WO2023282161A1 - 低分子化抗体 - Google Patents

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adeno
amino acid
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翔太 平山
将弘 荒武
拓馬 末岡
妃佐子 八浦
正克 西八條
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株式会社カネカ
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    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof

Definitions

  • the present invention relates to minibodies.
  • Adeno-associated virus (AAV) vectors are important molecules in medical fields such as gene therapy. For its use, there is a demand for a purification technique for efficiently recovering AAV vectors from biological samples such as cell cultures.
  • solids such as cells and cell debris are first removed by filtration from the culture medium of transformed cells in which the virus is produced, and then purification is performed by ultracentrifugation, chromatography, or the like. is known (Patent Document 1, etc.).
  • Affinity chromatography is a technique that separates the target molecule from other impurities using a carrier in which a ligand such as a low-molecular-weight antibody that specifically binds to the target molecule is immobilized on a base material such as beads.
  • a ligand such as a low-molecular-weight antibody that specifically binds to the target molecule is immobilized on a base material such as beads.
  • affinity chromatography used for AAV vector purification, commercially available products such as Cytiva's Capto (registered trademark) AVB and Thermo Fisher Scientific's POROS (registered trademark) CaptureSelect (registered trademark) AAVX are known.
  • Non-Patent Document 1 there was a problem in efficiently purifying the AAV vector while maintaining the titer.
  • the object of the present invention is to solve the above-mentioned problems in the past and to achieve the following objects. That is, the present invention provides a low-molecular-weight antibody that dissociates from AAV in a weakly acidic solution, and an efficient method for producing AAV using the same.
  • a low-molecular-weight antibody that binds to adeno-associated virus (AAV), wherein the adeno-associated virus (AAV) and the low-molecular-weight antibody
  • the dissociation rate constant at pH 5.0 is 1 ⁇ 10 -2 (s -1 ) or more, and the dissociation rate constant at pH 5.0 is 10 times or more the dissociation rate constant at pH 7.0
  • a minibody characterized in that it binds to adeno-associated virus (AAV), wherein the amino acid sequence of variable heavy chain complementarity determining region 2 is the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, or In the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, at least one selected from the group consisting of serine at position 2 from the N-terminus and threonine at position 6 from the N-terminus is substituted with another amino acid, and variable heavy chain complementarity
  • the amino acid sequence of the determining region 3 is the amino acid sequence set
  • At least one of the amino acid sequence of the variable heavy chain complementarity determining region 2 or the amino acid sequence of the variable heavy chain complementarity determining region 3 is set forth in SEQ ID NO: 1 Among the amino acid sequences, at least one selected from the group consisting of the second serine and the sixth threonine from the N-terminus is substituted with another amino acid or the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2, the N-terminus and at least one selected from the group consisting of arginine and the fourth tryptophan from the N-terminus is an amino acid sequence substituted with another amino acid, or an adeno-associated virus (AAV) A low-molecular-weight antibody that binds, wherein the amino acid sequence of framework region 3 is arginine at position 15 and asparagine at position 16 from the N-terminus in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NOs: 3, 4, 36, or 37 An amino acid sequence in which at least one selected from the group consisting of acid, asparagine or isole
  • AAV adeno-associated virus
  • a low-molecular-weight antibody that can solve the above-mentioned conventional problems and achieve the above-mentioned objects, and that dissociates from AAV in a weakly acidic solution, and an efficient method for producing AAV using the same. can do.
  • FIG. 1 is a chromatogram of AAV adsorption/desorption by Carrier 1.
  • FIG. 2 is a chromatogram of AAV adsorption/desorption by carrier 2.
  • FIG. 3 is a chromatogram of AAV adsorption/desorption by carrier 3.
  • FIG. 4 is a chromatogram of AAV adsorption/desorption by carrier 4.
  • FIG. 5 is a chromatogram of AAV adsorption/desorption by carrier 7.
  • FIG. FIG. 6 is a chromatogram of AAV adsorption/desorption by carrier 9.
  • FIG. 7 is a chromatogram of AAV adsorption/desorption by carrier 6.
  • FIG. 8 is a chromatogram of AAV adsorption/desorption by carrier 8.
  • FIG. 9 shows the results of measurement of gene transfer efficiency of AAV2 eluted with pH 4.5 or pH 2.1 buffers.
  • FIG. 10 shows the results of measuring the gene transfer efficiency of AAV2 eluted with pH 4.5 or pH 2.1 buffers.
  • FIG. 11 is a chromatogram of AAV adsorption/desorption by the carrier 10.
  • FIG. 12 is a chromatogram of AAV adsorption/desorption by carrier 7.
  • the low-molecular-weight antibody is a low-molecular-weight antibody that binds to adeno-associated virus (AAV), (1)
  • the dissociation rate constant at pH 5.0 between the adeno-associated virus (AAV) and the low-molecular-weight antibody is 1 ⁇ 10 ⁇ 2 (s ⁇ 1 ) or more, and the dissociation rate at pH 5.0 a constant greater than or equal to 10 times the dissociation rate constant at pH 7.0;
  • the amino acid sequence of the variable heavy chain complementarity determining region 2 is the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, or from the second serine and the sixth threonine from the N-terminus in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1;
  • At least one selected from the group consisting of an amino acid sequence substituted with other amino acids, and the amino acid sequence of the variable heavy chain complementarity determining region 3 is the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2, or the amino acid sequence set forth in
  • At least one selected from the group consisting of N-terminal arginine and 4th tryptophan from the N-terminus in the amino acid sequence or the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in which at least one is substituted with other amino acids is substituted with other amino acids is a substituted amino acid sequence, or (3) the amino acid sequence of framework region 3 is arginine at position 15, aspartic acid at position 16, asparagine at position 17, or asparagine at position 17 from the N-terminus in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NOs: 3, 4, 36, or 37; An amino acid sequence in which at least one selected from the group consisting of isoleucine, glycine or lysine at position 19, asparagine at position 20, and tyrosine at position 23 is substituted with another amino acid.
  • the low-molecular-weight antibody dissociates from adeno-associated virus (AAV) in a weakly acidic solution.
  • Antibody is a general name that focuses on the function of immunoglobulins.
  • Immunoglobulins are glycoproteins produced by lymphocyte B cells, and have the function of recognizing and binding to molecules such as specific proteins. Immunoglobulins have the function of specifically binding to this specific molecule (antigen) and the function of detoxifying and removing antigen-bearing factors in cooperation with other biomolecules and cells.
  • Immunoglobulin G (hereinafter sometimes abbreviated as "IgG") is a monomeric immunoglobulin, composed of two heavy chains ( ⁇ chains) and two light chains, and has two antigen binding sites. has parts.
  • the region corresponding to the lower half vertical bar of the antibody "Y” is called the Fc region, and the upper half “V” is called the Fab region.
  • the Fc region has an effector function that elicits a reaction after an antibody binds to an antigen, and the Fab region has a function of binding to an antigen.
  • the Fab region and Fc region of the heavy chain are connected by a hinge region, and the proteolytic enzyme papain contained in papaya degrades this hinge region to cleave it into two Fab regions (fragments) and one Fc region.
  • a portion (domain) of the Fab region near the tip of the "Y” is called a variable region (V region) because various changes are observed in the amino acid sequence so that it can bind to various antigens.
  • the light chain variable region is called the VL region
  • the heavy chain variable region is called the VH region.
  • the Fab region and the Fc region other than the V region are regions that undergo relatively little change and are called constant regions (C regions).
  • the light chain constant region is called the CL region
  • the heavy chain constant region is called the CH region.
  • the CH region is further divided into three regions, CH1 to CH3.
  • the Fab region of the heavy chain consists of the VH region and CH1, and the Fc region of the heavy chain consists of CH2 and CH3.
  • the hinge portion is located between CH1 and CH2.
  • heavy-chain antibodies which are antibodies composed only of heavy chains without light chains.
  • Camelid-derived heavy-chain antibodies are distinguished from normal IgG antibodies (IgG1), which have light chains, and are termed IgG2, IgG3.
  • fish-derived heavy chain antibodies are called IgNAR (new antigen receptor).
  • a low-molecular-weight antibody in the present invention is an antibody fragment in which a portion of a full-length antibody (whole antibody, for example, whole IgG, etc.) is deleted, and is not particularly limited as long as it has the ability to bind to an antigen.
  • the minibodies of the present invention preferably do not have CH2 and CH3 domains.
  • the minibodies of the present invention preferably contain either or both of a heavy chain variable region (VH) and a light chain variable region (VL).
  • VH or VL amino acid sequence can contain additions, deletions and/or substitutions.
  • VH or VL, or a portion of both can be deleted as long as they bind to the antigen.
  • the low-molecular-weight antibody is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose.
  • Variable region V-NAR
  • Fab fragment antigen
  • Fab' single chain antibody
  • single chain antibody single chain antibody: scFv
  • diabody tribody
  • minibody minibody
  • those containing camelid-derived heavy chain antibody variable regions (VHH) or single chain antibodies (scFv) are preferable from the viewpoint of stability and production efficiency.
  • variable region (VHH) of the camelid-derived heavy chain antibody is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose. Examples include those designed based on heavy chain antibodies and produced by expressing VHH genes in host cells, and those chemically synthesized based on amino acid sequences.
  • the camelid is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the intended purpose.
  • the host cell in which the VHH gene is expressed is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose. Examples include bacteria such as E. coli, fungi such as yeast, animal cells, and plant cells.
  • the method of immunizing the camelid with the target to be adsorbed is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose.
  • the method of producing VHH genes by expressing them in host cells is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose. and the method described in .
  • the single-chain antibody is obtained by linking the VH and VL of the antibody.
  • VH and VL are joined via a linker, preferably a peptide linker (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1988 85:5879).
  • the peptide linker is not particularly limited. For example, any single-chain peptide consisting of about 3 to 25 residues can be used as a linker.
  • the scFv is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include those produced by expressing scFv genes in host cells, and those produced chemically based on amino acid sequences.
  • the host cell in which the scFv gene is expressed is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose. Examples include bacteria such as E. coli, fungi such as yeast, animal cells, and plant cells.
  • Minibodies in the present invention preferably include single domain antibodies.
  • the single domain antibody is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose, but preferably includes the variable region (VHH) of the camelid-derived heavy chain antibody.
  • VHH variable region
  • the minibodies in the present invention may be chimerized or humanized.
  • the molecular weight of the low-molecular-weight antibody is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose. 30,000 or less is particularly preferred, and 20,000 or less is most preferred.
  • the affinity of minibodies for AAV can be quantified by the "dissociation rate constant".
  • the dissociation rate constant of the adeno-associated virus (AAV) and the low-molecular-weight antibody at pH 5.0 is preferably 1 ⁇ 10 ⁇ 2 (s ⁇ 1 ) or more, more preferably 2 ⁇ 10 ⁇ 2 (s ⁇ 1 ). 3 ⁇ 10 ⁇ 2 (s ⁇ 1 ) or more is more preferable, 5 ⁇ 10 ⁇ 2 (s ⁇ 1 ) or more is particularly preferable, and 1 ⁇ 10 ⁇ 1 (s ⁇ 1 ) or more is particularly preferable.
  • the dissociation rate constant at pH 5.0 is preferably 10 times or more, more preferably 15 times or more, and even more preferably 20 times or more, the dissociation rate constant at pH 7.0.
  • the dissociation rate constant is measured as follows.
  • the low-molecular-weight antibody is first biotinylated to obtain a biotinylated low-molecular-weight antibody.
  • Dulbecco's phosphate-buffered saline (PBS Sigma-Aldrich) was added so that the concentration of the low-molecular-weight antibody converted using the absorbance of the low-molecular-weight antibody and the extinction coefficient of bovine serum albumin (BSA) was 500 ⁇ g/mL.
  • BSA bovine serum albumin
  • 12.6 ⁇ L of EZ-LinkTM NHS-PEG4-Biotin solution dissolved in PBS to 1 mM was added to the solution diluted with , reacted at 4° C. for 4 hours, and passed through a 0.2 ⁇ m filter.
  • the resulting solution is diluted 5-fold with PBS to obtain a biotinylated low-molecular-weight antibody solution.
  • a biosensor Octet RED 384 system (Sartorius) using biolayer interferometry is used to analyze the affinity of the low-molecular-weight antibody to AAV2. Immobilization of the biotinylated low-molecular-weight antibody to the sensor chip is performed. Immobilization on a sensor chip (Octet (registered trademark) Streptavidin (SA) Biosensor, Sartorius) is performed using the affinity between the biotin molecule attached to the low-molecular-weight antibody and streptavidin on the sensor chip.
  • SA Streptavidin
  • Octet (registered trademark) Kinetics Buffer 10X (Sartorius) is diluted 10-fold with PBS to prepare Kinetics Buffer. After immersing the sensor chip in Kinetics Buffer at a shaking speed of 1,000 rpm for 60 seconds at a temperature of 30°C, the sensor chip was immersed in a biotinylated low-molecular-weight antibody solution at a shaking speed of 1,000 rpm for 5 minutes at a temperature of 30°C.
  • the immobilization reaction is carried out until the In order to block excess streptavidin on the sensor chip, the sensor chip is immersed in a 25 ⁇ g/mL biocytin solution dissolved in PBS at a shaking speed of 1,000 rpm for 5 minutes at a temperature of 30°C.
  • the sensor chip is immersed in Kinetics Buffer at a shaking speed of 1,000 rpm for 200 seconds at a temperature of 30°C.
  • the immobilized minibodies are allowed to bind to AAV2 empty particles (EP).
  • a dissociation solution to measure the dissociation reaction of AAV2.
  • the sensor chip is immersed in various dissociation solutions under conditions of a shaking speed of 1,000 rpm, a temperature of 30° C., and a temperature of 30° C. for 500 seconds.
  • Fitting analysis is performed on the obtained binding/dissociation curve using a 1:1 or 2:1 binding model between the miniaturized antibody and the VP3 protein in AAV2, and the dissociation rate constant (koff) for AAV2 is calculated.
  • fitting analysis is performed using a 2:1 binding model, and among the calculated koff, the larger value is taken as the dissociation rate constant between the low-molecular-weight antibody and AAV.
  • the dissociation rate constant is calculated by the fitting analysis with the 1:1 binding model.
  • the fitting analysis uses the attached software (Data Analysis) and follows the parameters below.
  • the structure of the minibodies is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose. 2 (FR2), variable heavy chain complementarity determining region 2 (CDR2), framework region 3 (FR3), variable heavy chain complementarity determining region 3 (CDR3), and framework region 4 (FR4). structure is preferred.
  • the framework region and the variable heavy chain complementarity determining region may be defined based on the three-dimensional structure or may be defined by alignment by BLAST based on the annotation of the heavy chain of the IgG antibody (ACS Synth. Biol. 2018 7: 2480-2484), and in the present application, the latter is defined by BLAST alignment based on the heavy chain annotation of IgG antibodies (Med Microbiol Immunol 2009 198: 157-174).
  • the amino acid sequence of the variable heavy chain complementarity determining region 2 is the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, or in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, the second serine from the N-terminus and 6 is an amino acid sequence in which at least one selected from the group consisting of threonine is substituted with another amino acid, and the amino acid sequence of variable heavy chain complementarity determining region 3 is the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2, or SEQ ID NO: 2, wherein at least one amino acid sequence selected from the group consisting of N-terminal arginine and N-terminal tryptophan is substituted with another amino acid, and the variable heavy chain complementarity determination is performed.
  • amino acids before substitution amino acids before mutation introduction
  • proline amino acids other than cysteine
  • amino acids before substitution amino acids before mutation
  • amino acids before mutation more preferably amino acids excluding proline, glycine, and cysteine
  • amino acids before substitution amino acids before mutation
  • proline amino acids before mutation
  • amino acids before mutation amino acids before mutation
  • amino acids before mutation amino acids before mutation
  • amino acids before mutation excluding proline, serine, glycine, threonine, aspartic acid, methionine, and cysteine
  • Amino acids are more preferred, and alanine, glutamic acid, glutamine, and tryptophan are particularly preferred.
  • the amino acid sequence of the variable heavy chain complementarity determining region 1 of the minibody is not particularly limited as long as it satisfies any one of the above (1) to (3), and can be appropriately selected according to the purpose.
  • an amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 5 to 7, 52, or 53 an amino acid sequence having high sequence identity with the amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 5 to 7, 52, or 53, and the like.
  • the amino acid sequence having high sequence identity with the amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 5 to 7, 52, or 53 is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose.
  • the sequence identity with the amino acid sequence according to any one of -7, 52, or 53 is preferably 50% or more, more preferably 60% or more, even more preferably 70% or more, particularly preferably 80% or more, and 90 % or more is most preferable.
  • the amino acid sequence of the variable heavy chain complementarity determining region 2 of the minibody is not particularly limited as long as it satisfies any one of the above (1) to (3), and can be appropriately selected according to the purpose.
  • the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, 31, 32, or 50 an amino acid sequence having high sequence identity with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, 31, 32, or 50, and the like.
  • the amino acid sequence having high sequence identity with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NOS: 1, 31, 32, or 50 is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose.
  • the sequence identity with the amino acid sequence described in 32 or 50 is preferably 50% or more, more preferably 60% or more, even more preferably 70% or more, particularly preferably 80% or more, most preferably 90% or more.
  • the amino acid sequence of the variable heavy chain complementarity determining region 3 of the minibody is not particularly limited as long as it satisfies any one of the above (1) to (3), and can be appropriately selected according to the purpose.
  • the amino acid sequence having high sequence identity with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NOS: 2, 33, 51, or 54 is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose.
  • the sequence identity with the amino acid sequence described in 51 or 54 is preferably 50% or more, more preferably 60% or more, even more preferably 70% or more, particularly preferably 80% or more, most preferably 90% or more.
  • the amino acid sequence of the framework region 3 of the minibody is not particularly limited as long as it satisfies any one of the above (1) to (3), and can be appropriately selected according to the purpose. , 4, 36, or 37, amino acid sequences having high sequence identity with the amino acid sequences of SEQ ID NOS: 3, 4, 36, or 37, and the like.
  • the amino acid sequence having high sequence identity with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NOS: 3, 4, 36, or 37 is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose.
  • the sequence identity with the amino acid sequence described in 36 or 37 is preferably 50% or more, more preferably 60% or more, even more preferably 70% or more, particularly preferably 80% or more, most preferably 90% or more.
  • the amino acid sequence of the minibody before substitution is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose.
  • the amino acid sequence having high sequence identity with the amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NOS: 8 to 10, 34, or 35 is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose.
  • the sequence identity with the amino acid sequence according to any one of -10, 34, or 35 is preferably 70% or more, more preferably 80% or more, even more preferably 90% or more, particularly preferably 95% or more, and 99 % or more is most preferable.
  • the adeno-associated virus is a virus belonging to the Parvoviridae family that contains linear single-stranded DNA in the capsid.
  • the serotypes of the adeno-associated virus include type 1 AAV (AAV1), type 2 AAV (AAV2), type 3 AAV (AAV3), type 4 AAV (AAV4), type 5 AAV (AAV5), type 6 AAV (AAV6 ), type 7 AAV (AAV7), type 8 AAV (AAV8), type 9 AAV (AAV9), and type 10 AAV (AAV10).
  • type 2 AAV (AAV2) is preferred.
  • the adeno-associated virus may be an adeno-associated virus capsid or a vector containing an adeno-associated virus gene.
  • the low-molecular-weight antibody binds to adeno-associated virus (AAV) in a neutral pH range and dissociates from adeno-associated virus (AAV) in a weakly acidic pH range. can be used as a modified antibody.
  • the low-molecular-weight antibody binds to adeno-associated virus (AAV) in the neutral pH range, and has reduced AAV-binding ability in the weakly acidic pH range compared to the low-molecular-weight antibody before substitution.
  • AAV adeno-associated virus
  • the neutral pH range is pH 6.0 or more and less than 8.0
  • the weakly acidic pH range is pH 3.5 or more and less than 6.0.
  • nucleic acid includes a base sequence encoding the minibody or the miniantibody for adeno-associated virus (AAV) weakly acidic elution, and can further include other elements.
  • AAV adeno-associated virus
  • the low-molecular-weight antibody or the low-molecular-weight adeno-associated virus (AAV) weakly acidic elution antibody is as described above.
  • the vector contains the nucleic acid and can contain other elements.
  • the nucleic acid is as described above.
  • the cell contains the nucleic acid and can contain other elements.
  • the nucleic acid is as described above.
  • the cells are not particularly limited and can be appropriately selected depending on the intended purpose, and include bacteria such as Escherichia coli, fungi such as yeast, animal cells, and plant cells. Said cell may be said host cell.
  • the method for producing the low-molecular-weight antibody or low-molecular-weight antibody for weakly acidic elution antibody includes the step of culturing the cell, and may further include other steps.
  • the cells are as described above.
  • the culture is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose, and examples include a method of seeding the cells in a culture medium and allowing the cells to stand, stir or shake.
  • the affinity carrier has a water-insoluble substrate and the low-molecular-weight antibody or the low-molecular-weight adeno-associated virus (AAV) weakly acidic elution antibody immobilized on the water-insoluble substrate, It can have other elements as well. That is, in the affinity carrier, the water-insoluble base and the low-molecular-weight antibody or the low-molecular-weight adeno-associated virus (AAV) weakly acidic elution antibody may be directly connected, or the water-insoluble group The material and the low-molecular-weight antibody or the low-molecular-weight adeno-associated virus (AAV) weakly acidic eluting antibody may be connected via other elements.
  • the low-molecular-weight antibody or the low-molecular-weight adeno-associated virus (AAV) weakly acidic elution antibody is as described above.
  • the density (ligand density) of the low-molecular-weight antibody or the low-molecular-weight adeno-associated virus (AAV) weakly acidic elution antibody in the affinity carrier (ligand density) is not particularly limited, and can be appropriately selected according to the purpose. 1 to 20 mg/mL is preferred, 1 to 10 mg/mL is more preferred, and 2 to 10 mg/mL is even more preferred.
  • the ligand density is measured as follows.
  • the filtrate from the immobilization of the ligand on the water-insoluble substrate is recovered, passed through a 0.2 ⁇ m filter, and then the absorbance is measured to calculate the ligand density of the ligand immobilized on the water-insoluble substrate.
  • the ligand density is calculated from the absorbance of the filtrate and a calibration curve prepared using the absorbance of the low-molecular-weight antibody and the absorbance coefficient of BSA.
  • the water-insoluble substrate is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include water-insoluble fibers, beads, membranes (including hollow fibers), and monoliths. Among these, water-insoluble fibers or beads are preferred.
  • the lower limit of the thickness of the water-insoluble fiber is not particularly limited, and can be appropriately selected according to the purpose. Preferably, 0.12 mm or more is more preferable.
  • the upper limit of the thickness of the water-insoluble fiber is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose. It is preferably 0.30 mm or less, and more preferably 0.30 mm or less.
  • the lower limit of the basis weight of the water - insoluble fiber is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose. is more preferred.
  • the upper limit of the basis weight of the water - insoluble fiber is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose. 2 or less is more preferable, 80 g/m 2 or less is even more preferable, and 70 g/m 2 or less is particularly preferable.
  • the lower limit of the bulk density of the water-insoluble fiber is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose. m 3 or more is preferable, 60 kg/m 3 or more is more preferable, and 70 kg/m 3 or more is even more preferable.
  • the upper limit of the bulk density of the water - insoluble fiber is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose. is more preferable, and 300 kg/m 3 or less is even more preferable.
  • the bulk density is a value obtained by measuring the weight per 1 m 3 of the water-insoluble fiber.
  • the shape of the water-insoluble fiber is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose. Examples include circular, square, triangular, and bale-shaped.
  • the surface of the water-insoluble fiber may be modified by graft polymerization, polymer coating, treatment with chemicals such as alkali or acid, plasma treatment, or the like.
  • the graft polymerization is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include a graft polymerization method in which electron beam irradiation is performed.
  • a water-insoluble fiber is irradiated with an electron beam in advance to generate radicals, and then a radically polymerizable compound is applied to the water-insoluble fiber in which the generated species is generated.
  • a so-called pre-irradiation method in which the polymerization of the graft-polymerizable compound is promoted by post-polymerization, and a radical-polymerizable compound is applied to the water-insoluble fiber, which is then irradiated with an electron beam to generate radicals, followed by post-polymerization.
  • both the pre-irradiation method and the simultaneous irradiation method can be employed.
  • a film is laminated on the surface of the water-insoluble fiber after the radically polymerizable compound is applied to the water-insoluble fiber until the post-polymerization is completed. is preferred.
  • volatilization of the radically polymerizable compound can be prevented, the graft polymerization is started uniformly, and deactivation of radicals by oxygen in the air is suppressed by shutting off the air.
  • the surface of the water-insoluble fiber is sealed with a film even when the electron beam is irradiated, and the water-insoluble fiber and the radically polymerizable compound are shielded from oxygen in the air. Oxidation of water-insoluble fibers due to is less likely to occur.
  • a polymer film having a thickness of 0.01 to 0.20 mm is used, which has an appropriate thickness according to the penetrating power of the electron beam used.
  • the material of the film is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include polyesters such as polyethylene terephthalate and polyolefins. Among these, polyethylene terephthalate is preferable. In particular, in the case of the simultaneous irradiation method, a polyethylene terephthalate film with low polymer radical generation efficiency and low oxygen permeability by electron beam irradiation is suitable.
  • water-insoluble fibers are irradiated with an electron beam to generate radicals (polymer radicals, etc.) that induce a polymerization reaction.
  • radicals polymer radicals, etc.
  • the ambient temperature during electron beam irradiation the lower the temperature, the higher the radical generation efficiency, but normal room temperature may be used.
  • the irradiation conditions of the electron beam in the case of the pre-irradiation method are not particularly limited, and can be appropriately selected according to the purpose.
  • 100 to 2000 kilovolts hereinafter abbreviated as “kV”), more preferably 120 to 300 kV and a current of 1 to 100 mA, are appropriately determined according to the thickness of the water-insoluble fiber, the target graft ratio, and the like.
  • the irradiation dose of the electron beam may be appropriately determined in consideration of the target graft rate and the deterioration of the physical properties of the water-insoluble fiber due to irradiation, and is usually about 10 to 300 kilograys (hereinafter abbreviated as "kGy"). and preferably 10 to 200 kGy. If the irradiation dose is less than 10 kGy, the generation of radicals required for a sufficient amount of graft polymerization does not occur. I don't like it because it happens.
  • the irradiation atmosphere in the case of the pre-irradiation method is preferably an inert gas atmosphere such as nitrogen gas, but may be an air atmosphere. However, in an air atmosphere, oxygen in the air may oxidize the water-insoluble fibers.
  • a radically polymerizable compound is applied to the water-insoluble fibers after the electron beam irradiation.
  • the water-insoluble fiber is immersed in a bath of a radically polymerizable compound solution from which dissolved oxygen has been removed by passing nitrogen gas through it, or is passed through the bath of the radically polymerizable compound solution for a predetermined period of time. is sufficiently provided with a radically polymerizable compound.
  • “Immersion” in the present invention means that the water-insoluble fibers are brought into contact with the radically polymerizable compound solution. Therefore, various coating methods can be used as a method of applying the radically polymerizable compound to the water-insoluble fibers. Among them, impregnation coating, comma direct coating, comma reverse coating, kiss coating, gravure coating, etc. are preferable because they can be coated efficiently.
  • the water-insoluble fiber to which the radically polymerizable compound has been applied is removed from the solution bath. At that time, it is preferable to laminate a film on the surface of the water-insoluble fiber.
  • the water-insoluble fiber is sheet-like or fibrous
  • the water-insoluble fiber to which the radically polymerizable compound solution has been applied is sandwiched between two films and brought into close contact.
  • the graft reaction is further promoted by allowing the water-insoluble fiber and the radically polymerizable compound to react in a space sealed by laminating the film.
  • laminating in the present invention means bringing the water-insoluble fiber and the film into contact with each other.
  • the water-insoluble fibers taken out of the solution tank are retained in a post-polymerization tank at a predetermined temperature for a predetermined period of time, thereby promoting the graft polymerization of the radically polymerizable compound (post-polymerization).
  • the post-polymerization temperature at this time is 0°C to 130°C, more preferably 40°C to 70°C. This promotes the graft polymerization reaction between the water-insoluble fiber and the radically polymerizable compound. After that, the grafted fiber can be obtained by washing and drying.
