WO2023282162A1 - 低分子化抗体 - Google Patents

低分子化抗体 Download PDF

Info

Publication number
WO2023282162A1
WO2023282162A1 PCT/JP2022/026123 JP2022026123W WO2023282162A1 WO 2023282162 A1 WO2023282162 A1 WO 2023282162A1 JP 2022026123 W JP2022026123 W JP 2022026123W WO 2023282162 A1 WO2023282162 A1 WO 2023282162A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
virus
amino acid
antibody
framework region
region
Prior art date
Application number
PCT/JP2022/026123
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
将弘 荒武
拓馬 末岡
正克 西八條
Original Assignee
株式会社カネカ
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 株式会社カネカ filed Critical 株式会社カネカ
Publication of WO2023282162A1 publication Critical patent/WO2023282162A1/ja

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/04—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length on carriers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/42—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione

Definitions

  • the present invention relates to minibodies.
  • Viruses, virus-like particles, virus vectors, immunoglobulins, and albumin are important molecules in medical fields such as gene therapy and molecular target therapy.
  • a purification technique for efficiently recovering viruses, virus-like particles, viral vectors, immunoglobulins, albumin, and the like from biological samples such as cell cultures, plasma, and serum.
  • cells or cells are first purified from the culture medium, plasma, or serum of transformed cells in which viruses or immunoglobulins are produced.
  • a method of removing solids such as pieces by filtration and then purifying by ultracentrifugation, chromatography, or the like is known (Patent Document 1).
  • Affinity chromatography is a technique that separates the target molecule from other impurities using a carrier in which a ligand such as a low-molecular-weight antibody that specifically binds to the target molecule is immobilized on a water-insoluble substrate such as beads. be.
  • Non-Patent Document 1 Non-Patent Document 1
  • the object of the present invention is to solve the above-mentioned problems in the past and to achieve the following objects. That is, the present invention provides a low-molecular-weight antibody that dissociates from a target molecule in a pH solution higher than conventional, and an efficient method for producing the target molecule using the same.
  • framework region 1 variable heavy chain complementarity determining region 1, framework region 2, variable heavy chain complementarity determining region 2, framework region 3, a minibody having a structure in which a variable heavy chain complementarity determining region 3 and a framework region 4 are linked in this order, wherein at least one polar amino acid in the amino acid sequence of the framework region 3 is A sequence substituted with other amino acids, which binds to an antigen in a neutral pH range, and is characterized by reduced antigen-binding ability in a weakly acidic pH range compared to low-molecular-weight antibodies before substitution.
  • the present invention is based on the findings of the present inventors, and means for solving the above problems are as follows. Namely ⁇ 1> Framework Region 1, Variable Heavy Chain Complementarity Determining Region 1, Framework Region 2, Variable Heavy Chain Complementarity Determining Region 2, Framework Region 3, Variable Heavy Chain Complementarity Determining Region 3, and Framework Region 4 wherein at least one polar amino acid in the amino acid sequence of the framework region 3 is substituted with another amino acid, and in a neutral pH region A low-molecular-weight antibody that binds to an antigen and has reduced antigen-binding ability in a weakly acidic pH range compared to the low-molecular-weight antibody before substitution.
  • Framework Region 3 is the amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 1 to 3, wherein at least one polar amino acid is other is a low-molecular-weight antibody characterized by having a sequence substituted with an amino acid of
  • the above-mentioned problems in the conventional art can be solved, the above-mentioned objects can be achieved, and a low-molecular-weight antibody that dissociates from a target molecule in a pH solution higher than the conventional one, and an efficient target molecule using the same can provide a manufacturing method of
  • the low-molecular-weight antibody is (1) Framework Region 1, Variable Heavy Chain Complementarity Determining Region 1, Framework Region 2, Variable Heavy Chain Complementarity Determining Region 2, Framework Region 3, Variable Heavy Chain Complementarity Determining Region 3, and Framework Region 4 wherein at least one polar amino acid in the amino acid sequence of the framework region 3 is substituted with another amino acid, and in a neutral pH region It binds to an antigen and has reduced antigen-binding ability in a weakly acidic pH region compared to the low-molecular-weight antibody before substitution, or (2) Framework Region 1, Variable Heavy Chain Complementarity Determining Region 1, Framework Region 2, Variable Heavy Chain Complementarity Determining Region 2, Framework Region 3, Variable Heavy Chain Complementarity Determining Region 3, and Framework Region 4 wherein the amino acid sequence of the framework region 3 is the amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 1 to 3, wherein at least one polar amino acid is other is a sequence substituted with amino acids of
  • the low-molecular-weight antibody dissociates from the target molecule in a pH solution higher than conventional.
  • the framework region and the variable heavy chain complementarity determining region may be defined based on the three-dimensional structure or may be defined by alignment by BLAST based on the annotation of the heavy chain of the IgG antibody (ACS Synth. Biol. 2018 7: 2480-2484), and in the present application, the latter is defined by BLAST alignment based on the heavy chain annotation of IgG antibodies (Med Microbiol Immunol 2009 198: 157-174).
  • Antibody is a general name that focuses on the function of immunoglobulins.
  • Immunoglobulins are glycoproteins produced by lymphocyte B cells, and have the function of recognizing and binding to molecules such as specific proteins. Immunoglobulins have the function of specifically binding to this specific molecule (antigen) and the function of detoxifying and removing antigen-bearing factors in cooperation with other biomolecules and cells.
  • Immunoglobulin G (hereinafter sometimes abbreviated as "IgG") is a monomeric immunoglobulin, composed of two heavy chains ( ⁇ chains) and two light chains, and has two antigen binding sites. has parts.
  • the place corresponding to the vertical bar part of the lower half of the "Y" letter of the antibody is called the Fc region, and the upper half “V” part is called the Fab region, and in the Fab region, the complete antigen-binding site is contained,
  • the portion that has the same binding properties as the Fab region is called the Fv region.
  • the Fc region has an effector function that elicits a reaction after an antibody binds to an antigen
  • the Fab region has a function of binding to an antigen.
  • the Fab region and Fc region of the heavy chain are connected by a hinge region, and the proteolytic enzyme papain contained in papaya degrades this hinge region to cleave it into two Fab regions (fragments) and one Fc region.
  • V region A portion (domain) of the Fab region near the tip of the "Y" is called a variable region (V region) because various changes are observed in the amino acid sequence so that it can bind to various antigens.
  • the light chain variable region is called the VL region
  • the heavy chain variable region is called the VH region.
  • the Fab region and the Fc region other than the V region are regions that undergo relatively little change and are called constant regions (C regions).
  • the light chain constant region is called the CL region
  • the heavy chain constant region is called the CH region.
  • the CH region is further divided into three regions, CH1 to CH3.
  • the Fab region of the heavy chain consists of the VH region and CH1, and the Fc region of the heavy chain consists of CH2 and CH3.
  • the hinge portion is located between CH1 and CH2.
  • heavy-chain antibodies which are antibodies composed only of heavy chains without light chains.
  • Camelid-derived heavy-chain antibodies are distinguished from normal IgG antibodies (IgG1), which have light chains, and are termed IgG2, IgG3.
  • the heavy chain variable domain of a heavy chain dimer immunoglobulin is called VHH (Variable domain of the heavy-chain of heavy-chain antibody).
  • VHHs are also used as single domain antibodies that have the ability to specifically bind antigens by themselves.
  • a single-domain heavy-chain antibody composed of VHHs has high chemical stability and is easy to produce, and is therefore suitable for applications such as pharmaceuticals.
  • fish-derived heavy chain antibodies are called IgNAR (new antigen receptor).
  • the minibodies in the present invention may contain the heavy chain variable domain, may be a single domain antibody (VHH antibody) consisting of the heavy chain variable domain, or may be a single domain antibody (VHH antibody) consisting of the heavy chain variable domain. It may be a heavy chain antibody containing a chain constant domain or a fragment thereof, and is not particularly limited as long as it has antigen-binding ability.
  • VHH antibody single domain antibody
  • VHH antibody single domain antibody
  • the minibodies of the present invention preferably do not have CH2 and CH3 domains.
  • the VHH amino acid sequence in the minibodies of the present invention may be in the form of a fusion polypeptide in which another polypeptide is further linked to one or both of the N-terminal side and the C-terminal side.
  • polypeptides include, but are not limited to, signal peptides, tag peptides, and the like.
  • signal peptides include pelB signal peptide, heat-stable enterotoxin II (STII) signal peptide, and outer membrane protein A (OmpA) signal peptide.
  • tag peptides include tag peptides (polyhistidine tag) composed of a plurality of (eg, 6 to 10) histidine residues and FLAG tag peptides.
  • the minibodies in the present invention are preferably camelid-derived heavy chain antibody variable regions (VHH).
  • VHH camelid-derived heavy chain antibody variable regions
  • the variable region (VHH) of the camelid-derived heavy chain antibody is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose. , those produced by expressing VHH genes in host cells, and those synthesized chemically based on amino acid sequences.
  • the camelid is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the intended purpose.
  • the host cell in which the VHH gene is expressed is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose. Examples include bacteria such as E. coli, fungi such as yeast, animal cells, and plant cells.
  • the yeast is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include Pichia yeast.
  • the method of immunizing the camelid with the target to be adsorbed is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose.
  • the method of producing VHH genes by expressing them in host cells is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose. and the method described in .
  • Minibodies in the present invention preferably include single domain antibodies.
  • the single domain antibody is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose, but preferably includes the variable region (VHH) of the camelid-derived heavy chain antibody.
  • VHH variable region
  • the minibodies in the present invention may be chimerized or humanized.
  • the molecular weight of the low-molecular-weight antibody is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose. 30,000 or less is particularly preferred, and 20,000 or less is most preferred.
  • the amino acid sequence of the variable heavy chain complementarity determining region 1 is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose. and an amino acid sequence having a high sequence identity with the amino acid sequence described in any one of.
  • the amino acid sequence having high sequence identity with the amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NOS: 4-6 is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose. 50% or more is preferable, 60% or more is more preferable, 70% or more is still more preferable, 80% or more is particularly preferable, and 90% or more is most preferable.
  • the amino acid sequence of the variable heavy chain complementarity determining region 2 is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose. and an amino acid sequence having a high sequence identity with the amino acid sequence described in any one of.
  • the amino acid sequence having high sequence identity with the amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NOS: 7-9 is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose. 50% or more is preferable, 60% or more is more preferable, 70% or more is still more preferable, 80% or more is particularly preferable, and 90% or more is most preferable.
  • the amino acid sequence of the variable heavy chain complementarity determining region 3 is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose. and an amino acid sequence having a high sequence identity with the amino acid sequence described in any one of.
  • the amino acid sequence having high sequence identity with the amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 10 to 12 is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose. 50% or more is preferable, 60% or more is more preferable, 70% or more is still more preferable, 80% or more is particularly preferable, and 90% or more is most preferable.
  • the amino acid sequence of the framework region 3 is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose. 80% or more is more preferable, 85% or more is even more preferable, 90% or more is particularly preferable, and 95% or more is most preferable.
  • the amino acid sequence of the framework region 3 is preferably a sequence in which at least one polar amino acid is substituted with another amino acid among the amino acid sequences set forth in any one of SEQ ID NOS: 1-3.
  • sequences in which at least one polar amino acid at positions 15 to 23 is substituted with other amino acids are more preferable, and positions 15, 16, 17, Sequences in which at least one polar amino acid is substituted with another amino acid out of positions 20 and 21 are more preferred, and out of positions 15, 16, and 21, at least one polar amino acid is Sequences in which other amino acids are substituted are more preferred, sequences in which the polar amino acid at position 16 or 21 is substituted with other amino acids are particularly preferred, and polar amino acids at position 21 are substituted with other amino acids. sequence is most preferred.
  • the polar amino acids are aspartic acid, glutamic acid, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine, cysteine, arginine, histidine, and lysine.
  • amino acids before substitution amino acids before mutation introduction
  • proline amino acids other than cysteine
  • amino acids before substitution amino acids before mutation introduction
  • amino acids before substitution amino acids before mutation introduction
  • amino acids before mutation introduction more preferably amino acids excluding proline, glycine, and cysteine
  • amino acids before substitution amino acids before mutation introduction
  • amino acids before substitution amino acids before mutation introduction
  • amino acids before mutation introduction amino acids excluding proline, serine, glycine, threonine, aspartic acid, methionine, and cysteine is more preferred, and alanine is particularly preferred.
  • the amino acid sequence of the minibody before substitution is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose. Examples include amino acid sequences having high sequence identity with any of the amino acid sequences described above.
  • the amino acid sequence having high sequence identity with the amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NOS: 13 to 15 is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose. preferably 70% or more, more preferably 80% or more, even more preferably 90% or more, particularly preferably 95% or more, and most preferably 99% or more.
  • the antigen is an object to be adsorbed by the low-molecular-weight antibody.
  • the antigen is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose. products, derivatives and the like. Among these, viruses, virus-like particles, virus vectors, immunoglobulins, albumin, or derivatives thereof are preferred, immunoglobulins or albumin are more preferred, and immunoglobulins are particularly preferred.
  • the derivative is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the intended purpose. and those obtained by a reduction reaction on the base.
  • the immunoglobulin derivative is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose.
  • humanized immunoglobulin in which the complementarity-determining region portion of human immunoglobulin is replaced with the complementarity-determining region portion of antibody of other biological species and fused
  • immunoglobulin in which the sugar chain of the Fc region is molecularly modified
  • artificial immunoglobulins in which the Fv region and Fc region of human immunoglobulin are fused, and the like.
  • the virus-like particles are all or part of the viral coat protein that mainly constitutes the capsid, and since they do not contain nucleic acid, there is no concern about infection. be able to.
  • viruses, virus-like particles, and virus vectors are not particularly limited and can be appropriately selected depending on the intended purpose.
  • Non-enveloped viruses such as rotavirus, coxsackievirus, sapovirus, norovirus, poliovirus, echovirus, hepatitis A virus, hepatitis E virus, rhinovirus, astrovirus, circovirus, simian virus, retrovirus, lentivirus, Sendai Viruses, herpes viruses such as herpes simplex virus, vaccinia virus, measles virus, baculovirus, influenza virus, leukemia virus, enveloped viruses such as Sindbis virus, capsids of these viruses, virus vectors containing these genes, etc. mentioned.
  • the immunoglobulin is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose, and the antigen may be a variable region (V region) or a constant region (C region), It is preferably a constant region (C region), more preferably an Fc region.
  • the isotype of the immunoglobulin is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose. Examples thereof include IgG, IgM, IgA, IgD and IgE. Among these, IgG is preferred.
  • the albumin is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include serum albumin, egg albumin, milk albumin and the like. Among these, serum albumin is preferred, and human serum albumin is more preferred.
  • the minibodies bind to antigens in a neutral pH range, and have reduced antigen-binding ability in a weakly acidic pH range compared to the minibodies before substitution.
  • the neutral pH range is pH 6.0 or more and less than 8.0
  • the weakly acidic pH range is pH 3.5 or more and less than 6.0.
  • nucleic acid contains a base sequence that encodes the minibody, and may contain other elements.
  • the minibodies are as described above.
  • the vector contains the nucleic acid and may contain other elements.
  • the nucleic acid is as described above.
  • the cell contains the nucleic acid and may contain other elements.
  • the nucleic acid is as described above.
  • the cells are not particularly limited and can be appropriately selected depending on the intended purpose, and include bacteria such as Escherichia coli, fungi such as yeast, animal cells, and plant cells. Said cell may be said host cell.
  • the method for producing minibodies includes a step of culturing the cells, and may further include other steps.
  • the cells are as described above.
  • the culture is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose. Examples include a method of seeding the cells in a culture medium in which the cells can grow, and allowing the cells to stand, stir or shake.
