JP2019517789A - 変異免疫グロブリン結合ポリペプチド - Google Patents
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Abstract
Description
「抗体」および「免疫グロブリン」という用語は、本明細書では互換的に使用され、抗体の断片、抗体または抗体断片を含む融合タンパク質および抗体または抗体断片を含むコンジュゲートも含むと理解される。
KEX1Q X2AFYEILX3LP NLTEEQRX4X5F IX6X7LKDX8PSX9 SX10X11X12LAEAKX13 X14NX15AQAPK
ここで、互いに個別に:
X1=AまたはQまたは欠失
X2=E、K、Y、T、F、L、W、I、M、V、A、HまたはR
X3=HまたはK
X4=AまたはN
X5=A、G、S、Y、Q、T、N、F、L、W、I、M、V、D、E、H、RまたはK、例えばS、Y、Q、T、N、F、L、W、I、M、V、D、E、H、RまたはKなど
X6=QまたはE
X7=SまたはK
X8=EまたはD
X9=QまたはVまたは欠失
X10=K、RまたはAまたは欠失
X11=A、EまたはNまたは欠失
X12=IまたはL
X13=KまたはR
X14=LまたはY
X15=D、F、Y、W、KまたはR
である。
X1=Aまたは欠失
X2=E
X3=H
X4=N
X6=Q
X7=S
X8=D
X9=Vまたは欠失
X10=Kまたは欠失
X11=Aまたは欠失
X12=I
X13=K
X14=L
であってよい。
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SAALLAEAKK LNDAQAPK
配列番号9 Zvar(Q9A,N11E,N28A,N43A)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRAAF IQSLKDDPSQ SAALLAEAKK LNDAQAPK
配列番号10 Zvar(Q9A,N11E,Q40V,A42K,N43E,L44I)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKEILAEAKK LNDAQAPK
配列番号11 Zvar(Q9A,N11E,Q40V,A42K,N43A,L44I)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK
配列番号12 Zvar(N11E,Q32A)
VDAKFDKEQQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IASLKDDPSQ SANLLAEAKK LNDAQAPK
配列番号13 Zvar(N11E)
VDAKFDKEQQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SANLLAEAKK LNDAQAPK
配列番号14 Zvar(N11E,Q32E,Q40E)
VDAKFDKEQQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IESLKDDPSE SANLLAEAKK LNDAQAPK
配列番号15 Zvar(N11E,Q32E,K50R)
VDAKFDKEQQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IESLKDDPSQ SANLLAEAKR LNDAQAPK
配列番号16 Zvar(N11K)
VDAKFDKEQQ KAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SANLLAEAKK LNDAQAPK
配列番号23 Zvar(N11K,H18K,S33K,D37E,A42R,N43A,L44I,K50R,L51Y)
VDAKFDKEQQ KAFYEILKLP NLTEEQRNAF IQKLKDEPSQ SRAILAEAKR YNDAQAPK
配列番号24 Zvar(Q9A,N11E,N28A,Q40V,A42K,N43A,L44I)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRAAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK
配列番号25 Zvar(Q9A,N11K,H18K,S33K,D37E,A42R,N43A,L44I,K50R,L51Y)
VDAKFDKEAQ KAFYEILKLP NLTEEQRAAF IQKLKDEPSQ SRAILAEAKR YNDAQAPK
配列番号26 Zvar(N11K,H18K,D37E,A42R,N43A,L44I)
VDAKFDKEQQ KAFYEILKLP NLTEEQRNAF IQSLKDEPSQ SRAILAEAKK LNDAQAPK
配列番号27 Zvar(Q9A,N11K,H18K,D37E,A42R,N43A,L44I)
VDAKFDKEAQ KAFYEILKLP NLTEEQRNAF IQSLKDEPSQ SRAILAEAKK LNDAQAPK
配列番号28 Zvar(Q9A,N11K,H18K,D37E,A42R,N43A,L44I,K50R)
VDAKFDKEAQ KAFYEILKLP NLTEEQRNAF IQSLKDEPSQ SRAILAEAKR LNDAQAPK
配列番号29 Zvar(Q9A,N11K,H18K,D37E,A42R)
VDAKFDKEAQ KAFYEILKLP NLTEEQRNAF IQSLKDEPSQ SRNLLAEAKK LNDAQAPK
配列番号36 B(Q9A,N11E,Q40V,A42K,N43A,L44I)
ADNKFNKEAQ EAFYEILHLP NLNEEQRNGF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK
配列番号37 C(Q9A,N11E,E43A)
ADNKFNKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNGF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK
配列番号38 Zvar(N11Y)
VDAKFDKEQQ YAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SANLLAEAKK LNDAQAPK
配列番号39 Zvar(N11T)
VDAKFDKEQQ TAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SANLLAEAKK LNDAQAPK
配列番号40 Zvar(N11F)
VDAKFDKEQQ FAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SANLLAEAKK LNDAQAPK
配列番号41 Zvar(N11L)
VDAKFDKEQQ LAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SANLLAEAKK LNDAQAPK
配列番号42 Zvar(N11W)
VDAKFDKEQQ WAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SANLLAEAKK LNDAQAPK
配列番号43 Zvar(N11I)
VDAKFDKEQQ IAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SANLLAEAKK LNDAQAPK
配列番号44 Zvar(N11M)
VDAKFDKEQQ MAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SANLLAEAKK LNDAQAPK
配列番号45 Zvar(N11V)
