CN103459427A

CN103459427A - 针对人IgG抗体的CH1结构域中表位的抗原结合蛋白

Info

Publication number: CN103459427A
Application number: CN2012800158866A
Authority: CN
Inventors: W·J·J·赫尔曼斯; S·布洛克兰; M·A·范克斯特伦; J·M·霍勒弗特; F·J·M·德特默斯
Original assignee: Bacip Pte Ltd
Current assignee: Bacip Pte Ltd; BAC IP BV
Priority date: 2011-02-01
Filing date: 2012-01-31
Publication date: 2013-12-18
Anticipated expiration: 2032-01-31
Also published as: US20180305461A1; EP2670779A1; US20130337478A1; WO2012105833A1; CN103459427B; US9850315B2; EP2670779B1; EP3266800B1; EP3266800A1

Abstract

本发明涉及用抗原结合蛋白纯化包含人IgG-CH1结构域的分子的方法，所述抗原结合蛋白能结合包含在人IgG1、人IgG2、人IgG3和人IgG4的每一个的CH1结构域中的表位。本发明进一步涉及能用于本发明方法中的抗原结合蛋白。本发明的抗原结合蛋白的构架区优选相应于天然没有轻链的抗体的那些构架区，例如可以在骆驼中发现的抗体。本发明进一步涉及编码这种抗原结合蛋白的核酸，包含这种蛋白的免疫吸附材料，及这种免疫吸附材料从各种物质中纯化含有IgG-CH1结构域的分子的用途。

Description

针对人IgG抗体的CH1结构域中表位的抗原结合蛋白

发明领域

本发明涉及生物化学及免疫学领域，特别是免疫亲和性及抗体技术。本发明涉及用能结合人CH1结构域的抗原结合蛋白捕获包含人IgG-CH1结构域的靶分子的方法。本发明进一步涉及用于所述方法中的手段，包括衍生自骆驼(camelid)抗体的抗原结合蛋白，包含这种蛋白的免疫吸附材料及其生产手段和方法。

发明背景

哺乳动物IgG抗体和／或其Fab片段、特别是人和／或人源化IgG抗体和／或其Fab片段的高效、快速、节约和成本高效的纯化是现有技术中深入研究的问题。随着新的基于抗体药物的出现，IgG和／或其Fab片段的纯化在基于抗体药物生产中变成更关键和昂贵的步骤，需要高纯度。另外，这种治疗性抗体必须保持它们的结合亲和性及生物学活性，包括效应物功能。

为了纯化所有4个亚类的人或人源化IgG，即人／人源化IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，常用纯化方法包括使用经典生化分离和纯化技术如阴离子／阳离子交换、大小排阻／凝胶过滤、沉淀及应用特异性亲和性配体。常用亲和性配体是细菌衍生的蛋白A和蛋白G，单克隆抗体及骆驼抗体或者衍生自其中的结合片段，其结合4个亚类人或人源化IgG的一或多个亚类。

蛋白A结合人IgG1、人IgG2和人IgG4(Fc)的CH2-CH3界面，因此不能用于纯化人IgG3，因此不能用于所有人IgG亚类。蛋白A显示与VH3家族的一些人VH结构域结合，但是不与人VH1和VH2结合(Janssonet al(1998)FEMS Immunology and Medical Microbiology20：69-78)，因此蛋白A不能用作通用工具纯化所有人IgG衍生的Fab片段。另外，蛋白A不能用于从由人IgG Fc-和Fab片段的混合物组成的原料样品中选择性捕获人IgG衍生的Fab片段，因为其对IgG Fc结构域的结合反应性更突出。另外，基于Z结构域的蛋白A变体(如MabSelect Sure)缺少结合人VH3结构域的能力，因此不能用于Fab纯化。

蛋白G是由C和G群链球菌表达的细菌表面蛋白。蛋白G以高亲和性识别在人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4抗体的Fc部分(Fcγ)上CH2和CH3结构域之间界面处的共同位点。另外，蛋白G显示通过结合IgG的CH1结构域组合kappa同种型的CL结构域而结合IgG抗体的Fab部分(Derrick andWigley(1994)J.Mol.Biol.243：906-918)。蛋白G仅结合来自IgG1、IgG3和IgG4的Fab，但是不结合IgG2的Fab(Perosa et al(1997)Journal ofImmunological Methods203：153-155)。对CH1的结合亲和性显著低于Fc部分上的其表位，这例如反映在必须使用低流速以使得有效纯化人Fab片段(Proudfoot et al.(1992)Protein expression and purification3：368-373)。关于蛋白G在CH2和CH3结构域界面的结合，实验数据表明发生诱导契合，其可以解释洗脱所需的严苛条件，如在等于或低于pH2.5的洗脱pH所示(PROTEUS，Protein G Antibody Purification Handbook；Mini&Midi spincolumns；5September2005；Pro-Chem，Littleton，USA)。这些严苛条件可影响结合位点的构象，由此改变纯化的IgG抗体的免疫功能(P.Gagnon，1996，inPurification tools for monoclonal antibodies，published by Validated Biosystems，Inc5800N)。X-射线晶体测量示出通过结合蛋白A，CH2结构域可以朝CH3结构域纵向移位，其最终导致CH2结构域之间碳水化合物区域的部分旋转及去稳定化。所述变形干扰随后的蛋白质-蛋白质相互作用，这种相互作用是IgG发挥其效应物功能所需的。除了严苛洗脱条件对抗原结合能力的后果(特别是对于蛋白G)，这些二级作用有时干扰或改变抗体效应物功能及增加免疫球蛋白对蛋白酶解的易感性。如果人或人源化抗体用作治疗目的，由变性导致的效应物功能的丧失改变折叠及纯化步骤期间产生的化学修饰是非常不希望的。特别地，分子内及分子间硫桥的还原经常是纯化和储存期间产生的问题。

蛋白L经VL kappa1、3和4结合人Fab，但是不结合VL kappa2及不结合lambda同种型的任何VL结构域。因此，蛋白L不结合全部人IgG衍生的Fab片段并且不是仅对IgG选择性的。

作为人IgG结合蛋白如蛋白G的替代，在文献中已描述一些小鼠单克隆抗体(Mab)能够结合人IgG抗体的Fc结构域(Nelson PN，et al.Characterisation of anti-IgG monoclonal antibody A57H by epitope mapping.Biochem Soc Trans1997；25：373)。已鉴别一些共同Fc表位，例如：Mab G7C、JD312具有在CH2上的结合表位，氨基酸290-KPREE-294。Mab PNF69C、PNF110A、PNF211C具有在CH2-CH3上的结合表位，AA：338-KAKGQPR-344。Mab A57H显示在CH3上的结合表位，AA380-EWESNGQPE-388。与使用小鼠Mab或者来自其它非人物种的Mab相关的问题是Mab从基质释放导致纯化的制备物中的污染很难被除去。另外，Mab及其功能片段(Fab、Fab2)容易变性，对于分子的正确3D结构及重链和轻链排列所需的S-S桥容易被破坏，特别是在经常是释放柱结合人IgG所需的严苛洗脱条件下。由于基于Mab的亲和性配体的弱点，柱容量快速降低，柱在洗脱后的再利用能力非常有限并且不适合连续操作。

代替EP-A-434317所述的(sc)Fv片段，如WO2006／059904所述的衍生自天然缺乏轻链的抗体的抗体片段(VHH)也可以用于产生免疫吸附材料用于人IgG抗体的纯化。应用这些VHH片段的优势是它们是单结构域肽，甚至在更高温度下也非常稳定。另外，VHH小，容易在节约成本的宿主生物体如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中生产。另外，由于这些VHH片段与人VH3结构域家族之间的序列相似性，预期与细菌表面蛋白如蛋白A和G相比免疫原性非常低。这些抗体在EP-A-656946中更详细描述。

WO2006／059904所述的氨基酸序列涉及结合kappa或lambda同种型的人抗体轻链的VHH片段，因此不能选择性纯化仅IgG同种型的抗体和／或Fab片段。另外，在例如表达人IgG抗体和／或其Fab片段的细胞系的上清中存在的过量轻链也会被所述配体捕获。合成配体如Fabsorbent^TM FlP HF(ProMetic BioSciences Ltd，Cambridge，UK)具有相同缺点。

WO2009／011572所述的氨基酸序列涉及结合人IgG的Fc部分的VHH片段。因此它们不能纯化不包含Fc结构域的人IgG的片段，如人IgG的F(ab’)₂片段的Fab。

Carredano et al.描述了用于人Fab纯化的合成亲和性配体的开发，它们结合所有IgG-kappa类型抗体共有的保守腔(在IgG CH1和CL-kappa结构域之间形成的小袋)(Carredano et al.(2004)Protein Science13：1476-1488)。尽管IgG-CH1被认为是在不同IgG Fab片段之间最保守的区域，但是Carredano et al.的结论是这个结构域对于产生好的结合亲和性配体是不太合适的，因为其扁平结构(也在Derrick et al.如前中报道)。相反，选择上述腔，因此没有对包含lambda同种型轻链的人Fab片段的反应性。

因此，现有技术中已知的结合剂已被描述可以用于纯化人IgG抗体和／或其Fab片段。但是这些结合剂(本身)无一能提供通用纯化方法用于所有人IgG抗体和／或其Fab片段。因此，现有技术需要新的手段和方法以获得捕获和／或纯化人或人源化IgG1、IgG2、IgG3和IgG4和／或其Fab片段的通用方法。

发明概述

在第一方面，本发明涉及用于捕获包含人IgG-CH1结构域的靶分子的方法，其中所述方法包括步骤：a)将包含靶分子的样品与固定化于支持物上的包含抗原结合蛋白的免疫吸附材料接触；及b)使得靶分子通过特异性结合抗原结合蛋白而被免疫吸附材料捕获；其中所述抗原结合蛋白能够结合单表位，所述表位包含在人IgG1、人IgG2、人IgG3和人IgG4的每一个的CH1结构域中，其中所述抗原结合蛋白被具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的VHH交叉阻断(cross-blocked)或者其中所述抗原结合蛋白被具有SEQ IDNO：1-158任一氨基酸序列的VHH交叉阻断，优选其中所述抗原结合蛋白包含免疫球蛋白衍生的可变结构域，所述可变结构域包含针对所述表位的完整抗原结合位点。

在一个优选实施方案中，所述抗原结合蛋白包含：a)可得自骆驼或鲨鱼的抗体，所述抗体仅由重链组成并且天然缺少轻链；b)在a)中限定的抗体的可变结构域；或者c)可变结构域，其中在b)中限定的可变结构域的构架序列移植有得自其它来源的CDR。

在一个优选实施方案中，所述靶分子是选自下组的分子：人或人源化IgG1分子、人或人源化IgG2分子、人或人源化IgG3分子、人或人源化IgG4分子、人或人源化IgG Fab、人或人源化IgG F(ab’)₂、单臂(one armed)人或人源化IgG抗体、单链人或人源化IgG抗体、IVIG及人或人源化IgG消化物。在一个优选实施方案中，所述人或人源化IgG消化物是木瓜蛋白酶或胃蛋白酶人IgG消化物。

或者或与早前的优选实施方案组合，在一个优选实施方案中，所述抗原结合蛋白结合CH1结构域的表位，所述表位包含一或多个氨基酸：在122位的苯丙氨酸，在127和128位的任一位置不是半胱氨酸或者是单个半胱氨酸，在156位的丝氨酸或赖氨酸和／或在216位的天冬酰胺或丝氨酸，其中所述氨基酸位置是基于Kabat编号。

或者或与早前的优选实施方案组合，在一个优选实施方案中，所述抗原结合蛋白是：a)抗体；b)包含完整抗原结合位点的抗体片段；c)没有轻链的单结构域重链抗体；d)包含完整抗原结合位点的没有轻链的单结构域重链抗体的片段；或者e)包含完整抗原结合位点的免疫球蛋白衍生的可变结构域。优选地，所述抗原结合蛋白是骆驼VHH或骆驼化VH。

在优选的实施方案中，本发明涉及纯化靶分子的方法，所述方法包括在如前述实施方案限定的方法中用免疫吸附材料捕获靶分子，其中所述方法进一步包括步骤：c)在降低靶分子与免疫吸附材料之间的亲和性的条件下洗脱结合的靶分子，及任选地回收靶分子。在一个优选实施方案中，所述抗原结合蛋白不结合游离轻链，更优选不结合人抗体的游离轻链，更优选不结合人IgG的轻链。

在一个方面，本发明涉及纯化包含人IgG-CH1结构域的Fab片段而不共纯化游离轻链的方法，其中所述方法包括步骤：a)将包含靶分子和游离轻链的样品与固定化于支持物上的包含抗原结合蛋白的免疫吸附材料接触；b)使得靶分子通过特异性结合抗原结合蛋白而被免疫吸附材料捕获；及c)在降低靶分子与免疫吸附材料之间的亲和性的条件下洗脱结合的靶分子，及任选地回收靶分子；其中所述抗原结合蛋白如前述任一实施方案限定。

在一个方面，本发明涉及从液体中吸附包含人IgG-CH1结构域的靶分子的体外方法，所述方法包括将免疫吸附材料与液体接触的步骤，其中所述免疫吸附材料包含固定化于载体上的如前述任一实施方案限定的抗原结合蛋白，及其中优选抗原结合蛋白通过共价连接固定化于载体上。