  • the affinity carrier has a water-insoluble substrate, the low-molecular-weight antibody immobilized on the water-insoluble substrate, and may further have other elements. That is, in the affinity carrier, the water-insoluble substrate and the low-molecular-weight antibody may be directly connected, or the water-insoluble substrate and the low-molecular-weight antibody may be connected via other elements. may be The minibodies are as described above.
  • the density (ligand density) of the low-molecular-weight antibody in the affinity carrier is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose. 10 mg/mL is more preferred, and 0.5-5 mg/mL is even more preferred.
  • the ligand density is measured as follows. Filtrate from the immobilization of the ligand on the water-insoluble substrate is recovered, and the absorbance is measured to calculate the ligand density of the ligand immobilized on the water-insoluble substrate.
  • the water-insoluble base material is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include water-insoluble fibers, beads, membranes, monoliths, capillaries and the like. Among these, water-insoluble fibers or beads are preferred.
  • the lower limit of the thickness of the water-insoluble fiber is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose. Preferably, 0.12 mm or more is more preferable.
  • the upper limit of the thickness of the water-insoluble fiber is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose. It is preferably 0.30 mm or less, and more preferably 0.30 mm or less.
  • the lower limit of the basis weight of the water - insoluble fiber is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose. is more preferred.
  • the upper limit of the basis weight of the water - insoluble fiber is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose. 2 or less is more preferable, 80 g/m 2 or less is even more preferable, and 70 g/m 2 or less is particularly preferable.
  • the lower limit of the bulk density of the water-insoluble fibers is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose. m 3 or more is preferable, 60 kg/m 3 or more is more preferable, and 70 kg/m 3 or more is even more preferable.
  • the upper limit of the bulk density of the water - insoluble fiber is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose. is more preferable, and 300 kg/m 3 or less is even more preferable.
  • the bulk density is a value obtained by measuring the weight per 1 m 3 of the water-insoluble fiber.
  • the shape of the water-insoluble fiber is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose. Examples include circular, square, triangular, and bale-shaped.
  • the surface of the water-insoluble fiber may be modified by graft polymerization, polymer coating, treatment with chemicals such as alkali or acid, plasma treatment, or the like.
  • the graft polymerization is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include a graft polymerization method in which electron beam irradiation is performed in order to impart a radically polymerizable compound to the water-insoluble fiber. .
  • the radically polymerizable compound is a compound that forms a bond with polymer radicals generated in water-insoluble fibers by electron beam irradiation.
  • unsaturated compounds having an acidic group such as acrylic acid, methacrylic acid, itaconic acid, methacrylsulfonic acid, and styrenesulfonic acid, their esters, unsaturated carboxylic acid amides such as acrylamide and methacrylamide, and terminally glycidyl Unsaturated compounds having groups, hydroxyl groups, amino groups, or formyl groups, unsaturated organic phosphoric acid esters such as vinyl phosphonates, basic methacrylic acid esters such as quaternary ammonium salts and tertiary ammonium salts, fluoroacrylates, acrylonitrile, etc.
  • a composite grafted fiber can be obtained in which the graft chain is a copolymer of at least two kinds of radically polymerizable compounds.
  • acrylic monomers from the viewpoint of graft ratio. Furthermore, from the viewpoint of reactivity with ligands having amino groups, hydroxyl groups, thiol groups, etc., acrylic monomers having carboxy groups or epoxy groups at the molecular ends are preferred, more preferably acrylic acid, methacrylic acid, and methacrylic acid. It is at least one selected from the group consisting of glycidyl (hereinafter abbreviated as "GMA").
  • GMA glycidyl
  • the above radically polymerizable compound may be a diluted solution using water, an organic solvent such as a lower alcohol, or a mixed solution thereof as a solvent.
  • concentration of the radically polymerizable compound in this diluted solution varies depending on the desired grafting ratio, but it can be prepared in the range of 1 to 70% by volume.
  • the generation of a homopolymer may be suppressed by adding a metal salt of copper or iron to a diluted solution of the radically polymerizable compound.
  • the lower limit of the concentration of the radically polymerizable compound in the solution is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the intended purpose. , more preferably 5% by weight or more, and particularly preferably 10% by weight or more.
  • the upper limit of the concentration of the radically polymerizable compound in the solution is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose. % by weight or less is more preferable, and 40% by weight or less is particularly preferable.
  • the graft ratio of the graft polymerization reaction is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose, but is preferably 50% or more.
  • the material of the water-insoluble fiber is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose.
  • examples include polyolefin, polypropylene, maleic anhydride polypropylene, modified polypropylene, polyethylene, cellulose, regenerated cellulose, cellulose acetate, Cellulose diacetate, cellulose triacetate, ethyl cellulose, cellulose acetate, polyethylene terephthalate (PET), polybutylene terephthalate (PBT), acrylic resin, polycarbonate, polyester, polyacrylonitrile, polyamide, polystyrene, brominated polystyrene, polyalkyl(meth)acrylate , polyvinyl chloride, polychloroprene, polyurethane, polyvinyl alcohol, polyvinyl acetate, polysulfone, polyethersulfone, polybutadiene, butadiene-acrylonitrile copolymer, styrene-butadiene copolymer,
  • polyolefin-based or cellulose-based materials are preferable, polyolefin-based materials are more preferable, and polypropylene is even more preferable, from the viewpoint of good reactivity in electron beam graft polymerization.
  • the lower limit of the average fiber diameter of the water-insoluble fibers is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose. is preferred, 0.4 ⁇ m or more is more preferred, and 0.5 ⁇ m or more is even more preferred.
  • the upper limit of the average fiber diameter of the water-insoluble fibers is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose. The following is more preferable, and 3 ⁇ m or less is particularly preferable. Those having an average fiber diameter of more than 15 ⁇ m are not preferable because of their low refining performance.
  • the lower limit of the average pore size of the water-insoluble fibers is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose. is preferred, 1.0 ⁇ m or more is more preferred, and 1.5 ⁇ m or more is even more preferred.
  • the upper limit of the average pore size of the water-insoluble fibers is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose. is more preferable, and 10 ⁇ m or less is particularly preferable.
  • the water-insoluble fiber is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose. It may be a nonwoven fabric, a woven fabric or a knitted fabric. is preferred.
  • the method for producing the nonwoven fabric is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the intended purpose.
  • a thermal bond method, a chemical bond method, a needle punch method, a spunlace method (water flow entanglement method), a stitch bond method, a steam jet method, and the like can be mentioned.
  • the meltblowing method, the electrospinning method, the flash spinning method, the papermaking method, and the like are preferable because ultrafine fibers can be obtained.
  • the melt blowing method is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose.
  • a thermoplastic resin melted in an extruder is blown out in a fibrous form from a melt blowing die at a high temperature and high speed with an air flow, and fibrous.
  • There is a method of obtaining a non-woven fabric of self-adhesive ultrafine fibers with no binder by causing entanglement and fusion between fibers by accumulating stretched resin on a conveyor.
  • the fiber diameter, basis weight, fiber orientation, and fiber dispersibility of the nonwoven fabric can be adjusted. can be controlled. Furthermore, it is possible to control the thickness and average pore diameter of the nonwoven fabric by heat press processing, tenter processing, or the like.
  • the beads are not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose, but NHS (N-hydroxysuccinimide)-esterified beads are preferred.
  • the beads consist of spherical particles. Suitable particle sizes thereof may range in diameter from 5 to 500 ⁇ m, preferably from 10 to 100 ⁇ m, more preferably from 20 to 80 ⁇ m.
  • the lower limit of the average pore size of the beads is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose. , is more preferably 1.0 ⁇ m or more, and more preferably 1.5 ⁇ m or more.
  • the upper limit of the average pore size of the beads is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose. It is preferably 10 ⁇ m or less, and particularly preferably 10 ⁇ m or less.
  • the material of the beads is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the intended purpose.
  • the other elements are not particularly limited and can be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include spacers.
  • the affinity carrier containing the spacer is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the intended purpose. etc.
  • the functional group possessed by the spacer is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose. Examples thereof include amino group, hydroxy group, epoxy group and carboxy group. Among these, an epoxy group is preferable from the viewpoint of stability, reactivity, and ease of connection with a ligand.
  • the spacer is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose. Examples include those containing polymers, monomers, dimers, trimers, and tetramers. Among these, those containing polymers are preferred. Said polymer may be a copolymer.
  • the polymer is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose.
  • examples thereof include hydrophilic polymers and hydrophobic polymers.
  • those containing a hydrophilic polymer are preferable because they can be handled with an aqueous solvent and suppress non-specific hydrophobic action between the protein and the spacer.
  • the hydrophilic polymer is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose. Examples include those containing polyamines and polysaccharides.
  • the polyamine is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the intended purpose. , piperazine, 2,5-dimethylpiperazine, isophoronediamine, 4,4′-dicyclohexylmethanediamine, 1,4-cyclohexanediamine and other diamines; diethylenetriamine, dipropylenetriamine, triethylenetetramine and other polyamines; hydrazine, N ,N'-dimethylhydrazine, 1,6-hexamethylenebishydrazine; and dihydrazides such as succinic acid dihydrazide, adipic acid dihydrazide, glutaric acid dihydrazide, sebacic acid dihydrazide, and isophthalic acid dihydrazide. These may be used individually by 1 type, and may use 2 or more types together. Among these, those containing polyethylenimine or polyallylamine are preferable because molecules with different molecular weights are readily available.
  • the polysaccharides are not particularly limited and can be appropriately selected depending on the intended purpose. etc. These may be used individually by 1 type, and may use 2 or more types together. Among these, chitosan is preferable because it contains an amino group.
  • the lower limit of the molar mass of the polymer is not particularly limited, and can be appropriately selected according to the purpose. Preferably, 10,000 g/mol or more is more preferable, and 60,000 g/mol or more is particularly preferable.
  • the upper limit of the molar mass of the polymer is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose. 000,000 g/mol or less is more preferable, 500,000 g/mol or less is even more preferable, and 200,000 g/mol or less is particularly preferable.
  • the polymer may be a polymer having a branched chain or a linear polymer, but a polymer having a branched chain is preferable from the standpoint of bioparticle adsorption.
  • the method for producing the affinity carrier includes a step of connecting a water-insoluble base material and a low-molecular-weight antibody, and may further include other steps.
  • the water-insoluble base material and the low-molecular-weight antibody are as described above.
  • connection between the water-insoluble substrate and the low-molecular-weight antibody is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose.
  • Examples include a method of mixing by inversion, a method of adding other components to the water-insoluble base material, mixing by inversion, and further adding a low-molecular-weight antibody and mixing by inversion.
  • the time for the inversion mixing is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose. From the above, 24 hours or less is more preferable, and 8 hours or more and 24 hours or less is particularly preferable.
  • the method for producing the affinity carrier containing the spacer is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose. and the like.
  • the spacer, the water-insoluble base material, and the low-molecular-weight antibody are as described above.
  • the order of connecting the water-insoluble base material to one end of the spacer and connecting the low-molecular-weight antibody to the other end of the spacer does not matter, but the reaction control for connection is easy. After connecting the water-insoluble base material to one end of the spacer, it is preferable to connect the low-molecular-weight antibody to the other end of the spacer.
  • connection of the water-insoluble base material to one end of the spacer is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose. mentioned.
  • the time for the inversion mixing is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose. From the above, 24 hours or less is more preferable, and 8 hours or more and 24 hours or less is particularly preferable.
  • connection of the low-molecular-weight antibody to the other end of the spacer is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose. methods and the like.
  • the time for the inversion mixing is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose. From the above, 24 hours or less is more preferable, and 8 hours or more and 24 hours or less is particularly preferable.
  • the affinity carrier of the present invention can be processed according to purpose, and its shape is not particularly limited.
  • the shape can be selected from flat film, hollow fiber, pleated, roll, spiral, tubular and the like. These processed affinity carriers may be used singly, laminated, or connected in series or in parallel.
  • the shape of the device for filling the affinity carrier is not particularly limited, and a disk shape, cylindrical shape, plate shape, or the like can be selected.
  • a disk shape or a cylindrical shape is preferable from the viewpoint of realizing uniform liquid passage.
  • the method for producing the virus, virus-like particle, virus vector, immunoglobulin, albumin, or derivative thereof comprises the affinity carrier, the virus, virus-like particle, virus vector, immunoglobulin, albumin, or derivative thereof. It includes a contacting step, and may include other steps. Said affinity carrier and said virus, virus-like particle, viral vector, immunoglobulin, albumin, or derivatives thereof are as described above. By the contacting step, the affinity carrier and the virus, virus-like particle, viral vector, immunoglobulin, albumin, or derivatives thereof can be bound or adsorbed.
  • the contact is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose.
  • the affinity carrier is mixed with the virus, virus-like particle, viral vector, immunoglobulin, albumin, or derivatives thereof.
  • method and a method of passing a solution containing the virus, virus-like particle, viral vector, immunoglobulin, albumin, or derivatives thereof through a column packed with the affinity carrier.
  • the material of the column is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose. Examples thereof include glass, resins such as polypropylene and acrylic, and metals such as stainless steel.
  • the other steps are not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose.
  • Examples thereof include a separation step of separating albumin or derivatives thereof from the affinity carrier.
  • the separation step the virus, virus-like particle, virus vector, immunoglobulin, albumin, or derivatives thereof can be separated, dissociated, or eluted from the affinity carrier.
  • the separation is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose.
  • a separation buffer (elution buffer) is added to a column filled with the affinity carrier to which the virus, virus-like particles, viral vector, immunoglobulin, albumin, or derivatives thereof are bound.
  • a method of passing a liquid through the substrate is exemplified.
  • the method for purifying the virus, virus-like particle, viral vector, immunoglobulin, albumin, or derivative thereof includes contacting the affinity carrier with the virus, virus-like particle, viral vector, immunoglobulin, albumin, or derivative thereof. It includes steps, and may further include other steps. Said affinity carrier, said virus, virus-like particle, viral vector, immunoglobulin, albumin or derivatives thereof, said contacting and said other steps are as described above.
  • the plasmid used for transformation of E. coli is the constructed vector.
  • E. coli JM109 competent cells manufactured by Takara Bio Inc.
  • the resulting transformants were cultured and amplified. It was prepared by introducing into E. coli DH5 ⁇ competent cells (manufactured by Takara Bio Inc.) and culturing and amplifying the resulting transformants. Plasmids were prepared from plasmid-carrying strains using QIAprep spin miniprep kit (manufactured by QIAGEN) and the like. Prime STAR Max DNA Polymerase (manufactured by Takara Bio Inc.) or the like was used for PCR, and the reaction conditions were performed according to the method described in the attached manual.
  • ⁇ Comparative Example 1 Preparation of anti-Fc-VHH antibody>
  • the amino acid sequence of the anti-Fc-VHH antibody is set forth in SEQ ID NO: 163 of EP2170960B1. Based on this publicly known information, a synthetic DNA of a gene encoding anti-Fc-VHH with an upstream pelB signal peptide (SEQ ID NO: 16) was prepared and used for vector construction.
  • SOC medium (20 g / L bacto tryptone (manufactured by Becton, Dickinson and Company (BD)), 5 g / L bacto yeast extract (manufactured by BD), 10 mM sodium chloride, 2.5 mM potassium chloride, 10 mM magnesium sulfate, 100 ⁇ L of 10 mM magnesium chloride, 20 mM glucose) was added, and recovery culture was performed at 37° C. for 1 hour.
  • BD Becton, Dickinson and Company
  • LBK selective agar plate (10 g / L polypeptone (manufactured by BD), 5 g / L bacto yeast extract (manufactured by BD), 10 g / L sodium chloride, 50 ⁇ g / L kanamycin, 15 g / L agarose), 37 ° C., A strain that grew in static culture for 16 hours was selected to obtain an anti-Fc-VHH expressing strain.
  • the anti-Fc-VHH antibody-expressing strain was expressed by flask culture, and the collected culture fluid was purified by liquid chromatography to obtain anti-Fc-VHH antibody.
  • the above anti-Fc-VHH antibody-expressing strain was added to a test tube in 2 mL of 2YT medium (1.6% (w/v) polypeptone (manufactured by Nihon Pharmaceutical Co., Ltd.), 1% (w/v) yeast extract (BD), 0.5% (w/v) yeast extract (BD). 5% (w/v) sodium chloride) and precultured at 30° C. for 16 hours at a shaking speed of 110 times per minute.