VDAKFDKEQQ VAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SANLLAEAKK LNDAQAPK
配列番号46 Zvar(N11A)
VDAKFDKEQQ AAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SANLLAEAKK LNDAQAPK
配列番号47 Zvar(N11H)
VDAKFDKEQQ HAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SANLLAEAKK LNDAQAPK
配列番号48 Zvar(N11R)
VDAKFDKEQQ RAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SANLLAEAKK LNDAQAPK
配列番号49 Zvar(Q9A,N11E,D37E,Q40V,A42K,N43A,L44I)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDEPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK
配列番号50 Zvar(Q9A,N11E,D37E,Q40V,A42R,N43A,L44I)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDEPSV SRAILAEAKK LNDAQAPK
配列番号54 Zvar(Q9A,N11E,A29G,Q40V,A42K,N43A,L44I)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNGF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK
配列番号55 Zvar(Q9A,N11E,A29S,Q40V,A42K,N43A,L44I)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNSF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK
配列番号56 Zvar(Q9A,N11E,A29Y,Q40V,A42K,N43A,L44I)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNYF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK
配列番号57 Zvar(Q9A,N11E,A29Q,Q40V,A42K,N43A,L44I)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNQF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK
配列番号58 Zvar(Q9A,N11E,A29T,Q40V,A42K,N43A,L44I)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNTF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK
配列番号59 Zvar(Q9A,N11E,A29N,Q40V,A42K,N43A,L44I)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNNF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK
配列番号60 Zvar(Q9A,N11E,A29F,Q40V,A42K,N43A,L44I)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNFF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK
配列番号61 Zvar(Q9A,N11E,A29L,Q40V,A42K,N43A,L44I)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNLF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK
配列番号62 Zvar(Q9A,N11E,A29W,Q40V,A42K,N43A,L44I)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNWF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK
配列番号63 Zvar(Q9A,N11E,A29I,Q40V,A42K,N43A,L44I)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNIF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK
配列番号64 Zvar(Q9A,N11E,A29M,Q40V,A42K,N43A,L44I)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNMF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK
配列番号65 Zvar(Q9A,N11E,A29V,Q40V,A42K,N43A,L44I)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNVF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK
配列番号66 Zvar(Q9A,N11E,A29D,Q40V,A42K,N43A,L44I)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNDF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK
配列番号67 Zvar(Q9A,N11E,A29E,Q40V,A42K,N43A,L44I)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNEF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK
配列番号68 Zvar(Q9A,N11E,A29H,Q40V,A42K,N43A,L44I)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNHF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK
配列番号69 Zvar(Q9A,N11E,A29R,Q40V,A42K,N43A,L44I)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNRF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK
配列番号70 Zvar(Q9A,N11E,A29K,Q40V,A42K,N43A,L44I)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNKF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK
配列番号71 Zvar(Q9A,N11E,Q40V,A42K,N43A,L44I,D53F)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNFAQAPK
配列番号72 Zvar(Q9A,N11E,Q40V,A42K,N43A,L44I,D53Y)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNYAQAPK
配列番号73 Zvar(Q9A,N11E,Q40V,A42K,N43A,L44I,D53W)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNWAQAPK
配列番号74 Zvar(Q9A,N11E,Q40V,A42K,N43A,L44I,D53K)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNKAQAPK
配列番号75 Zvar(Q9A,N11E,Q40V,A42K,N43A,L44I,D53R)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNRAQAPK
配列番号76 Zvar(Q9del,N11E,Q40V,A42K,N43A,L44I)
VDAKFDKE_Q EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK
配列番号77 Zvar(Q9A,N11E,Q40del,A42K,N43A,L44I)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPS_ SKAILAEAKK LNDAQAPK
配列番号78 Zvar(Q9A,N11E,Q40V,A42del,N43A,L44I)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV S_AILAEAKK LNDAQAPK
配列番号79 Zvar(Q9A,N11E,Q40V,A42K,N43del,L44I)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SK_ILAEAKK LNDAQAPK
配列番号89 Zvar(D2del,A3del,K4del,Q9A,N11E,Q40V,A42K,N43A,L44I)
V___FDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK
配列番号90 Zvar(V1del,D2del,Q9A,N11E,Q40V,A42K,N43A,L44I,K58del)
__AKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAP_
配列番号91 Zvar(K4del,F5del,D6del,K7del,E8del,Q9A,N11E,Q40V,A42K,N43A,L44I)
VDA_____AQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK
配列番号92 Zvar(Q9A,N11E,Q40V,A42K,N43A,L44I,A56del,P57del,K58del)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQ___
配列番号93 Zvar(V1del,D2del,A3del,Q9A,N11E,Q40V,A42K,N43A,L44I)
___KFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK
配列番号94 Zvar(V1del,D2del,A3del,K4del,F5del,D6del,K7del,E8del,Q9A,N11E,Q40V,A42K,N43A,L44I)
________AQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK
配列番号95 Zvar(Q9A,N11E,Q40V,A42K,N43A,L44I,K58_insYEDG)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPKYE DG
第2の態様では、本発明は、上に開示されるいずれかの実施形態によって定義される複数のポリペプチド単位を含むか、またはそれから本質的になる多量体を開示する。多量体の使用は、免疫グロブリン結合容量を増加させることがあり、また、多量体は単量体よりも高いアルカリ安定性を有することがある。多量体は、例えば二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、八量体または九量体であり得る。それは、多量体中の全ての単位が同一であるホモ多量体であってもよいし、少なくとも1つの単位が他の単位と異なるヘテロ多量体であってもよい。有利には、多量体中の全ての単位は、例えば上に開示される変異を含むことによって、アルカリ安定性である。ポリペプチドは、ポリペプチドのC末端とN末端との間のペプチド結合によって直接に互いと結合することができる。あるいは、多量体中の2以上の単位は、オリゴマー種またはポリマー種、例えば最大15または30アミノ酸、例えば1〜5、1〜10または5〜10アミノ酸などを含む要素などを含むリンカーによって結合することができる。これは特に配列番号51および52の変異ならびに配列番号53のポリペプチドの例であり、リンカーの具体例は、例えば、VDAKFDまたはADNKFN、例えばVDAKFDなどであり得る。そのようなリンカーの性質は、好ましくはタンパク質単位の空間的立体構造を不安定化するべきではない。これは、例えばリンカー中にプロリンが存在しないようにすることによって達成することができる。さらに、リンカーはまた、好ましくは変異したタンパク質単位の性質を損なわないようにアルカリ環境で十分に安定しているべきでもある。この目的のため、リンカーがアスパラギンを含まない場合は有利である。リンカーがグルタミンを含まない場合はさらに有利であり得る。多量体はさらにN末端で複数のアミノ酸残基、例えばクローニングプロセスに由来するか、または切断されるシグナル伝達配列由来の残基を構成するアミノ酸残基などを含むことがある。さらなるアミノ酸残基の数は、例えば15以下、例えば10以下または5以下などであってよい。具体例として、多量体は、AQ配列をN末端に含むことがある。
AQGT VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SAALLAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SAALLAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SAALLAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SAALLAEAKK LNDAQAPKC
配列番号18 Zvar(Q9A,N11E,N28A,N43A)4
AQGT VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRAAF IQSLKDDPSQ SAALLAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRAAF IQSLKDDPSQ SAALLAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRAAF IQSLKDDPSQ SAALLAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRAAF IQSLKDDPSQ SAALLAEAKK LNDAQAPKC
配列番号19 Zvar(Q9A,N11E,Q40V,A42K,N43E,L44I)4
AQGT VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKEILAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKEILAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKEILAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKEILAEAKK LNDAQAPKC
