基树脂)固定4h为最佳固定条件。另外，游离FAD合成酶突变体E263A的酶活力单位为4925U/mg，固定化后的FAD合成酶突变体E263A的酶活力单位为野生型的90％，4432.5U/mg，由此可见，固定化FAD合成酶突变体E263A仍保持一定酶活力。
实施例5
固定化FAD合成酶突变体E263A的活性测定：
(1)绘制FAD标准曲线：
用水溶解FAD标准品，配成25、100、200、300、400、500mg/L梯度浓度的FAD标准样品溶液，进行高效液相色谱检测，以峰面积为纵坐标，以黄素腺嘌呤二核苷酸标准样品溶液浓度为横坐标，制作标准曲线。如图5所示。高效液相色谱法测定条件：中国华谱S6000，色谱柱为Kromasil 100-5-C18反相柱(4.6×250mm)，流速：1mL/min；检测波长为445nm，柱温为35℃，流动相A为30％甲醇、10mM NaH2PO4，流动相B为30％甲醇，流动相A：流动相B＝4：6。
(2)酶促反应如下：用50mM pH8.0的Tris-HCl缓冲液溶解底物核黄素(RF)和ATP，使底物RF终浓度为0.05mM，ATP终浓度为2.5mM，再加入二价金属离子Mg2+终浓度为10mM以及固定化FAD合成酶突变体E263A 60ug，置于37℃避光振荡反应30min。然后沸水浴处理5min使酶失活，终止反应，取反应液用高效液相色谱法测定产物FAD谱图，以FAD标准品为对照，根据FAD标准曲线获得反应液中FAD含量。
高效液相色谱法测定条件：中国华谱S6000，色谱柱为Kromasil 100-5-C18反相柱(4.6×250mm)，流速：1mL/min；检测波长为445nm，柱温为35℃，流动相A为30％甲醇、10MmNaH2PO4，流动相B为30％甲醇，流动相A：流动相B＝4：6。
结果显示：如图6所示，FAD保留时间为2.76min，FMN保留时间为4.0767min，RF保留时间为6.41min，则FAD的出峰时间为2.76min。酶促反应液中产物FAD的出峰时间为2.76min，如图5所示，与标准样品出峰时间基本一致。另外，酶促反应液主要是FAD产物峰(主峰)，而其它杂峰比较少，说明酶促反应产物浓度高、杂质少，这有利于后续纯化。
实施例6
固定化FAD合成酶突变体E263A的酶学特性研究：
对实施例4中获得的固定化FAD合成酶粗酶进行酶学特性研究，包括热稳定性、最适pH、pH稳定性等对FAD合成的影响。
(1)固定化FAD合成酶突变体E263A的热稳定性：将固固定化FAD合成酶突变体E263A粗酶分别置于不同温度(30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃)水浴中孵育60min。用50mM pH8.0的Tris-HCl缓冲液溶解底物核黄素(RF)和ATP，使底物RF终浓度为0.05mM，ATP终浓度为2.5mM，再加入二价金属离子Mg2+终浓度为10mM以及上述处理后的固定化酶60ug置于37℃避光振荡反应30min。然后沸水浴处理5min使反应终止，反应后的样品用实施例5中所述液相检测方法检测FAD产量。结果如图7所示，其中，SQ为未固定上清液，EA为短链氨基树脂固定化酶HA为长链氨基树脂固定化酶，由图可知，在55℃时固定化FAD合成酶已失活。
(2)反应pH的影响：(2.1)最适pH:配置不同pH(pH 5.0、6.0、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0和10.0)的缓冲液，用于配置含终浓度为0.05mM的RF、终浓度为2.5mM的ATP和终浓度为10mM的Mg2+的反应液，加入固定化FAD合成酶粗酶60ug，置于37℃避光振荡反应30min。沸水浴处理5min使反应终止。反应后的样品用实施例6中所述液相检测方法检测FAD产量。结果如图8所示，SQ为未固定上清液；EA为短链氨基树脂固定化酶；HA为长链氨基树脂固定化酶，由图可知，固定化FAD合成酶粗酶反应最适pH为8.0，中性至碱性条件下酶活较高。(2.2)固定化FAD合成酶粗酶的pH稳定性：配置不同pH(pH 5.0、6.0、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0和10.0)的缓冲液，将固定化FAD合成酶粗酶置于不同缓冲液中冰上孵育120min，用pH8.0 50mM Tris-HCl缓冲液配置含终浓度为0.05mM的RF、终浓度为2.5mM的ATP和终浓度为10mM的Mg2+的反应液，加处理之后的酶60ug，置于37℃避光振荡反应30min。沸水浴处理5min使反应终止。反应后的样品用实施例5中所述液相检测方法检测FAD产量。结果如图9显示，固定化FAD合成酶的pH稳定性较好。
(3)测定固定化酶的操作稳定性：用50mM pH8.0的Tris-HCl缓冲液溶解底物核黄素(RF)和ATP，使底物RF终浓度为8mM，ATP终浓度为50mM，再加入二价金属离子Mg2+终浓度为10mM以及固定化酶(510ug)置于37℃避光振荡反应，每隔12h，离心取样1次，保留固定化酶在试管底部，加入新的反应液，继续反应12h，以此循环6次，反应后的样品用实施例6中所述液相检测方法检测FAD产量。结果如图10显示，固定化酶在重复反应5次之后，酶活几乎为零，由此说明其可以重复利用。
实施例7
工业化生产FAD：
利用实施例4中获得的固定化FAD合成酶粗酶进行工业生产FAD，反应体系为：20ml，6mM RF、50mM ATP、10mM MgCl2、11mg固定化酶，37℃，摇床反应12h，反应后的样品用实施例6中所述液相检测方法检测FAD产量。结果如图10显示，FAD最终产量为4.5g/L，底物转换率可高达99％。利用生物酶法合成FAD，相比化学合成法的收率25.6％，提高了73.4％，比腺苷脱氨酶缺陷的Sarcina lutea突变体发酵5天后FAD的产量为0.7g/L提高了6倍，比产氨棒杆菌基因工程菌发酵45h生产FAD 1.2g/L提高了3.75倍，比重组无名假丝酵母T-FD-FM27菌株发酵40h生产FAD 451mg/L提高了10倍，因此，利用生物酶法合成FAD其产量较高，且纯度较好。
<110> 西北工业大学
<120> 一种固定化FAD合成酶及用于催化制备黄素腺嘌呤二核苷酸的方法
<130> 无
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> SEQ ID NO1
<211> 960
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> SEQ ID NO1
atggatatct ggtatggtac cgcagcagtt ccgaaagatc tggataacag cgccgttacc 60
attggtgttt ttgatggtgt gcatcgtggt catcagaaac tgattaatgc aactgtggaa 120
aaagcccgtg aagttggcgc aaaagcaatt atggttactt ttgatccaca tccggttagt 180
gtttttctgc cgcgtcgtgc acctctgggt attaccaccc tggcagaacg ctttgcactg 240
gcagaaagtt ttggtattga tggtgtgctg gttattgatt ttacccgtga actgaaaggt 300
acctctcctg aaaaatatgt tgaatttctg ctggaagata cactgcatgc ctcacatgtt 360
gttgttggtg ccaactttac ttttggtgaa aatgcagccg gcaccgcaga tagcctgcgt 420
cagatttgtc agagccgtct gacggttgat gtgattgatc tgctggatga tgaaggtgtt 480
cgtattagta gcacgaccgt gcgtgaattt ctgagtgaag gtgatgttgc acgtgccaat 540
tgggcgctgg gtcgtcattt ttatgttacc ggtccggttg ttcgtggtgc aggtcgtggt 600
ggtaaagaac tgggttttcc taccgccaat cagtattttc atgatacagt tgcactgccg 660
gcagatggtg tttatgccgg ttggctgacg attctgccga ccgaagcacc ggttagtggt 720
aatatggaac cggaagttgc atacgctgca gccattagcg tgggtaccaa tccgactttt 780
ggtgatgagc agcgtagcgt tgaaagtttt gtcctggatc gtgatgcaga tctgtatggt 840
catgatgtta aagttgaatt tgtggatcat gttcgtgcaa tggaaaaatt tgatagcgtt 900
gaacagctgc tggaagttat ggcaaaagat gttcagaaaa cccgtaccct gctggcacag 960
<210> SEQ ID NO2
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> SEQ ID NO2
MDIWYGTAAV PKDLDNSAVT IGVFDGVHRG HQKLINATVE KAREVGAKAI 50
MVTFDPHPVS VFLPRRAPLG ITTLAERFAL AESFGIDGVL VIDFTRELSG 100
TSPEKYVEFL LEDTLHASHV VVGANFTFGE NAAGTADSLR QICQSRLTVD 150
VIDLLDDEGV RISSTTVREF LSEGDVARAN WALGRHFYVT GPVVRGAGRG 200
GKELGFPTAN QYFHDTVALP ADGVYAGWLT ILPTEAPVSG NMEPEVAYAA 250
AISVGTNPTF GDAQRSVESF VLDRDADLYG HDVKVEFVDH VRAMEKFDSV 300
EQLLEVMAKD VQKTRTLLAQ DVQAHKMAPE TYFLQAES 330

Claims (9)

1.一种FAD合成酶突变体E263A，其特征在于，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。
2.一种FAD合成酶突变体E263A的编码基因，其特征在于，为权利要求1所述的一种FAD合成酶突变体E263A的编码基因经大肠杆菌密码子优化表达，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。
3.一种重组表达载体，其特征在于，由权利要求2所述的一种FAD合成酶突变体E263A的编码基因构建而成。
4.一种重组基因工程菌，其特征在于，由权利要求3所述的一种重组表达载体制备而成。
5.如权利要求4所述的一种重组基因工程菌的制备方法，其特征在于，该制备方法如下：
获得突变重组质粒pET-28a-CaFADS(+)(E263A)；
将突变重组质粒转入大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)，接种，获得单克隆；
培养单克隆，得重组基因工程菌。
6.一种固定化FAD合成酶，其特征在于，由权利要求1中所述的一种FAD合成酶突变体E263A负载于树脂载体上制备而得。
7.如权利要求6所述的一种固定化FAD合成酶在生产黄素腺嘌呤二核苷酸中的应用。
8.一种制备黄素腺嘌呤二核苷酸的方法，其特征在于，该方法如下：固定化FAD合成酶与pH5-10缓冲液混合，加入底物核黄素、ATP和二价金属阳离子构成反应体系，在30～55℃反应完全，将反应液分离纯化，获得黄素腺嘌呤二核苷酸。
9.根据权利要求8所述的一种制备黄素腺嘌呤二核苷酸的方法，其特征在于，所述二价金属阳离子为Mg2+。
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