  • a 500 mL Sakaguchi flask was filled with 50 mL of MagicMedia® E.V.
  • 125 ⁇ L of the preculture solution was inoculated into E. coli Expression Medium (manufactured by Thermo Scientific) and cultured at 30° C. for 24 hours at a shaking speed of 110 times per minute. After culturing, acetic acid was added to a final concentration of 2% (v/v) to extract anti-Fc-VHH antibodies from the cells. Cell debris was removed by centrifugation, and the centrifugal supernatant was filtered through a 0.2 ⁇ m filter (manufactured by Sartorius).
  • the anti-Fc-VHH antibody was purified by chromatography from the filtrate obtained by the filtration.
  • a column of HiTrap (registered trademark) Mabselect (registered trademark) PrismA (manufactured by Cytiva) was used for purification.
  • the following solutions A to F were prepared and filtered through a 0.2 ⁇ m filter before use.
  • a solution 50 mM sodium phosphate pH 7.0
  • B solution 50 mM sodium acetate pH 6.0
  • C solution 1 M acetic acid
  • D solution 50 mM NaOH Solution
  • E 20% (v/v) ethanol Solution
  • F A solution obtained by adjusting the pH of the filtrate of the culture solution obtained above to 7.0 with 1M NaOH HiTrap (registered trademark) Mabselect (registered trademark) PrismA was added to AKTA Avant 25 (manufactured by Cytiva), the flow rate was set to 1 mL/min, washed with pure water, and equilibrated with A solution.
  • liquid F was passed through the column to retain the VHH antibodies
  • liquid A was passed through the column, washed with liquid B
  • anti-Fc-VHH antibodies were eluted with liquid C.
  • the column was washed with liquid D and pure water in that order, and the column was replaced with liquid E and stored in a refrigerator.
  • the eluted anti-Fc-VHH antibody was neutralized with 1 M NaOH and concentrated using a 3 kDa cut ultrafiltration membrane (manufactured by Merck) until the anti-Fc-VHH antibody concentration reached 10 mg/mL.
  • Example 1 Preparation of anti-Fc-VHH antibody variants> Using KOD-Plus-Mutagenesis Kit (manufactured by Toyobo Co., Ltd.), five types of anti-Fc-mutant VHH antibody expression vectors were prepared. Reaction conditions were carried out according to the method described in the attached manual. PCR was performed using the anti-Fc-VHH antibody expression vector as a template. Inverse PCR was performed using the anti-Fc-VHH antibody expression vector described in Comparative Example 1 as a template and the primers shown in Table 1. DpnI was added to the PCR product, and the template vector was digested by standing at 37° C. for 1 hour.
  • each of the 5 anti-Fc-mutant VHH antibody-expressing strains was expressed by flask culture, and the recovered culture was purified by liquid chromatography to obtain anti-Fc-mutant VHH antibodies 1 to 5. obtained respectively.
  • ⁇ Production Example 1 Preparation of anti-Fc-VHH antibody column>
  • the anti-Fc-VHH antibody obtained in Comparative Example 1 was immobilized on a carrier to prepare an anti-Fc-VHH antibody column.
  • a HiTrap (registered trademark) NHS-activated HP (manufactured by Cytiva) column was used for immobilization onto the carrier.
  • the following solutions A to F were prepared and passed through a 0.2 ⁇ m filter before use.
  • the anti-Fc-VHH antibody was diluted with solution A to 1 mg/mL. Liquid B cooled in an ice bath was passed through the column at 6 column volumes at a flow rate of 1 mL/min to remove isopropanol in the column. Immediately thereafter, anti-Fc-VHH antibody solution diluted with A solution was added for 1 column volume and allowed to stand at room temperature for 30 minutes.
  • Liquid C was passed through 6 column volumes, liquid D was passed through 6 column volumes, and liquid C was passed through 6 column volumes, and left to stand at room temperature for 20 minutes.
  • Liquid D was passed through 6 column volumes, liquid C was passed through 6 column volumes, solution D was passed through 6 column volumes, and liquid E was passed through to prepare an anti-Fc-VHH antibody column.
  • ⁇ Production Example 2 Preparation of anti-Fc-mutant VHH antibody column> Each of the five anti-Fc-mutant VHH antibodies obtained in Example 1 was immobilized on a carrier to prepare an anti-Fc-mutant VHH antibody column.
  • the anti-Fc-mutant VHH antibody column was prepared in the same manner as described in Production Example 1.
  • the column immobilized with anti-Fc-mutant VHH antibody 1 is anti-Fc-mutant VHH antibody 1 column
  • the column immobilized with anti-Fc-mutant VHH antibody 2 is anti-Fc-mutant VHH antibody 2 column
  • the column immobilized with 3 is an anti-Fc-mutant VHH antibody 3 column
  • the column immobilized with anti-Fc-mutant VHH antibody 4 is an anti-Fc-mutant VHH antibody 4 column
  • the column immobilized with anti-Fc-mutant VHH antibody 5 was used as an anti-Fc-mutant VHH antibody 5 column.
  • ⁇ Test Example 1 IgG antibody purification by linear gradient of anti-Fc-VHH antibody column> Using the anti-Fc-VHH antibody column prepared in Production Example 1, a commercially available IgG antibody was purified. The pH (elution pH) at the peak top position when the IgG antibody was eluted from the anti-Fc-VHH antibody column was confirmed.
  • Example 2 IgG antibody purification by linear gradient of anti-Fc-mutant VHH antibody column> Purification of commercially available IgG antibodies was carried out using five types of anti-Fc-mutant VHH antibody columns prepared in Production Example 2. The pH at which the IgG antibody was eluted from the anti-Fc-mutant VHH antibody column on which the anti-Fc-mutant VHH antibody after the mutation was immobilized was confirmed. The evaluation method was the same as in Test Example 1. In Test Example 1 and the above results, the pH (elution pH) at the peak top position when the IgG antibody was eluted was confirmed, and the difference in elution pH before and after mutation introduction was calculated. Table 2 shows the results. This result indicates that the column on which the mutated VHH antibody was immobilized could be eluted at a higher elution pH.
  • ⁇ Test Example 3 IgG antibody purification by step elution of anti-Fc-VHH antibody column> Using the anti-Fc-VHH antibody column prepared in Production Example 1, a commercially available IgG antibody was purified. The amount of IgG antibody eluted from the column when the pH 3.75 buffer solution was passed through was calculated.
  • ⁇ Test Example 4 Purification of IgG antibody by step elution of anti-Fc-mutant VHH antibody column> Using the anti-Fc-mutant VHH antibody column prepared in Production Example 2, purification of a commercially available IgG antibody was performed. A pH 3.75 buffer solution was passed through and the amount of eluted IgG antibody was calculated. The evaluation method was the same as in Test Example 3. The ratio of the amount of IgG antibody in the eluted fractions in Test Example 3 and the above was calculated from the absorbance at a wavelength of 280 nm. Table 3 shows the results. This result indicates that the column on which the mutated VHH antibody is immobilized has a high IgG antibody recovery rate.
  • Comparative Example 2 Preparation of anti-HSA-VHH antibody> Comparative Example 2-1: Preparation of anti-HSA-VHH antibody expression vector
  • the AOX1 promoter (SEQ ID NO: 29), AOX1 terminator (SEQ ID NO: 30), and HIS4 gene (SEQ ID NO: 31) used in the construction of the vector were Komagataella pastoris ATCC76273.
  • the chromosomal DNA of the strain (nucleotide sequence is described in EMBL (The European Molecular Biology Laboratory) ACCSESSION No. FR839628 to FR839631) was prepared by PCR using a mixture as a template.
  • the chromosomal DNA mixture was prepared using Gen Torukun (trademark) (manufactured by Takara Bio Inc.) and the like from Komagataella pastoris ATCC76273 strain under the conditions described therein.
  • Gen Torukun trademark
  • the amino acid sequence of the anti-HSA-VHH antibody is set forth in SEQ ID NO: 62 of EP2069402A2 (WO2008/028977).
  • a synthetic DNA of an anti-HSA-VHH gene was prepared with a mating factor ⁇ signal sequence (MF sequence) (SEQ ID NO: 32) added upstream and a His tag sequence (GGGGSHHHHHH) added downstream. , was utilized in the construction of the vector.
  • a gene fragment (SEQ ID NO: 33) having a HindIII-BamHI-BglII-XbaI-EcoRI multiple cloning site was totally synthesized and inserted between the HindIII-EcoRI sites of pUC19 (manufactured by Takara Bio Inc.) to obtain pUC-1. built. Further, a nucleic acid fragment with BamHI recognition sequences added to both sides of the AOX1 promoter was prepared by PCR using the chromosomal DNA mixture as a template and primers 13 (SEQ ID NO: 34) and 14 (SEQ ID NO: 35), and BamHI After treatment, it was inserted into the BamHI site of pUC-1 to construct pUCPaox.
  • nucleic acid fragment with XbaI recognition sequences added to both sides of the AOX1 terminator was prepared by PCR using the chromosomal DNA mixture as a template and primer 15 (SEQ ID NO: 36) and primer 16 (SEQ ID NO: 37), and treated with XbaI. It was later inserted into the XbaI site of pUCPaox to construct pUC-PaoxTaox.
  • a nucleic acid fragment having EcoRI recognition sequences added to both sides of the HIS4 gene was prepared by PCR using the chromosomal DNA mixture as a template and primers 17 (SEQ ID NO: 38) and 18 (SEQ ID NO: 39), and treated with EcoRI.
  • Comparative Example 2-2 Acquisition of Transformed Yeast
  • the anti-HSA-VHH antibody expression vector constructed in Comparative Example 2-1 was used to transform Komagataella pastoris as follows.
  • Komagataella pastoris ATCC76273 strain-derived histidine-requiring strain was inoculated into 3 mL of YPD medium (1% yeast extract bacto (manufactured by Difco), 2% polypeptone (manufactured by Nihon Pharmaceutical Co., Ltd.), 2% glucose) and incubated overnight at 30°C. Shaking culture was performed to obtain a preculture solution.
  • 500 ⁇ L of the resulting preculture solution was inoculated into 50 mL of YPD medium, cultured with shaking until OD600 reached 1 to 1.5, harvested (3000 ⁇ g, 10 minutes, 20 ° C.), and added to 250 ⁇ L of 1M 1, Resuspend in 10 mL of 50 mM potassium phosphate buffer, pH 7.5, containing 4-dithiothreitol (DTT) (25 mM final concentration). After incubating this suspension at 30° C. for 15 minutes, the cells were harvested (3000 ⁇ g, 10 minutes, 20° C.) and added to 50 mL of pre-cooled STM buffer (270 mM sucrose, 10 mM Tris-HCl, 1 mM magnesium chloride, pH 7.0).
  • STM buffer 270 mM sucrose, 10 mM Tris-HCl, 1 mM magnesium chloride, pH 7.0.
  • the washed solution was collected (3000 ⁇ g, 10 minutes, 4° C.), washed again with 25 mL of STM buffer, and collected (3000 ⁇ g, 10 minutes, 4° C.). Finally, it was suspended in 250 ⁇ L of ice-cold STM buffer to obtain a competent cell suspension.
  • E. coli was transformed with the anti-HSA-VHH antibody expression vector (pUC-Paoxanti-HSAVHHTaoxHIS4) constructed in Comparative Example 2-1, and the resulting transformant was added to 2 mL of ampicillin-containing LB medium (1% Tryptone (Difco (manufactured by Difco), 0.5% yeast extract (manufactured by Difco), 1% sodium chloride (manufactured by Difco)).
  • -Paoxanti-HSAVHHTaoxHIS4 was obtained. This plasmid was treated with SalI to prepare a linear vector cleaved at the SalI recognition sequence in the HIS4 gene.
  • Comparative Example 2-3 Preparation of anti-HSA-VHH antibody
  • the anti-HSA-VHH-expressing yeast obtained in Comparative Example 2-2 was added to 3 mL of BMGMY medium (1% yeast extract bacto (manufactured by Difco), 2% polypeptone (Japan). Pharmaceutical Co.), 0.34% yeast nitrogen base without Amino Acid and Ammonium sulfate, 1% ammonium sulfate, 0.4 mg/L biotin, 100 mM potassium phosphate (pH 7.0), 1% glycerol, 1% methanol). After culturing with shaking at 30° C. for 72 hours, the culture supernatant was recovered by centrifugation (12000 rpm, 5 minutes, 4° C.) and filtered through a 0.2 ⁇ m filter (manufactured by Sartorius).
  • the anti-HSA-VHH antibody was purified by chromatography from the filtrate obtained by the filtration.
  • a carrier of Cellufine MAX Sr manufactured by JNC
  • the following solutions A to F were prepared and filtered through a 0.2 ⁇ m filter before use.
  • the column was washed with liquid D and pure water in that order, and the column was replaced with liquid E and stored in a refrigerator.
  • the eluted anti-HSA-VHH antibody was neutralized with 1M NaOH and concentrated using a 3 kDa cut ultrafiltration membrane (manufactured by Merck) until the anti-HSA-VHH antibody concentration reached 1 mg/mL.
  • Example 2 Preparation of anti-HSA-VHH antibody mutant>
  • One type of anti-HSA-mutant VHH antibody expression vector was prepared using KOD-Plus-Mutagenesis Kit (manufactured by Toyobo Co., Ltd.). Reaction conditions were carried out according to the method described in the attached manual.
  • PCR was performed using the anti-HSA-VHH antibody expression vector as a template.
  • Inverse PCR was performed using the anti-HSA-VHH antibody expression vector described in Comparative Example 2-1 as a template and the primers shown in Table 4.
  • DpnI was added to the PCR product, and the template vector was digested by standing at 37° C. for 1 hour. Self-ligation of the DpnI-treated PCR product was performed with T4 Polynucleotide Kinase and Ligation high at 16° C. for 1 hour to prepare one type of anti-HSA-VHH antibody mutant expression vector.
  • a transformed yeast expressing the prepared anti-HSA-mutant VHH antibody mutant was prepared by the same method as in Comparative Example 2-2.
  • Each of the anti-HSA-mutant VHH antibody-expressing strains was expressed by flask culture in the same manner as in Comparative Example 2-3, and the collected culture fluid was purified by liquid chromatography to obtain an anti-HSA-mutant VHH1 antibody.
  • ⁇ Production Example 3 Preparation of anti-HSA-VHH antibody column>
  • the anti-HSA-VHH antibody obtained in Comparative Example 2 was immobilized on a carrier to prepare an anti-HSA-VHH antibody column.
  • a HiTrap (registered trademark) NHS-activated HP (manufactured by Cytiva) column was used for immobilization onto the carrier.
  • the following solutions A to F were prepared and passed through a 0.2 ⁇ m filter before use.
  • the anti-HSA-VHH antibody was diluted with solution A to 1 mg/mL. Liquid B cooled in an ice bath was passed through the column at 6 column volumes at a flow rate of 1 mL/min to remove isopropanol in the column. Immediately thereafter, an anti-HSA-VHH antibody solution diluted with A solution was added for 1 column volume and allowed to stand at room temperature for 30 minutes.
  • Liquid C was passed through 6 column volumes, liquid D was passed through 6 column volumes, and liquid C was passed through 6 column volumes, and left to stand at room temperature for 20 minutes.
  • Liquid D was passed through 6 column volumes, liquid C was passed through 6 column volumes, solution D was passed through 6 column volumes, and liquid E was passed through to prepare an anti-HSA-VHH antibody column.
  • ⁇ Production Example 4 Preparation of anti-HSA-mutant VHH antibody column>
  • the anti-HSA-mutant VHH antibody obtained in Example 2 was immobilized on a carrier to prepare an anti-HSA-mutant VHH antibody column.
  • An anti-HSA-mutant VHH antibody column was prepared in the same manner as described in Production Example 3.
  • the column on which the anti-HSA-mutant VHH antibody 1 was immobilized was designated as the anti-HSA-mutant VHH antibody 1 column.
  • ⁇ Test Example 5 IgG antibody purification by linear gradient of anti-HSA-VHH antibody column> Using the anti-HSA-VHH antibody column prepared in Production Example 3, commercially available HSA was purified. The pH at the top of the peak when HSA was eluted from the anti-HSA-VHH antibody column (elution pH) was confirmed.
  • ⁇ Test Example 6 IgG antibody purification by linear gradient of anti-HSA-mutant VHH antibody column> Using the anti-HSA-mutant VHH antibody column prepared in Production Example 4, commercially available HSA was purified. The pH at which HSA was eluted from the anti-HSA-mutant VHH antibody column on which the anti-HSA-mutant VHH antibody after mutation was immobilized was confirmed. The evaluation method was the same as in Test Example 5. In Test Example 5 and the above results, the pH (elution pH) at the peak top position when HSA was eluted was confirmed, and the difference in elution pH before and after mutation introduction was calculated. Table 5 shows the results. This result indicates that the column on which the mutated VHH antibody was immobilized could be eluted at a higher elution pH.
  • Embodiments of the present invention include, for example, the following. ⁇ 1> Framework Region 1, Variable Heavy Chain Complementarity Determining Region 1, Framework Region 2, Variable Heavy Chain Complementarity Determining Region 2, Framework Region 3, Variable Heavy Chain Complementarity Determining Region 3, and Framework Region 4 wherein at least one polar amino acid in the amino acid sequence of the framework region 3 is substituted with another amino acid, and in a neutral pH region A low-molecular-weight antibody that binds to an antigen and has reduced antigen-binding ability in a weakly acidic pH range compared to the low-molecular-weight antibody before substitution.
  • Framework Region 1 Variable Heavy Chain Complementarity Determining Region 1
  • Framework Region 2 Variable Heavy Chain Complementarity Determining Region 2
  • Framework Region 3 Variable Heavy Chain Complementarity Determining Region 3
  • the amino acid sequence of the framework region 3 is the amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 1 to 3, wherein at least one polar amino acid is other is a low-molecular-weight antibody characterized by having a sequence substituted with an amino acid of ⁇ 3>
  • VHH camelid-derived heavy chain antibody variable region
  • ⁇ 4> The low-molecular-weight antibody according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 3>, wherein the antigen is a virus, virus-like particle, viral vector, immunoglobulin, albumin, or derivative thereof.
  • ⁇ 5> The low-molecular-weight antibody according to ⁇ 4>, wherein the albumin is human serum albumin.
  • ⁇ 6> In the amino acid sequence of the framework region 3, at least one polar amino acid at positions 15 to 23 in the amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 1 to 3 is replaced with another amino acid.
  • the low-molecular-weight antibody according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 5> which is a sequence.
  • the amino acid sequence of the framework region 3 is at positions 15, 16, 17, 20, and 21 in the amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 1 to 3.
  • a nucleic acid comprising a base sequence encoding the minibody according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 7>.
  • ⁇ 9> A vector comprising the nucleic acid according to ⁇ 8>.
  • a cell comprising the nucleic acid according to ⁇ 8>.
  • a method for producing a low-molecular-weight antibody according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 7> comprising the step of culturing the cell according to ⁇ 10>.
  • An affinity carrier comprising a water-insoluble substrate and the low-molecular-weight antibody according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 7> immobilized on the water-insoluble substrate.
  • a virus, virus-like virus characterized by comprising a contacting step of contacting the affinity carrier according to ⁇ 12> with a virus, virus-like particle, virus vector, immunoglobulin, albumin, or derivative thereof.
  • the virus, virus-like particle according to ⁇ 13> above comprising a separation step of separating the virus, virus-like particle, virus vector, immunoglobulin, albumin, or derivative thereof bound to the affinity carrier from the affinity carrier, A method for producing a viral vector, an immunoglobulin, an albumin, or a derivative thereof.
  • a virus or virus-like particle comprising a contacting step of contacting the affinity carrier according to ⁇ 12> with the virus, virus-like particle, virus vector, immunoglobulin, albumin, or derivative thereof. , methods for purifying viral vectors, immunoglobulins, albumin, or derivatives thereof.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

