ES2612114T3 - Nuevas proteínas de unión a inmunoglobulina con especificidad mejorada - Google Patents

Abstract

Una proteína aislada de unión a inmunoglobulina que comprende uno o más dominios E, A o B aislados de la proteína A de Staphyloccocus, en donde los uno o más dominios aislados comprenden al menos el resto de glicina en la posición 29 de los dominios E, A o B, reemplazados por un resto de aminoácido distinto de la alanina, treonina y triptófano, en donde la proteína de unión a inmunoglobulina se une a una porción Fc de una inmunoglobulina, pero exhibe una unión reducida a una porción Fab de la inmunoglobulina en relación con una proteína de unión a inmunoglobulina que incluya alanina o glicina en la posición 29.

Description

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prolina, serina, valina y tirosina. También podrían usarse aminoácidos que no son de origen natural y derivados de aminoácidos que son bien conocidos en la técnica para reemplazar la glicina o la alanina en la posición 29.

En la Tabla I se muestran ejemplos de modificaciones de dominio de SpA. Las proteínas de unión a la inmunoglobulina abarcadas por la presente invención pueden incluir cualquier combinación de uno o más, dos o 5 más, tres o más, cuatro o más, cinco o más, o seis o más dominios (E, D, A, B, C y Z), donde cada dominio incluye una modificación en la posición 29 y donde la glicina o la alanina en la posición 29 se sustituye por un resto de aminoácido distinto de glicina, alanina y triptófano y en algunas realizaciones, otro diferente de glicina, alanina, triptófano y treonina. También se incluyen en la presente invención proteínas de unión a inmunoglobulina que incluyen dos o más dominios del mismo tipo (por ejemplo, dos o más dominios E; dos o más dominios A y dos o más

10 dominios B; dos o más dominios C; y dos o más dominios Z), donde cada dominio incluye una modificación en la posición 29, donde el resto de aminoácido en la posición 29 se reemplaza por un resto de aminoácido distinto de glicina, alanina y triptófano y en algunas realizaciones, distinto de glicina, alanina, triptófano y treonina.

Tabla I

Dominios de SpA que incluyen modificaciones

Denominación

E, D, A, B, C o Z o el dominio de glicina 29 o alanina 29 reemplazada por arginina

E-G29R D-G29R A-G29R B-G29R C-G29R Z-A29R

E, D, A, B, C o Z o el dominio de glicina 29 o alanina 29 reemplazada por asparagina

E-G29N D-G29N A-G29N B-G29N C-G29N Z-A29N

E, D, A, B, C o Z o el dominio de glicina 29 o alanina 29 reemplazada por ácido aspártico

E-G29D D-G29D A-G29D B-G29D C-G29D Z-A29D

E, D, A, B, C o Z o el dominio de glicina 29 o alanina 29 reemplazada por cisteína

E-G29C D-G29C A-G29C B-G29C C-G29C Z-A29C

E, D, A, B, C o Z o el dominio de glicina 29 o alanina 29 reemplazada por glutamina

E-G29Q D-G29Q

Dominios de SpA que incluyen modificaciones

Denominación

A-G29Q B-G29Q C-G29Q Z-A29Q

E, D, A, B, C o Z o el dominio de glicina 29 o alanina 29 reemplazada por ácido glutámico

E-G29E

D-G29E

A-G29E

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E, D, A, B, C o Z o el dominio de glicina 29 o alanina 29 reemplazada por histidina

E-G29H

D-G29H

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E, D, A, B, C o Z o el dominio de glicina 29 o alanina 29 reemplazada por isoleucina

E-G29I

D-G29I

A-G29I

B-G29I

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Z-A29I

E, D, A, B, C o Z o el dominio de glicina 29 o alanina 29 reemplazada por leucina

E-G29L

D-G29L

A-G29L

B-G29L

C-G29L

Z-A29L

E, D, A, B, C o Z o el dominio de glicina 29 o alanina 29 reemplazada por lisina

E-G29K

D-G29K

A-G29K

B-G29K

C-G29K

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Dominios de SpA que incluyen modificaciones