在一个方面，本发明涉及前述任一实施方案限定的抗原结合蛋白。

在一个方面，本发明进一步涉及包含编码本发明的抗原结合蛋白的核苷酸序列的核酸。

在一个方面，本发明进一步涉及包含本发明的核酸的宿主细胞。

在一个方面，本发明涉及产生本发明的抗原结合蛋白的方法，所述方法包括在有助于所述抗原结合蛋白表达的条件下培养本发明的宿主细胞的步骤。

在进一步的方面，本发明涉及包含本发明的抗原结合蛋白的免疫吸附材料。

在进一步的方面，本发明涉及本发明的抗原结合蛋白或本发明的免疫吸附材料用于检测和／或纯化包含人IgG-CH1结构域的靶分子的用途，优选用于体外检测和／或体外纯化包含人IgG-CH1结构域的靶分子的用途。在一个优选实施方案中，所述靶分子是选自下组的分子：人或人源化IgG1、人或人源化IgG2、人或人源化IgG3、人或人源化IgG4、人或人源化IgG Fab、人或人源化IgG F(ab’)₂、单臂人或人源化IgG抗体、单链人或人源化IgG抗体、IVIG及人或人源化IgG消化物。在一个优选实施方案中，所述人IgG消化物是木瓜蛋白酶或胃蛋白酶人或人源化IgG消化物。在一个优选实施方案中，所述靶分子是人IgG或者人或人源化IgG Fab而无游离轻链的共结合。在一个优选实施方案中，所述靶分子是存在游离轻链的人IgG Fab。

发明描述

定义

“序列相同性”或“相同性”在本文定义为通过比较序列而确定的两个或更多个氨基酸(多肽或蛋白质)序列或者两个或更多个核酸(多核苷酸)序列之间的关系。在本领域中，“相同性"还指氨基酸或核酸序列之间的序列相关性程度，可以通过这种序列串之间的匹配而确定。两个氨基酸序列之间的“相似性”是通过比较一个多肽的氨基酸序列及其保守氨基酸取代物与第二个多肽的序列而确定。“相同性”和“相似性”可以容易地通过已知方法计算。术语“序列相同性”或“序列相似性”是指两个(多)肽或两个核苷酸序列当优选在(至少进行比较的最短序列的)整个长度上最佳排列对比时并且如通过程序ClustalW(1.83)、GAP或BESTFIT使用默认参数使匹配数最大化及使缺口数最小化，共享至少一定百分比的序列相同性，如在本文它处定义。GAP使用Needleman and Wunsch全局对比算法在它们的整个长度上对比两个序列，使匹配数最大化及缺口数最小化。一般地，使用GAP默认参数，缺口产生罚分=50。ClustalW(1.83)使用blosum矩阵及默认设置(Gap开口罚分(opening penalty)：10；Gap延长罚分(extension penalty)：0.05)。用于序列相同性百分比的序列对比及评分可以使用计算机程序如GCG Wisconsin Package，Version10.3，得自Accelrys Inc.，9685Scranton Road，San Diego，CA92121-3752USA确定，或者使用开放来源软件如程序“needle"(使用全局Needleman Wunsch算法)或“water'’(使用局部Smith Waterman算法)于(核苷酸)／8(蛋白质)和缺口延长罚分=3(核苷酸)／2(蛋白质)而确定。对于核苷酸，使用的默认评分矩阵是nwsgapdna，对于蛋白质，默认评分矩阵是Blosum62(Henikoff&Henikoff，1992，PNAS89，915-919)。用于对比本发明的蛋白质序列的优选的多对比程序EmbossWIN version2.10.0，使用如上述GAP相同的参数，或者使用默认设置(对于“needle”及“water”以及对于蛋白质及DNA对比，默认Gap开口罚分是10.0，默认缺口延长罚分是0.5；默认评分矩阵对于蛋白质是Blossum62，对于DNA是DNAFull)。当序列具有实质上不同的整体长度时，优选局部对比，如使用Smith Waterman算法的那些。或者，相似性或相同性百分比可以通过用例如FASTA、BLAST等算法对公共数据库进行检索而确定。

抗体或免疫球蛋白(Ig)上下文中的“同种型”在本文用于定义已知为IgA、IgD、IgE、IgG和IgM的抗体同种型。“人IgG亚类”在本文用于指示IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。

“静脉内免疫球蛋白”或“IVIG”是静脉内施用的血液产品。其含有从超过1000个血液供体的血浆提取的混合IgG。IVIG用于治疗免疫缺陷如X连锁无丙种球蛋白血症、低丙球蛋白血症、特征为低抗体水平的获得性免疫功能低下病症、炎性及自身免疫疾病和急性感染。IVIG作为血浆蛋白替代治疗(IgG)而给予具有降低或缺乏抗体产生能力的免疫缺陷患者。IVIG也由于各种其它病症，如同种骨髓移植、慢性淋巴细胞白血病、特发性血小板减少性紫癜、peiatric HIV、原发性免疫缺陷、川崎病、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病、具有高抗体受体或具有ABO不相容供体的肾移植、孤独症、慢性疲劳综合征、艰难梭菌(Clostridium difficile)结肠炎、皮肌炎和多肌炎、graves眼病、guillain-Barré综合征、肌营养不良和包涵体myuositis。

表位(也已知为“抗原决定簇”)定义为由抗原结合蛋白结合的靶分子的一部分。识别表位的抗原结合蛋白部分称为互补位。蛋白质靶分子的表位基于它们的结构及与互补位的相互作用分为两类：构象表位和线性表位。构象表位由靶分子氨基酸序列的不连续部分组成。这些表位基于靶分子的三维表面特征和形状或三级结构而与互补位相互作用。相反，线性表位基于它们的一级结构与互补位相互作用。组成线性表位的氨基酸是来自靶分子的连续氨基酸序列。当抗原结合蛋白是抗体时，表位是用这个分子免疫个体脊椎动物宿主时引起免疫学应答的靶分子部分。通常其是发生结合抗体的靶分子的位点。表位优选天然存在于靶分子中。任选地，表位是已人工包括在靶分子中的序列。任选地，多个相同或不同表位被包括在靶分子中以便于其纯化及检测。

术语“特异性结合”或“结合”如本文用于指抗原结合蛋白和靶分子的相互作用时是指抗原结合蛋白识别靶分子及所述相互作用依赖于靶分子上特定结构(即抗原决定簇或表位)的存在；换句话说，抗原结合蛋白识别并结合特异性靶分子结构而非一般而言的蛋白质。可以结合特异性靶分子(抗原决定簇、表位、抗原或蛋白质)、可以特异性结合特异性靶分子(抗原决定簇、表位、抗原或蛋白质)、对特异性靶分子(抗原决定簇、表位、抗原或蛋白质)具有亲和性和／或对特异性靶分子(抗原决定簇、表位、抗原或蛋白质)具有特异性的本发明的抗原结合蛋白可以被称为“抗”或“针对”所述靶分子。术语“特异性”是指特定抗原结合蛋白分子可以结合的不同类型抗原或抗原决定簇的数目。抗原结合蛋白的特异性可以基于亲和性和／或亲合力(aviditV)确定。亲和性由抗原与抗原结合蛋白解离的平衡常数(K_D)代表，是抗原决定簇与抗原结合蛋白上抗原结合位点之间的结合强度的测量。或者，亲和性也可以表示为亲和性常数(K_A)，其是1／K_D。根据抗原结合蛋白和感兴趣抗原的特异组合，亲和性可以以已知方式确定。亲合力在本文是指具有多个结合位点的靶分子与更大的结合剂复合物的结合强度，即多价结合的结合强度。亲合力与抗原决定簇及其在抗原结合分子上的抗原结合位点之间的亲和性以及抗原结合分子上存在的结合位点数相关。另一方面，亲和性是指简单的单价受体配体系统。

术语肽和多肽在本文同义使用，是指这类化合物而不限制大小。这个类别的最大成员称为蛋白质。

发明详述

本发明人发现了一种用于选择性捕获和／或纯化靶分子的新方法，所述靶分子包含人IgG-CH1结构域，包括人或人源化IgG1、IgG2、IgG3、IgG4抗体和／或其片段，其中所述方法包括一特定类别的抗原结合蛋白，用于掺入和／或附着于免疫吸附材料。用于本方法中的抗原结合蛋白优选通过结合存在于人IgG1、人IgG2、人IgG3和人IgG4每种的CH1结构域中的表位而起作用，因此不依赖于IgG-Fc结构域。用于本发明方法中的抗原结合蛋白优选结合仅存在于IgG同种型的抗体重链的CH1结构域上的独特表位。另外，用于本发明方法中的抗原结合蛋白优选不结合除IgG之外的人重链抗体同种型，也不结合来自例如牛和猪的IgG抗体。更优选地，所述抗原结合蛋白显示在温和条件下(例如pH≥3)有效的洗脱，即释放靶分子。用于本发明方法中的抗原结合蛋白具有不依赖于轻链类型和VH亚类的特异性结合人IgG抗体和／或Fab(片段抗原结合)片段或其它包含4种人IgG亚类之一的人IgG-CH1结构域的片段所需的亲和性和选择性。通过选择性结合人IgG1、人IgG2、人IgG3和人IgG4的CH1结构域，本发明的抗原结合蛋白可以用于捕获和／或纯化任何人IgG衍生的Fab片段而不依赖于其IgG亚类、轻链同种型及VH亚类。这种选择性进一步导致明显益处，即没有对可能存在于源自例如重组表达系统和／或胃蛋白酶或木瓜蛋白酶处理的IgG消化产物的原料中的游离抗体轻链和／或IgG Fc片段的交叉结合。这种选择性是独特的，现有技术中已知的任何抗原结合蛋白均未证实这种选择性。令人感兴趣地，直至今日本发明人未发现任何人报道了特异于所有同种型的人IgG抗体的CH1结构域上的表位的抗原结合蛋白。

本发明提供了通用工具，用于同种型特异性捕获和／或纯化人IgG抗体和／或其Fab片段，不依赖于所述人IgG抗体或Fab片段的IgG亚类、轻链类型及VH亚类，由此例如不需要不同类型结合剂和／或方法以使得纯化完整系列的人IgG抗体靶。

因此，本发明的抗原结合蛋白能够选择性捕获和／或纯化所有人IgG衍生的Fab片段，不显示对可能存在于原料中的游离抗体轻链和／或IgG Fc片段的交叉反应性。现有技术中已知的结合剂无一能选择性纯化人IgG Fab而不显示对游离轻链的交叉反应性(例如蛋白L、KappaSelect、FabSorbent)或对IgG Fc结构域的交叉反应性(例如蛋白A和G)，这些结合剂自己也不能覆盖纯化衍生自所有4种IgG亚类的所有类型的Fab片段。另外，由于蛋白A和G结合IgG Fc结构域，蛋白A和G不能用于从由人IgG Fc和Fab片段的混合物组成的原料样品选择性捕获人IgG衍生的Fab片段。

因为本发明的结合剂显示对所有4种不同人IgG亚类抗体的CH1结构域的相似的结合特征，其使得能在温和洗脱条件下从例如人血浆衍生的原料样品选择性纯化多克隆IgG而不改变起始材料的IgG亚类分布，在其中免疫吸附材料被过载情况中不依赖于临界点(breakthrough)的百分比。

在第一个方面，本发明涉及捕获包含人IgG-CH1结构域所示氨基酸序列的靶分子的方法。所示方法优选包括步骤：a)将包含靶分子的组合物与优选固定化于支持物上的包含本发明的抗原结合蛋白的免疫吸附材料接触；及b)使得靶分子通过特异结合抗原结合蛋白而用免疫吸附材料捕获，优选在使得靶分子与免疫吸附材料中的抗原结合蛋白结合的条件下进行。我们现在首先描述本发明的抗原结合蛋白。

抗原结合蛋白

在第二个方面，本发明涉及特异性结合单表位的抗原结合蛋白，所述表位包含在人IgG1、人IgG2、人IgG3和IgG4每种的CH1结构域中。优选地，本发明的抗原结合蛋白能够特异性结合人IgG的CH1结构域中存在的表位，所述表位也能特异性地被具有选自SEQ ID NO：1-158的氨基酸序列的一或多个VHH(参考VHH)结合。本发明抗原结合蛋白与也被至少一个参考VHH特异性结合的人IgG的CH1结构域中的表位的结合优选通过所述抗原结合蛋白交叉阻断一或多个参考VHH(即SEQ ID NO：1-158的任一或多个)对该表位的结合的能力确定。

因此，本发明的优选的抗原结合蛋白具有交叉阻断具有选自SEQ IDNO：1-158的氨基酸序列的一或多个VHH结合包含人CH1结构域的靶分子例如SED ID NO：28的能力。抗原结合蛋白交叉阻断参考VHH的结合的能力在本文定义为当靶分子首先被抗原结合蛋白结合时其使参考VHH与包含人IgG的CH1结构域的合适靶分子的结合降低至少10％、20％、50％、75％、90％、95％、99％、99.9％或99.99％的能力，或者反之亦然(即当靶分子首先被参考VHH结合时抗原结合蛋白的结合被降低)。

交叉阻断的能力原则上可以用任何类型免疫测定确定，优选竞争性免疫测定，包括例如ELISA、固相直接或间接放射免疫测定(RIA)、固相直接或间接酶免疫测定(EIA)、夹心竞争测定(参见Stahli et al.，Methods inEnzymology9：242-253(1983))；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(参见Kirkland et al.，J.Immunol.137：3614-3619(1986))；固相直接标记测定、固相直接标记夹心测定(参见Harlow and Lane，″Antibodies，A LaboratoryManual,″Cold Spring Harbor Press(1988))；使用I¹²⁵标记的固相直接标记RIA(参见Morel et al.，Molec.Immunol.25(1)：7-15(1988))；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(Cheung et al.，Virology176：546-552(1990))；及直接标记RIA(Moldenhauer et al.，Scand.J.Immunol.32：77-82(1990))。