配列番号20 Zvar(Q9A,N11E,Q40V,A42K,N43A,L44I)4
AQGT VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPKC
配列番号30 Zvar(N11K,H18K,S33K,D37E,A42R,N43A,L44I,K50R,L51Y)4
AQGT VDAKFDKEQQ KAFYEILKLP NLTEEQRNAF IQKLKDEPSQ SRAILAEAKR YNDAQAPK VDAKFDKEQQ KAFYEILKLP NLTEEQRNAF IQKLKDEPSQ SRAILAEAKR YNDAQAPK VDAKFDKEQQ KAFYEILKLP NLTEEQRNAF IQKLKDEPSQ SRAILAEAKR YNDAQAPK VDAKFDKEQQ KAFYEILKLP NLTEEQRNAF IQKLKDEPSQ SRAILAEAKR YNDAQAPKC
配列番号31 Zvar(Q9A,N11K,H18K,D37E,A42R)4
AQGT VDAKFDKEAQ KAFYEILKLP NLTEEQRNAF IQSLKDEPSQ SRNLLAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ KAFYEILKLP NLTEEQRNAF IQSLKDEPSQ SRNLLAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ KAFYEILKLP NLTEEQRNAF IQSLKDEPSQ SRNLLAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ KAFYEILKLP NLTEEQRNAF IQSLKDEPSQ SRNLLAEAKK LNDAQAPKC
配列番号32 Zvar(Q9A,N11E,N28A,Q40V,A42K,N43A,L44I)4
AQGT VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRAAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRAAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRAAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRAAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPKC
配列番号33 Zvar(Q9A,N11E,Q40V,A42K,N43A,L44I)6
AQGT VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPKC
配列番号34 Zvar(Q9A,N11E,D37E,Q40V,A42K,N43A,L44I)4
AQGT VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDEPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDEPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDEPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDEPSV SKAILAEAKK LNDAQAPKC
配列番号35 Zvar(Q9A,N11E,D37E,Q40V,A42R,N43A,L44I)4
AQGT VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDEPSV SRAILAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDEPSV SRAILAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDEPSV SRAILAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDEPSV SRAILAEAKK LNDAQAPKC
配列番号80 リンカーのD2、A3およびK4が欠失した、Zvar(Q9A、N11E、Q40V、A42K、N43A、L44I)2
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK VFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPKC
配列番号81 リンカーのK58、V1およびD2が欠失した、Zvar(Q9A、N11E、Q40V、A42K、N43A、L44I)2
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAP AKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPKC
配列番号82 リンカーのP57、K58、V1、D2およびA3が欠失した、Zvar(Q9A、N11E、Q40V、A42K、N43A、L44I)2
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAP AKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPKC
配列番号83 リンカーのK4、F5、D6、K7およびE8が欠失した、Zvar(Q9A、N11E、Q40V、A42K、N43A、L44I)2
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK VDAAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPKC
配列番号84 リンカーのA56、P57およびK58が欠失した、Zvar(Q9A、N11E、Q40V、A42K、N43A、L44I)2
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQ VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPKC
配列番号85 リンカーのV1、D2およびA3が欠失した、Zvar(Q9A、N11E、Q40V、A42K、N43A、L44I)2
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK KFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPKC
配列番号86 リンカーのV1、D2、A3、K4、F5、D6、K7およびE8が欠失した、Zvar(Q9A、N11E、Q40V、A42K、N43A、L44I)2
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK AQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPKC
配列番号87 リンカーのK58とV1の間にYEDGが挿入された、Zvar(Q9A、N11E、Q40V、A42K、N43A、L44I)2
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK YEDG VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPKC
配列番号88 Zvar2
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPKC
いくつかの実施形態では、上に開示されるポリペプチドおよび/または多量体は、C末端またはN末端に、1または複数のシステイン残基、複数のリジン残基および複数のヒスチジン残基からなる群から選択される、1または複数のカップリングエレメントをさらに含む。1または複数のカップリングエレメントはまた、C末端またはN末端から1〜5アミノ酸残基の範囲内、例えば1〜3または1〜2アミノ酸残基の範囲内に位置してもよい。カップリングエレメントは、例えばC末端の単一のシステインであることがある。1または複数のカップリングエレメントは、C末端またはN末端に直接に結合してもよいし、あるいはカップリングエレメントは、最大15アミノ酸、例えば1〜5、1〜10または5〜10アミノ酸を含むストレッチを介して結合してもよい。このストレッチもまた、好ましくは変異したタンパク質の性質を損なわないようにアルカリ環境で十分に安定しているべきである。この目的のために、ストレッチがアスパラギンを含まない場合に有利である。ストレッチがグルタミンを含まない場合はさらに有利であり得る。C末端システインを有する利点は、タンパク質のエンドポイントカップリングがシステインチオールと支持体上の求電子基との反応を通じて達成され得ることである。このことは、結合容量に重要である、結合したタンパク質の優れた移動度をもたらす。
a)免疫グロブリンを含む液体試料と上に開示される分離マトリックスとを接触させる工程、
b)分離マトリックスを洗液で洗う工程、
c)溶出液を用いて分離マトリックスから免疫グロブリンを溶出する工程、および
d)分離マトリックスを洗浄液(あるいは定置洗浄(CIP)液と呼ぶこともできる)で、例えば少なくとも10分の接触(インキュベーション)時間で洗浄する工程
を含む。
ある種の実施形態では、洗浄液は0.1〜2.0M NaOHまたはKOH、例えば0.5〜2.0または0.5〜1.0M NaOHまたはKOHなどを含む。これらは効率的な洗浄溶液であり、特にNaOHまたはKOH濃度が0.1Mまたは少なくとも0.5Mを上回る場合にそうである。本発明のポリペプチドの高い安定性は、そのような強アルカリ溶液の使用を可能にする。
部位特異的変異誘発を、変異をコードするオリゴヌクレオチドを用いて2工程のPCRによって実施した。鋳型として、Z、BまたはCのいずれかの単一のドメインを含有するプラスミドを使用した。PCR断片を大腸菌発現ベクターに連結した。DNA塩基配列決定法を使用して、挿入した断片の正しい配列を検証した。
構築物を、標準培地中の大腸菌K12の発酵によって細菌ペリプラズム内に発現させた。発酵後、細胞を熱処理してペリプラズムの内容物を培地に放出させた。培地に放出された構築物を、孔径0.2μmの膜を用いる精密濾過法によって回収した。
使用したベースマトリックスは、米国特許第6602990号明細書に記載の方法に従って調製し、Gel Filtration Principles and Methods,Pharmacia LKB Biotechnology 1991,pp 6−13に記載の方法に従う、分子量110kDaのデキストランの逆ゲル濾過クロマトグラフィーのKav値0.70に相当する孔径をもつ、85マイクロメートル(体積加重、d50V)のメジアン径の硬質架橋アガロースビーズであった。
50ml Falconチューブ中20mLのリガンド溶液(50mg/mL)に、169mgのNaHCO3、21mgのNa2CO3、175mgのNaClおよび7mgのEDTAを添加した。Falconチューブをローラーテーブルの上に5〜10分間載せた後、77mgのDTEを添加した。還元は45分超進行した。次に、Sephadex G−25を充填したPD10カラムでリガンド溶液を脱塩した。脱塩した溶液中のリガンド含有量を、276nmのUV吸収を測定することによって求めた。
Gammanorm 165mg/ml(Octapharma)、平衡化緩衝液中2mg/mlに希釈。
PBSリン酸緩衝液10mM+0.14M NaCl+0.0027M KCl、pH7.4(Medicago)
吸着緩衝液
PBSリン酸緩衝液10mM+0.14M NaCl+0.0027M KCl、pH7.4(Medicago)
溶出緩衝液
100mM酢酸塩pH2.9
動的結合容量
2mlの樹脂を、TRICORN(商標)5 100カラムに充填した。貫流容量を、AKTAExplorer10システムで滞留時間6分(流量0.33ml/分)で求めた。安定したベースラインが得られるまで平衡化緩衝液をバイパスカラムに流した。これは自動ゼロ化の前に行った。100%UVシグナルが得られるまで試料をカラムに適用した。その後、安定したベースラインが得られるまで、平衡バッファーを再度適用した。
Asub=非結合IgGサブクラスによる吸光度への寄与;
A(V)=所与添加容量での吸光度;
Vc=カラム容量;
Vapp=10%貫流までの添加量;
Vsys=システムのデッドボリューム;
C0=供給濃度。
10%貫流のDBC(Qb10)は、アルカリ洗浄溶液に繰り返し曝露する前と後に求めた。各々のサイクルには、0.5M NaOHを0.5/分の速度で20分間カラムに通してポンプ送達し、その後カラムを4時間静置するCIP工程が含まれた。曝露は室温(22+/−2℃)で行った。このインキュベーションの後、カラムを平衡緩衝液で流量0.5ml/分で20分間洗った。表4は、6回の4時間サイクル後の残存容量(すなわち、0.5M NaOHへの累積曝露時間は24時間)を、絶対数で、そして初期容量と比較して表す。
[実施態様1]
配列番号4〜7の11位に対応する位置の少なくともアスパラギンまたはセリン残基が、グルタミン酸、リジン、チロシン、トレオニン、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、メチオニン、バリン、アラニン、ヒスチジンおよびアルギニンからなる群から選択されるアミノ酸に変異している、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号22、配列番号51または配列番号52によって定義される、ブドウ球菌プロテインA(SpA)の親Fc結合ドメインの変異体を含む、Fc結合ポリペプチド。
[実施態様2]
配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号51または配列番号52によって定義される、ブドウ球菌プロテインA(SpA)の親Fc結合ドメインの変異体を含む、実施態様1に記載のポリペプチド。
[実施態様3]
配列番号4〜7の11位に対応する位置のアミノ酸残基がグルタミン酸である、実施態様1または2に記載のポリペプチド。
[実施態様4]
前記配列番号4〜7の11位に対応する位置の前記アミノ酸残基がリジンである、実施態様1乃至3のいずれか1項に記載のポリペプチド。
[実施態様5]
配列番号4〜7の29位に対応する位置の前記アミノ酸残基が、グリシン、セリン、チロシン、グルタミン、トレオニン、アスパラギン、フェニルアラニン、ロイシン、トリプトファン、イソロイシン、メチオニン、バリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、アルギニンまたはリジンである、実施態様1乃至4のいずれか1項に記載のポリペプチド。
[実施態様6]
配列番号4〜7の9位に対応する位置の前記アミノ酸残基がアラニンである、実施態様1乃至5のいずれか1項に記載のポリペプチド。
[実施態様7]
配列番号4〜7の9位に対応する位置の前記アミノ酸残基を欠失している、実施態様1乃至6のいずれか1項に記載のポリペプチド。
[実施態様8]
配列番号4〜7の50位に対応する位置の前記アミノ酸残基が、アルギニンまたはグルタミン酸、例えばアルギニンなどである、実施態様1乃至7のいずれか1項に記載のポリペプチド。
[実施態様9]
配列番号4〜7の3位に対応する位置の前記アミノ酸残基がアラニンであり、かつ/または配列番号4〜7の6位に対応する位置の前記アミノ酸残基がアスパラギン酸である、実施態様1乃至8のいずれか1項に記載のポリペプチド。
[実施態様10]
配列番号4〜7の3位および6位に対応する位置の前記アミノ酸残基の少なくとも1つ、例えば両方がアスパラギンである、実施態様1乃至6のいずれか1項に記載のポリペプチド。
[実施態様11]