Denominación

E, D, A, B, C o Z o el dominio de glicina 29 o alanina 29 reemplazada por metionina

E-G29M D-G29M A-G29M B-G29M C-G29M Z-A29M

E, D, A, B, C o Z o el dominio de glicina 29 o alanina 29 reemplazada por fenilalanina

E-G29F D-G29F A-G29F B-G29F C-G29F Z-A29F

E, D, A, B, C o Z o el dominio de glicina 29 o alanina 29 reemplazada por prolina

E-G29P D-G29P A-G29P B-G29P C-G29P Z-A29P

E, D, A, B, C o Z o el dominio de glicina 29 o alanina 29 reemplazada por serina

E-G29S D-G29S A-G29S B-G29S

C-G29S Z-A29S

E, D, A, B, C o Z o el dominio de glicina 29 o alanina 29 reemplazada por treonina

E-G29T D-G29T A-G29T B-G29T C-G29T Z-A29T

E, D, A, B, C o el dominio Z de glicina 29 o alanina 29 reemplazado por treonina

E-G29T D-G29T C-G29T Z-A29T

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Dominios de SpA que incluyen modificaciones

Denominación

E, D, A, B, C o Z o el dominio de glicina 29 o alanina 29 reemplazada por tirosina

E-G29Y D-G29Y A-G29Y B-G29Y C-G29Y Z-A29Y

E, D, A, B, C o Z o el dominio de glicina 29 o alanina 29 reemplazada por valina

E-G29V D-G29V A-G29V B-G29V C-G29V Z-A29V

Tal como se utilizan indistintamente en la presente memoria, las expresiones "dominio E", "dominio E de SpA" y "dominio E de proteína A de Staphylococcus" se refieren al polipéptido cuya secuencia de aminoácidos se expone en la SEQ ID NO: 7 o aquel codificado, por ejemplo, por la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 1. El "dominio E" es un polipéptido de 51 aminoácidos que se pliega en una estructura de haz de tres hélices. Es capaz de unirse a Fc a través de restos sobre la superficie de las hélices 1 y 2, o a Fab a través de restos sobre la superficie de las hélices 2 y 3. En algunas realizaciones, un dominio E según la invención es al menos un 70 % idéntico, o al menos un 80 % idéntico, o al menos un 90 % idéntico o al menos un 95 % o más idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 7.

Tal como se utilizan indistintamente en la presente memoria, las expresiones "dominio D", "dominio D de SpA" y "dominio D de proteína A de Staphylococcus" se refieren al polipéptido cuya secuencia de aminoácidos se expone en la SEQ ID NO: 8 o codificado, por ejemplo, por la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 2. El "dominio D" es un polipéptido de 61 aminoácidos que se pliega en una estructura de haz de tres hélices. Es capaz de unirse Fc a través de restos sobre la superficie de las hélices 1 y 2, o a Fab a través de restos sobre la superficie de las hélices 2 y 3. Un dominio D puede ser al menos un 70% idéntico, o al menos un 80 % idéntico, o al menos un 90 % idéntico o al menos un 95 % o más idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 8.

Tal como se utilizan indistintamente en la presente memoria, los términos "dominio A", "dominio A de SpA" y "dominio A de proteína A de Staphylococcus" se refieren al polipéptido cuya secuencia de aminoácidos se expone en la SEQ ID NO: 3 o codificado, por ejemplo, por la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 9. El "dominio A" es un polipéptido de 58 aminoácidos que se pliega en una estructura de haz de tres hélices. Es capaz de unirse Fc a través de restos sobre la superficie de las hélices 1 y 2, o a Fab a través de restos sobre la superficie de las hélices 2 y 3. En algunas realizaciones, un dominio A según la invención es al menos un 70 % idéntico, o al menos un 80 % idéntico, o al menos un 90 % idéntico o al menos un 95 % o más idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 3.