典型地，这种测定涉及使用结合于固相表面的纯化的靶分子、未标记的测试抗原结合蛋白及标记的参考VHH。竞争性抑制通过确定在测试抗原结合蛋白存在下结合于固相表面的标记的量而测量。通常测试抗原结合蛋白过量存在。合适的竞争性结合测定的例子例如如下所述。通过竞争测定鉴别的抗原结合蛋白(竞争抗原结合蛋白)包括与参考VHH结合相同表位的抗原结合蛋白及与相邻表位结合的抗原结合蛋白，所述相邻表位与由参考抗原结合蛋白结合的表位足够近而发生立体位阻。合适的靶分子是包含人CH1结构域的任何靶分子，如下定义包括例如人IgG及其Fab片段。

例如，人们可以在例如夹心ELISA设置中使用参考抗IgG-CH1 VHH片段和待确定的抗原结合蛋白确定是否两个结合蛋白均能同时结合人IgGFab片段的CH1结构域。为此目的，参考抗IgG-CH1 VHH片段优选包被在Maxisorp ELISA平板上并用在PBS中的2％(w／v)奶粉(Protifar)封闭。作为对照，抗人Fab kappa轻链VHH片段(抗Fab-kappa)优选包被在无包被对照相邻处。然后使多克隆人IgG Fab片段结合固定化VHH片段1小时(10μg／ml Fab于在PBS中的1％(w／v)奶粉和0.05％(v／v)Tween-20中，100μl／孔)。在洗涤后，结合的人Fab片段用其交叉阻断待确定的生物素化抗原结合蛋白或蛋白L(后者结合人Fab的VL-kappa结构域)检测，随后与HRPO缀合的链霉抗生物素蛋白保温以用于检测。

靶分子在本文中定义为由结合剂、优选本发明的抗原结合蛋白结合的分子。靶分子可以是需要捕获、纯化的蛋白质，或者需要从样品中被移除的蛋白质，或者待检测或鉴别的蛋白质。

在优选的实施方案中，本发明的抗原结合蛋白能选择性结合包含人IgG-CH1结构域或其等位基因变体的靶分子。优选地，包含人IgG-CH1结构域的靶分子是选自下组的分子：人IgG1分子、人IgG2分子、人IgG3分子、人IgG4分子、人Fab、人F(ab’)₂、单臂人抗体、单链人抗体、人源化IgG1分子、人源化IgG2分子、人源化IgG3分子、人源化IgG4分子、人源化Fab、人源化F(ab’)₂、单臂人源化抗体、单链人源化抗体和IVIG。人源化抗体或抗体片段在本文应理解为嵌合抗体或抗体片段，其中一或多个恒定结构域的至少部分是人来源的，及其中一或多个CDR的至少部分不是人来源的。

本发明的抗原结合蛋白用于纯化IVIG的优势是保持亚类分布。本发明的抗原结合蛋白纯化Fab的优势是本发明的抗原结合蛋白不交叉结合游离轻链和Fc片段。在另一个实施方案，包含人IgG-CH1结构域的靶分子是重组蛋白质。所述重组蛋白质可以是融合蛋白或嵌合蛋白如人源化抗体。

代替或与前述实施方案组合，本发明的抗原结合蛋白能选择性结合包含由SEQ ID NO：190-193任一氨基酸序列限定的人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的人IgG CH1结构域的靶分子。在一个优选实施方案中，本发明的抗原结合蛋白能选择性结合IgG CH1结构域的表位，所述表位由SEQ ID NO：194-200的任一氨基酸序列限定。在一个优选实施方案中，本发明的抗原结合蛋白不能选择性结合IgG CH1结构域的表位，所述表位由SEQ ID NO：201-217的任一氨基酸序列限定。

本发明的抗原结合蛋白优选不结合人非IgG相关抗体同种型、人IgG的Fc结构域、人IgG的Fv结构域或者人IgG的游离轻链。特别地，蛋白G和蛋白A不是本发明的抗原结合蛋白。

在优选实施方案中，本发明的抗原结合蛋白结合IgG同种型的人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4抗体重链的CH1结构域中存在的表位，其中与CH1结构域中的表位的结合对于4个人IgG亚类的每一个是相当于nM亲和性，即对4个亚类的每一个的亲和性的差异优选不超过一个数量级，更优选差异小于5、4、3或2倍。

在一个实施方案中，本发明的抗原结合蛋白不结合选自下组的IgG的至少一个CH1结构域：兔IgG、猪IgG1、猪IgG2、牛IgG1、牛IgG2、绵羊IgG1、山羊IgG1、骆驼IgG1a、骆驼IgG1b、大鼠IgG1、大鼠IgG2a、大鼠IgG2b、大鼠IgG2c、小鼠IgG1、小鼠IgG2a、小鼠IgG2b和小鼠IgG3。

人IgG1、人IgG2、人IgG3和／或人IgG4如本文所用可以是天然、完整(intact)或完全(complete)人IgG1、人IgG2、人IgG3和／或人IgG4。其也可以涵盖人源化IgG1、IgG2、IgG3和／或IgG4。

优选地，抗原结合蛋白与靶分子例如人IgG的结合及后续靶分子的洗脱不影响靶分子的效应物功能，这可以在已知测定中确定。还优选的是抗原结合蛋白与靶分子例如人IgG的结合及后续靶分子的洗脱不降低、抑制或另外影响靶分子与其预定抗原的结合。

在一个优选实施方案中，本发明的抗原结合蛋白结合CH1结构域的表位，所述表位包含、涉及和／或者由一或多个氨基酸限定：在122位的苯丙氨酸，在127和128位的任一位置不是半胱氨酸或者是单个半胱氨酸，在156位的丝氨酸或赖氨酸和／或在216位的天冬酰胺或丝氨酸，其中所述氨基酸位置是基于Kabat编号(E.A.Kabat，T.T.Wu，H.M.Perry,K.S.Gottesmanand C.Foeller,Sequences of Proteins of Immunological Interest(5th Edition)，NIH Publication No.91-3242，U.S.Department Of Health and Human Services，Public Health Service，National Institutes of Health(1991))。由此得出结论，本发明的抗原结合蛋白结合的CH1结构域的表位特别在122位不包含酪氨酸残基并且在156位不包含苏氨酸残基。更优选地，所述表位包含在156位的丝氨酸残基及在216位的天冬酰胺残基或者在156位的赖氨酸残基及在216位的丝氨酸残基。

由本发明的抗原结合蛋白识别的IgG抗体的CH1结构域上的表位与蛋白G识别的表位是不同的。例如，后者亲和性配体不区分在122位具有Phe或Tyr残基的CH1结构域，本发明的结合剂观测到这种区分(其不结合在122位具有Tyr的CH1结构域)。

为测试潜在的抗原结合蛋白是否能特异性结合靶分子但不结合另一个分子如人IgG Fc片段、Fv片段和／或轻链，优选可以进行如实施例所述的ELISA和／或表面等离子共振分析。

在一个优选实施方案中，本发明的抗原结合蛋白包含一或多个单结合结构域，其中单结合结构域不包含轻链及其中单结合结构域包含全抗原结合能力。优选地，本发明的抗原结合蛋白选自下组：包含重链及没有轻链的抗体、其片段、affibody、单结构域抗体及其片段。本发明的抗原结合蛋白的例子是衍生自天然没有轻链的骆驼或鲨鱼仅重链抗体的VHH或者affibody。优选地，抗原结合蛋白是仅包含重链及天然没有轻链的抗体或者其抗体片段。或者，(及也是优选的)本发明的抗原结合蛋白可以例如通过修饰如突变衍生自天然没有轻链的抗体或者其片段。天然没有轻链的抗体可以通过免疫骆驼(例如美洲驼羊、骆驼、单峰骆驼、双峰骆驼、羊驼、骆马和原驼)或鲨鱼(见下述)而获得。这些抗体仅包含重链并且没有轻链。这些单结构域重链抗体的优势是它们特别稳定、小并且容易在宿主生物体如酿酒酵母中生产。

因此，本发明的抗原结合蛋白优选包含免疫球蛋白衍生的可变结构域，其在一条单多肽链上包含针对靶分子上表位的完整抗原结合位点。这种抗原结合蛋白特别包括但不限于：

1)可得自骆驼和鲨鱼的抗体，仅由重链组成及天然没有轻链；

2)在1)中定义的抗体的可变结构域，通常称为VHH结构域；

3)在1)中定义的抗体或2)中的结构域的工程化形式，例如“骆驼化”抗体，其中骆驼(或鲨鱼)VHH结构域的构架序列用得自其它来源的CDR移植；

4)免疫球蛋白样可变结构域的工程化形式，其中来自各种免疫球蛋白样分子的构架序列与特异于给定靶分子的CDR组合，例如如WO04／108749所述。

在本发明的一个优选抗原结合蛋白中，包含全抗原结合能力的可变结构域的单多肽链优选具有被认为包含4个构架区或“FR”的氨基酸序列及结构，这些区域在本领域及在本文中分别被称为“构架区1”或“FR1”、“构架区2”或“FR2”、“构架区3”或“FR3”和“构架区4”或“FR4”，所述构架区由3个互补决定区或“CDR”间断，所述互补决定区在本领域中分别被称为“互补决定区1”或“CDR1”、“互补决定区2”或“CDR2”和“互补决定区3”或“CDR3”。这些构架区和互补决定区优选以顺序FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4(从氨基末端到羧基末端)可操作连接。

在具有全抗原结合能力的可变结构域中的氨基酸残基总数可以在110-135范围内，优选在115-129范围内。但是，根据本发明具有全抗原结合能力的可变结构域不特别限制其长度和／或大小，只要该结构域满足本文所述的进一步功能要求和／或其适合本文描述的目的。具有全抗原结合能力的可变结构域的氨基酸残基根据Kabat et al.给出的VH结构域一般编号而编号(E.A.Kabat，T.T.Wu，H.M.Perry,K.S.Gottesman and C.Foeller,Sequences of Proteins of Immunological Interest(5th Edition)，NIH PublicationNo.91-3242，U.S.Department Of Health and Human Services，Public HealthService，National Institutes of Health(1991))，如适用于Riechmann andMuyldermans(1999，J.Immunol.Methods231(1-2)：25-38，例如参见所述文献图2)及Harmsen et al.(2000，Molecular Immunology37：579-590，例如参见所述文献图1)的来自骆驼的VHH结构域。

根据这个编号，在具有全抗原结合能力的可变结构域中：FR1包含1-26位的氨基酸残基；CDR1包含27-35位的氨基酸残基；FR2包含36-49位的氨基酸残基；CDR2包含50-64位的氨基酸残基；FR3包含65-94位的氨基酸残基；CDR3包含95-102位的氨基酸残基；及最终，FR4包含103-113位的氨基酸残基。

在这个方面，应注意，如本领域熟知的针对VH结构域及针对VHH结构域，在每个CDR中的氨基酸残基总数可能变化并且可能不相应于由Kabat编号指示的氨基酸残基总数。但是，基于构架区的保守氨基酸，本领域技术人员能够针对那些具有非113个氨基酸的长度的具有全抗原结合能力的可变结构域根据Kabat定义排列各自构架区和互补决定区。其例子在图1所示IgG-CH1的氨基酸序列中的互补决定区的定义中给出。对VH结构域的氨基酸残基编号的其它方法是Chothia et al.描述的也可以类似方式适用于来自骆驼的VHH结构域和具有全抗原结合能力的可变结构域的方法(Nature342，877-883(1989))，所谓的“AbM definition”及所谓的“contactdefinition”，或者IMGT编号系统(Leffanc et al.，1999，Nucl.Acids Res.27：209-212)。

或者或与先前实施方案组合，在一个优选实施方案中，抗原结合蛋白包含氨基酸序列，所述氨基酸序列包含4个构架区，FR1至FR4，及3个互补决定区，CDR1至CDR3，它们以顺序FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4可操纵连接，其中：a)CDR1具有选自SEQ ID No：159-162的氨基酸序列或者与SEQ ID No：159-162有1、2、3、4、5或6个氨基酸残基不同的氨基酸序列；b)CDR2具有选自SEQ ID No：163-181的氨基酸序列或者与SEQ ID No：163-181有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸残基不同的氨基酸序列；及c)CDR3具有选自SEQ ID No：182-185的氨基酸序列或者与SEQ ID No：182-185有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸残基不同的氨基酸序列；以及其中每个构架区与SEQ ID No：186-189任一个的构架氨基酸序列具有至少50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100％的氨基酸相同性。或者，抗原结合蛋白中的至少一个CDR是选自上述a)、b)和c)定义的CDR中的CDR。

在一个优选实施方案中，CDR1具有SEQ ID NO：159或160的氨基酸序列。或者或与先前优选的实施方案组合，在本发明一个优选实施方案中，CDR2具有选自SEQ ID NO：163-168、SEQ ID NO：176-181的氨基酸序列。或者或与先前优选的实施方案组合，在本发明一个优选实施方案中，CDR3具有选自SEQ ID NO：182、SEQ ID NO：183和SEQ ID NO：184的氨基酸序列。

在本发明的一个优选抗原结合蛋白中，具有全抗原结合能力的可变结构域的构架氨基酸序列优选与SEQ ID No：186-189任一个的构架氨基酸序列具有至少50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100％的氨基酸相同性。

更优选地，在根据本发明的特异结合人IgG-CH1的可变结构域的单多肽链的FR1、FR2、FR3和FR4的每个位置(根据Kabat编号)存在的氨基酸残基如表1-4所示的FR1、FR2、FR3和FR4。对于每个位置，在每个位置最频繁存在的氨基酸残基以粗体示出。在这些残基以外，表1-4提供一些可以在天然发生的VHH结构域的FR1、FR2、FR3和FR4的每个位置存在的非限制性残基(数据得自WO2009／011572；PCT／NL2008／050460)。但是更优选地，具有全抗原结合能力的可变结构域的构架氨基酸残基选自在特异性结合人IgG-CH1的抗原结合蛋白的SEQ ID NO：186-189任一个的氨基酸序列的FR1、FR2、FR3和FR4的每个位置(根据Kabat编号)存在的表1-4中的氨基酸残基。对于每个位置，在每个位置最频繁出现的氨基酸残基在表1-4中以粗体指示。

因此，在本发明一个优选实施方案中，基于表1-4所述的位置上存在的氨基酸残基，在本发明的抗原结合蛋白中的包含全抗原结合能力的可变结构域的氨基酸序列可以具有结构：

FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4

其中，FR1具有选自如下的氨基酸序列：

a)[1]QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAVSG[26](SEQ ID：186)；

b)与a)中序列有至少50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100％序列相同性的氨基酸序列；和／或，

c)具有如表1定义的一或多个氨基酸取代的a)的氨基酸序列；

其中，FR2选自如下的氨基酸序列：

d)[36]WFRQTPGNEREFVA[49](SEQ ID：187)；

e)与d)中序列有至少50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100％序列相同性的氨基酸序列；和／或

f)具有如表2定义的一或多个氨基酸取代的d)的氨基酸序列；

其中，FR3选自如下的氨基酸序列：

g)[65]GRFTISRDSGKNTVYLQMNNLKPEDTAVYYCAG[94](SEQ ID：188)；

h)与g)中序列有至少50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100％序列相同性的氨基酸序列；和／或，

i)具有如表3定义的一或多个氨基酸取代的g)的氨基酸序列；以及，

其中，FR4选自如下的氨基酸序列：

j)[103]WGQGTQVTVSS[113](SEQ ID：189)；

k)与j)中序列有至少50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100％序列相同性的氨基酸序列；和／或，

1)具有如表4定义的一或多个氨基酸取代的i)的氨基酸序列。

在一个替代优选实施方案中，本发明的抗原结合蛋白包含如图1各行之一给出的CDR1、CDR2和CDR3组合，其中构架区(FR1至FR4)可以是上述定义的任何构架区(FR1至FR4)，更优选是图1中同一行的构架区。更优选地，本发明的抗原结合蛋白包含图1各行之一给出的CDR1、CDR2和CDR3组合，其中抗原结合蛋白具有与图1同一行提供的全部氨基酸序列的序列具有至少90、95、98、99或100％序列相同性的氨基酸序列。

在一个优选实施方案中，本发明的抗原结合蛋白包含与SEQ ID No：1-158的氨基酸序列的任一个具有至少85％、优选至少90％、更优选至少93、95、97、98、99或100％相同性的氨基酸序列，更优选其中抗原结合蛋白由与SEQ ID No：1-158的氨基酸序列的任一个具有至少90％、更优选至少93、95、97、98、99或100％相同性的氨基酸序列组成。

本发明的抗原结合蛋白是以希望的结合亲和性(如本文定义)特异结合靶分子的成分。本发明的抗原结合蛋白优选是单特异性抗原结合蛋白。应理解包含单特异性抗原结合蛋白的组合物如本发明的免疫吸附材料是指具有均一抗原结合蛋白群的组合物。由此，单特异性抗原结合蛋白特异于单一表位。但是明确包括在本发明中的是免疫吸附材料可包含超过一种类型的单特异性抗原结合蛋白，每个由均匀群组成。但是通常在本发明上下文中，免疫吸附材料不包含超过4、6、8、10或20种不同的单特异性抗原结合蛋白。抗原结合蛋白通常是抗体或其片段，其中单特异性抗原结合蛋白由此是单克隆抗体或其片段，其可得自克隆的细胞系(例如杂交瘤)或者表达自克隆的编码序列。术语单特异性抗原结合蛋白如本文所用由此排除多克隆抗体和抗血清。

典型地，本发明的抗原结合蛋白结合靶分子的解离常数(K_D)为大约10^-5至10^-12M或更低，优选为10^-7至10^-12M或更低，更优选为10^-8至10^-12M或更低，和／或结合亲和性为至少10^-7M，优选至少10^-8M，更优选至少10^-9M，如至少10^-10、10^-11、10^-12M或更多。任何大于10^-4M(即小于100μM)的K_D值通常被认为是指示非特异性结合。优选地，本发明多肽以低于500nM、优选低于200nM、更优选低于10nM、如低于500pM的亲和性结合希望的抗原。抗原结合蛋白与抗原或抗原决定簇的特异性结合可以以任何已知的合适方式确定，包括例如Scatchard分析和／或竞争结合测定，如放射免疫测定(RIA)、酶免疫测定(EIA)及夹心竞争测定以及本领域已知的其不同变体(也见上述)。在一个优选实施方案中，本发明的抗原结合蛋白以上述定义的亲和性结合希望的抗原，而这个亲和性与在温和洗脱条件下抗原从抗原结合蛋白的有效释放组合。

温和洗脱条件在本文中应理解为这样的条件，在所述条件下抗原活性和／或完整性(例如二级／三级结构)仅稍受影响(例如失活或变性低于10％)，优选抗原活性和／或完整性没有可检测的降低。这种温和洗脱条件的例子包括例如本文下述的酸性条件，包括例如0.1M甘氨酸或0.02M柠檬酸pH3.0或pH4.0，0.1M精氨酸pH4.0或pH5.0。在(近)中性pH的温和洗脱条件的其它例子包括例如高离子强度，如条件等价于2M NaCl或2M MgCl2(在例如20mM Tris pH8.0中)或者离液剂如乙二醇或丙二醇(40-60％，优选大约50％(v／v)，在例如20mM咪唑，10mM CaCl₂，0.01％Tween80，250mMNaCl中，pH7.0)。在pH3.0下释放抗原的本发明抗原结合蛋白的例子包括具有本文上述定义的结构的抗原结合蛋白，其中：a)CDR1具有选自SEQ IDNo：159-162的氨基酸序列或者与SEQ ID No：159-162有1、2、3、4、5或6个氨基酸残基不同的氨基酸序列；b)CDR2具有选自SEQ ID No：163-181的氨基酸序列或者与SEQ ID No：163-181有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸残基不同的氨基酸序列；及c)CDR3具有选自SEQ ID No：182-189的氨基酸序列或者与SEQ ID No：182-189有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸残基不同的氨基酸序列。更优选地，所述抗原结合蛋白具有选自SEQ ID No1-158的氨基酸序列。

结合人IgG1、人IgG2、人IgG3及人IgG4分子的CH1结构域的本发明的抗原结合蛋白是优选具有选自如下一或多种性质的抗原结合蛋白：a)抗原结合蛋白以至少10^-7M、10^-8M或10^-9M的结合亲和性结合人IgG分子，如实施例所述经BiaCore分析；b)抗原结合蛋白可表达得自酵母，表达水平为至少0.5、0.8、1.0g／L酵母培养物。

在一个实施方案中，本发明涉及特定形式的本发明抗原结合蛋白：多价抗原结合蛋白。所述多价抗原结合蛋白包含至少两个本文上述定义的抗原结合蛋白的氨基酸序列。至少两个抗原结合蛋白的氨基酸序列可以彼此不同或者它们可以相同，例如一个氨基酸序列的拷贝或重复。至少两个抗原结合蛋白的氨基酸序列通常头至尾融合，即最N-末端序列的C-末端融合于第二个序列的N-末端等等。至少两个抗原结合蛋白的氨基酸序列可以直接连接融合或者经接头或间隔基融合。本发明的多价抗原结合蛋白可以通过表达编码多价蛋白的核苷酸序列而产生，其中两个或更多个抗原结合蛋白的编码序列可操纵连接在相同读框中。本领域技术人员知道如何可操纵融合蛋白编码序列。多价抗原结合蛋白的优势是动力学结合能力改善，特别是如果多价抗原结合结构域例如用共价结合定向固定化于固体支持物上时。

本发明的抗原结合蛋白还包括修饰形式，其中氨基酸残基用赖氨酸残基取代以提高等电点(pI)。是SEQ ID NO：1的修饰形式的这种抗原结合蛋白的例子如SEQ ID No：10，19，28，37，46，55，64和73所示。具有7以上pI的抗原结合蛋白比具有低于7的pI的抗原结合蛋白更容易纯化，其中纯化例如是从一个来源如酵母发酵液经离子交换层析进行。

抗原结合蛋白的其它有利修饰形式是例如这样的形式，其中抗原结合蛋白具有改良的稳定性，例如改良的苛性稳定性(caustic stability)，改良的对变性剂的稳定性和／或改良的蛋白酶稳定性。是SEQ ID NO：28的修饰形式的这种抗原结合蛋白的例子如SEQ ID No：29-36，117-137所示。本领域技术人员知道一些氨基酸残基对于多肽或蛋白质的稳定性是不利的。例如，在脱酰胺反应中，谷氨酰胺或天冬酰胺残基的侧链酰胺键水解形成游离羧酸。如Bischoffet al(J.ofChrom B(1994)，622，261-278)所述，可以发生肽和蛋白质中的天冬酰胺(Asn，N)及谷氨酰胺(Gin，Q)残基的非酶促脱酰胺，酰胺键的水解在碱性条件下显著加速，特别是当例如天冬酰胺后面是甘氨酸(Gly，G)或丝氨酸(Ser，S)残基时。在这个方面，天冬酰胺比相应位置的谷氨酰胺更易于脱酰胺。在Bischoffet al.中，提供了在肽或蛋白质序列内的展示较低不稳定天冬酰胺残基的残基组合及因此可以掺入例如基于通常存在的VHH序列中，-或者残基的替代组合以增加碱稳定性。另外，Geiger et al(J.of Biol Chem(1987)vol.262，no.2，785-794)描述了除天冬酰胺残基，天冬氨酸残基(Asp，D)也可以是用于蛋白质的非酶促降解的热点。在这个方面，Terashima et al(Anal.Biochem.(2007)，368，49-60)描述了当甘氨酸(Gly，G)在天冬氨酸残基的C-末端时，天冬氨酸(Asp，D)的异构化被加速，因此可以如上所述设想其它残基组合以增加抗IgG-CH1抗原结合蛋白的稳定性。

纯化靶分子的方法

如本文早先所述，在第一个方面，本发明涉及捕获包含如人IgG-CH1结构域所示氨基酸序列的靶分子的方法。所述方法优选包括步骤：a)将包含靶分子的组合物与优选固定化于支持物上的包含本发明抗原结合蛋白的免疫吸附材料接触；及b)使得靶分子通过特异性结合抗原结合蛋白而被免疫吸附材料捕获，优选在使得靶分子与免疫吸附材料中的抗原结合蛋白结合的条件下进行。

捕获靶分子的方法的实施方案适合使用任何亲和性捕获方案，包括例如本文上述的免疫测定。捕获靶分子的方法的实施方案进一步适合纯化和／或浓缩液体样品中存在的一或多种靶分子(见下述)和／或用于提供耗竭了一或多种靶分子的液体样品，例如用于蛋白质组学应用。

因此，在捕获靶分子方法的一个实施方案中，所述方法是纯化(和／或浓缩)靶分子的方法。所述方法包括在上述捕获方法中将靶分子捕获在免疫吸附材料上。所述方法进一步包括步骤：c)在降低靶分子与免疫吸附材料之间亲和性的条件下洗脱结合的靶分子。结合的靶分子的洗脱优选在本文上述温和洗脱条件下进行。任选地，所述方法可以包括进一步步骤d)用于回收靶分子和／或进一步加工靶分子，包括例如配制和／或包装纯化的靶分子。

在一个优选实施方案中，待纯化的靶分子选自本文上述定义的人和人源化靶分子；以及来自狒狒、黑猩猩、猕猴、猫、狗、豚鼠、叙利亚仓鼠、马和驴的IgG；以及来自这些物种的IVIG。待纯化的靶分子如人IgG1、人IgG2、人IgG3和／或人IgG4可以是天然的、完整的(intact)或完全的(complete)靶分子。在另一个实施方案中，包含人IgG-CH1结构域的靶分子是重组蛋白。所述重组蛋白可以是融合蛋白或嵌合蛋白如人源化IgG。

在一个优选实施方案中，本发明的抗原结合蛋白能够选择性结合本文上述定义的包含人IgG-CH1结构域的靶分子。

因为本发明的抗原结合蛋白显示对所有4种不同人IgG亚类的CH1结构域的相似的结合特征，包含所述结合剂之一的免疫吸附材料可以用于从例如人血浆选择性纯化多克隆IgG(例如静脉内免疫球蛋白(IVIG))而不影响亲本IgG亚类分布。本发明的抗原结合结构域在纯化Fab片段中的优势是本发明的抗原结合结构域不交叉结合游离轻链及Fc片段。

在一个优选实施方案中，本发明涉及从也包含游离轻链的组合物中纯化Fab片段的方法。这例如在生产重组人Fab片段中特别有利。不希望受理论束缚，在重组(人)Fab的生产中，产生显著量的游离轻链，其高度可溶并且难以用目前可获得的对游离轻链也具有亲和性的抗体结合蛋白与重组组装的Fab分开。当使用本发明的纯化方法时，组装的Fab片段可以在一个单步骤中与游离轻链有效分开，产生纯化的样品，其中不能检测到游离轻链。

所述人IgG-CH1结构域如本文上述“抗原结合蛋白”所定义。

包含靶分子的组合物经常是水性组合物，除了待纯化的靶之外还包含许多其它蛋白质。接触步骤的条件优选是发生结合剂与靶分子结合的条件。优选地在这个步骤中使用具有大约6.5-8的pH的上样缓冲液。合适的缓冲液是例如PBS缓冲液或者具有生理离子强度和pH的类似混合物。

在一个实施方案中，所述方法在变性剂存在下进行。这种变性剂可以在本发明方法之前或期间加入到组合物中。可以单独、顺序或组合使用各种变性剂。变性剂可以包括例如一或多种离液剂、亲液剂、有机变性剂和／或去污剂。优选地，当变性剂包括去污剂时，所述变性剂也包括一或多种离液剂、亲液剂和／或有机变性剂，例如所述变性剂除了离液剂、亲液剂和／或有机变性剂还包含去污剂。

离液剂可以包括各种不同化合物，例如尿素、CNS^-和CCl₃COO^-、盐酸胍、NO₃ ^-和ClO₄ ^-。亲液剂可以包括例如乙酸盐如乙酸钠(NaOAc)。有机变性剂可以包括例如乙腈(CAN)。去污剂可以包括阴离子、阳离子、非离子或两性离子去污剂。阴离子去污剂可以包括例如脱氧胆酸、胆酸和SDS(十二烷基硫酸钠)；阳离子去污剂可以包括例如十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)。非离子去污剂可以包括例如毛地黄皂苷、triton、吐温及nonidet40(NP40)；两性离子去污剂可以包括例如CHAPS、CHAPSO、BigCHAP、CHAPS、ZWITTERGENT3-08、ZWITTERGENT3-10、ZWITTERGENT3-12、ZWITTERGENT3-14和ZWITTERGENT3-16。

优选地，去污剂与缓冲液一起使用，以例如提供包含至少一种变性剂的变性剂流体。多种缓冲液是合适的，例如两性离子、磷酸盐、乙酸盐和碳酸盐。两性离子缓冲液可以包括例如Tris缓冲液。磷酸盐缓冲液例如磷酸盐缓冲溶液可以包括例如磷酸钠和磷酸钾缓冲液。在一个实施方案中，变性剂选自尿素、CHAPS、盐酸胍、CTAB、乙酸盐和乙腈。在其中至少一种变性剂是尿素的一些实施方案中，当与靶分子和／或抗原结合蛋白接触时，尿素具有至少大约0.8M或者至少大约1M的浓度。在其中至少一种变性剂是CHAPS的一些实施方案中，当与靶分子和／或抗原结合蛋白接触时，CHAPS具有至少大约0.1％或者至少大约0.25％的浓度。在其中至少一种变性剂是盐酸胍的一些实施方案中，当与靶分子和／或抗原结合蛋白接触时，盐酸胍具有至少大约0.03M或者至少大约0.05M的浓度。在其中至少一种变性剂是乙腈的一些实施方案中，当与靶分子和／或抗原结合蛋白接触时，乙腈具有至少大约8％或者至少大约10％的浓度。

与靶分子接触的变性剂的浓度任选可以被调节以优化靶分子的变性和／或非特异性结合的降低。

优选上样材料被洗涤直至非特异性结合物被洗脱。这通常通过用合适缓冲液漂洗而进行，合适缓冲液可以与上样缓冲液相同。靶分子的解吸或洗脱是下一个步骤。这优选通过改变条件而进行由此抗体或片段不再结合靶分子。洗脱可以通过改变与pH、盐、温度或任何其它合适测量有关的条件而实现。用于解吸的优选洗脱方法是用具有低于4、3或2的缓冲液洗脱。合适的洗脱缓冲液如本文上述。

包含靶分子的组合物包括但不限于任何数量的来自活或死生物体或其一部分的物质，例如血液、血清、血浆、尿、泪、细胞、器官、组织、骨骼、骨髓、淋巴、淋巴结、滑膜组织、软骨细胞、滑膜巨噬细胞、内皮细胞和皮肤。包含靶分子的组合物也可以是包含重组产生的靶分子的组合物，如微生物，例如酵母、真菌、细菌(例如大肠杆菌(Escherichia coli))，或者包含靶分子的组织培养细胞、培养基、上清、过滤物和发酵液。包含靶分子的组合物也可以是包含例如为了从完整IgG分子产生Fab片段而已经用木瓜蛋白酶和／或胃蛋白酶处理的靶分子的组合物。

更具体地，本发明涉及通过免疫亲和性纯化靶分子的方法，包括步骤c)上样包含本发明抗原结合蛋白的免疫吸附材料和包含靶分子的组合物，优选在靶分子与抗原结合蛋白发生结合的条件下；d)任选地，洗涤上样的免疫吸附材料以除去非特异性结合物；及e)通过施加洗脱条件而洗脱靶分子。任选地，所述方法可以包括步骤a)选择结合靶分子的抗原结合蛋白或其片段；及b)将所述抗原结合蛋白或其片段与免疫吸附材料结合。优选地，抗原结合蛋白的片段在本发明中保留上述定义的结合亲和性。所述方法可以进一步包括步骤f)回收靶分子和／或进一步加工靶分子，包括例如配制和／或包装纯化的靶分子。

抗原结合蛋白用于检测和／或纯化的用途

在第三个方面，本发明涉及本文定义的抗原结合蛋白或者本文定义的免疫吸附材料检测和／或纯化包含如人IgG-CH1结构域所示氨基酸序列的靶分子的用途。优选地，人IgG-CH1结构域的氨基酸序列在上述“抗原结合蛋白”中描述。在一个优选实施方案中，待检测和／或纯化的靶分子如本文上述定义。在一个优选实施方案中，检测和／或纯化是体外检测和／或体外纯化。

治疗性血液成分单采(Therapeutic aphereses)

在第四个方面，本发明涉及用于治疗性血液成分单采的方法。治疗性血液成分单采是身体外血液处理以从血液中消除病原化合物(Bosch，2003，J.Artif.Organs6(1)：1-8)。TA的一个例子涉及吸附各种抗体介导的免疫疾病中的抗体。在TA中用于吸附抗体的常用基质是蛋白A琼脂糖。这个基质用于治疗各种自身免疫病及抗体介导的移植排斥。但是，由于对人IgG亚类3抗体的低亲和性，蛋白A基质不能有效除去IgG3抗体。有利地，特异于哺乳动物或人IgG的本发明的抗原结合蛋白也可以用于在患有抗体介导疾病的患者中耗竭IgG，包括IgG3。优选地，用于治疗性血液成分单采的方法包括在(从)体液中除去、耗竭及失活人IgG中的至少一种。优选地，所述在(从)体液中除去、耗竭及失活人IgG离体进行。体液优选是血液、血液级分如血浆或血清，或者另一种体液。在所述方法中，上文定义的本发明的抗原结合蛋白或包含上文定义的抗原结合蛋白的免疫吸附材料在身体外与对象优选人对象的体液接触。免疫吸附血液成分单采材料可以是颗粒或珠形式，其可以有利地包装进流动室或者柱，对象或患者的体液体外流过所述流动室或柱。在其中耗竭IgG的治疗之前或之后，可以进行体液的一或多种进一步处理阶段。体液的一些处理可以在相继单元中进行，其中IgG通过吸附耗竭，以实现希望的IgG终浓度。在IgG耗竭之前及之后的体液样品可以用例如ELISA测试IgG水平(使用例如本发明的抗原结合蛋白)。体液然后可以回输进对象或人类患者，尽管后一步骤可以从所述方法的优选体外实施方案中明确排除。在优选实施方案中，用于治疗性血液成分单采的本发明方法在来自患有抗体介导的自身免疫病、抗体介导的移植排斥或具有抗体介导成分的自身免疫病的患者或对象的体液上使用。这种疾病的例子包括重症肌无力、Goodpasture综合征、系统性红斑狼疮(SLE)和扩张型心肌病(DCM)。本发明的血液成分单采方法特别有用于其中涉及亚类3自身抗体的自身免疫病，例如SLE和DCM，因为IgG3不能用蛋白A有效耗竭(Staudt et al.，2002，Circulation106：2448-2453)。

在一个方面，本发明因此也涉及结合哺乳动物IgG分子的本发明抗原结合蛋白用于体外除去或耗竭对象体液优选人对象中的哺乳动物IgG的用途。

融合蛋白

在第五方面，本发明涉及融合蛋白，其中本文定义的抗原结合蛋白的氨基酸序列与治疗性蛋白的氨基酸序列融合。两个氨基酸序列优选通过基因融合连接在一起，其中编码各自氨基酸序列的核苷酸序列通过本领域已知方式可操纵符合读框地连接在一起。所述氨基酸序列可以直接连接或者任选通过间隔基或接头氨基酸序列连接。包含与治疗性蛋白融合的本发明抗原结合蛋白的氨基酸序列的融合蛋白可用于增加蛋白质的血清半衰期。注射的生物治疗剂在给予后可能快速从血液循环中清除，需要高剂量或频繁给予以保持有效治疗水平。为克服这些问题，生物治疗性蛋白质或肽可以与循环血清蛋白质如IgG结合以增强它们的生物利用度。在本发明中，生物治疗性蛋白质或肽通过将生物治疗性蛋白质或肽的氨基酸序列与本发明的抗原结合蛋白的氨基酸序列融合而结合于循环IgG。这将增强融合的生物治疗性蛋白质或肽的生物利用度。本发明的抗原结合蛋白与生物治疗剂的基因融合可以提供针对人IgG的CH1结构域的结合部分，导致生物治疗剂在血清中的半衰期增加。Harmsen et al.，(2005，Vaccine23(41)，p.4926-42)实际上已报道通过与结合猪IgG的VHH的融合，具有治疗潜力的模式VHH与猪IgG的结合导致模式VHH的体内驻留相比于不结合猪IgG的对照融合VHH增加。这种改良血清半衰期的方法原则上可以用于任何生物治疗性蛋白质，包括例如抗原(用于免疫接种)、酶(用于酶替代治疗)、激素、趋化因子、白介素、(人源化)单克隆抗体等。

核酸

在第六个方面，本发明涉及包含编码本文上述定义的抗原结合蛋白的核苷酸序列的核酸。本发明的优选核酸是核酸构建体，其中编码抗原结合蛋白的核苷酸序列可操纵地连接于启动子及任选存在的其它调控元件例如终止子、增强子、聚腺苷酸化信号、用于分泌的信号序列等。这种核酸构建体特别可用于用重组技术生产本发明的抗原结合蛋白，其中编码感兴趣的抗原结合蛋白的核苷酸序列在合适的宿主细胞中表达，如Ausubel et al.，″Current Protocols in Molecular Biology″，Greene Publishing andWiley-Interscience，New York(1987)及Sambrook and Russell(2001)″Molecular Cloning：A Laboratory Manual(3^rdedition)，Cold Spring HarborLaboratory,Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York)所述。如本文所用，术语“可操纵连接"是指多核苷酸元件以功能关系连接。当核酸被置于与另一个核酸序列的功能关系中时，所述核酸是“可操纵连接的”。例如，如果启动子或增强子影响编码序列的转录则其与编码序列可操纵连接。可操纵连接是指连接的DNA序列典型是连续的，当需要连接两个蛋白质编码区时，是连续并且符合读框的。

宿主细胞

在第七个方面，本发明涉及包含上述定义的核酸的宿主细胞。优选宿主细胞是用于产生本发明抗原结合蛋白的宿主细胞。宿主细胞可以是能产生本发明抗原结合蛋白的任何宿主细胞，包括例如原核宿主细胞，例如大肠杆菌，或者(培养的)哺乳动物、植物、昆虫、真菌或酵母宿主细胞，包括例如CHO细胞、BHK细胞、人细胞系(包括HeLa、COS和PER.C6)、Sf9细胞及Sf+细胞。用于产生本发明抗原结合蛋白的优选宿主细胞是真核微生物如酵母和丝状真菌的细胞。优选的酵母宿主细胞例如包括例如酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)、及乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)。用于生产本发明抗原结合蛋白的优选菌株、构建体及发酵条件如van de Laar，et al.，(2007，Biotechnology and Bioengineering，Vol.96，No.3：483-494)所述。例如，生产抗原结合蛋白可以在标准生物反应器中进行，工作体积为10-10000升。溶解氧可以通过自动化调节搅拌机速度而控制。pH可以用磷酸、氨气或氨溶液控制及温度通过例如冷却夹套及加热夹套控制。分析废气的乙醇浓度、rO₂及rCO₂。分批阶段(batch phase)通过加入3％-8％完全生长接种物而开始(例如30℃，0.3-0.4VVM空气，DO₂最小30％，pH5.0)。当废气中的乙醇浓度在分批阶段下降时，可以开始乙醇发酵。可以根据脉冲进料谱(pulsed feedprofile)施加进料以维持乙醇水平在需要的水平。进料阶段可以在21℃及0.7-1.1VVM空气下进行。在乙醇发酵期间，DO₂降低至0％，积累的乙醇可以进一步由脉冲进料谱控制。当乙醇进料耗竭时进料阶段停止。发酵液可以冷却至5-10℃的温度直至进一步加工如除去生物量等(VVM=每体积批次每分钟空气体积)。在这个方面，也应理解当本文中我们指出本发明的抗原结合蛋白可以通过在一定最小表达水平在酵母中表达而获得时，这个水平是用WO97／25591的实施例1.1或者Van der Laar(2007)Biotechnologyand Bioengineering96(3)：483-494所述的方法获得的。Van der Laar et al.提供了针对几种VHH配体的抗原结合蛋白(在发酵结束时)的(最大)浓度。“g／L”是指每升无细胞发酵液(即通过例如过滤除去生物量之后)的分泌的抗原结合蛋白的量(克)。抗原特异性VHH片段的选择及产生见Frenkenet al.(2000)Journal of Biotechnology78：11-21所述。

