ES2612138T3

ES2612138T3 - Nuevas proteínas de unión a inmunoglobulina con especificidad mejorada

Info

Publication number: ES2612138T3
Application number: ES12163614.6T
Authority: ES
Inventors: Shari Spector
Original assignee: EMD Millipore Corp
Current assignee: EMD Millipore Corp
Priority date: 2008-08-11
Filing date: 2009-08-11
Publication date: 2017-05-12
Anticipated expiration: 2029-08-11
Also published as: EP2495253A1; ES2612166T3; JP2016121152A; CN101704879B; EP2495253B1; EP2495254A1; US8592555B2; US20100063256A1; EP2495254B1; JP2010075175A; US20140046037A1; CN101704879A; CN104804073A; EP2157099A1; CN104804073B; CN104163866A; ES2612114T3; SG159458A1; IN2015DE00245A; JP5913202B2

Abstract

Una proteína aislada de unión a inmunoglobulina que comprende uno o más dominios C aislados de la proteína A de Staphyloccocus, en donde los uno o más dominios C aislados comprenden la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 11 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 % de identidad con la misma en donde al menos el resto de glicina en la posición 29 se reemplaza por un resto de aminoácido distinto de la alanina, treonina o triptófano, en donde la proteína de unión a inmunoglobulina se une a una porción Fc de una inmunoglobulina, pero exhibe una unión reducida a una porción Fab de la inmunoglobulina en relación con una proteína de unión a inmunoglobulina que incluya alanina o glicina en la posición 29.

Description

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Dominios de SpA que incluyen modificaciones: Denominación

C-G29N Z-A29N

E, D, A, B, C o Z o el dominio de glicina 29 o alanina 29 reemplazada por ácido aspártico: E-G29D D-G29D A-G29D B-G29D C-G29D Z-A29D

E, D, A, B, C o Z o el dominio de glicina 29 o alanina 29 reemplazada por cisteína: E-G29C D-G29C A-G29C B-G29C C-G29C Z-A29C

E, D, A, B, C o Z o el dominio de glicina 29 o alanina 29 reemplazada por glutamina: E-G29Q D-G29Q A-G29Q B-G29Q C-G29Q Z-A29Q

E, D, A, B, C o Z o el dominio de glicina 29 o alanina 29 reemplazada por ácido glutámico: E-G29E D-G29E A-G29E B-G29E C-G29E Z-A29E

E, D, A, B, C o Z o el dominio de glicina 29 o alanina 29 reemplazada por histidina: E-G29H D-G29H A-G29H B-G29H C-G29H Z-A29H

E, D, A, B, C o Z o el dominio de glicina 29 o alanina 29 reemplazada por isoleucina: E-G29I D-G29I

Dominios de SpA que incluyen modificaciones: Denominación

A-G29I B-G29I C-G29I Z-A29I

E, D, A, B, C o Z o el dominio de glicina 29 o alanina 29 reemplazada por leucina: E-G29L

D-G29L

A-G29L

B-G29L

C-G29L

Z-A29L

E, D, A, B, C o Z o el dominio de glicina 29 o alanina 29 reemplazada por lisina: E-G29K

D-G29K

A-G29K

B-G29K

C-G29K

Z-A29K

E, D, A, B, C o Z o el dominio de glicina 29 o alanina 29 reemplazada por metionina: E-G29M

D-G29M

A-G29M

B-G29M

C-G29M

Z-A29M

E, D, A, B, C o Z o el dominio de glicina 29 o alanina 29 reemplazada por fenilalanina: E-G29F

D-G29F

A-G29F

B-G29F

C-G29F

Z-A29F

E, D, A, B, C o Z o el dominio de glicina 29 o alanina 29 reemplazada por prolina: E-G29P

D-G29P

A-G29P

B-G29P

C-G29P

Z-A29P

Dominios de SpA que incluyen modificaciones: Denominación

E, D, A, B, C o Z o el dominio de glicina 29 o alanina 29 reemplazada por serina: E-G29S

D-G29S

A-G29S

B-G29S

C-G29S

E, D, A, B, C o Z o el dominio de glicina 29 o alanina 29 reemplazada por treonina: Z-A29S

E-G29T

D-G29T

A-G29T

B-G29T

C-G29T

Z-A29T

E, D, A, B, C o Z o el dominio de glicina 29 o alanina 29 reemplazada por tirosina: E-G29Y

D-G29Y

A-G29Y

B-G29Y

C-G29Y

Z-A29Y

E, D, A, B, C o Z o el dominio de glicina 29 o alanina 29 reemplazada por valina: E-G29V

D-G29V

A-G29V

B-G29V

C-G29V

Z-A29V

Tal como se utilizan indistintamente en la presente memoria, las expresiones "dominio E", "dominio E de SpA" y "dominio E de proteína A de Staphylococcus" se refieren al polipéptido cuya secuencia de aminoácidos se expone en la SEQ ID NO: 7 o aquel codificado, por ejemplo, por la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 1.