フレームワーク領域１、可変重鎖相補性決定領域１、フレームワーク領域２、可変重鎖相補性決定領域２、フレームワーク領域３、可変重鎖相補性決定領域３、及びフレームワーク領域４の順で連結された構造を有する低分子化抗体であって、前記フレームワーク領域３のアミノ酸配列のうち、少なくとも１つの極性アミノ酸がその他のアミノ酸に置換された配列であり、中性ｐＨ領域で抗原と結合し、置換前の低分子化抗体と比較して、弱酸性ｐＨ領域での抗原結合能が低下していることを特徴とする低分子化抗体である。

Description

低分子化抗体
　本発明は、低分子化抗体に関する。
　ウイルス、ウイルス様粒子、ウイルスベクター、免疫グロブリン、及びアルブミンなどは遺伝子治療、分子標的治療などの医療分野で重要な分子である。その利用にあたり、ウイルス、ウイルス様粒子、ウイルスベクター、免疫グロブリン、及びアルブミンなどを細胞培養液、血漿、血清などの生体試料から効率的に回収する精製手法が求められている。
　一般的に、ウイルス、ウイルス様粒子、ウイルスベクター、免疫グロブリン、及びアルブミンなどの精製において、ウイルス、又は免疫グロブリンなどを生産させた形質転換細胞の培養液、血漿又は血清などから、まず細胞や細胞片などの固形物をろ過により取り除き、次に超遠心法やクロマトグラフィーなどにより精製する手法が知られている（特許文献１）。
　アフィニティークロマトグラフィーは、対象分子と特異的に結合する低分子化抗体などのリガンドをビーズなどの水不溶性基材に固定化した担体を用いて、対象分子とそれ以外の不純物とを分離する手法である。
　しかしながら、従来のアフィニティークロマトグラフィーでは、対象分子の溶出にｐＨが約２～３の低ｐＨ溶液を使用する必要があるが、低ｐＨ溶液中では、対象分子の機能が低下、又は対象分子の凝集体が増えることが知られており（非特許文献１）、分子の機能を保持、又は凝集体の形成を抑制して対象分子を効率的に精製する上で課題があった。
　したがって、従来よりも高いｐＨ溶液において対象分子と解離する低分子化抗体及びそれを用いた効率的な対象分子の製造方法は全く知られておらず、これらの提供が強く求められている。
国際公開第２０１２／１０５８３３号パンフレット
Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　２０１９　１０：２４１５
　本発明は、従来における前記諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、従来よりも高いｐＨ溶液において対象分子と解離する低分子化抗体、及びそれを用いた効率的な対象分子の製造方法を提供する。
　本発明者らが、前記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、フレームワーク領域１、可変重鎖相補性決定領域１、フレームワーク領域２、可変重鎖相補性決定領域２、フレームワーク領域３、可変重鎖相補性決定領域３、及びフレームワーク領域４の順で連結された構造を有する低分子化抗体であって、前記フレームワーク領域３のアミノ酸配列のうち、少なくとも１つの極性アミノ酸がその他のアミノ酸に置換された配列であり、中性ｐＨ領域で抗原と結合し、置換前の低分子化抗体と比較して、弱酸性ｐＨ領域での抗原結合能が低下していることを特徴とする低分子化抗体、又は、フレームワーク領域１、可変重鎖相補性決定領域１、フレームワーク領域２、可変重鎖相補性決定領域２、フレームワーク領域３、可変重鎖相補性決定領域３、及びフレームワーク領域４の順で連結された構造を有する低分子化抗体であって、前記フレームワーク領域３のアミノ酸配列が、配列番号１～３のいずれかに記載のアミノ酸配列のうち、少なくとも１つの極性アミノ酸がその他のアミノ酸に置換された配列であることを特徴とする低分子化抗体により、従来よりも高いｐＨ溶液において対象分子と解離する低分子化抗体、及びそれを用いた効率的な対象分子の製造方法が提供できることを知見した。
　本発明は、本発明者らによる前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては以下の通りである。即ち、
　＜１＞　フレームワーク領域１、可変重鎖相補性決定領域１、フレームワーク領域２、可変重鎖相補性決定領域２、フレームワーク領域３、可変重鎖相補性決定領域３、及びフレームワーク領域４の順で連結された構造を有する低分子化抗体であって、前記フレームワーク領域３のアミノ酸配列のうち、少なくとも１つの極性アミノ酸がその他のアミノ酸に置換された配列であり、中性ｐＨ領域で抗原と結合し、置換前の低分子化抗体と比較して、弱酸性ｐＨ領域での抗原結合能が低下していることを特徴とする低分子化抗体である。
　＜２＞　フレームワーク領域１、可変重鎖相補性決定領域１、フレームワーク領域２、可変重鎖相補性決定領域２、フレームワーク領域３、可変重鎖相補性決定領域３、及びフレームワーク領域４の順で連結された構造を有する低分子化抗体であって、前記フレームワーク領域３のアミノ酸配列が、配列番号１～３のいずれかに記載のアミノ酸配列のうち、少なくとも１つの極性アミノ酸がその他のアミノ酸に置換された配列であることを特徴とする低分子化抗体である。
　本発明によると、従来における前記諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、従来よりも高いｐＨ溶液において対象分子と解離する低分子化抗体、及びそれを用いた効率的な対象分子の製造方法を提供することができる。
　（低分子化抗体）
　前記低分子化抗体は、
　（１）フレームワーク領域１、可変重鎖相補性決定領域１、フレームワーク領域２、可変重鎖相補性決定領域２、フレームワーク領域３、可変重鎖相補性決定領域３、及びフレームワーク領域４の順で連結された構造を有する低分子化抗体であって、前記フレームワーク領域３のアミノ酸配列のうち、少なくとも１つの極性アミノ酸がその他のアミノ酸に置換された配列であり、中性ｐＨ領域で抗原と結合し、置換前の低分子化抗体と比較して、弱酸性ｐＨ領域での抗原結合能が低下している、又は、
　（２）フレームワーク領域１、可変重鎖相補性決定領域１、フレームワーク領域２、可変重鎖相補性決定領域２、フレームワーク領域３、可変重鎖相補性決定領域３、及びフレームワーク領域４の順で連結された構造を有する低分子化抗体であって、前記フレームワーク領域３のアミノ酸配列が、配列番号１～３のいずれかに記載のアミノ酸配列のうち、少なくとも１つの極性アミノ酸がその他のアミノ酸に置換された配列である。
　前記（１）又は（２）を満たすことにより、前記低分子化抗体は、従来よりも高いｐＨ溶液において対象分子と解離する。
　前記フレームワーク領域、及び可変重鎖相補性決定領域は、立体構造をベースに定義する場合と、ＩｇＧ抗体の重鎖のアノテーションを基にＢＬＡＳＴによるアライメントから定義する場合があるが（ＡＣＳ　Ｓｙｎｔｈ．　Ｂｉｏｌ．　２０１８　７：　２４８０－２４８４）、本願では、後者の、ＩｇＧ抗体の重鎖のアノテーションを基にＢＬＡＳＴによるアライメントから定義する（Ｍｅｄ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　２００９　１９８：１５７－１７４）。
　「抗体」は免疫グロブリンの機能に着目した、一般的な名称である。免疫グロブリンは、リンパ球のＢ細胞が産生する糖タンパク質であり、特定のタンパク質などの分子を認識して結合する働きを有する。免疫グロブリンは、この特定の分子（抗原）に特異的に結合する機能と、他の生体分子や細胞と協同して抗原を有する因子を無毒化・除去する機能を有する。
　全ての免疫グロブリンは、基本的には同じ分子構造からなり、“Ｙ”字型の４本鎖構造（軽鎖・重鎖の２本のポリペプチド鎖が２本ずつ）を基本構造としている。軽鎖（Ｌ鎖）には、λ鎖とκ鎖の２種類があり、すべての免疫グロブリンはこのどちらかを有する。重鎖（Ｈ鎖）には、γ鎖、μ鎖、α鎖、δ鎖、ε鎖という構造の異なる５種類があり、この重鎖の違いによって免疫グロブリンの種類（アイソタイプ）が変わる。免疫グロブリンＧ（以下、「ＩｇＧ」と略記する場合がある）は、単量体型の免疫グロブリンで、２本の重鎖（γ鎖）と２本の軽鎖から構成され、２箇所の抗原結合部位を有している。
　抗体の“Ｙ”字の下半分の縦棒部分にあたる場所をＦｃ領域と呼び、上半分の“Ｖ”字の部分をＦａｂ領域と呼び、前記Ｆａｂ領域において、完全な抗原結合性部位を含み、前記Ｆａｂ領域と同一の結合特性を有する部分をＦｖ領域と呼ぶ。Ｆｃ領域は抗体が抗原に結合した後の反応を惹起するエフェクター機能を有し、Ｆａｂ領域は抗原と結合する機能を有する。重鎖のＦａｂ領域とＦｃ領域はヒンジ部でつながっており、パパイヤに含まれるタンパク質分解酵素パパインは、このヒンジ部を分解して２つのＦａｂ領域（断片）と１つのＦｃ領域に切断する。Ｆａｂ領域のうち“Ｙ”字の先端に近い部分（ドメイン）は、多様な抗原に結合できるように、アミノ酸配列に多彩な変化が見られるため、可変領域（Ｖ領域）と呼ばれている。軽鎖の可変領域をＶＬ領域、重鎖の可変領域をＶＨ領域と呼ぶ。Ｖ領域以外のＦａｂ領域とＦｃ領域は、比較的変化の少ない領域であり、定常領域（Ｃ領域）と呼ばれる。軽鎖の定常領域をＣＬ領域と呼び、重鎖の定常領域をＣＨ領域と呼ぶが、ＣＨ領域はさらにＣＨ１～ＣＨ３の３つに分けられる。重鎖のＦａｂ領域はＶＨ領域とＣＨ１からなり、重鎖のＦｃ領域はＣＨ２とＣＨ３からなる。ヒンジ部はＣＨ１とＣＨ２の間に位置する。
　ラクダ科動物由来抗体やサメなどの魚類由来抗体の中には、軽鎖が存在しない重鎖のみで構成される抗体である、重鎖抗体が存在する。ラクダ科動物由来重鎖抗体は、軽鎖を有する通常のＩｇＧ抗体（ＩｇＧ１）と区別され、ＩｇＧ２，ＩｇＧ３と呼ばれる。重鎖２量体免疫グロブリンの重鎖可変ドメインはＶＨＨ（Ｖａｒｉａｂｌｅ　ｄｏｍａｉｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｈｅａｖｙ－ｃｈａｉｎ　ｏｆ　ｈｅａｖｙ－ｃｈａｉｎ　ａｎｔｉｂｏｄｙ（重鎖抗体の重鎖可変ドメイン））と呼ばれている。ＶＨＨは、それ単独で抗原への特異的結合能を有する単一ドメイン抗体としても用いられる。ＶＨＨからなる単一ドメイン重鎖抗体は、化学的な安定性が高く、製造が容易であることから、医薬等への応用に適している。一方、魚類由来の重鎖抗体は、ＩｇＮＡＲ（ｎｅｗ　ａｎｔｉｇｅｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ）と呼ばれる。
　本発明における低分子化抗体とは、前記重鎖可変ドメインを含むものであればよく、前記重鎖可変ドメインからなるシングルドメイン抗体（ＶＨＨ抗体）あってもよいし、前記重鎖可変ドメインと重鎖定常ドメイン又はその断片とを含む重鎖抗体であってもよく、抗原への結合能を有していれば特に限定されない。
　本発明における低分子化抗体は、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを有さないことが好ましい。
　本発明における低分子化抗体におけるＶＨＨのアミノ酸配列は、Ｎ末端側及びＣ末端側の一方又は両方に、更に他のポリペプチドが連結された融合ポリペプチドの形態であってもよい。他のポリペプチドとしては、シグナルペプチド、タグペプチド等が例示できるがこれらに限定されない。シグナルペプチドとしては、ｐｅｌＢシグナルペプチド、耐熱性エンテロトキシンＩＩ（ＳＴＩＩ）シグナルペプチド、外膜タンパク質Ａ（ＯｍｐＡ）シグナルペプチドが例示できる。タグペプチドとしては複数（例えば６～１０個）のヒスチジン残基からなるタグペプチド（ポリヒスチジンタグ）や、ＦＬＡＧタグペプチドが例示できる。
　本発明における低分子化抗体は、ラクダ科動物由来の重鎖抗体の可変領域（ＶＨＨ）であることが好ましい。
　前記ラクダ科動物由来の重鎖抗体の可変領域（ＶＨＨ）としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記吸着対象を免疫したラクダ科動物の血清から精製したもの、宿主細胞にＶＨＨ遺伝子を発現させて作製したもの、アミノ酸配列に基づいて化学合成したものなどが挙げられる。
　前記ラクダ科動物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、フタコブラクダ、ヒトコブラクダ、ラマ、アルパカ、ビクーニャ、グアナコなどが挙げられる。
　ＶＨＨ遺伝子を発現させる前記宿主細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、大腸菌などの細菌、酵母などの真菌、動物細胞、植物細胞などが挙げられる。
　前記酵母としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ピキア酵母などが挙げられる。
　前記ラクダ科動物に前記吸着対象を免疫する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、国際公開第２０２０／０６７４１８号パンフレットに記載の方法などが挙げられる。
　宿主細胞にＶＨＨ遺伝子を発現させて作製する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、国際公開第２０２０／０６７４１８号パンフレット、及び特開２０１５－１１９６３７号公報に記載の方法などが挙げられる。
　本発明における低分子化抗体は、シングルドメイン抗体を含むことが好ましい。
　前記シングルドメイン抗体としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記ラクダ科動物由来の重鎖抗体の可変領域（ＶＨＨ）を含むものが好ましい。
　本発明における低分子化抗体は、キメラ化やヒト化されていてもよい。
　前記低分子化抗体の分子量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１３０，０００以下が好ましく、１００，０００以下がより好ましく、５０，０００以下がさらに好ましく、３０，０００以下が特に好ましく、２０，０００以下が最も好ましい。
　前記可変重鎖相補性決定領域１のアミノ酸配列としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、配列番号４～６のいずれかに記載のアミノ酸配列、配列番号４～６のいずれかに記載のアミノ酸配列と配列同一性の高いアミノ酸配列などが挙げられる。
　前記配列番号４～６のいずれかに記載のアミノ酸配列と配列同一性の高いアミノ酸配列としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、配列番号４～６のいずれかに記載のアミノ酸配列との配列同一性が、５０％以上が好ましく、６０％以上がより好ましく、７０％以上がさらに好ましく、８０％以上が特に好ましく、９０％以上が最も好ましい。
　前記可変重鎖相補性決定領域２のアミノ酸配列としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、配列番号７～９のいずれかに記載のアミノ酸配列、配列番号７～９のいずれかに記載のアミノ酸配列と配列同一性の高いアミノ酸配列などが挙げられる。
　前記配列番号７～９のいずれかに記載のアミノ酸配列と配列同一性の高いアミノ酸配列としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、配列番号７～９のいずれかに記載のアミノ酸配列との配列同一性が、５０％以上が好ましく、６０％以上がより好ましく、７０％以上がさらに好ましく、８０％以上が特に好ましく、９０％以上が最も好ましい。
　前記可変重鎖相補性決定領域３のアミノ酸配列としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、配列番号１０～１２のいずれかに記載のアミノ酸配列、配列番号１０～１２のいずれかに記載のアミノ酸配列と配列同一性の高いアミノ酸配列などが挙げられる。
　前記配列番号１０～１２のいずれかに記載のアミノ酸配列と配列同一性の高いアミノ酸配列としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、配列番号１０～１２のいずれかに記載のアミノ酸配列との配列同一性が、５０％以上が好ましく、６０％以上がより好ましく、７０％以上がさらに好ましく、８０％以上が特に好ましく、９０％以上が最も好ましい。
　前記フレームワーク領域３のアミノ酸配列としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、配列番号１～３のいずれかに記載のアミノ酸配列との配列同一性が、７０％以上が好ましく、８０％以上がより好ましく、８５％以上がさらに好ましく、９０％以上が特に好ましく、９５％以上が最も好ましい。
　前記フレームワーク領域３のアミノ酸配列は、配列番号１～３のいずれかに記載のアミノ酸配列のうち、少なくとも１つの極性アミノ酸がその他のアミノ酸に置換された配列であることが好ましく、配列番号１～３のいずれかに記載のアミノ酸配列のうち、第１５位～第２３位の少なくとも１つの極性アミノ酸がその他のアミノ酸に置換された配列がより好ましく、第１５位、第１６位、第１７位、第２０位、及び第２１位のうち、少なくとも１つの極性アミノ酸がその他のアミノ酸に置換された配列がさらに好ましく、第１５位、第１６位、及び第２１位のうち、少なくとも１つの極性アミノ酸がその他のアミノ酸に置換された配列がよりさらに好ましく、第１６位、又は第２１位の極性アミノ酸がその他のアミノ酸に置換された配列が特に好ましく、第２１位の極性アミノ酸がその他のアミノ酸に置換された配列が最も好ましい。
　前記極性アミノ酸とは、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、アルギニン、ヒスチジン、リシンである。
　前記その他のアミノ酸としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、置換前のアミノ酸（変異導入前のアミノ酸）、プロリン、及びシステインを除くアミノ酸が好ましく、置換前のアミノ酸（変異導入前のアミノ酸）、プロリン、グリシン、及びシステインを除くアミノ酸がより好ましく、置換前のアミノ酸（変異導入前のアミノ酸）プロリン、セリン、グリシン、スレオニン、アスパラギン酸、メチオニン、及びシステインを除くアミノ酸がさらに好ましく、アラニンが特に好ましい。
　置換前の前記低分子化抗体のアミノ酸配列としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、配列番号１３～１５のいずれかに記載のアミノ酸配列、配列番号１３～１５のいずれかに記載のアミノ酸配列と配列同一性の高いアミノ酸配列などが挙げられる。
　前記配列番号１３～１５のいずれかに記載のアミノ酸配列と配列同一性の高いアミノ酸配列としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、配列番号１３～１５のいずれかに記載のアミノ酸配列との配列同一性が、７０％以上が好ましく、８０％以上がより好ましく、９０％以上がさらに好ましく、９５％以上が特に好ましく、９９％以上が最も好ましい。
　－抗原－
　前記抗原は、前記低分子化抗体の吸着対象である。
　前記抗原としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ウイルス、ウイルス様粒子、ウイルスベクター、核酸、免疫グロブリン、酵素、ホルモン、アルブミン、及びそれらの複合体、代謝産物、誘導体などが挙げられる。
　これらの中でも、ウイルス、ウイルス様粒子、ウイルスベクター、免疫グロブリン、アルブミン、又はそれらの誘導体が好ましく、免疫グロブリン、又はアルブミンがさらに好ましく、免疫グロブリンが特に好ましい。
　前記誘導体としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、母体の一部を変化又は置換して得られるもの、母体に対する付加反応で得られるもの、母体に対する酸化反応で得られるもの、母体に対する還元反応で得られるものなどが挙げられる。