产生抗原结合蛋白的方法

因此，本发明的进一步方面涉及产生本发明抗原结合蛋白的方法，其中所述方法优选包括步骤：a)在有利于表达抗原结合蛋白的条件下培养上述宿主细胞；及任选地，b)从宿主细胞和培养基中至少一种中纯化抗原结合蛋白。合适条件可包括使用合适培养基，存在合适食物来源和／或合适营养素，合适温度，及任选存在合适诱导因子或化合物(例如当本发明核苷酸序列是在可诱导启动子控制下时)；所有这些均可以由本领域技术人员选择。在这种条件下，本发明的氨基酸序列可以以组成型方式表达，以瞬时方式表达，或者仅当适当诱导时表达。本发明的抗原结合蛋白可以然后从宿主细胞／宿主生物体／或从培养所述宿主细胞或宿主生物体的培养基中分离，使用已知的蛋白质分离和／或纯化技术，如(制备)层析和／或电泳技术、差异沉淀技术、亲和性技术(例如使用特异性可裂解的氨基酸序列与本发明氨基酸序列融合)和／或制备免疫学技术(即使用抗待分离抗原结合蛋白的抗体)。

组合物

在另一方面，本发明涉及包含本文定义的抗原结合蛋白的组合物。其优选实施方案是包含抗原结合蛋白的免疫吸附材料。免疫吸附材料在本文中应理解是指载体与固定化于载体上的抗原结合蛋白的组合。优选在免疫吸附材料中，抗原结合蛋白固定化于载体上，其中更优选抗原结合蛋白经共价连接固定化于载体上。载体可以是可以用于抗原结合蛋白固定化的任何材料。合适例子是基质材料，以捕获结合剂；细胞表面，其上展示结合剂；及可以共价连接结合剂的聚合物。亲和性层析领域的技术人员熟知合适的载体例如多孔固相载体材料如琼脂糖、聚苯乙烯、可控孔度玻璃、纤维素、葡聚糖、硅藻土、合成聚合物如Sepharose^TM、多孔无定形硅。载体材料可以为任何合适形式如颗粒、粉末、片材、珠、滤膜等。合适载体材料的进一步描述例如在EP-A-434317中揭示。通过选择的官能团快速、容易及安全固定化配体的方法是可获得的。偶联方法的正确选择依赖于待固定化的物质。例如，下述商业已知的Sepharose^TM的衍生物允许蛋白质方便地固定化于其上：CNBr活化的Sepharose^TM4B使得含有伯胺基的配体通过自发反应快速固定化。AH-Sepharose^TM4B及CH-Sepharose^TM4B均具有6个碳长的间隔臂并且允许分别经羧基和氨基偶联。柔性间隔基适合用于其中靶分子的柔性有限或其中靶的三维结构需要结合剂的一些柔性以允许最佳结合的情况。活化的CH-Sepharose^TM4B提供6碳间隔臂及活性酯用于经氨基的自发偶联。这些仅是合适固定化途径的几个例子。任选免疫吸附材料被置于柱中以促进容易的层析分离。

在本文件及其权利要求书中，动词“包含”以其非限制含义使用，是指该词后面的项目被包括，但是不排除未特异提到的项目。另外，通过不定冠词“一个”说明的元件不排除超过一个元件存在的可能性，除非上下文清晰需要有且仅有一个元件。不定冠词“一个”因此通常是指“至少一个”。

本说明书引用的所有专利及文献全文援引加入本文。

下述实施例仅为举例目的提供，不意味着以任何方式限制本发明的范围。

附图描述

图1.抗IgG-CH1 VHH片段及其CDR的氨基酸序列。

-抗IgG-CH1 VHH片段：SEQ ID No：1-158

-抗IgG-CH1 VHH CDR：CDR1：SEQ ID No：159-162，CDR2：SEQ IDNo：163-181，CDR3：SEQ ID No：182-185

图2.基于在Biacore中观测的与抗IgG-CH1 VHH片段的结合反应性集合的不同IgG种类的CH1序列。

*根据Kabat编号，1991，Vol1，fifth edition，US Department ofHealth andHuman Services，NIH publication No.91-3242.

序列相应于SEQ ID No：190-217

-黑体残基：存在于由抗IgG-CH1 VHH片段识别的CH1结构域中的给定位置

-下划线残基：仅存在于不被抗IgG-CH1VHH片段识别的CH1结构域中的给定位置

图3.在Western印迹中抗原结合蛋白对人IgG及其Fab片段的结合反应性。

M：预染色标记；IgG：多克隆人IgG；Fab：多克隆人IgG-Fab片段；NR：非还原的；R：还原的

凝胶A：在具有和不具有β-巯基乙醇的SDS样品缓冲液中变性的多克隆人IgG和人IgG-Fab片段(Jackson Immunoresearch)的CBB染色的SDS凝胶(4-20％Tris-甘氨酸)；即还原的(R)和非还原的(NR)

印迹B：蛋白G生物素(5μg／ml于1％(w／v)奶粉0.05％Tw-20于PBS中)／链霉抗生物素蛋白-AP(1：2000)

印迹C：抗IgG-CH1 VHH，His标记的(5μg／ml于样品缓冲液中)／小鼠抗His-AP(1：2000)

印迹D：抗人Fab-kappa VHH，His-标记(5μg／ml)／小鼠抗His-AP(1：2000)

印迹E：抗人IgG-Fc VHH，His-标记(5μg／ml)／小鼠抗His-AP(1：2000)

Western印迹B-E用BCIP／NBT作为底物显色。

图4.在ELISA中一组人IgG亚类特异性小鼠Mab对多克隆人IgG起始材料及不同抗体结合亲和性树脂的相应洗脱级分的结合模式。

图5.抗IgG-CH1亲和性树脂的IgG结构域选择性

(A)多克隆人IgG抗体；(B)多克隆人IgG-Fc片段；(C)多克隆人IgG-Fab片段；M：分子量标记，泳道1：起始材料，泳道2：流穿液，泳道3：洗脱级分

图6.人IgG Fab片段在不同亲和性树脂上的纯化

(A)抗IgG-CH1亲和性树脂；(B)蛋白G亲和性树脂

图7.从IgG／木瓜蛋白酶消化混合物纯化人IgG Fab片段

(A)CBB染色的SDS page凝胶(非还原的)；M：分子量标记；泳道1：未处理的多克隆人IgG；泳道2：起始材料：在消化缓冲液(O.02M半胱氨酸，20mM磷酸钠pH7.4，±7mg／ml)中的木瓜蛋白酶处理的人IgG；泳道3：在加样起始材料后抗人IgG-Fc VHH树脂的流穿液级分(在PBS中稀释，±1mg／ml)；泳道4：抗人IgG-Fc VHH树脂的洗脱级分

(B)CBB染色的SDS-page凝胶；在通过抗IgG-Fc VHH树脂耗竭IgG Fc片段、完整和／或部分消化的IgG之后用抗IgG-CH1 VHH树脂从人IgG-木瓜蛋白酶消化混合物纯化Fab片段。M：分子量标记；泳道1：起始材料，即在加样人IgG／木瓜蛋白酶消化样品后抗人IgG-Fc VHH树脂的流穿液级分(在PBS中稀释，±1mg／ml)；泳道2：在加样起始材料后抗人IgG-CH1VHH树脂的流穿液；泳道3：抗人IgG-CH1 VHH树脂的洗脱级分

实施例

实施例1.鉴别结合IgG-CH1的VHH片段

结合IgG抗体的CH1结构域的VHH片段从用人IgG抗体和／或其Fab片段免疫接种的美洲驼羊中鉴别。从构建的表达文库中筛选各个VHH片段是使用不同人抗体同种型及其亚类和片段经ELISA进行，结果鉴别了一组VHH片段，其结合来自不同哺乳动物物种的IgG特别是人IgG1-4的CH1结构域。

为筛选目的，Maxisorp结合平板(Nunc)用人抗体抗原包被，随后用在PBS中的2％(w／v)奶粉(Protifar)封闭。结合的VHH片段通过小鼠抗Myc mAb组合多克隆山羊抗小鼠-HRP缀合物(Bio-Rad，172-1011)或多克隆兔抗美洲驼羊VHH血清组合多克隆猪抗兔IgG-HPO缀合物(Dako，P217)检测。从这个筛选鉴别了一组VHH片段，它们显示对多克隆人IgG及其Fab片段的结合及对下述人IgG抗体的结合；人IgG1-kappa、人IgG-1-lambda、人IgG3-lambda及人IgG4-kappa。未观测到对多克隆人IgG Fc片段及人IgM的结合。这些结果表明这组VHH片段识别存在于人IgG抗体的Fab部分上的表位及与这个表位的结合使得能结合所有4种人IgG亚类，而无论其轻链类型(kappa或lambda)。因为未观测到对人IgM(类似于IgG，也包含轻链和VH结构域)的结合，所述表位存在于IgG抗体的CH1结构域上。

这组抗IgG-CH1 VHH片段的IgG结合反应性进一步用表面等离子体共振分析(SPR)在Biacore3000上进行了确定。为此目的，结合剂固定化于CM5传感器芯片的表面上。随后，传感器芯片与纯化的抗体和／或其片段(20μg／ml)于HBS-EP缓冲液(0.01M HEPES，pH7,4；0.15M NaCl；3mM EDTA；0.005％表面活性剂P20)中保温。以5μl／min允许结合1分钟，随后以5μl／min进行2.5分钟的解离步骤。结合信号(共振单位，RU)与仅用HBS-EP缓冲液测得的背景信号进行比较。结果总结于表5。

表5.在Biacore中结合IgG-CH1的VHH片段的抗体结构域选择性

＊(+)阳性结合；在Biacore中>400RU

(-)无结合；在Biacore中<5RU

如也在ELISA中证实，未观测到对人IgG-Fc片段和人IgM的结合。IgG-CH1结合表位进一步通过在Biacore中缺失对人IgA、游离人kappa-及lambda轻链(Bence Jones蛋白)以及人scFv片段的结合而证实。这证实没有对在人IgM、IgA和人scFv中存在的VH结构域的结合反应性，也没有对IgG抗体轻链上存在的任何表位的结合反应性。

IgG-CH1特异性进一步通过观测到的抗仅包含人IgG1抗体的CH1-及CL结构域的抗体结构域构建体(即IgG1 Fab片段的恒定结构域)的结合反应性而证实。这个结合不依赖于CL结构域的亚类(即kappa或lambda)。

如Derrick et.al.所报道，观测到蛋白G通过结合CH1而有对一些IgGFab片段的低亲和性交叉结合，但是与蛋白G不同，本发明的抗原结合蛋白显示对所有人IgG Fab片段的结合，而不交叉结合人IgG抗体的Fc区域。

实施例2.结合IgG-CH1的VHH片段的DNA测序

抗IgG-CH1结合VHH片段的氨基酸序列经DNA测序确定并且示于图1(SEQ ID：1-158)。尽管分离的VHH片段来自用不同类型抗体抗原免疫接种的不同美洲驼羊，所有测序的抗IgG-CH1 VHH片段的CDR区域显示显著的相似性，由此表明识别存在于IgG抗体的CH1结构域上的相同表位。被本发明的抗原结合蛋白识别的IgG-CH1表位因此看起来在美洲驼羊中通过引起属于相当保守的序列家族的抗IgG-CH1 VHH抗体片段的显著富集而产生免疫应答的能力是独特的。

实施例3.在Biacore中结合IgG-CH1的VHH片段的IgG物种选择性

为进一步鉴别由本发明的抗原结合蛋白识别的IgG CH1结构域上的表位，在Biacore3000系统上用表面等离子体共振分析(SPR)分析了对来自一组不同物种的IgG的结合反应性。基于观测到的跨物种反应性，不同的CH1氨基酸序列可以然后被对比并分析潜在的独特和／或区分性残基和／或残基组合。为此目的，结合剂被固定化于CM5传感器芯片表面上。随后，传感器芯片与纯化的IgG抗体(20μg／ml)和／或来自不同物种的血清(20x稀释)在HBS-EP缓冲液(0.01M HEPES，pH7,4；0.15M NaCl；3mM EDTA；0.005％表面活性剂P20)中保温。以5μl／min允许结合1分钟，随后以5μl／min进行2.5分钟的解离步骤。结合信号(共振单位，RU)与仅用HBS-EP缓冲液测得的背景信号进行比较。结果总结于表6。

