JP2022521648A - 抗体の精製を促進するための機能化ｕｂｘタンパク質物質 - Google Patents

Abstract

本明細書では、抗体を精製するための方法及び組成物が提供される。精製は、プロテインＡドメイン（Ｅ、Ｄ、Ａ、Ｂ、Ｃ）、もしくはドメインＺ、またはその機能性バリアントをＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ転写因子Ｕｌｔｒａｂｉｔｈｏｒａｘ（Ｕｂｘ）物質に共有結合で付加することでプロテインＡクロマトグラフィーの結合容量を増加させることによって達成される。組成物は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ転写因子Ｕｌｔｒａｂｉｔｈｏｒａｘ（Ｕｂｘ）またはその断片と、免疫グロブリン結合タンパク質と、を含む融合タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、免疫グロブリン結合タンパク質は、プロテインＡドメイン、プロテインＺドメイン、またはその断片である。

Description

先行関連出願
本出願は、２０１９年４月２日出願の米国仮出願第６２／８２８，１４２号の利益を主張し、当該文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。

抗体ベースの治療薬は、有害作用をほとんど伴うことなく特定の分子または細胞を効率的に標的とする。一方で、治療抗体は費用のかかる上、臨床試験中の治療抗体は、現存施設を使用して製造可能なものを超えてしまっている。それ故に、抗体精製法を工業的に改良して製造コストを抑制し、効率を向上させることが必要不可欠である。抗体を単離及び精製し得る方法は多く確立されており、こうした方法は、クラス特異的親和性クロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー、または抗原特異的親和性クロマトグラフィーなどである。最も一般的な親和性リガンドは、ヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）のＦｃ領域に結合するプロテインＡ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ由来の４１ｋＤの細胞壁タンパク質）である。追加の親和性リガンドは、プロテインＧ（Ｇ群連鎖球菌の６５ｋＤのＩｇＧ結合タンパク質）、プロテインＬ（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｇｎｕｓの７６Ｋｄの結合タンパク質）、及びプロテインＡ／Ｇ（プロテインＡ及びプロテインＧの両方のＩｇＧ結合ドメインを組み合わせた組換え融合タンパク質）であり、これらは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓプロテインＡの機能性バリアントである。プロテインＡクロマトグラフィーは、その選択性の高さ（純度９０％）及びその結合容量の大きさ（樹脂１ｍｌ当たり抗体６０ｍｇ）故に、抗体精製の絶対的基準として広く認識されている。

米国特許第６，１２７，５２６号では、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーを介してタンパク質を単離及び精製するための従来手法について記載されている。この精製プロセスでは、（ｉ．）プロテインＡドメイン（Ｅ、Ｄ、Ａ、Ｂ、Ｃ）またはその機能性バリアントを固相上に固定化すること、（ｉｉ．）疎水性電解質溶液で固相物質を洗浄することによって混入物を除去すること、及び（ｉｉｉ．）固相から所望のタンパク質を単離すること、が行われる。固相担体の型は、抗体精製プロセスに劇的に影響を与え得る。一般に利用される固相マトリックスは、シリカまたはアガロースのような物質からなり得る。一方で、ブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）を固相担体に付加する方法も重要である。プロテインＡクロマトグラフィーは、有力な抗体精製方法ではあるが、プロテインＡクロマトグラフィーにはかなりのコストがかかり、スループット、スケールアップ、及びリガンド漏出と関連する制限が現存することを考慮すると、代替の精製方法が必要である。

本開示は、プロテインＡドメイン（Ｅ、Ｄ、Ａ、Ｂ、Ｃ）または合成プロテインＺ（例えば、合成Ｚドメイン）をＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ転写因子Ｕｌｔｒａｂｉｔｈｏｒａｘ（Ｕｂｘ）物質に共有結合で付加することによってプロテインＡクロマトグラフィーの結合容量を増加させるための組成物及び方法を対象とする。Ｕｂｘ物質に組み込まれるＳｐＡタンパク質は、同じＳｐＡタンパク質と架橋した市販のクロマトグラフィー樹脂のものと比較して、物質のグラム当たりで約１，０００倍多いことを本発明者らは発見した。本明細書で提供される組成物は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ転写因子Ｕｌｔｒａｂｉｔｈｏｒａｘ（Ｕｂｘ）またはその断片と、免疫グロブリン結合タンパク質と、を含む融合タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、免疫グロブリン結合タンパク質は、プロテインＡドメイン、プロテインＺドメイン、またはその断片である。

約２～約１８個の免疫グロブリン結合ドメイン（例えば、ＳｐＡドメインまたはＺドメインの反復配列）を含む親和性クロマトグラフィーマトリックスも提供される。複数の免疫グロブリン結合ドメイン（例えば、ＳｐＡドメインまたはＺドメインの約２～約１８回反復配列）をＵｂｘタンパク質またはその断片に共有結合で付加することによって結合容量が増加し得る。他のＳｐＡ適用と関連してよく見られる問題は、固相マトリックスにＳｐＡドメインを化学的に固定化すると分解が生じやすく、それによってプロテインＡが漏出してしまうことである。例えば、米国特許出願公開公報第２００５００３８２３１号を参照のこと。本明細書で提供される組成物及び方法は、リガンド漏出によるＳｐＡの混入を阻止することによって免疫グロブリン純度を向上させることを可能にする。ＳｐＡドメイン反復配列（複数可）、Ｚドメイン（複数可）、またはその断片をＵｂｘ物質に共有結合で付加することで、マトリックスからのリガンドの漏出または解離が阻止される。したがって、本発明は、純度向上を伴って免疫グロブリンを単離することを可能にする容量増加型抗体親和性分離マトリックスを提供する。本明細書では、提供される親和性分離マトリックスのいずれかを使用して抗体または免疫グロブリン含有タンパク質を単離または精製する方法も提供される。