　前記免疫グロブリンの誘導体としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト免疫グロブリンの一部のドメインを他生物種の免疫グロブリンのドメインに置き換えて融合させたキメラ型免疫グロブリンや、ヒト免疫グロブリンの相補性決定領域部分を他生物種抗体の相補性決定領域部分に置き換えて融合させたヒト型化免疫グロブリン、Ｆｃ領域の糖鎖に分子改変を加えた免疫グロブリン、ヒト免疫グロブリンのＦｖ領域とＦｃ領域とを融合させた人工免疫グロブリンなどが挙げられる。
　前記ウイルス様粒子は、主にカプシドを構成するウイルス外殻タンパク質の全部又は一部であり、核酸を含まないため感染の懸念が無い一方で、免疫反応を惹起するため、ワクチンの有効成分として用いることができる。
　前記ウイルス、ウイルス様粒子、ウイルスベクターとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、エンテロウイルス、パルボウイルス、パポバウイルス、ヒトパピローマウイルス、ロタウイルス、コクサッキーウイルス、サポウイルス、ノロウイルス、ポリオウイルス、エコーウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、ライノウイルス、アストロウイルス、サーコウイルス、シミアンウイルス等のノンエンベロープウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、センダイウイルス、単純ヘルペスウイルス等のヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、麻疹ウイルス、バキュロウイルス、インフルエンザウイルス、白血病ウイルス、シンドビスウイル等のエンベロープウイルス、及びこれらのウイルスのカプシド、又はこれらの遺伝子を含むウイルスベクターなどが挙げられる。
　前記免疫グロブリンとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、前記抗原が、可変領域（Ｖ領域）であっても、定常領域（Ｃ領域）であってもよいが、定常領域（Ｃ領域）であることが好ましく、Ｆｃ領域であることがより好ましい。
　前記免疫グロブリンのアイソタイプとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥなどが挙げられる。
　これらの中でも、ＩｇＧが好ましい。
　前記アルブミンとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、血清アルブミン、卵アルブミン、乳アルブミンなどが挙げられる。
　これらの中でも、血清アルブミンが好ましく、ヒト血清アルブミンがより好ましい。
　前記低分子化抗体は、中性ｐＨ領域で抗原に結合し、置換前の低分子化抗体と比較して、弱酸性ｐＨ領域での抗原結合能が低下している。
　前記中性ｐＨ領域とは、ｐＨ６．０以上８．０未満であり、前記弱酸性ｐＨ領域とは、ｐＨ３．５以上６．０未満である。
　（核酸）
　前記核酸は、前記低分子化抗体をコードする塩基配列を含、さらにその他の要素を含むことができる。
　前記低分子化抗体は、前述のとおりである。
　（ベクター）
　前記ベクターは、前記核酸を含、さらにその他の要素を含むことができる。
　前記核酸は、前述のとおりである。
　（細胞）
　前記細胞は、前記核酸を含、さらにその他の要素を含むことができる。
　前記核酸は、前述のとおりである。
　前記細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、大腸菌などの細菌、酵母などの真菌、動物細胞、植物細胞などが挙げられる。
　前記細胞は、前記宿主細胞であってもよい。
　（低分子化抗体の製造方法）
　前記低分子化抗体の製造方法は、前記細胞を培養する工程を含み、さらにその他の工程を含むことができる。
　前記細胞は、前述のとおりである。
　前記培養としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、前記細胞が増殖可能な培養培地に播種し、静置、撹拌又は振盪する方法などが挙げられる。
　（アフィニティ担体）
　前記アフィニティ担体は、水不溶性基材と、前記水不溶性基材に固定化された、前記低分子化抗体と、を有し、さらにその他の要素を有することができる。
　すなわち、前記アフィニティ担体は、前記水不溶性基材と前記低分子化抗体とが直接接続していてもよいし、前記水不溶性基材と前記低分子化抗体とがその他の要素を介して接続していてもよい。
　前記低分子化抗体は、前述のとおりである。
　前記アフィニティ担体における、前記低分子化抗体の密度（リガンド密度）としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、０．２～２０ｍｇ／ｍＬが好ましく、０．２～１０ｍｇ／ｍＬがより好ましく、０．５～５ｍｇ／ｍＬがさらに好ましい。
　前記リガンド密度は、以下のとおり測定する。
　水不溶性基材へのリガンド固定化の際のろ液を回収し、吸光度を測定することにより水不溶性基材に固定化されたリガンドのリガンド密度を算出する。
－水不溶性基材－
　前記水不溶性基材としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、水不溶性繊維、ビーズ、メンブレン、モノリス、キャピラリーなどが挙げられる。
　これらの中でも、水不溶性繊維、又はビーズが好ましい。
－水不溶性繊維－
　前記水不溶性繊維の厚みの下限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、製造の安定性の点から、０．０８ｍｍ以上が好ましく、０．１０ｍｍ以上がより好ましく、０．１２ｍｍ以上がさらに好ましい。
　前記水不溶性繊維の厚みの上限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、目付の均一性の点から、０．５０ｍｍ以下が好ましく、０．４０ｍｍ以下がより好ましく、０．３０ｍｍ以下がさらに好ましい。
　前記水不溶性繊維の目付の下限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、製造の安定性の点から、５ｇ／ｍ２以上が好ましく、１０ｇ／ｍ２以上がより好ましい。
　前記水不溶性繊維の目付の上限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、水不溶性繊維の均一性の点から、１００ｇ／ｍ２以下が好ましく、９０ｇ／ｍ２以下がより好ましく、８０ｇ／ｍ２以下がさらに好ましく、７０ｇ／ｍ２以下が特に好ましい。
　前記水不溶性繊維の嵩密度の下限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、デバイスへの装入後の水不溶性繊維構造の変化が少ない点から、５０ｋｇ／ｍ３以上が好ましく、６０ｋｇ／ｍ３以上がより好ましく、７０ｋｇ／ｍ３以上がさらに好ましい。
　前記水不溶性繊維の嵩密度の上限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、通液性能の点から、４００ｋｇ／ｍ３以下が好ましく、３５０ｋｇ／ｍ３以下がより好ましく、３００ｋｇ／ｍ３以下がさらに好ましい。
　なお、前記嵩密度とは、前記水不溶性繊維１ｍ３当たりの重さを測定した値をいう。
　前記水不溶性繊維の形状としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、円形、四角形、三角形、俵型、などが挙げられる。
　前記水不溶性繊維の表面は、グラフト重合、ポリマーコーティング、アルカリ、酸等の薬品処理、プラズマ処理などで改質されていてもよい。
　前記グラフト重合としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、水不溶性繊維にラジカル重合性化合物を付与するために、電子線照射を行うグラフト重合法などが挙げられる。
　前記ラジカル重合性化合物は、電子線照射により水不溶性繊維に生成したポリマーラジカルと結合を生じる化合物である。具体的には、アクリル酸、メタクリル酸、イタコン酸、メタクリルスルホン酸、スチレンスルホン酸などの酸性基を有する不飽和化合物やこれらのエステル、アクリルアミド、メタクリルアミドなどの不飽和カルボン酸アミド、末端にグリシジル基、水酸基、アミノ基、やホルミル基を有する不飽和化合物、ビニルホスホネート等の不飽和有機燐酸エステル、第４アンモニウム塩、第３アンモニウム塩などの塩基性を有するメタクリル酸エステル、フルオロアクリレート、アクリロニトリルなどを挙げることができるが、これらに限られるものではない。これらは単独又は２種以上混合して用いることができる。２種類以上のラジカル重合性化合物を用いることで、グラフト鎖が少なくとも２種類以上のラジカル重合性化合物の共重合体からなる複合グラフト化繊維が得られる。
　これらラジカル重合性化合物の中でも、本発明においては、グラフト率の観点からアクリル系モノマーを用いることが好ましい。更に、アミノ基、水酸基、チオール基などを有するリガンドとの反応性の観点から、分子末端にカルボキシ基やエポキシ基を有するアクリル系モノマーが好ましく、より好ましくは、アクリル酸、メタクリル酸、及びメタクリル酸グリシジル（以下「ＧＭＡ」と略記する）からなる群から選ばれる少なくとも１種である。
　上記のラジカル重合性化合物は、水、低級アルコールのような有機溶剤又はこれらの混合溶液を溶媒とした希釈溶液であってもよい。この希釈溶液のラジカル重合性化合物の濃度は希望するグラフト率により変化するが、１～７０容量％で調製することができる。また、ホモポリマーの生成しやすいラジカル重合性化合物を用いる場合は、ラジカル重合性化合物の希釈溶液に、銅や鉄の金属塩を添加することで、ホモポリマーの生成を抑制してもよい。
　前記溶液中の前記ラジカル重合性化合物の濃度の下限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１重量％以上が好ましく、２．５重量％以上がより好ましく、５重量％以上がさらに好ましく、１０重量％以上が特に好ましい。
　前記溶液中の前記ラジカル重合性化合物の濃度の上限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、７０重量％以下が好ましく、６０重量％以下がより好ましく、５０重量％以下がさらに好ましく、４０重量％以下が特に好ましい。
　前記グラフト重合反応のグラフト率としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、５０％以上が好ましい。
　本発明で前記「グラフト率」とは、グラフト反応前の水不溶性繊維乾燥重量（Ｗ１）とグラフト反応後のグラフト化繊維乾燥重量（Ｗ２）から以下のように算出した値である。
　グラフト率＝〔（Ｗ２－Ｗ１）／Ｗ１〕×１００（％）
　前記水不溶性繊維の材料としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ポリオレフィン系、ポリプロピレン、無水マレイン酸ポリプロピレン、変性ポリプロピレン、ポリエチレン、セルロース、再生セルロース、セルロースアセテート、セルロースジアセテート、セルローストリアセテート、エチルセルロース、酢酸セルロース、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリブチレンテレフタレート（ＰＢＴ）、アクリル樹脂、ポリカーボネート、ポリエステル系、ポリアクリロニトリル、ポリアミド、ポリスチレン、臭素化ポリスチレン、ポリアルキル（メタ）アクリレート、ポリ塩化ビニル、ポリクロロプレン、ポリウレタン、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセテート、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリブタジエン、ブタジエン－アクリロニトリル共重合体、スチレン－ブタジエン共重合体、エチレン－ビニルアルコール共重合体、アラミド、ガラス、ナイロン、レーヨンなどが挙げられる。これらは、１種を単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、電子線グラフト重合の反応性が良好な点から、ポリオレフィン系、又はセルロース系が好ましく、ポリオレフィン系がより好ましく、ポリプロピレンがさらに好ましい。
　前記水不溶性繊維の平均繊維直径の下限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、良好な引張強度を有する点、もしくは生産性の点から、０．３μｍ以上が好ましく、０．４μｍ以上がより好ましく、０．５μｍ以上がさらに好ましい。
　前記水不溶性繊維の平均繊維直径の上限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、精製性能が高い点から、１５μｍ以下が好ましく、１０μｍ以下がより好ましく、５μｍ以下がさらに好ましく、３μｍ以下が特に好ましい。平均繊維直径が１５μｍを超えるものは、精製性能が低いため好ましくない。
　前記水不溶性繊維の平均孔径の下限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、良好な通液性能を有する点、もしくは生産性の点から、０．１μｍ以上が好ましく、１．０μｍ以上がより好ましく、１．５μｍ以上がさらに好ましい。
　前記水不溶性繊維の平均孔径の上限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、精製性能が高い点から、５０μｍ以下が好ましく、３０μｍ以下がより好ましく、２０μｍ以下がさらに好ましく、１０μｍ以下が特に好ましい。
　前記水不溶性繊維としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、不織布であっても、織布もしくは編物であってもよいが、製造工程の簡略化の点から、不織布が好ましい。
　前記不織布の製造方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、湿式法、乾式法、メルトブロー法、エレクトロスピニング法、フラッシュ紡糸法、抄造法、スパンボンド法、サーマルボンド法、ケミカルボンド法、ニードルパンチ法、スパンレース法（水流絡合法）、ステッチボンド法、スチームジェット法などが挙げられる。これらの中でも、極細繊維が得られる点から、メルトブロー法、エレクトロスピニング法、フラッシュ紡糸法、抄造法などが好ましい。
　前記メルトブロー法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、押出機で溶融した熱可塑性樹脂をメルトブローダイから高温・高速の空気流で糸状に吹き出し、繊維状に延伸された樹脂をコンベアー上で集積することで、繊維同士の絡み合い、及び融着が起こりノーバインダーの自己接着型極細繊維の不織布を得る方法などが挙げられる。この際、樹脂粘度、溶融温度、吐出量、熱風温度、風圧、ＤＣＤ（紡糸口金と表面からコンベアーまでの距離）などを調整することにより、前記不織布の繊維直径、目付、繊維配向、繊維分散性を制御することができる。更に、熱プレス加工やテンター加工等により、不織布の厚み、平均孔径の制御を行うことが可能である。
－－ビーズ－－
　前記ビーズとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、ＮＨＳ（Ｎ―ヒドロキシスクシンイミド）エステル化ビーズが好ましい。
　前記ビーズは球状の粒子からなる。その適切な粒子サイズは５～５００μｍ、好ましくは１０～１００μｍ、より好ましくは２０～８０μｍの直径範囲であってもよい。
　前記ビーズの平均孔径の下限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、良好な通液性能を有する点、もしくは生産性の点から、０．１μｍ以上が好ましく、１．０μｍ以上がより好ましく、１．５μｍ以上がさらに好ましい。
　前記ビーズの平均孔径の上限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、精製性能が高い点から、５０μｍ以下が好ましく、３０μｍ以下がより好ましく、２０μｍ以下がさらに好ましく、１０μｍ以下が特に好ましい。
　前記ビーズの材料としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ポリオレフィン系、ポリプロピレン、無水マレイン酸ポリプロピレン、変性ポリプロピレン、ポリエチレン、アガロース、セルロース、再生セルロース、セルロースアセテート、セルロースジアセテート、セルローストリアセテート、エチルセルロース、酢酸セルロース、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリブチレンテレフタレート（ＰＢＴ）、アクリル樹脂、ポリカーボネート、ポリエステル系、ポリアクリロニトリル、ポリアミド、ポリスチレン、臭素化ポリスチレン、ポリアルキル（メタ）アクリレート、ポリ塩化ビニル、ポリクロロプレン、ポリウレタン、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセテート、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリブタジエン、ブタジエン－アクリロニトリル共重合体、スチレン－ブタジエン共重合体、エチレン－ビニルアルコール共重合体、アラミド、ガラス、ナイロン、レーヨンなどが挙げられる。これらは、１種を単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、圧力流速特性の点から、セルロース又はアガロースが好ましく、アガロースがより好ましい。
－その他の要素－
　前記その他の要素としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、スペーサーなどが挙げられる。
－－スペーサー－－
　前記スペーサーを含むアフィニティ担体としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記低分子化抗体が、スペーサーを介して前記水不溶性基材に接続されているアフィニティ担体などが挙げられる。
　前記スペーサーが有する官能基としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、アミノ基、ヒドロキシ基、エポキシ基、カルボキシ基などが挙げられる。これらの中でも、安定性、反応性、リガンドとの接続の容易さの点からエポキシ基が好ましい。
　前記スペーサーとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ポリマー、モノマー、ダイマー、トライマー、テトラマーを含むものなどが挙げられる。これらの中でも、ポリマーを含むものが好ましい。前記ポリマーは、コポリマーであってもよい。
　前記ポリマーとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、親水性ポリマー、疎水性ポリマーを含むものなどが挙げられる。これらの中でも、水系溶媒での取り扱いが可能な点、タンパク質とスペーサーとの非特異的な疎水性作用を抑制する点から、親水性ポリマーを含むものが好ましい。
　前記親水性ポリマーとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ポリアミン、多糖類を含むものなどが挙げられる。
　前記ポリアミンとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ポリエチレンイミン、ポリアリルアミン、ポリビニルアミン、ポリリジン、エチレンジアミン、１，２－プロパンジアミン、１，６－ヘキサメチレンジアミン、ピペラジン、２，５－ジメチルピペラジン、イソホロンジアミン、４，４’－ジシクロヘキシルメタンジアミン、１，４－シクロヘキサンジアミン等のジアミン類；ジエチレントリアミン、ジプロピレントリアミン、トリエチレンテトラミン等のポリアミン類；ヒドラジン、Ｎ，Ｎ’－ジメチルヒドラジン、１，６－ヘキサメチレンビスヒドラジン等のヒドラジン類；コハク酸ジヒドラジッド、アジピン酸ジヒドラジド、グルタル酸ジヒドラジド、セバシン酸ジヒドラジド、イソフタル酸ジヒドラジド等のジヒドラジド類などが挙げられる。これらは、１種を単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、分子量の異なる分子を容易に入手可能である点から、ポリエチレンイミン、又はポリアリルアミンを含むものが好ましい。