5 El "dominio E" es un polipéptido de 51 aminoácidos que se pliega en una estructura de haz de tres hélices. Es capaz de unirse a Fc a través de restos sobre la superficie de las hélices 1 y 2, o a Fab a través de restos sobre la superficie de las hélices 2 y 3. En algunas realizaciones, un dominio E descrito en la presente memoria es al menos un 70 % idéntico, o al menos un 80 % idéntico, o al menos un 90 % idéntico o al menos un 95 % o más idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 7.

10 Tal como se utilizan indistintamente en la presente memoria, las expresiones "dominio D", "dominio D de SpA" y "dominio D de proteína A de Staphylococcus" se refieren al polipéptido cuya secuencia de aminoácidos se expone en la SEQ ID NO: 8 o codificado, por ejemplo, por la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 2. El "dominio D" es un polipéptido de 61 aminoácidos que se pliega en una estructura de haz de tres hélices. Es capaz de unirse Fc a través de restos sobre la superficie de las hélices 1 y 2, o a Fab a través de restos sobre la superficie

15 de las hélices 2 y 3. En algunas realizaciones, un dominio D descrito en la presente memoria es al menos un 70% idéntico, o al menos un 80 % idéntico, o al menos un 90 % idéntico o al menos un 95 % o más idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 8.

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variante de SpA se diluye a una concentración de 0,11 mg/ml, el Fc se diluye a una concentración de 0,44 mg/ml y el F(ab)2 se diluye a una concentración de 0,92 mg/ml en solución salina tamponada con fosfato que contiene imidazol 20 mM. La resina de agarosa NiNTA se resuspende y se pipetean aproximadamente 20 μl de la suspensión de resina en un tubo de microcentrifugación de 0,5 ml. Posteriormente, se sedimenta la resina y se desecha el sobrenadante. La resina se lava con aproximadamente 100 μl de PBS con imidazol 20 mM, se incuba a temperatura ambiente durante aproximadamente 15 minutos y se sedimenta de nuevo. El sobrenadante se desecha. Se cargan aproximadamente 250 μl de cada variante de SpA a 0,11 mg/ml o de cada control de PBS sobre la columna de resina por duplicado y se incuban durante aproximadamente 30 minutos a temperatura ambiente. La resina se sedimenta posteriormente y el sobrenadante se conserva para su análisis. El sedimento se lava tres veces con 100 μl de PBS más imidazol 20 mM cada vez, se incuba durante 5 minutos y se sedimenta de nuevo. El sobrenadante se desecha. Se prueba la unión de aproximadamente 100 μl de Fc o F(ab)2 con cada una de las variantes de SpA o el control de PBS incubando con la resina durante aproximadamente 30 minutos. La resina se sedimenta posteriormente y el sobrenadante se guarda para su análisis. La resina se lava de nuevo tres veces con unos 100 μl de PBS más imidazol 20 mM cada vez, se incuba durante 5 minutos y se sedimenta de nuevo. Esta vez se desecha el sobrenadante. La fracción unida se eluye con aproximadamente 100 μl de PBS más imidazol 20 mM, se incuba durante aproximadamente 15 minutos y se sedimenta. El sobrenadante se conserva para su posterior análisis. Las muestras se analizan posteriormente mediante SDS-PAGE en geles de gradiente al 4-15 % adquiridos a través de Bio-Rad Laboratories, CA, como se ilustra en las figuras 9-12.

Se prueba la unión de cinco variantes de la proteína A a Fc y F(ab)2 mediante análisis de biosensor de resonancia de plasmón superficial. Todos los experimentos se llevan a cabo en solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contiene Tween-20 al 0,005%. Las variantes de la proteína A se inmovilizan en una microplaca de sensor ProteOn GLC (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) mediante química de amina, con acoplamiento a un nivel de 500 UR. Se preparan tres diluciones seriadas de fragmentos Fc y F(ab)2 (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA), con concentraciones de proteínas en el intervalo de 45 nM a 185 pM, y cada concentración se analiza por duplicado. Cada concentración de Fc o F (ab)2 se inyecta durante 250 segundos, seguido por 3,5 horas de PBS para medir las velocidades de disociación. Los datos se ajustan a un modelo heterogéneo de dos sitios para obtener velocidades de asociación y disociación (kon y koff). Como se representa en las Figuras 13A-13E, la proteína con glicina 29 de tipo silvestre y cada una de G29A, G29R, G29K y G29L se unen a Fc. Las Figuras 14A-14E observa que la G29 de tipo silvestre se une a Fab y que G29A muestra una unión a F(ab)2 débil pero detectable. No se observa unión a F(ab)2 para G29R, G29K o G29L.