  • the post-polymerization atmosphere is preferably an inert gas atmosphere such as nitrogen gas, but may be an air atmosphere when the post-polymerization is performed with the film laminated.
  • the solution is immersed in a bath of the radically polymerizable compound solution from which dissolved oxygen has been removed by passing nitrogen gas through it, or is allowed to stay for a predetermined time by immersing and passing through the bath.
  • a sufficient amount of the radically polymerizable compound is applied to the insoluble fibers. After that, it is taken out from the solution bath and irradiated with an electron beam.
  • it is preferable to laminate a film on the surface of the water-insoluble fiber and irradiate it with an electron beam in this state.
  • the acceleration voltage in the simultaneous irradiation method may be appropriately determined depending on the type of polymer material, the total thickness of the water-insoluble fiber to which the radically polymerizable compound solution is applied and the laminated film, and the target graft ratio. , an acceleration voltage of about 100 to 2000 kV is appropriate.
  • the irradiation dose of the electron beam may be the same as in the case of the pretreatment method.
  • the atmosphere during electron beam irradiation is preferably an inert gas atmosphere such as nitrogen or helium, but if a film is laminated on the surface of the water-insoluble fiber, the irradiation atmosphere will not affect the graft polymerization, so economic efficiency should be considered. Therefore, in-air irradiation is suitable.
  • the post-polymerization atmosphere is preferably an inert gas atmosphere such as nitrogen gas, but an air atmosphere may be used when the post-polymerization is performed in a laminated state of the film.
  • the radically polymerizable compound used in the present invention is a compound that forms bonds with polymer radicals generated in water-insoluble fibers by electron beam irradiation.
  • unsaturated compounds having an acidic group such as acrylic acid, methacrylic acid, itaconic acid, methacrylsulfonic acid, and styrenesulfonic acid, their esters, unsaturated carboxylic acid amides such as acrylamide and methacrylamide, and terminally glycidyl unsaturated compounds having groups, hydroxyl groups, amino groups or formyl groups, unsaturated organic phosphoric acid esters such as vinyl phosphonates, basic methacrylic acid esters such as quaternary ammonium salts and tertiary ammonium salts, fluoroacrylates, acrylonitrile, etc.
  • a composite grafted fiber can be obtained in which the graft chain is a copolymer of at least two kinds of radically polymerizable compounds.
  • acrylic monomers from the viewpoint of graft ratio. Furthermore, from the viewpoint of reactivity with ligands having amino groups, hydroxyl groups, thiol groups, etc., acrylic monomers having carboxy groups or epoxy groups at the molecular ends are preferred, more preferably acrylic acid, methacrylic acid, and methacrylic acid. It is at least one selected from the group consisting of glycidyl (hereinafter abbreviated as "GMA").
  • GMA glycidyl
  • the above radically polymerizable compound may be a diluted solution using water, an organic solvent such as a lower alcohol, or a mixed solution thereof as a solvent.
  • concentration of the radically polymerizable compound in this diluted solution varies depending on the desired grafting ratio, but it can be prepared in the range of 1 to 70% by volume.
  • the generation of a homopolymer may be suppressed by adding a metal salt of copper or iron to a diluted solution of the radically polymerizable compound.
  • the lower limit of the concentration of the radically polymerizable compound in the solution is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the intended purpose. , more preferably 5% by weight or more, and particularly preferably 10% by weight or more.
  • the upper limit of the concentration of the radically polymerizable compound in the solution is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose. % by weight or less is more preferable, and 40% by weight or less is particularly preferable.
  • the graft ratio is improved.
  • concentration of the emulsifier in the solvent it is preferable to adjust the concentration of the emulsifier in the solvent to be in the range of 0.1 to 5% by weight.
  • the emulsifier is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the intended purpose.
  • polysorbate is preferable.
  • Polysorbate 20 which has a high degree of toughness, is more preferred.
  • the graft ratio of the graft polymerization reaction is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose, but is preferably 50% or more.
  • the material of the water-insoluble fiber is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose.
  • examples include polyolefin, polypropylene, maleic anhydride polypropylene, modified polypropylene, polyethylene, cellulose, regenerated cellulose, cellulose acetate, Cellulose diacetate, cellulose triacetate, ethyl cellulose, cellulose acetate, polyethylene terephthalate (PET), polybutylene terephthalate (PBT), acrylic resin, polycarbonate, polyester, polyacrylonitrile, polyamide, polystyrene, brominated polystyrene, polyalkyl(meth)acrylate , polyvinyl chloride, polychloroprene, polyurethane, polyvinyl alcohol, polyvinyl acetate, polysulfone, polyethersulfone, polybutadiene, butadiene-acrylonitrile copolymer, styrene-butadiene copolymer,
  • polyolefin-based or cellulose-based materials are preferable, polyolefin-based materials are more preferable, and polypropylene is even more preferable, from the viewpoint of good reactivity in electron beam graft polymerization.
  • the lower limit of the average fiber diameter of the water-insoluble fibers is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose. is preferred, 0.4 ⁇ m or more is more preferred, and 0.5 ⁇ m or more is even more preferred.
  • the upper limit of the average fiber diameter of the water-insoluble fibers is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose. The following is more preferable, and 3 ⁇ m or less is particularly preferable. Those having an average fiber diameter of more than 15 ⁇ m are not preferable because of low refining performance.
  • the lower limit of the average pore size of the water-insoluble fibers is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the intended purpose. is preferred, 1.0 ⁇ m or more is more preferred, and 1.5 ⁇ m or more is even more preferred.
  • the upper limit of the average pore size of the water-insoluble fiber is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose. is more preferable, and 10 ⁇ m or less is particularly preferable.
  • the water-insoluble fiber is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose. It may be a nonwoven fabric, a woven fabric or a knitted fabric. is preferred.
  • the method for producing the nonwoven fabric is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the intended purpose.
  • a thermal bond method, a chemical bond method, a needle punch method, a spunlace method (water flow entanglement method), a stitch bond method, a steam jet method, and the like can be mentioned.
  • the meltblowing method, the electrospinning method, the flash spinning method, the papermaking method, and the like are preferable because ultrafine fibers can be obtained.
  • the melt blowing method is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose.
  • a thermoplastic resin melted in an extruder is blown out in a fibrous form from a melt blowing die at a high temperature and high speed with an air flow, and fibrous.
  • There is a method of obtaining a non-woven fabric of self-adhesive ultrafine fibers with no binder by causing entanglement and fusion between fibers by accumulating stretched resin on a conveyor.
  • the fiber diameter, basis weight, fiber orientation, and fiber dispersibility of the nonwoven fabric can be adjusted. can be controlled. Furthermore, it is possible to control the thickness and average pore diameter of the nonwoven fabric by heat press processing, tenter processing, or the like.
  • the beads are not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose, but epoxidized beads or NHS (N-hydroxysuccinimide) esterified beads are preferred.
  • the average particle size of the beads is not particularly limited, and can be appropriately selected according to the intended purpose. If the volume average particle diameter is 20 ⁇ m or more, it is possible to keep the back pressure low when filling the device. On the other hand, if the volume average particle diameter is 1000 ⁇ m or less, the surface area increases and the adsorption amount of the target compound increases.
  • the volume average particle diameter is more preferably 30 ⁇ m or more, more preferably 40 ⁇ m or more, more preferably 250 ⁇ m or less, still more preferably 125 ⁇ m or less, even more preferably 100 ⁇ m or less, and even more preferably 60 ⁇ m or less.
  • the volume average particle size of the porous beads can be determined by measuring the particle size of 100 randomly selected porous beads.
  • the particle size of each porous bead can be measured by taking a micrograph of each porous bead, saving it as electronic data, and using particle size measurement software (e.g., "Image Pro Plus” manufactured by MediaCybernetics).
  • particle size measurement software e.g., "Image Pro Plus” manufactured by MediaCybernetics.
  • the porous beads are preferably crosslinked with a polyfunctional compound according to a conventional method in order to improve strength and the like.
  • the material for the beads is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the intended purpose.
  • examples include polysaccharides such as cellulose, agarose, dextran, starch, pullulan, chitosan and chitin; Synthetic polymers such as poly(meth)acrylic acid esters, polyacrylamides, and polyvinyl alcohol, and crosslinked products thereof; glasses such as silica glass, borosilicate glass, optical glass, and soda glass;
  • the surface of a substrate made of a synthetic polymer having no functional groups, such as polystyrene or a styrene-divinylbenzene copolymer may be coated with a polymeric material having reactive functional groups such as hydroxyl groups.
  • Such polymeric materials for coating include hydroxyethyl methacrylate, graft copolymers such as copolymers of a monomer having a polyethylene oxide chain and other polymerizable monomers having a reactive functional group, and the like. can be mentioned. These may be used individually by 1 type, and may use 2 or more types together.
  • Commercially available products include porous cellulose gel GCL2000, Sephacryl (registered trademark) S-1000 obtained by covalently cross-linking allyl dextran and methylenebisacrylamide, methacrylate-based carrier Toyopearl (registered trademark), and agarose-based cross-linked carrier.
  • Sepharose CL4B which is a cellulose-based crosslinked carrier Cellufine (registered trademark)
  • POROS (registered trademark) 50OH which is a carrier obtained by coating a styrene-divinylbenzene copolymer with a polymer material.
  • POROS (registered trademark) 50OH is preferable because it has a preferable particle size range and because it has a reactive functional group and facilitates modification reaction.
  • the monolith is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the intended purpose, but a carboximidazole-activated monolith is preferred.
  • the average pore diameter of the monolith is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose. 0 ⁇ m or more is more preferable, and 1.5 ⁇ m or more is even more preferable.
  • the upper limit of the average pore size of the monolith is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose. Preferably, 10 ⁇ m or less is particularly preferable.
  • the monolith is constructed from a polyvinyl monomer and a monovinyl monomer, and the types of the polyvinyl monomer and the monovinyl monomer are not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose.
  • the polyvinyl monomer include divinylbenzene and divinylnaphthalene.
  • alkylene dimethacrylates alkylene dimethacrylates, hydroxyalkylene dimethacrylates, hydroxyalkylene diacrylates, oligoethylene glycol diacrylates, vinyl polycarboxylic acids, vinyl ethers, pentaerythritol di-, tri- or tetramethacrylate or pentaerythritol di-, tri-, or tetraacrylate, trimethylolpropane trimethylacrylate or trimethylolpropane acrylate, alkylenebisacrylamides or alkylenebismethacrylamides, Ethylene dimethacrylate, and mixtures thereof.
  • Examples of the monovinyl monomer include styrene, ring-substituted styrene (wherein the substituents are chloromethyl group, alkyl group having up to 18 carbon atoms, hydroxyl group, t-butyloxygarbonyl group, halogen group, nitro group, amino (including protected hydroxyl or amino groups), vinyl naphthalene, acrylates, methacrylates, glycidyl methacrylate, vinyl acetate, and pyrrolidone, and mixtures thereof.
  • Examples of commercially available products include CIMmic (registered trademark) CDI-0.1 Disk (Carboxy imidazole) (manufactured by Sartorius) constructed from ethylene dimethacrylate and glycidyl methacrylate.
  • the other elements are not particularly limited and can be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include spacers.
  • the affinity carrier containing the spacer is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the intended purpose. etc.
  • the functional group possessed by the spacer is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose. Examples thereof include an amino group, a hydroxy group, an epoxy group and a carboxy group. Spacers having these functional groups may be used singly or in combination of two or more. Among these, an epoxy group is preferable from the viewpoint of stability, reactivity, and ease of connection with a ligand.
  • the spacer is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose. Examples include those containing polymers, monomers, dimers, trimers, and tetramers. Among these, those containing polymers are preferred. Said polymer may be a copolymer.
  • the polymer is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose.
  • examples thereof include hydrophilic polymers and hydrophobic polymers.
  • those containing a hydrophilic polymer are preferable because they can be handled with an aqueous solvent and suppress non-specific hydrophobic action between the protein and the spacer.
  • the hydrophilic polymer is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose. Examples include those containing polyamines and polysaccharides.
  • the polyamine is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the intended purpose. , piperazine, 2,5-dimethylpiperazine, isophoronediamine, 4,4′-dicyclohexylmethanediamine, 1,4-cyclohexanediamine and other diamines; diethylenetriamine, dipropylenetriamine, triethylenetetramine and other polyamines; hydrazine, N ,N'-dimethylhydrazine, 1,6-hexamethylenebishydrazine; and dihydrazides such as succinic acid dihydrazide, adipic acid dihydrazide, glutaric acid dihydrazide, sebacic acid dihydrazide, and isophthalic acid dihydrazide. These may be used individually by 1 type, and may use 2 or more types together. Among these, those containing polyethylenimine or polyallylamine are preferable because molecules with different molecular weights are readily available.
  • the polysaccharides are not particularly limited and can be appropriately selected depending on the intended purpose. etc. These may be used individually by 1 type, and may use 2 or more types together. Among these, chitosan is preferable because it contains an amino group.
  • the lower limit of the molar mass of the polymer is not particularly limited, and can be appropriately selected according to the purpose. Preferably, 10,000 g/mol or more is more preferable, and 60,000 g/mol or more is particularly preferable.
  • the upper limit of the molar mass of the polymer is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose. 000,000 g/mol or less is more preferable, 500,000 g/mol or less is even more preferable, and 200,000 g/mol or less is particularly preferable.
  • the polymer may be a polymer having a branched chain or a linear polymer, but a polymer having a branched chain is preferable from the standpoint of bioparticle adsorption.
  • the method for producing the affinity carrier includes a step of connecting a water-insoluble substrate and a low-molecular-weight antibody or the low-molecular-weight adeno-associated virus (AAV) weakly acidic elution antibody, and further includes other steps. be able to.
  • the water-insoluble substrate and the low-molecular-weight antibody or the low-molecular-weight adeno-associated virus (AAV) weakly acidic elution antibody are as described above.
  • connection between the water-insoluble substrate and the low-molecular-weight antibody or the low-molecular-weight adeno-associated virus (AAV) weakly acidic elution antibody is not particularly limited, and can be appropriately selected according to the purpose.
  • the ligand may be attached to the carrier by conventional coupling methods utilizing amino, carboxyl, or thiol groups present on the ligand.
  • the carrier is reacted with cyanogen bromide, epichlorohydrin, diglycidyl ether, tosyl chloride, tresyl chloride, hydrazine, sodium periodate, or the like to activate the carrier (or to introduction of a reactive functional group), a coupling reaction with a compound to be immobilized as a ligand, and immobilization;
  • a fixing method by adding a reagent having a plurality of functional groups in the molecule, such as aldehyde, and condensing and cross-linking can be mentioned.
  • the operation for connecting the water-insoluble substrate and the low-molecular-weight antibody or the low-molecular-weight adeno-associated virus (AAV) weakly acidic eluting antibody is not particularly limited, and may be performed according to the purpose.
  • a method of adding the low-molecular-weight antibody or the low-molecular-weight adeno-associated virus (AAV) weakly acidic eluting antibody to the water-insoluble base material and mixing by inversion, or the water-insoluble base material is not particularly limited, and may be performed according to the purpose.
  • a method of adding the low-molecular-weight antibody or the low-molecular-weight adeno-associated virus (AAV) weakly acidic eluting antibody to the water-insoluble base material and mixing by inversion, or the water-insoluble base material.
  • the time for the inversion mixing is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose. From the above, 24 hours or less is more preferable, and 8 hours or more and 24 hours or less is particularly preferable.
  • the method for producing the affinity carrier containing the spacer is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose. , or the step of connecting the adeno-associated virus (AAV) weakly acidic low-molecular-weight antibody for elution.
  • the spacer, the water-insoluble base material, and the low-molecular-weight antibody or the low-molecular-weight adeno-associated virus (AAV) weakly acidic elution antibody are as described above.
  • the order of connecting the water-insoluble substrate to one end of the spacer and connecting the low-molecular-weight antibody or the low-molecular-weight antibody for weakly acidic elution of adeno-associated virus (AAV) to the other end of the spacer is
  • AAV adeno-associated virus
  • connection of the water-insoluble base material to one end of the spacer is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose. mentioned.
  • the time for the inversion mixing is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose. From the above, 24 hours or less is more preferable, and 8 hours or more and 24 hours or less is particularly preferable.
  • connection of the low-molecular-weight antibody to the other end of the spacer or the low-molecular-weight adeno-associated virus (AAV) weakly acidic elution antibody is not particularly limited, and can be appropriately selected according to the purpose.
  • a low-molecular-weight antibody or the low-molecular-weight adeno-associated virus (AAV) weakly acidic eluting antibody is added to a water-insoluble base material, and the mixture is mixed by inversion.
  • the time for the inversion mixing is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose. From the above, 24 hours or less is more preferable, and 8 hours or more and 24 hours or less is particularly preferable.
  • the shape of the device for filling the affinity carrier is not particularly limited, and a disk shape, cylindrical shape, plate shape, or the like can be selected.
  • a disk shape or a cylindrical shape is preferable from the viewpoint of realizing uniform liquid passage.
  • the method for producing the adeno-associated virus (AAV) includes a contacting step of contacting the affinity carrier with the adeno-associated virus (AAV), and may further include other steps.
  • the affinity carrier and the adeno-associated virus (AAV) are as described above. Through the contacting step, the affinity carrier and the adeno-associated virus (AAV) can be bound or adsorbed.
  • the contact is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose.
  • Examples include a method of mixing the affinity carrier and the adeno-associated virus (AAV), a method of Examples include a method in which a solution containing adeno-associated virus (AAV) is passed through.
  • AAV adeno-associated virus
  • the material of the column is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose. Examples thereof include glass, resins such as polypropylene and acrylic, and metals such as stainless steel.
  • the other steps are not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose.
  • the adeno-associated virus (AAV) bound to the affinity carrier is separated from the affinity carrier. and a separation step to be performed.
  • the separation step the adeno-associated virus (AAV) can be separated, dissociated, or eluted from the affinity carrier.
  • the separation is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose.
  • a separation buffer (elution buffer) is passed through a column filled with the affinity carrier to which adeno-associated virus (AAV) is bound.
  • AAV adeno-associated virus
  • the separation buffer is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose. Buffers with a pH of 4.5 or higher are particularly preferred.
  • the gene transfer efficiency of the adeno-associated virus (AAV) separated in the separation step 24 hours after separation is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose. ), it is preferably 50% or more, more preferably 60% or more, still more preferably 70% or more, and particularly preferably 80% or more.
  • the gene transfer efficiency of the adeno-associated virus (AAV) separated in the separation step 24 hours after separation was determined by an antibody that binds to the adeno-associated virus (AAV) with a buffer of pH 1.7 to 2.5.
  • Adeno-associated virus (AAV) isolated from an affinity carrier having an antibody that dissociates from adeno-associated virus (AAV) using a buffer of pH 2.1 is more than 1.2 times as efficient as gene transfer after 24 hours of isolation. is preferred, 1.5 times or more is more preferred, 2 times or more is even more preferred, and 2.5 times or more is particularly preferred.
  • Cytiva's Capto (registered trademark) AVB can be preferably used.
  • the method for purifying adeno-associated virus (AAV) includes a contacting step of contacting the affinity carrier with adeno-associated virus (AAV), and may further include other steps. Said affinity carrier, said adeno-associated virus (AAV), said contacting, and said other steps are as described above.
  • the method for inhibiting reduction of the infectivity titer of adeno-associated virus (AAV) includes a contacting step of contacting the affinity carrier with adeno-associated virus (AAV), and may further include other steps. Said affinity carrier, said adeno-associated virus (AAV), said contacting, and said other steps are as described above.
  • ⁇ Production Example 1 Production of water-insoluble fiber (nonwoven fabric 1)> Using polypropylene as a material, a nonwoven fabric having an average fiber diameter of 0.56 ⁇ m, a basis weight of 15 g/m 2 and a thickness of 0.11 mm was produced by a melt blow method. This was subjected to graft polymerization using GMA as a monomer. The radically polymerizable compound solution was prepared by mixing GMA/polysorbate 20/water at a weight percentage of 8/2/90, and nitrogen gas was passed through the mixture to remove dissolved oxygen.
  • the produced nonwoven fabric was irradiated with an electron beam at room temperature in a nitrogen gas atmosphere under the conditions of an acceleration voltage of 250 kV and an irradiation dose of 50 kGy.
  • the nonwoven fabric after electron beam irradiation was immersed in a radically polymerizable compound solution and heated in a reaction tank at 50° C. for 40 minutes to accelerate the polymerization reaction. Thereafter, the nonwoven fabric was washed with water at room temperature and then dried to obtain a water-insoluble fiber (nonwoven fabric 1) with a graft ratio of 70%.
  • ⁇ Production Example 2 Production of water-insoluble fiber disc> Using a punch, the nonwoven fabric 1 produced in Production Example 1 was punched into a circular shape with a diameter of 5 mm or 25 mm to produce water-insoluble fiber discs (nonwoven fabric disc 1, nonwoven fabric disc 2) for packing into columns.
  • ⁇ Comparative Example 1 Preparation of anti-AAV2-VHH antibody> An immunization experiment was performed by the method described in Example 6 of WO2020/067418 pamphlet. Antibody gene clusters were obtained from the blood of the immunized alpaca by the method described in Example 1 of JP-A-2015-119637, and a phage library of anti-AAV2-VHH antibodies was prepared. Screening of anti-AAV2-VHH antibodies from the phage library was performed by the biopanning method described in Example 1 of JP-A-2015-119637 using AAV2 empty particles (EP) as antigens. An EP solution of AAV2 was prepared by the method described in Example 3 of WO2020/067418.
  • the phage-infected E. coli after biopanning was serially diluted and cultured on 2YT agar medium (1.6% tryptone, 1.0% yeast extract, 2.0% agar) containing 100 ⁇ g/mL ampicillin and 2% glucose.
  • a single colony was cultured overnight at 37° C. in 3 mL of 2YT medium containing 100 ⁇ g/mL ampicillin and 2% glucose.
  • 30 ⁇ L of the overnight culture medium was added to 5 mL of 2YT medium containing 100 ⁇ g/mL ampicillin, and cultured at 37° C. and 300 rpm for 1 hour.
  • the binding activity to AAV2 was evaluated by the method described in International Publication No. 2020/067418, and multiple clones with high binding activity were selected.
  • primer 1 SEQ ID NO: 11
  • primer 2 SEQ ID NO: 12
  • a linearized vector was prepared by PCR using pET-28b (manufactured by Merck) as a template and primer 3 (SEQ ID NO: 13) and primer 4 (SEQ ID NO: 14).
  • Anti-AAV-VHH antibody 1 expression vector and anti-AAV-VHH antibody were prepared by In-Fusion (registered trademark) HD cloning kit (manufactured by Takara Bio Inc.) using the VHH antibody nucleic acid sequence and linearized vector solution prepared by PCR, respectively.
  • SOC medium (20 g / L bacto tryptone (manufactured by Becton, Dickinson and Company (BD)), 5 g / L bacto yeast extract (manufactured by BD), 10 mM sodium chloride, 2.5 mM potassium chloride, 10 mM magnesium sulfate, 100 ⁇ L of 10 mM magnesium chloride, 20 mM glucose) was added, and recovery culture was performed at 37° C. for 1 hour.
  • BD Becton, Dickinson and Company
  • LBK selective agar plate (10 g / L polypeptone (manufactured by BD), 5 g / L bacto yeast extract (manufactured by BD), 10 g / L sodium chloride, 50 ⁇ g / L kanamycin, 15 g / L agarose), 37 ° C.
  • Strains growing in static culture for 16 hours were selected, and 3 types of VHH ligand-expressing strains were obtained.
  • 2 mL of 2YT medium (1.6% (w/v) polypeptone (Nihon Pharmaceutical Co., Ltd.), 1% (w/v) yeast extract (BD ), 0.5% (w/v) sodium chloride) and precultured at 37° C.
  • Anti-AAV2-VHH antibodies were purified from the obtained VHH expression culture medium by cation exchange chromatography using AKTA (registered trademark) york 25 (Cytiva).
  • the purified anti-AAV-VHH antibody was concentrated with a centrifugal ultrafiltration unit OMEGA Membrane 1K (manufactured by PALL) to obtain a purified VHH antibody (VHH ligand 1) with an amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 and an amino acid sequence of SEQ ID NO: 9.
  • a purified VHH antibody (VHH ligand 2) and a purified VHH antibody (VHH ligand 3) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 were obtained.
  • Example 1 Preparation of anti-AAV2-VHH antibody mutant> (1) Preparation of plasmid expressing anti-AAV2-VHH antibody mutant 1 Using the DNA expressing the VHH ligand 1 as a template, PCR using the 1stPCR-1 primer combination shown in Table 1 (1stPCR-1) and PCR using the 1stPCR-2 primer combination (1stPCR- 2) was performed. Subsequently, using a mixture of the amplified fragment obtained in the 1stPCR-1 and the amplified fragment obtained in the 1stPCR-2 as a template, primer 5 (SEQ ID NO: 15) and primer 18 (SEQ ID NO: 28) were used.
  • mutant gene VHH ligand 4 mutant gene VHH ligand 5, mutant gene VHH ligand 6, mutant gene VHH ligand 7, with NdeI upstream and Bpu1102I restriction enzyme sites added downstream.
  • mutant gene VHH ligand 8, and mutant gene VHH ligand 9 were prepared.
  • VHH ligands 4 to 9 expressed by the mutant gene VHH ligand 4, mutant gene VHH ligand 5, mutant gene VHH ligand 6, mutant gene VHH ligand 7, mutant gene VHH ligand 8, and mutant gene VHH ligand 9 are all VHH A single amino acid substitution variant of ligand 1.
  • the VHH ligand 4 and the VHH ligand 5 are linked to the variable heavy chain complementarity determining region 2 (CDR2)
  • the VHH ligand 6 and the VHH ligand 7 are linked to the framework region 3 (FR3)
  • the VHH ligand 8 and the VHH ligand 9 is a VHH ligand in which one of the amino acids present in the variable heavy chain complementarity determining region 3 (CDR3) is mutated.
  • the CDR2 amino acid sequence has an amino acid sequence in which the second serine from the N-terminus in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is substituted with alanine
  • the VHH ligand 5 has a CDR2
  • the amino acid sequence has an amino acid sequence in which the 6th threonine from the N-terminus in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is substituted with alanine
  • the VHH ligand 6 has an amino acid sequence of FR3 in which the second asparagine from the N-terminus in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 is substituted with alanine
  • the VHH ligand 7 has an amino acid sequence of FR3.
  • the amino acid sequence has an amino acid sequence in which arginine at position 15 from the N-terminus is substituted with alanine in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:3.
  • the VHH ligand 8 has a CDR3 amino acid sequence in which the N-terminal arginine in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is replaced with alanine
  • the VHH ligand 9 has a CDR3 amino acid sequence of , having an amino acid sequence in which the fourth tryptophan from the N-terminus is substituted with alanine in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:2.
  • DH5 ⁇ was transformed using the mutant heavy chain antibody expression vector constructed above, the resulting transformant was cultured in 1.5 mL of kanamycin-containing TB medium, and various plasmids were obtained from the resulting cells.
  • VHH ligand 10 expression vector 0.1 ⁇ L of the VHH ligand 10 expression vector prepared above and 1 ⁇ L of Escherichia coli competent cell line BL21 (DE3) (manufactured by Merck) were mixed on ice and allowed to stand for 20 minutes. Warmed to 42° C. for 45 seconds and chilled on ice.
  • SOC medium (20 g / L bacto tryptone (manufactured by Becton, Dickinson and Company (BD)), 5 g / L bacto yeast extract (manufactured by BD), 10 mM sodium chloride, 2.5 mM potassium chloride, 10 mM magnesium sulfate, 100 ⁇ L of 10 mM magnesium chloride, 20 mM glucose) was added, and recovery culture was performed at 37° C. for 1 hour.
  • BD Becton, Dickinson and Company
  • LBK selective agar plate (10 g / L polypeptone (manufactured by BD), 5 g / L bacto yeast extract (manufactured by BD), 10 g / L sodium chloride, 50 ⁇ g / L kanamycin, 15 g / L agarose), 37 ° C., A strain that grew in static culture for 16 hours was selected to obtain a VHH ligand 10-expressing strain.
  • VHH ligand 10 expressed by the VHH ligand 10-expressing strain is a single amino acid substitution mutant of VHH ligand 2, and a VHH in which one of the amino acids present in framework region 3 (FR3) is mutated. is a ligand.
  • the VHH ligand 10 has an amino acid sequence in which the FR3 amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 is substituted with alanine for arginine at position 15 from the N-terminus.