表6.在Biacore中结合IgG-CH1的VHH片段的物种选择性

抗体抗原	结合反应性＊
		HuIgG	+
黑猩猩IgG	+
		猕猴IgG	+
大鼠IgG	-
		小鼠IgG	-
兔IgG	-
		叙利亚仓鼠IgG	+
豚鼠IgG	+
		狗IgG	+
猫IgG	+
		牛IgG	-
山羊IgG	-
		绵羊IgG	-
猪IgG	-
		马IgG	+
驴IgG	+
		美洲驼羊IgG	-
鸡IgY	-
		缓冲液	-

＊(+)阳性结合；在Biocore中>250RU

(-)无结合；在Biacore中<5RU

如用来自不同物种的一组IgG样品分析的那样，观测到结合IgG-CH1的VHH片段的独特交叉反应性谱。例如，对来自“偶蹄类”如猪、牛、山羊、绵羊和美洲驼羊的IgG无结合，而来自“奇蹄类”如马和驴的IgG的CH1结构域显示显著结合信号。

对于啮齿类衍生的IgG样品，对鼠亚科(小鼠和大鼠)的IgG未观测到结合，而来自豚鼠和(叙利亚)仓鼠(各自属于啮齿目的不同亚科)的IgG可以被识别。抗IgG-CH1 VHH片段不识别兔IgG(属于兔形目)。

对狗和猫IgG均观测到好的结合，对属于灵长目的黑猩猩-和猕猴IgG如预期。尽管猕猴属于不同于人类和黑猩猩的灵长类科，但是观测到相当的结合反应性。

基于观测到的跨物种反应性，将公共领域可获得的不同CH1序列(www.uniprot.org)进行了对比并分析在不同IgG-CH1区域内的可与观测到的CH1结合反应性相关联的潜在的独特和／或区分性残基和／或残基组合。根据Kabat(Vol1(1991)fifth edition，US Department of Health and HumanServices，NIH publication No.91-3242)编号的不同CH1序列的示意图见图2。

基于表6所示观测到的物种选择性及图2示出的不同IgG-CH1结构域的氨基酸序列，人们可以得出结论，本发明的结合IgG-CH1的VHH片段结合存在于IgG同种型的抗体重链的CH1结构域上的表位，所述CH1结构域特征在于在122位具有苯丙氨酸残基(Phe，F)而不是酪氨酸(Tyr,Y)并且在127或128位不具有半胱氨酸残基或具有最多一个半胱氨酸残基(Cys，C)并且在156位具有丝氨酸(Ser，S)或赖氨酸残基(Lys，K)但在156位不是苏氨酸(Thr，T)并且在216位具有天冬酰胺(Asn，N)或丝氨酸(Ser，S)，如在图2所列出的天然发生的IgG-CＨ１结构域中展示的那样。所述残基和残基位置的概述见表7，这些残基和残基位置表明在本发明的抗原结合蛋白的结合反应性中起作用。

表7清楚证实在122位具有酪氨酸(Tyr，Y)的IgG-CH1结构域无一被抗IgG-CH1 VHH片段识别，表明在这个位置的这个残基对于表位结合是区分性的。另外，在156位具有苏氨酸(Thr，T)的CH1结构域无一被抗IgG-CH1VHH片段识别，及在127和128位均具有半胱氨酸(Cys，C)的CH1结构域无一被识别。除了豚鼠IgG，被抗IgG-CH1 VHH片段识别的所有IgG种类在216位具有天冬酰胺残基(Asp，N)，因此也指示抗IgG-CH1 VHH片段对IgG-CH1结构域的结合。

如Derrick et.al.(J.Mol.Biol.(1994)243，906-918)报道，蛋白G也显示一些对IgG抗体的CH1结构域的结合反应性。但是Derrick et.al.显示蛋白G结合小鼠和人IgG的Fab片段。本发明的抗原结合蛋白不显示对小鼠IgG-CH1结构域的任何结合，因此表明涉及与蛋白G识别的CH1表位内的不同的残基。

表7.鉴别IgG-CH1结构域中与抗IgG-CH1 VHH片段的物种选择性相关的关键残基

*基于在Biacore和ELISA中针对多克隆和单克隆IgG样品的结合反应性**编号是根据Kabat编号，1991，Vol1，第5版，US Department of Health andHuman Services，NIH publication No.91-3242

-粗体残基：存在于CH1结构域中由抗IgG-CH1 VHH识别的给定位置

-下划线残基：仅存在于CH1结构域中不被抗IgG-CH1 VHH片段识别的给定位置

Derrick et.al.进一步阐明取代Y129F(在我们的方案中这相应于Y122F，见图2)对于蛋白G的CH1结合不是严重不利。与蛋白G不一样，我们清楚观测到当酪氨酸(Tyr,Y)存在于这个位置时，确实对本发明的抗原结合蛋白的CH1结合有大影响(也见表7)。事实上，在所分析的一组天然发生的IgG-CH1结构域内，无一抗IgG-CH1 VHH片段显示对在该位置具有酪氨酸的CH1区域的任何结合。Derrick et al进一步报道蛋白G和IgG-CH1结构域之间相互作用大多数位于CH１结构域的C末端并且包括在不同CH１种类中高度保守的残基，如217位的苏氨酸(Thr，T)和218位的赖氨酸(Lys，K)(根据图2)，因此对蛋白G与小鼠和人IgG-CH１结构域的结合能力有贡献。这进一步证实本发明的抗原结合蛋白识别与蛋白G不同的表位，因为未观测到对例如小鼠IgG-CH１结构域和在122位具有酪氨酸(Tyr,Y)的CH１结构域的结合。

鉴别的结合IgG-CH１的VHH片段源自用人抗体和／或其包含IgG-CH１结构域的片段免疫的美洲驼羊。如预期，这些VHH片段无一显示对“经典”四聚体美洲驼羊IgG抗体的CH１结构域的反应性，因为免疫系统排除了诱导抗自身抗原的抗体。所述美洲驼羊IgG抗体的CH１结构域也可以鉴定为在122位具有酪氨酸残基(Tyr,Y)及在156位具有苏氨酸(Thr，T)(见图2)。

基于上述发现，具有与本发明的抗原结合蛋白相同的结合特征的抗体不太可能可以从本身展示在122位包含苯丙氨酸(Phe，F)及在156位包含丝氨酸(Ser，S)或赖氨酸(Lys，K)的IgG-CH１结构域的动物物种中产生。引入注目地，在现有技术中没有描述小鼠或大鼠IgG抗体(均在CH１中具有Y122和在156位的T或K)显示与该组抗IgG-CH１ VHH片段相同的结合反应性。另一方面，已描述蛋白质表面的裂缝被常规四聚体抗体的抗原组合位点避免，与重链抗体相反。当这种或其它VHH相关的抗原结合性质也在与CH１结构域结合能力中起作用时，人们至少可以预期本发明的抗原结合蛋白也可以得白具有重链抗体的动物，例如骆驼、单峰骆驼、铰口鲨和银鲛，在122位不具有酪氨酸(Tyr,Y)。

如所确定的，本发明的结合结构域无一结合在122位具有酪氨酸(Tyr，Y)的CH１区域。现有技术不知道或者未描述结合与本发明的抗原结合蛋白识别的IgG-CH１上相同表位的其它类型的抗原结合蛋白如蛋白G、A、L、甚至单克隆抗体，由此提供对所有4种人IgG亚类的CH１结构域、特别是其Fab片段的不依赖于轻链类型的结合反应性并且显示对IgG分子上存在的任何其它结构域如Fc(CH2-CH3)、VH和kappa-及lambda轻链无交叉结合。

实施例4.在Western印迹中抗原结合蛋白对人IgG结构域的结合反应性

在western印迹分析中测试了不同的抗原结合蛋白以确定对进行SDSpage后的还原和非还原的变性人IgG和人IgG-Fab样品的结合能力。为此目的，分析了C末端his标记的VHH片段(即抗IgG-CH1 VHH、抗人Fab-kappa轻链VHH和抗人IgG-Fc VHH)并与蛋白G(生物素化的)进行比较。结果示于图3。结果显示蛋白G和抗人IgG-Fc VHH片段仅结合非还原的变性人IgG，不结合其Fab片段。抗IgG-Fc VHH和蛋白G均不显示对人Fab片段的任何结合信号，这是对抗人IgG-Fc VHH所预期的。在这方面，未观测到蛋白G与人Fab的结合是由于其对人CH1的低亲和性。

抗IgG-CH1-和抗人Fab-kappa轻链VHH(针对人kappa轻链的CL结构域)均能结合变性(非还原的)人IgG抗体及其Fab片段。这因此可以提示识别CH1结构域呈递的更线性表位而非构象表位。但是，当IgG和Fab样品在SDS样品缓冲液中变性并且通过例如β-巯基乙醇还原时，用任何测试的抗原结合蛋白均未观测到结合信号。对于本发明的抗原结合蛋白(结合CH1)，这可能表明CH1结构域中链内半胱氨酸桥的破坏改变了结合表位，由此导致识别丧失。

实施例5.抗IgG-CH1 VHH片段的色谱测试

如WO94／18330所述在摇瓶中由酿酒酵母表达抗IgG-CH1 VHH片段。纯化后，抗IgG-CH1 VHH片段透析到NHS偶联缓冲液并根据供应商方案(GEHC)及WO2006／059904所述偶联于NHS活化的sepharose4B Fast Flow。所有抗IgG-CH1 VHH片段均以至少5mg／ml树脂的配体密度固定化。使用HR5／5柱(GEHC)制成偶联抗体基质柱。使用400μl柱体积。所有色谱实验均在Akta explorer100上进行。纯化的多克隆人IgG样品在PBS pH7.4中加样(例如10ml以0.5mg／ml于PBS，pH7.4中的人IgG流速150cm／hr)并用20mM柠檬酸pH3.0的第一洗脱步骤洗脱。用PBS pH2.1(即PBS添加8MHCl至pH2.1)进行第二洗脱步骤以确定第一洗脱缓冲液的洗脱效率。通过监测OD₂₁₄和OD₂₈₀的信号在线进行蛋白质检测。通过比较流穿液和洗脱峰的总峰面积计算结合能力。测试的抗IgG-CH1 sepharose载体在色谱中的结合能力的总结见表8。

表8.以mg／ml抗IgG-CH1树脂表示的人IgG的动态结合能力(DBC)

结果证实在随机共价偶联于NHS-Speharose后，所有测试的抗IgG-CH1VHH片段在色谱中在人IgG的结合和洗脱方面都是功能性的。

在这个偶联程序中，赖氨酸残基的￡氨基主要参与产生与树脂的活性基团的共价连接，与例如VHH结构域的氨基末端的α氨基相邻。在VHH片段的序列内有4个位置通常展示赖氨酸残基(即根据图1所示编号的位置43、64、75和83)。尽管已示出即使没有附着的C-末端肽或标记，VHH片段在共价偶联后仍保持它们的功能性，通常存在的赖氨酸残基数目及所述赖氨酸残基在VHH序列内的位置对树脂性能的影响在共价偶联于例如NHS sepharose后是可预期的。在此方面，基于这些赖氨酸残基产生变体可以因此作为改善固定化的VHH片段的功能性的策略，导致例如对其靶抗原的动态结合能力的改善。为举例说明，仅与VHH#1(Q83K)有一个残基不同而由此具有一个额外赖氨酸残基的抗IgG-CH1 VHH#28与VHH#1相比显示改善的对人IgG的结合能力。另外，额外的赖氨酸残基也可以改变VHH片段的pI，例如根据GPMAW7.01软件确定从5.66(VHH#1)增加到7.41(VHH#28)，其也有利于通过例如离子交换层析纯化VHH片段。

实施例6.使用具有不同人IgG结合蛋白的树脂亲和纯化的多克隆人 IgG的IgG亚类分布

为验证观测的抗IgG-CH1 VHH片段对不同人IgG亚类的类似的结合亲和性及这种抗原结合蛋白在制造例如来自人血浆的静脉内免疫球蛋白(IntraVenous Immune Globulins)(IVIG)中的可能用途，多克隆人IgG被过量加样到固定化抗IgG-CH1 VHH片段(VHH#01)或抗人IgG-Fc VHH片段的树脂上(配体密度为±15mg／ml树脂)。后一VHH片段已知展示对人IgG亚类1、2和4的类似的结合亲和性(全部±1nM)，但是证实对人IgG3的显著更弱的结合亲和性(±48nM)。抗IgG-CH1-和抗人IgG-Fc树脂的计算DBC分别是28和24mg人IgG／ml树脂。两种树脂均用多克隆人IgG过量加载，是DBC的±2.5倍(相当于50mg人IgG／ml树脂)。当对特定人IgG亚类的结合亲和性较低时，在用多克隆人IgG过量加载树脂期间其它IgG亚类会更有效竞争结合固定化的VHH配体。通过随后分析洗脱级分的亚类分布，具有对树脂最低结合亲和性的IgG亚类预期与起始材料相比未被充分表示(under represented)。当起始材料和洗脱级分甚至在洗脱之前过量加载树脂后仍显示类似亚类分布时，显示出亲和性树脂的实用性。

起始材料及洗脱级分的亚类分布用ELISA确定，通过测量人IgG亚类特异性小鼠单克隆抗体(生物素缀合物，Sigma)对包被在Maxisorp平板表面上的不同样品的相对结合信号进行。结果示于图4。结果显示不同亚类特异性小鼠MAb对抗IgG-CH1树脂的起始材料和洗脱级分的类似的结合模式。然而，从抗人IgG-Fc树脂洗脱的人IgG清楚证实使用抗人IgG3小鼠Mab的相对较低应答，表明与起始材料相比洗脱级分中人IgG3水平的明显降低。抗IgG-CH1树脂因此证实提供更强方法，当从多克隆原料如人血清／血浆或得自Cohn分级分离方法的样品纯化人IgG时保持人IgG亚类的最初分布。