La unión a Fc y Fab también se evalúa después de la inmovilización de las variantes de SpA sobre resinas de cromatografía. Se funcionalizan perlas de vidrio de poro controlado (50 ml cada una, tamaño medio de partícula de 60 µm, diámetro medio de poro de 800 Å) con proteína A o variante de proteína A según el método para acoplar la proteína A a un soporte sólido descrito en la Solicitud Internacional PCT n.º WO 90/09237. Después del acoplamiento del ligando, las muestras se lavan tres veces con 150 ml de volumen de cada una (en orden): Tris 0,1 M con NaCl 0,15 M, pH 8 seguido de ácido acético 0,05 M. Posteriormente, las muestras se equilibran y se almacenan en PBS con azida.

Las resinas de afinidad de vidrio de poro controlado inmovilizadas con el ligando correspondiente se envasan en columnas OmniFit de 6,6 mm de di x 70 mm de l. Los tampones usados en el experimento son: (A) tampón fosfato de sodio 50 mM, pH 7,2; y (B) fosfato de sodio 50 mM, pH 2, y el caudal es de 1,2 ml/min. Después de equilibrar la columna en el tampón de partida A, se inyectan en la columna 100 μl de F(ab)2 o Fc a 1-2 mg/ml (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) en tampón A. Después de 10 volúmenes de columna (VC) del tampón A, el tampón B se mezcla en más de 20 VC en un gradiente lineal. Se hacen pasar diez volúmenes de columna más de tampón B por la columna antes de que la columna se regenerara mediante 2 VC de hidrocloruro de guanidina 6 M. Como se representa en las Figuras 15A y 15B, la proteína con glicina 29 de tipo silvestre y cada una de G29A, G29R, G29K y G29L se unen a Fc. Se observa que la G29 de tipo silvestre se une a Fab y G29A muestra una unión a F(ab)2 débil pero detectable. No se observa unión a F(ab)2 para G29R, G29K o G29L.

En otro experimento ilustrativo, se ensaya un conjunto completo de variantes de la proteína A para determinar la unión a Fc y Fab mediante su captura en resina de agarosa NiNTA (Qiagen). Brevemente, se añaden en exceso a la resina variantes de la proteína A marcadas con His con una sustitución de aminoácidos en la posición 29 de la SpAts, la resina se lava con PBS que contiene imidazol 20 mM seguido de la adición de la porción Fc o Fab de una inmunoglobulina. La resina se lava de nuevo con PBS que contiene imidazol 20 mM, seguido de elución de fragmentos de SpA e IgG con PBS que contiene imidazol 200 mM. Las fracciones de elución resultantes se analizan en un gel de gradiente al 4-20 % (BioRad) seguido de tinción con azul de Commassie (Pierce). Se usa resina sin proteína A como control negativo. Los resultados de un experimento ejemplar se resumen a continuación en la tabla

III. Aunque no se observa diferencia aparente en la unión a Fc entre las diferentes variantes, la unión a Fab está marcadamente reducida para la mayoría de las variantes. La mayoría de las variantes muestran una unión a Fab que es un 15 % menor en comparación con el tipo silvestre. Se observa una unión residual a Fab del 24 % o más para tres de las variantes (G29A, G29T y G29W).

Tabla III

Variante: Unión a Fab cuantificada por densitometría (porcentaje de glicina de tipo silvestre)

TS: 100

G29K: 4

G29R: 9

G29L: 7

G29A: 24

G29C: 5

G29D: 8

G29E: 11

G29F: 7

G29H: 5

G29I: 8

G29M: 9

G29N: 8

G29P: 14

G29Q: 11

G29S: 8

G29T: 37

G29V: 10

G29W: 66

G29Y: 11

control: 11

La memoria descriptiva se entiende mejor a la luz de las enseñanzas de las referencias citadas dentro de la memoria descriptiva. Las realizaciones en la memoria descriptiva proporcionan una ilustración de realizaciones en

5 esta invención y no deben interpretarse como limitativas de su alcance. El experto en la materia reconoce fácilmente que muchas otras realizaciones están abarcadas por esta invención. La cita de cualquiera de las referencias en la presente memoria no es una admisión de que dichas referencias sean técnica anterior respecto de la presente invención.

