JP2009195184A - IgG−Fab断片抗体結合性ペプチド - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 ヒトIgG−Fab断片抗体およびIgG−Fab断片抗体誘導体に結合活性を有するポリペプチドを設計考案し、該ポリペプチドを取得した。また、該ポリペプチドを水不溶性担体に固定化したことを特徴とするヒトIgG−Fab断片抗体またはIgG−Fab断片抗体誘導体の吸着材料、およびヒトIgG−Fab断片抗体またはIgG−Fab断片抗体誘導体を分離精製する方法を考案した。また、遺伝子組換え細胞を用いて、該ポリペプチドを製造する方法を考案した。
【選択図】 なし
Description
A=Ala=アラニン、C=Cys=システイン、
D=Asp=アスパラギン酸、E=Glu=グルタミン酸、
F=Phe=フェニルアラニン、G=Gly=グリシン、
H=His=ヒスチジン、I=Ile=イソロイシン、
K=Lys=リシン、L=Leu=ロイシン、
M=Met=メチオニン、N=Asn=アスパラギン、
P=Pro=プロリン、Q=Gln=グルタミン、
R=Arg=アルギニン、S=Ser=セリン、
T=Thr=スレオニン、V=Val=バリン、
W=Trp=トリプトファン、Y=Tyr=チロシン、
B=Asx=AspまたはAsn、Z=Glx=GluまたはGln、
X=Xaa=任意のアミノ酸。
配列番号5をコードするDNAの調製
配列番号7および8に記載のヌクレオチド配列を有する合成DNA300pmolを混合し、オーバーラップPCR反応を行った。ポリメラーゼにはPyrobest(タカラバイオ株式会社)を用い、さらに添付のバッファーとdNTPも反応に用いた。反応液量は0.05mLとした。反応条件は96℃5分1回、96℃2分・55℃30秒・72℃30秒のサイクルを10回とした。PCR反応生成物をアガロース電気泳動にかけ、約90bpのサイズに相当するバンドを切り出し、抽出した二本鎖DNAを制限酵素BamHIとEco52I(いずれもタカラバイオ株式会社)により切断した。
配列番号2をコードするDNAの調製
配列番号11および12に記載の合成DNAを用い、実施例1と同様の方法で、オーバーラップPCR反応を行い、アガロース電気泳動にて分離・回収した二本鎖DNAを、BamHIとEco52Iにより切断した。この二本鎖DNA、および、実施例1において配列番号9および10に記載の合成DNAからPCR反応によって調製したEco52IとEcoRIで切断済みの二本鎖DNAを、プラスミドベクターpGEX−2TのBamHI/EcoRIサイトにサブクローニングした。なお、上記2種の二本鎖DNAが、Eco52I切断サイトで結合し、pGEX−2Tにサブクローニングしたときに、配列番号2をコードするように、配列番号9、10、11、12のDNAを設計した。このサブクローニングしたDNAの配列は、配列番号22に示した。実施例1と同様に、配列番号22のDNAを含むpGEX−2Tを用いて、大腸菌DH5α細胞の形質転換を行い、プラスミドDNAを増幅および抽出した。
配列番号1をコードするDNAの調製
配列番号5をコードするDNAを含むpGEX−6P−1を鋳型として、配列番号13および14の合成DNAプライマーを用い、クイックチェンジ法で、配列番号5のアミノ酸配列においてThr−17がGlyに変換された変異体、すなわち配列番号1をコードするDNAを含むpGEX−6P−1を作成した。上記方法で作成した、配列番号1をコードするDNAの配列を、配列番号23に示す。クイックチェンジ法に関しては、QuickChange Site−Directed Mutagenesis Kit(Stratagene社)を用い、添付のプロトコルに従って行った。実施例1と同様に、配列番号23のDNAを含むpGEX−6P−1を用いて、大腸菌DH5α細胞の形質転換を行い、プラスミドDNAを増幅・抽出した。
配列番号6をコードするDNAの調製
