KR101855714B1 - 항체의 선택적 농축 - Google Patents

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베링거 인겔하임 인터내셔날 게엠베하
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Abstract

본 발명은 면역글로불린 또는 Fc 도메인을 함유하는 기타 단백질(표적 단백질)의 선택적 농축을 위한 공정에 관한 것이고, 이는 하기 단계:
e. 상기 표적 단백질을 함유하는 용액을 제조하는 단계;
f. 결합이 발생되도록 하는 조건 하에서 정확히 2개의 결합 부위에 Fc-결합 단백질을 도입시키는 단계;
g. 상기 액상으로부터 침전물을 분리하는 단계;
h. 상기 Fc-결합 단백질로부터 상기 표적 단백질의 결합을 취소하는 단계
를 포함한다.

Description

항체의 선택적 농축{SELECTIVE ENRICHMENT OF ANTIBODIES}
본 발명은 단백질, 특히 면역글로불린 또는 Fc 도메인을 갖는 기타 단백질의 정제 공정에 관한 것이다.
단백질, 폴리뉴클레오타이드, 다당류 등의 생체분자는 의약으로서, 진단학적 제제로서, 식품, 세제 등의 첨가제로서, 연구 시약으로서, 그리고 다수의 기타 적용에 대해 점점 상업적 중요성이 증가하고 있다. 이러한 생체분자에 대한 요구는 더 이상 일반적으로, 예를 들면 단백질의 경우 천연 공급원으로부터 분자를 분리함으로써 충족될 수 없고, 생명공학적 제조 방법의 사용을 필요로 한다.
단백질의 생명공학적 제조는 전형적으로 적합한 발현 벡터에 DNA 단편을 클로닝하는 것으로 시작한다. 적합한 원핵 또는 진핵 발현 세포로의 상기 발현 벡터의 형질감염 및 형질감염된 세포의 후속적 선별 후, 형질감염된 세포를 생물반응기에서 배양하여 목적하는 단백질이 발현된다. 이어서, 세포 또는 배양 상청액을 수집하고, 그 안에 함유된 단백질을 워크 업(work up)시키고 정제한다.
진핵 발현 시스템의 경우, 즉 CHO 또는 NSO 세포와 같은 포유동물 세포 배양물을 사용하는 경우에 있어서, 예를 들면 발현 단계에서 달성될 수 있는 세포 배양물 또는 세포 배양 상청액 중의 목적하는 단백질의 농도가 지난 15년간 현저히 증가하였다. 동일한 기간에 걸쳐, 단백질의 후속적 정제에 사용되는 크로마토그래피 재료의 결합 능력은 그에 비해 단지 약간 증가하였다. 이러한 이유로, 공업적 대량 스케일로 수행될 수 있는, 생체분자, 특히 단백질의 개선된 최적의 정제 방법이 긴급히 요구된다.
예를 들면, 치료용 항체와 같은 약물로서 사용되는 단백질과 같은 생물 약제의 경우에 있어서, 생산 수율 이외에 불순물의 분리가 매우 중요하다. 공정-의존적 불순물 및 생성물-의존적 불순물 사이의 차이를 이끌어낼 수 있다. 공정-의존적 불순물은 단백질(숙주 세포 단백질, HCP) 및 핵산과 같은 숙주 세포의 성분을 함유하고, 세포 배양물(배지의 성분과 같은) 또는 워킹 업(working up)(예를 들면, 염 또는 용해된 크로마토그래피 리간드와 같은)으로부터 기원한다. 생성물-의존적 불순물은 상이한 특성들을 갖는 생성물의 분자 변이체이다. 이들은 전구체 및 가수분해성 분해 생성물과 같은 단축 형태(shortened form)를 포함하고, 또한 예를 들면, 탈아미노화, 부정확한 글리코실화 또는 잘못 연결된 디설파이드 가교에 의해 생성된 변형 형태도 포함한다. 또한, 생성물-의존적 변이체 중에서도 중합체 및 응집체가 포함된다. 다른 불순물은 오염물이다. 이 용어는 제조 공정에 직접적으로 속하지 않는 화학적, 생화학적 또는 미생물학적 성질의 모든 기타 물질을 포함한다. 오염물의 예로는 세포 배양물에 바람직하지 않은 방식으로 발생할 수 있는 바이러스가 포함된다.
생물 약제의 경우에 있어서, 불순물은 안전성 우려를 발생시킨다. 이들 우려가 생물 약제에서 자주 발생하여 심화되는 경우, 치료용 단백질을 주사 또는 주입에 의해 혈류에 직접 투여한다. 따라서, 숙주 세포 성분은 알레르기 반응 또는 면역병리학적 효과를 초래할 수 있다. 또한, 불순물은 투여되는 단백질의 바람직하지 못한 면역원성을 초래할 수도 있고, 즉 이들은 환자의 치료용 제제에 바람직하지 못한 면역 반응을 촉발하여 생명을 위협하는 과민성 쇼크(anaphylactic shock)를 초래할 수도 있다. 따라서, 원하지 않는 모든 물질을 무해한 수준으로 감소시킬 수 있는 수단에 의한 적합한 정제 공정을 필요로 한다.