  • VHH ligand 11-expressing strain was obtained in the same manner as in Example 1 (2) except that the DNA expressing VHH ligand 3 was used instead of the DNA expressing VHH ligand 2 as a template.
  • the VHH ligand 11 expressed by the mutant gene VHH ligand 11 is a single amino acid substitution mutant of VHH ligand 3, and a VHH in which one of the amino acids present in framework region 3 (FR3) is mutated. is a ligand.
  • the VHH ligand 11 has an amino acid sequence in which arginine at position 15 from the N-terminus in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 is substituted with alanine.
  • Adeno-associated virus (AAV2) production by animal cells and preparation of AAV2 pretreatment solution An AAV2 production plasmid expressing VENUS (GenBank: ACQ43955.1), which is a variant of the fluorescent protein GFP, was produced using an AAV vector production kit (“AAVpro (registered trademark) Helper Free System” manufactured by Takara Bio Inc.). . Cultured HEK293 cells were transfected with a plasmid prepared using a transfection reagent (“Polyethyleneimine MAX” manufactured by Polysciences, MW: 40,000) to produce AAV2. After culturing, the cells were detached and the cell culture medium was collected.
  • AAV2-producing cells obtained above were suspended in Dulbecco's phosphate-buffered saline (manufactured by Sigma-Aldrich, hereinafter abbreviated as "PBS") containing 0.1% Triton X-100, and placed on ice. Stirred for 20 minutes to disrupt cells. To the obtained cell lysate, 7.5 v/v% 1 M magnesium chloride aqueous solution and 0.1 v/v% 250 kU/mL KANEKA Endonuclease (manufactured by Kaneka Corporation) were added and allowed to stand at 37°C for 30 minutes.
  • PBS Dulbecco's phosphate-buffered saline
  • Triton X-100 0.1% Triton X-100
  • ⁇ Production Example 4 Preparation of crude purified AAV2 solution>
  • the AAV2 pretreatment solution prepared in Production Example 3 was purified by cation exchange chromatography with reference to Non-Patent Document (Journal of Virological Methods 2007 140:183-192).
  • POROS (registered trademark) 50HS (manufactured by Thermo) was packed in Tricorn (registered trademark) 10/150 (manufactured by Cytiva) to form a column for cation exchange purification.
  • the following solutions A to F were prepared and passed through a 0.2 ⁇ m filter before use.
  • liquid F was passed through to retain AAV2 on the column carrier, followed by washing with liquid A, liquid B, and liquid A in that order, and AAV2 was eluted with liquid C. After completion of elution, the column was washed with D solution and E solution. The degree of purification of crudely purified AAV2 was confirmed by SDS-PAGE, and the amount of AAV2 in the solution was quantified by quantitative PCR (qPCR).
  • ⁇ Test Example 1 Measurement of dissociation rate constant of VHH antibody> Biotinylation of the VHH antibody was performed for use in measuring dissociation rate constants.
  • EZ-Link dissolved in PBS to 1 mM was added to a solution diluted with PBS so that the VHH antibody concentration was 500 ⁇ g/mL, which was converted using the absorbance of the VHH ligand and the extinction coefficient of bovine serum albumin (BSA).
  • BSA bovine serum albumin
  • NHS-PEG4-Biotin solution (12.6 ⁇ L) was added, reacted at 4° C. for 4 hours, and passed through a 0.2 ⁇ m filter. The resulting solution was diluted 5-fold with PBS to obtain a biotinylated VHH antibody solution.
  • VHH antibodies VHH ligand 1, VHH ligands 4 to 9
  • AAV2 Affinities of VHH antibodies (VHH ligand 1, VHH ligands 4 to 9) to AAV2 were analyzed using a biosensor Octet RED 384 system (Sartorius) utilizing biolayer interferometry. Immobilization of biotinylated VHH antibodies to sensor chips was performed. Immobilization on a sensor chip (Octet (registered trademark) Streptavidin (SA) Biosensor, Sartorius) was performed using the affinity between the biotin molecule attached to the VHH antibody and streptavidin on the sensor chip. First, Octet (registered trademark) Kinetics Buffer 10X (Sartorius) was diluted 10-fold with PBS to prepare Kinetics Buffer.
  • the sensor chip After immersing the sensor chip in Kinetics Buffer at a shaking speed of 1,000 rpm for 60 seconds and a temperature of 30°C, the sensor chip was immersed in a biotinylated VHH antibody solution at a shaking speed of 1,000 rpm for 5 minutes at a temperature of 30°C to reach a steady state. The immobilization reaction was continued until In order to block excess streptavidin on the sensor chip, the sensor chip was immersed in a 25 ⁇ g/mL biocytin solution dissolved in PBS at a shaking speed of 1,000 rpm for 5 minutes at a temperature of 30°C. Next, the sensor chip was immersed in Kinetics Buffer at a shaking speed of 1,000 rpm for 200 seconds and a temperature of 30°C.
  • the immobilized VHH antibody was then allowed to bind to the AAV2 EP.
  • the sensor chip was immersed in various dissociation solutions (compositions are shown in Table 3) under conditions of a shaking speed of 1,000 rpm, a temperature of 30° C. for 500 seconds.
  • the resulting binding-dissociation curve was subjected to fitting analysis using a 1:1 or 2:1 binding model between the VHH ligand and the VP3 protein in AAV2, and the dissociation rate constant (koff) for AAV2 was calculated.
  • a fitting analysis is performed using a 2:1 binding model, and among the calculated koff, the larger value is taken as the dissociation rate constant between the low-molecular-weight antibody and AAV.
  • the dissociation rate constant is calculated by the fitting analysis with the 1:1 binding model. Attached software (Data Analysis) was used for fitting analysis, and the following parameters were followed.
  • Example 2 Production of Carrier 1> (1) Functionalization of bead base material 1.8 mL of ultrapure water and 0.8 mL of 2N sodium hydroxide aqueous solution are added to 3.0 mL-gel of wet volume of POROS (registered trademark) 50OH (manufactured by Thermo Scientific). 6 mL was added and mixed by inversion for 30 minutes. 3 mL of 1,4-butanediol diglycidyl ether (manufactured by Nagase) was added and mixed by inversion at 37° C. for 2 hours. After the reaction, the beads were transferred to a glass filter and washed with pure water to obtain epoxidized beads 1.
  • POROS registered trademark
  • 50OH manufactured by Thermo Scientific
  • the beads were transferred to a glass filter and washed with the above carbonate buffer. The filtrate at this time was collected, and the absorbance was measured to calculate the (immobilization yield) of the VHH ligand. Subsequently, 0.2 mol/L phosphate buffer (pH 8.0) containing 0.1 mol/L NaCl and 10% v/v thioglycerol was used to seal the epoxy groups remaining in the washed beads. was added and mixed by inversion at 37° C. for 6 hours. After the reaction, the beads were transferred to a glass filter and washed with pure water and 20% ethanol to obtain carrier 1, which is a VHH-immobilized bead carrier. The ligand density was measured to be 4.7 mg/mL-gel (Table 5).
  • Example 3 Preparation of carrier 2> (1) Immobilization of polyethyleneimine (PEI) spacer to nonwoven fabric 1 PEI solution (manufactured by Alfa Aesar, Mw: 70,000, branched chain) was added to the nonwoven fabric disk 1 obtained in Production Example 2, and the mixture was heated at 37°C. and mixed by inversion for 16 hours. After the reaction, the nonwoven fabric was transferred to a glass filter and washed with pure water to obtain a nonwoven fabric with PEI spacers immobilized thereon (PEI spacer-immobilized nonwoven fabric 1).
  • PEI spacer-immobilized nonwoven fabric PEI spacer-immobilized nonwoven fabric 1
  • Carrier 3 which is a VHH-immobilized bead carrier, was prepared in the same manner as in Example 2 except that VHH ligand 7 was used instead of VHH ligand 8. The ligand density was measured to be 4.9 mg/mL-gel (Table 5).
  • Carrier 4 which is a VHH-immobilized non-woven fabric carrier, was prepared in the same manner as in Example 3 except that VHH ligand 7 was used instead of VHH ligand 8. The ligand density was measured and found to be 9.9 mg/mL-column (Table 5).
  • Carrier 5 which is a VHH-immobilized bead carrier, was prepared in the same manner as in Example 2 except that VHH ligand 9 was used instead of VHH ligand 8. The ligand density was measured to be 2.6 mg/mL-gel (Table 5).
  • Carrier 6 which is a VHH-immobilized nonwoven fabric carrier, was produced in the same manner as in Example 5, except that nonwoven fabric disc 2 was used instead of nonwoven fabric disc 1 .
  • the ligand density was measured to be 3.0 mg/mL-gel (Table 5).
  • Carrier 7 which is a VHH-immobilized bead carrier, was produced in the same manner as in Example 2, except that VHH ligand 1 produced in Comparative Example 1 was used instead of VHH ligand 8.
  • the ligand density was measured to be 4.9 mg/mL-gel (Table 5).
  • Carrier 8 which is a VHH-immobilized non-woven fabric carrier, was prepared in the same manner as in Example 7 except that VHH ligand 1 produced in Comparative Example 1 was used instead of VHH ligand 8.
  • the ligand density was measured to be 4.2 mg/mL-gel (Table 5).
  • ⁇ Production Example 9 Packing Carrier 7 into Column> 0.2 mL-gel of carrier 7 prepared in Comparative Example 2 was measured in wet volume and packed into a Tricorn (registered trademark) 5/20 column (manufactured by Cytiva).
  • ⁇ Test Example 2 Purification of AAV2 by carrier 1> Using the column of Carrier 1 prepared in Production Example 5, the crude AAV2 solution prepared in Production Example 4 was purified by affinity chromatography. The following solutions A to G were prepared and filtered through a 0.2 ⁇ m filter before use.
  • a column filled with carrier 1 prepared in Production Example 5 was connected to AKTA (registered trademark) Avant 25 (Cytiva), the flow rate was set to 0.2 mL/min, washed with pure water, and equilibrated with liquid A. . After that, liquid G was passed through to retain AAV2 on the column carrier, followed by washing with liquid A, and AAV2 was eluted with liquid B. After completion of elution, the column was washed with C solution, A solution, D solution, A solution and E solution in this order. After washing, the column was replaced with F solution and stored in a refrigerator. A chromatogram during purification is shown in FIG.
  • the amount of AAV2 contained in each fraction was quantified by quantitative PCR (qPCR) using a QuantStudio3 real-time PCR system (manufactured by Thermo Fisher Scientific), and a buffer of pH 4.5 was used for the amount of AAV2 contained in the total recovered solution.
  • the amount of AAV2 in the elution peak in the elution step was calculated as the recovery rate at pH 4.5.
  • the amount of AAV2 in the elution peak in the elution step using the pH 2.1 buffer relative to the amount of AAV2 contained in the total recovered solution was calculated as the recovery rate at pH 2.1. Table 6 shows the results.
  • ⁇ Test Example 3 Purification of AAV2 by Carrier 2> A crude purified AAV2 solution was purified by affinity chromatography in the same manner as in Test Example 2, except that the column filled with carrier 2 produced in Production Example 6 was used instead of the column of bead carrier 1. The chromatogram obtained is shown in FIG. Recovered AAV2 at pH 4.5 and recovered AAV2 at pH 2.1 were calculated in the same manner as in Test Example 2. Table 6 shows the results.
  • ⁇ Test Example 4 Purification of AAV2 by carrier 3> A crude purified AAV2 solution was purified by affinity chromatography in the same manner as in Test Example 2, except that the column filled with carrier 3 produced in Production Example 7 was used instead of the column of bead carrier 1. The resulting chromatogram is shown in FIG. Recovered AAV2 at pH 4.5 and recovered AAV2 at pH 2.1 were calculated in the same manner as in Test Example 2. Table 6 shows the results.
  • ⁇ Test Example 5 Purification of AAV2 with Carrier 4> A crude purified AAV2 solution was purified by affinity chromatography in the same manner as in Test Example 2, except that the column filled with carrier 4 produced in Production Example 8 was used instead of the column of bead carrier 1. The chromatogram obtained is shown in FIG. Recovered AAV2 at pH 4.5 and recovered AAV2 at pH 2.1 were calculated in the same manner as in Test Example 2. Table 6 shows the results.
  • ⁇ Test Example 6 Purification of AAV2 with Carrier 7> A crude purified AAV2 solution was purified by affinity chromatography in the same manner as in Test Example 2, except that the column filled with carrier 7 produced in Production Example 9 was used instead of the column of bead carrier 1. The resulting chromatogram is shown in FIG. Recovered AAV2 at pH 4.5 and recovered AAV2 at pH 2.1 were calculated in the same manner as in Test Example 2. Table 6 shows the results.
  • ⁇ Test Example 7 Purification of AAV2 by Carrier 9> A crude purified AAV2 solution was purified by affinity chromatography in the same manner as in Test Example 2, except that the column filled with carrier 9 produced in Production Example 10 was used instead of the column of bead carrier 1. The resulting chromatogram is shown in FIG. Recovered AAV2 at pH 4.5 and recovered AAV2 at pH 2.1 were calculated in the same manner as in Test Example 2. Table 6 shows the results.
  • VHH ligand 10-immobilized carrier column Production of VHH ligand 10-immobilized carrier column> VHH ligand 10 obtained in Example 1 was immobilized on a carrier. A HiTrap (registered trademark) NHS-activated HP (manufactured by Cytiva) column was used for immobilization onto the carrier. The following solutions A to F were prepared and passed through a 0.2 ⁇ m filter before use.
  • HiTrap registered trademark
  • NHS-activated HP manufactured by Cytiva
  • VHH ligand 10 was diluted with A solution to 5 mg/mL. Liquid B cooled in an ice bath was passed through the column at 6 column volumes at a flow rate of 1 mL/min to remove isopropanol in the column. Immediately thereafter, one column volume of VHH ligand 10 solution diluted with A solution was added, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 30 minutes.
  • Liquid C was passed through 6 column volumes, liquid D was passed through 6 column volumes, and liquid C was passed through 6 column volumes, and left standing at room temperature for 20 minutes.
  • Liquid D was passed through 6 column volumes, liquid C was passed through 6 column volumes, solution D was passed through 6 column volumes, and liquid E was passed through to prepare a VHH ligand 10-immobilized carrier column.
  • VHH ligand 11-immobilized carrier column Preparation of VHH ligand 11-immobilized carrier column> A VHH ligand 11-immobilized carrier column was prepared in the same manner as in Production Example 11, except that VHH ligand 11 was used instead of VHH ligand 10.
  • VHH ligand 2-immobilized carrier column Production of VHH ligand 2-immobilized carrier column> A VHH ligand 2-immobilized carrier column was prepared in the same manner as in Production Example 11 except that VHH ligand 2 obtained in Comparative Example 1 was used instead of VHH ligand 10.
  • VHH ligand 3-immobilized support column Production of VHH ligand 3-immobilized support column> A VHH ligand 3-immobilized carrier column was prepared in the same manner as in Production Example 11 except that VHH ligand 3 obtained in Comparative Example 1 was used instead of VHH ligand 10.
  • ⁇ Test Example 8 AAV2 Purification by VHH Ligand 10-Immobilized Carrier Column> Using the VHH ligand 10-immobilized carrier column prepared in Production Example 11, the AAV2 crude purified liquid prepared in Production Example 4 was purified. The amount of AAV recovered in each elution step of the anti-AAV-VHH antibody column immobilized with the anti-AAV-VHH antibody before mutation was calculated using a buffer of pH 4.5 or pH 2.1.
  • Solution B was eluted with 5 column volumes, followed by a linear gradient of 20 column volumes from solution B to solution C, and then solution C was passed through 10 column volumes to elute AAV remaining in the column.
  • the amount of AAV2 contained in each fraction was quantified by quantitative PCR (qPCR) using a QuantStudio3 real-time PCR system (manufactured by Thermo Fisher Scientific), and contained in all eluates in the elution step using solution B and solution C.
  • the amount of AAV2 in the elution peak in the elution step using the pH 4.5 buffer relative to the amount of AAV2 was calculated as the recovery rate at pH 4.5. The results are shown in Table 7.
  • ⁇ Test Example 9 AAV2 Purification by VHH Ligand 11-Immobilized Carrier Column> AAV2 crude purified solution was purified by affinity chromatography in the same manner as in Test Example 8 except that the VHH ligand 11-immobilized carrier column produced in Production Example 12 was used instead of the VHH ligand 10-immobilized carrier column.
  • the amount of AAV2 at the elution peak in the elution step using a pH 4.5 buffer with respect to the amount of AAV2 contained in the entire eluate in the elution steps using solution B and solution C was adjusted to pH 4.5. was calculated as the recovery rate of The results are shown in Table 7.
  • ⁇ Test Example 10 AAV2 Purification by VHH Ligand 2-Immobilized Carrier Column>
  • the crude AAV2 solution was purified by affinity chromatography in the same manner as in Test Example 8, except that the VHH ligand 2-immobilized carrier column produced in Production Example 13 was used instead of the column of Bead Carrier 1.
  • the amount of AAV2 in the elution peak in the elution step using a pH 4.5 buffer relative to the amount of AAV2 contained in the total eluate in the elution step was calculated as the recovery rate at pH 4.5. was shown in Table 7.
  • ⁇ Test Example 11 Purification of AAV2 by VHH ligand 3-immobilized carrier column> A crude AAV2 purified solution was purified by affinity chromatography in the same manner as in Test Example 8, except that the VHH ligand 3-immobilized carrier column produced in Production Example 14 was used instead of the column of Bead Carrier 1. In the same manner as in Test Example 8, the amount of AAV2 in the elution peak in the elution step using a pH 4.5 buffer relative to the amount of AAV2 contained in the total eluate in the elution step was calculated as the recovery rate at pH 4.5. was shown in Table 7.
  • ⁇ Test Example 12 AAV Recovery Test Using Carrier 5> 0.01 mL-gel of the carrier 5 prepared in Example 6 was measured in a wet volume, to which the AAV2 crude purified liquid (about 1.5 ⁇ 10 12 vg) prepared in Production Example 4 was added and left for 16 hours. AAV2 was adsorbed to the carrier by inversion mixing.
  • a washing solution (20 mM Tris-hydrochloric acid, 0.5 M sodium chloride, pH 8.0) was added to wash the carrier, and then an eluate (citric acid (100 mmol / L), sodium chloride (500 mmol / L) , pH 4.5) was added to elute AAV2 from the carrier, and then an eluent (citric acid (100 mmol/L), sodium chloride (500 mmol/L), pH 2.1) was added to elute AAV2 from the carrier. .
  • the amount of AAV contained in each solution was quantified by quantitative PCR (qPCR) using a QuantStudio3 real-time PCR system (manufactured by Thermo Fisher Scientific).
  • the amount of AAV2 in the elution peak in the elution step using the pH 4.5 buffer relative to the amount of AAV2 contained in the total recovered solution was calculated as the recovery rate at pH 4.5.
  • the amount of AAV2 at the elution peak in the elution step using the pH 2.1 buffer relative to the amount of AAV2 contained in the total recovered solution was calculated as the recovery rate at pH 2.1. Table 8 shows the results.
  • ⁇ Test Example 13 Purification of AAV2 from AAV2 pretreatment solution using Carrier 4>
  • the AAV2 pretreatment liquid was purified by affinity chromatography in the same manner as in Test Example 5 except that the AAV2 pretreatment liquid prepared in Production Example 3 was used instead of the AAV2 crude purification liquid. Recovered AAV2 at pH 4.5 and recovered AAV2 at pH 2.1 were calculated in the same manner as in Test Example 2. The results are shown in Table 9.
  • ⁇ Test Example 14 Purification of AAV2 from AAV2 pretreatment solution using carrier 9>
  • the AAV2 pretreatment liquid was purified by affinity chromatography in the same manner as in Test Example 7, except that the AAV2 pretreatment liquid prepared in Production Example 3 was used instead of the AAV2 crude purification liquid. Recovered AAV2 at pH 4.5 and recovered AAV2 at pH 2.1 were calculated in the same manner as in Test Example 2. The results are shown in Table 9.
  • ⁇ Production Example 16 Packing Carrier 8 into Column>
  • the carrier 8 prepared in Comparative Example 3 was stacked one by one, and 1.0 mL-column portion was filled in a column prepared by cutting.
  • ⁇ Test Example 15 Purification of AAV2 with Carrier 6> Using the column of carrier 6 prepared in Production Example 15, the crude AAV2 solution prepared in Production Example 4 was purified by affinity chromatography. The following solutions A to G were prepared and filtered through a 0.2 ⁇ m filter before use.
  • a column filled with carrier 6 prepared in Production Example 15 is connected to AKTA (registered trademark) Avant 25 (Cytiva), the flow rate is set to 6.0 mL / min, washed with pure water, and equilibrated with A solution. bottom. After that, liquid G was passed through to retain AAV2 on the column carrier, the flow rate was set to 1.0 mL/min, the column was washed with liquid A, and AAV2 was eluted with liquid B. After completion of elution, the column was washed with C solution, A solution, D solution, A solution and E solution in this order. After washing, the column was replaced with F solution and stored in a refrigerator. A chromatogram during purification is shown in FIG.
  • the amount of AAV2 contained in each fraction was quantified by quantitative PCR (qPCR) using a QuantStudio3 real-time PCR system (Thermo Fisher Scientific), and the amount of AAV2 contained in the total recovered solution was eluted using a pH 4.5 buffer.
  • the amount of AAV2 in the elution peak in the process was calculated as the recovery at pH 4.5.
  • the amount of AAV2 at the elution peak in the elution step using the pH 2.1 buffer relative to the amount of AAV2 contained in the total recovered solution was calculated as the recovery rate at pH 2.1. Table 10 shows the results.
  • ⁇ Test Example 16 Purification of AAV2 by Carrier 8> A crude purified AAV2 solution was purified by affinity chromatography in the same manner as in Test Example 15, except that the column packed with carrier 8 produced in Production Example 16 was used instead of the column packed with carrier 6. The resulting chromatogram is shown in FIG. In the same manner as in Test Example 15, the amount of AAV2 at the elution peak in the elution step using the pH 4.5 buffer relative to the amount of AAV2 contained in the total recovered solution was calculated as the recovery rate at pH 4.5. In addition, the amount of AAV2 in the elution peak in the elution step using the pH 2.1 buffer relative to the amount of AAV2 contained in the total recovered solution was calculated as the recovery rate at pH 2.1. Table 10 shows the results.
  • ⁇ Test Example 17 Measurement of gene transfer efficiency of AAV2 eluted with pH 4.5 buffer> Collagen diluted 100-fold with PBS (Atelocollagen Bovine dermis 5 mg/mL, manufactured by Koken Co., Ltd.) was placed in a 96-well plate (Nunc (registered trademark) MicroWell (registered trademark) 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate, ThermoFisher company) was added to each well and collected immediately. After that, 2 ⁇ 10 3 cells of HEK293 cells were seeded in each well and incubated overnight under conditions of 37° C. and 5% CO 2 to adhere to the plate. The medium used in this case was FluoroBrite DMEM (ThermoFisher) supplemented with 10% FBS and 1 ⁇ GlutaMAXTM Supplement (Gibco).
  • the AAV2-containing eluate collected in Test Example 5 and eluted with a pH 4.5 buffer was neutralized to around pH 7 with a 1 mol/L Tris aqueous solution 1, 16 and 24 hours after elution.
  • the AAV2-containing eluate after neutralization was added to the wells of the 96-well plate to which the HEK293 cells had adhered so that the MOI (multiplicity of infection) was 10000, and the mixture was incubated at 37° C., 5% CO 2 for 3 hours. A daily culture was performed.
  • ⁇ Test Example 18 Measurement of gene transfer efficiency of AAV2 eluted with pH 2.1 buffer> Except that the AAV2-containing eluate collected in Test Example 7 and eluted with a pH 2.1 buffer was used instead of the AAV2-containing eluate collected in Test Example 5 and eluted with a pH 4.5 buffer. measured the fluorescence intensity of VENUS as an index of gene transfer efficiency in the same manner as in Test Example 17. The results are shown in Table 11 and FIG.
  • ⁇ Test Example 19 Measurement of AAV2 gene transfer efficiency in crudely purified AAV2 solution> Fluorescence of VENUS in the same manner as in Test Example 17 except that the AAV2-containing eluate collected in Test Example 5 and eluted with a pH 4.5 buffer was replaced with the AAV2 crude purified solution prepared in Production Example 4. Intensity was measured as an index of gene transfer efficiency. The results are shown in Table 12 and FIG.
  • ⁇ Test Example 20 Measurement of gene transfer efficiency of AAV2 eluted with pH 4.5 buffer> Except that the AAV2-containing eluate collected in Test Example 13 and eluted with a pH 4.5 buffer was used instead of the AAV2-containing eluate collected in Test Example 5 and eluted with a pH 4.5 buffer. measured the fluorescence intensity of VENUS as an index of gene transfer efficiency in the same manner as in Test Example 17. The results are shown in Table 12 and FIG.
  • ⁇ Test Example 21 Measurement of AAV2 gene transfer efficiency eluted with pH 2.1 buffer> Except that the AAV2-containing eluate collected in Test Example 14 and eluted with a pH 2.1 buffer was used instead of the AAV2-containing eluate collected in Test Example 5 and eluted with a pH 4.5 buffer. measured the fluorescence intensity of VENUS as an index of gene transfer efficiency in the same manner as in Test Example 17. The results are shown in Table 12 and FIG.
  • VHH ligand 12 expressed by the mutant gene VHH ligand 12 VHH ligand 13 expressed by the mutant gene VHH ligand 13, VHH ligand 14 expressed by the mutant gene VHH ligand 14, and VHH expressed by the mutant gene VHH ligand 15
  • VHH ligand 16 expressed by mutated gene VHH ligand 16 and VHH ligand 17 expressed by mutated gene VHH ligand 17 are single amino acid substitution variants of VHH ligand 1, with A VHH ligand in which one of the amino acids present has been mutated.
  • the VHH ligand 12 has an amino acid sequence of FR3 in which arginine at position 15 from the N-terminus in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 is replaced with glutamic acid, and the VHH ligand 13 is an amino acid sequence of FR3.
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 has an amino acid sequence in which arginine at position 15 from the N-terminus is replaced with glutamine, and the VHH ligand 14 has an FR3 amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.
  • the VHH ligand 15 has an amino acid sequence in which arginine at position 15 from the N-terminus is substituted with tryptophan in the described amino acid sequence, and the amino acid sequence of FR3 of the VHH ligand 15 is N
  • the VHH ligand 16 has an amino acid sequence in which the 16th aspartic acid from the terminal is replaced with alanine, and the FR3 amino acid sequence of the VHH ligand 16 has the 17th asparagine from the N-terminal in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3.
  • the VHH ligand 17 has an amino acid sequence in which tyrosine at position 23 from the N-terminus is substituted with alanine in the amino acid sequence of FR3 shown in SEQ ID NO: 3. have.
  • ⁇ Test Example 22 Measurement of dissociation rate constant of VHH antibody> Analysis of the affinity of VHH antibodies (VHH ligands 12 to 17) for AAV2 in the same manner as in Test Example 1, except that VHH ligands 12 to 17 were used instead of VHH ligands 1 and 4 to 9. bottom. Each result is shown in Table 14.
  • Carrier 10 which is a VHH-immobilized bead carrier, was prepared in the same manner as in Example 2 except that VHH ligand 17 was used instead of VHH ligand 8.
  • Table 15 shows the results of measuring the ligand density.
  • ⁇ Test Example 23 Purification of AAV2 by carrier 10> Using the column of Carrier 10 prepared in Example 9, the crude AAV2 solution prepared in Production Example 4 was purified by affinity chromatography. The following solutions A to G were prepared and filtered through a 0.2 ⁇ m filter before use.
  • a column filled with carrier 10 prepared in Production Example 17 was connected to AKTA (registered trademark) Avant 25 (Cytiva), the flow rate was set to 0.2 mL/min, washed with pure water, and equilibrated with liquid A. . After that, liquid I was passed through to retain AAV2 on the column carrier, followed by washing with liquid A, eluting AAV2 with liquid B, eluting AAV2 with liquid C, and then eluting with liquid D. AAV2 was eluted with After completion of elution, the column was washed with E solution, A solution, F solution, A solution and G solution in this order. After washing, the column was replaced with H solution and stored in a refrigerator. A chromatogram during purification is shown in FIG.