配列番号4〜7の43位に対応する位置の前記アミノ酸残基がアラニンまたはグルタミン酸、例えばアラニンなどである、実施態様1乃至10のいずれか1項に記載のポリペプチド。
[実施態様12]
配列番号4〜7の43位に対応する位置の前記アミノ酸残基を欠失している、実施態様1乃至11のいずれか1項に記載のポリペプチド。
[実施態様13]
配列番号4〜7の28位に対応する位置の前記アミノ酸残基がアラニンまたはアスパラギンである、実施態様1乃至12のいずれか1項に記載のポリペプチド。
[実施態様14]
配列番号4〜7の40位に対応する位置の前記アミノ酸残基が、アスパラギン、アラニン、グルタミン酸およびバリンからなる群から選択される、実施態様1乃至13のいずれか1項に記載のポリペプチド。
[実施態様15]
配列番号4〜7の40位に対応する位置の前記アミノ酸残基を欠失している、実施態様1乃至14のいずれか1項に記載のポリペプチド。
[実施態様16]
配列番号4〜7の42位に対応する位置の前記アミノ酸残基が、アラニン、リジンまたはアルギニン、例えばアルギニンなどである、実施態様1乃至15のいずれか1項に記載のポリペプチド。
[実施態様17]
配列番号4〜7の42位に対応する位置の前記アミノ酸残基を欠失している、実施態様1乃至16のいずれか1項に記載のポリペプチド。
[実施態様18]
配列番号4〜7の44位に対応する位置の前記アミノ酸残基が、ロイシンまたはイソロイシン、例えばイソロイシンなどである、実施態様1乃至17のいずれか1項に記載のポリペプチド。
[実施態様19]
配列番号4〜7の44位に対応する位置の前記アミノ酸残基を欠失している、実施態様1乃至18のいずれか1項に記載のポリペプチド。
[実施態様20]
配列番号4〜7の53位に対応する位置の前記アミノ酸残基が、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アルギニンまたはリジンである、実施態様1乃至19のいずれか1項に記載のポリペプチド。
[実施態様21]
配列番号4〜7の18位に対応する位置の前記アミノ酸残基が、リジンまたはヒスチジン、例えばリジンなどである、実施態様1乃至20のいずれか1項に記載のポリペプチド。
[実施態様22]
配列番号4〜7の33位に対応する位置の前記アミノ酸残基が、リジンまたはセリン、例えばリジンなどである、実施態様1乃至21のいずれか1項に記載のポリペプチド。
[実施態様23]
配列番号4〜7の37位に対応する位置の前記アミノ酸残基が、グルタミン酸またはアスパラギン酸、例えばグルタミン酸などである、実施態様1乃至22のいずれか1項に記載のポリペプチド。
[実施態様24]
配列番号4〜7の51位に対応する位置の前記アミノ酸残基が、チロシンまたはロイシン、例えばチロシンなどである、実施態様1乃至23のいずれか1項に記載のポリペプチド。
[実施態様25]
配列番号4〜7の1、2、3、4、5、6、7、8、56、57または58位に対応する位置の前記アミノ酸残基の1以上が欠失している、実施態様1乃至24のいずれか1項に記載のポリペプチド。
[実施態様26]
配列番号7によって定義されるZvarの変異体である実施態様1乃至25のいずれか1項に記載のポリペプチドであって、前記9位のアミノ酸残基がアラニンであるか、または欠失しており、前記11位のアミノ酸残基がリジンまたはグルタミン酸、例えばリジンなどである、ポリペプチド。
[実施態様27]
前記43位のアミノ酸残基がアラニンまたはグルタミン酸であるか、あるいは欠失している、実施態様26に記載のポリペプチド。
[実施態様28]
前記40位のアミノ酸残基がバリンであるか、または欠失している、実施態様26または27に記載のポリペプチド。
[実施態様29]
前記44位のアミノ酸残基がイソロイシンでありか、または欠失している、実施態様26乃至28のいずれか1項に記載のポリペプチド。
[実施態様30]
前記変異が、
Q9A、N11E、A29G、Q40V、A42K、N43A、L44I;
Q9A、N11E、A29S、Q40V、A42K、N43A、L44I;
Q9A、N11E、A29Y、Q40V、A42K、N43A、L44I;
Q9A、N11E、A29Q、Q40V、A42K、N43A、L44I;
Q9A、N11E、A29T、Q40V、A42K、N43A、L44I;
Q9A、N11E、A29N、Q40V、A42K、N43A、L44I;
Q9A、N11E、A29F、Q40V、A42K、N43A、L44I;
Q9A、N11E、A29L、Q40V、A42K、N43A、L44I;
Q9A、N11E、A29W、Q40V、A42K、N43A、L44I;
Q9A、N11E、A29I、Q40V、A42K、N43A、L44I;
Q9A、N11E、A29M、Q40V、A42K、N43A、L44I;
Q9A、N11E、A29V、Q40V、A42K、N43A、L44I;
Q9A、N11E、A29D、Q40V、A42K、N43A、L44I;
Q9A、N11E、A29E、Q40V、A42K、N43A、L44I;
Q9A、N11E、A29H、Q40V、A42K、N43A、L44I;
Q9A、N11E、A29R、Q40V、A42K、N43A、L44I;および
Q9A、N11E、A29K、Q40V、A42K、N43A、L44I
からなる群から選択される、実施態様1乃至29のいずれか1項に記載のポリペプチド。
[実施態様31]
前記変異が、
Q9A、N11E、Q40V、A42K、N43A、L44I、D53F;
Q9A、N11E、Q40V、A42K、N43A、L44I、D53Y;
Q9A、N11E、Q40V、A42K、N43A、L44I、D53W;
Q9A、N11E、Q40V、A42K、N43A、L44I、D53K;および
Q9A、N11E、Q40V、A42K、N43A、L44I、D53R
からなる群から選択される、実施態様1乃至30のいずれか1項に記載のポリペプチド。
[実施態様32]
前記変異が、
Q9del、N11E、Q40V、A42K、N43A、L44I;
Q9A、N11E、Q40del、A42K、N43A、L44I;
Q9A、N11E、Q40V、A42del、N43A、L44I;および
Q9A、N11E、Q40V、A42K、N43del、L44I
からなる群から選択される、実施態様1乃至31のいずれか1項に記載のポリペプチド。
[実施態様33]
前記変異が、
D2del、A3del、K4del、Q9A、N11E、Q40V、A42K、N43A、L44I;
V1del、D2del、Q9A、N11E、Q40V、A42K、N43A、L44I、K58del;
V1del、D2del、A3del、Q9A、N11E、Q40V、A42K、N43A、L44I、P57del、K58del;
K4del、F5del、D6del、K7del、E8del、Q9A、N11E、Q40V、A42K、N43A、L44I;
Q9A、N11E、Q40V、A42K、N43A、L44I、A56del、P57del、K58del;
V1del、D2del、A3del、Q9A、N11E、Q40V、A42K、N43A、L44I;
V1del、D2del、A3del、K4del、F5del、D6del、K7del、E8del、Q9A、N11E、Q40V、A42K、N43A、L44I;および
Q9A、N11E、Q40V、A42K、N43A、L44I、K58_insYEDG
からなる群から選択される、実施態様1乃至32のいずれか1項に記載のポリペプチド。
[実施態様34]
配列番号54、配列番号55、配列番号56、配列番号57、配列番号58、配列番号59、配列番号60、配列番号61、配列番号62、配列番号63、配列番号64、配列番号65、配列番号66、配列番号67、配列番号68、配列番号69および配列番号70からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも90%、例えば95%または98%などの同一性を有する配列を含むかまたはそれから本質的になる、実施態様1乃至29のいずれか1項に記載のポリペプチド。
[実施態様35]