　前記多糖類としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、キトサン、キチン、セルロース、アガロース、カラギーナン、ヘパリン、ヒアルロン酸、ペクチン、キシログルカン、グルコマンナン、デンプン、グリコーゲンなどが挙げられる。これらは、１種を単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、アミノ基を含む点から、キトサンが好ましい。
　前記ポリマーのモル質量の下限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、生体粒子の吸着性の点から、５００ｇ／ｍｏｌ以上が好ましく、５０００ｇ／ｍｏｌ以上がより好ましく、１０，０００ｇ／ｍｏｌ以上がさらに好ましく、６０，０００ｇ／ｍｏｌ以上が特に好ましい。
　前記ポリマーのモル質量の上限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、生体粒子の吸着性の点から、２，０００，０００ｇ／ｍｏｌ以下が好ましく、１，０００，０００ｇ／ｍｏｌ以下がより好ましく、５００，０００ｇ／ｍｏｌ以下がさらに好ましく、２００，０００ｇ／ｍｏｌ以下が特に好ましい。
　前記ポリマーは、分岐鎖を有するポリマーであっても、線状ポリマーであってもよいが、生体粒子の吸着性の点から、分岐鎖を有するポリマーが好ましい。
　（アフィニティ担体の製造方法）
　前記アフィニティ担体の製造方法は、水不溶性基材と、低分子化抗体と、を接続する工程を含み、さらにその他の工程を含むことができる。
　前記水不溶性基材、及び前記低分子化抗体は、前述のとおりである。
　前記水不溶性基材と、前記低分子化抗体との接続としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記水不溶性基材に前記低分子化抗体を加え、転倒混和する方法、前記水不溶性基材にその他の要素を加え、転倒混和し、さらに、低分子化抗体を加え転倒混和する方法などが挙げられる。
　前記転倒混和の時間としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、るが、１時間以上から４８時間以下が好ましく、２時間以上から４８時間以下がより好ましく、３時間以上から２４時間以下がさらに好ましく、８時間以上２４時間以下が特に好ましい。
　前記スペーサーを含むアフィニティ担体の製造方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、スペーサーの、一端に水不溶性基材を接続し、他端に低分子化抗体を接続する工程などが挙げられる。
　前記スペーサー、前記水不溶性基材、及び前記低分子化抗体は、前述のとおりである。
　ここで、スペーサーの、一端への水不溶性基材の接続と、スペーサーの、他端への低分子化抗体の接続の順序は問わないが、接続のための反応制御が容易であるという点から、スペーサーの、一端への水不溶性基材の接続の後、スペーサーの、他端への低分子化抗体の接続を行うことが好ましい。
　前記スペーサーの、一端への水不溶性基材の接続としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、水不溶性基材にスペーサー溶液を加え、転倒混和する方法などが挙げられる。
　前記転倒混和の時間としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、るが、１時間以上から４８時間以下が好ましく、２時間以上から４８時間以下がより好ましく、３時間以上から２４時間以下がさらに好ましく、８時間以上２４時間以下が特に好ましい。
　前記スペーサーの、他端への低分子化抗体の接続としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、水不溶性基材に低分子化抗体を加え、転倒混和する方法などが挙げられる。
　前記転倒混和の時間としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、るが、１時間以上から４８時間以下が好ましく、２時間以上から４８時間以下がより好ましく、３時間以上から２４時間以下がさらに好ましく、８時間以上２４時間以下が特に好ましい。
　本発明のアフィニティ担体は、目的に応じて加工することができ、その形状は特に限定されない。例えば、平膜状、中空糸状、プリーツ状、ロール状、スパイラル状、チューブラー状等の形状を選択することができる。これらの加工されたアフィニティ担体は、単体で用いてもよいし、積層してもよく、直列又は並列に接続して使用してもよい。
　前記アフィニティ担体を充填するためのデバイスの形状は特に限定されず、円盤状、円筒状、板状などを選択することができる。均一な通液を実現する観点からは、円盤状、又は円筒状が好ましい。
　（ウイルス、ウイルス様粒子、ウイルスベクター、免疫グロブリン、アルブミン、又はそれらの誘導体の製造方法）
　前記ウイルス、ウイルス様粒子、ウイルスベクター、免疫グロブリン、アルブミン、又はそれらの誘導体の製造方法は、前記アフィニティ担体と、ウイルス、ウイルス様粒子、ウイルスベクター、免疫グロブリン、アルブミン、又はそれらの誘導体と、を接触させる接触工程を含み、さらにその他の工程を含むことができる。
　前記アフィニティ担体、及び前記ウイルス、ウイルス様粒子、ウイルスベクター、免疫グロブリン、アルブミン、又はそれらの誘導体は前述のとおりである。
　前記接触工程により、前記アフィニティ担体と前記ウイルス、ウイルス様粒子、ウイルスベクター、免疫グロブリン、アルブミン、又はそれらの誘導体とを結合、又は吸着させることができる。
　前記接触としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記アフィニティ担体と前記ウイルス、ウイルス様粒子、ウイルスベクター、免疫グロブリン、アルブミン、又はそれらの誘導体とを混合する方法、前記アフィニティ担体を充填したカラムに、前記ウイルス、ウイルス様粒子、ウイルスベクター、免疫グロブリン、アルブミン、又はそれらの誘導体を含む溶液を通液する方法などが挙げられる。
　前記カラムの材質としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ガラス、ポリプロピレンやアクリルなどの樹脂、ステンレスなどの金属などが挙げられる。
　－その他の工程－
　前記その他の工程としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記接触工程後の、前記アフィニティ担体に結合した前記ウイルス、ウイルス様粒子、ウイルスベクター、免疫グロブリン、アルブミン、又はそれらの誘導体を前記アフィニティ担体から分離する分離工程などが挙げられる。
　前記分離工程により、前記アフィニティ担体から前記ウイルス、ウイルス様粒子、ウイルスベクター、免疫グロブリン、アルブミン、又はそれらの誘導体を分離、解離、又は溶出させることができる。
　前記分離としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記ウイルス、ウイルス様粒子、ウイルスベクター、免疫グロブリン、アルブミン、又はそれらの誘導体が結合した前記アフィニティ担体と分離バッファー（溶出バッファー）とを混合する方法、前記ウイルス、ウイルス様粒子、ウイルスベクター、免疫グロブリン、アルブミン、又はそれらの誘導体が結合した前記アフィニティ担体が充填されたカラムに、分離バッファー（溶出バッファー）を通液する方法などが挙げられる。
　（ウイルス、ウイルス様粒子、ウイルスベクター、免疫グロブリン、アルブミン、又はそれらの誘導体の精製方法）
　前記ウイルス、ウイルス様粒子、ウイルスベクター、免疫グロブリン、アルブミン、又はそれらの誘導体の精製方法は、前記アフィニティ担体とウイルス、ウイルス様粒子、ウイルスベクター、免疫グロブリン、アルブミン、又はそれらの誘導体を接触させる接触工程を含み、さらにその他の工程を含むことができる。
　前記アフィニティ担体、前記ウイルス、ウイルス様粒子、ウイルスベクター、免疫グロブリン、アルブミン、又はそれらの誘導体、前記接触、及び前記その他の工程は前述のとおりである。
　以下、本発明の実施例を説明するが、本発明は、これらの実施例に何ら限定されるものではない。
　以下の実施例において用いた組換えＤＮＡ技術に関する詳細な方法などは、次の成書に記載されている：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　２ｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，　１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｇｒｅｅｎ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ　ａｎｄ　Ｗｉｌｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）。
　また、以下の実施例において、大腸菌の形質転換に用いるプラスミドは、構築したベクターを大腸菌Ｅ．Ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９コンピテントセル（タカラバイオ社製）に導入し、得られた形質転換体を培養して増幅することによって調製し、酵母の形質転換に用いるプラスミドは、構築したベクターを大腸菌Ｅ．Ｃｏｌｉ　ＤＨ５αコンピテントセル（タカラバイオ社製）に導入し、得られた形質転換体を培養して増幅することによって調製した。プラスミド保持株からのプラスミドの調製は、ＱＩＡｐｒｅｐ　ｓｐｉｎ　ｍｉｎｉｐｒｅｐ　ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）等を用いて行った。
　ＰＣＲにはＰｒｉｍｅ　ＳＴＡＲ　Ｍａｘ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）等を用い、反応条件は添付のマニュアルに記載の方法で行った。
＜比較例１：抗Ｆｃ－ＶＨＨ抗体の調製＞
　抗Ｆｃ－ＶＨＨ抗体のアミノ酸配列は欧州特許第２１７０９６０Ｂ１号の配列番号：１６３に記載されている。この公知情報に基づいて、上流にｐｅｌＢシグナルペプチド（配列番号１６）を付加した抗Ｆｃ－ＶＨＨをコードする遺伝子の合成ＤＮＡを調製し、ベクターの構築に利用した。
　合成遺伝子上流にＮｄｅＩ、下流にＢｐｕ１１０２Ｉの制限酵素サイトを付加した核酸断片を、前記ｐｅｌＢシグナルペプチド付加した抗Ｆｃ－ＶＨＨ抗体合成ＤＮＡを鋳型としプライマー１（配列番号１７）及びプライマー２（配列番号１８）を用いたＰＣＲによりそれぞれ調製し、ＮｄｅＩ、Ｂｐｕ１１０２Ｉを用いた制限酵素処理後に、ｐＥＴ－２８ｂ（メルク社製）のＮｄｅＩ、Ｂｐｕ１１０２Ｉサイトに挿入して、抗Ｆｃ－ＶＨＨ抗体発現ベクターを調製した。
　前記抗Ｆｃ－ＶＨＨ抗体発現ベクターを０．１μＬと、大腸菌コンピテント細胞株ＢＬ２１（ＤＥ３）（メルク社製）１μＬを氷上で混合し、２０分間静置した。４２℃で４５秒間加温して、氷上で冷却した。冷却後、ＳＯＣ培地（２０ｇ／Ｌバクトトリプトン（ベクトンディッキンソンアンドカンパニー（ＢＤ）社製）、５ｇ／Ｌバクト酵母エキス（ＢＤ社製）、１０ｍＭ塩化ナトリウム、２．５ｍＭ塩化カリウム、１０ｍＭ硫酸マグネシウム、１０ｍＭ塩化マグネシウム、２０ｍＭグルコース）を１００μＬ添加して、３７℃で１時間回復培養した。ＬＢＫ選択寒天プレート（１０ｇ／Ｌポリペプトン（ＢＤ社製）、５ｇ／Ｌバクト酵母エキス（ＢＤ社製）、１０ｇ／Ｌ塩化ナトリウム、５０μｇ／Ｌカナマイシン、１５ｇ／Ｌアガロース）に塗布し、３７℃、１６時間の静置培養で生育する株を選択し、抗Ｆｃ－ＶＨＨ発現株を取得した。
　前記抗Ｆｃ－ＶＨＨ抗体発現株をフラスコ培養により発現させ、回収した培養液を液体クロマトグラフィーにより精製し、抗Ｆｃ－ＶＨＨ抗体を取得した。
　前記抗Ｆｃ－ＶＨＨ抗体発現株を試験管に２ｍＬの２ＹＴ培地（１．６％（ｗ／ｖ）ポリペプトン（日本製薬社製）、１％（ｗ／ｖ）酵母エキス（ＢＤ社）、０．５％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウム）に植菌し、３０℃で１６時間、毎分１１０回の振とう速度で前培養を行った。５００ｍＬ容坂口フラスコに５０ｍＬのＭａｇｉｃＭｅｄｉａ（登録商標）Ｅ．ｃｏｌｉＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＭｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に、前培養液１２５μＬを植菌し、３０℃で２４時間、毎分１１０回の振とう速度で培養を行った。
　培養終了後に酢酸を終濃度２％（ｖ／ｖ）になるように添加して、細胞内から抗Ｆｃ－ＶＨＨ抗体を抽出した。遠心分離により細胞残渣を除き、遠心上清を０．２μｍのフィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社製）によりろ過した。
　前記ろ過で取得したろ過液から抗Ｆｃ－ＶＨＨ抗体をクロマトグラフィーにより精製した。精製にはＨｉＴｒａｐ（登録商標）Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ（登録商標）ＰｒｉｓｍＡ（Ｃｙｔｉｖａ社製）のカラムを使用した。
　下記Ａ～Ｆ液を調製し、使用前に０．２μｍフィルターでろ過した。
Ａ液：５０ｍＭ　リン酸ナトリウム　ｐＨ７．０
Ｂ液：５０ｍＭ　酢酸ナトリウム　ｐＨ６．０
Ｃ液：１Ｍ　酢酸
Ｄ液：５０ｍＭ　ＮａＯＨ
Ｅ液：２０％（ｖ／ｖ）エタノール
Ｆ液：上記で取得した培養液のろ過液を１Ｍ　ＮａＯＨでｐＨを７．０に調製した溶液
　ＨｉＴｒａｐ（登録商標）Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ（登録商標）ＰｒｉｓｍＡをＡＫＴＡ　Ａｖａｎｔ　２５（Ｃｙｔｉｖａ社製）に接続し、流速を１ｍＬ／分間に設定し、純水で洗浄後、Ａ液で平衡化した。その後、Ｆ液を通液し、ＶＨＨ抗体をカラムに保持させた後にＡ液を通液し、Ｂ液にて洗浄し、Ｃ液にて抗Ｆｃ－ＶＨＨ抗体を溶出した。溶出終了後、Ｄ液、純水の順に洗浄し、カラムをＥ液に置換して冷蔵保存した。
　溶出した抗Ｆｃ－ＶＨＨ抗体を１Ｍ　ＮａＯＨで中和して、３ｋＤａカットの限外ろ過膜（メルク社製）を用いて抗Ｆｃ－ＶＨＨ抗体の濃度が１０ｍｇ／ｍＬになるまで濃縮した。
＜実施例１：抗Ｆｃ－ＶＨＨ抗体の変異体の調製＞
　ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－ＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓＫｉｔ（東洋紡社製）を用いて抗Ｆｃ－変異ＶＨＨ抗体の発現ベクターを５種類作製した。反応条件は添付のマニュアルに記載の方法で行った。前記抗Ｆｃ－ＶＨＨ抗体発現ベクターをＰＣＲの鋳型にして実施した。
　比較例１に記載の抗Ｆｃ－ＶＨＨ抗体発現ベクターを鋳型に表１に示すプライマーを用いて、インバースＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物にＤｐｎＩを添加して、３７℃で一時間静置により鋳型ベクターを消化した。ＤｐｎＩ処理済ＰＣＲ産物のＳｅｌｆ－ｌｉｇａｔｉｏｎをＴ４　Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｋｉｎａｓｅ及びＬｉｇａｔｉｏｎ　ｈｉｇｈにより、１６℃で１時間静置にて行い、抗Ｆｃ－ＶＨＨ抗体の変異体の発現ベクターを５種類調製した。
　比較例１と同様の方法により、調製した５種類の抗Ｆｃ－変異ＶＨＨ抗体の変異体の発現ベクターをそれぞれ大腸菌コンピテント細胞株ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、抗Ｆｃ－変異ＶＨＨ抗体発現株５株を取得した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　比較例１と同様の方法で、前記抗Ｆｃ－変異ＶＨＨ抗体発現株５株をそれぞれフラスコ培養により発現させ、回収した培養液を液体クロマトグラフィーにより精製し、抗Ｆｃ－変異ＶＨＨ抗体１から５をそれぞれ取得した。
＜製造例１：抗Ｆｃ－ＶＨＨ抗体カラムの作製＞
　比較例１で得られた抗Ｆｃ－ＶＨＨ抗体を担体に固定化して、抗Ｆｃ－ＶＨＨ抗体カラムを作製した。担体への固定化にはＨｉＴｒａｐ（登録商標）ＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ＨＰ（Ｃｙｔｉｖａ社製）カラムを使用した。
　下記Ａ～Ｆ液を調製し、使用前に０．２μｍフィルターを通した。
Ａ液：０．２Ｍ　炭酸ナトリウム、０．５Ｍ　塩化ナトリウム、ｐＨ８．３
Ｂ液：１ｍＭ　塩酸
Ｃ液：０．５Ｍ　エタノールアミン、０．５Ｍ　塩化ナトリウム、ｐＨ８．３
Ｄ液：０．１Ｍ　酢酸、０．５Ｍ　塩化ナトリウム、ｐＨ４　
Ｅ液：２０％（ｖ／ｖ）エタノール
　前記抗Ｆｃ－ＶＨＨ抗体を１ｍｇ／ｍＬになるようにＡ液で希釈した。氷浴で冷やしたＢ液をカラムに６カラム容積、流速を１ｍＬ／分間で通液させてカラム中のイソプロパノールを除去した。その後すぐにＡ液で希釈した抗Ｆｃ－ＶＨＨ抗体溶液を１カラム容積分添加して、室温で３０分間静置した。Ｃ液を６カラム容積通液し、Ｄ液を６カラム容積通液し、Ｃ液を６カラム容積通液して室温で２０分間静置した。Ｄ液を６カラム容積通液し、Ｃ液を６カラム容積通液し、Ｄ液を６カラム容積通液して、Ｅ液を通液して抗Ｆｃ－ＶＨＨ抗体カラムを作製した。
＜製造例２：抗Ｆｃ－変異ＶＨＨ抗体カラムの作製＞
　実施例１で得られた抗Ｆｃ－変異ＶＨＨ抗体５種類をそれぞれ担体に固定化して、抗Ｆｃ－変異ＶＨＨ抗体カラムを作製した。抗Ｆｃ－変異ＶＨＨ抗体カラムの作製は製造例１に記載の方法と同様に実施した。抗Ｆｃ－変異ＶＨＨ抗体１を固定化したカラムを抗Ｆｃ－変異ＶＨＨ抗体１カラム、抗Ｆｃ－変異ＶＨＨ抗体２を固定化したカラムを抗Ｆｃ－変異ＶＨＨ抗体２カラム、抗Ｆｃ－変異ＶＨＨ抗体３を固定化したカラムを抗Ｆｃ－変異ＶＨＨ抗体３カラム、抗Ｆｃ－変異ＶＨＨ抗体４を固定化したカラムを抗Ｆｃ－変異ＶＨＨ抗体４カラム、抗Ｆｃ－変異ＶＨＨ抗体５を固定化したカラムを抗Ｆｃ－変異ＶＨＨ抗体５カラムとした。
＜試験例１：抗Ｆｃ－ＶＨＨ抗体カラムのリニアグラジエントによるＩｇＧ抗体精製＞
　製造例１で作製した抗Ｆｃ－ＶＨＨ抗体カラムを用いて、市販のＩｇＧ抗体の精製を実施した。抗Ｆｃ－ＶＨＨ抗体カラムからＩｇＧ抗体が溶出した際のピークトップの位置におけるｐＨ（溶出ｐＨ）を確認した。
カラム：抗Ｆｃ－ＶＨＨ抗体カラム（製造例１）
流速：０．５ｍＬ／分間、接触時間２分間
Ａ液：２０ｍＭ　リン酸ナトリウム、ｐＨ７．４
Ｂ液：５０ｍＭ　クエン酸ナトリウム、ｐＨ５．０
Ｃ液：５０ｍＭ　クエン酸ナトリウム、ｐＨ３．０
Ｅ液：１ｍｇ／ｍＬ　ガンマガード（人免疫グロブリン製剤、武田薬品工業社製）
　上記カラムをＡＫＴＡ（登録商標）　Ａｖａｎｔ　２５（Ｃｙｔｉｖａ社）に接続し、Ａ液で平衡化した。その後、Ｅ液を１００μＬ負荷し、ＩｇＧ抗体をカラム担体に保持させた後、Ａ液を３カラム容積、Ｂ液を５カラム容積の順に洗浄した。Ｂ液→Ｃ液の２０カラム容積のリニアグラジエントで通液、さらにＣ液を５カラム容積通液してＩｇＧ抗体を溶出した。
＜試験例２：抗Ｆｃ－変異ＶＨＨ抗体カラムのリニアグラジエントによるＩｇＧ抗体精製＞
　製造例２で作製した抗Ｆｃ－変異ＶＨＨ抗体カラム５種類を用いて、市販のＩｇＧ抗体の精製を実施した。変異導入後の抗Ｆｃ－変異ＶＨＨ抗体を固定化した抗Ｆｃ－変異ＶＨＨ抗体カラムのＩｇＧ抗体が溶出するｐＨを確認した。評価の方法は試験例１と同様の方法で実施した。
