CN112334490B - 使用变异vhh抗体的亲和载体 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种使用变异VHH抗体的亲和载体。该亲和载体包含固相载体和结合于该固相载体的免疫球蛋白结合蛋白质,该免疫球蛋白结合蛋白质包含VHH抗体的变异体或其片段,该VHH抗体的变异体或其片段识别选自序列号22的氨基酸序列的127~184位和序列号23的氨基酸序列的13~210位中的至少1个区域的表位。
Description
技术领域
本发明涉及使用变异VHH抗体的亲和载体以及使用该亲和载体的目标物质的分离方法。
背景技术
以抗体医药为代表的蛋白质制剂基本上是单克隆抗体,使用细胞培养技术大量地生产。在这些抗体医药的制造工序的初期纯化工序,一般利用亲和色谱。现在,上市的主要的抗体医药为免疫球蛋白G(IgG)亚类,其初期纯化中,广泛利用将由革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)生产的作为细胞壁蛋白质的1种的蛋白A用作配体的亲和色谱。另一方面,近年来,出于抗体医药的高功能化的目的,正在积极地进行部分化抗体、抗体药物复合体、双重特异性抗体等修饰抗体的开发。为了这些修饰抗体的亲和纯化,也开发并上市了利用了与蛋白A不同的性质的配体的亲和载体。
VHH(variable domain of heavy chain of heavy chain antibody)是偶蹄目骆驼科动物(双峰骆驼、单峰骆驼、无峰骆驼等)的血清中所含的、包含不具有轻链的重链抗体的可变区的结构域。VHH作为能够结合于抗原的免疫球蛋白片段,是最小的单位,作为抗体医药、亲和载体的配体是有用的。
发明内容
本发明提供固定有作为抗体结合性配体是有用的VHH抗体变异体的亲和载体。
本发明提供以下方案。
〔1〕一种亲和载体,包含固相载体和结合于该固相载体的免疫球蛋白结合蛋白质,
该免疫球蛋白结合蛋白质包含VHH抗体的变异体或其片段,该VHH抗体的变异体或其片段识别选自序列号22的氨基酸序列的127~184位和序列号23的氨基酸序列的13~210位中的至少1个区域的表位。
〔2〕根据〔1〕所述的亲和载体,其中,所述VHH抗体变异体具有对变异前的VHH抗体插入有至少1个组氨酸或将至少1个氨基酸残基置换为组氨酸的互补决定区。
〔3〕根据〔2〕所述的亲和载体,其中,所述变异前的VHH抗体是由与序列号1~4中的任一氨基酸序列至少85%相同的氨基酸序列构成且对曲妥珠单抗的Fab区域具有亲和性的多肽。
〔4〕根据〔2〕或〔3〕所述的亲和载体,其中,所述互补决定区为CDR3。
〔5〕根据〔4〕所述的亲和载体,其中,所述VHH抗体变异体是由在与所述序列号1的氨基酸序列至少85%相同的氨基酸序列中将选自相当于序列号1的氨基酸序列的97位的位置、相当于100位的位置和相当于102位的位置中的至少1个位置的氨基酸残基置换为组氨酸的氨基酸序列构成的多肽。
〔6〕根据〔3〕~〔5〕中任一项所述的亲和载体,其中,与所述序列号1的氨基酸序列至少85%相同的氨基酸序列在相当于序列号1的26~35位区域的CDR1区域具有序列号10的氨基酸序列,在相当于序列号1的51~65位区域的CDR2区域具有序列号11的氨基酸序列,在相当于序列号1的96~107位区域的CDR3区域具有序列号12的氨基酸序列,
与所述序列号2的氨基酸序列至少85%相同的氨基酸序列在相当于序列号2的26~37位区域的CDR1区域具有序列号13的氨基酸序列,在相当于序列号2的53~68位区域的CDR2区域具有序列号14的氨基酸序列,在相当于序列号2的99~118位区域的CDR3区域具有序列号15的氨基酸序列,
与所述序列号3的氨基酸序列至少85%相同的氨基酸序列在相当于序列号3的26~35位区域的CDR1区域具有序列号16的氨基酸序列,在相当于序列号3的51~66位区域的CDR2区域具有序列号17的氨基酸序列,在相当于序列号3的97~116位区域的CDR3区域具有序列号18的氨基酸序列,
与所述序列号4的氨基酸序列至少85%相同的氨基酸序列在相当于序列号4的26~35位区域的CDR1区域具有序列号19的氨基酸序列,在相当于序列号4的51~66位区域的CDR2区域具有序列号20的氨基酸序列,在相当于序列号4的97~116位区域的CDR3区域具有序列号21的氨基酸序列。
〔7〕根据〔2〕~〔6〕中任一项所述的亲和载体,其中,所述VHH抗体变异体由将所述变异前的VHH抗体的氨基酸序列中的至少1个赖氨酸置换为精氨酸的氨基酸序列构成。
〔8〕根据〔1〕所述的亲和载体,其中,所述VHH抗体变异体由将变异前的VHH抗体的氨基酸序列中的至少1个赖氨酸置换为精氨酸的氨基酸序列构成。
〔9〕根据〔8〕所述的亲和载体,其中,所述变异前的VHH抗体是由与序列号1的氨基酸序列至少85%相同的氨基酸序列构成且对曲妥珠单抗的Fab区域具有亲和性的多肽。
〔10〕根据〔9〕所述的亲和载体,其中,所述VHH抗体变异体是由在与所述序列号1的氨基酸序列至少85%相同的氨基酸序列中在选自相当于序列号1的氨基酸序列的43位的位置、相当于53位的位置、相当于64位的位置、相当于75位的位置和相当于86位的位置中的至少1个位置具有精氨酸的氨基酸序列构成的多肽。
〔11〕根据〔9〕或〔10〕所述的亲和载体,其中,与所述序列号1的氨基酸序列至少85%相同的氨基酸序列在相当于序列号1的26~35位区域的CDR1区域具有序列号10的氨基酸序列,在相当于序列号1的51~65位区域的CDR2区域具有序列号11的氨基酸序列,在相当于序列号1的96~107位区域的CDR3区域具有序列号12的氨基酸序列。
〔12〕一种亲和载体,包含固相载体和结合于该固相载体的免疫球蛋白结合蛋白质,
该免疫球蛋白结合蛋白质包含多肽,该多肽由与序列号1的氨基酸序列至少85%相同的且在选自相当于序列号1的氨基酸序列的97位的位置、相当于100位的位置和相当于102位的位置中的至少1个位置具有组氨酸的氨基酸序列构成。
〔13〕根据〔12〕所述的亲和载体,其中,与所述序列号1的氨基酸序列至少85%相同的氨基酸序列在相当于序列号1的26~35位区域的CDR1区域具有序列号10的氨基酸序列,在相当于序列号1的51~65位区域的CDR2区域具有序列号11的氨基酸序列,在相当于序列号1的96~107位区域的CDR3区域具有序列号12的氨基酸序列。
〔14〕根据〔12〕所述的亲和载体,其中,所述免疫球蛋白结合蛋白质包含由序列号5~8中的任一氨基酸序列构成的多肽。
〔15〕一种亲和载体,包含固相载体和结合于该固相载体的免疫球蛋白结合蛋白质,
该免疫球蛋白结合蛋白质包含多肽,该多肽由与序列号1的氨基酸序列至少85%相同的且在选自相当于序列号1的氨基酸序列的43位的位置、相当于53位的位置、相当于64位的位置、相当于75位的位置和相当于86位的位置中的至少1个位置具有精氨酸的氨基酸序列构成。
〔16〕根据〔15〕所述的亲和载体,其中,与所述序列号1的氨基酸序列至少85%相同的氨基酸序列在相当于序列号1的26~35位区域的CDR1区域具有序列号10的氨基酸序列,在相当于序列号1的51~65位区域的CDR2区域具有序列号11的氨基酸序列,在相当于序列号1的96~107位区域的CDR3区域具有序列号12的氨基酸序列。
〔17〕根据〔15〕所述的亲和载体,其中,所述免疫球蛋白结合蛋白质包含由序列号9的氨基酸序列构成的多肽。
〔18〕一种免疫球蛋白或其片段的分离方法,使用〔1〕~〔17〕中任一项所述的亲和载体。
与亲本抗体相比,本发明的亲和载体提高了免疫球蛋白的溶出行为或结合容量。利用本发明的亲和载体,能够提高免疫球蛋白或其片段的制造效率。
附图说明
图1是本发明的VHH抗体变异体的免疫球蛋白结合解离行为。横轴的“pH2.0”表示流过pH2.0的洗脱液的时间。
图2是免疫球蛋白从本发明的以VHH抗体变异体为配体的亲和载体中溶出的行为。
具体实施方式