Salvo que se indique lo contrario, todos los números que expresan cantidades de ingredientes, cultivo celular,

10 condiciones de tratamiento, y así sucesivamente, utilizados en la memoria descriptiva, incluyendo las reivindicaciones, deben entenderse como modificados en todos los casos por el término "aproximadamente". Por consiguiente, a menos que se indique lo contrario, los parámetros numéricos son aproximaciones y pueden variar dependiendo de las propiedades deseadas que se pretenden obtener mediante la presente invención. A menos que se indique lo contrario, debe entenderse que la expresión "al menos" precediendo a una serie de elementos se

15 refiere a cada elemento de la serie. Los expertos en la técnica reconocerán, o serán capaces de determinar, utilizando no más que la experimentación rutinaria, muchos equivalentes a las realizaciones específicas de la invención descritas en la presente memoria. Dichos equivalentes están destinados a ser abarcados por las reivindicaciones más adelante.

Pueden hacerse muchas modificaciones y variaciones de esta invención, como será evidente para los expertos en la

20 materia. Las realizaciones específicas descritas en la presente memoria se ofrecen únicamente a modo de ejemplo y no pretenden ser limitativas de ninguna manera. Se pretende que la memoria descriptiva y los ejemplos se consideren únicamente como ilustrativos, indicándose el un verdadero alcance y espíritu de la invención mediante

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las siguientes reivindicaciones. En particular, las diversas realizaciones descritas en la presente memoria pueden combinarse, a menos que se indique lo contrario o que sea técnicamente contradictorio.

Referencias:

Unión a Fab: Melissa A. Starovasnik, Mark P. O'connell, Wayne J. Fairbrother, y Robert F. Kelley (1999). Antibody variable region binding by Staphylococcal protein A: Thermodynamic analysis and location of the Fv binding site on E-domain. Protein Science 8, 1423-1431. Unión constante a Fc: Susanne Gülich, Mathias Uhlén, Sophia Hober (2000) Protein engineering of an IgG-binding domain allows milder elution conditions during affinity chromatography. Journal of Biotechnology 76, 233-244

5.: La proteína de unión a inmunoglobulina del párrafo 4, en donde la asparagina está en la posición 23.

6.: La proteína de unión a inmunoglobulina de uno cualquiera de los párrafos 1 a 5, en donde la inmunoglobulina es una IgG o un fragmento de la misma.

7.: La proteína de unión a inmunoglobulina de cualquiera de los párrafos 1 a 6, en donde la porción Fc de la inmunoglobulina es parte de una proteína de fusión de Fc.

8.: Una proteína aislada de unión a inmunoglobulina que comprende uno o más dominios E, D, A, B, C o Z aislados de la proteína A de Staphyloccocus, en donde los uno o más dominios aislados comprenden: (I) al menos el resto de glicina en la posición 29 reemplazado por un resto de aminoácido distinto de alanina cuando el dominio es E, D, A, B o C o (ii) al menos la alanina en la posición 29 reemplazada por un aminoácido distinto de glicina cuando el dominio es el dominio Z, en donde la proteína de unión a inmunoglobulina se une a una porción Fc de una inmunoglobulina y muestra una mayor unión a una porción Fab de la inmunoglobulina en relación con una proteína de unión a inmunoglobulina que incluya alanina en la posición 29.

9.: La proteína de unión a inmunoglobulina aislada del párrafo 8, en donde al menos la glicina en la posición 29 o la alanina en la posición 29 se reemplaza por una treonina o un triptófano.

10.: La proteína de unión a inmunoglobulina del párrafo 8 o 9, en donde la inmunoglobulina se selecciona del grupo que consiste en IgG, IgA o IgM, o un fragmento de la misma.

11.: Una biblioteca de polipéptidos que comprende la proteína de unión a inmunoglobulina de uno cualquiera de los párrafos 1 a 10.

12.: Una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína de unión a inmunoglobulina de uno cualquiera de los párrafos 1 a 10.

13.: Una célula hospedadora que comprende la molécula de ácido nucleico del párrafo 12.

14.: Una matriz de cromatografía que comprende la proteína de unión a inmunoglobulina aislada de uno cualquiera de los párrafos 1 a 10 acoplada a un soporte sólido.

15.: Un método de purificación por afinidad de una o más inmunoglobulinas de una muestra, comprendiendo el método las etapas de:

(a): proporcionar una muestra que comprende una o más inmunoglobulinas;

(b): poner en contacto la muestra con la matriz del párrafo 14 en condiciones tales que una o más inmunoglobulinas se unan a la matriz; y

(c): recuperar una o más inmunoglobulinas unidas mediante elución en condiciones adecuadas.

Claims

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