  • the amount of AAV2 contained in each fraction was quantified by quantitative PCR (qPCR) using a QuantStudio3 real-time PCR system (manufactured by Thermo Fisher Scientific), and a buffer of pH 4.5 was used for the amount of AAV2 contained in all the collected liquids. Calculate the total amount of AAV2 in the elution peak in the elution step using a buffer of pH 4.0 with respect to the amount of AAV2 in the elution peak in the elution step and the amount of AAV2 contained in the total recovery solution as the recovery rate at pH 4.0 or higher bottom.
  • ⁇ Test Example 24 Purification of AAV2 with carrier 7> A crude purified AAV2 solution was purified by affinity chromatography in the same manner as in Test Example 23, except that the column filled with carrier 7 produced in Production Example 9 was used instead of the column of bead carrier 10. The resulting chromatogram is shown in FIG. Recovered AAV2 at pH 4.0 or higher and recovered AAV2 at pH less than 4.0 were calculated in the same manner as in Test Example 23. The results are shown in Table 16.
  • Embodiments of the present invention include, for example, the following.
  • ⁇ 1> A low-molecular-weight antibody that binds to adeno-associated virus (AAV), wherein the dissociation rate constant of the adeno-associated virus (AAV) and the low-molecular-weight antibody at pH 5.0 is 1 ⁇ 10 -2 ( s ⁇ 1 ) or more, and the dissociation rate constant at pH 5.0 is 10 times or more the dissociation rate constant at pH 7.0.
  • ⁇ 3> A minibody that binds to adeno-associated virus (AAV), wherein the amino acid sequence of framework region 3 is the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3, 4, 36, or 37, , 15th arginine, 16th aspartic acid, 17th asparagine or isoleucine, 19th glycine or lysine, 20th asparagine, and 23rd tyrosine at least one selected from the group consisting of other amino acids A low-molecular-weight antibody characterized by having a substituted amino acid sequence.
  • a minibody according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 3>, which is a camelid-derived heavy chain antibody variable region (VHH).
  • VHH camelid-derived heavy chain antibody variable region
  • a nucleic acid comprising: ⁇ 7> A vector comprising the nucleic acid according to ⁇ 6> above.
  • ⁇ 8> A cell containing the nucleic acid according to ⁇ 6>.
  • ⁇ 9> A method for producing the low-molecular-weight antibody according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 4> or the low-molecular-weight adeno-associated virus (AAV) weakly acidic elution antibody according to ⁇ 5>, , a method comprising the step of culturing the cell according to ⁇ 8>.
  • ⁇ 11> The affinity carrier according to ⁇ 10>, wherein the low-molecular-weight antibody is immobilized on the water-insoluble substrate at a density of 1 to 20 mg/mL.
  • ⁇ 14> The method for producing an adeno-associated virus (AAV) according to ⁇ 13>, wherein in the separation step, the adeno-associated virus (AAV) is separated from the affinity carrier using a buffer of pH 4 or higher.
  • Adeno-associated virus (AAV) isolated from an affinity carrier having an antibody that dissociates from adeno-associated virus (AAV) using a buffer of pH 2.1 using a buffer of pH 2.1 is more than doubled compared to the gene transfer efficiency 24 hours after isolation.
  • AAV adeno-associated virus
  • ⁇ 19> The method for inhibiting reduction of the infectivity titer of adeno-associated virus (AAV) according to ⁇ 18>, wherein in the separation step, the adeno-associated virus (AAV) is separated from the affinity carrier using a buffer of pH 4 or higher.
  • the gene transfer efficiency of adeno-associated virus (AAV) isolated from an affinity carrier having an antibody that dissociates from adeno-associated virus (AAV) by using a buffer of pH 2.1 is more than doubled compared to the gene transfer efficiency 24 hours after isolation.

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Abstract

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に結合する低分子化抗体であって、前記アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）と前記低分子化抗体とのｐＨ５．０での解離速度定数が１×１０－２（ｓ－１）以上であって、前記ｐＨ５．０での解離速度定数が、ｐＨ７．０での解離速度定数の１０倍以上であることを特徴とする低分子化抗体である。

Description

低分子化抗体
　本発明は、低分子化抗体に関する。
　アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは遺伝子治療などの医療分野で重要な分子である。その利用にあたり、ＡＡＶベクターを細胞培養液などの生体試料から効率的に回収する精製手法が求められている。
　一般的に、ＡＡＶベクターの精製において、ウイルスを生産させた形質転換細胞の培養液から、まず細胞や細胞片などの固形物をろ過により取り除き、次に超遠心法やクロマトグラフィーなどにより精製する手法が知られている（特許文献１など）。
　アフィニティークロマトグラフィーは、対象分子と特異的に結合する低分子化抗体などのリガンドをビーズなどの基材に固定化した担体を用いて、対象分子とそれ以外の不純物とを分離する手法である。ＡＡＶベクター精製に用いられるアフィニティークロマトグラフィー用担体として、Ｃｙｔｉｖａ社のＣａｐｔｏ（登録商標）　ＡＶＢ，Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社のＰＯＲＯＳ（登録商標）　ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（登録商標）　ＡＡＶＸなどの市販品が知られている。
　しかしながら、従来のアフィニティークロマトグラフィーでは、ＡＡＶベクターの溶出にｐＨが約２～３の低ｐＨ溶液を使用する必要があるが、低ｐＨ溶液中では、ＡＡＶベクターの感染価が低下することが知られており（非特許文献１）、力価を保持してＡＡＶベクターを効率的に精製する上で課題があった。
　したがって、弱酸性溶液においてＡＡＶと解離する低分子化抗体、及びそれを用いた効率的なＡＡＶの製造方法は全く知られておらず、これらの提供が強く求められている。
特表２０１８－５０７７０７号公報
Ｖｉｒｕｓｅｓ　２０２０　１２：６６８
　本発明は、従来における前記諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、弱酸性溶液においてＡＡＶと解離する低分子化抗体、及びそれを用いた効率的なＡＡＶの製造方法を提供する。
　本発明者らが、前記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に結合する低分子化抗体であって、前記アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）と前記低分子化抗体とのｐＨ５．０での解離速度定数が１×１０－２（ｓ－１）以上であって、前記ｐＨ５．０での解離速度定数が、ｐＨ７．０での解離速度定数の１０倍以上であることを特徴とする低分子化抗体、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に結合する低分子化抗体であって、可変重鎖相補性決定領域２のアミノ酸配列が、配列番号１に記載のアミノ酸配列、又は配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、Ｎ末端から２番目のセリン及び６番目のスレオニンからなる群から選択される少なくとも１つがその他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列であり、可変重鎖相補性決定領域３のアミノ酸配列が、配列番号２に記載のアミノ酸配列、又は配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち、Ｎ末端のアルギニン及びＮ末端から４番目のトリプトファンからなる群から選択される少なくとも１つがその他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列であり、前記可変重鎖相補性決定領域２のアミノ酸配列又は前記可変重鎖相補性決定領域３のアミノ酸配列の少なくとも１つが、前記配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、Ｎ末端から２番目のセリン及び６番目のスレオニンからなる群から選択される少なくとも１つがその他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列又は配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち、Ｎ末端のアルギニン及びＮ末端から４番目のトリプトファンからなる群から選択される少なくとも１つがその他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列であることを特徴とする低分子化抗体、又は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に結合する低分子化抗体であって、フレームワーク領域３のアミノ酸配列が、配列番号３、４、３６、又は３７に記載のアミノ酸配列のうち、Ｎ末端から、１５番目のアルギニン、１６番目のアスパラギン酸、１７番目のアスパラギン若しくはイソロイシン、１９番目のグリシン若しくはリシン、２０番目のアスパラギン、及び２３番目のチロシンからなる群から選択される少なくとも１つがその他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列であることを特徴とする低分子化抗体により、弱酸性溶液においてＡＡＶと解離する低分子化抗体、及びそれを用いた効率的なＡＡＶの製造方法が提供できることを知見した。
　本発明は、本発明者らによる前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては以下の通りである。即ち、
　＜１＞　アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に結合する低分子化抗体であって、前記アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）と前記低分子化抗体とのｐＨ５．０での解離速度定数が１×１０－２（ｓ－１）以上であって、前記ｐＨ５．０での解離速度定数が、ｐＨ７．０での解離速度定数の１０倍以上であることを特徴とする低分子化抗体である。
　＜２＞　アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に結合する低分子化抗体であって、可変重鎖相補性決定領域２のアミノ酸配列が、配列番号１に記載のアミノ酸配列、又は配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、Ｎ末端から２番目のセリン及び６番目のスレオニンからなる群から選択される少なくとも１つがその他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列であり、可変重鎖相補性決定領域３のアミノ酸配列が、配列番号２に記載のアミノ酸配列、又は配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち、Ｎ末端のアルギニン及びＮ末端から４番目のトリプトファンからなる群から選択される少なくとも１つがその他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列であり、前記可変重鎖相補性決定領域２のアミノ酸配列又は前記可変重鎖相補性決定領域３のアミノ酸配列の少なくとも１つが、前記配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、Ｎ末端から２番目のセリン及び６番目のスレオニンからなる群から選択される少なくとも１つがその他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列又は配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち、Ｎ末端のアルギニン及びＮ末端から４番目のトリプトファンからなる群から選択される少なくとも１つがその他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列であることを特徴とする低分子化抗体である。
　＜３＞　アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に結合する低分子化抗体であって、フレームワーク領域３のアミノ酸配列が、配列番号３、４、３６、又は３７に記載のアミノ酸配列のうち、Ｎ末端から、１５番目のアルギニン、１６番目のアスパラギン酸、１７番目のアスパラギン若しくはイソロイシン、１９番目のグリシン若しくはリシン、２０番目のアスパラギン、及び２３番目のチロシンからなる群から選択される少なくとも１つがその他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列であることを特徴とする低分子化抗体である。
　本発明によると、従来における前記諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、弱酸性溶液においてＡＡＶと解離する低分子化抗体、及びそれを用いた効率的なＡＡＶの製造方法を提供することができる。
図１は、担体１によるＡＡＶ吸脱着のクロマトグラムを示す図である。 図２は、担体２によるＡＡＶ吸脱着のクロマトグラムを示す図である。 図３は、担体３によるＡＡＶ吸脱着のクロマトグラムを示す図である。 図４は、担体４によるＡＡＶ吸脱着のクロマトグラムを示す図である。 図５は、担体７によるＡＡＶ吸脱着のクロマトグラムを示す図である。 図６は、担体９によるＡＡＶ吸脱着のクロマトグラムを示す図である。 図７は、担体６によるＡＡＶ吸脱着のクロマトグラムを示す図である。 図８は、担体８によるＡＡＶ吸脱着のクロマトグラムを示す図である。 図９は、ｐＨ４．５、又はｐＨ２．１のバッファーで溶出したＡＡＶ２の遺伝子導入効率の測定結果を示す図である。 図１０は、ｐＨ４．５、又はｐＨ２．１のバッファーで溶出したＡＡＶ２の遺伝子導入効率の測定結果を示す図である。 図１１は、担体１０によるＡＡＶ吸脱着のクロマトグラムを示す図である。 図１２は、担体７によるＡＡＶ吸脱着のクロマトグラムを示す図である。
　（低分子化抗体）
　前記低分子化抗体は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に結合する低分子化抗体であって、
　（１）前記アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）と前記低分子化抗体とのｐＨ５．０での解離速度定数が１×１０－２（ｓ－１）以上であって、前記ｐＨ５．０での解離速度定数が、ｐＨ７．０での解離速度定数の１０倍以上である、
　（２）可変重鎖相補性決定領域２のアミノ酸配列が、配列番号１に記載のアミノ酸配列、若しくは配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、Ｎ末端から２番目のセリン及び６番目のスレオニンからなる群から選択される少なくとも１つがその他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列であり、可変重鎖相補性決定領域３のアミノ酸配列が、配列番号２に記載のアミノ酸配列、若しくは配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち、Ｎ末端のアルギニン及びＮ末端から４番目のトリプトファンからなる群から選択される少なくとも１つがその他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列であり、前記可変重鎖相補性決定領域２のアミノ酸配列若しくは前記可変重鎖相補性決定領域３のアミノ酸配列の少なくとも１つが、前記配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、Ｎ末端から２番目のセリン及び６番目のスレオニンからなる群から選択される少なくとも１つがその他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列若しくは配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち、Ｎ末端のアルギニン及びＮ末端から４番目のトリプトファンからなる群から選択される少なくとも１つがその他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列である、又は、
　（３）フレームワーク領域３のアミノ酸配列が、配列番号３、４、３６、又は３７に記載のアミノ酸配列のうち、Ｎ末端から、１５番目のアルギニン、１６番目のアスパラギン酸、１７番目のアスパラギン若しくはイソロイシン、１９番目のグリシン若しくはリシン、２０番目のアスパラギン、及び２３番目のチロシンからなる群から選択される少なくとも１つがその他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列である。
　前記（１）から（３）のいずれかを満たすことにより、前記低分子化抗体は、弱酸性溶液においてアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）と解離する。
　「抗体」は免疫グロブリンの機能に着目した、一般的な名称である。免疫グロブリンは、リンパ球のＢ細胞が産生する糖タンパク質であり、特定のタンパク質などの分子を認識して結合する働きを有する。免疫グロブリンは、この特定の分子（抗原）に特異的に結合する機能と、他の生体分子や細胞と協同して抗原を有する因子を無毒化・除去する機能を有する。
　全ての免疫グロブリンは、基本的には同じ分子構造からなり、“Ｙ”字型の４本鎖構造（軽鎖・重鎖の２本のポリペプチド鎖が２本ずつ）を基本構造としている。軽鎖（Ｌ鎖）には、λ鎖とκ鎖の２種類があり、すべての免疫グロブリンはこのどちらかを有する。重鎖（Ｈ鎖）には、γ鎖、μ鎖、α鎖、δ鎖、ε鎖という構造の異なる５種類があり、この重鎖の違いによって免疫グロブリンの種類（アイソタイプ）が変わる。免疫グロブリンＧ（以下、「ＩｇＧ」と略記する場合がある）は、単量体型の免疫グロブリンで、２本の重鎖（γ鎖）と２本の軽鎖から構成され、２箇所の抗原結合部位を有している。
　抗体の“Ｙ”字の下半分の縦棒部分にあたる場所をＦｃ領域と呼び、上半分の“Ｖ”字の部分をＦａｂ領域と呼ぶ。Ｆｃ領域は抗体が抗原に結合した後の反応を惹起するエフェクター機能を有し、Ｆａｂ領域は抗原と結合する機能を有する。重鎖のＦａｂ領域とＦｃ領域はヒンジ部でつながっており、パパイヤに含まれるタンパク質分解酵素パパインは、このヒンジ部を分解して２つのＦａｂ領域（断片）と１つのＦｃ領域に切断する。Ｆａｂ領域のうち“Ｙ”字の先端に近い部分（ドメイン）は、多様な抗原に結合できるように、アミノ酸配列に多彩な変化が見られるため、可変領域（Ｖ領域）と呼ばれている。軽鎖の可変領域をＶＬ領域、重鎖の可変領域をＶＨ領域と呼ぶ。Ｖ領域以外のＦａｂ領域とＦｃ領域は、比較的変化の少ない領域であり、定常領域（Ｃ領域）と呼ばれる。軽鎖の定常領域をＣＬ領域と呼び、重鎖の定常領域をＣＨ領域と呼ぶが、ＣＨ領域はさらにＣＨ１～ＣＨ３の３つに分けられる。重鎖のＦａｂ領域はＶＨ領域とＣＨ１からなり、重鎖のＦｃ領域はＣＨ２とＣＨ３からなる。ヒンジ部はＣＨ１とＣＨ２の間に位置する。
　ラクダ科動物由来抗体やサメなどの魚類由来抗体の中には、軽鎖が存在しない重鎖のみで構成される抗体である、重鎖抗体が存在する。ラクダ科動物由来重鎖抗体は、軽鎖を有する通常のＩｇＧ抗体（ＩｇＧ１）と区別され、ＩｇＧ２，ＩｇＧ３と呼ばれる。一方、魚類由来の重鎖抗体は、ＩｇＮＡＲ（ｎｅｗ　ａｎｔｉｇｅｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ）と呼ばれる。
　本発明における低分子化抗体とは、全長抗体（ｗｈｏｌｅ　ａｔｉｂｏｄｙ、例えばｗｈｏｌｅ　ＩｇＧ等）の一部分を欠損させた抗体断片であって、抗原への結合能を有していれば特に限定されない。
　本発明における低分子化抗体は、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを有さないことが好ましい。
　本発明における低分子化抗体は、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）のいずれか、又は両方を含むことが好ましい。ＶＨ又はＶＬのアミノ酸配列は、付加、欠失及び／又は置換を含むことができる。さらに抗原に結合する限り、ＶＨ及びＶＬのいずれか、又は両方の一部を欠損させることもできる。
　前記低分子化抗体としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ラクダ科動物由来重鎖抗体に由来する可変領域（ＶＨＨ）、魚類由来重鎖抗体に由来する可変領域（Ｖ－ＮＡＲ）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖抗体（ｓｉｎｇｌｅ　ｃｈａｉｎ　ａｎｔｉｂｏｄｙ：ｓｃＦｖ）、ｄｉａｂｏｄｙ、ｔｒｉａｂｏｄｙ、ｍｉｎｉｂｏｄｙを含むものなどが挙げられる。これらの中でも、安定性、及び産生効率の点から、ラクダ科動物由来重鎖抗体の可変領域（ＶＨＨ）、又は一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）を含むものが好ましい。
　前記ラクダ科動物由来の重鎖抗体の可変領域（ＶＨＨ）としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記吸着対象を免疫したラクダ科動物の血清から精製した重鎖抗体をもとに設計され、宿主細胞にＶＨＨ遺伝子を発現させて作製したもの、アミノ酸配列に基づいて化学合成したものなどが挙げられる。
　前記ラクダ科動物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、フタコブラクダ、ヒトコブラクダ、ラマ、アルパカ、ビクーニャ、グアナコなどが挙げられる。
　ＶＨＨ遺伝子を発現させる前記宿主細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、大腸菌などの細菌、酵母などの真菌、動物細胞、植物細胞などが挙げられる。
　前記ラクダ科動物に前記吸着対象を免疫する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、国際公開第２０２０／０６７４１８号パンフレットに記載の方法などが挙げられる。
　宿主細胞にＶＨＨ遺伝子を発現させて作製する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、国際公開第２０２０／０６７４１８号パンフレット、及び特開２０１５－１１９６３７号公報に記載の方法などが挙げられる。
　前記一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）は、抗体のＶＨとＶＬを連結することにより得られる。ｓｃＦｖにおいて、ＶＨとＶＬは、リンカー、好ましくはペプチドリンカーを介して連結される（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ　１９８８　８５：５８７９）。当該ペプチドリンカーには、特に制限はない。例えば、３から２５残基程度からなる任意の一本鎖ペプチドをリンカーとして用いることができる。
　前記ｓｃＦｖとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、宿主細胞にｓｃＦｖ遺伝子を発現させて作製したもの、アミノ酸配列に基づいて化学合成したものなどが挙げられる。
　ｓｃＦｖ遺伝子を発現させる前記宿主細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、大腸菌などの細菌、酵母などの真菌、動物細胞、植物細胞などが挙げられる。
　本発明における低分子化抗体は、シングルドメイン抗体を含むことが好ましい。
　前記シングルドメイン抗体としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記ラクダ科動物由来の重鎖抗体の可変領域（ＶＨＨ）を含むものが好ましい。
　本発明における低分子化抗体は、キメラ化やヒト化されていてもよい。
　前記低分子化抗体の分子量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１３０，０００以下が好ましく、１００，０００以下がより好ましく、５０，０００以下がさらに好ましく、３０，０００以下が特に好ましく、２０，０００以下が最も好ましい。
　本明細書では、低分子化抗体のＡＡＶに対するアフィニティは、「解離速度定数」で数値化することができる。
　前記アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）と前記低分子化抗体とのｐＨ５．０での解離速度定数としては、１×１０－２（ｓ－１）以上が好ましく、２×１０－２（ｓ－１）以上がより好ましく、３×１０－２（ｓ－１）以上がさらに好ましく、５×１０－２（ｓ－１）以上が特に好ましく、１×１０－１（ｓ－１）以上が特に好ましい。
　また、前記ｐＨ５．０での解離速度定数は、ｐＨ７．０での解離速度定数の１０倍以上が好ましく、１５倍以上がより好ましく、２０倍以上がさらに好ましい。
　前記解離速度定数は、以下のとおり測定する。
　前記低分子化抗体は、まずビオチン化を実施し、ビオチン化低分子化抗体とする。
　前記低分子化抗体の吸光度とウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の吸光係数を用いて換算した低分子化抗体濃度が５００μｇ／ｍＬになるようにダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ　Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）で希釈した溶液に、１ｍＭになるようにＰＢＳに溶かしたＥＺ－Ｌｉｎｋ（商標）　ＮＨＳ－ＰＥＧ４－Ｂｉｏｔｉｎ溶液を１２．６μＬ加えて４℃で４時間反応させた後、０．２μｍフィルターを通す。得られた溶液をＰＢＳで５倍希釈したものをビオチン化低分子化抗体溶液とする。
　バイオレイヤー干渉法を利用したバイオセンサーＯｃｔｅｔ　ＲＥＤ　３８４システム（ザルトリウス社）を用いて、低分子化抗体のＡＡＶ２に対する親和性を解析する。
　ビオチン化低分子化抗体のセンサーチップへの固定化を実施する。センサーチップ（Ｏｃｔｅｔ（登録商標）　Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ　（ＳＡ）　Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ、ザルトリウス社）への固定化は、低分子化抗体に付加したビオチン分子とセンサーチップ上のストレプトアビジンとの親和性を利用して行う。
　まず、Ｏｃｔｅｔ（登録商標）　Ｋｉｎｅｔｉｃｓ　Ｂｕｆｆｅｒ　１０Ｘ（ザルトリウス社）をＰＢＳで１０倍希釈し、Ｋｉｎｅｔｉｃｓ　Ｂｕｆｆｅｒを調製する。振とう速度１，０００ｒｐｍ、６０秒間、温度３０℃の条件で、センサーチップをＫｉｎｅｔｉｃｓ　Ｂｕｆｆｅｒに浸漬した後、ビオチン化低分子化抗体溶液に振とう速度１，０００ｒｐｍ、５分間、温度３０℃で定常状態になるまで固定化反応を行う。
　センサーチップ上の余剰のストレプトアビジンをブロッキングするために、振とう速度１，０００ｒｐｍ、５分間、温度３０℃の条件で、センサーチップをＰＢＳに溶解させた２５μｇ／ｍＬのビオシチン溶液に浸漬する。
　次に、振とう速度１，０００ｒｐｍ、２００秒間、温度３０℃の条件で、センサーチップをＫｉｎｅｔｉｃｓ　Ｂｕｆｆｅｒに浸漬する。
　次に、固定化した低分子化抗体をＡＡＶ２のｅｍｐｔｙ　ｐａｒｔｉｃｌｅ（ＥＰ）に結合させる。ＡＡＶ２のＥＰの吸光度とＢＳＡの吸光係数を用いて換算したＡＡＶ２のＥＰ濃度が２５μｇ／ｍＬのＡＡＶ２のＥＰ溶液を調製し、振とう速度１，０００ｒｐｍ、１０分間、温度３０℃の条件でセンサーチップを浸漬する。
　最後に解離溶液に漬けて、ＡＡＶ２の解離反応を測定する。振とう速度１，０００ｒｐｍ、５００秒間、温度３０℃の条件でセンサーチップを各種解離溶液に浸漬する。
　得られた結合解離曲線に対して、低分子化抗体とＡＡＶ２中のＶＰ３タンパク質との１：１又は２：１の結合モデルによるフィッティング解析を行い、ＡＡＶ２に対する解離速度定数（ｋｏｆｆ）を算出する。本明細書中では２：１の結合モデルによるフィッティング解析を行い、算出されたｋｏｆｆのうち、より値の大きなものを低分子化抗体とＡＡＶとの間の解離速度定数とする。但し、２：１の結合モデルによるフィッティング解析で１種の数ｋｏｆｆのみが得られる場合には、１：１の結合モデルによるフィッティング解析により解離速度定数を算出する。