Tal como se utilizan indistintamente en la presente memoria, los términos "dominio B", "dominio B de SpA" y "dominio B de proteína A de Staphylococcus" se refieren al polipéptido cuya secuencia de aminoácidos se expone en la SEQ ID NO: 10 o codificado, por ejemplo, por la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 4. El "dominio B" es un polipéptido de 58 aminoácidos que se pliega en una estructura de haz de tres hélices. Es capaz de unirse Fc a través de restos sobre la superficie de las hélices 1 y 2, o a Fab a través de restos sobre la superficie de las hélices 2 y 3. En algunas realizaciones, un dominio B según la invención es al menos un 70 % idéntico, o al menos un 80 % idéntico, o al menos un 90 % idéntico o al menos un 95 % o más idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 10.

Tal como se utilizan indistintamente en la presente memoria, los términos "dominio C", "dominio C de SpA" y "dominio C de proteína A de Staphylococcus" se refieren al polipéptido cuya secuencia de aminoácidos se expone en la SEQ ID NO: 11 o codificado, por ejemplo, por la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 5. El "dominio C" es un polipéptido de 58 aminoácidos que se pliega en una estructura de haz de tres hélices. Es capaz

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cromatografía en el que el analito que se va a separar se aísla por su interacción con una molécula (por ejemplo, una proteína de unión a inmunoglobulina) que interactúa específicamente con el analito.

II. Estructura de SpA y sitios de unión a Inmunoglobulina

La SpA es una proteína de aproximadamente 42 kDa procedente de la bacteria Staphylococcus aureus y contiene cinco dominios de unión a inmunoglobulina (Ig) extracelulares en tándem altamente homólogos en el extremo Nterminal, denominados E, D, A, B y C. Cada dominio extracelular de SpA posee sitios de unión a Ig distintos. Un sitio es para Fcγ (la región constante de la clase IgG de Ig) y el otro es para la porción Fab de ciertas moléculas de Ig (la porción de Ig que es responsable del reconocimiento del antígeno). Se ha comunicado que cada uno de los dominios contiene un sitio de unión a Fab. La porción de no unión a Ig de SpA está situada en el extremo C-terminal y se denomina región X o dominio X.

La clonación del gen que codifica SpA se describe en la Patente de los Estados Unidos n.º 5.151.350, cuyo contenido completo se incorpora íntegramente a la presente memoria por referencia.

III. Generación y Expresión de Variantes de SpA

Las variantes de SpA de la presente invención pueden generarse mediante cualquier método adecuado conocido en la técnica. Por ejemplo, se pueden usar técnicas estándar para mutagénesis de sitio dirigido de ácidos nucleicos tales como las descritas, por ejemplo, en el manual de laboratorio titulado Molecular Cloning de Sambrook, Fritsch y Maniatis. Adicionalmente, pueden usarse técnicas de biología molecular estándar que implican mutagénesis por reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

En algunas realizaciones, las variantes de SpA se generan usando técnicas de ingeniería genética estándar. Por ejemplo, puede clonarse una molécula de ácido nucleico que codifica un dominio de SpA o partes de la misma en un vector adecuado para la expresión en una célula hospedadora adecuada. Se conocen en la técnica vectores de expresión adecuados e incluyen típicamente los elementos necesarios para la transcripción y traducción de la secuencia codificante de la variante de SpA.

Las variantes de SpA descritas en la presente memoria también pueden sintetizarse químicamente a partir de precursores de aminoácidos para fragmentos usando métodos bien conocidos en la técnica, que incluyen métodos de síntesis de péptidos en fase sólida tales como las estrategias Boc (terc-butiloxicarbonilo) o Fmoc (9fluorenilmetiloxicarbonilo) (véanse, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos n.º 6.060.596; 4.879.378; 5.198.531; y 5.240.680).

La expresión de variantes de SpA se puede conseguir en células hospedadores eucariotas, tales como levaduras, insectos o mamíferos o en células hospedadoras procariotas, por ejemplo, bacterias tales como E. coli.