　試験例１と上記の結果において、ＩｇＧ抗体が溶出する際のピークトップの位置におけるｐＨ（溶出ｐＨ）を確認し、変異導入前後での溶出ｐＨの差を算出した。結果を表２に示した。この結果は、変異導入したＶＨＨ抗体を固定化したカラムでは溶出ｐＨがより高いｐＨで溶出できたことを示している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
＜試験例３：抗Ｆｃ－ＶＨＨ抗体カラムのステップ溶出によるＩｇＧ抗体精製＞
　製造例１で作製した抗Ｆｃ－ＶＨＨ抗体カラムを用いて、市販のＩｇＧ抗体の精製を実施した。ｐＨ３．７５の緩衝液を通液した時にカラムから溶出されるＩｇＧ抗体の量を算出した。
カラム：抗Ｆｃ－ＶＨＨ抗体カラム（製造例１）
流速：０．５ｍＬ／分間、接触時間２分間
Ａ液：２０ｍＭ　リン酸ナトリウム、ｐＨ７．４
Ｂ液：５０ｍＭ　クエン酸ナトリウム、ｐＨ３．７５
Ｃ液：１ｍｇ／ｍＬ　ガンマガード（人免疫グロブリン製剤、武田薬品工業社製）
　上記カラムをＡＫＴＡ（登録商標）　Ａｖａｎｔ　２５（Ｃｙｔｉｖａ社）に接続し、Ａ液で平衡化した。その後、Ｃ液を１００μＬ負荷し、ＩｇＧ抗体をカラム担体に保持させた後、Ａ液を３カラム容積で洗浄した。Ｂ液を３カラム容積通液してＩｇＧ抗体を溶出した（溶出画分）。
＜試験例４：抗Ｆｃ－変異ＶＨＨ抗体カラムのステップ溶出によるＩｇＧ抗体の精製＞
　製造例２で作製した抗Ｆｃ－変異ＶＨＨ抗体カラムを用いて、市販のＩｇＧ抗体の精製を実施した。ｐＨ３．７５の緩衝液を通液して、溶出されるＩｇＧ抗体の量を算出した。評価の方法は試験例３と同様の方法で実施した。
　試験例３と上記で実施した際の溶出画分中のＩｇＧ抗体の量を波長２８０ｎｍの吸光度によりＩｇＧ抗体量の比を算出した。結果を表３に示した。この結果は、変異導入したＶＨＨ抗体を固定化したカラムでは、ＩｇＧ抗体回収率が高くなることを示している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
＜比較例２：抗ＨＳＡ－ＶＨＨ抗体の調製＞
　比較例２－１：抗ＨＳＡ－ＶＨＨ抗体発現ベクターの調製
　ベクターの構築において利用した、ＡＯＸ１プロモーター（配列番号２９）、ＡＯＸ１ターミネーター（配列番号３０）、ＨＩＳ４遺伝子（配列番号３１）はコマガタエラ・パストリスＡＴＣＣ７６２７３株の染色体ＤＮＡ（塩基配列はＥＭＢＬ（Ｔｈｅ　Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）　ＡＣＣＳＥＳＳＩＯＮ　Ｎｏ．ＦＲ８３９６２８～ＦＲ８３９６３１に記載）混合物をテンプレートにしてＰＣＲで調製した。前記染色体ＤＮＡ混合物の調製は、コマガタエラ・パストリスＡＴＣＣ７６２７３株からＧｅｎとるくん(商標)（タカラバイオ社製）等を用いて、これに記載の条件で実施した。
　抗ＨＳＡ－ＶＨＨ抗体のアミノ酸配列は欧州特許出願公開第２０６９４０２Ａ２号（国際公開第２００８／０２８９７７号）の配列番号：６２に記載されている。
　これらの公知情報に基づいて、上流にＭａｔｉｎｇ　Ｆａｃｔｏｒαシグナル配列（ＭＦ配列）（配列番号３２）が付加され、下流にＨｉｓタグ配列（ＧＧＧＧＳＨＨＨＨＨＨ）が付加された抗ＨＳＡ－ＶＨＨ遺伝子の合成ＤＮＡを調製し、ベクターの構築において利用した。
　ＨｉｎｄＩＩＩ－ＢａｍＨＩ－ＢｇｌＩＩ－ＸｂａＩ－ＥｃｏＲＩのマルチクローニングサイトをもつ遺伝子断片（配列番号３３）を全合成し、これをｐＵＣ１９（タカラバイオ社製）のＨｉｎｄＩＩＩ－ＥｃｏＲＩサイト間に挿入して、ｐＵＣ－１を構築した。
　また、ＡＯＸ１プロモーターの両側にＢａｍＨＩ認識配列を付加した核酸断片を、前記染色体ＤＮＡ混合物を鋳型としたとしプライマー１３（配列番号３４）及びプライマー１４（配列番号３５）を用いたＰＣＲにより調製し、ＢａｍＨＩ処理後にｐＵＣ－１のＢａｍＨＩサイトに挿入して、ｐＵＣＰａｏｘを構築した。
　次に、ＡＯＸ１ターミネーターの両側にＸｂａＩ認識配列を付加した核酸断片を、前記染色体ＤＮＡ混合物を鋳型としプライマー１５（配列番号３６）及びプライマー１６（配列番号３７）を用いたＰＣＲにより調製し、ＸｂａＩ処理後にｐＵＣＰａｏｘのＸｂａＩサイトに挿入して、ｐＵＣ－ＰａｏｘＴａｏｘを構築した。
　次に、ＨＩＳ４遺伝子の両側にＥｃｏＲＩ認識配列を付加した核酸断片を、前記染色体ＤＮＡ混合物を鋳型としプライマー１７（配列番号３８）及びプライマー１８（配列番号３９）を用いたＰＣＲにより調製し、ＥｃｏＲＩ処理後にｐＵＣ－ＰａｏｘＴａｏｘのＥｃｏＲＩサイトに挿入して、ｐＵＣ－ＰａｏｘＴａｏｘＨＩＳ４を構築した。
　次に、上流にＭＦ配列が付加され下流にＨｉｓタグ配列が付加された抗ＨＳＡ－ＶＨＨ遺伝子の両側にＢｇｌＩＩ認識配列を付加した核酸断片を、上流にＭＦ配列（配列番号３２）が付加された、Ｈｉｓタグ配列付加抗ＨＳＡ－ＶＨＨ遺伝子の前記合成ＤＮＡを鋳型とし、プライマー１９（配列番号４０）及びプライマー２０（配列番号４１）を用いたＰＣＲにより調製し、ＢｇｌＩＩ処理後にｐＵＣ－ＰａｏｘＴａｏｘＨＩＳ４のＢｇｌＩＩサイトに挿入して、抗ＨＳＡ－ＶＨＨ抗体発現ベクター（ｐＵＣ－Ｐａｏｘａｎｔｉ－ＨＳＡＶＨＨＴａｏｘＨＩＳ４）を構築した。
　比較例２－２：形質転換酵母の取得
　比較例２－１で構築した抗ＨＳＡ－ＶＨＨ抗体発現ベクターを用いて、以下のようにコマガタエラ・パストリスを形質転換した。
　コマガタエラ・パストリスＡＴＣＣ７６２７３株由来ヒスチジン要求性株を３ｍＬのＹＰＤ培地（１％　ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔ　ｂａｃｔｏ（Ｄｉｆｃｏ社製）、２％　ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎｅ（日本製薬社製）、２％　ｇｌｕｃｏｓｅ）に接種し、３０℃で一晩振盪培養して前培養液を得た。得られた前培養液５００μＬを５０ｍＬのＹＰＤ培地に接種し、ＯＤ６００が１～１．５になるまで振盪培養後、集菌（３０００×ｇ、１０分間、２０℃）し、２５０μＬの１Ｍ　１，４－ジチオスレイトール（ＤＴＴ）（終濃度２５ｍＭ）を含む１０ｍＬの５０ｍＭリン酸カリウムバッファー、ｐＨ７．５に再懸濁した。
　この懸濁液を３０℃で１５分インキュベート後、集菌（３０００×ｇ、１０分間、２０℃）し、予め予冷した５０ｍＬのＳＴＭバッファー（２７０ｍＭ　スクロース、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１ｍＭ塩化マグネシウム、ｐＨ７．５）で洗浄した。洗浄液を集菌（３０００×ｇ、１０分間、４℃）し、２５ｍＬのＳＴＭバッファーで再度洗浄したのち、集菌（３０００×ｇ、１０分間、４℃）した。最終的に、２５０μＬの氷冷ＳＴＭバッファーに懸濁し、これをコンピテントセル懸濁液とした。
　比較例２－１で構築した抗ＨＳＡ－ＶＨＨ抗体発現ベクター（ｐＵＣ－Ｐａｏｘａｎｔｉ－ＨＳＡＶＨＨＴａｏｘＨＩＳ４）を用いて大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体を２ｍＬのアンピシリン含有ＬＢ培地（１％　Ｔｒｙｐｔｏｎｅ（Ｄｉｆｃｏ社製）、０．５％　Ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔ（Ｄｉｆｃｏ社製）、１％　塩化ナトリウム（Ｄｉｆｃｏ社製））で培養し、得られた菌体からＱＩＡｐｒｅｐ　ｓｐｉｎ　ｍｉｎｉｐｒｅｐ　ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、ｐＵＣ－Ｐａｏｘａｎｔｉ－ＨＳＡＶＨＨＴａｏｘＨＩＳ４を取得した。本プラスミドをＳａｌＩ処理し、ＨＩＳ４遺伝子内のＳａｌＩ認識配列で切断された直鎖状ベクターを調製した。
　上述のコンピテントセル懸濁液６０μＬと直鎖状のｐＵＣ－Ｐａｏｘａｎｔｉ－ＨＳＡＶＨＨＴａｏｘＨＩＳ４溶液１μＬを混合し、エレクトロポレーション用キュベット（ディスポキュベット電極、電極間隔２ｍｍ（ビーエム機器社製））に移し入れ、７．５ｋＶ/ｃｍ、２５μＦ、２００Ωに供した後、菌体を１ｍＬのＹＰＤ培地で懸濁し、３０℃で１時間静置した。１時間静置後、集菌（３０００×ｇ、５分間、２０℃）し、１ｍＬのＹＮＢ培地（０．６７％　ｙｅａｓｔ　ｎｉｔｒｏｇｅｎ　ｂａｓｅ　Ｗｉｔｈｏｕｔ　Ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ（Ｄｉｆｃｏ社製））に懸濁後、再度集菌（３０００×ｇ、５分間、２０℃）した。菌体を適当量のＹＮＢ培地で再懸濁後、ＹＮＢ選択寒天プレート（０．６７％　ｙｅａｓｔ　ｎｉｔｒｏｇｅｎ　ｂａｓｅ　Ｗｉｔｈｏｕｔ　Ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ（Ｄｉｆｃｏ社製）、２％アガロース、２％グルコース）に塗布し、３０℃、３日間の静置培養で生育する株を選択し、抗ＨＳＡ－ＶＨＨ発現酵母を取得した。
　比較例２－３：抗ＨＳＡ－ＶＨＨ抗体の調製
　比較例２－２で得られた抗ＨＳＡ－ＶＨＨ発現酵母を３ｍＬのＢＭＧＭＹ培地（１％　ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔ　ｂａｃｔｏ（Ｄｉｆｃｏ社製）、２％　ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎｅ（日本製薬社製）、０．３４％ｙｅａｓｔ　ｎｉｔｒｏｇｅｎ　ｂａｓｅ　ｗｉｔｈｏｕｔ　Ａｍｉｎｏ　Ａｃｉｄ　ａｎｄ　Ａｍｍｏｎｉｕｍ　ｓｕｌｆａｔｅ、１％　硫酸アンモニウム、０．４ｍｇ／Ｌ　ビオチン、１００ｍＭ　リン酸カリウム（ｐＨ７．０）、１％　ｇｌｙｃｅｒｏｌ、１％　メタノール）に接種し、これを３０℃、７２時間振盪培養後、遠心分離（１２０００ｒｐｍ、５分間、４℃）により培養液上清を回収し、０．２μｍのフィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社製）によりろ過した。
　前記ろ過で取得したろ過液から抗ＨＳＡ－ＶＨＨ抗体をクロマトグラフィーにより精製した。精製にはＣｅｌｌｕｆｉｎｅＭＡＸ　Ｓ－ｒ（ＪＮＣ社製）の担体を使用した。
　下記Ａ～Ｆ液を調製し、使用前に０．２μｍフィルターでろ過した。
Ａ液：２５ｍＭ　酢酸ナトリウム　ｐＨ４．５
Ｂ液：２５ｍＭ　酢酸ナトリウム、３Ｍ尿素　ｐＨ４．５
Ｃ液：２５ｍＭ　酢酸ナトリウム、５００ｍＭ　塩化ナトリウム　ｐＨ４．５
Ｄ液：０．５Ｍ　ＮａＯＨ
Ｅ液：２０％（ｖ／ｖ）エタノール
Ｆ液：上記で取得した培養液のろ過液を純水で５倍希釈して、塩酸でｐＨを４．５に調製した溶液
　ＣｅｌｌｕｆｉｎｅＭＡＸ　Ｓ－ｒ（ＪＮＣ社製）の担体をＴｒｉｃｏｒｎ５／１５０（Ｃｙｔｉｖａ社製）にパッキングしたカラムをＡＫＴＡ　Ａｖａｎｔ　２５（Ｃｙｔｉｖａ社製）に接続し、流速を０．６ｍＬ／分間に設定し、純水で洗浄後、Ａ液で平衡化した。その後、Ｆ液を通液し、ＶＨＨ抗体をカラムに保持させた後にＡ液を通液し、Ｂ液にて洗浄し、Ｃ液にて抗ＨＳＡ－ＶＨＨ抗体を溶出した。溶出終了後、Ｄ液、純水の順に洗浄し、カラムをＥ液に置換して冷蔵保存した。
　溶出した抗ＨＳＡ－ＶＨＨ抗体を１Ｍ　ＮａＯＨで中和して、３ｋＤａカットの限外ろ過膜（メルク社製）を用いて抗ＨＳＡ－ＶＨＨ抗体の濃度が１ｍｇ／ｍＬになるまで濃縮した。
＜実施例２：抗ＨＳＡ－ＶＨＨ抗体の変異体の調製＞
　ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－ＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓＫｉｔ（東洋紡社製）を用いて抗ＨＳＡ－変異ＶＨＨ抗体の発現ベクターを１種類作製した。反応条件は添付のマニュアルに記載の方法で行った。前記抗ＨＳＡ－ＶＨＨ抗体発現ベクターをＰＣＲの鋳型にして実施した。
　比較例２－１に記載の抗ＨＳＡ－ＶＨＨ抗体発現ベクターを鋳型に表４に示すプライマーを用いて、インバースＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物にＤｐｎＩを添加して、３７℃で一時間静置により鋳型ベクターを消化した。ＤｐｎＩ処理済ＰＣＲ産物のＳｅｌｆ－ｌｉｇａｔｉｏｎをＴ４　Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｋｉｎａｓｅ及びＬｉｇａｔｉｏｎ　ｈｉｇｈにより、１６℃で１時間静置にて行い、抗ＨＳＡ－ＶＨＨ抗体の変異体の発現ベクターを１種類調製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　比較例２－２と同様の方法により、調製した抗ＨＳＡ－変異ＶＨＨ抗体の変異体を発現する形質転換酵母を作製した。
　比較例２－３と同様の方法で、前記抗ＨＳＡ－変異ＶＨＨ抗体発現株をそれぞれフラスコ培養により発現させ、回収した培養液を液体クロマトグラフィーにより精製し、抗ＨＳＡ－変異ＶＨＨ１抗体を取得した。
＜製造例３：抗ＨＳＡ－ＶＨＨ抗体カラムの作製＞
　比較例２で得られた抗ＨＳＡ－ＶＨＨ抗体を担体に固定化して、抗ＨＳＡ－ＶＨＨ抗体カラムを作製した。担体への固定化にはＨｉＴｒａｐ（登録商標）ＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ＨＰ（Ｃｙｔｉｖａ社製）カラムを使用した。
　下記Ａ～Ｆ液を調製し、使用前に０．２μｍフィルターを通した。
Ａ液：０．２Ｍ　炭酸ナトリウム、０．５Ｍ　塩化ナトリウム、ｐＨ８．３
Ｂ液：１ｍＭ　塩酸
Ｃ液：０．５Ｍ　エタノールアミン、０．５Ｍ　塩化ナトリウム、ｐＨ８．３
Ｄ液：０．１Ｍ　酢酸、０．５Ｍ　塩化ナトリウム、ｐＨ４　
Ｅ液：２０％（ｖ／ｖ）エタノール
　前記抗ＨＳＡ－ＶＨＨ抗体を１ｍｇ／ｍＬになるようにＡ液で希釈した。氷浴で冷やしたＢ液をカラムに６カラム容積、流速を１ｍＬ／分間で通液させてカラム中のイソプロパノールを除去した。その後すぐにＡ液で希釈した抗ＨＳＡ－ＶＨＨ抗体溶液を１カラム容積分添加して、室温で３０分間静置した。Ｃ液を６カラム容積通液し、Ｄ液を６カラム容積通液し、Ｃ液を６カラム容積通液して室温で２０分間静置した。Ｄ液を６カラム容積通液し、Ｃ液を６カラム容積通液し、Ｄ液を６カラム容積通液して、Ｅ液を通液して抗ＨＳＡ－ＶＨＨ抗体カラムを作製した。
＜製造例４：抗ＨＳＡ－変異ＶＨＨ抗体カラムの作製＞
　実施例２で得られた抗ＨＳＡ－変異ＶＨＨ抗体を担体に固定化して、抗ＨＳＡ－変異ＶＨＨ抗体カラムを作製した。抗ＨＳＡ－変異ＶＨＨ抗体カラムの作製は製造例３に記載の方法と同様に実施した。抗ＨＳＡ－変異ＶＨＨ抗体１を固定化したカラムを抗ＨＳＡ－変異ＶＨＨ抗体１カラムとした。
＜試験例５：抗ＨＳＡ－ＶＨＨ抗体カラムのリニアグラジエントによるＩｇＧ抗体精製＞
　製造例３で作製した抗ＨＳＡ－ＶＨＨ抗体カラムを用いて、市販のＨＳＡの精製を実施した。抗ＨＳＡ－ＶＨＨ抗体カラムからＨＳＡが溶出した際のピークトップの位置におけるｐＨ（溶出ｐＨ）を確認した。
カラム：抗ＨＳＡ－ＶＨＨ抗体カラム（製造例３）
流速：０．５ｍＬ／分間、接触時間２分間
Ａ液：２０ｍＭ　リン酸ナトリウム、ｐＨ７．４
Ｂ液：５０ｍＭ　クエン酸ナトリウム、ｐＨ５．０
Ｃ液：５０ｍＭ　クエン酸ナトリウム、ｐＨ３．０
Ｅ液：１ｍｇ／ｍＬ　ＨＳＡ（富士フイルム和光純薬社製）
　上記カラムをＡＫＴＡ（登録商標）　Ａｖａｎｔ　２５（Ｃｙｔｉｖａ社）に接続し、Ａ液で平衡化した。その後、Ｅ液を１ｍＬ負荷し、ＨＳＡをカラム担体に保持させた後、Ａ液を３カラム容積、Ｂ液を５カラム容積の順に洗浄した。Ｂ液→Ｃ液の２０カラム容積のリニアグラジエントで通液、さらにＣ液を５カラム容積通液してＨＳＡを溶出した。
＜試験例６：抗ＨＳＡ－変異ＶＨＨ抗体カラムのリニアグラジエントによるＩｇＧ抗体精製＞
　製造例４で作製した抗ＨＳＡ－変異ＶＨＨ抗体カラムを用いて、市販のＨＳＡの精製を実施した。変異導入後の抗ＨＳＡ－変異ＶＨＨ抗体を固定化した抗ＨＳＡ－変異ＶＨＨ抗体カラムのＨＳＡが溶出するｐＨを確認した。評価の方法は試験例５と同様の方法で実施した。
　試験例５と上記の結果において、ＨＳＡが溶出する際のピークトップの位置におけるｐＨ（溶出ｐＨ）を確認し、変異導入前後での溶出ｐＨの差を算出した。結果を表５に示した。この結果は、変異導入したＶＨＨ抗体を固定化したカラムでは溶出ｐＨがより高いｐＨで溶出できたことを示している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　本発明の態様としては、例えば、以下のものなどが挙げられる。
　＜１＞　フレームワーク領域１、可変重鎖相補性決定領域１、フレームワーク領域２、可変重鎖相補性決定領域２、フレームワーク領域３、可変重鎖相補性決定領域３、及びフレームワーク領域４の順で連結された構造を有する低分子化抗体であって、前記フレームワーク領域３のアミノ酸配列のうち、少なくとも１つの極性アミノ酸がその他のアミノ酸に置換された配列であり、中性ｐＨ領域で抗原と結合し、置換前の低分子化抗体と比較して、弱酸性ｐＨ領域での抗原結合能が低下していることを特徴とする低分子化抗体である。
　＜２＞　フレームワーク領域１、可変重鎖相補性決定領域１、フレームワーク領域２、可変重鎖相補性決定領域２、フレームワーク領域３、可変重鎖相補性決定領域３、及びフレームワーク領域４の順で連結された構造を有する低分子化抗体であって、前記フレームワーク領域３のアミノ酸配列が、配列番号１～３のいずれかに記載のアミノ酸配列のうち、少なくとも１つの極性アミノ酸がその他のアミノ酸に置換された配列であることを特徴とする低分子化抗体である。
　＜３＞　ラクダ科動物由来の重鎖抗体の可変領域（ＶＨＨ）である、前記＜１＞又は＜２＞に記載の低分子化抗体である。
　＜４＞　前記抗原がウイルス、ウイルス様粒子、ウイルスベクター、免疫グロブリン、アルブミン、又はそれらの誘導体である、前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載の低分子化抗体である。
　＜５＞　前記アルブミンがヒト血清アルブミンである前記＜４＞に記載の低分子化抗体である。
　＜６＞　前記フレームワーク領域３のアミノ酸配列が、配列番号１～３のいずれかに記載のアミノ酸配列のうち、第１５位～第２３位の少なくとも１つの極性アミノ酸がその他のアミノ酸に置換された配列である、前記＜１＞から＜５＞のいずれかに記載の低分子化抗体である。
　＜７＞　前記フレームワーク領域３のアミノ酸配列が、配列番号１～３のいずれかに記載のアミノ酸配列のうち、第１５位、第１６位、第１７位、第２０位、及び第２１位のうち、少なくとも１つの極性アミノ酸がその他のアミノ酸に置換された配列である、前記＜１＞から＜６＞のいずれかに記載の低分子化抗体である。
　＜８＞　前記＜１＞から＜７＞のいずれかに記載の低分子化抗体をコードする塩基配列を含むことを特徴とする核酸である。
　＜９＞　前記＜８＞に記載の核酸を含むことを特徴とするベクターである。
　＜１０＞　前記＜８＞に記載の核酸を含むことを特徴とする細胞である。
　＜１１＞　前記＜１＞から＜７＞のいずれかに記載の低分子化抗体の製造方法であって、前記＜１０＞に記載の細胞を培養する工程を含むことを特徴とする方法である。
　＜１２＞　水不溶性基材と、前記水不溶性基材に固定化された、前記＜１＞から＜７＞のいずれかに記載の低分子化抗体と、を有することを特徴とするアフィニティ担体である。
　＜１３＞　前記＜１２＞に記載のアフィニティ担体と、ウイルス、ウイルス様粒子、ウイルスベクター、免疫グロブリン、アルブミン、又はそれらの誘導体と、を接触させる接触工程を含むことを特徴とするウイルス、ウイルス様粒子、ウイルスベクター、免疫グロブリン、アルブミン、又はそれらの誘導体の製造方法である。
　＜１４＞　前記アフィニティ担体に結合したウイルス、ウイルス様粒子、ウイルスベクター、免疫グロブリン、アルブミン、又はそれらの誘導体をアフィニティ担体から分離する分離工程を含む、前記＜１３＞に記載ウイルス、ウイルス様粒子、ウイルスベクター、免疫グロブリン、アルブミン、又はそれらの誘導体の製造方法である。
　＜１５＞　前記＜１２＞に記載のアフィニティ担体と、ウイルス、ウイルス様粒子、ウイルスベクター、免疫グロブリン、アルブミン、又はそれらの誘導体を接触させる接触工程を含むことを特徴とする、ウイルス、ウイルス様粒子、ウイルスベクター、免疫グロブリン、アルブミン、又はそれらの誘導体の精製方法である。