　フィッティング解析には付属のソフトウェア（Ｄａｔａ　Ａｎａｌｙｓｉｓ）を使用し、以下のパラメータに従う。
［Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ　Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ］
Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｔｙｐｅ：Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｗｅｌｌｓ
Ａｌｉｇｎ　Ｙ：Ｙｅｓ
Ｓｔｅｐ　ｔｏ　Ａｌｉｇｎ：Ｂａｓｅｌｉｎｅ
Ｔｉｍｅ：１９０～１９９．５（ｓｅｃｏｎｄ）
Ｉｎｔｅｒｓｔｅｐ　Ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ：Ｎｏ
Ｓ－Ｇ　Ｆｉｌｔｅｒｉｎｇ：ＯＮ
［Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ］
Ｓｔｅｐ　ｔｏ　Ａｎａｌｙｚｅ：Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ
Ｍｏｄｅｌ：１　ｔｏ　１もしくは２　ｔｏ　１
Ｆｉｔｔｉｎｇ：Ｌｏｃａｌ　Ｐａｒｔｉａｌ
Ｗｉｎｄｏｗ　ｏｆ　Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）：０～５００（ｓｅｃｏｎｄ）
　ｐＨ７．０での解離速度定数を算出する場合は、解離溶液として、０．１Ｍ　クエン酸ナトリウム／０．５Ｍ　塩化ナトリウム　ｐＨ７の溶液を使用し、ｐＨ５．０での解離速度定数を算出する場合は、解離溶液として、０．１Ｍ　クエン酸ナトリウム／０．５Ｍ　塩化ナトリウム　ｐＨ５の溶液を使用する。
　前記低分子化抗体の構造としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、フレームワーク領域１（ＦＲ１）、可変重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、フレームワーク領域２（ＦＲ２）、可変重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ２）、フレームワーク領域３（ＦＲ３）、可変重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ３）、及びフレームワーク領域４（ＦＲ４）の順で連結された構造が好ましい。
　前記フレームワーク領域、及び可変重鎖相補性決定領域は、立体構造をベースに定義する場合と、ＩｇＧ抗体の重鎖のアノテーションを基にＢＬＡＳＴによるアライメントから定義する場合があるが（ＡＣＳ　Ｓｙｎｔｈ．　Ｂｉｏｌ．　２０１８　７：　２４８０－２４８４）、本願では、後者の、ＩｇＧ抗体の重鎖のアノテーションを基にＢＬＡＳＴによるアライメントから定義する（Ｍｅｄ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　２００９　１９８：１５７－１７４）。
　前記低分子化抗体は、可変重鎖相補性決定領域２のアミノ酸配列が、配列番号１に記載のアミノ酸配列、若しくは配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、Ｎ末端から２番目のセリン及び６番目のスレオニンからなる群から選択される少なくとも１つがその他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列であり、可変重鎖相補性決定領域３のアミノ酸配列が、配列番号２に記載のアミノ酸配列、若しくは配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち、Ｎ末端のアルギニン及びＮ末端から４番目のトリプトファンからなる群から選択される少なくとも１つがその他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列であり、前記可変重鎖相補性決定領域２のアミノ酸配列若しくは前記可変重鎖相補性決定領域３のアミノ酸配列の少なくとも１つが、前記配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、Ｎ末端から２番目のセリン及び６番目のスレオニンからなる群から選択される少なくとも１つがその他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列若しくは配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち、Ｎ末端のアルギニン及びＮ末端から４番目のトリプトファンからなる群から選択される少なくとも１つがその他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列であるか、又は、フレームワーク領域３のアミノ酸配列が、配列番号３、４、３６、又は３７に記載のアミノ酸配列のうち、Ｎ末端から、１５番目のアルギニン、１６番目のアスパラギン酸、１７番目のアスパラギン若しくはイソロイシン、１９番目のグリシン若しくはリシン、２０番目のアスパラギン、及び２３番目のチロシンからなる群から選択される少なくとも１つがその他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列であることが好ましい。
　前記その他のアミノ酸としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、置換前のアミノ酸（変異導入前のアミノ酸）、プロリン、及びシステインを除くアミノ酸が好ましく、置換前のアミノ酸（変異導入前のアミノ酸）、プロリン、グリシン、及びシステインを除くアミノ酸がより好ましく、置換前のアミノ酸（変異導入前のアミノ酸）、プロリン、セリン、グリシン、スレオニン、アスパラギン酸、メチオニン、及びシステインを除くアミノ酸がさらに好ましく、アラニン、グルタミン酸、グルタミン、トリプトファンが特に好ましい。
　前記低分子化抗体の前記可変重鎖相補性決定領域１のアミノ酸配列としては、前記（１）から（３）のいずれかを満たす限り特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、配列番号５～７、５２、又は５３のいずれかに記載のアミノ酸配列、配列番号５～７、５２、又は５３のいずれかに記載のアミノ酸配列と配列同一性の高いアミノ酸配列などが挙げられる。
　前記配列番号５～７、５２、又は５３のいずれかに記載のアミノ酸配列と配列同一性の高いアミノ酸配列としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、配列番号５～７、５２、又は５３のいずれかに記載のアミノ酸配列との配列同一性が、５０％以上が好ましく、６０％以上がより好ましく、７０％以上がさらに好ましく、８０％以上が特に好ましく、９０％以上が最も好ましい。
　前記低分子化抗体の前記可変重鎖相補性決定領域２のアミノ酸配列としては、前記（１）から（３）のいずれかを満たす限り特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、配列番号１、３１、３２、又は５０に記載のアミノ酸配列、配列番号１、３１、３２、又は５０に記載のアミノ酸配列と配列同一性の高いアミノ酸配列などが挙げられる。
　前記配列番号１、３１、３２、又は５０に記載のアミノ酸配列と配列同一性の高いアミノ酸配列としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、配列番号１、３１、３２、又は５０に記載のアミノ酸配列との配列同一性が、５０％以上が好ましく、６０％以上がより好ましく、７０％以上がさらに好ましく、８０％以上が特に好ましく、９０％以上が最も好ましい。
　前記低分子化抗体の前記可変重鎖相補性決定領域３のアミノ酸配列としては、前記（１）から（３）のいずれかを満たす限り特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、配列番号２、３３、５１、又は５４に記載のアミノ酸配列、配列番号２、３３、５１、又は５４に記載のアミノ酸配列と配列同一性の高いアミノ酸配列などが挙げられる。
　前記配列番号２、３３、５１、又は５４に記載のアミノ酸配列と配列同一性の高いアミノ酸配列としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、配列番号２、３３、５１、又は５４に記載のアミノ酸配列との配列同一性が、５０％以上が好ましく、６０％以上がより好ましく、７０％以上がさらに好ましく、８０％以上が特に好ましく、９０％以上が最も好ましい。
　前記低分子化抗体の前記フレームワーク領域３のアミノ酸配列としては、前記（１）から（３）のいずれかを満たす限り特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、配列番号３、４、３６、又は３７に記載のアミノ酸配列、配列番号３、４、３６、又は３７に記載のアミノ酸配列と配列同一性の高いアミノ酸配列などが挙げられる。
　前記配列番号３、４、３６、又は３７に記載のアミノ酸配列と配列同一性の高いアミノ酸配列としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、配列番号３、４、３６、又は３７に記載のアミノ酸配列との配列同一性が、５０％以上が好ましく、６０％以上がより好ましく、７０％以上がさらに好ましく、８０％以上が特に好ましく、９０％以上が最も好ましい。
　置換前の前記低分子化抗体のアミノ酸配列としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、配列番号８～１０、３４、又は３５のいずれかに記載のアミノ酸配列、配列番号８～１０、３４、又は３５のいずれかに記載のアミノ酸配列と配列同一性の高いアミノ酸配列などが挙げられる。
　前記配列番号８～１０、３４、又は３５のいずれかに記載のアミノ酸配列と配列同一性の高いアミノ酸配列としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、配列番号８～１０、３４、又は３５のいずれかに記載のアミノ酸配列との配列同一性が、７０％以上が好ましく、８０％以上がより好ましく、９０％以上がさらに好ましく、９５％以上が特に好ましく、９９％以上が最も好ましい。
　－アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）－
　前記アデノ随伴ウイルスは、カプシド中に直鎖状一本鎖ＤＮＡを含むパルボウイルス科に属するウイルスである。前記アデノ随伴ウイルスの血清型としては、１型ＡＡＶ（ＡＡＶ１）、２型ＡＡＶ（ＡＡＶ２）、３型ＡＡＶ（ＡＡＶ３）、４型ＡＡＶ（ＡＡＶ４）、５型ＡＡＶ（ＡＡＶ５）、６型ＡＡＶ（ＡＡＶ６）、７型ＡＡＶ（ＡＡＶ７）、８型ＡＡＶ（ＡＡＶ８）、９型ＡＡＶ（ＡＡＶ９）、及び１０型ＡＡＶ（ＡＡＶ１０）などが知られている。
　これらの中でも、２型ＡＡＶ（ＡＡＶ２）が好ましい。
　前記アデノ随伴ウイルスとしては、アデノ随伴ウイルスのカプシド、又はアデノ随伴ウイルス遺伝子を含むベクターであってもよい。
　前記低分子化抗体は、中性ｐＨ領域でアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に結合し、弱酸性ｐＨ領域でアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）と解離するため、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）弱酸性溶出用低分子化抗体として使用することができる。
　前記低分子化抗体は、中性ｐＨ領域でアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）と結合し、置換前の低分子化抗体と比較して、弱酸性ｐＨ領域でのＡＡＶ結合能が低下している。
　前記中性ｐＨ領域とは、ｐＨ６．０以上８．０未満であり、弱酸性ｐＨ領域とは、ｐＨ３．５以上６．０未満である。
　（核酸）
　前記核酸は、前記低分子化抗体、又は前記アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）弱酸性溶出用低分子化抗体、をコードする塩基配列を含み、さらにその他の要素を含むことができる。
　前記低分子化抗体、又は前記アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）弱酸性溶出用低分子化抗体は、前述のとおりである。
　（ベクター）
　前記ベクターは、前記核酸を含み、さらにその他の要素を含むことができる。
　前記核酸は、前述のとおりである。
　（細胞）
　前記細胞は、前記核酸を含み、さらにその他の要素を含むことができる。
　前記核酸は、前述のとおりである。
　前記細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、大腸菌などの細菌、酵母などの真菌、動物細胞、植物細胞などが挙げられる。
　前記細胞は、前記宿主細胞であってもよい。
　（低分子化抗体、又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）弱酸性溶出用低分子化抗体の製造方法）
　前記低分子化抗体、又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）弱酸性溶出用低分子化抗体の製造方法は、前記細胞を培養する工程を含み、さらにその他の工程を含むことができる。
　前記細胞は、前述のとおりである。
　前記培養としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、前記細胞を培養培地に播種し、静置、撹拌又は振盪するする方法などが挙げられる。
　（アフィニティ担体）
　前記アフィニティ担体は、水不溶性基材と、前記水不溶性基材に固定化された、前記低分子化抗体、又は前記アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）弱酸性溶出用低分子化抗体と、を有し、さらにその他の要素を有することができる。
　すなわち、前記アフィニティ担体は、前記水不溶性基材と前記低分子化抗体、又は前記アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）弱酸性溶出用低分子化抗体とが直接接続していてもよいし、前記水不溶性基材と前記低分子化抗体、又は前記アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）弱酸性溶出用低分子化抗体とがその他の要素を介して接続していてもよい。
　前記低分子化抗体、又は前記アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）弱酸性溶出用低分子化抗体は、前述のとおりである。
　前記アフィニティ担体における、前記低分子化抗体、又は前記アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）弱酸性溶出用低分子化抗体の密度（リガンド密度）としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１～２０ｍｇ／ｍＬが好ましく、１～１０ｍｇ／ｍＬがより好ましく、２～１０ｍｇ／ｍＬがさらに好ましい。
　前記リガンド密度は、以下のとおり測定する。
　水不溶性基材へのリガンド固定化の際のろ液を回収し、０．２μｍフィルターを通した後、吸光度を測定することにより水不溶性基材に固定化されたリガンドのリガンド密度を算出する。リガンド密度の算出は低分子化抗体の吸光度とＢＳＡの吸光係数を用いて作成した検量線とろ液の吸光度から行う。
－水不溶性基材－
　前記水不溶性基材としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、水不溶性繊維、ビーズ、メンブレン（中空糸を含む）、モノリスなどが挙げられる。
　これらの中でも、水不溶性繊維、又はビーズが好ましい。
－－水不溶性繊維－－
　前記水不溶性繊維の厚みの下限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、製造の安定性の点から、０．０８ｍｍ以上が好ましく、０．１０ｍｍ以上がより好ましく、０．１２ｍｍ以上がさらに好ましい。
　前記水不溶性繊維の厚みの上限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、目付の均一性の点から、０．５０ｍｍ以下が好ましく、０．４０ｍｍ以下がより好ましく、０．３０ｍｍ以下がさらに好ましい。
　前記水不溶性繊維の目付の下限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、製造の安定性の点から、５ｇ／ｍ２以上が好ましく、１０ｇ／ｍ２以上がより好ましい。
　前記水不溶性繊維の目付の上限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、水不溶性繊維の均一性の点から、１００ｇ／ｍ２以下が好ましく、９０ｇ／ｍ２以下がより好ましく、８０ｇ／ｍ２以下がさらに好ましく、７０ｇ／ｍ２以下が特に好ましい。
　前記水不溶性繊維の嵩密度の下限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、デバイスへの装入後の水不溶性繊維構造の変化が少ない点から、５０ｋｇ／ｍ３以上が好ましく、６０ｋｇ／ｍ３以上がより好ましく、７０ｋｇ／ｍ３以上がさらに好ましい。
　前記水不溶性繊維の嵩密度の上限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、通液性能の点から、４００ｋｇ／ｍ３以下が好ましく、３５０ｋｇ／ｍ３以下がより好ましく、３００ｋｇ／ｍ３以下がさらに好ましい。
　なお、前記嵩密度とは、前記水不溶性繊維１ｍ３当たりの重さを測定した値をいう。
　前記水不溶性繊維の形状としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、円形、四角形、三角形、俵型、などが挙げられる。
　前記水不溶性繊維の表面は、グラフト重合、ポリマーコーティング、アルカリ、酸等の薬品処理、プラズマ処理などで改質されていてもよい。
　前記グラフト重合としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、電子線照射を行うグラフト重合法などが挙げられる。
　前記電子線照射を行うグラフト重合法には、予め水不溶性繊維に電子線を照射してラジカルを発生させた後、該発生種が発生した水不溶性繊維にラジカル重合性化合物を付与し、その後の後重合によりグラフト重合性化合物の重合を促進させる、いわゆる前照射法と、水不溶性繊維にラジカル重合性化合物を付与した後、これに電子線を照射してラジカルを発生させ、その後の後重合によりグラフト重合化合物の重合を促進させる、いわゆる同時照射法とがある。本発明では、前記前照射法と同時照射法のいずれも採用することができる。
　前記前照射法及び同時照射法のいずれの場合において、水不溶性繊維へラジカル重合性化合物を付与した後、後重合が終了するまでの間は、水不溶性繊維の表面にフィルムをラミネートしておくことが好ましい。これにより、ラジカル重合性化合物の揮散を防ぐことができ、均一にグラフト重合が開始され、かつ空気を遮断することで空気中の酸素によるラジカルの失活が抑制される。また、同時照射法の場合には、電子線照射時にも水不溶性繊維表面がフィルムによりシールされていて、水不溶性繊維とラジカル重合性化合物は空気中の酸素と遮断されるため、空気中の酸素による水不溶性繊維の酸化が起こりにくくなる。
　前記フィルムとしては、０．０１～０．２０ｍｍの厚みを有する高分子フィルムであって、使用する電子線の透過力に応じて、適切な厚さのものを使用する。
　前記フィルムの材質としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ポリエチレンテレフタレートなどのポリエステル系やポリオレフィン系などが挙げられるが、これらの中でも、ポリエチレンテレフタレートが好ましい。特に、同時照射法の場合には、電子線照射でポリマーラジカルの生成効率が低く、また酸素透過性の低いポリエチレンテレフタレートフィルムが好適である。
　前記前照射法においては、先ず、水不溶性繊維に電子線を照射することにより、重合反応を誘発するラジカル（ポリマーラジカルなど）が生成する。電子線照射時の雰囲気温度は、低い温度の方がラジカルの生成効率が上がるが、通常の室温でもよい。
　前照射法の場合の前記電子線の照射条件としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、好ましくは照射雰囲気の酸素濃度を３００ｐｐｍ以下に設定した状態で、加速電圧１００～２０００キロボルト（以下「ｋＶ」と略記する。）、より好ましくは１２０～３００ｋＶ及び電流１～１００ｍＡの範囲において、水不溶性繊維の厚み、目標グラフト率などに応じて適宜決定する。
　また、前記電子線の照射線量は、目標グラフト率及び照射による水不溶性繊維の物性低下を考慮して適宜決定すればよく、通常１０～３００キログレイ（以下「ｋＧｙ」と略記する。）程度が適当であり、好ましくは１０～２００ｋＧｙである。照射線量が１０ｋＧｙ未満では充分なグラフト重合量に必要なラジカルの生成が起こらず、３００ｋＧｙを越えると、水不溶性繊維が放射線耐性のある高分子素材からなる場合においても主鎖の切断による物性低下が起こるので好ましくない。
　なお、前照射法の場合の照射雰囲気は、窒素ガスなど不活性ガス雰囲気が好ましいが、空気雰囲気でもよい。ただし、空気雰囲気では空気中の酸素により、水不溶性繊維が酸化される可能性がある。
　次いで、前記電子線照射後の水不溶性繊維に、ラジカル重合性化合物を付与する。例えば、窒素ガスを通気することで溶存酸素を除去されたラジカル重合性化合物溶液の槽に浸漬する、又は前記ラジカル重合性化合物溶液の槽を浸漬通過させることにより所定時間滞留させて、水不溶性繊維にラジカル重合性化合物を十分付与する。
　なお、本発明における「浸漬」とは、水不溶性繊維がラジカル重合性化合物溶液に接触することを意味する。よって、水不溶性繊維にラジカル重合性化合物を付与する方法としては、様々なコーティング方法を用いることができる。その中でも含浸コート、コンマダイレクトコート、コンマリバースコート、キスコート、グラビアコート等は効率良くコーティングできるため、好ましい。
　ラジカル重合性化合物を付与した水不溶性繊維を、前記溶液槽から取り出す。その際、水不溶性繊維の表面にフィルムをラミネートすることが好ましい。例えば、水不溶性繊維がシート状又は繊維状の場合には、２枚のフィルムの間に、ラジカル重合性化合物溶液を付与した水不溶性繊維を挟み、密着させる。ラジカル重合性化合物溶液を付与した水不溶性繊維にフィルムを密着させることで、ラジカル重合性化合物溶液の付与率を一定に制御でき、かつ水不溶性繊維に対してラジカル重合性化合物を均一に付与できる。また、フィルムをラミネートして密閉された空間内で、水不溶性繊維とラジカル重合性化合物とを反応させることで、グラフト反応がより促進される。
　なお、本発明における「ラミネート」とは、水不溶性繊維とフィルムを接触させることを意味する。
　前記溶液槽から取り出した水不溶性繊維を、所定温度の後重合槽に所定の時間滞留させることで、ラジカル重合性化合物のグラフト重合を促進させる（後重合）。このときの後重合温度は、０℃～１３０℃、より好ましくは４０℃～７０℃である。これにより、水不溶性繊維とラジカル重合性化合物のグラフト重合反応が促進される。その後、洗浄・乾燥することで、グラフト化繊維を得ることができる。なお、後重合雰囲気は、窒素ガスなど不活性ガス雰囲気が好ましいが、フィルムをラミネートした状態で後重合を行う場合には空気雰囲気でもよい。
　また、前記同時照射法の場合は、窒素ガスを通気することで溶存酸素を除去されたラジカル重合性化合物溶液の槽に浸漬する、又は前記槽を浸漬通過させることにより所定時間滞留させて、水不溶性繊維にラジカル重合性化合物を十分に付与する。その後、前記溶液槽から取り出し、電子線を照射する。溶液槽から取り出す際、水不溶性繊維の表面にフィルムをラミネートし、この状態で、電子線を照射することが好ましい。
　同時照射法の場合の加速電圧は、高分子素材の種類、ラジカル重合性化合物溶液を付与した水不溶性繊維及びラミネートしたフィルムの合計厚さ、目標グラフト率に応じて適宜決定すればよいが、通常、加速電圧１００～２０００ｋＶ程度が適当である。また、電子線の照射線量は前記前処理法の場合と同様でよい。電子線照射時の雰囲気は、窒素やヘリウムなど不活性ガス雰囲気が好ましいが、水不溶性繊維の表面にフィルムをラミネートした場合には、照射雰囲気によるグラフト重合への影響はないので、経済性を考慮して、空気中照射が適当である。
　電子線照射された水不溶性繊維は、前記前照射法の場合と同様にして、ラジカル重合性化合物の後重合を行う。その後、洗浄・乾燥することで、グラフト化繊維を得ることができる。なお、同時照射法においても、後重合雰囲気は、窒素ガスなど不活性ガス雰囲気が好ましいが、フィルムをラミネートした状態で後重合を行う場合には空気雰囲気でもよい。
　また、本発明で使用されるラジカル重合性化合物は、電子線照射により水不溶性繊維に生成したポリマーラジカルと結合を生じる化合物である。具体的には、アクリル酸、メタクリル酸、イタコン酸、メタクリルスルホン酸、スチレンスルホン酸などの酸性基を有する不飽和化合物やこれらのエステル、アクリルアミド、メタクリルアミドなどの不飽和カルボン酸アミド、末端にグリシジル基、水酸基、アミノ基やホルミル基を有する不飽和化合物、ビニルホスホネート等の不飽和有機燐酸エステル、第４アンモニウム塩、第３アンモニウム塩などの塩基性を有するメタクリル酸エステル、フルオロアクリレート、アクリロニトリルなどを挙げることができるが、これらに限られるものではない。これらは単独又は２種以上混合して用いることができる。２種類以上のラジカル重合性化合物を用いることで、グラフト鎖が少なくとも２種類以上のラジカル重合性化合物の共重合体からなる複合グラフト化繊維が得られる。
　これらラジカル重合性化合物の中でも、本発明においては、グラフト率の観点からアクリル系モノマーを用いることが好ましい。更に、アミノ基、水酸基、チオール基などを有するリガンドとの反応性の観点から、分子末端にカルボキシ基やエポキシ基を有するアクリル系モノマーが好ましく、より好ましくは、アクリル酸、メタクリル酸、及びメタクリル酸グリシジル（以下「ＧＭＡ」と略記する）からなる群から選択される少なくとも１種である。
　上記のラジカル重合性化合物は、水、低級アルコールのような有機溶剤又はこれらの混合溶液を溶媒とした希釈溶液であってもよい。この希釈溶液のラジカル重合性化合物の濃度は希望するグラフト率により変化するが、１～７０容量％で調製することができる。また、ホモポリマーの生成しやすいラジカル重合性化合物を用いる場合は、ラジカル重合性化合物の希釈溶液に、銅や鉄の金属塩を添加することで、ホモポリマーの生成を抑制してもよい。
　前記溶液中の前記ラジカル重合性化合物の濃度の下限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１重量％以上が好ましく、２．５重量％以上がより好ましく、５重量％以上がさらに好ましく、１０重量％以上が特に好ましい。
　前記溶液中の前記ラジカル重合性化合物の濃度の上限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、７０重量％以下が好ましく、６０重量％以下がより好ましく、５０重量％以下がさらに好ましく、４０重量％以下が特に好ましい。
　また、前記ラジカル重合性化合物溶液が溶剤を含むと、グラフト率が向上する。この場合において、溶媒中における乳化剤の濃度は０．１～５重量％の範囲となるように調整することが好ましい。
　前記乳化剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えばポリソルベートが好ましく、前記ポリソルベートとしては、ポリソルベート２０、６０、６５、８０等が挙げられるが、これらの中でも親水性が高いポリソルベート２０がより好ましい。
　なお、ラジカル重合性化合物溶液はあらかじめ、窒素ガスなど不活性ガスを吹き込むことで、溶存酸素を除去することが望ましい。
　前記グラフト重合反応のグラフト率としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、５０％以上が好ましい。
　本発明で前記「グラフト率」とは、グラフト反応前の水不溶性繊維乾燥重量（Ｗ１）とグラフト反応後のグラフト化繊維乾燥重量（Ｗ２）から以下のように算出した値である。
　グラフト率＝〔（Ｗ２－Ｗ１）／Ｗ１〕×１００（％）
　前記水不溶性繊維の材料としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ポリオレフィン系、ポリプロピレン、無水マレイン酸ポリプロピレン、変性ポリプロピレン、ポリエチレン、セルロース、再生セルロース、セルロースアセテート、セルロースジアセテート、セルローストリアセテート、エチルセルロース、酢酸セルロース、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリブチレンテレフタレート（ＰＢＴ）、アクリル樹脂、ポリカーボネート、ポリエステル系、ポリアクリロニトリル、ポリアミド、ポリスチレン、臭素化ポリスチレン、ポリアルキル（メタ）アクリレート、ポリ塩化ビニル、ポリクロロプレン、ポリウレタン、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセテート、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリブタジエン、ブタジエン－アクリロニトリル共重合体、スチレン－ブタジエン共重合体、エチレン－ビニルアルコール共重合体、アラミド、ガラス、ナイロン、レーヨンなどが挙げられる。これらは、１種を単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、電子線グラフト重合の反応性が良好な点から、ポリオレフィン系、又はセルロース系が好ましく、ポリオレフィン系がより好ましく、ポリプロピレンがさらに好ましい。
　前記水不溶性繊維の平均繊維直径の下限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、良好な引張強度を有する点、又は生産性の点から、０．３μｍ以上が好ましく、０．４μｍ以上がより好ましく、０．５μｍ以上がさらに好ましい。
　前記水不溶性繊維の平均繊維直径の上限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、精製性能が高い点から、１５μｍ以下が好ましく、１０μｍ以下がより好ましく、５μｍ以下がさらに好ましく、３μｍ以下が特に好ましい。平均繊維直径が１５μｍを超えるものは、精製性能が低いため好ましくない。
　前記水不溶性繊維の平均孔径の下限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、良好な通液性能を有する点、又は生産性の点から、０．１μｍ以上が好ましく、１．０μｍ以上がより好ましく、１．５μｍ以上がさらに好ましい。
　前記水不溶性繊維の平均孔径の上限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、精製性能が高い点から、５０μｍ以下が好ましく、３０μｍ以下がより好ましく、２０μｍ以下がさらに好ましく、１０μｍ以下が特に好ましい。
　前記水不溶性繊維としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、不織布であっても、織布又は編物であってもよいが、製造工程の簡略化の点から、不織布が好ましい。
　前記不織布の製造方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、湿式法、乾式法、メルトブロー法、エレクトロスピニング法、フラッシュ紡糸法、抄造法、スパンボンド法、サーマルボンド法、ケミカルボンド法、ニードルパンチ法、スパンレース法（水流絡合法）、ステッチボンド法、スチームジェット法などが挙げられる。これらの中でも、極細繊維が得られる点から、メルトブロー法、エレクトロスピニング法、フラッシュ紡糸法、抄造法などが好ましい。
　前記メルトブロー法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、押出機で溶融した熱可塑性樹脂をメルトブローダイから高温・高速の空気流で糸状に吹き出し、繊維状に延伸された樹脂をコンベアー上で集積することで、繊維同士の絡み合い、及び融着が起こりノーバインダーの自己接着型極細繊維の不織布を得る方法などが挙げられる。この際、樹脂粘度、溶融温度、吐出量、熱風温度、風圧、ＤＣＤ（紡糸口金と表面からコンベアーまでの距離）などを調整することにより、前記不織布の繊維直径、目付、繊維配向、繊維分散性を制御することができる。更に、熱プレス加工やテンター加工等により、不織布の厚み、平均孔径の制御を行うことが可能である。
－－ビーズ－－
　前記ビーズとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、エポキシ化ビーズ、又はＮＨＳ（Ｎ―ヒドロキシスクシンイミド）エステル化ビーズが好ましい。