在本申请说明书中,“免疫球蛋白结合蛋白质”是指对免疫球蛋白或其片段具有结合活性的蛋白质。在本说明书中,“免疫球蛋白”(Ig)包含IgG、IgA、IgD、IgE、IgM和它们的亚类等任意类型的免疫球蛋白。在本说明书中,作为免疫球蛋白的片段,可举出Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、还原型IgG(rIgG)等包含具有抗原识别部位的免疫球蛋白的重链和轻链的复合体的免疫球蛋白片段。
在本说明书中,“抗体”是指可介由位于免疫球蛋白的可变区的至少1个抗原识别部位与多核苷酸等靶特异性结合的分子。本说明书中的“抗体”可包含IgG、IgA、IgD、IgE、IgM和它们的亚类等任意类型的免疫球蛋白、其片段(Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、rIgG等)、单链抗体(ScFv)、重链抗体、VHH(variable domain of heavy chain of heavy chainantibody)抗体、它们的变异体等。另外,本说明书中的“抗体”也可以为人源化抗体等嵌合抗体、抗体复合体和包含抗原识别部位的其它免疫球蛋白修饰体等。
在本说明书中,“VHH抗体”是指包含重链抗体的重链可变结构域(VHH)的抗体,优选是指由VHH构成的单结构域抗体。重链抗体是从骆驼科动物等发现的,本发明中使用的VHH抗体优选来自骆驼科动物。本发明所使用的VHH抗体中也可以包含重链抗体的恒定区的片段。
在本说明书中,作为骆驼科动物,可举出双峰骆驼、单峰骆驼、无峰骆驼、羊驼、小羊驼、原驼等,可举出优选羊驼。
在本说明书中,“抗体医药”是指以抗体为主成分的医药。在许多情况下,该主成分的抗体为单克隆抗体。作为抗体医药,上市了作为抗癌剂的利妥昔单抗(Rituxan(注册商标))、曲妥珠单抗(Herceptin(注册商标))、贝伐单抗(Avastin(注册商标))、作为抗风湿药的英夫利昔单抗(Remicade(注册商标))、阿达木单抗(Humira(注册商标))、作为血管生成抑制剂的雷珠单抗(Lucentis(注册商标))等,但本说明书中提及的抗体医药并不限定于这些。
在本申请说明书中,“表位”是指抗原上的被抗体识别并结合的与抗体的相互作用部位。
在本说明书中,氨基酸序列、核苷酸序列的同源性可以使用Karlin和Altschul的BLAST算法(Pro.Natl.Acad.Sci.USA,1993,90:5873-5877)来决定。基于该BLAST算法开发了被称为BLASTN、BLASTX、BLASTP、TBLASTN和TBLASTX的程序(J.Mol.Biol.,1990,215:403-410)。在使用这些程序的情况下,可以使用各程序的默认参数。这些解析方法的具体的方法是公知的(参照www.ncbi.nlm.nih.gov)。
在本说明书中,关于氨基酸序列和核苷酸序列的“至少85%的同源性”是指85%以上的同源性、优选90%以上的同源性、更优选95%以上的同源性、进一步优选97%以上的同源性、进一步优选98%以上的同源性、再进一步优选99%以上、再进一步优选100%的同源性。
在本说明书中,氨基酸序列和核苷酸序列上的“相当的位置”可以通过将目标序列和参照序列(例如序列号1的氨基酸序列)以对各氨基酸序列或核苷酸序列中存在的保守氨基酸残基或核苷酸赋予最大的同源性的方式排列(比对)来决定。比对可以使用公知的算法来执行,其步骤是本领域技术人员公知的。例如,比对可以通过以默认设定使用Clustal W多重比对程序(Thompson,J.D.et al,1994,Nucleic Acids Res.,22:4673-4680)来进行。Clustal W例如可以在欧洲生物信息学研究所(European Bioinformatics Institute:EBI[www.ebi.ac.uk/index.html])、国立遗传学研究所所经营的日本DNA数据库(DDBJ[www.ddbj.nig.ac.jp/Welcome-j.html])的网站上利用。
在本说明书中,氨基酸残基以以下的缩写记载:丙氨酸(Ala或A)、精氨酸(Arg或R)、天冬酰胺(Asn或N)、天冬氨酸(Asp或D)、半胱氨酸(Cys或C)、谷氨酰胺(Gln或Q)、谷氨酸(Glu或E)、甘氨酸(Gly或G)、组氨酸(His或H)、异亮氨酸(Ile或I)、亮氨酸(Leu或L)、赖氨酸(Lys或K)、甲硫氨酸(Met或M)、苯丙氨酸(Phe或F)、脯氨酸(Pro或P)、丝氨酸(Ser或S)、苏氨酸(Thr或T)、色氨酸(Trp或W)、酪氨酸(Tyr或Y)、缬氨酸(Val或V);和任意的氨基酸残基(Xaa或X)。另外,在本说明书中,肽的氨基酸序列依照常规方法,以氨基末端(以下称为N末端)位于左侧、羧基末端(以下称为C末端)位于右侧的方式记载。
本发明所提供的亲和载体包含固相载体和结合于该固相载体的免疫球蛋白结合蛋白质。本发明的亲和载体中所含的该免疫球蛋白结合蛋白质包含1个以上的VHH抗体变异体或其片段,优选包含1个以上的VHH抗体变异体。在该免疫球蛋白结合蛋白质包含2个以上的VHH抗体变异体或其片段的情况下,各变异体或其片段优选直接或介由连接肽彼此连结。在一个实施方式中,该免疫球蛋白结合蛋白质本质上由1个以上的VHH抗体变异体或其片段构成。在另一实施方式中,该免疫球蛋白结合蛋白质本质上由1个以上的VHH抗体变异体或其片段以及连接肽构成。
本发明的亲和载体中所含的该VHH抗体变异体或其片段与位于免疫球蛋白的Fab区域的表位特异性结合。该结合特性与以往通常作为配体使用的与免疫球蛋白Fc区域结合的蛋白A结构域不同。因此,通过使用了该VHH抗体变异体或其片段的亲和纯化,不仅能够分离具有Fc区域的完全体的抗体分子,还能够分离Fab这样的片段化抗体。
本发明中使用的VHH抗体变异体或其片段识别选自序列号22的氨基酸序列的127~184位和序列号23的氨基酸序列的13~210位中的至少1个区域、优选两个区域的表位。这些表位区域分别与曲妥珠单抗的Fab的轻链(序列号22)内区域和重链(序列号23)内区域相当。更详细而言,该VHH抗体变异体或其片段所识别的表位为选自序列号22的氨基酸序列的127-129位、157-158位、180-182位和184位以及序列号23的氨基酸序列的13位、119-125位、150-151位、153位、177-182位和210位中的至少1个部位,优选为它们中的多个部位,更优选为全部这些部位。
在本说明书中,有时将作为本发明所使用的VHH抗体变异体的基础的变异前的VHH抗体称为“亲本VHH抗体”。作为这样的本发明的VHH抗体变异体的亲本VHH抗体的例子,可举出来自野生型重链抗体的VHH抗体(也称为野生型VHH抗体)和具有与该野生型VHH抗体相同的抗原结合性的其变异体。
作为该亲本VHH抗体的优选的例子,可举出由序列号1~4中的任一氨基酸序列构成的多肽。序列号1~4表示对曲妥珠单抗的Fab区域具有亲和性的来自骆驼科动物的野生型VHH抗体的氨基酸序列。因此,作为本发明的变异体的亲本VHH抗体的进一步的例子,可举出由与序列号1~4中的任一氨基酸序列至少85%相同的氨基酸序列构成且对曲妥珠单抗的Fab区域具有亲和性的多肽。更优选该亲本VHH抗体为由与序列号1的氨基酸序列至少85%相同的氨基酸序列构成且对曲妥珠单抗的Fab区域具有亲和性的多肽。优选该亲本VHH抗体为来自骆驼科动物的VHH抗体,因此,本发明中使用的VHH抗体变异体优选为来自骆驼科动物的VHH抗体的变异体。
由序列号1~4的氨基酸序列构成的亲本VHH抗体在其氨基酸序列中具有CDR1~3的3个互补决定区(CDR):
序列号1的VHH抗体在序列号1的26~35位具有由序列号10的氨基酸序列构成的CDR1,在51~65位具有由序列号11的氨基酸序列构成的CDR2,在96~107位具有由序列号12的氨基酸序列构成的CDR3;
序列号2的VHH抗体在序列号2的26~37位具有由序列号13的氨基酸序列构成的CDR1,在53~68位具有由序列号14的氨基酸序列构成的CDR2,在99~118位具有由序列号15的氨基酸序列构成的CDR3;
序列号3的VHH抗体在序列号3的26~35位具有由序列号16的氨基酸序列构成的CDR1,在51~66位具有由序列号17的氨基酸序列构成的CDR2,在97~116位具有由序列号18的氨基酸序列构成的CDR3;