한편, 생물 약제의 경우에서도 경제적 고려 사항은 무시할 수 없다. 따라서, 사용되는 제조 및 정제 방법은 이로써 제조되는 생물 약제학적 생성물의 경제적 실행 가능성을 위협하지 않아야 한다.
단백질에 대한 워킹 업 및 프로세싱(processing) 단계들로서, 여과 및 침전 공정뿐만 아니라 (컬럼) 크로마토그래피 공정도 매우 중요하다. 따라서, 정확한 조작의 항체 농축은 친화성 크로마토그래피에 의한 정제 단계를 함유한다. 따라서, 이들 공정에 사용될 수 있는 다수의 컬럼 크로마토그래피 방법 및 크로마토그래피 재료가 현재 알려져 있다.
친화성 크로마토그래피 매트릭스는 다양한 물질의 산업적 정제에서 고정상으로서 사용된다. 사용되는 특정 리간드에 대해 특정 친화성을 갖는 물질을 특이적으로 농축하고 정제하기 위해 고정화된 리간드를 사용할 수 있다. 항체(면역글로불린)의 산업적 정제, 특히 단클론 항체의 정제를 위해, 고정화된 단백질 A를 종종 초기 정제 단계로서 사용한다. 단백질 A는 면역글로불린의 Fc 영역의 CH2/CH3 도메인에 고친화도(10-8M 내지 10-12M의 사람 IgG)로 결합하는 약 41kDa의 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)를 갖는 단백질이다. 단백질 A 크로마토그래피에 있어서, 이동상 유래의 단백질 A-결합 Fc 영역을 갖는 면역글로불린 또는 융합 단백질은 담체(예를 들면, 세파로스)에 공유 결합되는 단백질 A 리간드에 특이적으로 결합한다. 스타필로코커스 아우레우스 유래의 단백질 A(야생형 단백질 A) 및 유전적으로 변형된 재조합 단백질 A(rec. 단백질 A)는 비-공유 상호작용을 통해 항체의 불변 영역(Fc 단편)과 상호작용한다. 이러한 특이적 상호 작용을 사용하여 항체로부터 불순물을 효율적으로 분리할 수 있다. pH를 변경함으로써, 항체와 단백질 A 리간드 사이의 상호 작용을 의도적으로 정지시키고, 고정상으로부터 항체를 방출 또는 용출시킬 수 있다.
친화성 리간드로서의 단백질 A와는 달리, Fc 단편에 결합하는 것으로 현재 알려져 있는 다수의 기타 분자들이 존재한다. 따라서, 단백질 A의 개별 도메인이 완전 단백질 대신에 사용된다(8). 단백질 변이체가 공지되어 있고, 이는 단백질 A의 B 도메인과 정확히 상이하며, 이는 Fc-단편-함유 분자의 결합에 적합하다(16, 17). 이들 상이한 변이체들은 안정성 또는 결합 친화성을 증가시키기 위해 삽입된 돌연변이에 있어서 필수적으로 상이하다. B 도메인의 이들 돌연변이는 일반적으로 Z-도메인 또는 단백질 Z로서 공지되어 있다. 단백질 A 또는 단백질 G 이외에, 각종 펩타이드도 Fc 단편에 대한 선택적 결합에 적합하다(14). Fc 단편에 대한 친화성 리간드의 현재 중대한 관심사는 보다 더 친화성 리간드인 것으로 추정되는 것이 발견되는 것이다.
친화성 크로마토그래피 및 특히 빈번하게 사용되는 단백질 A 크로마토그래피는 고가이고, 정확하게는 발효기 내에 증가하는 생성물 농도 및 다량의 생성물이 존재하는 경우에 수행할 수 있는 크로마토그래피 정제 공정의 한계가 존재한다. 임계점은 하기와 같다: 로딩 용량, 사이클의 수, 공정 시간, 풀(pool) 체적 및 완충제의 양. 따라서, 미래에는 대안의 정제 공정이 필수적일 것이다. 친화성 크로마토그래피 및 친화성 크로마토그래피의 대안의 방법을 포함한 종래 정제 전략의 일반적 개요는 하기 문헌에서 발견할 수 있다(7, 10).
보다 최근의 친화성 크로마토그래피 방법은 불변 고정된 친화성 리간드를 사용하는 것이 아니라, 표적 단백질과 혼합된 가용화된 친화성 리간드로 시작하는 것이다(11). 친화성 리간드는 제 2 단계에서 발생하는 고체상에 대한 친화성 리간드의 고정화를 수행할 수 있도록 하는 융합 태그 또는 융합 단백질을 지닌다. 다음 단계에서, 종래 친화성 크로마토그래피에서와 같이 표적 단백질은 적합한 조건 하에서 리간드로부터 분리되고, 따라서 컬럼으로부터 용출된다.
당해 문헌들에 기재된 발명은 친화성 크로마토그래피 대신에 친화성 침전을 사용하여 생체 분자를 정제한다. 이러한 방법은 보다 큰 스케일에 사용하는 경우에 정확하게 큰 잠재력을 갖는 것으로 나타난다(1, 2).