　前記ビーズの平均粒径は、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、体積平均粒径で２０μｍ以上１０００μｍ以下とすることが好ましい。当該体積平均粒径が２０μｍ以上であれば、デバイスに充填した際における背圧を低く抑えることが可能になる。一方、当該体積平均粒径が１０００μｍ以下であれば、表面積が大きくなって標的化合物の吸着量が大きくなる。当該体積平均粒径としては、３０μｍ以上がより好ましく、４０μｍ以上がさらに好ましく、また、２５０μｍ以下がより好ましく、１２５μｍ以下がさらに好ましく、１００μｍ以下がよりさらに好ましく、６０μｍ以下がよりさらに好ましい。
　多孔性ビーズの体積平均粒径は、ランダムに選んだ１００個の多孔性ビーズの粒径を測定して求めることができる。個々の多孔性ビーズの粒径は、個々の多孔性ビーズの顕微鏡写真を撮影して電子データとして保存し、粒径測定ソフトウェア（例えば、メディアサイバーネティックス社製「イメージプロプラス」）を用いて測定することができる。多孔性ビーズは、強度向上などのため、常法に従って、多官能化合物により架橋することが好ましい。
　前記ビーズの材料としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、セルロース、アガロース、デキストラン、デンプン、プルラン、キトサン、キチンなどの多糖類；ポリ（メタ）アクリル酸、ポリ（メタ）アクリル酸エステル、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコールなどの合成ポリマー、及びその架橋体；シリカガラス、ホウケイ酸ガラス、光学ガラス、ソーダガラスなどのガラスを挙げることができる。
　また、ポリスチレンやスチレン－ジビニルベンゼン共重合体など官能基を有さない合成ポリマーからなる基材の表面を、水酸基などの反応性官能基を有する高分子材料でコーティングしてもよい。かかるコーティング用高分子材料としては、ヒドロキシエチルメタクリレートや、ポリエチレンオキサイド鎖を有する単量体と、反応性官能基を有する他の重合性単量体との共重合体のようなグラフト共重合体などを挙げることができる。これらは、１種を単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
　市販品としては多孔質セルロースゲルであるＧＣＬ２０００、アリルデキストランとメチレンビスアクリルアミドを共有結合で架橋したＳｅｐｈａｃｒｙｌ（登録商標）　Ｓ－１０００、メタクリレート系の担体であるＴｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）、アガロース系の架橋担体であるＳｅｐｈａｒｏｓｅ　ＣＬ４Ｂ、セルロース系の架橋担体であるＣｅｌｌｕｆｉｎｅ（登録商標）、及びスチレン－ジビニルベンゼン共重合体を高分子材料でコーティングした担体であるＰＯＲＯＳ（登録商標）　５０ＯＨなどを例示することができる。これらの中でも、好ましい粒子径範囲を有する点、及び反応性官能基を有し修飾反応を行いやすい点から、ＰＯＲＯＳ（登録商標）　５０ＯＨが好ましい。
　－－モノリス－－
　前記モノリスとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、カルボキシイミダゾール活性化モノリスが好ましい。
　前記モノリスの平均孔径としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、良好な通液性能を有する点、又は生産性の点から、０．１μｍ以上が好ましく、１．０μｍ以上がより好ましく、１．５μｍ以上がさらに好ましい。
　前記モノリスの平均孔径の上限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、精製性能が高い点から、５０μｍ以下が好ましく、３０μｍ以下がより好ましく、２０μｍ以下がさらに好ましく、１０μｍ以下が特に好ましい。
　前記モノリスはポリビニルモノマー及びモノビニルモノマーから構築され、ポリビニルモノマー及びモノビニルモノマーの種類には特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、前記ポリビニルモノマーとしては、例えば、ジビニルベンゼン、ジビニルナフタレン、ジビニルピリジン、アルキレンジメタクリル酸エステル類、ヒドロキシアルキレンジメタクリル酸エステル類、ヒドロキシアルキレンジアクリル酸エステル類、オリゴエチレングリコールジアクリル酸エステル類、ビニルポリカルボン酸類、ビニルエーテル、ペンタエリトリトールジ－、トリ－、若しくはテトラメタクリル酸エステル又はペンタエリトリトールジ－、トリ－、又はテトラアクリル酸エステル、トリメチルオルプロパン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｌｐｒｏｐａｎｅ）トリメチルアクリル酸エステル又はトリメチルオルプロパンアクリル酸エステル、アルキレンビスアクリルアミド類又はアルキレンビスメタクリルアミド類、エチレンジメタクリレート、及びそれらの混合物が挙げられる。前記モノビニルモノマーとしては例えば、スチレン、環置換スチレン（但し、置換基は、クロロメチル基、１８までの炭素元素を有するアルキル基、水酸基、ｔ－ブチルオキシガルボニル基、ハロゲン基、ニトロ基、アミノ基、保護水酸基又はアミノ基を包含する）、ビニルナフタレン、アクリル酸エステル類、メタクリル酸エステル類、グリシジルメタクリレート、酢酸ビニル、及びピロリドン、並びにそれらの混合物を包含する。
　市販品としては例えば、エチレンジメタクリレートとグリシジルメタクリレートから構築されるＣＩＭｍｉｃ（登録商標）　ＣＤＩ－０．１　Ｄｉｓｋ　（Ｃａｒｂｏｘｙ　ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）（ザルトリウス社製）などを例示することができる。
－その他の要素－
　前記その他の要素としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、スペーサーなどが挙げられる。
－－スペーサー－－
　前記スペーサーを含むアフィニティ担体としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記低分子化抗体が、スペーサーを介して前記水不溶性基材に接続されているアフィニティ担体などが挙げられる。
　前記スペーサーが有する官能基としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、アミノ基、ヒドロキシ基、エポキシ基、カルボキシ基などが挙げられる。これらの官能基を有するスペーサーは、１種を単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、安定性、反応性、リガンドとの接続の容易さの点からエポキシ基が好ましい。
　前記スペーサーとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ポリマー、モノマー、ダイマー、トライマー、テトラマーを含むものなどが挙げられる。これらの中でも、ポリマーを含むものが好ましい。前記ポリマーは、コポリマーであってもよい。
　前記ポリマーとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、親水性ポリマー、疎水性ポリマーを含むものなどが挙げられる。これらの中でも、水系溶媒での取り扱いが可能な点、タンパク質とスペーサーとの非特異的な疎水性作用を抑制する点から、親水性ポリマーを含むものが好ましい。
　前記親水性ポリマーとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ポリアミン、多糖類を含むものなどが挙げられる。
　前記ポリアミンとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ポリエチレンイミン、ポリアリルアミン、ポリビニルアミン、ポリリジン、エチレンジアミン、１，２－プロパンジアミン、１，６－ヘキサメチレンジアミン、ピペラジン、２，５－ジメチルピペラジン、イソホロンジアミン、４，４’－ジシクロヘキシルメタンジアミン、１，４－シクロヘキサンジアミン等のジアミン類；ジエチレントリアミン、ジプロピレントリアミン、トリエチレンテトラミン等のポリアミン類；ヒドラジン、Ｎ，Ｎ’－ジメチルヒドラジン、１，６－ヘキサメチレンビスヒドラジン等のヒドラジン類；コハク酸ジヒドラジッド、アジピン酸ジヒドラジド、グルタル酸ジヒドラジド、セバシン酸ジヒドラジド、イソフタル酸ジヒドラジド等のジヒドラジド類などが挙げられる。これらは、１種を単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、分子量の異なる分子を容易に入手可能である点から、ポリエチレンイミン、又はポリアリルアミンを含むものが好ましい。
　前記多糖類としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、キトサン、キチン、セルロース、アガロース、カラギーナン、ヘパリン、ヒアルロン酸、ペクチン、キシログルカン、グルコマンナン、デンプン、グリコーゲンなどが挙げられる。これらは、１種を単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、アミノ基を含む点から、キトサンが好ましい。
　前記ポリマーのモル質量の下限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、生体粒子の吸着性の点から、５００ｇ／ｍｏｌ以上が好ましく、５０００ｇ／ｍｏｌ以上がより好ましく、１０，０００ｇ／ｍｏｌ以上がさらに好ましく、６０，０００ｇ／ｍｏｌ以上が特に好ましい。
　前記ポリマーのモル質量の上限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、生体粒子の吸着性の点から、２，０００，０００ｇ／ｍｏｌ以下が好ましく、１，０００，０００ｇ／ｍｏｌ以下がより好ましく、５００，０００ｇ／ｍｏｌ以下がさらに好ましく、２００，０００ｇ／ｍｏｌ以下が特に好ましい。
　前記ポリマーは、分岐鎖を有するポリマーであっても、線状ポリマーであってもよいが、生体粒子の吸着性の点から、分岐鎖を有するポリマーが好ましい。
　（アフィニティ担体の製造方法）
　前記アフィニティ担体の製造方法は、水不溶性基材と、低分子化抗体、又は前記アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）弱酸性溶出用低分子化抗体と、を接続する工程を含み、さらにその他の工程を含むことができる。
　前記水不溶性基材、及び前記低分子化抗体、又は前記アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）弱酸性溶出用低分子化抗体は、前述のとおりである。
　前記水不溶性基材と、前記低分子化抗体、又は前記アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）弱酸性溶出用低分子化抗体との接続としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、リガンドに存在するアミノ基、カルボキシル基、又はチオール基を利用した、従来のカップリング法で担体に結合してよい。
　前記カップリング法としては、担体を臭化シアン、エピクロロヒドリン、ジグリシジルエーテル、トシルクロライド、トレシルクロライド、ヒドラジン、及び過ヨウ素酸ナトリウムなどと反応させて担体を活性化し（あるいは担体表面に反応性官能基を導入し）、リガンドとして固定化する化合物とカップリング反応を行い固定化する方法、また、担体とリガンドとして固定化する化合物が存在する系にカルボジイミドのような縮合試薬、又はグルタルアルデヒドのように分子中に複数の官能基を持つ試薬を加えて縮合、架橋することによる固定化方法が挙げられる。
　また、前記水不溶性基材と、前記低分子化抗体、又は前記アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）弱酸性溶出用低分子化抗体との接続のための操作としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記水不溶性基材に前記低分子化抗体、又は前記アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）弱酸性溶出用低分子化抗体を加え、転倒混和する方法、前記水不溶性基材にその他の要素を加え、転倒混和し、さらに、低分子化抗体、又は前記アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）弱酸性溶出用低分子化抗体を加え転倒混和する方法などが挙げられる。
　前記転倒混和の時間としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、るが、１時間以上から４８時間以下が好ましく、２時間以上から４８時間以下がより好ましく、３時間以上から２４時間以下がさらに好ましく、８時間以上２４時間以下が特に好ましい。
　前記スペーサーを含むアフィニティ担体の製造方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、スペーサーの、一端に水不溶性基材を接続し、他端に低分子化抗体、又は前記アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）弱酸性溶出用低分子化抗体を接続する工程などが挙げられる。
　前記スペーサー、前記水不溶性基材、及び前記低分子化抗体、又は前記アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）弱酸性溶出用低分子化抗体は、前述のとおりである。
　ここで、スペーサーの、一端への水不溶性基材の接続と、スペーサーの、他端への低分子化抗体、又は前記アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）弱酸性溶出用低分子化抗体の接続の順序は問わないが、接続のための反応制御が容易であるという点から、スペーサーの、一端への水不溶性基材の接続の後、スペーサーの、他端への低分子化抗体、又は前記アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）弱酸性溶出用低分子化抗体の接続を行うことが好ましい。
　前記スペーサーの、一端への水不溶性基材の接続としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、水不溶性基材にスペーサー溶液を加え、転倒混和する方法などが挙げられる。
　前記転倒混和の時間としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、るが、１時間以上から４８時間以下が好ましく、２時間以上から４８時間以下がより好ましく、３時間以上から２４時間以下がさらに好ましく、８時間以上２４時間以下が特に好ましい。
　前記スペーサーの、他端への低分子化抗体、又は前記アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）弱酸性溶出用低分子化抗体の接続としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、水不溶性基材に低分子化抗体、又は前記アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）弱酸性溶出用低分子化抗体を加え、転倒混和する方法などが挙げられる。
　前記転倒混和の時間としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、るが、１時間以上から４８時間以下が好ましく、２時間以上から４８時間以下がより好ましく、３時間以上から２４時間以下がさらに好ましく、８時間以上２４時間以下が特に好ましい。
　前記アフィニティ担体を充填するためのデバイスの形状は特に限定されず、円盤状、円筒状、板状などを選択することができる。均一な通液を実現する観点からは、円盤状、又は円筒状が好ましい。
　（アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の製造方法）
　前記アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の製造方法は、前記アフィニティ担体とアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）とを接触させる接触工程を含み、さらにその他の工程を含むことができる。
　前記アフィニティ担体、及び前記アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は前述のとおりである。
　前記接触工程により、前記アフィニティ担体と前記アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）とを結合、又は吸着させることができる。
　前記接触としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記アフィニティ担体と前記アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）とを混合する方法、前記アフィニティ担体を充填したカラムに、前記アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を含む溶液を通液する方法などが挙げられる。
　前記カラムの材質としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ガラス、ポリプロピレンやアクリルなどの樹脂、ステンレスなどの金属などが挙げられる。
　－その他の工程－
　前記その他の工程としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記接触工程後の、前記アフィニティ担体に結合した前記アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を前記アフィニティ担体から分離する分離工程などが挙げられる。
　前記分離工程により、前記アフィニティ担体から前記アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を分離、解離、又は溶出させることができる。
　前記分離としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）が結合した前記アフィニティ担体と分離バッファー（溶出バッファー）とを混合する方法、前記アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）が結合した前記アフィニティ担体が充填されたカラムに、分離バッファー（溶出バッファー）を通液する方法などが挙げられる。
　前記分離バッファー（溶出バッファー）としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、ｐＨ３以上のバッファーが好ましく、ｐＨ３．５以上のバッファーがより好ましく、ｐＨ４以上のバッファーがさらに好ましく、ｐＨ４．５以上のバッファーが特に好ましい。
　前記分離工程において分離したアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の、分離２４時間後の遺伝子導入効率としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、分離前のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）と比較して５０％以上が好ましく、６０％以上がより好ましく、７０％以上がさらに好ましく、８０％以上が特に好ましい。
　また、前記分離工程において分離したアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の、分離２４時間後の遺伝子導入効率が、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）と結合する抗体であって、ｐＨ１．７～２．５のバッファーによりアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）と解離する抗体を有するアフィニティ担体からｐＨ２．１のバッファーを用いて分離したアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の、分離２４時間後の遺伝子導入効率と比較して１．２倍以上が好ましく、１．５倍以上がより好ましく、２倍以上がさらに好ましく、２．５倍以上が特に好ましい。
　前記アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）と結合する抗体であって、ｐＨ１．７～２．５のバッファーによりアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）と解離する抗体を有するアフィニティ担体としては、Ｃｙｔｉｖａ社のＣａｐｔｏ（登録商標）　ＡＶＢが好適に使用できる。
　（アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の精製方法）
　前記アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の精製方法は、前記アフィニティ担体とアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を接触させる接触工程を含み、さらにその他の工程を含むことができる。
　前記アフィニティ担体、前記アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、前記接触、及び前記その他の工程は前述のとおりである。
　（アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の感染価低減抑制方法）
　前記アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の感染価低減抑制方法は、前記アフィニティ担体とアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を接触させる接触工程を含み、さらにその他の工程を含むことができる。
　前記アフィニティ担体、前記アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、前記接触、及び前記その他の工程は前述のとおりである。
　以下、本発明の実施例を説明するが、本発明は、これらの実施例に何ら限定されるものではない。
　以下の実施例において用いた組換えＤＮＡ技術に関する詳細な方法などは、次の成書に記載されている：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　２ｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，　１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｇｒｅｅｎ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ　ａｎｄ　Ｗｉｌｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）。
　ＰＣＲにはＰｒｉｍｅ　ＳＴＡＲ　Ｍａｘ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）等を用い、反応条件は添付のマニュアルに記載の方法で行った。
＜製造例１：水不溶性繊維（不織布１）の作製＞
　ポリプロピレンを材料として、メルトブロー法により平均繊維径０．５６μｍ、目付１５ｇ／ｍ２、厚さ０．１１ｍｍの不織布を作製した。これにＧＭＡをモノマーとしたグラフト重合を行った。
　ラジカル重合性化合物溶液はＧＭＡ／ポリソルベート２０／水を重量％で８／２／９０となるように混合し、窒素ガスを通気することで溶存酸素を除去した。作製した不織布に加速電圧２５０ｋＶ、照射線量５０ｋＧｙとなる条件で、窒素ガス雰囲気下、室温で電子線照射を行った。電子線照射後の不織布をラジカル重合性化合物溶液に浸漬し、反応槽にて５０℃で４０分間過熱して重合反応を促進させた。その後、常温の水で不織布を洗浄した後、乾燥し、グラフト率７０％の水不溶性繊維（不織布１）を得た。
＜製造例２：水不溶性繊維ディスクの作製＞
　ポンチを用いて、前記製造例１で作製した不織布１を直径５ｍｍ、又は２５ｍｍの円形に打ち抜き、カラムに充填するための水不溶性繊維ディスク（不織布ディスク１、不織布ディスク２）をそれぞれ作製した。
＜比較例１：抗ＡＡＶ２－ＶＨＨ抗体の調製＞
　国際公開第２０２０／０６７４１８号パンフレットの実施例６に記載の方法で免疫実験を実施した。免疫したアルパカの血液から特開２０１５－１１９６３７号公報の実施例１に記載の方法で、抗体遺伝子群を取得し、抗ＡＡＶ２－ＶＨＨ抗体のファージライブラリーを調製した。
　ファージライブラリーからの抗ＡＡＶ２－ＶＨＨ抗体のスクリーニングは、ＡＡＶ２のｅｍｐｔｙ　ｐａｒｔｉｃｌｅ（ＥＰ）を抗原として、特開２０１５－１１９６３７号公報の実施例１に記載のバイオパンニングの方法で実施した。ＡＡＶ２のＥＰ溶液は、国際公開第２０２０／０６７４１８号パンフレットの実施例３に記載の方法で調製した。
　バイオパンニング後のファージ感染した大腸菌を段階希釈し、１００μｇ／ｍＬアンピシリンと２％グルコースを含む２ＹＴ寒天培地（１．６％トリプトン、１．０％酵母エキス、２．０％寒天）で培養した。シングルコロニーを、１００μｇ／ｍＬアンピシリンと２％グルコースを含む２ＹＴ培地　３ｍＬで、３７℃で一晩培養した。１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含む２ＹＴ培地　５ｍＬに、一晩培養した培養液を３０μＬ加え、３７℃、３００ｒｐｍで１時間培養した。培養後、培養液３ｍＬを分取し、ヘルパーファージ（Ｍ１３ＫＯ７（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）：１．０×１０１３／ｍＬ）をＭＯＩ＝５で感染させた。３７℃で３０分間静置した後、３７℃、３００ｒｐｍで３０分間振とうした。この培養液にカナマイシンを５０μｇ／ｍＬになるように添加し、３７℃、３００ｒｐｍで一晩培養した。培養後、培養液を４℃、４，０００ｒｐｍで３０分間遠心し、上清を０．２μｍのフィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社製）でろ過し、大腸菌を除去し、抗ＡＡＶ２－ＶＨＨ抗体がディスプレイされたファージを取得した。
　このファージ溶液を抗体溶液とし、国際公開第２０２０／０６７４１８号パンフレットに記載の方法で、ＡＡＶ２に対する結合活性を評価し、結合活性の高いクローンを複数種選抜した。
　結合活性の高いファージクローン３種を鋳型に、プライマー１（配列番号１１）及びプライマー２（配列番号１２）を用いてＰＣＲによりＶＨＨ抗体核酸配列を増幅させた。ｐＥＴ－２８ｂ（メルク社製）を鋳型にプライマー３（配列番号１３）及びプライマー４（配列番号１４）を用いてＰＣＲにより線状化ベクターを調製した。それぞれＰＣＲにより調製したＶＨＨ抗体核酸配列及び線状化ベクター溶液を用いてＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）　ＨＤ　ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）により、抗ＡＡＶ－ＶＨＨ抗体１発現ベクター、抗ＡＡＶ－ＶＨＨ抗体２発現ベクター又は抗ＡＡＶ－ＶＨＨ抗体３発現ベクターをそれぞれ調製した。反応条件は添付のマニュアルに記載の方法で行った。
　上記で調製した抗ＡＡＶ－ＶＨＨ抗体１発現ベクター又は抗ＡＡＶ－ＶＨＨ抗体２発現ベクターをそれぞれ０．１μＬと、大腸菌コンピテント細胞株ＢＬ２１（ＤＥ３）（メルク社製）１μＬを氷上で混合し、２０分間静置した。４２℃で４５秒間加温して、氷上で冷却した。冷却後、ＳＯＣ培地（２０ｇ／Ｌバクトトリプトン（ベクトンディッキンソンアンドカンパニー（ＢＤ）社製）、５ｇ／Ｌバクト酵母エキス（ＢＤ社製）、１０ｍＭ塩化ナトリウム、２．５ｍＭ塩化カリウム、１０ｍＭ硫酸マグネシウム、１０ｍＭ塩化マグネシウム、２０ｍＭグルコース）を１００μＬ添加して、３７℃で１時間回復培養した。ＬＢＫ選択寒天プレート（１０ｇ／Ｌポリペプトン（ＢＤ社製）、５ｇ／Ｌバクト酵母エキス（ＢＤ社製）、１０ｇ／Ｌ塩化ナトリウム、５０μｇ／Ｌカナマイシン、１５ｇ／Ｌアガロース）に塗布し、３７℃、１６時間の静置培養で生育する株を選択し、３種のＶＨＨリガンド発現株を取得した。得られたＶＨＨリガンド発現株３種をそれぞれ試験管に入れた２ｍＬの２ＹＴ培地（１．６％（ｗ／ｖ）ポリペプトン（日本製薬社製）、１％（ｗ／ｖ）酵母エキス（ＢＤ社）、０．５％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウム）に植菌し、３７℃で６時間、毎分１１０回の振とう速度で前培養を行った。５００ｍＬ容坂口フラスコに５０ｍＬのＭａｇｉｃＭｅｄｉａ（登録商標）Ｅ．ｃｏｌｉＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＭｅｄｉｕｍに、前培養液１２５μＬを植菌し、３７℃で１６時間、毎分１１０回の振とう速度で培養を行った。
　得られたＶＨＨ発現培養液から、ＡＫＴＡ（登録商標）　ａｖａｎｔ　２５（Ｃｙｔｉｖａ社）を用いた陽イオン交換クロマトグラフィーにより、抗ＡＡＶ２－ＶＨＨ抗体を精製した。精製した抗ＡＡＶ－ＶＨＨ抗体を遠心限外ろ過ユニットＯＭＥＧＡ　Ｍｅｍｂｒａｎｅ　１Ｋ（ＰＡＬＬ社製）で濃縮し、アミノ酸配列が配列番号８である精製ＶＨＨ抗体（ＶＨＨリガンド１）、アミノ酸配列が配列番号９である精製ＶＨＨ抗体（ＶＨＨリガンド２）、及びアミノ酸配列が配列番号１０である精製ＶＨＨ抗体（ＶＨＨリガンド３）を得た。
＜実施例１：抗ＡＡＶ２－ＶＨＨ抗体の変異体の調製＞
　（１）抗ＡＡＶ２－ＶＨＨ抗体の変異体を発現するプラスミドの調製１
　前記ＶＨＨリガンド１を発現するＤＮＡを鋳型とし、表１に示した、１ｓｔＰＣＲ－１のプライマーの組合せを用いたＰＣＲ（１ｓｔＰＣＲ－１）と、１ｓｔＰＣＲ－２のプライマーの組合せを用いたＰＣＲ（１ｓｔＰＣＲ－２）を行った。
　続いて、前記１ｓｔＰＣＲ－１で得られた増幅断片と前記１ｓｔＰＣＲ－２で得られた増幅断片とを混合したものを鋳型としプライマー５（配列番号１５）及びプライマー１８（配列番号２８）を用いてＰＣＲを行い、上流にＮｄｅＩ、下流にＢｐｕ１１０２Ｉの制限酵素サイトを付加した各種変異ＶＨＨ遺伝子発現ＤＮＡ断片（変異遺伝子ＶＨＨリガンド４、変異遺伝子ＶＨＨリガンド５、及び変異遺伝子ＶＨＨリガンド６、変異遺伝子ＶＨＨリガンド７、及び変異遺伝子ＶＨＨリガンド８、及び変異遺伝子ＶＨＨリガンド９）を調製した。
　前記変異遺伝子ＶＨＨリガンド４、変異遺伝子ＶＨＨリガンド５、変異遺伝子ＶＨＨリガンド６、変異遺伝子ＶＨＨリガンド７、変異遺伝子ＶＨＨリガンド８、変異遺伝子ＶＨＨリガンド９により発現されるＶＨＨリガンド４～９は、いずれもＶＨＨリガンド１の１アミノ酸置換変異体である。
　前記ＶＨＨリガンド４、及びＶＨＨリガンド５は可変重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ２）に、前記ＶＨＨリガンド６、及びＶＨＨリガンド７はフレームワーク領域３（ＦＲ３）に、前記ＶＨＨリガンド８、及びＶＨＨリガンド９は可変重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ３）に存在するアミノ酸のうちの１つに変異が導入されているＶＨＨリガンドである。
　前記ＶＨＨリガンド４は、ＣＤＲ２のアミノ酸配列が、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、Ｎ末端から２番目のセリンがアラニンに置換されたアミノ酸配列を有し、前記ＶＨＨリガンド５は、ＣＤＲ２のアミノ酸配列が、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、Ｎ末端から６番目のスレオニンがアラニンに置換されたアミノ酸配列を有する。
　前記ＶＨＨリガンド６は、ＦＲ３のアミノ酸配列が、配列番号３に記載のアミノ酸配列のうち、Ｎ末端から２番目のアスパラギンがアラニンに置換されたアミノ酸配列を有し、前記ＶＨＨリガンド７は、ＦＲ３のアミノ酸配列が、配列番号３に記載のアミノ酸配列のうち、Ｎ末端から１５番目のアルギニンがアラニンに置換されたアミノ酸配列を有する。
　前記ＶＨＨリガンド８は、ＣＤＲ３のアミノ酸配列が、配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち、Ｎ末端のアルギニンがアラニンに置換されたアミノ酸配列を有し、前記ＶＨＨリガンド９は、ＣＤＲ３のアミノ酸配列が、配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち、Ｎ末端から４番目のトリプトファンがアラニンに置換されたアミノ酸配列を有する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　上記で調製した変異ＶＨＨ抗体遺伝子を含むＤＮＡ断片をＮｄｅＩ、Ｂｐｕ１１０２Ｉ処理後に、ｐＥＴ－２８ｂ（メルク社製）のＮｄｅＩ、Ｂｐｕ１１０２Ｉサイトに挿入して各種変異ＶＨＨ抗体遺伝子発現ベクターを構築した。
上記で構築した変異重鎖抗体発現ベクターを用いてＤＨ５αを形質転換し、得られた形質転換体を１．５ｍＬのカナマイシン含有ＴＢ培地で培養し、得られた菌体から各種プラスミドを取得した。
　（２）抗ＡＡＶ２－ＶＨＨ抗体の変異体を発現する大腸菌の作製１
　ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－ＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓＫｉｔ（東洋紡社製）を用いて抗ＡＡＶ－変異ＶＨＨ抗体発現ベクターを作製した。反応条件は添付のマニュアルに記載の方法で行った。前記ＶＨＨリガンド２を発現するＤＮＡをＰＣＲの鋳型に、表２に示すプライマーを用いて、インバースＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物にＤｐｎＩを添加して、３７℃で一時間静置により鋳型ベクターを消化した。ＤｐｎＩ処理済ＰＣＲ産物のＳｅｌｆ－ｌｉｇａｔｉｏｎをＴ４　Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｋｉｎａｓｅ及びＬｉｇａｔｉｏｎ　ｈｉｇｈにより、１６℃で１時間静置してＤｐｎＩ処理済ＰＣＲ産物のＳｅｌｆ－ｌｉｇａｔｉｏｎを行い、ＶＨＨリガンド１０発現ベクターを調製した。
　上記で調製したＶＨＨリガンド１０発現ベクター０．１μＬと、大腸菌コンピテント細胞株ＢＬ２１（ＤＥ３）（メルク社製）１μＬを氷上で混合し、２０分間静置した。４２℃で４５秒間加温して、氷上で冷却した。冷却後、ＳＯＣ培地（２０ｇ／Ｌバクトトリプトン（ベクトンディッキンソンアンドカンパニー（ＢＤ）社製）、５ｇ／Ｌバクト酵母エキス（ＢＤ社製）、１０ｍＭ塩化ナトリウム、２．５ｍＭ塩化カリウム、１０ｍＭ硫酸マグネシウム、１０ｍＭ塩化マグネシウム、２０ｍＭグルコース）を１００μＬ添加して、３７℃で１時間回復培養した。ＬＢＫ選択寒天プレート（１０ｇ／Ｌポリペプトン（ＢＤ社製）、５ｇ／Ｌバクト酵母エキス（ＢＤ社製）、１０ｇ／Ｌ塩化ナトリウム、５０μｇ／Ｌカナマイシン、１５ｇ／Ｌアガロース）に塗布し、３７℃、１６時間の静置培養で生育する株を選択し、ＶＨＨリガンド１０発現株を取得した。
　前記ＶＨＨリガンド１０発現株により発現されるＶＨＨリガンド１０はＶＨＨリガンド２の１アミノ酸置換変異体であり、フレームワーク領域３（ＦＲ３）に存在するアミノ酸のうちの１つに変異が導入されているＶＨＨリガンドである。
　前記ＶＨＨリガンド１０は、ＦＲ３のアミノ酸配列が、配列番号４に記載のアミノ酸配列のうち、Ｎ末端から１５番目のアルギニンがアラニンに置換されたアミノ酸配列を有する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　（３）抗ＡＡＶ２－ＶＨＨ抗体の変異体を発現する大腸菌の作製２
　ＶＨＨリガンド２を発現するＤＮＡに代えて前記ＶＨＨリガンド３を発現するＤＮＡを鋳型とした以外は実施例１の（２）と同様にして、ＶＨＨリガンド１１発現株を取得した。
　前記変異遺伝子ＶＨＨリガンド１１により発現されるＶＨＨリガンド１１はＶＨＨリガンド３の１アミノ酸置換変異体であり、フレームワーク領域３（ＦＲ３）に存在するアミノ酸のうちの１つに変異が導入されているＶＨＨリガンドである。
　前記ＶＨＨリガンド１１は、ＦＲ３のアミノ酸配列が、配列番号４に記載のアミノ酸配列のうち、Ｎ末端から１５番目のアルギニンがアラニンに置換されたアミノ酸配列を有する。
　（４）抗ＡＡＶ２－ＶＨＨ抗体の変異体の調製
　ＶＨＨリガンド１を発現する大腸菌に代えて、実施例１の（１）で得られたプラスミドを用いて形質転換したＢＬ２１（ＤＥ３）、又は実施例１の（２）～（３）で得られたＶＨＨリガンド１０発現株若しくはＶＨＨリガンド１１発現株を用いた以外は比較例１と同様にして各種抗ＡＡＶ２－ＶＨＨ抗体変異体（ＶＨＨリガンド４、ＶＨＨリガンド５、ＶＨＨリガンド６、ＶＨＨリガンド７，ＶＨＨリガンド８、ＶＨＨリガンド９、ＶＨＨリガンド１０、ＶＨＨリガンド１１）を得た。
＜製造例３：動物細胞によるアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ２）産生、及びＡＡＶ２前処理液の調製＞
　蛍光タンパク質ＧＦＰの改変体であるＶＥＮＵＳ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＣＱ４３９５５．１）を発現するＡＡＶ２作製用プラスミドを、ＡＡＶベクター作製キット（「ＡＡＶｐｒｏ（登録商標）　Ｈｅｌｐｅｒ　Ｆｒｅｅ　Ｓｙｓｔｅｍ」タカラバイオ社製）を用いて作製した。
　培養したＨＥＫ２９３細胞に、トランスフェクション試薬（「Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ　ＭＡＸ」Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ社製，ＭＷ：４０，０００）を用いて作製したプラスミドをトランスフェクションし、ＡＡＶ２を産生させた。培養終了後、細胞を剥離し、細胞培養液を回収した。これを遠心分離し、上清を除去し、ＡＡＶ２産生細胞を得た。
　上記で得たＡＡＶ２産生細胞を、０．１％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００を含む、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製、以下、「ＰＢＳ」と略記する）に懸濁し、氷中で２０分間撹拌し、細胞破砕した。得られた細胞破砕液に、７．５ｖ／ｖ％の１Ｍ塩化マグネシウム水溶液と、０．１ｖ／ｖ％の２５０ｋＵ／ｍＬ　ＫＡＮＥＫＡ　Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ（カネカ社製）を添加し、３７℃で３０分間静置し、細胞由来核酸を分解した。反応後、反応液に対して１５ｖ／ｖ％の０．５Ｍ　ＥＤＴＡ溶液を添加した後、デプスフィルター（Ｐａｌｌ社製）により清澄化した。得られた清澄化液をＡＡＶ２前処理液とした。
＜製造例４：ＡＡＶ２粗精製液の調製＞
　非特許文献（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　２００７　１４０：１８３－１９２）を参考に、製造例３で調整したＡＡＶ２前処理液を陽イオン交換クロマトグラフィーにより精製した。
　ＰＯＲＯＳ（登録商標）　５０ＨＳ（Ｔｈｅｒｍｏ社製）をＴｒｉｃｏｒｎ（登録商標）　１０／１５０（Ｃｙｔｉｖａ社製）に充填し、陽イオン交換精製用のカラムとした。
　下記Ａ～Ｆ液を調製し、使用前に０．２μｍフィルターを通した。
Ａ液：ＮａＰＯ４（２０ｍｍｏｌ／Ｌ），ＮａＣｌ（１００ｍｍｏｌ／Ｌ），ｐＨ７．４
Ｂ液：ＮａＰＯ４（２０ｍｍｏｌ／Ｌ），ＮａＣｌ（１００ｍｍｏｌ／Ｌ），Ｓａｒｋｏｓｙｌ（５ｍｍｏｌ／Ｌ），ｐＨ７．４
Ｃ液：ＮａＰＯ４（２０ｍｍｏｌ／Ｌ），ＮａＣｌ（３７０ｍｍｏｌ／Ｌ），ｐＨ７．４
Ｄ液：ＮａＣｌ（１ｍｏｌ／Ｌ）
Ｅ液：ＮａＯＨ（０．５ｍｏｌ／Ｌ）
Ｆ液：ＡＡＶ２前処理液をＡ液で希釈し、ｐＨ７．４に調製した溶液
　上記カラムをＡＫＴＡ（登録商標）　Ａｖａｎｔ　２５（Ｃｙｔｉｖａ社）に接続し、Ｄ液で洗浄、Ａ液で平衡化した。その後、Ｆ液を通液し、ＡＡＶ２をカラム担体に保持させた後、Ａ液、Ｂ液、Ａ液の順に洗浄し、Ｃ液でＡＡＶ２を溶出した。溶出終了後、カラムはＤ液、及びＥ液で洗浄した。
　粗精製したＡＡＶ２はＳＤＳ－ＰＡＧＥで精製度合いの確認、定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）で液中のＡＡＶ２量を定量した。
＜試験例１：ＶＨＨ抗体の解離速度定数の測定＞
　解離速度定数の測定に用いるため、ＶＨＨ抗体のビオチン化を実施した。
　ＶＨＨリガンドの吸光度とウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の吸光係数を用いて換算したＶＨＨ抗体濃度が５００μｇ／ｍＬになるようにＰＢＳで希釈した溶液に、１ｍＭになるようにＰＢＳに溶かしたＥＺ－Ｌｉｎｋ（商標）　ＮＨＳ－ＰＥＧ４－Ｂｉｏｔｉｎ溶液を１２．６μＬ加えて４度で４時間反応させた後、０．２μｍフィルターを通した。得られた溶液をＰＢＳで５倍希釈したものをビオチン化ＶＨＨ抗体溶液とした。
　バイオレイヤー干渉法を利用したバイオセンサーＯｃｔｅｔ　ＲＥＤ　３８４システム（ザルトリウス社）を用いて、ＶＨＨ抗体（ＶＨＨリガンド１、ＶＨＨリガンド４～９）のＡＡＶ２に対する親和性を解析した。
　ビオチン化ＶＨＨ抗体のセンサーチップへの固定化を実施した。センサーチップ（Ｏｃｔｅｔ（登録商標）　Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ　（ＳＡ）　Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ、ザルトリウス社）への固定化は、ＶＨＨ抗体に付加したビオチン分子とセンサーチップ上のストレプトアビジンとの親和性を利用して行った。
　まず、Ｏｃｔｅｔ（登録商標） Ｋｉｎｅｔｉｃｓ Ｂｕｆｆｅｒ １０Ｘ（ザルトリウス社）をＰＢＳで１０倍希釈し、Ｋｉｎｅｔｉｃｓ　Ｂｕｆｆｅｒを調製した。振とう速度１，０００ｒｐｍ、６０秒間、温度３０℃の条件で、センサーチップをＫｉｎｅｔｉｃｓ　Ｂｕｆｆｅｒに浸漬した後、ビオチン化ＶＨＨ抗体溶液に振とう速度１，０００ｒｐｍ、５分間、温度３０℃で定常状態になるまで固定化反応した。
　センサーチップ上の余剰のストレプトアビジンをブロッキングするために、振とう速度１，０００ｒｐｍ、５分間、温度３０℃の条件で、センサーチップをＰＢＳに溶解させた２５μｇ／ｍＬのビオシチン溶液に浸漬した。
　次に、振とう速度１，０００ｒｐｍ、２００秒間、温度３０℃の条件で、センサーチップをＫｉｎｅｔｉｃｓ　Ｂｕｆｆｅｒに浸漬した。
　次に、固定化したＶＨＨ抗体をＡＡＶ２のＥＰに結合させた。ＡＡＶ２のＥＰの吸光度とＢＳＡの吸光係数を用いて換算したＡＡＶ２のＥＰ濃度が２５μｇ／ｍＬのＡＡＶ２のＥＰ溶液を調製し、振とう速度１，０００ｒｐｍ、１０分間、温度３０℃の条件でセンサーチップを浸漬した。
　最後に解離溶液に漬けて、ＡＡＶ２の解離反応を測定した。振とう速度１，０００ｒｐｍ、５００秒間、温度３０℃の条件でセンサーチップを各種解離溶液（表３に組成を示した）に浸漬した。
　得られた結合解離曲線に対して、ＶＨＨリガンドとＡＡＶ２中のＶＰ３タンパク質との１：１又は２：１の結合モデルによるフィッティング解析を行い、ＡＡＶ２に対する解離速度定数（ｋｏｆｆ）を算出した。本実施例中では２：１の結合モデルによるフィッティング解析を行い、算出されたｋｏｆｆのうち、より値の大きなものを低分子化抗体とＡＡＶとの間の解離速度定数とする。但し、２：１の結合モデルによるフィッティング解析で１種の数ｋｏｆｆのみが得られる場合には、１：１の結合モデルによるフィッティング解析により解離速度定数を算出する。フィッティング解析には付属のソフトウェア（Ｄａｔａ　Ａｎａｌｙｓｉｓ）を使用し、以下のパラメータに従った。
［Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ　Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ］
Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｔｙｐｅ：Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｗｅｌｌｓ
Ａｌｉｇｎ　Ｙ：Ｙｅｓ
Ｓｔｅｐ　ｔｏ　Ａｌｉｇｎ：Ｂａｓｅｌｉｎｅ
Ｔｉｍｅ：１９０～１９９．５（ｓｅｃｏｎｄ）
Ｉｎｔｅｒｓｔｅｐ　Ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ：Ｎｏ
Ｓ－Ｇ　Ｆｉｌｔｅｒｉｎｇ：ＯＮ
［Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ］
Ｓｔｅｐ　ｔｏ　Ａｎａｌｙｚｅ：Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ
Ｍｏｄｅｌ：１　ｔｏ　１又は２　ｔｏ　１
Ｆｉｔｔｉｎｇ：Ｌｏｃａｌ　Ｐａｒｔｉａｌ
Ｗｉｎｄｏｗ　ｏｆ　Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）：０～５００（ｓｅｃｏｎｄ）
　各々の結果を表４に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
＜実施例２：担体１の作製＞
　（１）ビーズ基材への官能基化
　湿潤体積で３．０ｍＬ－ｇｅｌのＰＯＲＯＳ（登録商標）５０ＯＨ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に対し、超純水１．８ｍL、及び２Ｎ水酸化ナトリウム水溶液０．６ｍLを加えて３０分間転倒混和した。１，４‐ブタンジオールジグリシジルエーテル（ナガセ社製）３ｍＬを加え、３７℃で２時間転倒混和した。反応後、ビーズをグラスフィルターに移して純水で洗浄し、エポキシ化ビーズ１を得た。
　（２）エポキシ化ビーズ１へのＶＨＨリガンド８の固定化
　実施例２の（１）で得られたエポキシ化ビーズ１を湿潤体積で１．０ｍＬ－ｇｅｌとり、これに対し、０．５ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌを含む０．２ｍｏｌ／Ｌ炭酸緩衝液（ｐＨ１０．０）を加えた。それに対し、実施例１で作製した精製ＶＨＨ抗体（ＶＨＨリガンド８）を２．５ｍｇ分添加し、液量が４ｍＬとなるようにした。
　３７℃で３０分間転倒混和した後、無水硫酸ナトリウム０．３９７ｇをゆっくりと加えて溶解させ、さらに３７℃で１６時間転倒混和した。
　反応後、ビーズをグラスフィルターに移して上記炭酸緩衝液で洗浄した。この際のろ液を回収し、吸光度を測定することによりＶＨＨリガンドの（固定化収率）を算出した。
　続いて、洗浄後のビーズに残存するエポキシ基を封止するため、０．１ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ、及び１０％ｖ／ｖチオグリセロールを含む０．２ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）を加え、３７℃で６時間転倒混和した。反応後、ビーズをグラスフィルターに移して純水及び２０％エタノールで洗浄し、ＶＨＨ固定化ビーズ担体である担体１を得た。リガンド密度を測定したところ、４．７ｍｇ／ｍＬ－ｇｅｌであった（表５）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
＜実施例３：担体２の作製＞
　（１）不織布１へのポリエチレンイミン（ＰＥＩ）スペーサー固定化
　製造例２で得られた不織布ディスク１に対し、ＰＥＩ溶液（Ａｌｆａ　Ａｅｓａｒ社製、Ｍｗ：７０，０００、分岐鎖）を加え、３７℃で１６時間転倒混和した。反応後、不織布をグラスフィルターに移して純水で洗浄し、ＰＥＩスペーサーの固定化された不織布（ＰＥＩスペーサー固定化不織布１）を得た。
　（２）ＰＥＩスペーサー固定化不織布への官能基化
　実施例３の（１）で得られたＰＥＩスペーサー固定化不織布１に対し、超純水、及び２Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を加えて３０分間転倒混和した。１，４‐ブタンジオールジグリシジルエーテル（ナガセ社製）４ｍＬを加え、３７℃で２時間転倒混和した。反応後、不織布をグラスフィルターに移して純水で洗浄し、エポキシ化不織布１を得た。
　（３）エポキシ化不織布１へのＶＨＨリガンド８の固定化
　実施例３の（２）で得られたエポキシ化不織布１に対し、０．５ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌを含む０．２ｍｏｌ／Ｌ炭酸緩衝液（ｐＨ１０．０）を加えた。それに対し、実施例１で作製した精製ＶＨＨ抗体（ＶＨＨリガンド８）を４．８ｍｇ分添加し、液量が４．８ｍＬとなるようにした。３７℃で３０分間転倒混和した後、無水硫酸ナトリウム０．４７６ｇをゆっくりと加えて溶解させ、さらに３７℃で１６時間転倒混和した。
　反応後、不織布をグラスフィルターに移して上記炭酸緩衝液で洗浄した。この際のろ液を回収し、吸光度を測定することによりＶＨＨリガンドの（固定化収率）を算出した。
　続いて、洗浄後の不織布に残存するエポキシ基を封止するため、０．１ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ、及び１０％ｖ／ｖチオグリセロールを含む０．２ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）を加え、３７℃で６時間転倒混和した。反応後、不織布をグラスフィルターに移して純水及び２０％エタノールで洗浄し、ＶＨＨ固定化不織布担体である担体２を得た。リガンド密度を測定したところ、９．３ｍｇ／ｍＬ－ｃｏｌｕｍｎであった（表５）。
＜実施例４：担体３の作製＞
　ＶＨＨリガンド８に変えて、ＶＨＨリガンド７を用いた以外は実施例２と同様にしてＶＨＨ固定化ビーズ担体である担体３を作製した。リガンド密度を測定したところ、４．９ｍｇ／ｍＬ－ｇｅｌであった（表５）。
＜実施例５：担体４の作製＞
　ＶＨＨリガンド８に変えて、ＶＨＨリガンド７を用いた以外は実施例３と同様にしてＶＨＨ固定化不織布担体である担体４を作製した。リガンド密度を測定したところ、９．９ｍｇ／ｍＬ－ｃｏｌｕｍｎであった（表５）。
＜実施例６：担体５の作製＞
　ＶＨＨリガンド８に変えて、ＶＨＨリガンド９を用いた以外は実施例２と同様にしてＶＨＨ固定化ビーズ担体である担体５を作製した。リガンド密度を測定したところ、２．６ｍｇ／ｍＬ－ｇｅｌであった（表５）。
＜実施例７：担体６の作製＞
　不織布ディスク１に代えて不織布ディスク２を用いた以外は実施例５と同様にしてＶＨＨ固定化不織布担体である担体６を作製した。リガンド密度を測定したところ、３．０ｍｇ／ｍＬ－ｇｅｌであった（表５）。
＜比較例２：担体７の作製＞
　ＶＨＨリガンド８に変えて、比較例１で製造したＶＨＨリガンド１を用いた以外は実施例２と同様にしてＶＨＨ固定化ビーズ担体である担体７を作製した。リガンド密度を測定したところ、４．９ｍｇ／ｍＬ－ｇｅｌであった（表５）。
＜比較例３：担体８の作製＞
　ＶＨＨリガンド８に変えて、比較例１で製造したＶＨＨリガンド１を用いた以外は実施例７と同様にしてＶＨＨ固定化不織布担体である担体８を作製した。リガンド密度を測定したところ、４．２ｍｇ／ｍＬ－ｇｅｌであった（表５）。
＜製造例５：担体１のカラムへの充填＞
　実施例２で調製した担体１を湿潤体積で０．２ｍＬ－ｇｅｌ測り取り、Ｔｒｉｃｏｒｎ（登録商標）　５／２０カラム（Ｃｙｔｉｖａ社製）へ充填した。
＜製造例６：担体２のカラムへの充填＞
　実施例３で調製した担体２を１枚ずつ重ね合わせ、０．２ｍＬ－ｃｏｌｕｍｎ分をＴｒｉｃｏｒｎ（登録商標）　５／２０カラムに充填した。
＜製造例７：担体３のカラムへの充填＞
　実施例４で調製した担体３を湿潤体積で０．２ｍＬ－ｇｅｌ測り取り、Ｔｒｉｃｏｒｎ（登録商標）　５／２０カラム（Ｃｙｔｉｖａ社製）へ充填した。
＜製造例８：担体４のカラムへの充填＞
　実施例５で調製した担体４を１枚ずつ重ね合わせ、０．２ｍＬ－ｃｏｌｕｍｎ分をＴｒｉｃｏｒｎ（登録商標）　５／２０カラム（Ｃｙｔｉｖａ社）に充填した。
＜製造例９：担体７のカラムへの充填＞
　比較例２で調製した担体７を湿潤体積で０．２ｍＬ－ｇｅｌ測り取り、Ｔｒｉｃｏｒｎ（登録商標）　５／２０カラム（Ｃｙｔｉｖａ社製）へ充填した。
＜製造例１０：担体９のカラムへの充填＞
　Ｃａｐｔｏ（登録商標）　ＡＶＢ（Ｃｙｔｉｖａ社製）を湿潤体積で０．２ｍＬ－ｇｅｌ測り取り、Ｔｒｉｃｏｒｎ（登録商標）　５／２０カラム（Ｃｙｔｉｖａ社製）へ充填した。
＜試験例２：担体１によるＡＡＶ２精製＞
　製造例５で作製した担体１のカラムを用い、製造例４で調整したＡＡＶ２粗精製液をアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。
　下記Ａ～Ｇ液を調製し、使用前に０．２μｍフィルターでろ過した。
Ａ液：クエン酸（１００ｍｍｏｌ／Ｌ），塩化ナトリウム（５００ｍｍｏｌ／Ｌ），ｐＨ７．０
Ｂ液：クエン酸（１００ｍｍｏｌ／Ｌ），塩化ナトリウム（５００ｍｍｏｌ／Ｌ），ｐＨ４．５
Ｃ液：クエン酸（１００ｍｍｏｌ／Ｌ），塩化ナトリウム（５００ｍｍｏｌ／Ｌ），ｐＨ２．１
Ｄ液：ＮａＯＨ（１０ｍｍｏｌ／Ｌ）
Ｅ液：リン酸（１２０ｍｍｏｌ／Ｌ），酢酸（１６７ｍｍｏｌ／Ｌ），ベンジルアルコール（２．２％ｖ／ｖ）
Ｆ液：２０％エタノール
Ｇ液：ＡＡＶ２粗精製液（１．５×１０１２ｖｇ程度）
　製造例５で作製した担体１を充填したカラムをＡＫＴＡ（登録商標）　Ａｖａｎｔ　２５（Ｃｙｔｉｖａ社）に接続し、流速を０．２ｍＬ／ｍｉｎに設定し、純水で洗浄、Ａ液で平衡化した。
　その後、Ｇ液を通液し、ＡＡＶ２をカラム担体に保持させた後、Ａ液で洗浄し、Ｂ液にてＡＡＶ２を溶出した。溶出終了後、カラムはＣ液、Ａ液、Ｄ液、Ａ液、Ｅ液の順に洗浄した。洗浄後、カラムをＦ液に置換し冷蔵保存した。精製時のクロマトグラムを図１に示した。
　また、各フラクションに含まれるＡＡＶ２量をＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ３　リアルタイムＰＣＲシステム（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いた定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）にて定量し、全回収液に含まれるＡＡＶ２量に対するｐＨ４．５のバッファーを用いた溶出工程での溶出ピークのＡＡＶ２量をｐＨ４．５での回収率として算出した。また、全回収液に含まれるＡＡＶ２量に対するｐＨ２．１のバッファーを用いた溶出工程での溶出ピークのＡＡＶ２量をｐＨ２．１での回収率として算出した。結果を表６に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
＜試験例３：担体２によるＡＡＶ２精製＞
　ビーズ担体１のカラムに変えて、製造例６で製造した担体２を充填したカラムを用いた以外は試験例２と同様にしてＡＡＶ２粗精製液をアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。得られたクロマトグラムを図２に示した。試験例２と同様にしてｐＨ４．５での回収ＡＡＶ２、及びｐＨ２．１での回収ＡＡＶ２を算出した。結果を表６に示した。
＜試験例４：担体３によるＡＡＶ２精製＞
　ビーズ担体１のカラムに変えて、製造例７で製造した担体３を充填したカラムを用いた以外は試験例２と同様にしてＡＡＶ２粗精製液をアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。得られたクロマトグラムを図３に示した。試験例２と同様にしてｐＨ４．５での回収ＡＡＶ２、及びｐＨ２．１での回収ＡＡＶ２を算出した。結果を表６に示した。
＜試験例５：担体４によるＡＡＶ２精製＞
　ビーズ担体１のカラムに変えて、製造例８で製造した担体４を充填したカラムを用いた以外は試験例２と同様にしてＡＡＶ２粗精製液をアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。得られたクロマトグラムを図４に示した。試験例２と同様にしてｐＨ４．５での回収ＡＡＶ２、及びｐＨ２．１での回収ＡＡＶ２を算出した。結果を表６に示した。
＜試験例６：担体７によるＡＡＶ２精製＞
　ビーズ担体１のカラムに変えて、製造例９で製造した担体７を充填したカラムを用いた以外は試験例２と同様にしてＡＡＶ２粗精製液をアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。得られたクロマトグラムを図５に示した。試験例２と同様にしてｐＨ４．５での回収ＡＡＶ２、及びｐＨ２．１での回収ＡＡＶ２を算出した。結果を表６に示した。
＜試験例７：担体９によるＡＡＶ２精製＞
　ビーズ担体１のカラムに変えて、製造例１０で製造した担体９を充填したカラムを用いた以外は試験例２と同様にしてＡＡＶ２粗精製液をアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。得られたクロマトグラムを図６に示した。試験例２と同様にしてｐＨ４．５での回収ＡＡＶ２、及びｐＨ２．１での回収ＡＡＶ２を算出した。結果を表６に示した。
　図１～５及び表６の結果より、担体７、及び担体９（市販ビーズ担体であるＣａｐｔｏ（登録商標）ＡＶＢ）を用いた場合は、ｐＨ２．１の溶出工程からＡＡＶ２が一定量検出されたことから、ｐＨ４．５のバッファーを溶出バッファーに用いたＡＡＶ２精製を行うことは難しい資材であるといえる。
　一方で、本発明の構造物である担体１、担体２、担体３、及び担体４を用いた場合は、ｐＨ４．５の溶出工程から大部分のＡＡＶ２が検出されたことから、弱酸性のバッファーを溶出バッファーに用いた溶出工程でＡＡＶ２を効率的に回収することが可能な資材であるといえる。
＜製造例１１：ＶＨＨリガンド１０固定化担体カラムの作製＞
　実施例１で得られたＶＨＨリガンド１０を担体に固定化した。担体への固定化にはＨｉＴｒａｐ（登録商標）ＮＨＳ―ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ＨＰ（Ｃｙｔｉｖａ社製）カラムを使用した。
　下記Ａ～Ｆ液を調製し、使用前に０．２μｍフィルターを通した。
Ａ液：０．２Ｍ　炭酸ナトリウム、０．５Ｍ　塩化ナトリウム、ｐＨ８．３
Ｂ液：１ｍＭ　塩酸
Ｃ液：０．５Ｍ　エタノールアミン、０．５Ｍ　塩化ナトリウム、ｐＨ８．３
Ｄ液：０．１Ｍ　酢酸、０．５Ｍ　塩化ナトリウム、ｐＨ４ 
Ｅ液：２０％（ｖ／ｖ）エタノール
　ＶＨＨリガンド１０を５ｍｇ／ｍＬになるようにＡ液で希釈した。氷浴で冷やしたＢ液をカラムに６カラム容積、流速を１ｍＬ／ｍｉｎで通液させてカラム中のイソプロパノールを除去した。その後、すぐにＡ液で希釈したＶＨＨリガンド１０溶液を１カラム容積分添加して、室温で３０分間静置した。Ｃ液を６カラム容積通液し、Ｄ液を６カラム容積通液し、Ｃ液を６カラム容積通液して室温で２０分間静置した。Ｄ液を６カラム容積通液し、Ｃ液を６カラム容積通液し、Ｄ液を６カラム容積通液して、Ｅ液を通液してＶＨＨリガンド１０固定化担体カラムを作製した。
＜製造例１２：ＶＨＨリガンド１１固定化担体カラムの作製＞
　ＶＨＨリガンド１０に代えてＶＨＨリガンド１１を用いた以外は製造例１１と同様にしてＶＨＨリガンド１１固定化担体カラムを作製した。
＜製造例１３：ＶＨＨリガンド２固定化担体カラムの作製＞
　ＶＨＨリガンド１０に代えて比較例１で得られたＶＨＨリガンド２を用いた以外は製造例１１と同様にしてＶＨＨリガンド２固定化担体カラムを作製した。
＜製造例１４：ＶＨＨリガンド３固定化担体カラムの作製＞
　ＶＨＨリガンド１０に代えて比較例１得られたＶＨＨリガンド３を用いた以外は製造例１１と同様にしてＶＨＨリガンド３固定化担体カラムを作製した。
＜試験例８：ＶＨＨリガンド１０固定化担体カラムによるＡＡＶ２精製＞
　製造例１１で作製したＶＨＨリガンド１０固定化担体カラムを用いて、製造例４で調整したＡＡＶ２粗精製液の精製を実施した。変異導入前の抗ＡＡＶ－ＶＨＨ抗体を固定化した抗ＡＡＶ－ＶＨＨ抗体カラムの、ｐＨ４．５又はｐＨ２．１のバッファーを用いた溶出工程での各溶出工程におけるＡＡＶ回収量を算出した。
カラム：抗ＡＡＶ－ＶＨＨ抗体カラム（製造例１１）
流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ、接触時間２ｍｉｎ
Ａ液：２０ｍＭ　トリス－塩酸、０．５Ｍ　塩化ナトリウム、ｐＨ７．０
Ｂ液：０．１Ｍ　クエン酸ナトリウム、０．５Ｍ　塩化ナトリウム、ｐＨ４．５
Ｃ液：０．１Ｍ　クエン酸ナトリウム、０．５Ｍ　塩化ナトリウム、ｐＨ２．１
Ｄ液：ＡＡＶ粗精製溶液（製造例４）
　上記カラムをＡＫＴＡ（登録商標）　Ａｖａｎｔ　２５（Ｃｙｔｉｖａ社）に接続し、Ａ液で平衡化した。その後、Ｄ液を１０１２　ｖｇ／ｍＬ負荷し、ＡＡＶをカラム担体に保持させた後、Ａ液を５カラム容積で洗浄した。Ｂ液を５カラム容積で溶出し、Ｂ液→Ｃ液の２０カラム容積のリニアグラジエントで通液し、さらにＣ液を１０カラム容積通液してカラムに残存しているＡＡＶを溶出した。各フラクションに含まれるＡＡＶ２量をＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ３　リアルタイムＰＣＲシステム（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いた定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）にて定量し、Ｂ液、Ｃ液を用いた溶出工程での全溶出液に含まれるＡＡＶ２量に対するｐＨ４．５のバッファーを用いた溶出工程での溶出ピークのＡＡＶ２量をｐＨ４．５での回収率として算出した。結果を表７に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
＜試験例９：ＶＨＨリガンド１１固定化担体カラムによるＡＡＶ２精製＞
　ＶＨＨリガンド１０固定化担体カラムに代えて、製造例１２で製造したＶＨＨリガンド１１固定化担体カラムを用いた以外は試験例８と同様にしてＡＡＶ２粗精製液をアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。試験例８と同様にしてＢ液、Ｃ液を用いた溶出工程での全溶出液に含まれるＡＡＶ２量に対するｐＨ４．５のバッファーを用いた溶出工程での溶出ピークのＡＡＶ２量をｐＨ４．５での回収率として算出した。結果を表７に示した。
＜試験例１０：ＶＨＨリガンド２固定化担体カラムによるＡＡＶ２精製＞
　ビーズ担体１のカラムに代えて、製造例１３で製造したＶＨＨリガンド２固定化担体カラムを用いた以外は試験例８と同様にしてＡＡＶ２粗精製液をアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。試験例８と同様にして溶出工程での全溶出液に含まれるＡＡＶ２量に対するｐＨ４．５のバッファーを用いた溶出工程での溶出ピークのＡＡＶ２量をｐＨ４．５での回収率として算出し、結果を表７に示した。
＜試験例１１：ＶＨＨリガンド３固定化担体カラムによるＡＡＶ２精製＞
　ビーズ担体１のカラムに代えて、製造例１４で製造したＶＨＨリガンド３固定化担体カラムを用いた以外は試験例８と同様にしてＡＡＶ２粗精製液をアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。試験例８と同様にして溶出工程での全溶出液に含まれるＡＡＶ２量に対するｐＨ４．５のバッファーを用いた溶出工程での溶出ピークのＡＡＶ２量をｐＨ４．５での回収率として算出し、結果を表７に示した。
＜試験例１２：担体５によるＡＡＶ回収試験＞
　実施例６で作製した担体５を湿潤体積で０．０１ｍＬ－ｇｅｌ測り取り、これに対し、製造例４で調整したＡＡＶ２粗精製液（１．５×１０１２ｖｇ程度）を加えて、１６時間転倒混和して担体にＡＡＶ２を吸着させた。
　上澄みを除いた後、洗浄液（２０ｍＭ　トリス－塩酸、０．５Ｍ　塩化ナトリウム、ｐＨ８．０）を加えて担体を洗浄したのち、溶出液（クエン酸（１００ｍｍｏｌ／Ｌ），塩化ナトリウム（５００ｍｍｏｌ／Ｌ），ｐＨ４．５）を加えてＡＡＶ２を担体から溶出させ、その後、溶出液（クエン酸（１００ｍｍｏｌ／Ｌ），塩化ナトリウム（５００ｍｍｏｌ／Ｌ），ｐＨ２．１）を加えてＡＡＶ２を担体から溶出させた。
　各液中に含まれるＡＡＶ量をＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ３　リアルタイムＰＣＲシステム（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いた定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）にて定量した。全回収液に含まれるＡＡＶ２量に対するｐＨ４．５のバッファーを用いた溶出工程での溶出ピークのＡＡＶ２量をｐＨ４．５での回収率として算出した。また、全回収液に含まれるＡＡＶ２量に対するｐＨ２．１のバッファーを用いた溶出工程での溶出ピークのＡＡＶ２量をｐＨ２．１での回収率として算出した。結果を表８に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
＜試験例１３：担体４によるＡＡＶ２前処理液からのＡＡＶ２精製＞
　ＡＡＶ２粗精製液に代えて、製造例３で調整したＡＡＶ２前処理液を用いた以外は試験例５と同様にしてＡＡＶ２前処理液をアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。試験例２と同様にしてｐＨ４．５での回収ＡＡＶ２、及びｐＨ２．１での回収ＡＡＶ２を算出した。結果を表９に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
＜試験例１４：担体９によるＡＡＶ２前処理液からのＡＡＶ２精製＞
　ＡＡＶ２粗精製液に代えて、製造例３で調整したＡＡＶ２前処理液を用いた以外は試験例７と同様にしてＡＡＶ２前処理液をアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。試験例２と同様にしてｐＨ４．５での回収ＡＡＶ２、及びｐＨ２．１での回収ＡＡＶ２を算出した。結果を表９に示した。
＜製造例１５：担体６のカラムへの充填＞
　実施例７で調製した担体６を１枚ずつ重ね合わせ、１．０ｍＬ－ｃｏｌｕｍｎ分を切削加工により作製したカラムに充填した。
＜製造例１６：担体８のカラムへの充填＞
　比較例３で調製した担体８を１枚ずつ重ね合わせ、１．０ｍＬ－ｃｏｌｕｍｎ分を切削加工により作製したカラムに充填した。
＜試験例１５：担体６によるＡＡＶ２精製＞
　製造例１５で作製した担体６のカラムを用い、製造例４で調整したＡＡＶ２粗精製液をアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。
　下記Ａ～Ｇ液を調製し、使用前に０．２μｍフィルターでろ過した。
Ａ液：クエン酸（１００ｍｍｏｌ／Ｌ），塩化ナトリウム（５００ｍｍｏｌ／Ｌ），ｐＨ７．０
Ｂ液：クエン酸（１００ｍｍｏｌ／Ｌ），塩化ナトリウム（５００ｍｍｏｌ／Ｌ），ｐＨ４．５
Ｃ液：クエン酸（１００ｍｍｏｌ／Ｌ），塩化ナトリウム（５００ｍｍｏｌ／Ｌ），ｐＨ２．１
Ｄ液：ＮａＯＨ（１０ｍｍｏｌ／Ｌ）