序列号4的VHH抗体在序列号4的26~35位具有由序列号19的氨基酸序列构成的CDR1,在51~66位具有由序列号20的氨基酸序列构成的CDR2,在97~116位具有由序列号21的氨基酸序列构成的CDR3。
优选由与序列号1~4中的任一氨基酸序列至少85%相同的氨基酸序列构成且对曲妥珠单抗的Fab区域具有亲和性的多肽即亲本VHH抗体具有与序列号1~4的亲本VHH抗体同等的互补决定区CDR1~3:
优选由与序列号1的氨基酸序列至少85%相同的氨基酸序列构成且对曲妥珠单抗的Fab区域具有亲和性的多肽在相当于序列号1的26~35位的区域具有由序列号10的氨基酸序列构成的CDR1,在相当于51~65位的区域具有由序列号11的氨基酸序列构成的CDR2,在相当于96~107位的区域具有由序列号12的氨基酸序列构成的CDR3;
优选由与序列号2的氨基酸序列至少85%相同的氨基酸序列构成且对曲妥珠单抗的Fab区域具有亲和性的多肽在相当于序列号2的26~37位的区域具有由序列号13的氨基酸序列构成的CDR1,在相当于53~68位的区域具有由序列号14的氨基酸序列构成的CDR2,在相当于99~118位的区域具有由序列号15的氨基酸序列构成的CDR3;
优选由与序列号3的氨基酸序列至少85%相同的氨基酸序列构成且对曲妥珠单抗的Fab区域具有亲和性的多肽在相当于序列号3的26~35位的区域具有由序列号16的氨基酸序列构成的CDR1,在相当于51~66位的区域具有由序列号17的氨基酸序列构成的CDR2,在相当于97~116位的区域具有由序列号18的氨基酸序列构成的CDR3;
优选由与序列号4的氨基酸序列至少85%相同的氨基酸序列构成且对曲妥珠单抗的Fab区域具有亲和性的多肽在相当于序列号4的26~35位的区域具有由序列号19的氨基酸序列构成的CDR1,在相当于51~66位的区域具有由序列号20的氨基酸序列构成的CDR2,在相当于97~116位的区域具有由序列号21的氨基酸序列构成的CDR3。
本发明中使用的VHH抗体变异体可通过使上述亲本VHH抗体的氨基酸残基变异而得到。在一个实施方式中,该VHH抗体变异体可通过对亲本VHH抗体的CDR插入至少1个His,或者在亲本VHH抗体的CDR中将至少1个氨基酸残基置换为His而得到。在以下的本说明书中,有时将这样得到的VHH抗体变异体称为“本发明的His变异体”。进行该His的插入或置换的亲本VHH抗体的CDR为选自上述的CDR1~3中的至少1个即可,更优选为CDR3。
在优选的实施方式中,本发明的His变异体可通过对由与序列号1~4的氨基酸序列至少85%相同的氨基酸序列构成且对曲妥珠单抗的Fab区域具有亲和性的多肽的CDR3插入至少1个His,或者在该CDR3中将至少1个氨基酸残基置换为His而得到。在更优选的实施方式中,本发明的His变异体可通过在由与序列号1的氨基酸序列至少85%相同的氨基酸序列构成且对且曲妥珠单抗的Fab区域具有亲和性的多肽的CDR3中将至少1个氨基酸残基置换为His而得到。在进一步优选的实施方式中,本发明的His变异体可通过在由与序列号1的氨基酸序列至少85%相同的氨基酸序列构成且对曲妥珠单抗的Fab区域具有亲和性的多肽的CDR3中将选自相当于序列号1的氨基酸序列的97位的位置、相当于100位的位置和相当于102位的位置中的至少1个位置的氨基酸残基置换为His而得到。优选应置换为His的氨基酸残基为相当于序列号1的97位的位置的氨基酸残基、相当于100位的位置的氨基酸残基、相当于102位的位置的氨基酸残基或相当于100位和102位的位置的氨基酸残基。
这样得到的本发明的His变异体具有对亲本VHH抗体插入了至少1个His或将至少1个氨基酸残基置换为His的CDR。优选本发明的His变异体具有对亲本VHH抗体插入了至少1个His或将至少1个氨基酸残基置换为His的CDR3。更优选本发明的His变异体具有相对于亲本VHH抗体将至少1个氨基酸残基置换为His的CDR3。本发明的His变异体优选除上述的His的插入或置换以外,具有与亲本VHH抗体相同的氨基酸序列的CDR。优选该亲本VHH抗体为由与序列号1的氨基酸序列至少85%相同的氨基酸序列构成且对曲妥珠单抗的Fab区域具有亲和性的多肽。
在优选的实施方式中,本发明的His变异体由如下氨基酸序列构成:与序列号1的氨基酸序列至少85%相同,且在选自相当于序列号1的氨基酸序列的97位的位置、相当于100位的位置和相当于102位的位置中的至少1个位置具有His。更优选本发明的His变异体由如下氨基酸序列构成:与序列号1的氨基酸序列至少85%相同,且在相当于序列号1的26~35位的区域具有由序列号10的氨基酸序列构成的CDR1、在相当于51~65位的区域具有由序列号11的氨基酸序列构成的CDR2、在相当于96~107位的区域具有由序列号12的氨基酸序列构成的CDR3,其中,在选自相当于序列号1的氨基酸序列的97位的位置、相当于100位的位置和相当于102位的位置中的至少1个位置具有His。进一步优选本发明的His变异体由如下氨基酸序列构成:在序列号1的氨基酸序列中,在相当于其97位的位置、相当于100位的位置、相当于102位的位置或相当于100位和102位的位置具有His。该His变异体的氨基酸序列与序列号1的氨基酸序列的同源性优选为90%以上,更优选为95%以上,进一步优选为97%以上,进一步优选为98%以上,进一步优选为99%以上。
作为本发明的His变异体的优选的例子,可举出由序列号5~8的氨基酸序列构成的多肽。
本发明的His变异体识别上述的本发明中使用的VHH抗体变异体所识别的表位。优选本发明的His变异体能够结合于曲妥珠单抗的Fab区域。
在进一步的实施方式中,本发明中使用的VHH抗体变异体可通过将亲本VHH抗体的氨基酸序列中的至少1个Lys置换为Arg而得到。在以下的本说明书中,有时将这样得到的VHH抗体变异体称为“本发明的Arg变异体”。
在优选的实施方式中,本发明的Arg变异体可通过在由与序列号1~4的氨基酸序列至少85%相同的氨基酸序列构成且对曲妥珠单抗的Fab区域具有亲和性的多肽的氨基酸序列中,将至少1个Lys置换为Arg而得到。在更优选的实施方式中,本发明的Arg变异体可通过在由与序列号1的氨基酸序列至少85%相同的氨基酸序列构成且对曲妥珠单抗的Fab区域具有亲和性的多肽的氨基酸序列中,将选自相当于序列号1的氨基酸序列的43位的位置、相当于53位的位置、相当于64位的位置、相当于75位的位置和相当于86位的位置中的至少1个位置中的Lys置换为Arg而得到。优选将相当于序列号1的43位、53位、64位、75位和86位的位置的Lys置换为Arg。
这样得到的本发明的Arg变异体由将亲本VHH抗体的氨基酸序列中的至少1个Lys置换为Arg的氨基酸序列构成。本发明的Arg变异体优选除上述的Arg置换以外,具有与亲本VHH抗体相同的氨基酸序列的CDR。优选该亲本VHH抗体为由与序列号1的氨基酸序列至少85%相同的氨基酸序列构成且对曲妥珠单抗的Fab区域具有亲和性的多肽。
在优选的实施方式中,本发明的Arg变异体由如下氨基酸序列构成:与序列号1的氨基酸序列至少85%相同,且在选自相当于序列号1的氨基酸序列的43位的位置、相当于53位的位置、相当于64位的位置、相当于75位的位置和相当于86位的位置中的至少1个位置具有Arg。更优选本发明的Arg变异体由如下氨基酸序列构成:与序列号1的氨基酸序列至少85%相同,且在相当于序列号1的26~35位的区域具有由序列号10的氨基酸序列构成的CDR1、在相当于51~65位的区域具有由序列号11的氨基酸序列构成的CDR2、在相当于96~107位的区域具有由序列号12的氨基酸序列构成的CDR3,其中,在选自相当于序列号1的氨基酸序列的43位的位置、相当于53位的位置、相当于64位的位置、相当于75位的位置和相当于86位的位置中的至少1个位置具有Arg。进一步优选本发明的Arg变异体由如下氨基酸序列构成:在序列号1的氨基酸序列中,在相当于其43位、53位、64位、75位和86位的位置具有Arg。该Arg变异体的氨基酸序列与序列号1的氨基酸序列的同源性优选为90%以上,更优选为95%以上。
作为本发明的Arg变异体的优选的例子,可举出由序列号9的氨基酸序列构成的多肽。