配列番号15および16に記載の合成DNAを用い、実施例1と同様の方法で、オーバーラップPCR反応を行い、アガロース電気泳動にて分離・回収した二本鎖DNAを、BamHIとEco52Iにより切断した。また同様に、配列番号17および18に記載の合成DNAを用い、オーバーラップPCR反応を行い、アガロース電気泳動にて分離・回収した二本鎖DNAを、Eco52IとEcoRIにより切断した。上記2種の二本鎖DNAを、pGEX−6P−1のBamHI/EcoRIサイトにサブクローニングした。上記2種の二本鎖DNAが、Eco52I切断サイトで結合し、pGEX−6P−1にサブクローニングしたときに、配列番号6をコードするように、配列番号15、16、17、18のDNAを設計した。このサブクローニングしたDNAの配列は、配列番号24に示した。実施例1と同様に、配列番号24のDNAを含むpGEX−6P−1を用いて、大腸菌DH5α細胞の形質転換を行い、プラスミドDNAを増幅・抽出した。
配列番号3をコードするDNAの調製
配列番号6をコードするDNAを含むpGEX−6P−1を鋳型として、配列番号19および20の合成DNAプライマーを用い、実施例3と同様に、クイックチェンジ法で、配列番号6のアミノ酸配列においてThr−17がGlyに変換された変異体、すなわち配列番号3をコードするDNAを含むpGEX−6P−1を作成した。上記方法で作成した、配列番号3をコードするDNAの配列を、配列番号25に示した。実施例1と同様に、配列番号25のDNAを含むpGEX−6P−1を用いて、大腸菌DH5α細胞の形質転換を行い、プラスミドDNAを増幅・抽出した。
各DNAの配列確認
実施例1〜5で得られた、配列番号21〜25のDNAを含む、各々のプラスミドDNAの配列確認は、DNAシークエンサー3130xl Genetic Analyzer(Applied Biosystems社)を用いて行った。BigDye Terminator v.1.1 Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems社)を用いて、添付のプロトコルに従い、各々のプラスミドDNAのシークエンシングPCR反応を行い、そのシークエンシング産物を精製し、配列解析に用いた。
各SpGポリペプチド(GST融合蛋白質)の発現
実施例1〜5で得られた、配列番号21〜25のDNAのいずれかを含むpGEX−6P−1を導入したDH5α細胞を、アンピシリン(和光純薬工業株式会社)を0.1g/Lの濃度で含有するLB培地(1%トリプトン、0.5%乾燥酵母エキス、1%NaCl(全て和光純薬工業株式会社))を用い、各々別々に37℃にて8時間培養した。各々の培養液から2.5mL分を、アンピシリンを0.1g/Lの濃度で含有する0.5Lの2×YT培地(1.6%トリプトン、1%乾燥酵母エキス、0.5%NaCl)に接種し、37℃にて培養を始めた。接種から2時間後に、終濃度0.1mMになるようIPTG(イソプロピル1‐チオ‐β‐D‐ガラクトシド、和光純薬工業株式会社)を添加し、さらにIPTG添加後12時間培養した。培養終了後、各々の培養液を遠心にて集菌し、終濃度1mMのAEBSF(4−(2−Aminoethyl)benzenesulfonyl Fluoride Hydrochloride、ナカライテスク株式会社)、終濃度0.5mMのEDTA(Ethylenediaminetetraacetic Acid、和光純薬工業株式会社)、終濃度1mMのDTT(Dithiothreitol、和光純薬工業株式会社)を含むPBS緩衝液(8g/L NaCl、0.2g/L KCl、1.15g/L Na2HPO4、0.2g/L KH2PO4、和光純薬工業株式会社)25mLに、各々の集菌ペレットを再懸濁した。超音波破砕にて菌体を破砕し、各々の菌体破砕液を遠心分離にて上清画分と沈殿画分とに分画した(本操作は4℃にて行った)。
各GST融合SpGポリペプチドの精製
上記の通り、実施例7において、IPTGにより誘導されたと考えられる各蛋白質は、配列番号1、2、3、5、6のいずれかのSpGポリペプチドが、N末端側にGSTが付与したGST融合蛋白質として発現された。
ポリペプチドの精製