Ｅ液：リン酸（１２０ｍｍｏｌ／Ｌ），酢酸（１６７ｍｍｏｌ／Ｌ），ベンジルアルコール（２．２％ｖ／ｖ）
Ｆ液：２０％エタノール
Ｇ液：ＡＡＶ２粗精製液（１．５×１０１２ｖｇ程度）
　製造例１５で作製した担体６を充填したカラムをＡＫＴＡ（登録商標）　Ａｖａｎｔ　２５（Ｃｙｔｉｖａ社）に接続し、流速を６．０ｍＬ／ｍｉｎに設定し、純水で洗浄し、Ａ液で平衡化した。
　その後、Ｇ液を通液し、ＡＡＶ２をカラム担体に保持させた後、流速を１．０ｍＬ／ｍｉｎに設定し、Ａ液で洗浄し、Ｂ液にてＡＡＶ２を溶出した。溶出終了後、カラムはＣ液、Ａ液、Ｄ液、Ａ液、Ｅ液の順に洗浄した。洗浄後、カラムをＦ液に置換し冷蔵保存した。精製時のクロマトグラムを図７に示した。
　各フラクションに含まれるＡＡＶ２量をＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ３　リアルタイムＰＣＲシステム（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いた定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）にて定量し、全回収液に含まれるＡＡＶ２量に対するｐＨ４．５のバッファーを用いた溶出工程での溶出ピークのＡＡＶ２量をｐＨ４．５での回収率として算出した。また、全回収液に含まれるＡＡＶ２量に対するｐＨ２．１のバッファーを用いた溶出工程での溶出ピークのＡＡＶ２量をｐＨ２．１での回収率として算出した。結果を表１０に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
＜試験例１６：担体８によるＡＡＶ２精製＞
　担体６を充填したカラムに代えて、製造例１６で製造した担体８を充填したカラムを用いた以外は試験例１５と同様にしてＡＡＶ２粗精製液をアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。得られたクロマトグラムを図８に示した。試験例１５と同様にして全回収液に含まれるＡＡＶ２量に対するｐＨ４．５のバッファーを用いた溶出工程での溶出ピークのＡＡＶ２量をｐＨ４．５での回収率として算出した。また、全回収液に含まれるＡＡＶ２量に対するｐＨ２．１のバッファーを用いた溶出工程での溶出ピークのＡＡＶ２量をｐＨ２．１での回収率として算出した。結果を表１０に示した。
＜試験例１７：ｐＨ４．５のバッファーで溶出したＡＡＶ２の遺伝子導入効率測定＞
　ＰＢＳで１００倍希釈したコラーゲン（Ａｔｅｌｏｃｏｌｌａｇｅｎ　Ｂｏｖｉｎｅ　ｄｅｒｍｉｓ　５ｍｇ／ｍＬ、株式会社高研製）を９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ（登録商標）　ＭｉｃｒｏＷｅｌｌ（登録商標）　９６－Ｗｅｌｌ，　Ｎｕｎｃｌｏｎ　Ｄｅｌｔａ－Ｔｒｅａｔｅｄ，　Ｆｌａｔ－Ｂｏｔｔｏｍ　Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社製）に各ウェル５０μＬずつ添加し、すぐに回収した。
　その後、各ウェルにＨＥＫ２９３細胞を２×１０３Ｃｅｌｌずつ播種し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で一晩インキュベートし、プレートに接着させた。
　この際の培地には、ＦｌｕｏｒｏＢｒｉｔｅ　ＤＭＥＭ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）に１０％　ＦＢＳ、及び１×ＧｌｕｔａＭＡＸＴＭ　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ｇｉｂｃｏ社製）を添加したものを用いた。
　試験例５で回収した、ｐＨ４．５のバッファーを用いて溶出したＡＡＶ２含有溶出液を、溶出から１、１６、２４時間後に１ｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ水溶液によってｐＨ７付近になるように中和した。中和後のＡＡＶ２含有溶出液を、ＭＯＩ（多重感染度）＝１００００になるように、前記ＨＥＫ２９３細胞を接着させた９６ウェルプレートのウェルに添加し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で３日間培養を行った。
　ＡＡＶ２感染細胞が発現するＶＥＮＵＳの蛍光強度をプレートリーダー（ＣＹＴＡＴＩＯＮ１　イメージングマルチモードプレートリーダー、ＢｉｏＴｅｋ製）で測定し、得られた蛍光強度の数値を、遺伝子導入効率の指標とした。測定には付属のソフトウェア（Ｇｅｎ５）を使用し、以下のパラメータに従った。
Ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ：４８５／２０
Ｅｍｉｓｓｉｏｎ：５２８／２０
Ｍｉｒｒｏｒ：Ｔｏｐ　５１０ｎｍ
Ｇａｉｎ：ｅｘｔｅｎｄｅｄ
Ｌｉｇｈｔ　Ｓｏｕｒｃｅ：Ｘｅｎｏｎ　Ｆｌａｓｈ
Ｌａｍｐ　ｅｎｅｒｇｙ：Ｈｉｇｈ
Ｒｅａｄ　Ｓｐｅｅｄ：Ｎｏｒｍａｌ
Ｄｅｌａｙ：１００ｍｓｅｃ
Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ／Ｄａｔａ　Ｐｏｉｎｔ：１０
Ｒｅａｄ　Ｈｅｉｇｈｔ：７ｍｍ
　結果を表１１、及び図９に示した。
＜試験例１８：ｐＨ２．１のバッファーで溶出したＡＡＶ２の遺伝子導入効率測定＞
　試験例５で回収した、ｐＨ４．５のバッファーを用いて溶出したＡＡＶ２含有溶出液に代えて、試験例７で回収した、ｐＨ２．１のバッファーを用いて溶出したＡＡＶ２含有溶出液を用いた以外は試験例１７と同様にしてＶＥＮＵＳの蛍光強度を、遺伝子導入効率の指標として測定した。結果を表１１、及び図９に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
＜試験例１９：ＡＡＶ２粗精製液中のＡＡＶ２の遺伝子導入効率測定＞
　試験例５で回収した、ｐＨ４．５のバッファーを用いて溶出したＡＡＶ２含有溶出液に代えて、製造例４で調整したＡＡＶ２粗精製液を用いた以外は試験例１７と同様にしてＶＥＮＵＳの蛍光強度を、遺伝子導入効率の指標として測定した。結果を表１２、及び図１０に示した。
＜試験例２０：ｐＨ４．５のバッファーで溶出したＡＡＶ２の遺伝子導入効率測定＞
　試験例５で回収した、ｐＨ４．５のバッファーを用いて溶出したＡＡＶ２含有溶出液に代えて、試験例１３で回収した、ｐＨ４．５のバッファーを用いて溶出したＡＡＶ２含有溶出液を用いた以外は試験例１７と同様にしてＶＥＮＵＳの蛍光強度を、遺伝子導入効率の指標として測定した。結果を表１２、及び図１０に示した。
＜試験例２１：ｐＨ２．１のバッファーで溶出したＡＡＶ２遺伝子導入効率測定＞
　試験例５で回収した、ｐＨ４．５のバッファーを用いて溶出したＡＡＶ２含有溶出液に代えて、試験例１４で回収した、ｐＨ２．１のバッファーを用いて溶出したＡＡＶ２含有溶出液を用いた以外は試験例１７と同様にしてＶＥＮＵＳの蛍光強度を、遺伝子導入効率の指標として測定した。結果を表１２、及び図１０に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
＜実施例８：抗ＡＡＶ２－ＶＨＨ抗体の変異体の調製＞
（１）抗ＡＡＶ２－ＶＨＨ抗体の変異体を発現する大腸菌の作製
　ＶＨＨリガンド２を発現するＤＮＡに代えて前記ＶＨＨリガンド１を発現するＤＮＡを鋳型とし、また表２に示すプライマーに代えて表１３に示すプライマーを用いた以外は実施例１の（２）と同様にして、ＶＨＨリガンド１２発現株、ＶＨＨリガンド１３発現株、ＶＨＨリガンド１４発現株、ＶＨＨリガンド１５発現株、ＶＨＨリガンド１６発現株、ＶＨＨリガンド１７発現株を得た。
前記変異遺伝子ＶＨＨリガンド１２により発現されるＶＨＨリガンド１２、変異遺伝子ＶＨＨリガンド１３により発現されるＶＨＨリガンド１３、変異遺伝子ＶＨＨリガンド１４により発現されるＶＨＨリガンド１４、変異遺伝子ＶＨＨリガンド１５により発現されるＶＨＨリガンド１５、変異遺伝子ＶＨＨリガンド１６により発現されるＶＨＨリガンド１６、変異遺伝子ＶＨＨリガンド１７により発現されるＶＨＨリガンド１７、はＶＨＨリガンド１の１アミノ酸置換変異体であり、フレームワーク領域３（ＦＲ３）に存在するアミノ酸のうちの１つに変異が導入されているＶＨＨリガンドである。
　前記ＶＨＨリガンド１２は、ＦＲ３のアミノ酸配列が、配列番号３に記載のアミノ酸配列のうち、Ｎ末端から１５番目のアルギニンがグルタミン酸に置換されたアミノ酸配列を有し、前記ＶＨＨリガンド１３は、ＦＲ３のアミノ酸配列が、配列番号３に記載のアミノ酸配列のうち、Ｎ末端から１５番目のアルギニンがグルタミンに置換されたアミノ酸配列を有し、前記ＶＨＨリガンド１４は、ＦＲ３のアミノ酸配列が、配列番号３に記載のアミノ酸配列のうち、Ｎ末端から１５番目のアルギニンがトリプトファンに置換されたアミノ酸配列を有し、前記ＶＨＨリガンド１５は、ＦＲ３のアミノ酸配列が、配列番号３に記載のアミノ酸配列のうち、Ｎ末端から１６番目のアスパラギン酸がアラニンに置換されたアミノ酸配列を有し、前記ＶＨＨリガンド１６は、ＦＲ３のアミノ酸配列が、配列番号３に記載のアミノ酸配列のうち、Ｎ末端から１７番目のアスパラギンがアラニンに置換されたアミノ酸配列を有し、前記ＶＨＨリガンド１７は、ＦＲ３のアミノ酸配列が、配列番号３に記載のアミノ酸配列のうち、Ｎ末端から２３番目のチロシンがアラニンに置換されたアミノ酸配列を有する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
　（２）抗ＡＡＶ２－ＶＨＨ抗体の変異体の調製
　ＶＨＨリガンド１を発現する大腸菌に代えて、実施例８の（１）で得られたＶＨＨリガンド１２発現株、ＶＨＨリガンド１３発現株、ＶＨＨリガンド１４発現株、ＶＨＨリガンド１５発現株、ＶＨＨリガンド１６発現株、又はＶＨＨリガンド１７発現株を用いた以外は比較例１と同様にして各種抗ＡＡＶ２－ＶＨＨ抗体変異体（ＶＨＨリガンド１２、ＶＨＨリガンド１３、ＶＨＨリガンド１４、ＶＨＨリガンド１５、ＶＨＨリガンド１６、ＶＨＨリガンド１７）を得た。
＜試験例２２：ＶＨＨ抗体の解離速度定数の測定＞
　ＶＨＨリガンド１、ＶＨＨリガンド４～９に代えて、ＶＨＨリガンド１２～ＶＨＨリガンド１７を用いた以外は試験例１と同様にしてＶＨＨ抗体（ＶＨＨリガンド１２～ＶＨＨリガンド１７）のＡＡＶ２に対する親和性を解析した。
　各々の結果を表１４に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
＜実施例９：担体１０の作製＞
　ＶＨＨリガンド８に変えて、ＶＨＨリガンド１７を用いた以外は実施例２と同様にしてＶＨＨ固定化ビーズ担体である担体１０を作製した。リガンド密度を測定した結果を表１５に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
＜製造例１７：担体１０のカラムへの充填＞
　実施例９で調製した担体１０を湿潤体積で０．２ｍＬ－ｇｅｌ測り取り、Ｔｒｉｃｏｒｎ（登録商標）　５／２０カラム（Ｃｙｔｉｖａ社製）へ充填した。
＜試験例２３：担体１０によるＡＡＶ２精製＞
　実施例９で作製した担体１０のカラムを用い、製造例４で調整したＡＡＶ２粗精製液をアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。
　下記Ａ～Ｇ液を調製し、使用前に０．２μｍフィルターでろ過した。
Ａ液：クエン酸（１００ｍｍｏｌ／Ｌ），塩化ナトリウム（５００ｍｍｏｌ／Ｌ），ｐＨ７．０
Ｂ液：クエン酸（１００ｍｍｏｌ／Ｌ），塩化ナトリウム（５００ｍｍｏｌ／Ｌ），ｐＨ４．５
Ｃ液：クエン酸（１００ｍｍｏｌ／Ｌ），塩化ナトリウム（５００ｍｍｏｌ／Ｌ），ｐＨ４．０
Ｄ液：クエン酸（１００ｍｍｏｌ／Ｌ），塩化ナトリウム（５００ｍｍｏｌ／Ｌ），ｐＨ３．５
Ｅ液：クエン酸（１００ｍｍｏｌ／Ｌ），塩化ナトリウム（５００ｍｍｏｌ／Ｌ），ｐＨ２．１
Ｆ液：ＮａＯＨ（１０ｍｍｏｌ／Ｌ）
Ｇ液：リン酸（１２０ｍｍｏｌ／Ｌ），酢酸（１６７ｍｍｏｌ／Ｌ），ベンジルアルコール（２．２％ｖ／ｖ）
Ｈ液：２０％エタノール
Ｉ液：ＡＡＶ２粗精製液（１．５×１０１２ｖｇ程度）
　製造例１７で作製した担体１０を充填したカラムをＡＫＴＡ（登録商標）　Ａｖａｎｔ　２５（Ｃｙｔｉｖａ社）に接続し、流速を０．２ｍＬ／ｍｉｎに設定し、純水で洗浄、Ａ液で平衡化した。
　その後、Ｉ液を通液し、ＡＡＶ２をカラム担体に保持させた後、Ａ液で洗浄し、Ｂ液にてＡＡＶ２を溶出し、続いてＣ液にてＡＡＶ２を溶出し、続いてＤ液にてＡＡＶ２を溶出した。溶出終了後、カラムはＥ液、Ａ液、Ｆ液、Ａ液、Ｇ液の順に洗浄した。洗浄後、カラムをＨ液に置換し冷蔵保存した。精製時のクロマトグラムを図１１に示した。
　また、各フラクションに含まれるＡＡＶ２量をＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ３　リアルタイムＰＣＲシステム（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いた定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）にて定量し、全回収液に含まれるＡＡＶ２量に対するｐＨ４．５のバッファーを用いた溶出工程での溶出ピークのＡＡＶ２量と全回収液に含まれるＡＡＶ２量に対するｐＨ４．０のバッファーを用いた溶出工程での溶出ピークのＡＡＶ２量の合計をｐＨ４．０以上での回収率として算出した。また、全回収液に含まれるＡＡＶ２量に対するｐＨ３．５のバッファーを用いた溶出工程での溶出ピークのＡＡＶ２量と全回収液に含まれるＡＡＶ２量に対するｐＨ２．１のバッファーを用いた溶出工程での溶出ピークのＡＡＶ２量の合計をｐＨ４．０未満での回収率として算出した。結果を表１６に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
＜試験例２４：担体７によるＡＡＶ２精製＞
　ビーズ担体１０のカラムに変えて、製造例９で製造した担体７を充填したカラムを用いた以外は試験例２３と同様にしてＡＡＶ２粗精製液をアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。得られたクロマトグラムを図１２に示した。試験例２３と同様にしてｐＨ４．０以上での回収ＡＡＶ２、及びｐＨ４．０未満での回収ＡＡＶ２を算出した。結果を表１６に示した。
　本発明の態様としては、例えば、以下のものなどが挙げられる。
　＜１＞　アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に結合する低分子化抗体であって、前記アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）と前記低分子化抗体とのｐＨ５．０での解離速度定数が１×１０－２（ｓ－１）以上であって、前記ｐＨ５．０での解離速度定数が、ｐＨ７．０での解離速度定数の１０倍以上であることを特徴とする低分子化抗体である。
　＜２＞　アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に結合する低分子化抗体であって、可変重鎖相補性決定領域２のアミノ酸配列が、配列番号１に記載のアミノ酸配列、又は配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、Ｎ末端から２番目のセリン及び６番目のスレオニンからなる群から選択される少なくとも１つがその他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列であり、可変重鎖相補性決定領域３のアミノ酸配列が、配列番号２に記載のアミノ酸配列、又は配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち、Ｎ末端のアルギニン及びＮ末端から４番目のトリプトファンからなる群から選択される少なくとも１つがその他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列であり、前記可変重鎖相補性決定領域２のアミノ酸配列又は前記可変重鎖相補性決定領域３のアミノ酸配列の少なくとも１つが、前記配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、Ｎ末端から２番目のセリン及び６番目のスレオニンからなる群から選択される少なくとも１つがその他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列又は配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち、Ｎ末端のアルギニン及びＮ末端から４番目のトリプトファンからなる群から選択される少なくとも１つがその他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列であることを特徴とする低分子化抗体である。
　＜３＞　アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に結合する低分子化抗体であって、フレームワーク領域３のアミノ酸配列が、配列番号３、４、３６、又は３７に記載のアミノ酸配列のうち、Ｎ末端から、１５番目のアルギニン、１６番目のアスパラギン酸、１７番目のアスパラギン若しくはイソロイシン、１９番目のグリシン若しくはリシン、２０番目のアスパラギン、及び２３番目のチロシンからなる群から選択される少なくとも１つがその他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列であることを特徴とする低分子化抗体である。
　＜４＞　ラクダ科動物由来の重鎖抗体の可変領域（ＶＨＨ）である、前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載の低分子化抗体である。
　＜５＞　前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載の低分子化抗体からなることを特徴とするアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）弱酸性溶出用低分子化抗体である。
　＜６＞　前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載の低分子化抗体、又は前記＜５＞に記載のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）弱酸性溶出用低分子化抗体、をコードする塩基配列を含むことを特徴とする核酸である。
　＜７＞　前記＜６＞に記載の核酸を含むベクターである。
　＜８＞　前記＜６＞に記載の核酸を含む細胞である。
　＜９＞　前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載の低分子化抗体、又は前記＜５＞に記載のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）弱酸性溶出用低分子化抗体の製造方法であって、前記＜８＞に記載の細胞を培養する工程を含む方法である。
　＜１０＞　水不溶性基材と、前記水不溶性基材に固定化された、前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載の低分子化抗体、又は前記＜５＞５に記載のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）弱酸性溶出用低分子化抗体と、を有することを特徴とするアフィニティ担体である。
　＜１１＞　前記水不溶性基材に１～２０ｍｇ／ｍＬの密度で前記低分子化抗体が固定化されている、前記＜１０＞に記載のアフィニティ担体である。
　＜１２＞　前記＜１０＞又は＜１１＞に記載のアフィニティ担体とアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）とを接触させる接触工程を含むことを特徴とするアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の製造方法である。
　＜１３＞　前記アフィニティ担体に結合したアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）をアフィニティ担体から分離する分離工程を含む、前記＜１２＞に記載のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の製造方法である。
　＜１４＞　前記分離工程において、前記アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）をアフィニティ担体からｐＨ４以上のバッファーを用いて分離する、前記＜１３＞に記載のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の製造方法である。
　＜１５＞　前記分離工程において分離したアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の、分離２４時間後の遺伝子導入効率が、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）と結合する抗体であって、ｐＨ１．７～２．５のバッファーによりアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）と解離する抗体を有するアフィニティ担体からｐＨ２．１のバッファーを用いて分離したアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の、分離２４時間後の遺伝子導入効率と比較して２倍以上である、前記＜１３＞又は＜１４＞に記載のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の製造方法である。
　＜１６＞　前記＜１０＞又は＜１１＞に記載のアフィニティ担体とアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を接触させる接触工程を含むことを特徴とするアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の精製方法である。
　＜１７＞　前記＜１０＞又は＜１１＞に記載のアフィニティ担体とアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を接触させる接触工程を含むことを特徴とするアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の感染価低減抑制方法である。
　＜１８＞　前記アフィニティ担体に結合したアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）をアフィニティ担体から分離する分離工程を含む、前記＜１７＞に記載のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の感染価低減抑制方法である。
　＜１９＞　前記分離工程において、前記アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）をアフィニティ担体からｐＨ４以上のバッファーを用いて分離する、前記＜１８＞記載のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の感染価低減抑制方法である。
　＜２０＞　前記分離工程において分離したアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の、分離２４時間後の遺伝子導入効率が、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）と結合する抗体であって、ｐＨ１．７～２．５のバッファーによりアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）と解離する抗体を有するアフィニティ担体からｐＨ２．１のバッファーを用いて分離したアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の、分離２４時間後の遺伝子導入効率と比較して２倍以上である、前記＜１８＞又は＜１９＞に記載のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の感染価低減抑制方法である。

Claims (20)

  1. 　アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に結合する低分子化抗体であって、
    　前記アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）と前記低分子化抗体とのｐＨ５．０での解離速度定数が１×１０－２（ｓ－１）以上であって、
    　前記ｐＨ５．０での解離速度定数が、ｐＨ７．０での解離速度定数の１０倍以上であることを特徴とする低分子化抗体。
  2. 　アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に結合する低分子化抗体であって、
    　可変重鎖相補性決定領域２のアミノ酸配列が、配列番号１に記載のアミノ酸配列、又は配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、Ｎ末端から２番目のセリン及び６番目のスレオニンからなる群から選択される少なくとも１つがその他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列であり、
    　可変重鎖相補性決定領域３のアミノ酸配列が、配列番号２に記載のアミノ酸配列、又は配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち、Ｎ末端のアルギニン及びＮ末端から４番目のトリプトファンからなる群から選択される少なくとも１つがその他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列であり、
    　前記可変重鎖相補性決定領域２のアミノ酸配列又は前記可変重鎖相補性決定領域３のアミノ酸配列の少なくとも１つが、前記配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、Ｎ末端から２番目のセリン及び６番目のスレオニンからなる群から選択される少なくとも１つがその他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列又は配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち、Ｎ末端のアルギニン及びＮ末端から４番目のトリプトファンからなる群から選択される少なくとも１つがその他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列であることを特徴とする低分子化抗体。
  3. 　アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に結合する低分子化抗体であって、
    　フレームワーク領域３のアミノ酸配列が、配列番号３、４、３６、又は３７に記載のアミノ酸配列のうち、Ｎ末端から、１５番目のアルギニン、１６番目のアスパラギン酸、１７番目のアスパラギン若しくはイソロイシン、１９番目のグリシン若しくはリシン、２０番目のアスパラギン、及び２３番目のチロシンからなる群から選択される少なくとも１つがその他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列であることを特徴とする低分子化抗体。
  4. 　ラクダ科動物由来の重鎖抗体の可変領域（ＶＨＨ）である、請求項１から３のいずれかに記載の低分子化抗体。
  5. 　請求項１から４のいずれかに記載の低分子化抗体からなることを特徴とするアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）弱酸性溶出用低分子化抗体。
  6. 　請求項１から４のいずれかに記載の低分子化抗体、又は請求項５に記載のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）弱酸性溶出用低分子化抗体、をコードする塩基配列を含むことを特徴とする核酸。
  7. 　請求項６に記載の核酸を含むベクター。
  8. 　請求項６に記載の核酸を含む細胞。
  9. 　請求項１から４のいずれかに記載の低分子化抗体、又は請求項５に記載のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）弱酸性溶出用低分子化抗体の製造方法であって、
    　請求項８に記載の細胞を培養する工程を含む方法。
  10. 　水不溶性基材と、前記水不溶性基材に固定化された、請求項１から４のいずれかに記載の低分子化抗体、又は請求項５に記載のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）弱酸性溶出用低分子化抗体と、を有することを特徴とするアフィニティ担体。
  11. 　前記水不溶性基材に１～２０ｍｇ／ｍＬの密度で前記低分子化抗体が固定化されている、請求項１０に記載のアフィニティ担体。
  12. 　請求項１０又は１１に記載のアフィニティ担体とアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）とを接触させる接触工程を含むことを特徴とするアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の製造方法。
  13. 　前記アフィニティ担体に結合したアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）をアフィニティ担体から分離する分離工程を含む、請求項１２に記載のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の製造方法。
  14. 　前記分離工程において、前記アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）をアフィニティ担体からｐＨ４以上のバッファーを用いて分離する、請求項１３に記載のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の製造方法。
  15. 　前記分離工程において分離したアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の、分離２４時間後の遺伝子導入効率が、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）と結合する抗体であって、ｐＨ１．７～２．５のバッファーによりアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）と解離する抗体を有するアフィニティ担体からｐＨ２．１のバッファーを用いて分離したアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の、分離２４時間後の遺伝子導入効率と比較して２倍以上である、請求項１３又は１４に記載のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の製造方法。
  16. 　請求項１０又は１１に記載のアフィニティ担体とアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を接触させる接触工程を含むことを特徴とするアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の精製方法。
  17. 　請求項１０又は１１に記載のアフィニティ担体とアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を接触させる接触工程を含むことを特徴とするアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の感染価低減抑制方法。
  18. 　前記アフィニティ担体に結合したアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）をアフィニティ担体から分離する分離工程を含む、請求項１７に記載のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の感染価低減抑制方法。
  19. 　前記分離工程において、前記アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）をアフィニティ担体からｐＨ４以上のバッファーを用いて分離する、請求項１８記載のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の感染価低減抑制方法。
  20. 　前記分離工程において分離したアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の、分離２４時間後の遺伝子導入効率が、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）と結合する抗体であって、ｐＨ１．７～２．５のバッファーによりアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）と解離する抗体を有するアフィニティ担体からｐＨ２．１のバッファーを用いて分離したアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の、分離２４時間後の遺伝子導入効率と比較して２倍以上である、請求項１８又は１９に記載のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の感染価低減抑制方法。
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