친화성 침전은 단백질 침전의 가장 효율적인 방법이다(2). 일반적으로 용액으로부터의 단백질의 침전은 빈번하게 사용되는 널리 공지된 공정이다. 따라서, 단백질 혼합물로부터의 암모늄설페이트 침전에 의해 이미 용액으로부터 다수의 단백질이 분리되었다. 이러한 침전 동안, 거대 분자(예를 들면, 단백질)는 용액으로부터 제거되어 입자로 전환된다. 입자와 용액의 밀도 차이 및 입자 직경에 따라, 이러한 단계는 침전을 초래한다. 그러나, 이러한 침전은 일반적으로 비-특이적으로 발생한다.
따라서, 분자, 예를 들면 단백질의 보다 선택적인 농축을 위해서, 친화성 침전이 개발되었다. 친화성 침전은 표적 분자에 대한 친화성 분자의 선택적 결합을 사용한다. 친화성 분자는 예를 들면, 단백질, 펩타이드, 올리고뉴클레오타이드 또는 화학적 소분자일 수 있다. 2개의 원리, 1차 및 2차 친화성 침전 사이의 친화성 침전의 차이가 도출된다(7). 1차 친화성 침전에 있어서, 친화성 분자 및 표적 분자 둘 다 2개의 결합 부위를 가지므로, 2개의 분자 사이에 네트워크가 형성될 수 있고, 특정 크기의 침전물의 친화성 복합체가 형성된다. 2차 친화성 침전에 있어서는 예를 들면, 친화성 마크로리간드(AML)가 사용된다. 이러한 유형의 침전에 있어서, 친화성 분자는 자극가능한 물질, 일반적으로 중합체에 결합된다. 자극가능한 물질은 예를 들면, pH 또는 온도의 이동과 같은 주변 조건에서의 변화의 결과로서 이의 가용화 특성을 변화시켜, 침전이 발생한다. 1차 친화성 침전과는 다르게, 이기능성 친화성 분자도 또는 이기능성 표적 분자도 필요로 하지 않는다.
대부분 사용되는 친화성 침전에 있어서, 친화성 리간드는 중합체 또는 다른 매개체에 커플링된 상태로 존재한다(15).
Fc 단편을 함유하는 분자의 친화성 침전은 이미 다수의 연구에 기재되어 있다. 현재 가장 통상적인 적용은 소위 "스마트 중합체"의 사용을 특징으로 한다. "스마트 중합체"(또는 자극-반응성 "인텔리전트(intelligent)" 중합체 또는 친화성 마크로리간드)는 외부 영향(물리적 또는 화학적 자극)에 반응하여 이의 특성을 변화시킬 수 있는 중합체이다. 이들 자극은 예를 들면 pH 또는 온도를 변화시킬 수 있다(12-13). 일반적으로, 스마트 중합체는 용액 중의 침전을 사용하여 이의 자극에 반응한다. 이러한 침전은 목적하는 상청 용액의 분리 후 적합한 조건에 의해 리버스(reverse)될 수 있다. 스마트 중합체는 각종 생체 분자와 접합되어 모든 종류의 적용에 사용될 수 있는 중합체/생체 분자 시스템의 대량 축적을 초래할 수 있다. 이들 생체 분자의 예로는 단백질, 올리고뉴클레오타이드 및 당이 포함된다.
다른 형태의 친화성 침전은 최근 기술된 "친화성 침강(affinity sinking)" 방법이다. 이러한 형태의 친화성 침전에 있어서, 침강 분자 스캐폴드는 다수의 친화성 리간드가 서로 결합하는데 사용된다. 이어서, 이것은 침전에 요구되는 네트워크가 형성되는 것을 가능하게 한다. 네트워크 포머(network former)에 대한 친화성 리간드의 결합은 비-공유적으로 및 공유적으로 둘 다 발생할 수 있다. 이러한 방법은 최근에 특허 "Compositions and methods for purifying and crystallizing molecules of interest"에 기술되었다(6). 여기에서, 우선 항체를 함유하는 용액을 가교제에 공유 결합하는 친화성 리간드와 혼합한다. 침전이 관찰되지 않는다. 후속적인 배위 이온 또는 분자의 첨가 후에만 침전이 발생한다. 제2 유사 적용에 있어서, 친화성 리간드는 매개체 아비딘과 네트워크를 형성하는 비오틴-결합 단백질에 연결된다(9).
미국 특허 공보 제7,083,943호에는, 표적 단백질에 대한 결합 도메인이 스캐폴드 도메인에 연결되고, 이의 아미노산 서열이 침전 경향을 보조하도록 의도되는 친화성 침전이 기재되어 있다.
Chen 및 Hoffman(15)은 폴리(N-이소프로필아크릴아미드)-단백질 A 접합체를 사용한 IgG의 친화성 침전을 기재한다. 그러나, 비변형 단백질 A를 사용한 항체의 침전은 효과적인 것으로 증명되지 않는다.
선행 기술에 기술되어 있는 방법의 하나의 불리한 점은, 1차 친화성 침전 동안에 침전이 가교-결합 분자를 통해서만 가능하거나, 또는 2차 친화성 침전에 있어서 자극가능한 물질이 요구된다는 것이다. 한편, 가장 잘 알려져 있는 친화성 침전의 다른 불리한 점은 a) 고-분자 친화성 마크로리간드의 결합에 의해 표적 단백질의 결합이 제한되는 입체 장해, b) 침전 중합체 복합체의 재가용화가 느림, c) 일반적으로 제2 침전 단계를 요구하는 불순물의 비-특이적 동시-침전, d) 중합체 또는 가교제에 대한 친화성 단백질의 추가의 결합 단계이다(2-5).
본 발명은 2개의 결합 부위를 갖는 결합 단백질을 사용한 친화성 침전에 관한 것이고, 이는 추가의 융합 단백질 또는 링커 분자를 완전히 불필요하게 한다. 상기 친화성 단백질은 독자적으로 침전에 충분하고, 고정상을 필요로 하지 않는다. 또한, 여기에 사용되는 본 발명은 친화성 단백질을 회수하는 것을 더 용이하게 한다.
본 발명은 특히, 면역글로불린 또는 Fc 도메인을 함유하는 기타 단백질(표적 단백질)의 선택적 농축을 위한 공정에 관한 것으로서, 상기 공정은 하기 단계:
a. 상기 표적 단백질을 함유하는 용액을 제조하는 단계;
b. 결합이 발생되도록 하는 조건 하에서 정확히 2개의 결합 부위에 Fc-결합 단백질을 도입시키는 단계;
c. 상기 액상(liquid phase)으로부터 침전물을 분리하는 단계;
d. 상기 Fc-결합 단백질로부터 상기 표적 단백질의 결합을 취소하는 단계
를 포함한다.
다른 양상에서, 본 발명은 Fc-결합 단백질이 단백질 A 또는 단백질 G의 Fc-결합 도메인의 이량체인 공정에 관한 것이다. 바람직하게는 이량체의 2개의 단량체는 디설파이드 가교에 의해 서로 연결된다.
다른 양상에서, 본 발명은 이량체가 동종 이량체(homodimer)인 공정에 관한 것이고, 이의 단량체는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3 또는 서열번호 7, 또는 서열번호 1과는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 아미노산이 상이한 서열을 갖는다.
다른 양상에서, Fc-결합 단백질은 표적 단백질에 대하여 0.5 내지 20의 비율로 사용한다. 단계 a.의 용액은 바람직하게는 5.5 내지 8의 pH를 갖는다. 바람직하게, 단계 d.의 결합 취소는 pH 2 내지 4.5에서 발생한다.
다른 양상에서, 본 발명은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 7의 서열, 또는 서열번호 1과는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 아미노산이 상이한 서열을 갖는 2개의 동일한 서브-유닛으로 이루어진 Fc-결합 단백질에 관한 것이고, 상기 2개의 서브-유닛은 공유 결합을 통해 서로 연결된다. 바람직하게, 상기 공유 결합은 디설파이드 결합이다.
도 1: Z-이량체의 SDS-PAGE를 도시한다. 시스테인을 통한 이량체화를 입증하기 위해서, SDS-PAGE에의 적용 이전에 요오도아세트아미드를 또는 디티오트레이톨과 요오도아세트아미드를 첨가하였다.
Figure 112012071202986-pct00001

도 2: Z-이량체를 사용한 친화성 침전을 도시한다. 제 1 단계로서, 단백질 Z를 산화시킨다. 제 2 단계에서, Z-이량체를 항체(mAB) 함유 용액에 첨가하고, 이것은 항체의 선택적 침전을 초래한다.
도 3: 항체로부터 Z 이량체를 분리하기 위한 산성 조건 하에서의 이온 교환 크로마토그래피의 UV 다이아그램(실험 2)을 도시한다. 220nm에서의 UV 크로마토그램은 적색으로 나타내고, 280nm에서의 UV 크로마토그램은 청색으로 나타내며, 완충제 B(20mM 포스페이트, 3M NaCl)의 증가하는 함량은 녹색으로 나타낸다.
도 4: 실험 2를 위한 SDS-PAGE를 도시한다.
Figure 112012071202986-pct00002
본 발명은 단백질이 재조합적으로 또는 내생적으로 발현되는 세포 배양물로부터 얻어진 종류의 단백질 조성물로부터 불순물, 특히 숙주 세포 단백질(HCP) 및 DNA를 감소시키는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 Fc-결합 단백질 또는 이의 다량체를 적어도 2개의 결합 부위와 결합시킴으로써 단백질(표적 단백질)을 정제하거나 농축하는 방법에 관한 것이다. 추가의 단계에서, 침전물을 분리하고, 이어서 적합한 조건을 사용하여 표적 단백질에 대한 Fc-결합 단백질의 결합을 제거한다.
본 발명은 면역글로불린 또는 Fc 도메인을 함유하는 기타 단백질(표적 단백질)의 선택적 농축을 위한 공정에 관한 것으로서, 상기 공정은 하기 단계:
a. 상기 표적 단백질을 함유하는 용액을 제조하는 단계;
b. 결합이 발생되도록 하는 조건 하에서 정확히 2개의 결합 부위에 Fc-결합 단백질을 도입시키는 단계;
c. 상기 액상으로부터 침전물을 분리하는 단계;
d. 상기 Fc-결합 단백질로부터 상기 표적 단백질의 결합을 취소하는 단계
를 포함한다.
표적 단백질은 특히 면역글로불린 또는 면역글로불린의 Fc 도메인을 함유하는 단백질일 수 있고, 단백질 A 또는 단백질 A의 단편에 결합할 수 있다. 면역글로불린은 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄로 이루어진다. 중쇄는 각각 1개의 가변 도메인 및 면역글로불린에 따른 3개 내지 4개의 불변 도메인을 갖는다. 이들은 VH 및 CH1, CH2, CH3으로서 유사하게 나타낸다. 경쇄 및 중쇄의 가변 도메인은 항원 결합 부위를 형성한다. 도메인 CH2는 보체계에 대한 결합 부위를 형성하는 탄수화물 쇄를 함유한다. CH3 도메인은 Fc-수용체 결합 부위를 함유한다. 본 발명에 따른 공정이 적용될 수 있는 표적 단백질은 Fc 도메인을 갖는 모든 단백질이다. CH2/CH3 영역을 함유하는 단백질의 예는 항체, 관심 있는 단백질이 CH2/CH3 영역에 연결되는 면역부착 및 융합 단백질이다. 본 발명의 한 실시형태에 있어서, 표적 단백질은 예를 들면 CH2/CH3 영역을 갖는 항체이고, 따라서 단백질 A에 결합할 수 있다. 상기 용어 CH2/CH3 영역은 단백질 A와 상호작용하는 항체의 Fc 영역의 아미노산을 나타낸다.
Fc-결합 단백질은 본 발명에 따라 1개의 Fc 도메인에 대해 정확하게 2개의 결합 부위를 포함한다.
다른 양상에서, 본 발명은 Fc-결합 단백질이 단백질 A 또는 단백질 G의 Fc-결합 도메인의 이량체인 공정에 관한 것이다. 바람직하게는 이량체의 2개의 단량체들은 디설파이드 가교에 의해 서로 연결된다.
Fc-결합 단백질은 Fc 영역에 결합할 수 있는 단백질 또는 펩타이드를 의미한다. 바람직하게, Fc-결합 단백질은 10-2 내지 10-13M의 범위의 해리 상수(KD값)로 결합한다.
본 발명의 바람직한 실시형태에 있어서, Fc-결합 단백질은 표 1에 열거된 서열을 포함하거나 함유하는 Fc-결합 도메인의 동종- 또는 이종 이량체이다.
Figure 112012071202986-pct00003
본 명세서에서, 동종 이량체는 동일한 서열의 2개의 서브-유닛으로 구성된 Fc-결합 단백질을 의미한다.
본 명세서에서, 이종 이량체는 상이한 서열의 2개의 서브-유닛으로 구성된 Fc-결합 단백질을 의미하고, 이는 각각 Fc 도메인에 대한 결합 부위를 갖는다. 바람직하게, 상기 서브-유닛은 표 1의 서열로부터 선택되는 서열을 함유한다.
다른 양상에서, 본 발명은 이량체가 동종 이량체인 공정에 관한 것이고, 이의 단량체는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 7, 또는 서열번호 1과는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 아미노산이 상이한 서열을 갖는다. 서열번호 1과는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 아미노산이 상이한 상기 단량체는 10-2 내지 10-13M 범위의 KD값으로 Fc-도메인에 결합하는 특성을 갖는다. KD값의 측정 방법은 당업자에게 공지되어 있다.
결합 조건은 Fc-결합 단백질에 의해 표적 단백질에 대한 결합이 발생하는 조건이고, 바람직하게는 pH 5.5 내지 9, 바람직하게는 6 내지 8의 pH 범위이다.
침전은 예를 들면, 세포-불포함 진핵세포 배양 상청액에서 발견되는 바와 같이 결합 조건 하에서 자발적으로 발생한다. 본 발명에 따른 이량체는 중합체를 사용하여 침전을 촉진하기 위해서 중합체, 예를 들면, 폴리에틸렌글리콜에 연결할 필요가 없다.
다른 양상에서, Fc-결합 단백질은 표적 단백질에 대하여 0.5 내지 20의 몰비로 사용한다.
침전물의 분리는 원심분리 및 후속적인 상청액의 제거에 의해 수행할 수 있지만, 여과 기술에 의해서도 수행할 수 있다.
표적 단백질에 대한 결합의 취소는 Fc-결합 단백질이 표적 단백질로부터 분리될 수 있게 하는 조건 하에서 수행한다. 바람직하게, 이는 pH를 pH 2 내지 4.5의 범위로 조정함으로써 수행할 수 있다.
다른 양상에서, 본 발명은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 7의 서열, 또는 서열번호 1과는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 아미노산이 상이한 서열을 갖는 2개의 동일한 서브-유닛으로 이루어진 Fc-결합 단백질에 관한 것이고, 여기에서 2개의 서브-유닛은 공유 결합에 의해 서로 연결된다. 바람직하게, 상기 공유 결합은 디설파이드 결합이다.
실시예
장치 및 방법:
이량체화 단백질 Z의 제조
이. 콜라이 유래의 재조합 단백질로서 단백질 Z를 수득하였다. 세포 잔해의 분리 후, 이온 교환 크로마토그래피에 의해 불순물의 제거를 수행하였다.
사용된 Z 도메인의 단백질 서열:
Met-Val-Asp-Asn-Lys-Phe-Asn-Lys-Glu-Gln-Gln-Asn-Ala-Phe-Tyr-Glu-Ile-Leu-His-Leu-Pro-Asn-Leu-Asn-Glu-Glu-Gln-Arg-Asn-Ala-Phe-Ile-Gln-Ser-Leu-Lys-Asp-Asp-Pro-Ser-Gln-Ser-Ala-Asn-Leu-Leu-Ala-Glu-Ala-Lys-Lys-Leu-Asn-Asp-Ala-Gln-Ala-Pro-Lys-Ser-Ser-Ala-Cys-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Pro
Z 도메인의 펩타이드 쇄에 비-천연 시스테인을 삽입함으로써, 2개의 단백질 Z 분자를 디설파이드 가교를 통해 의도적으로 연결할 수 있다. 재조합 단백질 Z의 정제 직후에 후자를 산화에 의해 이량체화 단백질로서 수득한다.
세포-불포함 진핵세포 배양 상청액
분비 생산에 최적화된 CHO 세포의 세포 배양 상청액을 배양 수일 후 여과 또는 원심분리에 의해 수득하였다.
SEC 분석
실험 1로부터의 샘플의 단백질 불순물 및 항체 함량의 분석을 분석적 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의해 수행하였다. TSK-GEL SW 3000을 제조업체(TOSOH Bioscience)에 의해 추천되는 프리컬럼과 함께 사용하였다. Dionex Ultimate 장치에서 280 및 220nm에서의 UV 신호를 모니터링하면서 분석을 수행하였다.
항체로부터 Z- 이량체를 분리하기 위한 이온 교환 크로마토그래피
AKTA Explorer 10 장치(GE Healthcare)에서 220 및 280nm에서의 UV 흡수를 관찰하면서 이온 교환 크로마토그래피를 수행하였다. 사용된 컬럼 재료는 SP 세파로스 FF(19mL 겔 충전 체적)이었다. 산성 pH에서 재현탁된 펠렛의 적용 후, 컬럼을 20mM 포스페이트 완충제를 사용하여 pH 3.3으로 평형화하고, 이어서 항체 및 Z-이량체를 25 컬럼 체적 길이 구배에 걸쳐 서로 분리하였다. pH 3.3에서 3M의NaCl을 갖는 20mM 포스페이트 완충제를 용출에 사용하였다.
단백질 A HPLC
Waters 또는 Dionex 장치(주사 펌프 및 컬럼 오븐 W2790/5, UV 검출기 W2489)에서의 단백질 A HPLC를 사용하여 세포 배양물-불포함 상청액 및 정제된 항체의 항체 함량을 측정하였다. 상기 용액의 항체 함량은 산성 용출 피크의 UV 신호를 사용하여 측정하였다.
농축
분석적 방법을 위해, 시험에서 수득된 용액을 일부 농축시켰다(Amicon Ultra, 배제 크기 3kD).
SDS - PAGE :
20% 균일한 SDS 겔을 사용하여 개별 분획 및 상청액을 시험하였다. 단백질 밴드는 호이케쇼펜(Heukeshoven)에 따른 은 염색에 의해 검출하였다.
ELISA 검사에 의한 숙주 세포 단백질 분석
실험 3에서, ELISA 검사를 사용하여 숙주 세포 단백질 분석을 수행하였다.
DNA 분석
효소 촉매화 검출 반응에 의한 단일 가닥 생성 후 DNA 분석을 수행하였다.
UF / DF
180㎠의 표면적을 갖는 Messrs Pall에 의해 제조된 50kDa Centramate Sheet PES(폴리에테르설폰)를 실험 3의 UF/DF 시험에 사용하였다. UF/DF를 수행하여 항체가 처음으로 6-배 농축되었고, 이어서 완전히 열린 농축 밸브를 사용하여 10분 동안 순환시키기 전에 정용여과하였다(완충제 체적의 6배 교환됨). 정용여과를 2회 반복하였다. 50mM 아세테이트 완충제 + 100mM 아르기닌 + 150mM NaCl pH 3.0을 사용하여 전체 UF/DF를 수행하였다.
소수성 상호작용 크로마토그래피( HIC )
27mL 컬럼을 사용하여 AKTA 장치에서 소수성 상호작용 크로마토그래피(실험 3)를 수행하였다. 사용된 컬럼 재료는 Tosoh에 의해 제조된 Toyopearl Phenyl 650M이었다. 이러한 목적을 위해, UF/DF 후에 165mS/cm의 전도성이 얻어질 때까지 농축물에 3.5M 암모늄설페이트 완충제를 첨가하였다. 완충제(50mM 아세테이트 + 1.2M 암모늄 설페이트 pH 4)를 사용하여 평형화된 컬럼을 UF/DF로부터의 농축물로 충전시키고, 이어서 완충제 50mM 아세테이트, pH 4에 대해 40 충전 체적에 걸쳐 구배를 실시하였다.
실험:
시스테인에 의한 단백질 Z의 이량체화의 검출
SDS-PAGE 분석에 의해 시스테인에 의한 단백질 Z의 이량체화의 검출을 수행하였다(도 1). 워킹 업이 단백질 Z의 어떠한 산화도 유도하지 않는다는 것을 확인하기 위해서, 우선 유리 시스테인 그룹을 요오도아세트아미드로 알킬화하였다. 단량체를 검출하기 위해서, 디티오트레이톨(DTT)을 사용하여 추가의 환원을 수행하였다. 2.6nmol의 Z-이량체를 DTT 또는 상응하는 체적의 완충제와 혼합하고, 95℃에서 5분 동안 항온처리하였다. 이어서, 상기 혼합물을 주변 온도로 냉각시키고, 요오도아세트아미드 또는 상응하는 체적의 완충제를 첨가하고, 상기 혼합물을 암중에서 20분 동안 추가로 항온처리하였다. SDS-PAGE 완충제로 5분 동안 항온처리한 후, 상기 제제를 SDS-PAGE에 적용시켰다.
SDS-PAGE 분석은 환원제 DTT의 첨가에 의해 Z 단량체가 형성되어 Z 이량체의 겔 밴드가 사라진다는 것을 나타낸다.
Z-이량체를 사용한 선택적 침전
하기에 기술한 시험은 Z-이량체를 사용하여 항체의 선택적 침전이 이루어질 수 있다는 것을 나타낸다(도 2, 실험 1). Z-이량체는 2개의 비-천연 시스테인을 통해 연결된 스타필로코커스 아우레우스로부터의 단백질 A의 이량체화된 B-도메인이고, 이는 야생형에 비해 돌연변이를 갖는다(장치 및 방법 참조). 또한, 실험 2는, 산성 pH 범위에서의 재현탁에 의해 수득된 펠렛이 용액에 다시 투입되고, 이어서 산성 pH에서의 이온 교환 크로마토그래피에 의해 Z-이량체로부터 항체가 다시 제거될 수 있음을 입증한다.
실험 1:
세포-불포함 진핵세포 배양 상청액에 존재하는 항체에 대한 상이한 비율의 단백질 Z를 시험하였다. 또한, 개별 배치의 체적은 상이하였다. 시험 1에서, 0.13μmol의 Z-이량체를 전체 체적 5.47mL의 세포-불포함 진핵세포 배양 상청액에 함유된 0.065μmol의 IgG4와 함께 2시간 동안 교반하면서 항온처리하였다. 시험 2에서, 16.25nmol의 Z-이량체를 전체 체적 5.2mL의 세포-불포함 진핵세포 배양 상청액에 함유된 16.25nmol의 IgG1과 함께 다시 2시간 동안 교반하면서 항온처리하였다. 이어서, 상기 혼합물을 10분 동안 4000rpm으로 원심분리하고, 펠렛으로부터 상청액을 분리하였다. 분석적 SEC의 UV 신호 및 단백질 A 크로마토그래피에 의해 상청액의 항체 함량을 측정하였다(장치 및 방법). 상기 펠렛 중의 항체의 함량은 사용된 항체의 전체 함량으로부터 상청액의 항체 함량을 뺄셈하여 결정하였다. 99%까지의 항체의 침전을 관찰하였다(시험 1: 99% / 시험 2: 76%). 또한, 분석적 SEC에 의해 침전 전 및 후에 단백질 불순물에 대해 배양 상청액을 검사하였다. 세포-불포함 진핵세포 배양 상청액으로부터의 크로마토그램을 침전 후 상청액과 직접 비교하였다. 90 내지 99% 범위의 단백질 불순물의 감소를 관찰하였다(시험 1: 90% / 시험 2: 99%). 이것은 1% 또는 10%의 단백질 불순물이 동시-침전되었음을 의미한다. 여기에서, 단백질 불순물은 숙주 세포 단백질 및 표적 단백질의 단편 또는 응집체 둘 다일 수 있다.
실험 2:
양이온 교환기(SP 세파로스 FF)를 사용하여 항체로부터 Z-이량체를 분리하였다. 0.2μmol의 정제된 항체를 10.1mL의 체적 중 0.2μmol의 Z-이량체와 함께 36분 동안 항온처리하였다. 후속적인 원심분리(4000rpm, 10분) 후, 상청액을 제거하였다. 이어서, 펠렛을 pH 7.4의 10mL의 포스페이트 완충제에 회분식으로 용해시키고, 다시 원심분리하였다(4000rpm, 10분). 이로써 수득된 펠렛을 20mL 포스페이트 완충제(20mM 포스페이트, pH 3.3)에 재현탁시키고, 이온 교환기를 사용하여 정제하였다. 25 충전 체적에 걸친 구배를 통해 항체로부터 Z-이량체를 분리할 수 있었다(도 3 및 도 4).
실험 3:
포획 단계와 같이 친화성 침전을 사용하여 다-단계 항체 정제 공정을 수행하였다.
세포-불포함 배양 상청액으로부터의 침전시 500mg의 항체(3.3μmol)를 Z-이량체(6.6μmol)에 대해 1:2의 비율로 사용하였다. 온화하게 교반하면서 1시간 항온처리한 후, 전체 현탁액을 0.22μm 필터(Millipore)에 가하고, 이러한 방식으로 침전물의 상청액을 여과에 의해 분리하였다. 이어서, 침전물을 완충제(231mL의 50mM 포스페이트 완충제, pH 7.4)로 세척하고, 다음 단계에서 필터에서 아세테이트 완충제(179mL의 50mM 아세테이트 완충제 + 100mM 아르기닌 + 150mM NaCl pH 3.0)를 사용하여 재현탁시켰다. 항체로부터 Z-이량체를 분리하기 위해서, 50kDa의 막을 사용하여 UF/DF를 수행하였다. 다음 단계는 Z-이량체 및 추가의 불순물을 분리하기 위한 HIC였다.
침전 후 항체의 전체 수율은 98%였고, UF/DF 후 87%로 감소하였고, HIC 후64%로 감소하였다. 항체의 선택적 침전을 사용하여 수득된 양호한 수율 이외에, DNA 및 숙주 세포 단백질 분석은 DNA가 침전 단계, 이어서 UF/DF에 의해 99%로 감소될 수 있었다는 것과 숙주 세포 단백질 함량이 최초값(세포-불포함 배양 상청액)과 비교하여 99.9%로 감소될 수 있었다는 것을 보여주었다.
참조 문헌
Figure 112012071202986-pct00004
SEQUENCE LISTING <110> BOEHRINGER INGELHEIM INTERNATIONAL GMBH <120> SELECTIVE ENRICHMENT OF ANTIBODIES <130> P01-2592/WO/1 <150> EP10155647.0 <151> 2010-03-05 <160> 11 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 72 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 1 Met Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu 1 5 10 15 Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile 20 25 30 Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu 35 40 45 Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Ser Ser Ala Cys Arg 50 55 60 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Pro 65 70 <210> 2 <211> 63 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 2 Met Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu 1 5 10 15 Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile 20 25 30 Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu 35 40 45 Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Ser Ser Ala Cys 50 55 60 <210> 3 <211> 57 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 3 Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu 1 5 10 15 His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser 20 25 30 Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala Lys 35 40 45 Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 4 <211> 50 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 4 Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Gln Val Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Ala 1 5 10 15 Asp Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln 20 25 30 Ser Ala Asn Val Leu Gly Glu Ala Gln Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala 35 40 45 Pro Lys 50 <210> 5 <211> 57 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 5 Gln Asn Asn Phe Asn Lys Asp Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile Leu 1 5 10 15 Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Ala Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser 20 25 30 Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Thr Asn Val Leu Gly Glu Ala Lys 35 40 45 Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 6 <211> 57 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 6 Asp Asn Asn Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu 1 5 10 15 Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser 20 25 30 Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ser Glu Ala Lys 35 40 45 Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 7 <211> 57 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 7 Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu 1 5 10 15 His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser 20 25 30 Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala Lys 35 40 45 Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 8 <211> 57 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 8 Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu 1 5 10 15 His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser 20 25 30 Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys 35 40 45 Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 9 <211> 55 <212> PRT <213> Streptococcus Sp. <400> 9 Thr Thr Tyr Lys Leu Val Ile Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu Thr 1 5 10 15 Thr Thr Lys Thr Val Asp Ala Glu Thr Ala Glu Lys Ala Phe Lys Gln 20 25 30 Tyr Ala Asn Asp Asn Gly Val Asp Gly Val Trp Thr Tyr Asp Asp Ala 35 40 45 Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr 50 55 <210> 10 <211> 55 <212> PRT <213> Streptococcus dysgalactiae <400> 10 Thr Thr Tyr Lys Leu Val Ile Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu Thr 1 5 10 15 Thr Thr Lys Ala Val Asp Ala Glu Thr Ala Glu Lys Ala Phe Lys Gln 20 25 30 Tyr Ala Asn Asp Asn Gly Val Asp Gly Val Trp Thr Tyr Asp Asp Ala 35 40 45 Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr 50 55 <210> 11 <211> 56 <212> PRT <213> Streptococcus equi <400> 11 Thr Thr Tyr Arg Leu Val Ile Lys Gly Val Thr Phe Ser Gly Glu Thr 1 5 10 15 Ala Thr Lys Ala Val Asp Ala Ala Thr Ala Glu Gln Thr Phe Arg Gln 20 25 30 Tyr Ala Asn Asp Asn Gly Ile Thr Gly Glu Trp Ala Tyr Asp Thr Ala 35 40 45 Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu 50 55

Claims (10)

  1. 면역글로불린 또는 Fc 도메인을 함유하는 기타 단백질로부터 선택되는 표적 단백질의 선택적 농축을 위한 방법으로서,
    a. 상기 표적 단백질을 함유하는 용액을 제조하는 단계;
    b. 결합이 발생되도록 하는 조건 하에서 정확히 2개의 결합 부위에 Fc-결합 단백질을 도입시키는 단계;
    c. 액상(liquid phase)으로부터 침전물을 분리(separating)하는 단계; 및
    d. 상기 Fc-결합 단백질로부터 상기 표적 단백질의 결합을 해리(undoing)시키는 단계를 포함하는 방법으로서,
    상기 Fc-결합 단백질이 서열번호 1 내지 서열번호 11의 서열들 중 하나로 이루어진 Fc-결합 도메인의 이량체인, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 이량체의 2개의 단량체가 디설파이드 가교에 의해 서로 연결되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 Fc-결합 단백질이 상기 표적 단백질에 대하여 0.5 내지 20의 몰 비로 사용되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 단계 a.의 용액의 pH가 5.5 내지 9인 것을 특징으로 하는, 방법.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 단계 d.의 결합의 해리가 pH 2 내지 4.5에서 발생하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  6. 제4항에 있어서, 상기 단계 a.의 용액의 pH가 6 내지 8인 것을 특징으로 하는, 방법.
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