本发明的Arg变异体识别上述的本发明中使用的VHH抗体变异体所识别的表位。优选本发明的Arg变异体能够结合于曲妥珠单抗的Fab区域。
在进一步的实施方式中,本发明中使用的VHH抗体变异体可通过在由与序列号1的氨基酸序列至少85%相同的氨基酸序列构成且对曲妥珠单抗的Fab区域具有亲和性的多肽的氨基酸序列中,将相当于序列号1的氨基酸序列的84位的位置的Ser用其它氨基酸残基置换而得到。在以下的本说明书中,有时将这样得到的VHH抗体变异体称为“本发明的S84X变异体”。优选与该相当于84位的位置的Ser置换的氨基酸残基为Ala、Val或Thr。
这样得到的本发明的S84X变异体由如下氨基酸序列构成:与序列号1的氨基酸序列至少85%相同,且在相当于序列号1的氨基酸序列的84位的位置具有Ala、Val或Thr。更优选本发明的S84X变异体由如下氨基酸序列构成:与序列号1的氨基酸序列至少85%相同且在相当于序列号1的26~35位的区域具有由序列号10的氨基酸序列构成的CDR1、在相当于51~65位的区域具有由序列号11的氨基酸序列构成的CDR2、在相当于96~107位的区域具有由序列号12的氨基酸序列构成的CDR3,且在相当于序列号1的氨基酸序列的84位的位置具有Ala、Val或Thr。该S84X变异体的氨基酸序列与序列号1的氨基酸序列的同源性优选为90%以上,更优选为95%以上,进一步优选为97%以上,进一步优选为98%以上,进一步优选为99%以上。
本发明的S84X变异体识别上述的本发明中使用的VHH抗体变异体所识别的表位。优选本发明的S84X变异体能够结合于曲妥珠单抗的Fab区域。
本发明中使用的VHH抗体变异体可以为上述的本发明的His变异体、本发明的Arg变异体或本发明的S84X变异体,或者也可以为将这些变异组合而得的多重变异体。优选该多重变异体为该His变异体且Arg变异体的多重变异体。在任一情况下,该VHH抗体变异体均能够识别上述的表位,优选能够结合于曲妥珠单抗的Fab区域。
本发明中使用的VHH抗体变异体的片段可以为上述的本发明的His变异体、本发明的Arg变异体或本发明的S84X变异体的片段或者它们的多重变异体的片段。本发明中使用的该VHH抗体变异体的片段能够识别上述的本发明中使用的VHH抗体变异体所识别的表位,优选能够结合于曲妥珠单抗的Fab区域。
本发明中使用的VHH抗体变异体或其片段可通过该领域中公知的方法、例如基于氨基酸序列的化学合成法、重组法等来制造。例如,该VHH抗体变异体或其片段可通过将编码该变异体或其片段的多核苷酸(DNA等)编入载体,用该载体转化宿主细胞,将得到的转化体在培养基中进行培养并回收所表达的抗体或其片段而得到。编码该VHH抗体变异体或其片段的多核苷酸可通过对编码亲本VHH抗体的多核苷酸以在其所编码的多肽产生上述的His的插入或置换、Arg的置换等的方式进行变异导入而得到。作为用于对多核苷酸进行变异导入的具体的方法,可举出位点特异性突变、同源重组法、SOE(splicing by overlapextension)-PCR法(Gene,1989,77:61-68)等。对多核苷酸的变异导入的详细步骤是本领域技术人员周知的。
作为转化中使用的宿主,可举出大肠杆菌等细菌、酵母、真菌等微生物,优选大肠杆菌。作为转化中使用的载体,可以使用能够在宿主细胞内复制的已知的载体(质粒等)中的任一种,优选表达载体。作为优选的表达载体,可以使用能够在宿主细胞内复制的已知的载体中的任一种,例如可举出美国专利第5151350号说明书中记载的质粒、Sambrook等编集的Molecular Cloning(Cold Spring Harbor Laboratory Press,3rd edition,2001)等中记载的质粒。作为转化的方法,可以根据各宿主而使用该技术领域中已知的任一方法,例如可以利用Sambrook等编集的Molecular Cloning(Cold Spring Harbor LaboratoryPress,3rd edition,2001)等中记载的公知的方法。将得到的转化体(例如微生物细胞)进行培养并回收所表达的蛋白质的方法是本领域技术人员熟知的。或者,该VHH抗体变异体或其片段也可以使用无细胞蛋白质合成系统进行表达。
作为本发明的亲和载体中使用的免疫球蛋白结合蛋白质,在制造包含2个以上的该VHH抗体变异体或其片段的免疫球蛋白结合蛋白质的情况下,只要制作将编码该VHH抗体变异体或其片段的多核苷酸连接2个以上的多核苷酸,将其通过上述的步骤编入载体,用该载体转化宿主细胞,对得到的转化体进行培养并回收所表达的目标蛋白质即可。
因此,本发明还提供编码上述的本发明中使用的VHH抗体变异体的多核苷酸、包含其的载体、和包含该多核苷酸或载体的转化体。
包含上述的VHH抗体变异体或其片段的免疫球蛋白结合蛋白质可以作为亲和配体使用。通过将本发明的免疫球蛋白结合蛋白质固定于固相载体,能够制造本发明的亲和载体。本发明的亲和载体中使用的固相载体优选为不溶性载体。优选本发明的亲和载体为亲和色谱用载体。
作为该固相载体,可举出合成高分子系支承体、天然高分子系支承体等有机系支承体;无机系支承体;将它们组合而成的有机-有机复合系支承体、有机-无机复合系支承体等。作为合成高分子系支承体,例如可举出由聚乙烯醇类、聚(甲基)丙烯酸酯类、聚(甲基)丙烯酰胺类、聚苯乙烯类、乙烯-马来酸酐共聚物等构成的支承体。作为天然高分子系支承体,例如可举出由琼脂糖、葡聚糖、甘露聚糖、纤维素等多糖类构成的支承体。另外,也可以为将其进行物理交联、化学交联而成的支承体。作为无机系支承体,可举出由玻璃珠、硅胶、金属、金属氧化物等构成的支承体。这些之中,从流速特性的观点考虑,优选合成高分子系支承体。本发明的亲和载体即使在使用合成高分子系支承体作为支承体的情况下,也充分地具备防污性。作为合成高分子系支承体,优选单官能不饱和单体与多官能不饱和单体的共聚物,作为单官能不饱和单体,优选具有环氧基或开环环氧基的单官能不饱和单体。多官能不饱和单体的使用量相对于单官能不饱和单体100质量份,通常为1~100质量份,优选为1~50质量份。
支承体可以为非多孔,也可以为多孔,优选为多孔。另外,支承体的形态可以为粒子状、整块状、板状、切屑状、纤维状、膜状(包含中空丝)等中的任一种,从靶物质捕捉特性的观点看来,优选粒子状、整块状、板状、纤维状、膜状,更优选粒子状。
在支承体为粒子的情况下,从流速特性的观点考虑,其粒径优选为30μm以上,另外,从靶物质捕捉特性的观点考虑,其粒径优选为300μm以下。该粒径可通过聚合时的条件、分级等来调整。应予说明,本发明中的“粒径”是指利用激光衍射散射式粒度分布测定装置得到的体积平均粒径。
在支承体为多孔粒子的情况下,其比表面积在测定相当于孔径10~5000nm的范围的微孔时,以微孔孔径10nm~5000nm的比表面积计,优选为70m2/g以上,更优选为90m2/g以上。应予说明,本发明中的“比表面积”是指通过压汞法得到的细孔径10~5000nm的细孔所具有的表面积除以粒子的干燥质量而得的值。
支承体可以使用市售品,也可以使用依照常规方法合成的支承体。例如,合成高分子系支承体可依照日本特公昭58-058026号公报、日本特开昭53-090991号公报等中记载的公知的方法而得到。
作为配体(免疫球蛋白结合蛋白质)向该固相载体的结合方法,可以使用将蛋白质固定于载体的一般的方法进行。例如可举出使用具有羧基的载体,利用N-羟基琥珀酸酰亚胺使该羧基活化而与配体的氨基反应的方法;使用具有氨基或羧基的载体,在水溶性碳二亚胺等脱水缩合剂存在下与配体的羧基或氨基反应而形成酰胺键的方法;使用具有羟基的载体,用溴化氰等卤化氰使其活化而与配体的氨基反应的方法;将载体的羟基甲苯磺酰化或三氟乙烷磺酰化而与配体的氨基反应的方法;利用双环氧化物、表氯醇等将环氧基导入载体,与配体的氨基、羟基或硫醇基反应的方法;使用具有环氧基的载体,与配体的氨基或者羟基或硫醇基反应的方法等。上述中,从实施反应的水溶液中的稳定性的观点考虑,优选介由环氧基使配体结合的方法。
环氧基开环而生成的开环环氧基即醇羟基起到如下作用:将载体表面亲水化而防止蛋白质等的非特异吸附,并且在水中提高载体的韧性,防止高流速下的载体的破坏。因此,在使配体固定化后的载体中存在未与配体结合的残余的环氧基时,优选使该残余的环氧基开环。作为载体中的环氧基的开环方法,例如可举出在水溶剂中利用酸或碱在加热或室温下搅拌该载体的方法。另外,可以利用巯基乙醇、硫代甘油等具有巯基的封闭剂(blocking agent)、单乙醇胺等具有氨基的封闭剂使环氧基开环。更优选的开环环氧基是利用硫代甘油使载体中所含的环氧基开环而得到的开环环氧基。硫代甘油具有如下优点:作为原料与巯基乙醇等相比毒性低,并且,加成了硫代甘油的环氧开环基与利用了具有氨基的封闭剂的开环基相比,非特异吸附低,而且动态结合量变高。
也可以根据需要在固相载体与配体之间导入任意长度的分子(间隔区(spacer))。作为间隔区的例子,可举出聚亚甲基链、聚乙二醇链、糖类等。
本发明的亲和载体不仅能够分离完全体的免疫球蛋白分子,还能够分离Fab等片段化抗体。因此,本发明进一步提供使用本发明的亲和载体的免疫球蛋白或其片段的分离方法。本发明中所分离的免疫球蛋白或其片段优选为抗体,作为更优选的例子,可举出IgG、IgA、IgD、IgE、IgM和它们的亚类等任意类型的免疫球蛋白及其片段(例如Fab、Fab’、F(ab’)2、rIgG等)。
对本发明的一个实施方式的免疫球蛋白或其片段的分离方法进行说明。本实施方式的免疫球蛋白或其片段的分离方法优选包括如下工序,即,向固定有配体(包含上述的VHH抗体变异体或其片段的免疫球蛋白结合蛋白质)的亲和载体通入含有目标物质(免疫球蛋白或其片段)的试样,使该目标物质吸附于该载体的工序(第一工序),以及使该目标物质从该载体溶出的工序(第二工序)。
在该第一工序中,将含有目标物质的试样以该目标物质吸附于配体的条件流过填充有本发明的亲和载体的柱等。在该第一工序中,试样中的目标物质以外的物质几乎不吸附于配体而通过柱。然后,根据需要,为了除去较弱地保持于配体的一部分物质,可以将载体用含有NaCl等盐的中性的缓冲液进行清洗。
在该第二工序中,流过酸性的洗脱液,使吸附于配体的目标物质溶出。通过回收该溶出液,能够从试样分离目标免疫球蛋白或其片段。该洗脱液的pH优选为2以上,更优选为2.5以上,进一步优选为3以上,另一方面,优选为5以下,更优选为4.5以下,进一步优选为4以下。例如,该洗脱液的pH优选为2~5,更优选为2~4.5,更优选为2~4,进一步优选为2.5~5,进一步优选为2.5~4.5,进一步优选为2.5~4,再进一步优选为3~5,再进一步优选为3~4.5,再进一步优选为3~4。
在本发明的免疫球蛋白或其片段的分离方法的一个实施方式中,所分离的免疫球蛋白或其片段作为抗体医药使用。因此,在一个实施方式中,本发明提供使用本发明的亲和载体的抗体医药的制造方法。该方法的步骤除使用含有应使用于抗体医药的目标免疫球蛋白或其片段的试样以外,基本上与上述的免疫球蛋白或其片段的分离方法的步骤同样。
实施例
以下,举出实施例对本发明进一步具体地进行说明。另外,以下的记载概括地表示本发明的方式,在没有特别理由的情况下,本发明不受该记载限定。
参考例1多孔粒子的合成
(1)在360g的纯水中添加聚乙烯醇(Kuraray公司制PVA-217)3.58g,加热搅拌使聚乙烯醇溶解,冷却后,添加十二烷基硫酸钠(和光纯药工业制)0.36g、硫酸钠(和光纯药工业制)0.36g和亚硝酸钠(和光纯药工业制)0.18g,进行搅拌而制备水溶液S。
(2)使由甲基丙烯酸缩水甘油酯(三菱丽阳公司制)12.00g和二乙烯基苯(新日铁化学公司制)1.33g构成的单体组合物溶解于二异丁基酮(三井化学公司制)24.43g,制备单体溶液。
(3)将该水溶液S全部投入到500mL可拆式烧瓶内,安装温度计、搅拌叶片和冷却管并设置于温水浴,在氮气氛下开始搅拌。在该可拆式烧瓶内投入全部该单体溶液,利用温水浴进行加温。在内温达到85℃时添加2,2’-偶氮异丁腈(和光纯药工业公司制)0.53g。
(4)将得到的反应液一边维持温度在86℃一边搅拌3小时。接着,将反应液冷却后,过滤,用纯水和乙醇清洗。使清洗后的粒子分散于纯水进行3次倾析,除去小粒子。接着,以粒子的浓度成为10质量%的方式使粒子分散于纯水,得到分散液A。
(5)使由聚乙二醇二缩水甘油醚66.00g、硫酸钠(和光纯药工业制)45.70g构成的组合物与0.1M碳酸缓冲液388.3g混合,制备水溶液E。
(6)使硫代乙醇酸(和光纯药工业制)23.03g、硫酸钠(和光纯药工业制)7.10g溶解于纯水,加入氢氧化钠(和光纯药工业制)制备pH8.3、500mL的水溶液C。
(7)将抽滤水溶液E和分散液A而得的过滤物加入到1L的塑料瓶中,设置于转子式搅拌机,在室温条件下开始搅拌。2小时后,过滤液体,用纯水进行清洗。
(8)将该过滤物17.00g和水溶液C全部量加入到1L的塑料瓶中,设置于转子式搅拌机,在室温条件下开始搅拌。4小时后,过滤液体,用纯水、16vol%乙醇清洗。接着,以粒子体积成为50%(v/v)的方式使粒子分散于16vol%乙醇,得到多孔粒子(PB)分散液。
实施例1VHH抗体的制作
(1)VHH抗体2bS13的制作
制备编码由序列号1的氨基酸序列构成且与曲妥珠单抗(Herceptin(注册商标))结合的、来自骆驼科动物野生型重链抗体的VHH抗体2bS13和连接于其C末端的PB固定化用连接肽的质粒。使用该质粒转化大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)(NEW ENGLAND BIOLABS制)。将得到的转化体在37℃下进行孵育直至吸光度(OD600)达到约10为止,然后,以终浓度成为1mM的方式添加IPTG(和光纯药工业制),进一步在37℃下孵育5小时,使重组VHH抗体蛋白质表达。蛋白质表达后,通过离心分离来回收细胞,使其分散于pH8.5的Tris缓冲液中,使用均质机将细胞破坏。将得到的菌体破坏固体成分用胍盐酸盐(和光纯药)的含有改性剂的溶液进行分散,利用BioPro S和BioPro Q(株式会社YMC)将2bS13纯化。将纯化后的蛋白质相对于20mM磷酸缓冲液进行多次透析,进行复性。
(2)His置换变异VHH抗体的制作
制作将2bS13的CDR3的氨基酸残基置换为His的变异VHH抗体。制备编码将序列号1的97位氨基酸残基置换为His的变异VHH抗体2bS13-97H的质粒、编码将序列号1的100位氨基酸残基置换为His的变异VHH抗体2bS13-100H的质粒、编码将序列号1的102位氨基酸残基置换为His的变异VHH抗体2bS13-102H的质粒和编码将相当于序列号1的100位和102位的位置的氨基酸残基置换为His的变异VHH抗体2bS13-100-102H的质粒。使用这些质粒,通过与(1)同样的步骤制备CDR3中具有His置换的变异VHH抗体蛋白质2bS13-97H(序列号5)、2bS13-100H(序列号6)、2bS13-102H(序列号7)和2bS13-100-102H(序列号8)。
(3)Arg置换变异VHH抗体的制作
制作将2bS13中所含的Lys置换为Arg的变异VHH抗体。制备编码将2bS13的氨基酸序列中所含的5个Lys(序列号1的43位、53位、64位、75位和86位Lys)置换为Arg的变异VHH抗体2bS13-KR5的质粒。使用该质粒,通过与(1)同样的步骤制备变异VHH抗体蛋白质2bS13-KR5(序列号9)。
实施例2亲和载体的制备
使由N-羟基磺基琥珀酰亚胺(和光纯药工业制)0.22g、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(和光纯药工业制)0.95g构成的单体组合物溶解于0.02MMES缓冲液(pH5.5)1.84g,制备单体溶液。将该单体溶液与参考例1中取得的多孔粒子(PB)0.5g混合,设置于转子式搅拌机,在室温条件下开始搅拌。30分钟后,过滤液体,用0.02MMES缓冲液(pH5.5)和磷酸钠缓冲液(pH7.5)进行清洗。将得到的过滤物和实施例1中制备的任一VHH抗体以每1g多孔粒子的蛋白质量成为0.12g的方式混合于0.02M磷酸钠缓冲液(pH7.5)。将其在25℃振荡5小时使VHH抗体固定于多孔粒子,得到以VHH抗体为配体的亲和色谱用载体(2bS13/PB、2bS13-97H/PB、2bS13-100H/PB、2bS13-102H/PB、2bS13-100-102H/PB和2bS13-KR5/PB)。将残留于这些粒子的N-羟基磺基琥珀酰亚胺基使用三羟基甲基氨基甲烷封闭。然后,使用0.001M NaOH和0.1M柠檬酸缓冲液(pH2.5)清洗粒子,最终悬浮于PBS。