短いリンカー（複数可）を介して１つまたは最大で１８個のＺドメインがＵｂｘと融合したものの模式図である。この全融合タンパク質には、同様のリンカーを介して精製用タグが付加される。 ＦＩＴＣ標識抗体が、非改変Ｕｂｘ（Ａ）から構成される線維には結合できないが、Ｚ－Ｕｂｘ線維（Ｂ）及び１８Ｚ－Ｕｂｘ線維（Ｃ）には結合することを示す。挿入図：抗体が線維にくまなく結合していることを実証する断面図。 Ｚ－Ｕｂｘ及び１８Ｚ－Ｕｂｘの静的結合容量を定量化したものを示すグラフである。 沸騰水中に３０秒間沈めた後のＺ－Ｕｂｘ及び１８Ｚ－Ｕｂｘの静的結合容量を定量化したものを示すグラフである。 ＩｇＧの１回目の精製及び２回目の精製を示す。ＺＺ－Ｕｂｘ膜によるＩｇＧの精製から得られた画分（ＰＢＳ洗浄画分（レーン２及びレーン５）、ロード画分（レーン３）、素通り画分（レーン４）、及び溶出画分（レーン６～１０））を、レーン１の分子量マーカーと共に１０％のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルで泳動させた。 Ｚ－Ｚ－Ｕｂｘ対照（レーン１）及び溶出画分（レーン２）のウエスタンブロットである。一次抗体は、ウサギ抗プロテインＡ Ｚドメイン（１：１５０）である。二次抗体は、ヤギ抗ウサギＨＲＰ複合体（１：２００００）である。 抗体の精製元であるハイブリドーマ培地（レーン２）及び溶出画分（レーン３）を示すＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルである。 ハイブリドーマ培地中のＩｇＧ（レーン１）及び精製ＩｇＧ（レーン２）のウエスタンブロットである。抗体は、ＺＺ－Ｕｂｘ膜での精製後に活性を保持することが可能である。 ウエスタンブロットにおいてアルブミンを検出するための一次抗体として純粋な市販抗体を使用したものを示す。二次抗体は、ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）である。 ウエスタンブロットにおいてアルブミンを検出するための一次抗体として、ハイブリドーマ培地から精製した抗体を使用したものを示す。二次抗体は、ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）である。

定義
本明細書では、Ｕｂｘ物質骨格に固定化された抗体親和性タンパク質が提供される。このことは、抗体結合ドメイン及び物質形成Ｕｂｘタンパク質から構成される融合タンパク質を介して達成される。免疫グロブリンを精製するためのＵｂｘ物質の使用も提供される。Ｕｂｘ物質に組み込まれるＳｐＡタンパク質は、同じＳｐＡタンパク質と架橋した市販のクロマトグラフィー樹脂のものと比較して、物質のグラム当たりで１，０００倍多いため、親和性精製結合容量が顕著に改善し得るという発見に本発明は基づいている。さらに、抗体親和性ドメインをＵｂｘ物質に共有結合で結合することで、担体からのリガンドの漏出が阻止され、それによって産物純度が改善する。

「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すために本明細書で互換的に使用される。これらの用語は、全長タンパク質を含めて、アミノ酸残基が共有結合性のペプチド結合によって連結された任意の長さのアミノ酸鎖を包含する。この定義は、本明細書に記載の任意のポリペプチドの断片及びバリアントも含む。タンパク質は抗体であり得る。タンパク質は、宿主細胞によって産生されるものであり得る。

「抗体親和性ドメイン」及び「免疫グロブリン結合タンパク質」という用語は互換的に使用され、例えば、プロテインＡドメイン（例えば、Ｅ、Ｄ、Ａ、Ｂ、Ｃ、もしくはＺ）、またはプロテインＧドメイン、プロテインＬドメイン、プロテインＡ／Ｇドメイン、あるいはその機能性バリアントであり得る。いくつかの実施形態では、抗体親和性ドメインは、ブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）ドメインであり得る。いくつかの実施形態では、抗体親和性ドメインは、Ｚドメイン（例えば、合成Ｚドメイン（配列番号１（ＨＭＶＤＮＫＦＮＫＥＱＱＮＡＦＹＥＩＬＨＬＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＦＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ）など））もしくはその断片を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、親和性ドメインは、下記のものを含むか、下記のものから本質的になるか、または下記のものからなる：ＳｐＡドメインＥ（ＡＱＨＤＥＡＱＱＮＡＦＹＱＶＬＮＭＰＮＬＮＡＤＱＲＮＧＦＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱＳＡＮＶＬＧＥＡＱＫＬＮＤＳＱＡＰＫ（配列番号２））、ＳｐＡドメインＡ（ＡＤＮＮＦＮＫＥＱＱＮＡＦＹＥＩＬＮＭＰＮＬＮＥＥＱＲＮＧＦＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱＳＡＮＬＬＳＥＡＫＫＬＮＥＳＱＡＰＫ（配列番号３））、ＳｐＡドメインＢ（ＡＤＮＫＦＮＫＥＱＱＮＡＦＹＥＩＬＨＬＰＮＬＮＥＥＱＲＮＧＦＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ（配列番号４））、ＳｐＡドメインＣ（ＡＤＮＫＦＮＫＥＱＱＮＡＦＹＥＩＬＨＬＰＮＬＴＥＥＱＲＮＧＦＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶＳＫＥＩＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ（配列番号５））、ＳｐＡドメインＤ（配列番号１４）、プロテインＧドメイン（例えば、プロテインＧ Ｃ１ドメイン（ＴＹＫＬＩＬＮＧＫＴＬＫＧＥＴＴＴＥＡＶＤＡＡＴＡＥＫＶＦＫＱＹＡＮＤＮＧＶＤＧＥＷＴＹＤＤＡＴＫＴＦＴＶＴＥ）（配列番号６））、プロテインＧ Ｃ２ドメイン（ＴＹＫＬＶＩＮＧＫＴＬＫＧＥＴＴＴＥＡＶＤＡＡＴＡＥＫＶＦＫＱＹＡＮＤＮＧＶＤＧＥＷＴＹＤＤＡＴＫＴＦＴＶＴＥ）（配列番号７）、もしくはプロテインＧ Ｃ３ドメイン（ＴＹＫＬＶＩＮＧＫＴＬＫＧＥＴＴＴＫＡＶＤＡＥＴＡＥＫＡＦＫＱＹＡＮＤＮＧＶＤＧＶＷＴＹＤＤＡＴＫＴＦＴＶＴＥ（配列番号８））、プロテインＬドメイン（例えば、Ｂ１：（ＶＴＩＫＡＮＬＩＦＡＤＧＳＴＱＮＡＥＦＫＧＴＦＡＫＡＶＳＤＡＹＡＹＡＤＡＬＫＫＤＮＧＥＹＴＶＤＶＡＤＫＧＬＴＬＮＩＫＦＡＧ）（配列番号９））、Ｂ２：（ＶＴＩＫＶＮＬＩＦＡＤＧＫＴＱＴＡＥＦＫＧＴＦＥＥＡＴＡＫＡＹＡＹＡＤＬＬＡＫＥＮＧＥＹＴＡＤＬＥＤＧＧＮＴＩＮＩＫＦＡＧ）（配列番号１０））、Ｂ３：（ＶＴＩＫＶＮＬＩＦＡＤＧＫＩＱＴＡＥＦＫＧＴＦＥＥＡＴＡＫＡＹＡＹＡＮＬＬＡＫＥＮＧＥＹＴＡＤＬＥＤＧＧＮＴＩＮＩＫＦＡＧ）（配列番号１１））、もしくはＢ４：（ＶＴＩＫＶＮＬＩＦＡＤＧＫＴＱＴＡＥＦＫＧＴＦＥＥＡＴＡＥＡＹＲＹＡＤＬＬＡＫＶＮＧＥＹＴＡＤＬＥＤＧＧＹＴＩＮＩＫＦＡＧ）（配列番号１２）、プロテインＡ／Ｇドメイン（例えば、（ＡＱＨＤＥＡＱＱＮＡＦＹＱＶＬＮＭＰＮＬＮＡＤＱＲＮＧＦＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱＳＡＮＶＬＧＥＡＱＫＬＮＤＳＱＡＰＫ）（配列番号１３））、（ＡＤＡＱＱＮＮＦＮＫＤＱＱＳＡＦＹＥＩＬＮＭＰＮＬＮＥＡＱＲＮＧＦＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱＳＴＮＶＬＧＥＡＫＫＬＮＥＳＱＡＰＫ）（配列番号１４））、（ＡＤＮＮＦＮＫＥＱＱＮＡＦＹＥＩＬＮＭＰＮＬＮＥＥＱＲＮＧＦＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱＳＡＮＬＬＳＥＡＫＫＬＮＥＳＱＡＰＫ）（配列番号１５））、（ＡＤＮＫＦＮＫＥＱＱＮＡＦＹＥＩＬＨＬＰＮＬＮＥＥＱＲＮＧＦＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ）（配列番号１６））、（ＡＤＮＫＦＮＫＥＱＱＮＡＦＹＥＩＬＨＬＰＮＬＴＥＥＱＲＮＧＦＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶＳＫＥＩＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ）（配列番号１７））、（ＴＹＫＬＩＬＮＧＫＴＬＫＧＥＴＴＴＥＡＶＤＡＡＴＡＥＫＶＦＫＱＹＡＮＤＮＧＶＤＧＥＷＴＹＤＤＡＴＫＴＦＴＶＴＥ）（配列番号１８））、もしくは（ＴＹＫＬＶＩＮＧＫＴＬＫＧＥＴＴＴＫＡＶＤＡＥＴＡＥＫＡＦＫＱＹＡＮＤＮＧＶＤＧＶＷＴＹＤＤＡＴＫＴＦＴＶＴＥ）（配列番号１９））、またはその断片。任意選択で、本明細書に記載の免疫グロブリン結合タンパク質の断片のいずれかは、結合断片であり得る。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質のいずれかには、１つ以上の抗体親和性ドメインが存在する。任意選択で、親和性ドメインは、配列番号１～配列番号１９またはその機能性断片からなる群から選択される１つ以上の配列を含むアミノ酸配列、当該１つ以上の配列から本質的になるアミノ酸配列、または当該１つ以上の配列からなるアミノ酸配列を含む。