pGEX−6P−1マルチクローニングサイトに遺伝子を導入すると、PreScissionプロテアーゼ(GEヘルスケア バイオサイエンス株式会社)でGSTを切断することが可能な部位も導入された。これにより、導入したDNAがコードするポリペプチドのみを得ることが可能だが、PreScissionプロテアーゼで切断後も、ベクターpGEX−6P−1側のプロテアーゼ認識サイトと制限酵素サイトに由来するアミノ酸配列が、N末端側に付与された形で残った。pGEX−6P−1のBamHI/EcoRIサイトに目的のポリペプチドをコードするDNAをサブクローニングし、そのDNAプラスミドを用いて形質転換した大腸菌で目的のポリペプチドをGSTが融合した形で発現し、そのGST融合ポリペプチドをPreScissionプロテアーゼで切断した場合、N末端側にGly−Pro−Leu−Gly−Serの配列が付与された形の、目的のポリペプチドが得られた。したがって、実施例1〜8で得られたいずれかのGST融合SpGポリペプチドをPreScissionプロテアーゼで切断した場合、配列番号1、2、3、5、6のいずれかのアミノ酸配列のN末端側に、Gly−Pro−Leu−Gly−Serの配列が付与したSpGポリペプチドが得られた。本特許の実施例において用いられた、配列番号1、2、3、5、6に対応する各々のSpGポリペプチドは、上記のように、N末端側に5残基からなるベクター由来のアミノ酸配列が付与したポリペプチドであった。
BIACOREによるヒトIgG―Fab断片抗体への結合能の検討
表面プラズモン共鳴(surface plasmon resonance)を利用した分析機器BIACORE3000(ビアコア株式会社、33−1141438−3719)を用いて、取得した各々のSpGポリペプチドのヒトIgG―Fabへの結合を測定した。ヒトIgG―FabをセンサーチップCM5(ビアコア株式会社、ロット番号1150754)に固定し、SpGポリペプチドをチップ上に流し、固定化したヒトIgG―Fabへの結合・解離を観測する実験系で両者の解離定数KD(M)を算出した。
SpGポリペプチドの水不溶性担体への固定化
SpGポリペプチドをリガンドとして固定化した担体のIgG−Fab吸着能を検証するため、配列番号4で示されるSpGポリペプチドを固定化した担体を作製した。PCT出願WO96/026786において開示される、水不溶性担体にエポキシ基を導入し、そのエポキシ基の開環・酸化反応によりアルデヒド基を生成させて得られた担体にリガンドを固定化する方法によって、本SpGポリペプチド固定化担体を作製した。
SpGポリペプチド固定化担体のIgG−Fabアフィニティ・カラムクロマト実験
実施例10で得た、配列番号4で示されるSpGポリペプチドを固定化した担体がIgG−Fabに対してアフィニティ・カラムの様相を示すことを確認するため、以下に示す条件で評価を行った。
Claims (32)
- 配列番号26に示されるアミノ酸配列を有し、かつ、ヒトIgG抗体のFab部分との結合能を有する、変異型プロテインG−betaドメインを含むポリペプチド。
- 配列番号5または6に示されるアミノ酸配列において、少なくともThr−17が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
- 請求項1に記載のポリペプチドであって、プロテインG−betaドメインが配列番号5に示されるアミノ酸配列からなるプロテインG−beta−1型であるポリペプチド。
- 請求項1に記載のポリペプチドであって、プロテインG−betaドメインが配列番号6に示されるアミノ酸配列からなるプロテインG−beta−2型であるポリペプチド。
- 請求項3に記載のポリペプチドであって、さらに、Glu−15または/およびGlu−19を他のアミノ酸残基に置換したことを特徴とするポリペプチド。
- 請求項4に記載のポリペプチドであって、さらに、Glu−15または/およびLys−19を他のアミノ酸残基に置換したことを特徴とするポリペプチド。
- 請求項3に記載のポリペプチドであって、Thr−17をGlyに置換したことを特徴とするポリペプチド。