试验例1VHH抗体的抗原表位的确定
对实施例1中制备的VHH抗体所识别的表位进行调查。
(1)VHH抗体与曲妥珠单抗的复合体结晶的取得
将单克隆抗体曲妥珠单抗(Herceptin(注册商标))用木瓜蛋白酶消化,制备Fab。将得到的曲妥珠单抗Fab与来自骆驼科动物野生型重链抗体的VHH抗体2bS13(序列号1)混合,通过HPLC分取复合体。使用该复合体,利用蛋白质结晶化分注系统Gryphon(ArtRobbins Instruments社)进行结晶化,得到VHH抗体2bS13与曲妥珠单抗Fab的复合体的结晶。
(2)VHH抗体与曲妥珠单抗的复合体的立体结构的评价
根据得到的复合体结晶的X射线衍射数据进行复合体的建模和精密化。由该模型和VHH抗体、曲妥珠单抗Fab各自的模型算出构成各个蛋白质的各氨基酸残基在复合体形成前后的可及表面面积(Accessible surface area,以下,称为ASA)的变化。将曲妥珠单抗Fab的轻链(序列号22)和重链(序列号23)的氨基酸序列上的ASA的变化为1以上的位置的残基示于表1。在ASA的变化为1以上的情况下,可以认为在VHH抗体与曲妥珠单抗Fab之间产生相互作用,可以理解为该位置的残基为表位。根据这些结果,显示该VHH抗体并非蛋白A这样的结合于Fc区域的抗体,而是识别Fab的抗体。
[表1]
试验例2His置换变异VHH抗体的Ig结合解离行为的评价
对于实施例1中制备的2bS13、2bS13-97H、2bS13-100H和2bS13-102H,使用Biacore(GE Health Care公司)评价Ig结合能力。使该VHH抗体分散于HBS-EP(10mMHepes、150mM NaCl、3mM EDTA和0.005%Tween-20),得到12.5~150nM的VHH抗体溶液。将试验例1中制备的曲妥珠单抗Fab固定于Biacore传感器芯片,对其应用该VHH抗体溶液。测定在pH7.4的中性条件下进行。将使用了Binding model的曲线拟合应用于结合和解离行为,评价结合速度常数(Kon)和结合解离常数(Koff)、亲和性(KD)。进而,将该传感器芯片用酸性的洗脱液(10mM Glycine-HCl+0.5M NaCl、pH2.0)进行清洗并测定信号,根据得到的信号形状调查基于酸的Ig溶出行为。刚用洗脱液清洗后的信号的衰减越早,在酸性条件下VHH抗体越容易从抗体固定化传感器芯片脱离,即表示VHH抗体的Ig溶出效率高。
将测定结果示于表2和图1。如表2所示,显示了变异VHH抗体在中性条件下,相对于曲妥珠单抗Fab,均具有与亲本抗体2bS13同等的KD值,变异VHH抗体均具有与亲本抗体同等的Ig结合能力。另外,显示了变异VHH抗体与亲本抗体2bS13相比,利用酸性的洗脱液刚清洗后(图1中由四方形包围的区域)的信号的衰减率均高,与亲本抗体相比,酸性条件下的Ig溶出行为均提高。
[表2]
试验例3使用了His置换变异VHH抗体的亲和载体的Ig溶出能力
使用填充有实施例2中得到的亲和载体2bS13/PB、2bS13-100H/PB和2bS13-100-102H/PB的色谱柱进行亲和色谱,评价酸性条件下的自载体的Ig溶出能力。全部色谱实验用AKTA avant 150(GE Healthcare公司制)进行。色谱用柱使用Tricorn 5/50柱(GEHealthcare公司制),填充实施例2中得到的亲和载体(柱体积1mL)。对于结合于载体的Ig,使用与试验例1相同的曲妥珠单抗Fab。装载液体使用pH7.5的柠檬酸钠缓冲液,洗脱液依次使用pH3.0和2.5的柠檬酸钠缓冲液。通过连续监测来自柱的溶出物的OD280,从而测定溶出物中的Ig量。调查用pH3.0洗脱液和pH2.5洗脱液溶出的馏分中OD280的值为0.12AU以上的馏分的体积。
将来自柱的溶出物的OD280的变化示于图2。使用了没有His置换的配体的载体2bS13/PB在pH3.0下几乎不溶出Ig,进而,即使将pH降低至2.5,Ig的溶出量也很少。与此相对,在使用了有His置换变异的配体的载体2bS13-100H/PB中,结合的Ig大部分在pH3.0下溶出。进而,使用了双重His置换变异体的载体2bS13-100-102H/PB在pH3.0下将结合的Ig几乎全部溶出。
表3示出结合于载体的Ig的溶出所需的洗脱液的量。使用了具有His置换变异的配体的载体能够以pH3.0的洗脱液将充分量的Ig溶出。如果配体的His置换数变多,Ig溶出所需的洗脱液的量进一步减少。另一方面,使用了没有His置换的配体的载体即使大量使用pH2.5以上的洗脱液,也无法将充分量的Ig溶出。
[表3]
试验例4使用了Arg置换变异VHH抗体的亲和载体的Ig结合能力
(1)配体固定量的测定
使用实施例2中制备的固定有VHH抗体2bS13或变异2bS13-KR5的亲和载体1mg进行BCA蛋白质测试。基于标准曲线确定配体固定量。
(2)静态结合容量(SBC)的测定
在(1)中制备的固定有VHH抗体的基质3mg中添加溶解于磷酸钠缓冲液(pH7.5)的与试验例1相同的曲妥珠单抗Fab 0.5g,使用振荡机在25℃搅拌。1小时后过滤溶液,用磷酸钠缓冲液(pH7.5)清洗,将清洗液与滤液混合。测定所得到的水溶液的OD280,确定漏出的Fab量。通过从初期添加Fab量减去漏出的Fab量,从而算出静态结合容量(SBC)。
将测定结果示于表4。表4所示的数据是针对各载体的3次测定结果和其平均值。
[表4]
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序列表
<110> JSR株式会社
<120> 使用变异VHH抗体的亲和载体
<130> JSR0091
<150> JP 2018-117403
<151> 2018-06-20
<160> 23
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 118
<212> PRT
<213> 无峰驼
<220>
<223> VHH 抗体 2bS13
<400> 1
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Ser Phe Ala Ile Asn
20 25 30
Asn Val Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Leu Ile Asp Lys Tyr Asp Thr Gly Asn Ile Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Ser Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Ala Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn
85 90 95
Ala Leu Gly Thr Trp Ile Arg Ala Gly Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Gln Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 2
<211> 129
<212> PRT
<213> 无峰驼
<220>
<223> VHH 抗体 HL22
<400> 2
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Thr Phe Asp
20 25 30
Asp Phe Thr Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu
35 40 45
Gly Val Ser Cys Leu Ser Ser Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Glu Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Asn Ala Lys Asn Thr
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Glu Ala Ala Leu Gly Arg Asn Trp Ser Pro Glu Asp Leu Cys
100 105 110
Arg Ala Asp Phe Gly Ser Arg Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser
<210> 3
<211> 127
<212> PRT
<213> 无峰驼
<220>
<223> VHH 抗体
<220>
<223> 变异 VHH 抗体 HL26
<400> 3
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Asp Tyr Tyr
20 25 30
Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Leu Cys Ile Ser Ser Ser Gly Asp Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Val Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gly Thr Asp Ala Pro Tyr Tyr Ser Asp Asn Ser His Arg Cys Leu Ala
100 105 110
Asp Phe Gly Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 4
<211> 127
<212> PRT
<213> 无峰驼
<220>
<223> VHH 抗体 3bS19
<400> 4
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Val Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ser Cys Ile Ser Ser Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Glu Gly Pro Thr Val Leu Asp Gly Cys Ile Val Asp Ser Gly Ser
100 105 110
Tyr Tyr Phe Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 5
<211> 118
<212> PRT
<213> 无峰驼
<220>
<223> 变异 VHH 抗体 2bS13-97H
<400> 5
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Ser Phe Ala Ile Asn
20 25 30
Asn Val Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Leu Ile Asp Lys Tyr Asp Thr Gly Asn Ile Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Ser Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Ala Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn
85 90 95
His Leu Gly Thr Trp Ile Arg Ala Gly Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Gln Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 6
<211> 118
<212> PRT
<213> 无峰驼
<220>
<223> 变异 VHH 抗体 2bS13-100H
<400> 6
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Ser Phe Ala Ile Asn
20 25 30
Asn Val Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Leu Ile Asp Lys Tyr Asp Thr Gly Asn Ile Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Ser Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Ala Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn
85 90 95
Ala Leu Gly His Trp Ile Arg Ala Gly Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Gln Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 7
<211> 118
<212> PRT
<213> 无峰驼
<220>
<223> 变异 VHH 抗体 2bS13-102H
<400> 7
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Ser Phe Ala Ile Asn
20 25 30
Asn Val Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Leu Ile Asp Lys Tyr Asp Thr Gly Asn Ile Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Ser Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Ala Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn
85 90 95
Ala Leu Gly Thr Trp His Arg Ala Gly Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Gln Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 8
<211> 118
<212> PRT
<213> 无峰驼
<220>
<223> 变异 VHH 抗体 2bS13-100-102H
<400> 8
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Ser Phe Ala Ile Asn
20 25 30
Asn Val Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Leu Ile Asp Lys Tyr Asp Thr Gly Asn Ile Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Ser Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Ala Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn
85 90 95
Ala Leu Gly His Trp His Arg Ala Gly Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Gln Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 9