En algunas realizaciones, las variantes de SpA pueden expresarse en la superficie de un bacteriófago, de manera que cada fago contenga una secuencia de ADN que codifique una variante de SpA individual presentada en la superficie del fago. En esta estrategia, se prepara una biblioteca de variantes de SpA sintetizando oligonucleótidos aleatorios o semi-aleatorios en posiciones seleccionadas en la secuencia de SpA elegida para generar una variedad de aminoácidos en estas posiciones. El ADN codificante se inserta en un vector de fago adecuado, se introduce en una partícula de fago y se utiliza para infectar un hospedador bacteriano adecuado. Después, se clona cada una de las secuencias en un vector de fago y la variante SpA de interés (por ejemplo, que tiene una mutación en la posición 29) puede seleccionarse mediante la búsqueda de esos fagos que se unen a Fc pero no se unen a Fab (por ejemplo, mediante un método conocido como paneo). Los fagos recuperados de esta manera pueden amplificarse y repetirse la selección. Además, los fagos pueden aislarse y la secuencia de nucleótidos que codifica variantes de SpA seleccionadas se determina por secuenciación de nucleótidos.

IV. Unión de variantes de SpA a Fc y Fab

Tras la generación de las variantes de SpA, se determina la especificidad de unión de las variantes de SpA a porciones Fab o Fc de una inmunoglobulina usando técnicas estándar en la técnica y aquéllas descritas en la presente memoria.

Por ejemplo, la variante SpA se puede construir con una etiqueta de histidina (etiqueta (His)6) para su inmovilización por cromatografía de afinidad de níquel. La SpA unida a níquel puede entonces ensayarse respecto de la unión a Fc y Fab añadiendo los fragmentos adecuados a la resina. El material no unido se elimina por lavado y se detectan Fc y Fab en la muestra de elución mediante electroforesis en gel.

Como alternativa, la unión de Fc y Fab se puede medir por análisis de resonancia de plasmón superficial. La variante de SpA se inmoviliza en una microplaca usando química de amina reactiva, y el fragmento Fc o Fab se hace fluir sobre la microplaca. Si el Fc o Fab se une, se observa un aumento en la señal de resonancia de plasmón superficial.

La SpA también puede inmovilizarse en perlas de cromatografía. La unión de Fc o Fab se observa comparando los

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picos de flujo y elución para la resina de SpA.

V. Uso de SpA y sus variantes para matrices de cromatografía de enmascaramiento

La presente invención también proporciona un método para preparar una matriz de cromatografía que comprenda al menos una proteína de unión a inmunoglobulina con afinidad por la parte Fc de un anticuerpo y que tenga afinidad reducida o nula para la porción Fab del anticuerpo. En una realización, dicho método comprende: (a) proporcionar una secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio de SpA aislado (por ejemplo E, A o B); (b) mutar la secuencia de ácido nucleico para codificar una proteína variante en la que al menos la glicina en la posición 29 haya sido reemplazada por un aminoácido distinto de alanina o triptófano; (c) expresar la variante de la proteína en una célula hospedadora (por ejemplo, una célula procariótica o una célula eucariota adecuada); (d) recuperar la variante proteica de la célula hospedadora; y (e) acoplar la variante proteica a un soporte sólido.

Las matrices de soporte sólidas incluyen, pero sin limitación, vidrio de poro controlado, agarosa, metacrilato y poliestireno. La proteína se puede acoplar a la matriz, por ejemplo, por reacción química de amina reactiva o de tiol reactivo.

Esta invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos que no deben ser interpretados como limitantes. Los contenidos de todas las referencias, patentes y solicitudes de patente publicadas citadas a lo largo de esta solicitud, así como las figuras, se incorporan a la presente memoria por referencia.

Ejemplos

Ejemplo 1: Construcción de vectores que contienen variantes de SpA

Se sintetiza un gen que codifica el "dominio B" de proteína A mediante un método estándar utilizando un sintetizador de ADN. El extremo 5' del gen incluye un codón para una metionina de iniciación así como seis codones de histidina en el extremo 3' del gen. El gen se proporciona en el vector pJ56:8620. El vector parental pJ56 confiere resistencia a ampicilina, kanamicina, cloranfenicol y gentamicina. Se introducen en ambos extremos 5' y 3' del gen los sitios para enzimas de restricción adecuados para la posterior clonación del gen en vectores de expresión. En la figura 5 se muestra un mapa de plásmido del vector.