Claims (15)

  1. 　フレームワーク領域１、可変重鎖相補性決定領域１、フレームワーク領域２、可変重鎖相補性決定領域２、フレームワーク領域３、可変重鎖相補性決定領域３、及びフレームワーク領域４の順で連結された構造を有する低分子化抗体であって、
    　前記フレームワーク領域３のアミノ酸配列のうち、少なくとも１つの極性アミノ酸がその他のアミノ酸に置換された配列であり、
    　中性ｐＨ領域で抗原と結合し、
    　置換前の低分子化抗体と比較して、弱酸性ｐＨ領域での抗原結合能が低下していることを特徴とする低分子化抗体。
  2. 　フレームワーク領域１、可変重鎖相補性決定領域１、フレームワーク領域２、可変重鎖相補性決定領域２、フレームワーク領域３、可変重鎖相補性決定領域３、及びフレームワーク領域４の順で連結された構造を有する低分子化抗体であって、
    　前記フレームワーク領域３のアミノ酸配列が、配列番号１～３のいずれかに記載のアミノ酸配列のうち、少なくとも１つの極性アミノ酸がその他のアミノ酸に置換された配列であることを特徴とする低分子化抗体。
  3. 　ラクダ科動物由来の重鎖抗体の可変領域（ＶＨＨ）である、請求項１又は２に記載の低分子化抗体。
  4. 　前記抗原がウイルス、ウイルス様粒子、ウイルスベクター、免疫グロブリン、アルブミン、又はそれらの誘導体である、請求項１から３のいずれかに記載の低分子化抗体。
  5. 　前記アルブミンがヒト血清アルブミンである請求項４に記載の低分子化抗体。
  6. 　前記フレームワーク領域３のアミノ酸配列が、配列番号１～３のいずれかに記載のアミノ酸配列のうち、第１５位～第２３位の少なくとも１つの極性アミノ酸がその他のアミノ酸に置換された配列である、請求項１から５のいずれかに記載の低分子化抗体。
  7. 　前記フレームワーク領域３のアミノ酸配列が、配列番号１～３のいずれかに記載のアミノ酸配列のうち、第１５位、第１６位、第１７位、第２０位、及び第２１位のうち、少なくとも１つの極性アミノ酸がその他のアミノ酸に置換された配列である、請求項１から６のいずれかに記載の低分子化抗体。
  8. 　請求項１から７のいずれかに記載の低分子化抗体をコードする塩基配列を含むことを特徴とする核酸。
  9. 　請求項８に記載の核酸を含むことを特徴とするベクター。
  10. 　請求項８に記載の核酸を含むことを特徴とする細胞。
  11. 　請求項１から７のいずれかに記載の低分子化抗体の製造方法であって、
    　請求項１０に記載の細胞を培養する工程を含むことを特徴とする方法。
  12. 　水不溶性基材と、前記水不溶性基材に固定化された、請求項１から７のいずれかに記載の低分子化抗体と、を有することを特徴とするアフィニティ担体。
  13. 　請求項１２に記載のアフィニティ担体と、ウイルス、ウイルス様粒子、ウイルスベクター、免疫グロブリン、アルブミン、又はそれらの誘導体と、を接触させる接触工程を含むことを特徴とするウイルス、ウイルス様粒子、ウイルスベクター、免疫グロブリン、アルブミン、又はそれらの誘導体の製造方法。
  14. 　前記アフィニティ担体に結合したウイルス、ウイルス様粒子、ウイルスベクター、免疫グロブリン、アルブミン、又はそれらの誘導体をアフィニティ担体から分離する分離工程を含む、請求項１３に記載ウイルス、ウイルス様粒子、ウイルスベクター、免疫グロブリン、アルブミン、又はそれらの誘導体の製造方法。
  15. 　請求項１２に記載のアフィニティ担体と、ウイルス、ウイルス様粒子、ウイルスベクター、免疫グロブリン、アルブミン、又はそれらの誘導体を接触させる接触工程を含むことを特徴とする、ウイルス、ウイルス様粒子、ウイルスベクター、免疫グロブリン、アルブミン、又はそれらの誘導体の精製方法。
PCT/JP2022/026123 2021-07-09 2022-06-29 低分子化抗体 WO2023282162A1 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2021114105 2021-07-09
JP2021-114105 2021-07-09

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2023282162A1 true WO2023282162A1 (ja) 2023-01-12

Family

ID=84801565

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2022/026123 WO2023282162A1 (ja) 2021-07-09 2022-06-29 低分子化抗体

Country Status (1)

Country Link
WO (1) WO2023282162A1 (ja)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010533004A (ja) * 2007-07-13 2010-10-21 バク アイピー ベスローテン フェンノートシャップ 哺乳動物ＩｇＧと結合する単一ドメイン抗原結合タンパク質
WO2012105833A1 (en) * 2011-02-01 2012-08-09 Bac Ip B.V. Antigen-binding protein directed against epitope in the ch1 domain of human igg antibodies
JP2018510842A (ja) * 2015-02-05 2018-04-19 中外製薬株式会社 イオン濃度依存的抗原結合ドメインを含む抗体、Ｆｃ領域改変体、ＩＬ−８に結合する抗体、およびその使用
WO2021039574A1 (ja) * 2019-08-23 2021-03-04 株式会社カネカ Ｏ結合型糖鎖修飾が抑制された重鎖抗体

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010533004A (ja) * 2007-07-13 2010-10-21 バク アイピー ベスローテン フェンノートシャップ 哺乳動物ＩｇＧと結合する単一ドメイン抗原結合タンパク質
WO2012105833A1 (en) * 2011-02-01 2012-08-09 Bac Ip B.V. Antigen-binding protein directed against epitope in the ch1 domain of human igg antibodies
JP2018510842A (ja) * 2015-02-05 2018-04-19 中外製薬株式会社 イオン濃度依存的抗原結合ドメインを含む抗体、Ｆｃ領域改変体、ＩＬ−８に結合する抗体、およびその使用
WO2021039574A1 (ja) * 2019-08-23 2021-03-04 株式会社カネカ Ｏ結合型糖鎖修飾が抑制された重鎖抗体

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6580650B2 (ja) フロースルー式での生物製剤からのタンパク質凝集体の除去
JP6471183B2 (ja) 生体分子の精製
US8674073B2 (en) Immunoglobulin affinity ligand
JP4831436B2 (ja) クロマトグラフィーリガンド
JP5893622B2 (ja) タンパク質精製
Li et al. Emerging biomaterials for downstream manufacturing of therapeutic proteins
TW201348247A (zh) 利用蛋白質ａ親和性層析之非人類抗體之新穎純化
JP6951341B2 (ja) 生体分子溶液を濃縮するためのタンジェンシャルフロー濾過プロセス
JP2017504585A (ja) アクリルアミド含有フィルターを使用したタンパク質分離
JP2016518318A (ja) タンパク質ａに基づくクロマトグラフィを使用するタンパク質純度を増加させる方法
WO2023282161A1 (ja) 低分子化抗体
JP2010051927A (ja) 限外濾過膜を用いた生体成分の分離方法およびモジュール、装置
JP2016501275A (ja) タンパク質沈殿のためのコポリマー
WO2023282162A1 (ja) 低分子化抗体
WO2021221050A1 (ja) 構造物及びその製造方法、それを用いた吸着体、並びに生体粒子の精製方法
JP7125933B2 (ja) 免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチドの回収精製法
JP6769695B2 (ja) 血漿からの免疫グロブリンの精製
KR101718301B1 (ko) 다단계 최종 여과
US20030023043A1 (en) Method of separating and purifying protein

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 22837578

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE