KR20240007196A - 항원-결합 분자 - Google Patents

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Abstract

항체의 적어도 하나의 불변 영역 도메인 CH1/CL이 티틴 T-쇄/옵스큐린-O 쇄로 대체된 항원-결합 분자, 특히 도메인-조작 항체가 제공된다.

Description

항원-결합 분자
본 개시내용은 항체 약물 분야에 관한 것이며, 특히 CH1 및 CL 구조가 대체된 항원-결합 분자 및 그의 용도를 포함한다.
본원의 설명은 단지 본 개시내용에 관련된 배경 정보를 제공할 뿐이며 반드시 선행 기술을 구성하는 것은 아닐 수 있다.
항체 인간화 기술의 지속적인 개선으로 최근 몇 년 동안 단일클론 항체가 급속히 개발되었다. 악성 종양 및 자가면역 질환과 같은 주요 질환을 치료하기 위해 다양한 단일클론 항체가 사용되어 왔다. 그러나 종양의 면역 회피는 종종 다양한 상이한 메커니즘을 동반하며, 단 하나의 단일클론 항체는 하나의 특정 표적에만 결합할 수 있고, 이는 단일클론 항체의 치료 효과를 크게 감소시킬 수 있다.
이중특이성 항체(BsAb)는 2개의 상이한 항원 또는 2개의 상이한 에피토프를 표적으로 하는 항체를 유전 공학 수단을 이용해 결합시켜 형성된 인공 항체이다. 단일클론 항체와 달리, 이중특이성 항체는 2개의 상이한 항원 또는 2개의 상이한 에피토프를 동시에 표적화하는 능력을 가지며, 면역 세포 동원, 수용체 공자극 또는 동시-억제, 다가 바이러스 중화 등과 같은 특별한 생물학적 기능을 수행할 수 있고, 단 하나의 단일클론 항체, 심지어 항체 조합보다 더 우수한 임상 치료 효과를 얻을 것으로 기대된다.
예를 들어, IgG 항체 및 단일쇄 도메인의 융합에 의해 형성된 4가 이중특이성 항체와 같은 매우 다양한 재조합 이중특이성 항체가 개발되었다(문헌[Coloma, M.J., et al., Nature Biotech.15(1997) 159-163]; 문헌[Morrison, S.L., Nature Biotech. 25 (2007) 1233-1234] 참조). DVD-Ig, CrossMab 및 BiTE와 같은 다른 이중특이성 형태가 있다(문헌[Spiess et al., Molecular Immunology, 67(2), pp. 95-106(2015)]).
이중특이성 항체에 대한 다양한 구조 모델, 예를 들어, 돌연변이 "놉-인투-홀(knobs-into-holes)"을 Fc 영역에 도입하는 것(문헌[Ridgway et al., Protein Engineering, 9(7), pp. 617-621 (1996)]); 정전식 설계의 도입(문헌[Gunasekaran et al., Journal of Biological Chemistry, 285, (25), pp. 19637-19646, (2010)]), 또는 네거티브 상태 설계의 도입(문헌[Kreudenstein et al., mAbs, 5 (5), pp. 646-654(2013)]; 문헌[Leaver-Fay et al., Structure, 24(4), pp. 641-651(2016)]), CH1 및 CL 도메인의 교환(CrossMab 플랫폼)(문헌[Schaefer et al. al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 108(27), pp. 11187-11192(2011)]), TCR 불변 영역과의 융합(WO2019057122A1호) 등도 또한 개시되었다.
다중특이성 항체의 제조시, 상이한 항원의 경쇄 및 중쇄의 무작위 조합은 다양한 상이한 생성물들을 생성하는데, 그 중 하나만이 목적하는 것이며, 생성된 부산물은 경쇄가 결여된 항체, 반-항체, 중쇄 중합체, 경쇄 및 중쇄 불일치(misparing) 등을 포함하여, 다운스트림 공정(downstream process)의 개발에 중요한 문제를 야기한다. 이를 위해, 본 개시내용은 이량체화 폴리펩티드 및 상기 이량체화 폴리펩티드를 포함하는 항원-결합 분자를 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 티틴(Titin)-T 쇄 및 옵스큐린(Obscurin)-O 쇄, 또는 티틴-T 쇄 및 옵스큐린-유사-O 쇄를 포함하는 이량체화 폴리펩티드를 제공하며, 여기서,
i) 티틴-T 쇄는 서열번호 32의 변이체이고, 여기서 상기 변이체는 위치 60 및 64로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 위치에 아미노산 잔기 치환을 가지고/가지거나
ii) 옵스큐린-O 쇄는 서열번호 33의 변이체이고, 여기서 상기 변이체는 위치 13, 32, 48, 66, 82 및 93으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 위치에 아미노산 잔기 치환을 가지되; 단,
a) 변이체가 위치 13, 48, 66, 82 또는 93에 아미노산 잔기 치환을 갖지 않고 위치 32에 아미노산 잔기 치환을 갖는 경우, 위치 32의 아미노산 치환은 32P가 아니고;
b) 변이체가 위치 32, 48, 66, 82 또는 93에 아미노산 잔기 치환을 갖지 않고 위치 13에 아미노산 잔기 치환을 갖는 경우, 위치 13의 아미노산 치환은 13Y가 아니며;
c) 변이체가 위치 48, 66, 82 또는 93에 아미노산 잔기 치환을 갖지 않고 위치 13 및 32에 아미노산 잔기 치환을 갖는 경우, 위치 13의 아미노산 잔기 치환은 13Y가 아니고, 위치 32의 아미노산 잔기 치환은 32P가 아니다.
일부 실시양태에서, 상기 중 어느 하나에 따른 이량체화 폴리펩티드가 제공되며, 여기서,
i) 티틴-T 쇄는 서열번호 32의 변이체이고, 여기서 상기 변이체는 위치 60 및 64로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 위치에 아미노산 잔기 치환을 가지고/가지거나,
ii) 옵스큐린-O 쇄는 서열번호 33의 변이체이며, 여기서 상기 변이체는 13S, 32F, 위치 48의 아미노산 잔기 치환, 위치 66의 아미노산 잔기 치환, 위치 82의 아미노산 잔기 치환, 및 위치 93의 아미노산 잔기 치환으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기 치환을 갖는다.
일부 실시양태에서, 서열번호 32의 변이체가 60S 및 64T로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 치환을 가지고/가지거나, 서열번호 33의 변이체가 13S, 32F, 48V, 66C, 82H 및 93C로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기 치환을 갖는, 상기 중 어느 하나에 따른 이량체화 폴리펩티드가 제공된다.
일부 실시양태에서, 서열번호 32의 변이체가 60S 및 64T로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 치환을 가지고/가지거나, 서열번호 33의 변이체가 다음 a) 내지 c) 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 잔기 치환을 갖는, 상기 중 어느 하나에 따른 이량체화 폴리펩티드가 제공된다:
a) 32F 및 48V;
b) 13S, 32F, 48V 및 82H; 및
c) 13S, 32F, 48V, 66C, 82H 및 93C.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 티틴-T 쇄 및 옵스큐린-O 쇄, 또는 티틴-T 쇄 및 옵스큐린-유사-O 쇄로 이루어지는 이량체화 폴리펩티드를 제공하며, 여기서,
i) 티틴-T 쇄는 서열번호 32의 변이체이고, 여기서 상기 변이체는 서열번호 32와 비교하여 위치 60 및/또는 64에 적어도 아미노산 잔기 치환을 포함하고/하거나,
ii) 옵스큐린-O 쇄는 서열번호 33의 변이체이고, 여기서 상기 변이체는 서열번호 33과 비교하여 위치 13, 32, 48, 66, 82 및 93으로 이루어진 군에서 선택된 위치에 적어도 하나 이상의 아미노산 잔기 치환을 포함하되; 단,
a) 변이체가 위치 13, 48, 66, 82 또는 93에 아미노산 잔기 치환을 갖지 않고 위치 32에 아미노산 잔기 치환을 갖는 경우, 위치 32의 아미노산 치환은 32P가 아니고;
b) 변이체가 위치 32, 48, 66, 82 또는 93에 아미노산 잔기 치환을 갖지 않고 위치 13에 아미노산 잔기 치환을 갖는 경우, 위치 13의 아미노산 치환은 13Y가 아니며;
c) 변이체가 위치 48, 66, 82 또는 93에 아미노산 잔기 치환을 갖지 않고 위치 13 및 32에 아미노산 잔기 치환을 갖는 경우, 위치 13의 아미노산 잔기 치환은 13Y가 아니고, 위치 32의 아미노산 잔기 치환은 32P가 아니다.
일부 실시양태에서, 상기 중 어느 하나에 따른 이량체화 폴리펩티드가 제공되며, 여기서,
i) 티틴-T 쇄는 서열번호 32의 변이체이고, 여기서 상기 변이체는 서열번호 32와 비교하여 위치 60 및/또는 64에 적어도 하나 이상의 아미노산 잔기 치환을 포함하고/하거나,
ii) 옵스큐린-O 쇄는 서열번호 33과 비교하여, 13S, 32F, 위치 48의 아미노산 잔기 치환, 위치 66의 아미노산 잔기 치환 66, 위치 82의 아미노산 잔기 치환, 및 위치 93의 아미노산 잔기 치환으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기 치환을 갖는 서열번호 33의 변이체이다.
일부 실시양태에서, 서열번호 32의 변이체가 서열번호 32와 비교하여 적어도 60S 및/또는 64T의 아미노산 잔기 치환을 포함하고/하거나, 서열번호 33의 변이체가 서열번호 33과 비교하여 13S, 32F, 48V, 66C, 82H 및 93C로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나 이상의 아미노산 잔기 치환을 포함하는, 상기 중 어느 하나에 따른 이량체화 폴리펩티드가 제공된다.
일부 실시양태에서, 서열번호 32의 변이체가 서열번호 32와 비교하여 적어도 60S 및 64T의 아미노산 잔기 치환을 포함하고/하거나, 서열번호 33의 변이체가 서열번호 33과 비교하여 적어도 다음 a) 내지 c) 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 잔기 치환을 포함하는, 상기 중 어느 하나에 따른 이량체화 폴리펩티드가 제공된다:
a) 32F 및 48V;
b) 13S, 32F, 48V 및 82H; 및
c) 13S, 32F, 48V, 66C, 82H 및 93C.
일부 실시양태에서, 서열번호 32의 변이체가 서열번호 32와 비교하여 위치 3, 8, 11, 13, 20, 22, 25, 26, 39, 40, 42, 45, 47, 49, 56, 58, 66, 70, 75, 77, 79, 81, 82, 83 및 84로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 위치에 아미노산 잔기를 추가로 가지고, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개의 아미노산 잔기 치환을 추가로 갖는, 상기 중 어느 하나에 따른 이량체화 폴리펩티드가 제공된다. 일부 실시양태에서, 서열번호 32의 변이체가 서열번호 32와 비교하여 3W, 8C, 11I, 13L, 20C, 22M/22C, 25S, 26C, 39T, 40S, 42K, 45S, 47E, 49G, 56S, 58E, 66S/66K, 70R, 75V, 77S, 79T, 81R, 82M, 83D 및 84L로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기를 추가로 포함하는, 상기 중 어느 하나에 따른 이량체화 폴리펩티드가 제공된다.
일부 실시양태에서, 서열번호 32의 변이체가 서열번호 32와 비교하여 위치 8, 11, 20, 25, 26, 39, 66, 79 및 81로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 위치에 아미노산 잔기 치환을 추가로 포함하고; 일부 실시양태에서, 서열번호 32의 변이체가 서열번호 32와 비교하여 8C, 11I, 20C, 25S, 26C, 39T, 66K, 79T, 및 81R로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기 치환을 추가로 갖는, 상기 중 어느 하나에 따른 이량체화 폴리펩티드가 제공된다. 일부 실시양태에서, 서열번호 32의 변이체는 서열번호 32와 비교하여 위치 8, 11, 25, 39, 66, 79 및 81에 아미노산 잔기 치환을 추가로 포함하고; 일부 실시양태에서, 서열번호 32의 변이체는 서열번호 32와 비교하여 8C, 11I, 25S, 39T, 66K, 79T 및 81R의 아미노산 잔기 치환을 추가로 포함하고; 일부 실시양태에서, 서열번호 32의 변이체는 서열번호 32와 비교하여 8C, 11I, 25S, 39T, 60S, 64T, 66K, 79T 및 81R의 아미노산 잔기 치환, 및 20C 및/또는 26C의 아미노산 잔기 치환을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 서열번호 32의 변이체가 서열번호 32와 비교하여 다음 a) 내지 l) 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 잔기 치환을 추가로 포함하는, 상기 중 어느 하나에 따른 이량체화 폴리펩티드가 제공된다:
a) 8C, 25S 및 39T;
b) 20C, 25S 및 39T;
c) 25S, 26C 및 39T;
d) 22C, 25S 및 39T;
e) 8C, 25S, 39T, 66S 및 77S;
f) 8C, 25S, 39T, 66K, 70R, 79T 및 81R;
g) 3W, 8C, 11I, 13L, 22M, 25S, 39T 및 82M;
h) 8C, 11I, 25S, 39T, 66K, 79T 및 81R;
i) 8C, 25S, 39T, 40S, 42K, 45S, 47E, 49G, 56S, 58E, 75V, 83D 및 84L;
j) 8C, 25S, 39T, 47E, 49G, 56S, 58E 및 75V;
k) 8C, 25S, 39T, 56S, 58E 및 75V; 및
I) 8C, 25S, 39T, 56S, 58E, 66S 및 77S.
일부 실시양태에서, 서열번호 32의 변이체가 서열번호 32와 비교하여 다음 a) 내지 c) 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 잔기 치환을 갖는, 상기 중 어느 하나에 따른 이량체화 폴리펩티드가 제공된다:
A) 8C, 11I, 25S, 39T, 60S, 64T, 66K, 79T 및 81R;
B) 8C, 11I, 20C, 25S, 39T, 60S, 64T, 66K, 79T 및 81R; 및
C) 8C, 11I, 25S, 26C, 39T, 60S, 64T, 66K, 79T 및 81R.
일부 실시양태에서, 서열번호 33의 변이체가 서열번호 33과 비교하여 위치 2, 3, 7, 9, 11, 12, 13, 14, 17, 20, 22, 25, 30, 32, 34, 36, 41, 42, 44, 45, 53, 58, 62, 67, 69, 76, 88, 89, 92, 94 및 97로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 위치에 아미노산 잔기 치환을 추가로 가지고; 일부 실시양태에서, 서열번호 33의 변이체가 서열번호 33과 비교하여 2E, 3C, 7K/7R, 9C, 11L, 12S, 13Y, 14T, 17E, 20L, 22M/22S, 25S, 30D, 32P, 34E, 36T, 41K, 42L, 44I, 45T, 53L, 58V, 62E/62K/62H, 67Q/67T, 69S, 76S, 88C, 89L, 92E, 94G 및 97G로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기 치환을 추가로 갖는, 상기 중 어느 하나에 따른 이량체화 폴리펩티드가 제공된다.
일부 실시양태에서, 서열번호 33의 변이체가 서열번호 33과 비교하여 다음 A) 내지 R) 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 잔기 치환을 갖는, 상기 중 어느 하나에 따른 이량체화 폴리펩티드가 제공된다:
A) 88C;
B) 3C;
C) 9C;
D) 25S, 76S 및 88C;
E) 25S, 76S 및 3C;
F) 25S, 76S 및 9C;
G) 7K, 25S, 62K, 76S 및 88C;
H) 7K, 25S, 62H, 76S 및 88C;
I) 7R, 25S, 62K, 76S 및 88C;
G) 7R, 25S, 62H, 76S 및 88C;
K) 11L, 25S, 62K, 76S 및 88C;
L) 11L, 25S, 62H, 76S 및 88C;
M) 12S, 13Y, 14T, 22S, 25S, 62K, 76S 및 88C;
N) 2E, 11L, 17E, 25S, 30D, 32P, 34E, 36T, 44I, 45T, 58V, 62E, 67Q, 69S, 76S, 88C 및 97G;
O) 11L, 20L, 22M, 25S, 53L, 62K, 76S 및 88C;
P) 11L, 25S, 41K, 45T, 62K, 67Q, 69S, 76S, 88C 및 89L;
Q) 11L, 25S, 42L, 45T, 62K, 67T, 69S, 76S, 88C, 92E 및 94G; 및
R) 11L, 12S, 13Y, 22S, 25S, 42L, 45T, 62K, 67Q, 69S, 76S, 88C, 92E 및 94G.
일부 실시양태에서, 서열번호 33의 변이체가 서열번호 33과 비교하여 위치 3, 9, 25, 41, 45, 62, 67, 69, 76, 88 및 89로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 위치에 아미노산 잔기 치환을 추가로 가지고; 일부 실시양태에서, 서열번호 33의 변이체가 서열번호 33과 비교하여 3C, 9C, 25S, 41K, 45T, 62K, 67Q, 69S, 76S, 88C 및 89L로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기 치환을 추가로 갖는, 상기 중 어느 하나에 따른 이량체화 폴리펩티드가 제공된다.
일부 실시양태에서, 서열번호 33의 변이체가 서열번호 33과 비교하여 위치 41, 45, 62, 67, 69, 88 및 89로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 위치에 아미노산 잔기 치환을 추가로 가지고; 일부 실시양태에서, 서열번호 33의 변이체가 서열번호 33과 비교하여 41K, 45T, 62K, 67Q, 69S, 88C 및 89L로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기 치환을 추가로 가지며; 일부 실시양태에서, 서열번호 33의 변이체가 41K, 45T, 62K, 67Q, 69S, 88C 및 89L의 아미노산 잔기 치환을 갖는, 상기 중 어느 하나에 따른 이량체화 폴리펩티드가 제공된다.
일부 실시양태에서, 서열번호 33의 변이체가 서열번호 33과 비교하여, 13S, 32F, 48V 및 82H의 아미노산 잔기 치환, 및 3C, 9C, 25S, 41K, 45T, 62K, 67Q, 69S, 76S, 88C, 및 89L로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기 치환을 갖는, 상기 중 어느 하나에 따른 이량체화 폴리펩티드가 제공된다. 일부 실시양태에서, 서열번호 33의 변이체는 서열번호 33과 비교하여 41K, 45T, 62K, 67Q, 69S 및 89L로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기 치환을 추가로 가지고, 예를 들어. 41K, 45T, 62K, 67Q, 69S 및 89L의 아미노산 잔기 치환을 가지며; 일부 실시양태에서, 서열번호 33의 변이체는 서열번호 33과 비교하여 3C, 9C, 25S, 66C, 76S, 88C 및 V93C로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 위치에 아미노산 잔기 치환을 추가로 가지고, 예를 들어, 다음 a) 내지 j) 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 잔기 치환을 갖는다: a) 25S, 76S 및 88C; b) 3C, 25S, 76S 및 88C; c) 9C, 25S, 76S 및 88C; d) 88C; e) 3C 및 88C; f) 9C 및 88C; g) 25S, 66C, 76S, 88C 및 93C; h) 9C, 25S, 66C, 76S, 88C 및 93C; i) 3C, 25S, 66C, 76S, 88C 및 93C; 및 j) 3C, 9C, 25S, 66C, 76S 및 93C.
일부 실시양태에서, 서열번호 33의 변이체가 서열번호 33과 비교하여 위치 25, 41, 45, 62, 67, 69, 76, 88 및 89로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 위치에 아미노산 치환을 추가로 가지고; 일부 실시양태에서, 서열번호 33의 변이체가 서열번호 33과 비교하여 25S, 41K, 45T, 62K, 67Q, 69S, 76S, 88C 및 89L로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기 치환을 추가로 갖는, 상기 중 어느 하나에 따른 이량체화 폴리펩티드가 제공된다.
일부 실시양태에서, 서열번호 33의 변이체가 서열번호 33과 비교하여 다음 a) 내지 j) 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 잔기 치환을 갖는, 상기 중 어느 하나에 따른 이량체화 폴리펩티드가 제공된다:
a) 25S, 32F, 41K, 45T, 48V, 62K, 67Q, 69S, 76S, 88C 및 89L;
b) 13S, 25S, 32F, 41K, 45T, 48V, 62K, 67Q, 69S, 76S, 82H, 88C 및 89L;
c) 3C, 13S, 25S, 32F, 41K, 45T, 48V, 62K, 67Q, 69S, 76S, 82H, 88C 및 89L;
d) 9C, 13S, 25S, 32F, 41K, 45T, 48V, 62K, 67Q, 69S, 76S, 82H, 88C 및 89L;
e) 13S, 32F, 41K, 45T, 48V, 62K, 67Q, 69S, 82H, 88C 및 89L;
f) 3C, 13S, 32F, 41K, 45T, 48V, 62K, 67Q, 69S, 82H, 88C 및 89L;
g) 9C, 13S, 32F, 41K, 45T, 48V, 62K, 67Q, 69S, 82H, 88C 및 89L;
h) 13S, 25S, 32F, 41K, 45T, 48V, 62K, 66C, 67Q, 69S, 76S, 82H, 88C, 89L 및 93C;
i) 3C, 13S, 25S, 32F, 41K, 45T, 48V, 62K, 66C, 67Q, 69S, 76S, 82H, 88C, 89L 및 93C; 및
j) 9C, 13S, 25S, 32F, 41K, 45T, 48V, 62K, 66C, 67Q, 69S, 76S, 82H, 88C, 89L 및 93C.
일부 실시양태에서, 옵스큐린-유사-O 쇄가 서열번호 34 또는 그의 변이체이고, 여기서 서열번호 34의 변이체가 서열번호 34와 비교하여 위치 6, 26, 74, 77, 84 및 86으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 위치에 아미노산 잔기 치환을 가지고; 서열번호 34의 변이체의 아미노산 잔기 치환 위치가 서열번호 34의 서열에 대한 천연 서열번호 위치인, 상기 중 어느 하나에 따른 이량체화 폴리펩티드가 제공된다. 일부 실시양태에서, 서열번호 34의 변이체는 서열번호 33과 비교하여 6E, 26S, 74C, 77S, 84C 및 86C로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기 치환을 가지고; 일부 실시양태에서, 서열번호 34의 변이체는 서열번호 33과 비교하여 다음 A) 내지 F) 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 잔기 치환을 갖는다:
A) 6E 및 74C;
B) 6E 및 84C;
C) 6E 및 86C;
D) 6E, 26S, 77S 및 74C;
E) 6E, 26S, 77S 및 84C; 및
F) 6E, 26S, 77S 및 86C.
일부 실시양태에서, 티틴-T 쇄가 서열번호 32, 68 또는 127의 변이체이고, 여기서 상기 변이체가 60S 및 64T로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기 치환을 가지고, 옵스큐린-O 쇄가 서열번호 33, 80 또는 128의 변이체이고, 상기 변이체가 13S, 32F, 48V, 66C, 82H 및 93C로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기 치환을 갖는, 상기 중 어느 하나에 따른 이량체화 폴리펩티드가 제공된다. 티틴-T 쇄의 잔기 위치는 서열번호 32 서열에 대한 천연 서열번호 위치이고; 옵스큐린-O 쇄의 잔기 위치는 서열번호 33 서열에 대한 천연 서열번호 위치이다.
일부 실시양태에서, 티틴-T 쇄가 서열번호 32, 68 또는 127의 변이체이고, 여기서 상기 변이체가 서열번호 32, 68 또는 127과 비교하여 60S 및/또는 64T로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 잔기 치환을 가지고; 옵스큐린-O 쇄가 서열번호 33, 80 또는 128의 변이체이고, 여기서 상기 변이체가 서열번호 33, 80 또는 128과 비교하여 13S, 32F, 48V, 66C, 82H 및 93C로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기 치환을 갖는, 상기 중 어느 하나에 따른 이량체화 폴리펩티드가 제공된다. 티틴-T 쇄의 아미노산 잔기 위치는 서열번호 32 서열에 대한 천연 서열번호 위치이고; 옵스큐린-O 쇄의 아미노산 잔기 위치는 서열번호 33 서열에 대한 천연 서열번호 위치이다.
일부 실시양태에서, 티틴-T 쇄가 서열번호 132 내지 서열번호 141의 아미노산 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 85%(예를 들어, 적어도 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%) 서열 동일성을 가지고, 옵스큐린-O 쇄가 서열번호 129 내지 서열번호 131의 아미노산 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 85%(예를 들어, 적어도 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%) 서열 동일성을 갖는, 상기 중 어느 하나에 따른 이량체화 폴리펩티드가 제공된다. 일부 실시양태에서, 티틴-T 쇄가 서열번호 129 내지 서열번호 131 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 가지고, 옵스큐린-O 쇄가 서열번호 132 내지 서열번호 141 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 갖는, 상기 중 어느 하나에 따른 이량체화 폴리펩티드가 제공된다. 일부 실시양태에서, 티틴-T 쇄가 서열번호 129에 제시된 아미노산 서열을 가지고, 옵스큐린-O 쇄가 서열번호 133에 제시된 아미노산 서열을 가지거나; 티틴-T 쇄가 서열번호 129에 제시된 아미노산 서열을 가지고, 옵스큐린-O 쇄가 서열번호 135에 제시된 아미노산 서열을 가지거나; 티틴-T 쇄가 서열번호 129에 제시된 아미노산 서열을 가지고, 옵스큐린-O 쇄가 서열번호 136에 제시된 아미노산 서열을 갖는, 상기 중 어느 하나에 따른 이량체화 폴리펩티드가 제공된다.
일부 실시양태에서, 티틴-T 쇄가 옵스큐린-O 쇄와 결합하여 이량체화 폴리펩티드를 형성할 수 있는, 상기 중 어느 하나에 따른 이량체화 폴리펩티드가 제공되고; 일부 실시양태에서, 티틴-T 쇄가 옵스큐린-유사-O 쇄와 결합하여 이량체화 폴리펩티드를 형성할 수 있는, 상기 중 어느 하나에 따른 이량체화 폴리펩티드가 제공된다.
일부 실시양태에서, 티틴-T 쇄의 위치 7 내지 15, 19 내지 24, 26, 55, 59 및 60의 하나 이상의 잔기가 옵스큐린-O 쇄의 위치 3 내지 6, 9, 41, 73, 75 및 80 내지 90의 하나 이상의 잔기와 결합되고, 티틴-T 쇄의 위치 1, 7 내지 10, 13 내지 16, 19 내지 26, 59 내지 60 및 96의 하나 이상의 잔기가 옵스큐린-유사-O 쇄의 위치 4 내지 5, 10, 12 내지 13, 74, 76, 78 및 82 내지 91의 하나 이상의 잔기와 결합되는, 상기 중 어느 하나에 따른 이량체화 폴리펩티드가 제공된다. 일부 실시양태에서, 티틴-T 쇄는 서열번호 32의 위치 7 내지 60에 아미노산을 포함하고/하거나, 상기 중 어느 하나에 따른 상응하는 위치에 아미노산 잔기 치환을 추가로 포함하고; 옵스큐린-O 쇄는 서열번호 33의 위치 3 내지 90에 아미노산을 포함하고/하거나 상기 중 어느 하나에 따른 위치에 아미노산 잔기를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 티틴-T 쇄는 서열번호 32의 위치 1 내지 96에 아미노산을 포함하고/하거나, 상기 중 어느 하나에 따른 상응하는 위치에 아미노산 잔기 치환을 추가로 포함하고; 옵스큐린-유사-O 쇄는 서열번호 34의 위치 4 내지 91에 아미노산을 포함하고/하거나, 상기 중 어느 하나에 따른 위치에 아미노산 잔기를 추가로 포함한다.
티틴-T 쇄의 잔기 위치가 서열번호 32 서열에 대한 천연 서열번호 위치이고; 옵스큐린-O 쇄의 잔기 위치가 서열번호 33 서열에 대한 천연 서열번호 위치이며; 옵스큐린-유사-O 쇄의 잔기 위치가 서열번호 34 서열에 대한 천연 서열번호 위치인, 상기 중 어느 하나에 따른 이량체화 폴리펩티드가 제공된다.
일부 실시양태에서, 전술한 티틴-T 쇄가 서열번호 32, 68 또는 127의 60S 및 64T로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기 치환을 가지고, 옵스큐린-O 쇄가 서열번호 33, 80 또는 128의 13S, 32F, 48V, 66C, 82H 및 93C로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기 치환을 갖는, 상기 중 어느 하나에 따른 이량체화 폴리펩티드가 제공된다. 티틴-T 쇄의 잔기 위치는 서열번호 32 서열에 대한 천연 서열번호 위치이고; 옵스큐린-O 쇄의 잔기 위치는 서열번호 33 서열에 대한 천연 서열번호 위치이다.
일부 실시양태에서, 서열번호 32의 변이체는 서열번호 32에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양탱레서, 서열번호 32의 변이체는 서열번호 32와 비교하여 상기 중 어느 하나에 따른 아미노산 잔기 치환만을 갖는다. 일부 실시양태에서, 서열번호 33의 변이체는 서열번호 33에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 서열번호 33의 변이체는 서열번호 33과 비교하여 상기 중 어느 하나에 따른 아미노산 잔기 치환만을 갖는다. 일부 실시양태에서, 서열번호 34의 변이체는 서열번호 34에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 서열번호 34의 변이체는 서열번호 34와 비교하여 상기 중 어느 하나에 따른 아미노산 잔기 치환만을 갖는다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 상기 중 어느 하나에 따른 이량체화 폴리펩티드를 포함하는 항원-결합 분자를 제공한다.
일부 실시양태에서, 제1 항원-결합 모이어티를 포함하고, 상기 제1 항원-결합 모이어티는 중쇄 가변 영역 VH1, 경쇄 가변 영역 VL1, 및 이량체화 폴리펩티드를 포함하지만 경쇄 불변 영역 CL 및 중쇄 불변 영역 CH1은 포함하지 않는 도메인-조작된 Fab를 포함하고, 여기서 VH1 및 VL1은 각각 링커를 통해 이량체화 폴리펩티드의 펩티드 쇄 중 어느 하나에 연결되는, 상기 중 어느 하나에 따른 항원-결합 분자가 제공된다. 일부 실시양태에서, VH1의 C-말단은 링커를 통해 티틴-T 쇄의 N-말단에 융합되고, VL1의 C-말단은 링커를 통해 옵스큐린-O 쇄 또는 옵스큐린-유사-O 쇄의 N-말단에 융합되며; 일부 실시양태에서, VL1의 C-말단은 링커를 통해 티틴-T 쇄의 N-말단에 융합되고, VH1의 C-말단은 링커를 통해 옵스큐린-O 쇄 또는 옵스큐린-유사-O 쇄의 N-말단에 융합된다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 경쇄 불변 영역 CL 및 중쇄 불변 영역 CH1을 대체하는 상기 중 어느 하나에 따른 이량체화 폴리펩티드를 포함하는 항원-결합 분자를 제공한다.
일부 실시양태에서, 제1 항원-결합 모이어티를 포함하고, 상기 제1 항원-결합 모이어티는 중쇄 가변 영역 VH1, 경쇄 가변 영역 VL1, 및 전술한 이량체화 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 VH1 및 VL1은 각각 링커를 통해 이량체화 폴리펩티드의 펩티드 쇄 중 어느 하나에 연결되는, 상기 중 어느 하나에 따른 항원-결합 분자가 제공된다. 일부 실시양태에서, VH1의 C-말단은 링커를 통해 티틴-T 쇄의 N-말단에 융합되고, VL1의 C-말단은 링커를 통해 옵스큐린-O 쇄 또는 옵스큐린-유사-O 쇄의 N-말단에 융합되며; 일부 실시양태에서, VL1의 C-말단은 링커를 통해 티틴-T 쇄의 N-말단에 융합되고, VH1의 C-말단은 링커를 통해 옵스큐린-O 쇄 또는 옵스큐린-유사-O 쇄의 N-말단에 융합된다.
일부 실시양태에서, 다음을 포함하는 제1 항원-결합 모이어티를 포함하는, 상기 중 어느 하나에 따른 항원-결합 분자가 제공된다:
a. N-말단에서 C-말단의 순서로 [VH1]-[링커 1]-[티틴-T 쇄]의 펩티드 쇄, 및 N-말단에서 C-말단의 순서로 [VL1]-[링커 2]-[옵스큐린-O 쇄 또는 옵스큐린-유사-O 쇄]의 펩티드 쇄; 또는
b. N-말단에서 C-말단의 순서로 [VH1]-[링커 1]-[옵스큐린-O 쇄 또는 옵스큐린-유사-O 쇄]의 펩티드 쇄, 및 N-말단에서 C-말단의 순서로 [VL1]-[링커 2]-[티틴-T 쇄]의 펩티드 쇄;
여기서, 링커 1과 링커 2는 동일하거나 상이하다. 일부 실시양태에서, 펩티드 링커는 유연한 펩티드 링커이다. 일부 실시양태에서, 펩티드 링커는 길이가 3 내지 15개 아미노산 잔기이다. 일부 실시양태에서: A) 링커 1 및 링커 2는 둘 다 (GxS)y 링커이고, 여기서 x는 1 내지 5의 정수(예를 들어, 1, 2, 3, 4 또는 5)로 이루어진 군에서 선택되고, y는 0 내지 6의 정수(예를 들어, 0, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6)로 이루어진 군에서 선택되고, 여기서 y가 0인 경우 링커는 결합이거나, B) 링커 1은 CH1의 C-말단 절두 서열(truncated sequence)이고, 링커 2는 CL의 C-말단 절두 서열이다. 일부 다른 실시양태에서, A) 링커 1은 서열번호 173에 제시된 서열을 가지고; 링커 2는 서열번호 174에 제시된 서열을 가지거나; 또는 B) 링커 1 및 링커 2는 둘 다 서열번호 175에 제시된 서열을 가지거나; 또는 C) 링커 1 및 링커 2 둘 다 서열번호 176에 제시된 서열을 갖는다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 제1 항원-결합 모이어티 및 제2 항원-결합 모이어티를 포함하는 항원-결합 분자를 제공하며, 여기서 제1 항원-결합 모이어티는 상기에서 정의된 바와 같고, 제2 항원-결합 모이어티는 중쇄 가변 영역 VH2 및 경쇄 가변 영역 VL2을 포함하고, 제1 항원-결합 모이어티 및 제2 항원-결합 모이어티는 상이한 항원에 또는 동일한 항원상의 상이한 에피토프에 결합한다.
일부 실시양태에서, 제2 항원-결합 모이어티는 Fab를 포함한다.
일부 실시양태에서, 항원-결합-분자는 Fc 영역을 추가로 포함하고, 여기서 Fc 영역은 서로 결합할 수 있는 제1 서브유닛 Fc1 및 제2 서브유닛 Fc2를 포함하고; 일부 실시양태에서, Fc 영역은 IgG의 Fc 영역이고; 일부 실시양태에서, Fc 영역은 IgG1의 Fc 영역이고; 일부 실시양태에서, Fc 영역은 동종이량체화를 감소시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 가지고/가지거나; Fc 영역은 Fc 수용체에 대한 Fc 영역의 결합을 감소시킬 수 있는 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는다. 일부 실시양태에서, Fc 영역은 YTE 돌연변이(M252Y, S254T 및 T256E), L234A 및 L235A 돌연변이, 및/또는 S228P 돌연변이를 가지며, 여기서 돌연변이는 EU 인덱스에 따라 번호가 지정된다. 일부 실시양태에서, Fc는 서로 결합할 수 있는 제1 서브유닛 및 제2 서브유닛을 포함하며, 여기서 제1 서브유닛 및/또는 제2 서브유닛은 동종이량체화를 감소시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는다. 일부 실시양태에서, 제1 서브유닛은 놉-인투-홀 기술에 따른 돌기 구조를 가지고, 제2 서브유닛은 놉-인투-홀 기술에 따른 기공(pore) 구조를 가지거나, 또는 제1 서브유닛은 놉-인투-홀 기술에 따른 기공 구조를 가지고, 제2 서브유닛은 놉-인투-홀 기술에 따른 돌기 구조를 갖는다. 일부 실시양태에서, 제1 서브유닛은 354, 356, 358 및 366으로 이루어진 군에서 선택된 위치에 하나 이상의 아미노산 치환을 가지고, 제2 서브유닛은 349, 356, 358, 366, 368 및 407로 이루어진 군에서 선택된 위치에 하나 이상의 아미노산 치환을 가지고; 일부 실시양태에서, 제2 서브유닛은 354, 356, 358 및 366으로 이루어진 군에서 선택된 위치에 하나 이상의 아미노산 치환을 가지고, 제1 서브유닛은 349, 356, 358, 366, 368 및 407로 이루어진 군에서 선택된 위치에 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는다. 일부 실시양태에서, 제1 서브유닛은 354C, 356E, 358M 및 366W로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 치환을 가지고, 제2 서브유닛은 349C, 356E, 358M, 366S, 368A 및 407V로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는다. 일부 실시양태에서, 제2 서브유닛은 354C, 356E, 358M, 및 366W로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 치환을 가지고, 제1 서브유닛은 349C, 356E, 358M, 366S, 368A 및 407V로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는다. 일부 실시양태에서, 제1 서브유닛은 354C, 356E, 358M 및 366W의 아미노산 치환을 포함하고, 제2 서브유닛은 349C, 356E, 358M, 366S, 368A 및 407V의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 서브유닛은 354C, 356E, 358M 및 366W의 아미노산 치환을 포함하고, 제1 서브유닛은 349C, 356E, 358M, 366S, 368A 및 407V의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, Fc1은 서열번호 177에 제시된 서열을 가지고, Fc2는 서열번호 178에 제시된 서열을 가지거나; 또는 Fc2는 서열번호 177에 제시된 서열을 가지고, Fc1은 서열번호 178에 제시된 서열을 갖는다.
일부 실시양태에서, 제1 중쇄, 제1 경쇄, 제2 중쇄, 및 제2 경쇄를 포함하는, 상기 중 어느 하나에 따른 항원-결합 분자가 제공되며, 여기서,
a. 제1 중쇄는 N-말단에서 C-말단의 순서로 [VH1]-[링커 1]-[티틴-T 쇄]-[링커 3]-[Fc1]을 포함하고,
제1 경쇄는 N-말단에서 C-말단의 순서로 [VL1]-[링커 2]-[옵스큐린-O 쇄 또는 옵스큐린-유사-O 쇄]를 포함하고,
제2 중쇄는 N-말단에서 C-말단의 순서로 [VH2]-[CH1]-[Fc2]를 포함하고,
제2 경쇄는 N-말단에서 C-말단의 순서로 [VL2]-[CL]을 포함하거나; 또는
b. 제1 중쇄는 N-말단에서 C-말단의 순서로 [VH1]-[링커 1]-[옵스큐린-O 쇄 또는 옵스큐린-유사-O 쇄]-[링커 3]-[Fc1]을 포함하고,
제1 경쇄는 N-말단에서 C-말단의 순서로 [VL1]-[링커 2]-[티틴-T 쇄]를 포함하고,
제2 중쇄는 N-말단에서 C-말단의 순서로 [VH2]-[CH1]-[Fc2]를 포함하고,
제2 경쇄는 N-말단에서 C-말단의 순서로 [VL2]-[CL]을 포함하고;
여기서, 상기 링커 1, 링커 2 및 링커 3은 동일하거나 상이하다. 일부 실시양태에서, 펩티드 링커는 유연한 펩티드 링커이다. 일부 실시양태에서, 펩티드 링커는 길이가 3 내지 15개 아미노산 잔기이다. 일부 실시양태에서, Fc1 및 Fc2는 각각 독립적으로 동종이량체화를 감소시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는다. 일부 실시양태에서, 링커 1, 링커 2 및 링커 3이 제공되며, 여기서: A) 링커 1, 링커 2 및 링커 3은 모두 (GxS)y 링커이고, 여기서 x는 1 내지 5의 정수(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 또는 5)로 이루어진 군에서 선택되고, y는 0 내지 6의 정수(예를 들어, 0, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6)로 이루어진 군에서 선택되거나(여기서: y가 0인 경우, 링커는 결합이다); 또는 B) 링커 1은 CH1의 C-말단 절두 서열이고, 링커 2는 CL의 C-말단 절두 서열이고, 링커 3은 (GxS)y 링커이고, 여기서 x는 1 내지 5의 정수(예를 들어, 1, 2, 3, 4 또는 5)로 이루어진 군에서 선택되고 y는 0 내지 6의 정수(예를 들어, 0, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6)로 이루어진 군에서 선택된다. 일부 실시양태에서, 링커 3은 결합이고, 링커 1 및 링커 2는 다음과 같다: A) 링커 1은 서열번호 173에 제시된 서열을 가지고; 링커 2는 서열번호 174에 제시된 서열을 가지거나; 또는 B) 링커 1 및 링커 2는 둘 다 서열번호 175에 제시된 서열을 가지거나; 또는 C) 링커 1 및 링커 2는 둘 다 서열번호 176에 제시된 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, Fc1은 놉-인투-홀 기술에 따른 돌기 구조를 가지고, Fc2는 놉-인투-홀 기술에 따른 기공 구조를 가지거나, 또는 Fc1은 놉-인투-홀 기술에 따른 기공 구조를 가지고, Fc2는 놉-인투-홀 기술에 따른 돌기 구조를 갖는다. 일부 실시양태에서, Fc1은 354, 356, 358 및 366으로 이루어진 군에서 선택된 위치에 하나 이상의 아미노산 치환을 가지고, Fc2는 349, 349, 349, 356, 358, 366, 368 및 407로 이루어진 군에서 선택된 위치에 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는다. 일부 실시양태에서, Fc2는 354, 356, 358 및 366으로 이루어진 군에서 선택된 위치에 하나 이상의 아미노산 치환을 가지고, Fc1은 349, 356, 358, 366, 368 및 407로 이루어진 군에서 선택된 위치에 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는다. 일부 실시양태에서, Fc1은 354C, 356E, 358M 및 366W로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 치환을 가지고, Fc2는 349C, 356E, 358M, 366S, 368A 및 407V로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는다. 일부 실시양태에서, Fc2는 354C, 356E, 358M 및 366W로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 치환을 가지고, Fc1은 349C, 356E, 358M, 366S, 368A 및 407V로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는다. 일부 실시양태에서, Fc1은 354C, 356E, 358M 및 366W의 아미노산 치환을 포함하고, Fc2는 349C, 356E, 358M, 366S, 368A 및 407V의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, Fc2는 354C, 356E, 358M 및 366W의 아미노산 치환을 포함하고, Fc1은 349C, 356E, 358M, 366S, 368A 및 407V의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, Fc1은 서열번호 177에 제시되어 있고, Fc2는 서열번호 178에 제시되어 있거나; 또는 Fc2는 서열번호 177에 제시되어 있고, Fc1은 서열번호 178에 제시되어 있다.
일부 실시양태에서, 상기 중 어느 하나에 따른 항원-결합 분자는 다중특이성 항체이다.
일부 실시양태에서, 상기 중 어느 하나에 따른 항원-결합 분자는 이중특이성 항체, 삼중특이성 항체 또는 사중특이성 항체이다.
일부 실시양태에서, 상기 중 어느 하나에 따른 항원-결합 분자는 이중특이성 항체이다.
일부 실시양태에서, 상기 중 어느 하나에 따른 항원-결합 분자가 제공되며, 여기서:
(I) 항원-결합 분자는 NGF 및 RANKL에 결합할 수 있고; 일부 실시양태에서, 항원-결합 분자는 제1 중쇄, 제1 경쇄, 제2 중쇄, 및 제2 경쇄를 포함하며, 여기서:
제1 중쇄는 N-말단에서 C-말단의 순서로 [VH1]-[링커 1]-[옵스큐린-O 쇄]-[링커 3]-[Fc1]을 포함하고,
제1 경쇄는 N-말단에서 C-말단의 순서로 [VL1]-[링커 2]-[티틴-T 쇄]를 포함하고,
제2 중쇄는 N-말단에서 C-말단의 순서로 [VH2]-[CH1]-[Fc2]를 포함하고,
제2 경쇄는 N-말단에서 C-말단의 순서로 [VL2]-[CL]을 포함하고; 여기서 VH1은 VL1과 NGF에 결합하는 제1 항원-결합 모이어티를 형성하고, VH2는 VL2와 RANKL에 결합하는 제2 항원-결합 모이어티를 형성하거나; 또는
VH1은 VL1과 RANKL에 결합하는 제1 항원-결합 모이어티를 형성하고, VH2는 VL2와 NGF에 결합하는 제2 항원-결합 모이어티를 형성하며;
일부 실시양태에서, VH1은 서열번호 26에 제시된 서열을 가지고, VL1은 서열번호 27에 제시된 서열을 가지고, VH2는 서열번호 24에 제시된 서열을 가지고, VL2는 서열번호 25에 제시된 서열을 가지거나; 또는
VH1은 서열번호 24에 제시된 서열을 가지고, VL1은 서열번호 25에 제시된 서열을 가지고, VH2는 서열번호 26에 제시된 서열을 가지고, VL2는 서열번호 27에 제시된 서열을 가지며;
옵스큐린-O 쇄는 서열번호 132 내지 141 중 어느 하나에 제시된 서열을 가지고, 티틴-T 쇄는 서열번호 129 내지 131 중 어느 하나에 제시된 서열을 가지고;
일부 실시양태에서, Fc1은 서열번호 177에 제시된 서열을 가지고; Fc2는 서열번호 178에 제시된 서열을 가지고; CH1은 서열번호 179에 제시된 서열을 가지고; CL은 서열번호 4에 제시된 서열을 가지며; 링커 3은 결합이고; 링커 1 및 링커 2는 a) 둘 다 서열번호 175에 제시된 서열을 갖는 링커 1 및 링커 2; 및 b) 서열번호 173에 제시된 서열을 갖는 링커 1 및 서열번호 174에 제시된 서열을 갖는 링커 2로 이루어진 군에서 선택되거나;
(II) 항원-결합 분자는 PDL1 및 CTLA4에 결합할 수 있고; 일부 실시양태에서, 항원-결합 분자는 제1 중쇄, 제1 경쇄, 제2 중쇄, 및 제2 경쇄를 포함하며, 여기서:
제1 중쇄는 N-말단에서 C-말단의 순서로 [VH1]-[링커 1]-[옵스큐린-O 쇄]-[링커 3]-[Fc1]을 포함하고,
제1 경쇄는 N-말단에서 C-말단의 순서로 [VL1]-[링커 2]-[티틴-T 쇄]를 포함하고,
제2 중쇄는 N-말단에서 C-말단의 순서로 [VH2]-[CH1]-[Fc2]를 포함하고,
제2 경쇄는 N-말단에서 C-말단의 순서로 [VL2]-[CL]을 포함하고; 여기서 VH1은 VL1과 PDL1에 결합하는 제1 항원-결합 모이어티를 형성하고, VH2는 VL2와 CTLA4에 결합하는 제2 항원-결합 모이어티를 형성하거나; 또는
VH1은 VL1과 CTLA4에 결합하는 제1 항원-결합 모이어티를 형성하고, VH2는 VL2와 PDL1에 결합하는 제2 항원-결합 모이어티를 형성하며;
일부 실시양태에서, VH1은 서열번호 156에 제시된 서열을 가지고, VL1은 서열번호 155에 제시된 서열을 가지고, VH2는 서열번호 169에 제시된 서열을 가지며, VL2는 서열번호 170에 제시된 서열을 가지거나; 또는
VH1은 서열번호 169에 제시된 서열을 가지고, VL1은 서열번호 170에 제시된 서열을 가지고, VH2는 서열번호 156에 제시된 서열을 가지며, VL2는 서열번호 155에 제시된 서열을 가지고;
옵스큐린-O 쇄는 서열번호 132 내지 141 중 어느 하나에 제시된 서열을 가지고, 티틴-T 쇄는 서열번호 129 내지 131 중 어느 하나에 제시된 서열을 가지며;
일부 실시양태에서, Fc1은 서열번호 178에 제시된 서열을 가지고; Fc2는 서열번호 177에 제시된 서열을 가지고; CH1은 서열번호 179에 제시된 서열을 가지고; CL은 서열번호 4에 제시된 서열을 가지며; 링커 3은 결합이고; 링커 1 및 링커 2는 a) 둘 다 서열번호 175에 제시된 서열을 갖는 링커 1 및 링커 2; 및 b) 서열번호 173에 제시된 서열을 갖는 링커 1 및 서열번호 174에 제시된 서열을 갖는 링커 2로 이루어진 군에서 선택되거나; 또는
(III) 항원-결합 분자는 IL5 및 TSLP에 결합할 수 있고; 일부 실시양태에서, 항원-결합 분자는 제1 중쇄, 제1 경쇄, 제2 중쇄, 및 제2 경쇄를 포함하며, 여기서:
제1 중쇄는 N-말단에서 C-말단의 순서로 [VH1]-[링커 1]-[티틴-T 쇄]-[링커 3]-[Fc1]을 포함하고;
제1 경쇄는 N-말단에서 C-말단의 순서로 [VL1]-[링커 2]-[옵스큐린-O 쇄]를 포함하고;
제2 중쇄는 N-말단에서 C-말단의 순서로 [VH2]-[CH1]-[Fc2]를 포함하고;
제2 경쇄는 N-말단에서 C-말단의 순서로 [VL2]-[CL]을 포함하고; 여기서:
VH1은 VL1과 IL5에 결합하는 제1 항원-결합 모이어티를 형성하고, VH2는 VL2와 TSLP에 결합하는 제2 항원-결합 모이어티를 형성하거나; 또는
VH1은 VL1과 TSLP에 결합하는 제1 항원-결합 모이어티를 형성하고, VH2는 VL2와 IL5에 결합하는 제2 항원-결합 모이어티를 형성하며;
일부 실시양태에서, VH1은 서열번호 16에 제시된 서열을 가지고, VL1은 서열번호 17에 제시된 서열을 가지고, VH2는 서열번호 171에 제시된 서열을 가지며, VL2는 서열번호 172에 제시된 서열을 가지거나; 또는
VH1은 서열번호 171에 제시된 서열을 가지고, VL1은 서열번호 172에 제시된 서열을 가지고, VH2는 서열번호 16에 제시된 서열을 가지며, VL2는 서열번호 17에 제시된 서열을 가지고;
옵스큐린-O 쇄는 서열번호 132 내지 141 중 어느 하나에 제시된 서열을 가지고, 티틴-T 쇄는 서열번호 129 내지 131 중 어느 하나에 제시된 서열을 가지고;
일부 실시양태에서, Fc1은 서열번호 178에 제시된 서열을 가지고; Fc2는 서열번호 177에 제시된 서열을 가지고; CH1은 서열번호 179에 제시된 서열을 가지고; CL은 서열번호 4에 제시된 서열을 가지며; 링커 3은 결합이고; 링커 1 및 링커 2는 a) 둘 다 서열번호 175에 제시된 서열을 갖는 링커 1 및 링커 2; 및 b) 서열번호 173에 제시된 서열을 갖는 링커 1 및 서열번호 174에 제시된 서열을 갖는 링커 2로 이루어진 군에서 선택된다.
일부 실시양태에서, 다음을 포함하는, 상기 중 어느 하나에 따른 항원-결합 분자가 제공된다:
a. N-말단에서 C-말단의 순서로 [VH1]-[링커 1]-[티틴-T 쇄]-[링커 3]-[VH2]-[CH1]-[Fc1]을 포함하는 제1 중쇄;
N-말단에서 C-말단의 순서로 [VH1]-[링커 1]-[티틴-T 쇄]-[링커 3]-[VH2]-[CH1]-[Fc2]를 포함하는 제2 중쇄;
N-말단에서 C-말단의 순서로 [VL1]-[링커 2]-[옵스큐린-O 쇄 또는 옵스큐린-유사-O 쇄]를 포함하는 제1 경쇄; 및
N-말단에서 C-말단의 순서로 [VL2]-[CL]을 포함하는 제2 경쇄; 또는
b. N-말단에서 C-말단의 순서로 [VH1]-[링커 1]-[옵스큐린-O 쇄 또는 옵스큐린-유사-O 쇄]-[링커 3]-[VH2]-[CH1]-[Fc1]을 포함하는 제1 중쇄;
N-말단에서 C-말단의 순서로 [VH1]-[링커 1]-[옵스큐린-O 쇄 또는 옵스큐린-유사-O 쇄]-[링커 3]-[VH2]-[CH1]-[Fc2]를 포함하는 제2 중쇄;
N-말단에서 C-말단의 순서로 [VL1]-[링커 2]-[티틴-T 쇄]를 포함하는 제1 경쇄; 및
N-말단에서 C-말단의 순서로 [VL2]-[CL]을 포함하는 제2 경쇄;
여기서, 상기 링커 1, 링커 2 및 링커 3은 동일하거나 상이하고; 일부 실시양태에서, 링커 1, 링커 2 및 링커 3은 다음 A) 또는 B)이다:
A) 링커 1, 링커 2 및 링커 3은 모두 (GxS)y 링커이고, 여기서 x는 1 내지 5의 정수로 이루어진 군에서 선택되고, y는 0 내지 6의 정수로 이루어진 군에서 선택되고,
B) 링커 1은 CH1의 C-말단 절두 서열이고, 링커 2는 CL의 C-말단 절두 서열이며, 링커 3은 (GxS)y 링커이고, 여기서 x는 1 내지 5의 정수로 이루어진 군에서 선택되고, y는 0 내지 6의 정수로 이루어진 군에서 선택된다.
일부 실시양태에서, 링커 1, 링커 2 및 링커 3은 다음 A) 내지 C) 중 어느 하나로부터 선택된다:
A) 서열번호 173에 제시된 서열을 갖는 링커 1; 서열번호 174에 제시된 서열을 갖는 링커 2; 서열번호 175 또는 서열번호 176에 제시된 서열을 갖는 링커 3,
B) 모두 서열번호 175에 제시된 서열을 갖는 링커 1, 링커 2, 및 링커 3, 및
C) 모두 서열번호 176에 제시된 서열을 갖는 링커 1, 링커 2, 및 링커 3.
일부 실시양태에서, Fc1 및 Fc2는 각각 독립적으로 동종이량체화를 감소시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는다. 일부 실시양태에서, Fc1 및 Fc2는 동일하다. 일부 실시양태에서, 항원-결합 분자는 1개의 제1 중쇄 및 1개의 제2 중쇄, 및 2개의 제1 경쇄 및 2개의 제2 경쇄를 포함하며, 여기서 제1 중쇄 및 제2 중쇄는 동일한 아미노산 서열을 갖는다.
일부 실시양태에서, 항원-결합 분자는 PDL1 및 TIGIT에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 제1 항원은 PDL1이고, 제2 항원은 TIGIT이다. 일부 실시양태에서, 제1 항원은 TIGIT이고, 제2 항원은 PDL1이다. 일부 실시양태에서, 항원-결합 분자는 PDL1에 특이적으로 결합할 수 있는 제1 항원-결합 모이어티 및 TIGIT에 특이적으로 결합할 수 있는 제2 항원-결합 모이어티를 포함하며, 여기서 제1 항원-결합 모이어티는 중쇄 가변 영역 VH1 및 경쇄 가변 영역 VL1을 포함하고, 제2 항원-결합 모이어티는 중쇄 가변 영역 VH2 및 경쇄 가변 영역 VL2를 포함하고; 여기서:
VH1은 각각 서열번호 163, 서열번호 164, 및 서열번호 165에 제시된 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하고, VL1은 각각 서열번호 166, 서열번호 167 및 서열번호 168에 제시된 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하고/하거나;
VH2는 각각 서열번호 157, 서열번호 158 및 서열번호 159에 제시된 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하고, VL2는 각각 서열번호 160, 서열번호 161 및 서열번호 162에 제시된 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함한다.
일부 실시양태에서, VH1은 서열번호 156에 제시된 서열 또는 서열번호 156에 대해 적어도 90%(예를 들어, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 96%, 96%, 96%, 97%, 98% 또는 99%)의 서열 동일성을 갖는 서열을 가지며, VL1은 서열번호 155에 제시된 서열 또는 서열번호 155에 대해 적어도 90%(예를 들어, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%)의 서열 동일성을 갖는 서열을 가지고/가지거나;
VH2는 서열번호 154에 제시된 서열 또는 서열번호 154에 대해 적어도 90%(예를 들어, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%)의 서열 동일성을 갖는 서열을 가지며, VL2는 서열번호 153에 제시된 서열 또는 서열번호 153에 대해 적어도 90%(예를 들어, 적어도 90%, 91%, 92%%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%)의 서열 동일성을 갖는 서열을 갖는다.
일부 실시양태에서, 항원-결합 분자는 서열번호 148에 제시된 서열 또는 서열번호 148에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 갖는 중쇄; 서열번호 146에 제시된 서열 또는 서열번호 146에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 갖는 제1 경쇄; 및 서열번호 147에 제시된 서열 또는 서열번호 147에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 갖는 제2 경쇄를 포함하고; 일부 실시양태에서, 항원-결합 분자는 2개의 상기 중쇄, 2개의 상기 제1 경쇄, 및 2개의 상기 제2 경쇄를 갖는다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 PDL1에 특이적으로 결합할 수 있는 제1 항원-결합 모이어티 및 TIGIT에 특이적으로 결합할 수 있는 제2 항원-결합 모이어티를 포함하는 항원-결합 분자를 제공하며, 여기서 제1 항원-결합 모이어티는 중쇄 가변 영역 VH1 및 경쇄 가변 영역 VL1을 포함하고, 제2 항원-결합 모이어티는 중쇄 가변 영역 VH2 및 경쇄 가변 영역 VL2를 포함하고; 여기서:
VH1은 각각 서열번호 163, 서열번호 164 및 서열번호 165에 제시된 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하고, VL1은 각각 서열번호 166, 서열번호 167 및 서열번호 168에 제시된 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하고/하거나;
VH2는 각각 서열번호 157, 서열번호 158 및 서열번호 159에 제시된 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하고, VL2는 각각 서열번호 160, 서열번호 161 및 서열번호 162에 제시된 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함한다.
일부 실시양태에서, VH1은 서열번호 156에 제시된 서열 또는 서열번호 156에 대해 적어도 90%(예를 들어, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 96%, 96%, 96%, 97%, 98% 또는 99%)의 서열 동일성을 갖는 서열을 가지며, VL1은 서열번호 155에 제시된 서열 또는 서열번호 155에 대해 적어도 90%(예를 들어, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%)의 서열 동일성을 갖는 서열을 가지고/가지거나;
VH2는 서열번호 154에 제시된 서열 또는 서열번호 154에 대해 적어도 90%(예를 들어, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%)의 서열 동일성을 갖는 서열을 가지며, VL2는 서열번호 153에 제시된 서열 또는 서열번호 153에 대해 적어도 90%(예를 들어, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%)의 서열 동일성을 갖는 서열을 갖는다.
일부 실시양태에서, 항원-결합 분자는 서열번호 148에 제시된 서열 또는 서열번호 148에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 갖는 중쇄; 서열번호 146에 제시된 서열 또는 서열번호 146에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 갖는 제1 경쇄; 및 서열번호 147에 제시된 서열 또는 서열번호 147에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 갖는 제2 경쇄를 갖는다. 일부 실시양태에서, 항원-결합 분자는 2개의 중쇄, 2개의 제1 경쇄 및 2개의 제2 경쇄를 갖는다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은, 중쇄 불변 영역 CH1 및 경쇄 불변 영역 CL이 상기 중 어느 하나에 따른 이량체화 폴리펩티드로 대체된 도메인-조작된 항체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 중쇄 불변 영역 CH1이 티틴-T 쇄로 대체되고 경쇄 불변 영역 CL이 옵스큐린-O 쇄로 대체된 도메인-조작 항체가 제공된다. 일부 실시양태에서, 경쇄 불변 영역 CL이 티틴-T 쇄로 대체되고, 중쇄 불변 영역 CH1이 옵스큐린-O 쇄로 대체된 도메인-조작 항체가 제공된다. 일부 실시양태에서, 중쇄 불변 영역 CH1이 티틴-T 쇄로 대체되고, 경쇄 불변 영역 CL이 옵스큐린-유사-O 쇄로 대체된 도메인-조작 항체가 제공된다. 일부 실시양태에서, 경쇄 불변 영역 CL이 티틴-T 쇄로 대체되고, 중쇄 불변 영역 CH1이 옵스큐린-유사-O 쇄로 대체된 도메인-조작 항체가 제공된다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 상기 중 어느 하나에 따른 항원-결합 분자 또는 도메인-조작 항체, 및 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 항체 경쇄/중쇄 불일치의 감소에 있어서 상기 중 어느 하나에 따른 이량체화 폴리펩티드의 용도를 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 이중특이성 항체의 제조시 항체 경쇄/중쇄 불일치의 감소에 있어서 상기 중 어느 하나에 따른 이량체화 폴리펩티드의 용도를 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 다중특이성 항체의 제조시 경쇄/중쇄 불일치의 감소에 있어서 상기 중 어느 하나에 따른 이량체화 폴리펩티드의 용도를 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 사중특이성 항체, 삼중특이성 항체 및 이중특이성 항체의 제조시 경쇄/중쇄 불일치의 감소에 있어서 상기 중 어느 하나에 따른 이량체화 폴리펩티드의 용도를 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 상기 중 어느 하나에 따른 이량체화 폴리펩티드, 항원-결합 분자, 또는 도메인-조작 항체를 암호화하는 핵산 분자를 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 상기 중 어느 하나에 따른 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 상기 중 어느 하나에 따른 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포를 추가로 제공한다.
일부 실시양태에서, 전술한 벡터를 사용한 형질전환(또는 형질도입 또는 형질감염)에 의해 수득된, 상기 중 어느 하나에 따른 숙주 세포가 제공되며; 숙주 세포는 원핵 세포 및 진핵 세포, 바람직하게는 진핵 세포, 더욱 바람직하게는 포유동물 세포로 이루어진 군에서 선택된다. 숙주 세포에는 인간 배아 줄기 세포, 수정란 또는 생식 세포와 같은 온전한 개체로 발달할 수 있는 임의의 동물 또는 식물 세포는 포함되지 않는다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 진핵 세포이고, 더욱 바람직하게는 CHO, 293, NSO, 및 유전자 편집이 수행되어 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 글리코실화 변형을 변경시킴으로써 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 ADCC 기능을 변경시킬 수 있는, 예를 들어, FUT8 또는 GnT-III와 같은 유전자를 녹아웃시키는 세포를 포함하지만, 이로 제한되지 않는 포유동물 세포이다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 전술한 숙주 세포를 배양하고, 이량체화 폴릴펩티드, 항원-결합 분자 또는 도메인-조작 항체를 정제 및 단리하는 단계를 포함하는, 상기 중 어느 하나에 따른 이량체화 폴리펩티드, 항원-결합 분자 또는 도메인-조작 항체를 제조하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 또한 질환 또는 병태를 치료 또는 예방하기 위한 약제의 제조에 있어서 상기 중 어느 하나에 따른 항원-결합 분자, 도메인-조작 항체 또는 약학 조성물의 용도를 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 상기 중 어느 하나에 따른 항원-결합 분자, 도메인-조작 항체 또는 약학 조성물 효과량을 그를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 질환 또는 병태를 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 약제로서 사용하기 위한, 상기 중 어느 하나에 따른 항원-결합 분자, 도메인-조작 항체, 또는 약학 조성물을 제공하고; 일부 실시양태에서, 약제는 질환 또는 병태를 치료 또는 예방하는데 사용하기 위한 것이다.
일부 실시양태에서, 상기 중 어느 하나에 따른 질환 또는 병태는 골다공증, 골감소증 또는 골관절염, 류마티스 관절염, 치주 질환 또는 다발성 골수종과 같은 뼈-관련 질환이다. 일부 실시양태에서, 종양은 암종, 림프종, 모세포종, 육종, 백혈병 및 림프성 악성종양으로 이루어진 군에서 선택된다. 일부 실시양태에서, 종양은 편평 세포 암종, 골수종, 소세포 폐암, 비소세포 폐암(NSCLC), 두경부 편평 세포 암종(HNSCC), 신경교종, 호지킨 림프종, 비호지킨 림프종, 미만성 거대 B세포 림프종(DLBCL), 여포성 림프종, 급성 림프구성 백혈병(ALL), 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 만성 골수성 백혈병(CML), 원발성 종격동 거대 B세포 림프종, 외투세포 림프종(MCL), 소림프구성 림프종(SLL), T세포/조직구가 풍부한 거대 B세포 림프종, 다발성 골수종, 골수 세포 백혈병-1 단백질(Mcl-1), 골수이형성 증후군(MDS), 위장(관)암, 신장암, 난소암, 간암, 림프모구성 백혈병, 림프구성 백혈병, 대장암, 자궁내막암, 신장암, 전립선암, 갑상선암, 흑색종, 연골육종, 신경모세포종, 췌장암, 다형성 교모세포종, 위암, 뼈암, 유잉육종, 자궁경부암, 뇌암, 위암, 방광암, 간종양, 유방암, 결장암, 간세포암종(HCC), 투명세포 신세포암종(RCC), 두경부암, 후두암, 간담도암, 중추신경계암, 식도암, 악성 흉막 중피종, 전신 경쇄 아밀로이드증, 림프형질구성 림프종, 골수이형성 증후군, 골수증식성 종양, 신경내분비 종양, 메르켈 세포 암종, 고환암 및 피부암으로 이루어진 군에서 선택된다. 일부 실시양태에서, 염증성 질환은 류마티스 관절염, 건선, 크론병, 강직성 척추염, 다발성 경화증, 제1형 당뇨병, 간염(예를 들어, B형 간염, A형 간염, C형 간염), 심근염, 쇼그렌 증후군, 이식 거부후 자가면역 용혈성 빈혈, 유천포창, 그레이브스병, 하시모토 갑상선염, 전신성 홍반성 루푸스(SLE), 중증 근무력증, 천포창 및 악성 빈혈로 이루어진 군에서 선택된다. 일부 실시양태에서, 면역 질환은 류마티스 관절염, 건선, 관절 건선, 피부염, 전신 경피증 및 경화증, 염증성 장 질환(IBD), 크론병, 궤양성 대장염, 호흡 곤란 증후군, 수막염, 뇌염, 포도막염, 사구체신염, 습진, 천식, 동맥경화증, 백혈구 유착-결핍 질환, 다발성 경화증, 레이노 증후군, 쇼그렌 증후군, 소아 당뇨병, 라이터병, 베체트병, 면역 복합 신염, IgA 신장병증, IgM 다발신경병증, 면역-매개성 혈소판 감소증 증상(예를 들면, 급성 특발성 혈소판감소성 자반증 및 만성 특발성 혈소판감소성 자반증), 용혈성 빈혈, 중증 근무력증, 루푸스 신염, 전신성 홍반성 루푸스, 류마티스 관절염(RA), 아토피 피부염, 천포창, 그레이브스병, 하시모토 갑상선염, 베게너 육아종증, 오멘병 증후군, 만성 신부전, 급성 감염성 단핵구증, HIV 및 헤르페스 바이러스 관련 질환, 중증 급성 호흡기 증후군, 무도병염 및 바이러스 감염으로 인한 면역 질환(예를 들면, 엡스타인-바 바이러스(EBV)에 의한 B 세포 감염으로 야기되거나 매개되는 질환)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
도 1a 및 1b는 이량체화 폴리펩티드 복합체를 형성하기 위한 티틴-T 쇄와 옵스큐린-O 쇄 또는 옵스큐린-유사-O 쇄 사이의 상호작용의 계면 구조도를 나타낸 것으로, 여기서 도 1a는 티틴-T 쇄와 옵스큐린-O 쇄 사이의 상호작용의 계면 구조도를 나타내고; 도 1b는 티틴-T 쇄와 옵스큐린-유사-O 쇄 사이의 상호작용의 계면 구조도를 나타내며;
도 2는 CH1 및 CL이 대체된 Fab의 개략도를 나타내고;
도 3은 양쪽의 CH1 및 CL이 대체된 IgG 단일특이성 항체의 개략적인 구조도를 나타내고;
도 4는 한쪽의 CH1 및 CL이 대체된 IgG 이중특이성 항체의 개략적인 구조도를 나타내고;
도 5는 DI-1 이중특이성 항체의 개략적인 구조도를 나타내고;
도 6a 내지 6c는 DI-1의 질량 분석 스펙트럼을 나타내며; 여기서, 도 6a는 LC1/LC2의 질량 분석 스펙트럼을 나타내고, 도 6b는 HC1/HC2의 질량 분석 스펙트럼을 나타내고; 도 6c는 LC1 + LC2 + HC1 + HC2의 질량 분석 스펙트럼을 나타내며;
도 7은 항체 경쇄/중쇄 교차-불일치 분자의 개략적인 구조도를 나타내고;
도 8은 BU5 이중특이성 항체의 개략적인 구조도를 나타내고;
도 9a 내지 9c는 질량 분석 스펙트럼을 나타내며, 여기서 도 9a는 B0의 질량 분석 스펙트럼을 나타내고, 도 9b는 UO의 질량 분석 스펙트럼을 나타내며, 도 9c는 BU5의 질량 분석 스펙트럼을 나타내고;
도 10은 DI-1 이중특이성 항체의 파골세포 분화 실험의 결과를 나타내고;
도 11은 DI-1 이중특이성 항체의 TF1 세포 증식 실험의 결과를 나타내고;
도 12는 이중특이성 항체 HJ-1, HJ-2, HJ-3 및 HJ-4의 개략적인 구조도를 나타내고;
도 13a 내지 13d는 4개의 쇄가 동시-발현된 HJ 이중특이성 항체의 질량 분석 스펙트럼을 나타내며, 여기서 도 13a는 4개의 쇄가 동시-발현된 HJ-1의 질량 분석 스펙트럼을 나타내고, 도 13b는 4개의 쇄가 동시-발현된 HJ-2의 질량 분석 스펙트럼을 나타내고, 도 13c는 4개의 쇄가 동시-발현된 HJ-3의 질량 분석 스펙트럼을 나타내고, 도 13d는 4개의 쇄가 동시-발현된 HJ-4의 질량 분석 스펙트럼을 나타내며;
도 14a 및 14b는 HJ-1-H1, HJ-1-H2 및 HJ-1-L2의 3개 쇄가 동시-발현된 이중특이성 항체 HJ-1의 질량 분석 스펙트럼을 나타내고, 여기서 도 14a는 120000 내지 130000(amu) 디콘볼루션(deconvolution) 부분의 질량 분석 스펙트럼을 나타내고, 도 14b는 140000 내지 160000(amu) 디콘볼루션 부분의 질량 분석 스펙트럼을 나타내며;
도 15a 및 15b는 HJ-3-H1, HJ-3-H2 및 HJ-3-L2의 3개 쇄가 동시-발현된 이중특이성 항체 HJ-3의 질량 분석 스펙트럼을 나타내고; 여기서, 도 15a는 122600 내지 125200(amu) 디콘볼루션 부분의 질량 분석 스펙트럼을 나타내고, 도 15b는 120000 내지 148000(amu) 디콘볼루션 부분의 질량 분석 스펙트럼을 나타내고;
도 16a 및 16b: 여기서, 도 16a는 티틴-T 쇄/옵스큐린-O 쇄의 잔기들 사이의 상호작용 부위를 나타내고, 도 16b는 티틴-T 쇄/옵스큐린-유사-O 쇄의 잔기들 사이의 상호작용 부위를 나타내고;
도 17은 도메인-조작된 Fab에 의해 구축된 (FabV)2-IgG 형태의 이중특이성 항체 구조의 개략도를 나타내며;
도 18은 PDL1-TIGIT 이중특이성 항체에 의해 PD-1에 대한 PD-L1의 결합 및 CD155에 대한 TIGIT의 결합이 차단되는 것에 대한 실험 결과를 나타내고;
도 19는 PDL1-TIGIT 이중특이성 항체에 의한 IFN-γ 분비 촉진에 대한 실험 결과를 나타내며;
도 20은 PDL1-TIGIT 이중특이성 항체에 의한 MC38-HL1 마우스에서의 이종이식 종양 억제에 대한 실험 결과를 나타낸다.
본 개시내용의 이해를 돕기 위해, 일부 기술 및 과학 용어를 하기에 설명한다. 본원에서 달리 구체적으로 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 당해 분야의 숙련자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다.
설명 및 청구범위에 사용된 바와 같이, "하나의" 및 "그"의 단수형은 문맥에서 달리 명확하게 표시되지 않는 한 복수형을 포함한다.
문맥에서 달리 명확하게 언급되지 않는 한, 설명 및 청구범위 전반에 걸쳐, "구성되다", "갖는다", "포함하다" 등의 단어는 배타적이거나 완전한 의미가 아닌 포괄적인 의미로 해석되어야 한다.
"및/또는"이라는 용어는 "및"과 "또는"이라는 두 가지 의미를 포함하도록 의도된다. 예를 들어, "A, B 및/또는 C"라는 문구는 다음 각각을 포함하도록 의도된다: A, B 및 C; A, B 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A 및 C; A 및 B; B 및 C; A(단독); B(단독); 및 C(단독).
본원에 사용된 아미노산에 대한 3문자 및 단일-문자 코드는 문헌[J. biol. chem, 243, p3558(1968)]에 기재된 바와 같다.