- 請求項7に記載のポリペプチドであって、Glu−15をPheに、または/および、Glu−19をThrに置換したことを特徴とするポリペプチド。
- 請求項4に記載のポリペプチドであって、Thr−17をGlyに置換したことを特徴とするポリペプチド。
- 請求項9に記載のポリペプチドであって、Glu−15をPheに、または/および、Lys−19をThrに置換したことを特徴とするポリペプチド。
- 配列番号5に示されるアミノ酸配列において、少なくともThr−17をGlyに置換した変異を有するアミノ酸配列を含み、かつ、ヒトIgG抗体のFab部分との結合能を有する、ポリペプチド。
- 請求項11に記載のポリペプチドであって、さらに、Glu−15をPheに、または/および、Glu−19をThrに置換したことを特徴とするポリペプチド。
- 配列番号6に示されるアミノ酸配列において、少なくともThr−17をGlyに置換した変異を有するアミノ酸配列を含み、かつ、ヒトIgG抗体のFab部分との結合能を有する、ポリペプチド。
- 請求項13に記載のポリペプチドであって、さらに、Glu−15をPheに、または/および、Lys−19をThrに置換したことを特徴とするポリペプチド。
- 請求項11に記載のポリペプチドであって、配列番号1で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
- 請求項12に記載のポリペプチドであって、配列番号2で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
- 請求項13に記載のポリペプチドであって、配列番号3で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
- 請求項14に記載のポリペプチドであって、配列番号4で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
- 請求項1〜18のいずれかに記載のポリペプチドと他のポリペプチドとが共有結合した融合ポリペプチド。
- 請求項1〜19のいずれかに記載のポリペプチドのN末端、C末端または/およびアミノ酸側鎖に1〜100個のアミノ酸残基が共有結合したポリペプチド。
- 請求項1〜20のいずれかに記載のポリペプチドを1ドメイン単位として、該ドメイン単位2〜100個を共有結合にて融合させたポリペプチド。
- 請求項1〜21のいずれかに記載のポリペプチドを水不溶性担体に固定化したことを特徴とする、吸着材料。
- 請求項22に記載の吸着材料であって、抗体、抗体誘導体、断片抗体および断片抗体誘導体のいずれかを吸着することができる吸着材料。
- 請求項23に記載の吸着材料であって、IgG抗体、IgG抗体誘導体、IgG−Fab断片抗体およびIgG−Fab断片抗体誘導体のいずれかを吸着することができる吸着材料。
- 請求項24に記載の吸着材料であって、ヒトIgG抗体、ヒトIgG抗体誘導体、ヒトIgG−Fab断片抗体およびヒトIgG−Fab断片抗体誘導体のいずれかを吸着することができる吸着材料。
- 請求項23に記載の吸着材料を用いることを特徴とする、抗体、抗体誘導体、断片抗体および断片抗体誘導体のいずれかを分離精製する方法。
- 請求項24に記載の吸着材料を用いることを特徴とする、IgG抗体、IgG抗体誘導体、IgG−Fab断片抗体およびIgG−Fab断片抗体誘導体のいずれかを分離精製する方法。
- 請求項25に記載の吸着材料を用いることを特徴とする、ヒトIgG抗体、ヒトIgG抗体誘導体、ヒトIgG−Fab断片抗体およびヒトIgG−Fab断片抗体誘導体のいずれかを分離精製する方法。
- 請求項1〜21のいずれかに記載のポリペプチドをコードするDNA。
- 請求項29に記載のDNAを有するベクター。
- 請求項30に記載のベクターにより形質転換された形質転換体。
- 請求項31に記載の形質転換体を用いた、請求項1〜21のいずれかに記載のポリペプチドの製造方法。
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