La glicina en la posición 29 se muta a cada uno de los otros 19 aminoácidos por métodos basados en la PCR usando la ADN polimerasa de alta fidelidad Phusion (New England Biolabs, Ipswich, MA). Los cebadores fosforilados se adquieren a través de IDT DNA (Coralville, IA), como solución 100 μM en tampón Tris EDTA. El cebador mutagénico tiene la secuencia: 5'(P)GAAGAACAACGCAACNNNTTCATTCAGA (SEQ ID NO: 19) donde NNN representa las bases que codifican el aminoácido en la posición 29. El cebador no mutagénico tiene la secuencia 5'(P)GTTCAGGTTCGGCAGATGCAGGAT (SEQ ID NO: 20). La PCR se realiza en reacciones de 50 μl que contienen dNTP (cada uno, 0,2 mM), 0,5 mM de cada cebador, 10 pg de molde de plásmido y 1 U de enzima Phusion. La PCR se lleva a cabo de acuerdo con el esquema señalado en la Tabla II.

Tabla II: condiciones de la PCR

Descripción del ciclo

Temperatura Tiempo N.º de ciclos

Desnaturalización inicial

98 °C 30 segundos 1 ciclo

Desnaturalización

98 °C 30 segundos 25 ciclos

Hibridación

56 °C 30 segundos

Extensión

72 °C 2 minutos

Extensión final

98 °C 10 minutos 1 ciclo

4 °C

Retención

Las reacciones de PCR se tratan con la enzima de restricción DpnI (New England Biolabs, Ipswich, MA) para reducir el fondo de tipo silvestre. A cada reacción de PCR de 50 μl, se le añaden aproximadamente 1 μl de enzima Dpnl y las muestras se incuban durante aproximadamente una hora a 37 °C.

Las células competentes de E. coli (New England Biolabs, Ipswich, MA) se transforman con 2 μl de la reacción de PCR tratada con Dpnl. Las células se descongelan sobre hielo y se añaden 2 μl de la reacción de PCR a 25 μl de células. Después de aproximadamente 30 minutos de incubación en hielo, las células se someten a choque térmico durante 30 segundos a aproximadamente 42 °C. Se deja que las células se recuperen durante aproximadamente 5 minutos sobre hielo y luego se añaden 125 μl de medio SOC (New England BioLabs). Las células se incuban durante aproximadamente una hora a 37 °C y después se siembran 100 μl en placas LB (Northeast Laboratory

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Services, Winslow, ME) que contienen 100 μg/ml de ampicilina y se cultivan durante una noche a aproximadamente 37 °C. Con el fin de obtener ADN purificado, se escogen colonias individuales para su cultivo durante una noche en LB que contiene 100 μg/ml de ampicilina. El ADN se purifica utilizando kits spin mini-prep de Qiagen (Valencia, CA). El cebador pJR (5' GAATATGGCTCATAACACCCCTTG) (SEQ ID NO: 21) se utiliza para secuenciar el ADN minipreparado para confirmar la identidad de cada clon (MWG Biotech, Huntsville AL).

Tras la confirmación de secuencia de los diversos clones, el gen para cada variante de SpA se subclona en un plásmido para la expresión de la variante en células bacterianas. El plásmido se digiere con las enzimas de restricción adecuadas (New England Biolabs, Ipswich, MA) y el inserto se purifica en gel con geles Reliant FastLane de agarosa al 1% (Lonza Inc., Allendale, NJ). La banda correspondiente se corta del gel y se purifica usando el kit de extracción de gel de Qiagen (Valencia, CA). El inserto purificado se liga a la cadena principal de un vector de expresión adecuado usando T4 ADN ligasa (New England Biolabs, Ipswich, MA). El plásmido resultante se utiliza para transformar células competentes de E. coli NEB5α como se ha descrito anteriormente.

Ejemplo 2: Expresión y purificación de variantes de proteína A

Puede utilizarse cualquier sistema de expresión bacteriana adecuado para expresar las diversas variantes de SpA. Por ejemplo, la proteína puede expresarse en Escherichia coli, tal como la cepa BL21 (DE3) (Promega, Madison WI) a partir de un vector pET, tal como pET11a (Novagen, Madison WI). Se recoge una sola colonia de una placa y se cultiva durante ima noche a aproximadamente 37 °C en medio LB que contiene 100 µg/ml de ampicilina. El cultivo de una noche se diluye 100 veces en medio LB fresco que contiene 100 μg/ml de ampicilina y se cultiva hasta una densidad celular tal que la densidad óptica a 600 nm es ~0,8. Después de la adición de isopropil-beta-Dtiogalactopiranósido 1 mM, las células se cultivan durante dos horas adicionales. La expresión se confirma mediante análisis SDS-PAGE y de transferencia de Western. En la Figura 8 se muestra un ejemplo de transferencia de Western de proteína A, que muestra que la expresión de la proteína A del vector PET11a:8620 en células E. coli BL21 (DE3) se detecta usando un anticuerpo de IgY de pollo anti-proteína A.

Las células se recogen mediante centrifugación (4000 rpm, 4 °C, 5 minutos) y se resuspenden en 3 ml de solución salina tamponada con fosfato que contiene imidazol 20 mM. Las células se lisan por sonicación y los restos celulares se sedimentan por centrifugación (4000 rpm, 4 °C, 30 minutos). Las variantes de SpA se purifican utilizando columnas de centrifugación NiNTA (Qiagen), aplicando 400 μl de lisado celular por columna de centrifugación. Las columnas se lavan con 2 x 600 μl de solución salina tamponada con fosfato que contiene imidazol 20 mM y la SpA se eluye en 2 x 200 μl de solución salina tamponada con fosfato que contiene imidazol 200 mM. La SpA se dializa durante una noche en PBS. La concentración de proteína se confirma usando el ensayo de proteína Dc (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) con respecto a una curva patrón preparada con albúmina de suero bovino.

Ejemplo 3: Unión de variantes de SpA a fragmentos Fc y Fab

Posteriormente, se prueba en cada variante de SpA la capacidad de unirse a Fc y Fab usando resina de agarosa NiNTA (Qiagen). Los fragmentos Fc y F(ab)2 se obtienen de Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA). Cada variante de SpA se diluye a una concentración de 0,11 mg/ml, el Fc se diluye a una concentración de 0,44 mg/ml y el F(ab)2 se diluye a una concentración de 0,92 mg/ml en solución salina tamponada con fosfato que contiene imidazol 20 mM. La resina de agarosa NiNTA se resuspende y se pipetean aproximadamente 20 μl de la suspensión de resina en un tubo de microcentrifugación de 0,5 ml. Posteriormente, se sedimenta la resina y se desecha el sobrenadante. La resina se lava con aproximadamente 100 μl de PBS con imidazol 20 mM, se incuba a temperatura ambiente durante aproximadamente 15 minutos y se sedimenta de nuevo. El sobrenadante se desecha. Se cargan aproximadamente 250 μl de cada variante de SpA a 0,11 mg/ml o de cada control de PBS sobre la columna de resina por duplicado y se incuban durante aproximadamente 30 minutos a temperatura ambiente. La resina se sedimenta posteriormente y el sobrenadante se conserva para su análisis. El sedimento se lava tres veces con 100 μl de PBS más imidazol 20 mM cada vez, se incuba durante 5 minutos y se sedimenta de nuevo. El sobrenadante se desecha. Se prueba la unión de aproximadamente 100 μl de Fc o F(ab)2 con cada una de las variantes de SpA o el control de PBS incubando con la resina durante aproximadamente 30 minutos. La resina se sedimenta posteriormente y el sobrenadante se guarda para su análisis. La resina se lava de nuevo tres veces con unos 100 μl de PBS más imidazol 20 mM cada vez, se incuba durante 5 minutos y se sedimenta de nuevo. Esta vez se desecha el sobrenadante. La fracción unida se eluye con aproximadamente 100 μl de PBS más imidazol 20 mM, se incuba durante aproximadamente 15 minutos y se sedimenta. El sobrenadante se conserva para su posterior análisis. Las muestras se analizan posteriormente mediante SDS-PAGE en geles de gradiente al 4-15 % adquiridos a través de Bio-Rad Laboratories, CA, como se ilustra en las figuras 9-12.