配列番号71、配列番号72、配列番号73、配列番号74および配列番号75からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも90%、例えば95%または98%などの同一性を有する配列を含むかまたはそれから本質的になる、実施態様1乃至29のいずれか1項に記載のポリペプチド。
[実施態様36]
配列番号76、配列番号77、配列番号78および配列番号79からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも90%、例えば95%または98%などの同一性を有する配列を含むかまたはそれから本質的になる、実施態様1乃至29のいずれか1項に記載のポリペプチド。
[実施態様37]
配列番号89、配列番号90、配列番号91、配列番号92、配列番号93、配列番号94および配列番号95からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも90%、例えば95%または98%などの同一性を有する配列を含むかまたはそれから本質的になる、実施態様1乃至29のいずれか1項に記載のポリペプチド。
[実施態様38]
前記ポリペプチドが、配列番号1〜16、17〜34および36〜52からなる群から選択されるアミノ酸配列によって定義されるいずれの配列も含まない、実施態様34乃至37のいずれか1項に記載のポリペプチド。
[実施態様39]
実施態様1乃至38のいずれか1項に記載のポリペプチドであって、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6または配列番号7によって、例えば配列番号7などによって定義されるポリペプチドと比較して改善されたアルカリ安定性を有する、ポリペプチド。
[実施態様40]
実施態様1乃至39のいずれか1項に記載のポリペプチドであって、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6または配列番号7によって、例えば配列番号7などによって定義される親ポリペプチドと比較して改善されたアルカリ安定性を有する、ポリペプチド。
[実施態様41]
前記アルカリ安定性が、22+/−2℃の0.5Mまたは1.0M NaOH水溶液中、24または25時間のインキュベーションの後に残存IgG結合容量によって測定して改善されている、実施態様38または39に記載のポリペプチド。
[実施態様42]
配列番号53
KEX1Q X2AFYEILX3LP NLTEEQRX4X5F IX6X7LKDX8PSX9 SX10X11X12LAEAKX13 X14NX15AQAPK (配列番号53)
によって定義されるかあるいはそれとの少なくとも90%または少なくとも95%または98%の同一性を有する配列を含む、Fc結合ポリペプチドであって、
上式で、互いに個別に:
X1=AまたはQまたは欠失
X2=E、K、Y、T、F、L、W、I、M、V、A、HまたはR
X3=HまたはK
X4=AまたはN
X5=A、G、S、Y、Q、T、N、F、L、W、I、M、V、D、E、H、RまたはK
X6=QまたはE
X7=SまたはK
X8=EまたはD
X9=QまたはVまたは欠失
X10=K、RまたはAまたは欠失
X11=A、EまたはNまたは欠失
X12=IまたはL
X13=KまたはR
X14=LまたはY
X15=D、F、Y、W、KまたはR
であるFc結合ポリペプチド。
[実施態様42]
X1=Aまたは欠失
X2=E
X3=H
X4=N
X6=Q
X7=S
X8=D
X9=Vまたは欠失
X10=Kまたは欠失
X11=Aまたは欠失
X12=I
X13=K
X14=L
である、実施態様41に記載のポリペプチド。
[実施態様43]
X1=A、X2=E、X3=H、X4=N、X5=S、Y、Q、T、N、F、L、W、I、M、V、D、E、H、RまたはK、X6=Q、X7=S、X8=D、X9=V、X10=K、X11=A、X12=I、X13=K、X14=L、X15=Dである、実施態様41に記載のポリペプチド。
[実施態様44]
X1は欠失、X2=E、X3=H、X4=N、X5=A、X6=Q、X7=S、X8=D、X9=V、X10=K、X11=A、X12=I、X13=K、X14=L、X15=Dである、実施態様41に記載のポリペプチド。
[実施態様45]
X1=A、X2=E、X3=H、X4=N、X5=A、X6=Q、X7=S、X8=D、X9は欠失、X10=K、X11=A、X12=I、X13=K、X14=L、X15=Dである、実施態様41に記載のポリペプチド。
[実施態様46]
X1=A、X2=E、X3=H、X4=N、X5=A、X6=Q、X7=S、X8=D、X9=V、X10は欠失、X11=A、X12=I、X13=K、X14=L、X15=Dである、実施態様41に記載のポリペプチド。
[実施態様47]
X1=A、X2=E、X3=H、X4=N、X5=A、X6=Q、X7=S、X8=D、X9=V、X10=K、X11は欠失、X12=I、X13=K、X14=L、X15=Dである、実施態様41に記載のポリペプチド。
[実施態様48]
X1=A、X2=E、X3=H、X4=N、X5=A、X6=Q、X7=S、X8=D、X9=V、X10=K、X11=A、X12=I、X13=K、X14=L、X15=F、Y、W、KまたはRである、実施態様41に記載のポリペプチド。
[実施態様49]
前記ポリペプチドが、配列番号1〜16、17〜34および36〜52からなる群から選択されるアミノ酸配列によって定義されるいずれの配列も含まない、実施態様41乃至48のいずれか1項に記載のポリペプチド。
[実施態様50]
実施態様1乃至49のいずれか1項に記載の複数のポリペプチドを含むかまたはそれから本質的になる多量体。
[実施態様51]
前記ポリペプチドが、15個までのアミノ酸を含むリンカーによって連結されている、実施態様50に記載の多量体。
[実施態様52]
二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、八量体または九量体である、実施態様50または51に記載の多量体。
[実施態様53]
配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34および配列番号35によって定義される配列の群から選択される配列を含むか、あるいはそれから本質的になる、実施態様50乃至52のいずれか1項に記載の多量体。
[実施態様54]
前記C末端またはN末端に、または、前記C末端またはN末端から1〜5個のアミノ酸残基の範囲内に、1または複数のシステイン残基、複数のリジン残基および複数のヒスチジン残基からなる群から選択される1または複数のカップリングエレメントをさらに含む、実施態様1乃至53のいずれか1項に記載のポリペプチドまたは多量体。
[実施態様55]
実施態様1乃至54のいずれか1項に記載のポリペプチドまたは多量体をコードする核酸またはベクター。
[実施態様56]
実施態様55に記載の核酸またはベクターを含む発現系。
[実施態様57]
実施態様1乃至54のいずれか1項に記載の複数のポリペプチドまたは多量体が固相支持体に結合されている分離マトリックス。
[実施態様58]
前記ポリペプチドまたは多量体が、チオエーテル結合によって前記固相支持体に結合されている、実施態様57に記載の分離マトリックス。
[実施態様59]
前記固相支持体が多糖類である、実施態様57または58に記載の分離マトリックス。
[実施態様60]
22+/−2℃の0.5M NaOH中での24時間のインキュベーションの後の前記マトリックスの前記IgG容量が、前記インキュベーションの前の前記IgG容量の少なくとも80、例えば少なくとも85、少なくとも90または少なくとも95%である、実施態様57乃至59のいずれか1項に記載の分離マトリックス。
[実施態様61]
22+/−2℃の1.0M NaOH中での24時間のインキュベーションの後の前記マトリックスの前記IgG容量が、前記インキュベーションの前の前記IgG容量の少なくとも70、例えば少なくとも80または少なくとも90%である、実施態様57乃至60のいずれか1項に記載の分離マトリックス。