「固相」、「担体」、「骨格」、及び「マトリックス」という用語は本明細書で互換的に使用され、抗体親和性ドメインを固定するための物理構造を与える固体物質を指す。

本明細書で使用される「抗体」という用語は、免疫グロブリン（Ｉｇ）分子、その抗原結合断片、またはその結合誘導体を指す。抗体の抗原結合断片は、抗原に特異的に結合する抗原結合部位を含む。抗体（Ａｂ）は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、または多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）であり得る。抗体の例としては、免疫グロブリン（Ｉｇ）型がＩｇＧのもの、ＩｇＤのもの、ＩｇＥのもの、ＩｇＡのもの、及びＩｇＭのものが挙げられる。抗体は、天然抗体または組換え抗体であり得る。抗体は、宿主細胞によって産生され得る。

本明細書で使用される「融合タンパク質」という用語は、２つ以上のポリペプチドを含むタンパク質を指し、これら２つ以上のポリペプチドは、異なるタンパク質に由来するものであるが、両方のタンパク質と実施形態によっては連結配列とをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドから、単一のプロモーターの制御下で単一のポリペプチドとして産生される。本明細書に記載の融合タンパク質中の２つ以上のポリペプチドは、複合体化または連結され、この複合体化または連結は、任意選択でリンカーを介して行われる。

「核酸」または「ヌクレオチド」という用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）及びそれらのポリマー（一本鎖形態または二本鎖形態のいずれかのもの）を指す。別段の指定がない限り、特定の核酸配列は、明示的に示される配列だけでなく、保存的に改変されたそのバリアント（例えば、縮重コドン置換体）、アレル、オルソログ、ＳＮＰ、及び相補的配列も暗示的に包含する。

「プロモーター」は、核酸の転写を生じさせる１つ以上の核酸制御配列として定義される。本明細書で使用されるプロモーターは、転写開始部位付近に必要核酸配列（ポリメラーゼＩＩ型プロモーターの場合はＴＡＴＡ要素など）を含む。プロモーターは、遠位エンハンサー要素または遠位リプレッサー要素も任意選択で含み、こうした遠位要素は、転写開始部位から数千塩基対も離れて位置し得る。

核酸は、別の核酸配列との機能的関連性が生じるように配置される場合、「機能可能なように連結される」。例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、コード配列の転写に影響を及ぼす場合、当該配列に機能可能なように連結される。あるいは、リボソーム結合部位は、翻訳を促進するように配置される場合、コード配列に機能可能なように連結される。

「Ｕｂｘ物質（複数可）」という用語は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ転写因子Ｕｌｔｒａｂｉｔｈｏｒａｘ（ＵＳ２０１０／０１４３４３６）が自己集合してできた生体物質を指すか、またはＵＳ２０１８０２２２９４９Ａ１に記載のＵｌｔｒａｂｉｔｈｏｒａｘの改良合成バージョンのいずれかを指す。いくつかの例では、Ｕｂｘ物質は、２つ以上の自己集合Ｕｂｘタンパク質分子を含む。本明細書に記載のＵｂｘ物質のいずれかでは、Ｕｂｘタンパク質は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＮ１３７１７、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＮ１３７１８、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＮ１３７１９、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＦ５５３５５、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＦ５５３５６、及びＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＳ６５１５８に示されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列またはその断片を含み得る。他のクロマトグラフィー担体との比較目的では、１ｍＬのＵｂｘ物質は、沈着状態のアガロースベースの樹脂１ｍＬに相当する質量のＵｂｘ物質を意味する。

いくつかの実施形態では、融合タンパク質の創出には全長Ｕｂｘタンパク質が使用される。例えば、Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｐ８３９４９を参照のこと。他の実施形態では、Ｕｂｘ融合タンパク質の生成に使用されるＵｂｘタンパク質は、Ｕｂｘホメオドメインを含むＵｂｘタンパク質断片（例えば、配列番号２０（ＬＲＲＲＧＲＱＴＹＴＲＹＱＴＬＥＬＥＫＥＦＨＴＮＨＹＬＴＲＲＲＲＩＥＭＡＨＡＬＣＬＴＥＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＬＫＫＥＩ）から構成されるか、またはそれを含むＵｂｘタンパク断片）である。他の実施形態では、Ｕｂｘ融合タンパク質は、配列番号２０及び配列番号２１（ＭＮＳＹＦＥＱＡ）を含むＵｂｘタンパク質断片を含む。他の実施形態では、Ｕｂｘ融合タンパク質は、配列番号２２（ＶＲＰＳＡＣＴＰＤＳＲＶＧＧＹＬＤＴＳ）及び／または配列番号２３（ＦＹＰＷＭＡＩＡ）を含むＵｂｘタンパク質断片を含む。「Ｕｂｘタンパク質」という用語は、全長Ｕｂｘタンパク質またはその断片を意味することが理解されよう。

「機能性物質」という用語は、免疫グロブリン結合タンパク質とＵｂｘタンパク質またはその断片とを含む融合タンパク質からできたＵｂｘ生体物質を指す。いくつかの実施形態では、Ｕｂｘ生体物質は、免疫グロブリン結合タンパク質及びＵｂｘタンパク質を含む自己集合融合タンパク質を２つ以上含む。

詳細な説明
組成物
本発明は、抗体を精製するための生体物質を含む組成物に関する。いくつかの実施形態では、生体物質は、Ｕｂｘタンパク質またはその断片を含む。本明細書で提供される生体物質は、抗体結合タンパク質または免疫グロブリン結合タンパク質をＵｂｘタンパク質またはその断片と融合させることによって付与される機能特性を有する。免疫グロブリン結合タンパク質は、天然の免疫グロブリン結合容量を有する任意のタンパク質であり得、こうしたタンパク質は、ブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）、連鎖球菌プロテインＧ（ＳｐＧ）、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属のプロテインＬ、プロテインＡ／Ｇ、またはこうしたタンパク質のＩｇＧ結合ドメインを含む組換えタンパク質などである。そのようなタンパク質の総説については、例えば、Ｋｒｏｎｖａｌｌ ａｎｄ Ｊｏｎｓｓｏｎ（Ｒｅｃｅｐｔｉｎｓ：ａ ｎｏｖｅｌ ｔｅｒｍ ｆｏｒ ａｎ ｅｘｐａｎｄｉｎｇ ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｏｆ ｎａｔｕｒａｌ ａｎｄ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｉｔｈ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｆｏｒ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．１９９９ Ｊａｎｕａｒｙ－Ｆｅｂｒｕａｒｙ；１２（１）：３８－４４）を参照のこと。免疫グロブリン結合タンパク質は、ＳｐＡのＥドメイン、Ｄドメイン、Ａドメイン、Ｂドメイン、及びＣドメインのうちの１つ以上を含み得る。いくつかの実施形態では、免疫グロブリン結合タンパク質は、プロテインＡのドメインＢまたは操作創出された合成プロテインＺドメインを含む。いくつかの実施形態では、プロテインＡのドメインＥ、ドメインＤ、ドメインＡ、ドメインＢ、もしくはドメインＣ、またはドメインＺに由来する同じ単量体ドメインのコピーを２つ以上（２～１８個など）含む多量体リガンド（図１）。他の実施形態では、プロテインＡのドメインＥ、ドメインＤ、ドメインＡ、ドメインＢ、及びドメインＣ、またはドメインＺから選択される２つ以上（２～１８個など）の異なる単量体ドメインを含む多量体リガンドが使用され得る。本明細書に記載の実施形態のいずれかでは、プロテインＡのドメインＥ、ドメインＤ、ドメインＡ、ドメインＢ、もしくはドメインＣ、またはドメインＺの機能性バリアントが使用され得る。

いくつかの実施形態では、抗体結合の機能特性は、免疫グロブリン、抗体結合タンパク質、及びＵｂｘタンパク質またはその断片を含む融合タンパク質を介して付与される。機能性融合タンパク質をコードする核酸または遺伝子は、当該タンパク質を発現させるためのプラスミドにクローニングされ、一般に、タンパク質精製を容易化するためのペプチドタグ（例えば、ヒスチジンタグ）をコードするＤＮＡ配列の３’に連結される。当該技術分野で知られる他のタグ（例えば、化学的部分（蛍光タグなど））も使用され得る。融合タンパク質は、細胞（例えば、真核細胞または原核細胞）において発現され得る。本明細書に記載の融合タンパク質のいずれかをコードする核酸配列を含む細胞も提供される。任意選択で、核酸配列は、ベクター中に含められる。任意選択で、核酸配列は、細胞のゲノムに安定的に組み込まれる。融合タンパク質の発現は、適切なプロモーター（例えば、当業者に知られる任意の構成的プロモーターまたは制御可能なプロモーター）の制御下に置かれ得る。

いくつかの実施形態では、免疫グロブリン結合タンパク質をコードする核酸配列の３’末端にリンカーが配置される。このリンカーの長さ及び配列は異なり得る。例えば、リンカーの長さは、アミノ酸数で約２～約２０であり得る。いくつかの実施形態では、リンカーは、グリシン及びセリンの交互反復配列（例えば、（ＳＧＳＧ）_ｎ（配列番号２４）または（ＧＳＧＳ）_ｎ（配列番号２５）（配列中、ｎは整数である））を含む。リンカーが存在する場合、Ｕｂｘタンパク質またはその断片をコードする核酸は、リンカーの３’末端に位置し、当該核酸の下流には、１つ以上の終止コドン（遺伝子融合体中で唯一のもの（複数可））が存在する。宿主細胞中で融合遺伝子が発現すると融合タンパク質が産生され、この融合タンパク質を機能化物質の調製に使用することができる。融合タンパク質及び機能化物質の調製方法については、例えば、米国特許公開公報第２０１８０２２２９４９号を参照のこと。

本明細書に記載の組成物及び方法を使用することによって、Ｕｂｘ物質に組み込まれるタンパク質は、同じタンパク質と架橋した市販のクロマトグラフィー樹脂のものと比較して、物質のグラム当たりで１，０００倍多くなることから、以前の報告のように抗体結合技術を使用した場合と比較して高い容量で抗体を機能性生体物質に結合させることができる（図２及び図３）。

本明細書では、少なくとも１つのＵｂｘタンパク質と、免疫グロブリン結合タンパク質と、を含む融合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、免疫グロブリン結合タンパク質は、ブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）の単一ドメイン、ドメインＺ、またはその機能性バリアントを含む。いくつかの実施形態では、ブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）のドメインは、Ｅドメイン、Ｄドメイン、Ａドメイン、Ｂドメイン、またはＣドメインである。いくつかの実施形態では、免疫グロブリン結合タンパク質は、ブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）の２つ以上の異なる単量体ドメイン、ドメインＺ、またはその機能性バリアントを含む。いくつかの実施形態では、ブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）の２つ以上の異なる単量体ドメインは、Ｅドメイン、Ｄドメイン、Ａドメイン、Ｂドメイン、またはＣドメインである。いくつかの実施形態では、免疫グロブリン結合タンパク質は、ブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）の２つ以上の単量体ドメイン、ドメインＺ、またはその機能性バリアントを含み、これらの単量体ドメインは同じものである。いくつかの実施形態では、ブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）の２つ以上の異なる単量体ドメインは、Ｅドメイン、Ｄドメイン、Ａドメイン、Ｂドメイン、またはＣドメインである。

本明細書では、本明細書に記載の融合タンパク質のいずれかを含む固相マトリックスも提供される。いくつかの実施形態では、固相マトリックスからの免疫グロブリン結合タンパク質の漏出が阻止または低減される。例えば、漏出の低減率は、少なくとも５５、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または１００％であり得る。いくつかの実施形態では、物質１ｍＬの結合容量は、１ｇ／ｍＬを超える。

いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、Ｕｂｘタンパク質断片を含み、このＵｂｘタンパク質断片は、配列番号２０（ＬＲＲＲＧＲＱＴＹＴＲＹＱＴＬＥＬＥＫＥＦＨＴＮＨＹＬＴＲＲＲＲＩＥＭＡＨＡＬＣＬＴＥＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＬＫＫＥＩ）から構成されるか、またはそれを含む。他の実施形態では、Ｕｂｘ融合タンパク質は、配列番号２０及び配列番号２１（ＭＮＳＹＦＥＱＡ）を含むＵｂｘタンパク質断片から構成される。他の実施形態では、Ｕｂｘ融合タンパク質は、配列番号２２（ＶＲＰＳＡＣＴＰＤＳＲＶＧＧＹＬＤＴＳ）及び／または配列番号２３（ＦＹＰＷＭＡＩＡ）を含むＵｂｘタンパク質断片を含む。配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、及び配列番号２３のいずれか１つとの同一性％が少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％であるアミノ酸配列を含む融合タンパク質も提供される。ポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の文脈で使用される「同一性」という用語は、配列と参照配列との配列同一性％が少なくとも６０％であることを指す。あるいは、同一性パーセントは、６０％～１００％の任意の整数であり得る。実施形態例としては、本明細書に記載のプログラムを使用して参照配列と比較した場合に少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％であるものが挙げられ、この比較は、好ましくは、以下に記載のように標準パラメーターを使用してＢＬＡＳＴによって行われる。こうした値は、コドン縮重度、アミノ酸類似性、リーディングフレームの位置決め、及び同様のものを考慮することによって、２つのヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質の対応同一性が決定されるように適切に調整され得ることを当業者なら認識するであろう。

配列比較については、典型的には、被検配列の比較対象となる参照配列としての役割を１つの配列が果たす。配列比較アルゴリズムが使用される場合、被検配列及び参照配列がコンピューターに入力され、部分配列座標が指定され（必要に応じて）、配列アルゴリズムプログラムパラメーターが指定される。デフォルトプログラムパラメーターが使用され得るか、または代替パラメーターが指定され得る。次に、プログラムパラメーターに基づいて、被検配列と参照配列とを比較するために、配列比較アルゴリズムによる配列同一性パーセントの計算が行われる。

本明細書で使用される「比較幅」は、２０～６００、通常は約５０～約２００、より通常は約１００～約１５０からなる群から選択される連続位置数のいずれか１つのセグメントに対する言及を含み、このセグメントにおいて同じ連続位置数の参照配列と配列が比較され、この比較は、これら２つの配列が任意選択でアライメントされた後に行われ得る。比較のための配列アライメント方法は当該技術分野でよく知られている。比較のための最適な配列アライメントは、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ Ａｄｄ．ＡＰＬ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アライメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）８５：２４４４（１９８８）の類似性検索法、これらのアルゴリズムのコンピューターによる実装（例えば、ＢＬＡＳＴ）、または手動アライメント及び視覚的検証によって実施され得る。

配列同一性パーセント及び配列類似性パーセントの決定に適したアルゴリズムはＢＬＡＳＴアルゴリズム及びＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、これらのアルゴリズムについては、それぞれＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０及びＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９７７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２に記載されている。ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）ウェブサイトを介して公的に利用可能である。こうしたアルゴリズムでは、問い合わせ配列中の長さＷの短い文字列を同定することによって高スコア配列ペア（ＨＳＰ）が最初に同定することが行われ、この長さＷの短い文字列は、データベース配列中の同じ長さの文字列とアライメントすると何らかの正の値の閾値スコアＴと一致またはそれを満たすものである。Ｔは、隣接文字列スコア閾値（前出のＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ）と称される。こうした初期の隣接文字列ヒットは、それを含むより長いＨＳＰが見つかるように検索を開始するためのシードとして働く。次に、文字列ヒットは、累積アライメントスコアが増加し得る限り、各配列に沿って両方向に拡張される。累積スコアの計算は、ヌクレオチド配列については、パラメーターＭ（一致残基対に対する報酬スコア（常に＞０））及びパラメーターＮ（不一致残基に対するペナルティスコア（常に＜０））を使用して行われる。アミノ酸配列については、スコア付け行列を使用して累積スコアが計算される。各方向への文字列ヒットの拡張は以下の場合に停止される：累積アライメントスコアが、その最大達成値からＸ量分低下した場合、１つ以上の負のスコア付け残基アライメントが累積することによって累積スコアが０以下になった場合、またはいずれかの配列の末端に到達した場合。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターであるＷ、Ｔ、及びＸは、アライメントの感度及び速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）では、文字列長（Ｗ）２８、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝１、Ｎ＝－２、及び両鎖比較がデフォルトとして使用される。アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴＰプログラムでは、文字列長（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０、及びＢＬＯＳＵＭ６２スコア付け行列がデフォルトとして使用される（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ＆ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５（１９８９）を参照のこと）。

ＢＬＡＳＴアルゴリズムでは、２つの配列の間の類似性を統計解析することも実施される（例えば、Ｋａｒｌｉｎ ＆ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３－５７８７（１９９３）を参照のこと）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される１つの類似性尺度は、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、Ｐ（Ｎ）は、２つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の間で偶然の一致が生じることになる確率の指標となる。例えば、核酸は、当該被検核酸と参照核酸との比較において最小合計確率が約０．０１未満、より好ましくは約１０^－５未満、最も好ましくは約１０^－２０未満であるならば、参照配列と類似するものとみなされる。

本明細書に記載のポリペプチド中のアミノ酸は、２０種類の天然起源のアミノ酸、天然起源のアミノ酸のＤ－立体異性体、非天然起源または非天然のアミノ酸、及び化学的に修飾されたアミノ酸のいずれかであり得る。当該技術分野では非天然アミノ酸（すなわち、タンパク質中に天然には見られないもの）もよく知られており、こうした非天然アミノ酸は、例えば、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．“Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｗｉｔｈ ｕｎｎａｔｕｒａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ，” Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２３（４）：５８１－５８７（２０１３）、Ｘｉｅ ｅｔ ｌａ．“Ａｄｄｉｎｇ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｔｏ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ，” ９（６）：５４８－５４（２００５））、及びそこで引用されているすべての参考文献に示されている。当該技術分野ではΒアミノ酸及びγアミノ酸が知られており、これらのアミノ酸もまた、非天然アミノ酸として本明細書で企図される。本明細書に記載の合成ペプチドのいずれか（例えば、合成ドメインＺ）は、ＳｐＡのドメイン（例えば、ドメインＥ、ドメインＤ、ドメインＡ、ドメインＢ、もしくはドメインＣ）に由来するか、またはそこから操作創出されたものであり得る。

本明細書で使用される化学的に修飾されたアミノ酸は、側鎖が化学的に修飾されているアミノ酸を指す。例えば、側鎖は、シグナル伝達部分（フルオロフォアまたは放射標識など）を含むように修飾され得る。側鎖は、新たな官能基（チオール基、カルボン酸基、またはアミノ基など）を含むようにも修飾され得る。翻訳後修飾されたアミノ酸もまた、化学的に修飾されたアミノ酸の定義に含まれる。

本明細書に記載のポリペプチドのいずれか１つに対する１つ以上の保存的アミノ酸置換も企図される。例として、保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基の１つ以上（例えば、本明細書に提供されるポリペプチドのいずれかの１つ以上のリジン残基）に対して行われ得る。保存的置換は、１つのアミノ酸残基を、生物学的及び／または化学的に類似した別のアミノ酸残基で置き換えることであることを当業者なら知っているであろう。以下には８つの群が示され、これらの群はそれぞれ、互いに保存的置換となるアミノ酸を含む：

１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、

２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、

３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、

４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）、

５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）、

６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）、

７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、及び

８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）

例として、アルギニンからセリンへの置換について言及される場合、セリンに対する保存的置換（例えば、スレオニンへのもの）も企図される。非保存的置換（例えば、リジンをアスパラギンで置換するもの）も企図される。

方法
本明細書では、１つ以上の免疫グロブリン含有タンパク質を液体または溶液から分離するための方法も提供される。この方法は、（ａ）担体に固定化されたリガンド（複数可）（すなわち、免疫グロブリン結合タンパク質）を含む分離マトリックスと液体とを接触させること、（ｂ）免疫グロブリン含有タンパク質を、リガンド（複数可）との相互作用によってマトリックスに吸着させること、（ｃ）吸着した免疫グロブリン含有タンパク質を洗浄すること、及び（ｄ）免疫グロブリン含有タンパク質を遊離させる溶出液とマトリックスとを接触させることによって当該タンパク質を回収すること、を含む。この方法は、免疫グロブリン分子へのリガンドの結合容量を増加させるものであり、この増加は、ブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）の１つ以上のドメイン（すなわち、単量体）（Ｅ、Ｄ、Ａ、Ｂ、Ｃ、もしくはＺ）またはその機能性バリアントをそれぞれが含むリガンドを使用することによってもたらされる。

本明細書に記載の方法では、リガンド（すなわち、免疫グロブリン結合タンパク質）は、タンパク質ベースの生体物質（すなわち、Ｕｂｘ物質）上に固定化され、この固定化は、タンパク質リガンドをＵｂｘタンパク質またはその断片と融合させることによって行われる。本明細書で提供される方法では、マトリックスは、固相担体としてＵｂｘ物質から構成される。すべての実施形態において、生体物質は、Ｕｂｘタンパク質、Ｕｂｘタンパク質を含む融合タンパク質、またはその断片が自己集合することでできる。

すべての実施形態において、マトリックス中のリガンドは、固相担体上に存在する。固相担体の例としては、限定されないが、活性アルミナ、粉末セルロース、ケイ酸、ゲル、紙、ガラス繊維、プラスチック、アガロース、ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、シリカ、及びそれらの誘導体、ならびに任意の他の適切な固相担体が挙げられる。Ｕｂｘ物質によってリガンドが支持されるとリガンドの結合容量が約１，０００倍に増加することが見出され、これは予想外のことであった。結合容量は、遺伝子融合を介してリガンドの反復配列をＵｂｘ物質に付加すること（すなわち、Ｕｂｘと１つ以上のリガンド反復配列とを含む融合タンパク質を創出すること）によってさらに増加し得る。例えば、限定されないが、結合容量は、ＳｐＡドメインまたはＺドメインの１８回反復配列がＵｂｘ物質上に固定化されたものを含む融合タンパク質を使用することによって増加し得る（図３）。

本明細書で提供される組成物及び方法は、Ｕｂｘ物質への共有結合付加を介してリガンドを安定化することにも使用され得る。すべての実施形態において、リガンドはタンパク質融合を介して付加され、物質形成Ｕｂｘタンパク質と共に生成されるため、固相担体からのリガンドの漏出または解離は阻止または低減される。図４に示されるように、この安定性は、高熱への曝露後でさえ、本明細書に記載のマトリックスの結合容量が一貫して高いことによって示される（図４）。

免疫グロブリン（ＩｇＧ、ＩｇＡ、及び／またはＩｇＭなど）を単離する方法も提供され、本発明によるリガンドまたはマトリックスが使用される。したがって、本発明は、クロマトグラフィーのプロセスを包含し、上記のリガンドまたはマトリックスへの吸着によって液体から少なくとも１つの標的化合物が単離される。したがって、本発明のこの態様は、親和性クロマトグラフィーに関し、この親和性クロマトグラフィーは、広く使用され、よく知られる分離手法である。簡潔に記載すると、第１のステップでは、標的化合物（好ましくは、上述の抗体）を含む溶液が、分離マトリックス上に存在するリガンドへの標的化合物の吸着が可能になる条件の下で当該マトリックスに通液される。そのような条件は、例えば、ｐＨ及び／または塩濃度（すなわち、溶液中のイオン強度）によって制御される。マトリックスの容量を超えないように注意を払うべきであり、すなわち、流速は、良好な吸着が可能になり、マトリックスを傷つけないように十分遅くあるべきである。このステップでは、溶液の他の成分は、原理上は妨げられることなく素通りすることになる。次に、任意選択で、保持され、及び／または緩く結合した物質を除去するためにマトリックスの洗浄が行われる（例えば、水溶液での洗浄が行われる）。本開示のマトリックスには、添加剤（溶媒、塩、もしくは界面活性剤、またはそれらの混合物）を利用する中間洗浄ステップが任意選択で適用される。次のステップでは、脱着が生じる条件（すなわち、標的化合物が遊離する条件）の下で第２の溶液（溶出液）がマトリックスに通液される。そのような条件は、一般に、ｐＨ、塩濃度（すなわち、イオン強度）、疎水性などを変化させることによって得られる。溶出スキームは、さまざまなもの（グラジエント溶出及びステップワイズ溶出など）が知られている。溶出は、競合物質を含む第２の溶液によっても生じ得、こうした競合物質によって、マトリックス上の所望の抗体が置き換えられることになる。

開示の方法及び組成物に使用され得るか、それと併用され得るか、その調製に使用され得るか、またはその産物である物質、組成物、及び成分が開示される。本明細書では、こうした物質及び他の物質が開示されており、こうした物質の組み合わせ、サブセット、相互作用、群などが開示される場合、こうした化合物のさまざまな個別及び集合的な組み合わせ及び順列のそれぞれへの具体的な言及が明示的に開示されないことがあり得るが、本明細書ではそれぞれが明確に企図及び説明されることが理解されよう。例えば、方法について開示及び議論され、方法に含まれる１つ以上の分子に施され得る多くの改変について議論される場合、方法のありとあらゆる組み合わせ及び順列、ならびに可能なそうした改変は、矛盾することが具体的に示されない限り、明確に企図される。同様に、こうしたものの任意のサブセット及び組み合わせもまた、明確に企図及び開示される。この概念は、本開示のすべての態様（限定されないが、開示の組成物を使用する方法におけるステップを含む）に適用される。したがって、実施可能なさまざまな追加ステップが存在する場合、こうした追加ステップのそれぞれを、開示の方法の任意の特定の方法ステップまたは方法ステップ組み合わせと共に実施することができ、そのような組み合わせまたは組み合わせサブセットのそれぞれが明確に企図され、開示されたものとみなされることが理解されよう。

本明細書で引用される刊行物及びその引用対象の物質は、それらの全体が参照によって本明細書に明確に組み込まれる。

抗体結合試験
Ｕｂｘ物質と融合したＺドメインの機能性試験を実施した。非改変Ｕｂｘ線維、Ｚ－Ｕｂｘ線維、及び１８Ｚ－Ｕｂｘ線維を集合構築し、４ウェルプレートに入れた。２５０μｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で抗ミエリン塩基性タンパク質ヒト抗体（Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ；１：３００）と共に各線維をインキュベートした。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で線維を３回すすいだ後、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）（Ａｂｃａｍ）標識ヤギ抗ヒトＩｇＧを使用して検出した。ジチロシン結合も青色蛍光を発するため、４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）蛍光下では非改変線維は青色に見える。Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｔｉ Ａ１Ｒ倒立型共焦点顕微鏡でＤＡＰＩ及びＦＩＴＣの環境下で画像を取り込み、Ｎｉｋｏｎ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して解析した。図２Ａは、非改変Ｕｂｘ物質は抗体に結合できないが、Ｚ－Ｕｂｘ及び１８Ｚ－Ｕｂｘは両方共、顕著な量のＦＩＴＣ標識抗体に結合することを示す。この最初の試験は、Ｚドメインが融合したＵｂｘ物質には抗体が特異的に結合し得るが、物質自体には抗体が結合し得ないことを実証するものである。

結合容量
精製ＩｇＧ（１ｍｇ／ｍＬ）と共にＺ－Ｕｂｘ線維及び１８Ｚ－Ｕｂｘ線維を１５分間インキュベートすることによってＺ－Ｕｂｘ及び１８Ｚ－Ｕｂｘの静的結合容量を決定した。線維をＰＢＳ中で３回すすいだ後、２．５Ｍのヨウ化カリウム１００μｌ（ｐＨ７）中で溶出を行った。８％のＳＤＳ－ＰＡＧＥアクリルアミドゲルで溶出物を泳動させた。ＮＩＨ Ｉｍａｇｅ Ｊ画像解析ソフトウェアでの濃度測定分析を実施して結合容量を測定した。図３は、Ｚ－Ｕｂｘ線維の静的結合容量が７．４３ｇ／ｍＬであり、１８Ｚ－Ｕｂｘ線維の静的結合容量が６７．８６ｇ／ｍＬであることを示す。

耐久性
両方のＵｂｘ物質の耐久性及びＵｂｘ物質と融合したＺドメインの安定性を調べるために同じ実験を実施した。但し、異なる点として、線維を水中で３０秒間煮沸し、１分間室温で冷却してから精製ＩｇＧを線維に結合させた。煮沸後、Ｚ－Ｕｂｘ線維の静的結合容量は５．３５ｇ／ｍＬであり、１８Ｚ－Ｕｂｘ線維の静的結合容量は４６．１４ｇ／ｍＬである（図４）。このことは、結合が幾分かは失われているものの、Ｕｂｘ物質上に固定化されたＺドメインが、極度の熱への曝露後でさえ機能を保持していることを実証するものである。低ｐＨ緩衝液がＺ－Ｚ－Ｕｂｘ物質に影響を与えるかどうかをさらに試験するために、同じ膜を使用してＩｇＧの精製を２回実施した。流速０．５ｍｌ／分で１０ｍｌのＰＢＳを用いてＺ－Ｚ－Ｕｂｘ膜を洗浄した。モノクローナルＩｇＧを流速０．５ｍｌ／分で膜にロードし、素通り画分を回収した。流速０．５ｍｌ／分でＰＢＳを用いて膜を十分に洗浄した。流速０．５ｍｌ／分で０．１Ｍのグリシン（ｐＨ２．５）を用いて結合ＩｇＧを溶出させ、画分を得た。ＰＢＳを用いて膜を十分に洗浄してから、記載のように再びＩｇＧを膜にロードした。画分をＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルで泳動させた（図５）。これらのゲルから下記の２つの知見を得ることが可能である：（１）２回目の精製での膜へのＩｇＧの結合は、１回目の精製でのものよりも良好とまではいかないまでも同程度に良好であるということ、（２）いずれの精製においても洗浄ステップ（レーン２及びレーン５）においてＺ－Ｚ－Ｕｂｘオリゴマーは観察されないということ。これらの知見は、溶出緩衝液のｐＨが低くても、Ｚ－Ｚ－Ｕｂｘの結合容量が影響を受けることもなければ、物質の漏出が生じるわけでもないことを示唆している。さらに、溶出緩衝液５０ｍＬでの追加洗浄にＺ－Ｚ－Ｕｂｘ膜を供してから画分を回収し、この画分を、対照としての精製Ｚ－Ｚ－Ｕｂｘ単量体の隣に並べて１０％のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルで泳動させた。このゲルを、ウエスタンブロット分析を行うためにニトロセルロース膜に転写した。このニトロセルロース膜を５％ミルクでブロッキングした。漏出が生じていないことを確認するために、抗Ｚドメイン抗体を使用して、膜からの分解及び漏出を探索した（図６）。こうしたデータから、低いｐＨ緩衝液で処理した後でも膜からのプロテインＡリガンドの漏出が生じないことが見て取れる。

純度及び活性
ハイブリドーマ培地からモノクローナルヒト抗インスリン抗体（Ａｂｃａｍ）の精製を行う上でのＺ－Ｚ－Ｕｂｘ膜の能力を測定した。流速０．５ｍｌ／分でＰＢＳを用いてＺ－Ｚ－Ｕｂｘ膜を洗浄した。次に、抗インスリン抗体を添加したハイブリドーマ培地を０．５ｍｌ／分で膜に通液した。ＰＢＳを用いて膜を十分に洗浄した後、０．１Ｍのグリシン（ｐＨ２．５）を用いて抗体を溶出させた。開始時溶液及び溶出２から画分を回収し、１０％のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルで泳動させた（図７Ａ）。開始時溶液及び溶出２に由来する画分を、ウエスタンブロット分析も行うためにニトロセルロース膜に転写した。このニトロセルロース膜を５％ミルクでブロッキングした。ＩｇＧの存在を確認するために（図７Ｂ）、ヤギ抗ヒト二次抗体を使用した。こうしたデータから、抗体の純度が９０％超であることが見て取れる。最終的に、抗体は活性を保持している。無処理のヒト抗インスリン抗体（Ａｂｃａｍ）（図７Ｃ）とＺ－Ｚ－Ｕｂｘ膜を使用して精製した抗体（図７Ｄ）との効力比較を、ウエスタンブロット分析を使用して実施した。インスリンを２０％のアクリルアミドゲルで泳動し、ニトロセルロース膜に転写した。ニトロセルロース膜を５％ミルクでブロッキングした。膜に通液していない抗体と、Ｚ－Ｚ－Ｕｂｘ膜から溶出された抗体とを一次抗体として用いてインスリンを検出した。一次抗体の検出にはヤギ抗ヒト二次抗体（ａｂｃａｍ）を使用し、ニトロセルロース膜をＢｉｏｒａｄ Ｉｍａｇｅｒで画像化した。精製抗体は、野生型活性と似通った活性を示す。

Claims (13)

1. 少なくとも１つのＵｂｘタンパク質と、免疫グロブリン結合タンパク質と、を含む融合タンパク質。
2. 前記免疫グロブリン結合タンパク質が、ブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）の単一ドメイン、ドメインＺ、またはその機能性バリアントを含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
3. 前記ブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）の前記ドメインが、Ｅドメイン、Ｄドメイン、Ａドメイン、Ｂドメイン、またはＣドメインである、請求項２に記載の融合タンパク質。
4. 前記機能性バリアントが、プロテインＧ、プロテインＬ、またはプロテインＡ／Ｇである、請求項２に記載の融合タンパク質。
5. 前記免疫グロブリン結合タンパク質が、ブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）の２つ以上の異なる単量体ドメイン、ドメインＺ、またはその機能性バリアントを含む、請求項１または請求項２に記載の融合タンパク質。
6. 前記ブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）の前記２つ以上の異なる単量体ドメインが、Ｅドメイン、Ｄドメイン、Ａドメイン、Ｂドメイン、またはＣドメインである、請求項５に記載の融合タンパク質。
7. 前記免疫グロブリン結合タンパク質が、ブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）の２つ以上の単量体ドメイン、ドメインＺ、またはその機能性バリアントを含み、前記単量体ドメインが同じものである、請求項１または請求項２に記載の融合タンパク質。
8. 前記ブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）の前記２つ以上の異なる単量体ドメインが、Ｅドメイン、Ｄドメイン、Ａドメイン、Ｂドメイン、Ｃドメイン、またはＺドメインである、請求項７に記載の融合タンパク質。
9. 前記Ｕｂｘタンパク質が、配列番号２０の配列またはその断片を含み、前記免疫グロブリン結合タンパク質が、配列番号１の配列またはその断片を含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
10. 請求項１～９のいずれか１項に記載の融合タンパク質を含む固相マトリックス。
11. 前記固相マトリックスからの前記免疫グロブリン結合タンパク質の漏出が阻止または低減される、請求項９に記載のマトリックス。
12. 物質１ｍＬの結合容量が、１ｇ／ｍＬを超える、請求項９または請求項１０に記載のマトリックス。
13. 免疫グロブリン含有溶液から免疫グロブリンを単離するための方法であって、前記方法が、
    ａ）前記免疫グロブリン含有溶液と、請求項１０～１２のいずれか１項に記載の固相マトリックスとを、前記溶液中に含まれる免疫グロブリンが前記マトリックスに吸着する条件の下で接触させること、
    ｂ）前記吸着免疫グロブリンを洗浄すること、及び
    ｃ）前記マトリックスから前記免疫グロブリンを溶出させること、
    を含む、前記方法。

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