<211> 118
<212> PRT
<213> 无峰驼
<220>
<223> 变异 VHH 抗体 2bS13-KR5
<400> 9
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Ser Phe Ala Ile Asn
20 25 30
Asn Val Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Arg Gln Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Leu Ile Asp Arg Tyr Asp Thr Gly Asn Ile Ala Asp Ser Val Arg
50 55 60
Gly Arg Phe Ser Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Thr Ala Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn
85 90 95
Ala Leu Gly Thr Trp Ile Arg Ala Gly Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Gln Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 10
<211> 10
<212> PRT
<213> 无峰驼
<220>
<223> VHH 抗体 2bS13中的CDR1
<400> 10
Gly Ile Ser Phe Ala Ile Asn Asn Val Ala
1 5 10
<210> 11
<211> 15
<212> PRT
<213> 无峰驼
<220>
<223> VHH 抗体 2bS13中的CDR2
<400> 11
Ile Asp Lys Tyr Asp Thr Gly Asn Ile Ala Asp Ser Val Lys Gly
1 5 10 15
<210> 12
<211> 12
<212> PRT
<213> 无峰驼
<220>
<223> VHH 抗体 2bS13中的CDR3
<400> 12
Asn Ala Leu Gly Thr Trp Ile Arg Ala Gly Pro Tyr
1 5 10
<210> 13
<211> 12
<212> PRT
<213> 无峰驼
<220>
<223> VHH 抗体 HL22中的CDR1
<400> 13
Gly Phe Ser Phe Thr Phe Asp Asp Phe Thr Ile Gly
1 5 10
<210> 14
<211> 16
<212> PRT
<213> 无峰驼
<220>
<223> VHH 抗体 HL22中的CDR2
<400> 14
Leu Ser Ser Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Glu Asp Ser Val Lys Gly
1 5 10 15
<210> 15
<211> 20
<212> PRT
<213> 无峰驼
<220>
<223> VHH 抗体 HL22中的CDR3
<400> 15
Glu Ala Ala Leu Gly Arg Asn Trp Ser Pro Glu Asp Leu Cys Arg Ala
1 5 10 15
Asp Phe Gly Ser
20
<210> 16
<211> 10
<212> PRT
<213> 无峰驼
<220>
<223> VHH 抗体 HL26中的CDR1
<400> 16
Gly Phe Thr Leu Asp Tyr Tyr Ala Ile Gly
1 5 10
<210> 17
<211> 16
<212> PRT
<213> 无峰驼
<220>
<223> VHH 抗体 HL26中的CDR2
<400> 17
Ile Ser Ser Ser Gly Asp Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
1 5 10 15
<210> 18
<211> 20
<212> PRT
<213> 无峰驼
<220>
<223> VHH 抗体 HL26中的CDR3
<400> 18
Gly Thr Asp Ala Pro Tyr Tyr Ser Asp Asn Ser His Arg Cys Leu Ala
1 5 10 15
Asp Phe Gly Ser
20
<210> 19
<211> 10
<212> PRT
<213> 无峰驼
<220>
<223> VHH 抗体 3bS19中的CDR1
<400> 19
Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Val Ile Gly
1 5 10
<210> 20
<211> 16
<212> PRT
<213> 无峰驼
<220>
<223> VHH 抗体 3bS19中的CDR2
<400> 20
Ile Ser Ser Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
1 5 10 15
<210> 21
<211> 20
<212> PRT
<213> 无峰驼
<220>
<223> VHH 抗体 3bS19中的CDR3
<400> 21
Ala Glu Gly Pro Thr Val Leu Asp Gly Cys Ile Val Asp Ser Gly Ser
1 5 10 15
Tyr Tyr Phe Ser
20
<210> 22
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 嵌合抗体; 曲妥珠单抗 Fab 轻链
<400> 22
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 23
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 嵌合抗体; 曲妥珠单抗 Fab 重链
<400> 23
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly
Claims (3)
1.一种亲和载体,包含固相载体和结合于该固相载体的免疫球蛋白结合蛋白质,
该免疫球蛋白结合蛋白质包含VHH抗体的变异体,该VHH抗体的变异体识别选自序列号22的氨基酸序列的127~184位和序列号23的氨基酸序列的13~210位中的至少1个区域的表位,
该VHH抗体的变异体为下述(1)或(2):
(1)由在变异前的VHH抗体中、将选自相当于序列号1的氨基酸序列的97位的位置、相当于100位的位置和相当于102位的位置中的至少1个位置的氨基酸残基置换为组氨酸的氨基酸序列构成的多肽,
(2)由在变异前的VHH抗体中、将相当于序列号1的氨基酸序列的43位的位置、相当于53位的位置、相当于64位的位置、相当于75位的位置和相当于86位的位置中的赖氨酸置换为精氨酸的氨基酸序列构成的多肽;
该变异前的VHH抗体是由与序列号1的氨基酸序列至少90%序列相同的氨基酸序列构成且对曲妥珠单抗的Fab区域具有亲和性的多肽,所述与序列号1的氨基酸序列至少90%序列相同的氨基酸序列在相当于序列号1的26~35位区域的CDR1区域具有序列号10的氨基酸序列,在相当于序列号1的51~65位区域的CDR2区域具有序列号11的氨基酸序列,在相当于序列号1的96~107位区域的CDR3区域具有序列号12的氨基酸序列。
2.一种亲和载体,包含固相载体和结合于该固相载体的免疫球蛋白结合蛋白质,所述免疫球蛋白结合蛋白质包含由序列号5~8中的任一氨基酸序列构成的多肽。
3.一种亲和载体,包含固相载体和结合于该固相载体的免疫球蛋白结合蛋白质,所述免疫球蛋白结合蛋白质包含由序列号9的氨基酸序列构成的多肽。
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