Se prueba la unión de cinco variantes de la proteína A a Fc y F(ab)2 mediante análisis de biosensor de resonancia de plasmón superficial. Todos los experimentos se llevan a cabo en solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contiene Tween-20 al 0,005%. Las variantes de la proteína A se inmovilizan en una microplaca de sensor ProteOn GLC (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) mediante química de amina, con acoplamiento a un nivel de 500 UR. Se preparan tres diluciones seriadas de fragmentos Fc y F(ab)2 (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA), con concentraciones de proteínas en el intervalo de 45 nM a 185 pM, y cada concentración se analiza por duplicado. Cada concentración de Fc o F (ab)2 se inyecta durante 250 segundos, seguido por 3,5 horas de PBS para medir las velocidades de disociación. Los datos se ajustan a un modelo heterogéneo de dos sitios para obtener

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velocidades de asociación y disociación (kon y koff). Como se representa en las Figuras 13A-13E, la proteína con glicina 29 de tipo silvestre y cada una de G29A, G29R, G29K y G29L se unen a Fc. Las Figuras 14A-14E observa que la G29 de tipo silvestre se une a Fab y que G29A muestra una unión a F(ab)2 débil pero detectable. No se observa unión a F(ab)2 para G29R, G29K o G29L.

La unión a Fc y Fab también se evalúa después de la inmovilización de las variantes de SpA sobre resinas de cromatografía. Se funcionalizan perlas de vidrio de poro controlado (50 ml cada una, tamaño medio de partícula de 60 µm, diámetro medio de poro de 800 Å) con proteína A o variante de proteína A según el método para acoplar la proteína A a un soporte sólido descrito en la Solicitud Internacional PCT n.º WO 90/09237, cuyo contenido completo se incorpora por referencia a la presente memoria. Después del acoplamiento del ligando, las muestras se lavan tres veces con 150 ml de volumen de cada una (en orden): Tris 0,1 M con NaCl 0,15 M, pH 8 seguido de ácido acético 0,05 M. Posteriormente, las muestras se equilibran y se almacenan en PBS con azida.

Las resinas de afinidad de vidrio de poro controlado inmovilizadas con el ligando correspondiente se envasan en columnas OmniFit de 6,6 mm de di x 70 mm de l. Los tampones usados en el experimento son: (A) tampón fosfato de sodio 50 mM, pH 7,2; y (B) fosfato de sodio 50 mM, pH 2, y el caudal es de 1,2 ml/min. Después de equilibrar la columna en el tampón de partida A, se inyectan en la columna 100 μl de F(ab)2 o Fc a 1-2 mg/ml (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) en tampón A. Después de 10 volúmenes de columna (VC) del tampón A, el tampón B se mezcla en más de 20 VC en un gradiente lineal. Se hacen pasar diez volúmenes de columna más de tampón B por la columna antes de que la columna se regenerara mediante 2 VC de hidrocloruro de guanidina 6 M. Como se representa en las Figuras 15A y 15B, la proteína con glicina 29 de tipo silvestre y cada una de G29A, G29R, G29K y G29L se unen a Fc. Se observa que la G29 de tipo silvestre se une a Fab y G29A muestra una unión a F(ab)2 débil pero detectable. No se observa unión a F(ab)2 para G29R, G29K o G29L.

En otro experimento ilustrativo, se ensaya un conjunto completo de variantes de la proteína A para determinar la unión a Fc y Fab mediante su captura en resina de agarosa NiNTA (Qiagen). Brevemente, se añaden en exceso a la resina variantes de la proteína A marcadas con His con una sustitución de aminoácidos en la posición 29 de la SpAts, la resina se lava con PBS que contiene imidazol 20 mM seguido de la adición de la porción Fc o Fab de una inmunoglobulina. La resina se lava de nuevo con PBS que contiene imidazol 20 mM, seguido de elución de fragmentos de SpA e IgG con PBS que contiene imidazol 200 mM. Las fracciones de elución resultantes se analizan en un gel de gradiente al 4-20 % (BioRad) seguido de tinción con azul de Commassie (Pierce). Se usa resina sin proteína A como control negativo. Los resultados de un experimento ejemplar se resumen a continuación en la tabla

III. Aunque no se observa diferencia aparente en la unión a Fc entre las diferentes variantes, la unión a Fab está marcadamente reducida para la mayoría de las variantes. La mayoría de las variantes muestran una unión a Fab que es un 15 % menor en comparación con el tipo silvestre. Se observa una unión residual a Fab del 24 % o más para tres de las variantes (G29A, G29T y G29W).