实施例7.通过抗IgG-CH1亲和性树脂纯化人IgG及其片段

为研究在人IgG抗体及其片段的纯化中抗IgG-CH1亲和性树脂的CH1选择性，用多克隆人IgG、Fc和Fab片段测试了用抗IgG-CH1 VHH片段(VHH#01)固定化的树脂。使用400μl柱体积。所有层析实验均在Aktaexplorer100上进行。抗体样品在PBS pH7.4中加样(即4ml1mg／ml的人IgG，4ml+0.25mg／ml的人IgG-Fc和4ml+0.25mg／ml的人IgG-Fab，全部在PBS，pH7.4中，流速为150cm／hr)并用PBS pH2.1洗脱。所得层析谱见图5。注意在SDS样品缓冲液中煮沸起始材料过程中发生Fab制备物的一些还原(泳道1，图5C)。因为Fab起始材料的缓冲液含有残余量的半胱氨酸(来自木瓜蛋白酶消化缓冲液)，所以可以预期Fab片段的一些还原。

结果清楚证实抗IgG-CH1树脂结合人IgG及其Fab片段的能力(分别见图5A和5C)，但不结合人IgG-Fc片段(图5B)。

实施例8.在不同亲和性树脂上纯化人IgG Fab片段

比较抗IgG-CH1亲和性树脂与蛋白G(HiTrap，GEHC)结合人IgG Fab片段(Jackson Immunoresearch)的能力。对于抗IgG-CH1树脂，使用400μl柱体积。蛋白G HiTrap以1ml体积测试。所有层析实验均在Akta explorer100上进行。抗体样品在PBS pH7.4中加样(即4m1±0.25mg／ml的人IgG-Fab，在PBS，pH7.4中，流速为150cm/hr)并用PBS pH2.1洗脱。所得层析谱见图6。

结果清楚证实抗IgG-CH1树脂结合和洗脱多克隆人IgG Fab片段的能力(图6A)。如预期，用蛋白G亲和性基质观测到不良结合。尽管蛋白G的树脂体积是基于VHH的亲和性树脂的2.5倍，但是大部分Fab片段是在流穿液级分中收集(见图6B)。

因为多克隆Fab样品确实展示一些降解(例如游离轻链存在)，这可以解释在抗IgG-CH1亲和性树脂的层析谱中流穿液级分中观测到OD₂₈₀信号。

应注意因为本发明的抗原结合蛋白不显示任何对人抗体轻链的结合反应性，使用基于所述抗原结合蛋白的亲和性树脂可以使得选择性捕获完整IgG或Fab片段而不共结合存在于例如表达重组人IgG抗体或人IgG Fab片段的生产菌株培养基中的过量表达的游离轻链。

在这个方面，设计用于结合抗体轻链的亲和性配体不能区分过量的轻链和相应的IgG或Fab蛋白。例如在包含结合kappa和lambda轻链的可变结构域的配体的Fabsorbent F1P HF树脂产品的产品单(ProMetic Biosciences)中所报道的，存在于表达人IgG抗体的CHO细胞系上清中的过量轻链也被Fabsorbent F1P HF捕获及洗脱。这因此也说明靶向抗体轻链的其它抗原结合结构域如蛋白L、CaptureSelect Fab-kappa和lambda亲和性配体。

结果证实结合IgG-CH1的VHH片段在层析中的良好性质，由此能得到通用的纯化策略以用于所有人IgG亚类衍生的Fab片段，而不依赖于轻链类型。因此，有关于人Fab纯化的这一有利的通用特征由本发明的抗原结合蛋白提供。尽管蛋白G能够识别存在于IgG抗体的Fab片段上的表位，但是其对CH1的低结合亲和性需要非常低的样品加样流速(或者仅通过静态结合)，例如如Proudfoot et.al.(Prot.Expr and Purification(1992)3，368-373)所述。在这种情况中，1柱体积(3ml)／小时的流速用于样品加样。Proudfootet.al.另外说明所描述的用于Fab和F(ab)2片段的蛋白G纯化方法可能仅适用于一亚组人抗体片段。在这个方面，Perosa et.al.(JIM(1997)203，153-155)确实证实人IgG2骨髓瘤蛋白的Fab区域不携带蛋白G结合表位，因此在3小时静态结合程序后不能被蛋白G sepharose有效捕获。图6B显示的结果证实蛋白G对人IgG Fab片段的结合反应性不足，因此不能作为纯化所述片段的有效通用工具。

另外，由于蛋白G对IgG Fc结构域的结合，其不能用于从由人IgG Fc和Fab和／或F(ab)2片段(例如与分别用木瓜蛋白酶和／或胃蛋白酶的IgG消化程序相关)的混合物组成的原料样品选择性捕获人IgG衍生的Fab片段。

实施例9.从IgG消化混合物中纯化人Fab片段

木瓜蛋白酶和胃蛋白酶是从例如人IgG抗体分别制备Fab和F(ab)2片段常用的蛋白酶。人Fab和F(ab)2片段随后从这些消化混合物中的纯化可以如下获得，例如首先从这些混合物中通过抗IgG Fc亲和性树脂除去IgG-Fc片段、完整和／或部分消化的IgG，随后在第二步中通过例如大小排阻层析从未结合级分中进一步纯化Fab或F(ab)2片段。后一步骤也可以包括亲和性捕获步骤，其优选可以覆盖所有人IgG衍生的Fab片段而不依赖于IgG亚类及轻链类型。在这个方面，蛋白G显示对Fab的低亲和性并且不结合所有IgG Fab亚类，蛋白A对一些人VH3结构域有一些亲和性但是不结合所有人IgG Fab片段。蛋白L仅证实结合某些同种型的人VL-kappa家族，CaptureSelect配体人Fab-kappa和lambda各自仅能结合含有kappa或lambda轻链的Fab片段(不能区分IgG和例如IgM)。因此这些抗原结合结构域无一提供覆盖所有人IgG衍生的Fab或F(ab)2片段的通用用途。

为此目的，1ml人IgG(20mg／ml)用2ml消化缓冲液(例如0.020M半胱氨酸，20mM磷酸钠，pH7.4)稀释并与1ml木瓜蛋白酶珠(Thermo scientific，no.20341)在37℃保温过夜。收集IgG消化混合物(上清)并用PBS，pH7.4稀释至20ml(IgG终浓度±1mg／ml)。将3ml这个样品直接加到用抗人IgG-FcVHH片段固定化的亲和性树脂上(400μl树脂，以150cm／hr加样)。随后，收集流穿液级分(未结合级分)并直接加到用抗IgG-CH1 VHH片段固定化的亲和性树脂上(400μl树脂，以150cra／hr加样)，在洗涤后以低pH洗脱以回收结合的Fab片段。结果总结在图7。

结果证实通过抗人IgG-Fc树脂从消化混合物非常有效地除去了IgG-Fc片段及未消化或部分消化的IgG，在SDS page凝胶上显示了未结合级分中Fab片段的明显富集(图7A泳道3)。所述树脂的洗脱级分(图7A泳道4)含有Fc及未消化或部分消化的IgG。注意因为未结合的级分仍然含有一些半胱氨酸，所以在SDS样品缓冲液中煮沸样品期间发生Fab片段的部分还原(在图7A中指示为LC／HC片段)。

随后，这个未结合的(及Fab富集的)级分加样到抗IgG-CH1树脂上，显示有效捕获所有人IgG Fab片段，因为在流穿液级分中未见Fab蛋白(图7B泳道2)。这些结果进一步证实本发明的抗原结合蛋白的广泛实用性，能够结合任何人IgG衍生的Fab片段。层析谱确实显示流穿液级分的OD₂₈₀信号，表明无CH1相关污染物(例如缓冲液组分如半胱氨酸、残余木瓜蛋白酶和／或游离轻链)。结合的Fab片段全部回收在洗脱级分中，如泳道3所示(图7B)。

与显示人IgG抗体Fc结构域的有效结合的树脂组合，包含抗IgG-CH1VHH片段的树脂提供了从木瓜蛋白酶和／或胃蛋白酶消化的IgG样品获得纯化的人IgG Fab和／或F(ab)2片段的独特方法。在这个方面，人们甚至可以想象在开始消化之前用木瓜蛋白酶和／或胃蛋白酶“柱上消化”结合于抗IgG-Fc亲和性树脂上的IgG抗体，随后在保温一定时间后将上清或消化混合物直接加到包含抗IgG-CH1 VHH片段的树脂上。这可以然后促进例如一步纯化策略，用于获得纯化的由木瓜蛋白酶和／或胃蛋白酶消化人IgG抗体产生的Fab和／或F(ab)2片段。

Claims

1.捕获包含人IgG-CH1结构域的靶分子的方法，其中所述方法包括步骤：

a)将包含所述靶分子的样品与固定化于支持物上的包含抗原结合蛋白的免疫吸附材料接触；及，

b)使得所述靶分子通过特异性结合所述抗原结合蛋白而被所述免疫吸附材料捕获；

其中所述抗原结合蛋白能够结合单一表位，所述表位包含在人IgG1、人IgG2、人IgG3和人IgG4的每一个的CH1结构域中，其中所述抗原结合蛋白被具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的VHH交叉阻断，及其中所述抗原结合蛋白包含免疫球蛋白衍生的可变结构域，所述可变结构域包含针对所述表位的完整抗原结合位点。

2.权利要求1的方法，其中所述抗原结合蛋白包含：

a)可得自骆驼或鲨鱼的抗体，所述抗体仅由重链组成并且天然没有轻链；

b)在a）中限定的抗体的可变结构域；或者，

c)可变结构域，其中在b）中限定的可变结构域的构架序列移植了得自其它来源的CDR。

3.权利要求1或2的方法，其中所述靶分子是选自下组的分子：人或人源化IgG1分子、人或人源化IgG2分子、人或人源化IgG3分子、人或人源化IgG4分子、人或人源化IgG Fab、人或人源化IgG F(ab’)2、单臂人或人源化IgG抗体、单链人或人源化IgG抗体、IVIG及人或人源化IgG消化物。

4.权利要求3的方法，其中所述人或人源化IgG消化物是木瓜蛋白酶或胃蛋白酶人IgG消化物。

5.前述任一项权利要求的方法，其中所述抗原结合蛋白结合所述CH1结构域的表位，所述表位包含如下的一或多个氨基酸：在122位的苯丙氨酸，在127和128位的任一位置不是半胱氨酸或者是单个半胱氨酸，在156位的丝氨酸或赖氨酸和/或在216位的天冬酰胺或丝氨酸，其中所述氨基酸位置是基于Kabat编号。

6.前述任一权利要求的方法，其中所述抗原结合蛋白是骆驼VHH或骆驼源化VH。

7.纯化靶分子的方法，所述方法包括在权利要求1-6任一项定义的方法中用免疫吸附材料捕获所述靶分子，其中所述方法进一步包括步骤：

c)在降低所述靶分子与所述免疫吸附材料之间的亲和性的条件下洗脱结合的靶分子，及任选地回收所述靶分子。

8.权利要求7的纯化靶分子的方法，其中所述抗原结合蛋白不结合游离轻链。

9.纯化包含人IgG-CH1结构域的Fab片段而不共纯化游离轻链的方法，其中所述方法包括步骤：

a)将包含所述靶分子和游离轻链的样品与与固定化于支持物上的包含抗原结合蛋白的免疫吸附材料接触；

b)使得所述靶分子通过特异性结合所述抗原结合蛋白而被所述免疫吸附材料捕获；及

c)在降低所述靶分子与所述免疫吸附材料之间的亲和性的条件下洗脱结合的靶分子，及任选地回收所述靶分子；

其中所述抗原结合蛋白如权利要求1、2、5和6任一项所限定。

10.从液体中吸附包含人IgG-CH1结构域的靶分子的体外方法，所述方法包括将免疫吸附材料与所述液体接触的步骤，其中所述免疫吸附材料包含固定化于载体上的权利要求1、2、5和6任一项限定的抗原结合蛋白，及其中优选地所述抗原结合蛋白通过共价连接固定化于所述载体上。

11.权利要求1、2、5和6任一项限定的抗原结合蛋白。

12.包含编码权利要求11的抗原结合蛋白的核苷酸序列的核酸。

13.包含权利要求12的核酸的宿主细胞。

14.产生权利要求11的抗原结合蛋白的方法，所述方法包括在有助于表达所述抗原结合蛋白的条件下培养权利要求12的宿主细胞的步骤。

15.包含权利要求11的抗原结合蛋白的免疫吸附材料。

16.权利要求11的抗原结合蛋白或权利要求15的免疫吸附材料用于体外检测和/或体外纯化包含人IgG-CH1结构域的靶分子的用途。

17.权利要求16的用途，其中所述靶分子是选自下组中的分子：人或人源化IgG1分子、人或人源化IgG2分子、人或人源化IgG3分子、人或人源化IgG4分子、人或人源化IgG Fab、人或人源化IgG F(ab’)2、单臂人或人源化IgG抗体、单链人或人源化IgG抗体、IVIG及人或人源化IgG消化物。

18.权利要求17的用途，其中所述人IgG消化物是木瓜蛋白酶或胃蛋白酶人或人源化IgG消化物。

19.权利要求17的用途，其中所述靶分子是没有游离轻链共结合的人IgG或者人或人源化IgG Fab。