[実施態様62]
免疫グロブリンを単離する方法であって、実施態様57乃至61のいずれか1項に記載の分離マトリックスを使用する方法。
[実施態様63]
実施態様62に記載の方法であって、
a)免疫グロブリンを含む液体試料と、実施態様57乃至61のいずれか1項に記載の分離マトリックスとを接触させる工程と、
b)前記分離マトリックスを洗液で洗う工程と、
c)溶出液を用いて前記分離マトリックスから前記免疫グロブリンを溶出する工程と、
d)前記分離マトリックスを洗浄液で洗浄する工程と
を含む、方法。
[実施態様64]
前記洗浄液が、アルカリ性、例えばpHが13〜14である、実施態様63に記載の方法。
[実施態様65]
前記清浄液が0.1〜1.0M NaOHまたはKOH、例えば0.5〜1.0M NaOHまたはKOHを含む、実施態様63または64に記載の方法。
[実施態様66]
工程a)〜d)が少なくとも10回、例えば少なくとも50回または50〜200回繰り返される、実施態様63乃至65のいずれか1項に記載の方法。
[実施態様67]
工程a)〜c)が少なくとも10回、例えば少なくとも50回または50〜200回繰り返され、工程d)が複数回の工程c)の後に、例えば少なくとも10回または少なくとも50回実施される、実施態様63乃至66のいずれか1項に記載の方法。
Claims (15)
- 配列番号53
KEX1Q X2AFYEILX3LP NLTEEQRX4X5F IX6X7LKDX8PSX9 SX10X11X12LAEAKX13 X14NX15AQAPK (配列番号53)
によって定義されるかあるいはそれとの少なくとも90%または少なくとも95%または98%の同一性を有する配列を含む、Fc結合ポリペプチドであって、
上式で、互いに個別に:
X1=AまたはQまたは欠失
X2=E、K、Y、T、F、L、W、I、M、V、A、HまたはR
X3=HまたはK
X4=AまたはN
X5=A、G、S、Y、Q、T、N、F、L、W、I、M、V、D、E、H、RまたはK
X6=QまたはE
X7=SまたはK
X8=EまたはD
X9=QまたはVまたは欠失
X10=K、RまたはAまたは欠失
X11=A、EまたはNまたは欠失
X12=IまたはL
X13=KまたはR
X14=LまたはY
X15=D、F、Y、W、KまたはR
であるFc結合ポリペプチド。 - X1=Aまたは欠失
X2=E
X3=H
X4=N
X6=Q
X7=S
X8=D
X9=Vまたは欠失
X10=Kまたは欠失
X11=Aまたは欠失
X12=I
X13=K
X14=L
である、請求項1に記載のポリペプチド。 - i)X1=A、X2=E、X3=H、X4=N、X5=S、Y、Q、T、N、F、L、W、I、M、V、D、E、H、RまたはK、X6=Q、X7=S、X8=D、X9=V、X10=K、X11=A、X12=I、X13=K、X14=L、X15=Dであり、
ii)X1は欠失、X2=E、X3=H、X4=N、X5=A、X6=Q、X7=S、X8=D、X9=V、X10=K、X11=A、X12=I、X13=K、X14=L、X15=Dであり、
iii)X1=A、X2=E、X3=H、X4=N、X5=A、X6=Q、X7=S、X8=D、X9は欠失、X10=K、X11=A、X12=I、X13=K、X14=L、X15=Dであり、
iv)X1=A、X2=E、X3=H、X4=N、X5=A、X6=Q、X7=S、X8=D、X9=V、X10は欠失、X11=A、X12=I、X13=K、X14=L、X15=Dであり、
v)X1=A、X2=E、X3=H、X4=N、X5=A、X6=Q、X7=S、X8=D、X9=V、X10=K、X11は欠失、X12=I、X13=K、X14=L、X15=Dであり、または
vi)X1=A、X2=E、X3=H、X4=N、X5=A、X6=Q、X7=S、X8=D、X9=V、X10=K、X11=A、X12=I、X13=K、X14=L、X15=F、Y、W、KまたはRである、請求項1に記載のポリペプチド。 - 以下からなる群から選択されるアミノ酸配列との少なくとも90%、95%または98%の同一性を有する配列を含むかまたはその配列から本質的になる、請求項1乃至3のいずれか1項に記載のポリペプチド:
i)配列番号54、配列番号55、配列番号56、配列番号57、配列番号58、配列番号59、配列番号60、配列番号61、配列番号62、配列番号63、配列番号64、配列番号65、配列番号66、配列番号67、配列番号68、配列番号69および配列番号70;
ii)配列番号71、配列番号72、配列番号73、配列番号74および配列番号75;
iii)配列番号76、配列番号77、配列番号78および配列番号79;または
iv)配列番号89、配列番号90、配列番号91、配列番号92、配列番号93、配列番号94および配列番号95。 - 請求項1乃至4のいずれか1項に記載のポリペプチドであって、前記アルカリ安定性が、22+/−2℃の0.5Mまたは1.0M NaOH水溶液中、24または25時間のインキュベーションの後に残存IgG結合容量によって測定して改善されているように、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6または配列番号7によって、例えば配列番号7などによって定義されるポリペプチドまたは親ポリペプチドと比較して改善されたアルカリ安定性を有する、ポリペプチド。
- 請求項1乃至5のいずれか1項に記載の複数のポリペプチドを含むかまたはそれから本質的になる多量体であって、任意選択で前記ポリペプチドが、15個までのアミノ酸を含むリンカーによって連結されている多量体。
- 配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34および配列番号35によって定義される配列の群から選択される配列を含むか、あるいはそれから本質的になる、請求項6に記載の多量体。
- 前記C末端またはN末端に、または、前記C末端またはN末端から1〜5個のアミノ酸残基の範囲内に、1または複数のシステイン残基、複数のリジン残基および複数のヒスチジン残基からなる群から選択される1または複数のカップリングエレメントをさらに含む、請求項1乃至7のいずれか1項に記載のポリペプチドまたは多量体。
- 請求項1乃至8のいずれか1項に記載のポリペプチドまたは多量体をコードする核酸またはベクター。
- 請求項1乃至8のいずれか1項に記載の複数のポリペプチドまたは多量体が、例えばチオエーテル結合によって、固相支持体に結合されている分離マトリックス。
- 22+/−2℃の0.5M NaOH中での24時間のインキュベーションの後の前記マトリックスの前記IgG容量が、前記インキュベーションの前の前記IgG容量の少なくとも80、例えば少なくとも85、少なくとも90または少なくとも95%であり、および/または、22+/−2℃の1.0M NaOH中での24時間のインキュベーションの後の前記マトリックスの前記IgG容量が、前記インキュベーションの前の前記IgG容量の少なくとも70、例えば少なくとも80または少なくとも90%である、請求項10に記載の分離マトリックス。
- 免疫グロブリンを単離する方法であって、請求項10または11に記載の分離マトリックスを使用する方法。
- 請求項12に記載の方法であって、
a)免疫グロブリンを含む液体試料と、請求項10または11に記載の分離マトリックスとを接触させる工程と、
b)前記分離マトリックスを洗液で洗う工程と、
c)溶出液を用いて前記分離マトリックスから前記免疫グロブリンを溶出する工程と、
d)前記分離マトリックスを洗浄液で洗浄する工程と
を含む、方法。 - 前記洗浄液が、アルカリ性、例えばpHが13〜14であり、および/または、前記清浄液が0.1〜1.0M NaOHまたはKOH、例えば0.5〜1.0M NaOHまたはKOHを含む、請求項13に記載の方法。
- 工程a)〜d)が少なくとも10回、例えば少なくとも50回または50〜200回繰り返される、請求項12乃至14のいずれか1項に記載の方法。
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