Tabla III

Variante

Unión a Fab cuantificada por densitometría (porcentaje de glicina de tipo silvestre)

TS

100

G29K

4

G29R

9

G29L

7

G29A

24

G29C

5

G29D

8

G29E

11

G29F

7

G29H

5

G29I

8

G29M

9

G29N

8

G29P

14

5

10

15

20

25

30

Variante

Unión a Fab cuantificada por densitometría (porcentaje de glicina de tipo silvestre)

G29Q

11

G29S

8

G29T

37

G29V

10

G29W

66

G29Y

11

control

11

La memoria descriptiva se entiende mejor a la luz de las enseñanzas de las referencias citadas dentro de la memoria descriptiva, que se incorporan a la presente memoria por referencia. Las realizaciones en la memoria descriptiva proporcionan una ilustración de realizaciones en esta invención y no deben interpretarse como limitativas de su alcance. El experto en la materia reconoce fácilmente que muchas otras realizaciones están abarcadas por esta invención. Todas las publicaciones e invenciones se incorporan por referencia en su totalidad. En la medida en que el material incorporado por referencia contradice o sea incompatible con la presente memoria descriptiva, la presente memoria descriptiva reemplazará cualquier material de este tipo. La cita de cualquiera de las referencias en la presente memoria no es una admisión de que dichas referencias sean técnica anterior respecto de la presente invención.

Salvo que se indique lo contrario, todos los números que expresan cantidades de ingredientes, cultivo celular, condiciones de tratamiento, y así sucesivamente, utilizados en la memoria descriptiva, incluyendo las reivindicaciones, deben entenderse como modificados en todos los casos por el término "aproximadamente". Por consiguiente, a menos que se indique lo contrario, los parámetros numéricos son aproximaciones y pueden variar dependiendo de las propiedades deseadas que se pretenden obtener mediante la presente invención. A menos que se indique lo contrario, debe entenderse que la expresión "al menos" precediendo a una serie de elementos se refiere a cada elemento de la serie. Los expertos en la técnica reconocerán, o serán capaces de determinar, utilizando no más que la experimentación rutinaria, muchos equivalentes a las realizaciones específicas de la invención descritas en la presente memoria. Dichos equivalentes están destinados a ser abarcados por las reivindicaciones más adelante.

Pueden hacerse muchas modificaciones y variaciones de esta invención, sin salirse de su espíritu y alcance, como será evidente para los expertos en la materia. Las realizaciones específicas descritas en la presente memoria se ofrecen únicamente a modo de ejemplo y no pretenden ser limitativas de ninguna manera. Se pretende que la memoria descriptiva y los ejemplos se consideren únicamente como ilustrativos, indicándose el un verdadero alcance y espíritu de la invención mediante las siguientes reivindicaciones. En particular, las diversas realizaciones descritas en la presente memoria pueden combinarse, a menos que se indique lo contrario o que sea técnicamente contradictorio.

Referencias:

Unión a Fab: Melissa A. Starovasnik, Mark P. O'connell, Wayne J. Fairbrother, y Robert F. Kelley (1999). Antibody variable region binding by Staphylococcal protein A: Thermodynamic analysis and location of the Fv binding site on E-domain. Protein Science 8, 1423-1431.

Unión constante a Fc: Susanne Gülich, Mathias Uhlén, Sophia Hober (2000) Protein engineering of an IgG-binding domain allows milder elution conditions during affinity chromatography. Journal of Biotechnology 76, 233-244

Claims (1)

1. imagen1