"아미노산"이라는 용어는 천연 및 합성 아미노산뿐만 아니라 천연 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모방체를 지칭한다. 천연 아미노산은 유전자 코드에 의해 암호화된 아미노산 및 나중에 변형된 아미노산, 예를 들어, 하이드록시프롤린, γ-카복시글루탐산 및 O-포스포세린이다. 아미노산 유사체는 천연 아미노산과 실질적으로 동일한 화학 구조(즉, 수소, 카복실, 아미노 및 R기에 결합하는 α 탄소)를 갖는 화합물, 예를 들어, 호모세린, 노르류신, 메티오닌 설폭사이드 및 메티오닌메틸 설포늄을 지칭한다. 이러한 유사체는 변형된 R기(예를 들어, 노르류신) 또는 변형된 펩티드 골격을 가지지만, 천연 아미노산과 실질적으로 동일한 화학 구조를 유지한다. 아미노산 모방체는 아미노산과 상이한 구조를 갖지만 천연 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 화합물을 지칭한다.
"아미노산 돌연변이"라는 용어에는 아미노산 치환(아미노산 대체로도 알려짐함), 결실, 삽입 및 변형이 포함된다. 최종 구조물이 Fc 수용체에 대한 감소된 결합과 같은 목적하는 특성을 보유하는 한, 최종 구조물을 수득하기 위해 치환, 결실, 삽입 및 변형의 임의 조합이 이루어질 수 있다. 아미노산 서열 결실 및 삽입은 폴리펩티드 쇄의 아미노 말단 및/또는 카복실 말단에서의 결실 및 삽입을 포함한다. 특정 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환일 수 있다. 한 실시양태에서, 아미노산 돌연변이는 비보존적 아미노산 치환, 즉 하나의 아미노산을 상이한 구조적 및/또는 화학적 성질을 갖는 다른 아미노산으로 대체하는 것이다. 아미노산 치환은 비천연 아미노산 또는 20가지 천연 아미노산의 유도체(예를 들어, 4-하이드록시프롤린, 3-메틸히스티딘, 오르니틴, 호모세린 및 5-하이드록시라이신)로의 대체를 포함한다. 아미노산 돌연변이는 당해 분야에 잘 알려진 유전적 또는 화학적 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 유전적 방법은 부위-지정 돌연변이유발, PCR, 유전자 합성 등을 포함할 수 있다. 화학적 변형과 같은 유전 공학 이외의 아미노산 측쇄기를 변경하는 방법도 사용될 수 있는 것으로 고려된다. 본원에서는 동일한 아미노산 돌연변이를 나타내기 위해 다양한 명칭이 사용될 수 있다. 본원에서, "위치 + 아미노산 잔기"의 표현은 특정 위치에서의 아미노산 잔기를 의미하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 366W는 위치 366의 아미노산 잔기가 W라는 것을 나타낸다. T366W는 위치 366의 아미노산 잔기가 원래의 T에서 W로 돌연변이되었음을 나타낸다.
용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되며, 단일클론 항체, 다중클론 항체; 단일특이성 항체, 다중특이성 항체(예를 들어, 이중특이성 항체); 및 전장 항체, 및 원하는 항원-결합 활성을 나타내는 한 항체 단편(또는 항원-결합 단편 또는 항원-결합 모이어티)을 포함한다. "천연 항체"는 천연 면역글로불린 분자를 지칭한다. 예를 들어, 천연 IgG 항체는 다이설파이드 결합에 의해 연결된 2개의 동일한 경쇄 및 2개의 동일한 중쇄로 구성된 약 150,000 달톤의 이종사량체 당단백질이다. N-말단에서 C-말단까지, 각각의 중쇄는 가변 중쇄 도메인 또는 중쇄 가변 영역으로도 알려진 하나의 가변 영역(VH)과, 이어서 하나의 중쇄 불변 영역을 갖는다. 중쇄 불변 영역은 일반적으로 3개의 불변 도메인(CH1, CH2 및 CH3)을 포함한다. 유사하게, N-말단에서 C-말단으로, 각각의 경쇄는 가변 경쇄 도메인 또는 경쇄 가변 도메인으로도 알려진 하나의 가변 영역(VL)과, 이어서 하나의 불변 경쇄 도메인(경쇄 불변 영역, CL)을 갖는다. "전장 항체", "온전한 항체" 및 "전체 항체"란 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 천연 항체 구조와 실질적으로 유사한 구조를 가지거나 본원에 정의된 바와 같은 Fc 영역에 중쇄를 갖는 항체를 지칭한다. 온전한 천연 항체에서, 경쇄는 경쇄 가변 영역 VL 및 불변 영역 CL을 포함하며, 여기서 VL은 경쇄의 아미노 말단에 위치하고, 경쇄 불변 영역은 κ 쇄 및 λ 쇄를 포함하고; 중쇄는 가변 영역 VH 및 불변 영역(CH1, CH2 및 CH3)을 포함하며, 여기서 VH는 중쇄의 아미노 말단에 위치하고, 불변 영역은 카복실 말단에 위치하며, 여기서 CH3은 폴리펩티드의 카복실 말단에 가장 가깝고, 중쇄는 IgG(아형 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 포함), IgA(아형 IgA1 및 IgA2 포함), IgM 및 IgE를 포함하여 임의의 이소타입일 수 있다.
항체의 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"이라는 용어는 항원에 대한 항체의 결합에 관여하는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 지칭한다. 본원에서, 항체의 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)은 각각 4개의 보존된 프레임워크 영역(FR) 및 3개의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"이라는 용어는 주로 항원-결합에 기여하는 가변 도메인의 영역을 지칭하며; "프레임워크" 또는 "FR"은 CDR 잔기 이외의 가변 도메인 잔기를 지칭한다. VH는 3개의 CDR 영역: HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하고; VL은 3개의 CDR 영역: LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함한다. 각각의 VH 및 VL은 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4의 순서로 아미노 말단(N-말단으로도 알려짐)에서부터 카복실 말단(C-말단으로도 알려짐)까지 정렬된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다.
CDR의 아미노산 서열 경계는 다양한 잘 알려진 체계, 예를 들어 "Kabat" 번호지정 체계(문헌[Kabat et al. (1991), "Sequences of Proteins of Immunological Interest", 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD] 참조), "Chothia" 번호지정 체계, "ABM" 번호지정 체계, "Contact" 번호지정 체계(문헌 [Martin, ACR, Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains[J]. 2001] 참조) 및 ImMunoGenTics(IMGT) 번호지정 체계(문헌[Lefranc, M.P. et al., Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77(2003)]; 문헌[Front Immunol. 2018 Oct 16; 9: 2278] 참조) 등에 의해 결정될 수 있다. 다양한 번호지정 체계 간의 대응 관계는, 하기 표 1에 나타낸 바와 같이, 당해 분야의 숙련자에게 잘 알려져 있으며 예시적이다.
[표 1] CDR 번호지정 체계 간의 관계
달리 명시되지 않는 한, 본원에서 가변 영역 및 CDR의 서열에는 "Kabat" 번호지정 체계가 적용된다.
용어 "항체 단편"은 온전한 항체가 결합하는 항원에 결합하는 온전한 항체의 모이어티를 포함하는, 온전한 항체와는 다른 분자를 지칭한다. 항체 단편의 예로는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, 단일 도메인 항체, 단일쇄 Fab(scFab), 디아바디, 선형 항체, 단일쇄 항체 분자(예, scFv) 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이성 항체가 포함되지만 이로 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 항체의 항원-결합 단편은 1가 Fab(즉, Fab), 2가 Fab(F(ab)2), 3가 Fab 단편(F(ab)3), 다가 Fab(2개 이상의 Fab)이거나, 또는 적어도 하나의 Fab 단편을 포함하는 단일특이성 또는 다중특이성 항원-결합 단편일 수 있다.
"항원-결합 분자"라는 용어는 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질을 지칭한다.
용어 "Fc 영역" 또는 "단편 결정화가능 영역"은 천연 Fc 영역 및 변형된 Fc 영역 및 변형된 Fc 영역을 포함하는, 항체 중쇄의 C-말단 영역을 정의하는데 사용된다. 일부 실시양태에서, Fc 영역은 동일하거나 상이할 수 있는 2개의 서브유닛을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간 IgG 중쇄의 Fc 영역은 위치 Cys226의 아미노산 잔기로부터 또는 Pro230으로부터 그의 카복실 말단까지 연장되는 것으로 정의된다. 본원에 기재된 항체에 사용되는 적합한 Fc 영역에는 인간 IgG1, IgG2(IgG2A 및 IgG2B), IgG3 및 IgG4의 Fc 영역이 포함된다. 일부 실시양태에서, Fc 영역의 경계는 또한, 예를 들어, Fc 영역의 C-말단 라이신(EU 번호지정 체계에 따른 잔기 447)을 결실시키거나 Fc 영역의 C-말단 글리신 및 라이신(EU 번호지정 체계에 따른 잔기 446 및 447)을 결실시킴으로써 달라질 수 있다. 달리 명시되지 않는 한, Fc 영역에 대한 번호지정 체계는 EU 인덱스로도 알려진 EU 번호지정 체계이다.
본원에 기재된 "도메인-조작 항체"라는 용어는 CH1 및/또는 CL이 다른 도메인 또는 펩티드 단편으로 대체된 항체를 지칭하며, 예를 들어, CH1/CL은 티틴-T 쇄/옵스큐린-O 쇄 또는 티틴-T 쇄/옵스큐린-유사-O 쇄로 대체된다. 일부 실시양태에서, 도메인-조작 항체는 단일특이성 항체 또는 다중특이성 항체이고; 일부 실시양태에서, 도메인-조작 항체는 1가 항체, 2가 항체 또는 다가 항체이고; 일부 실시양태에서, 도메인-조작 항체는 온전한 항체 또는 그의 항원-결합 단편이며; 일부 실시양태에서, Fab의 CH1/CL이 티틴-T 쇄/옵스큐린-O 쇄 또는 티틴-T 쇄/옵스큐린-유사-O 쇄로 대체된 도메인-조작된 Fab의 개략적인 구조도를 도 2에 나타내었고; 단일클론 항체의 CH1/CL이 티틴-T 쇄/옵스큐린-O 쇄 또는 티틴-T 쇄/옵스큐린-유사-O 쇄로 대체된 도메인-조작 항체의 개략적인 구조도는 도 3에 나타내었으며; 이중특이성 항체의 한쪽의 CH1/CL이 티틴-T 쇄/옵스큐린-O 쇄 또는 티틴-T 쇄/옵스큐린-유사-O 쇄로 대체된 도메인-조작 항체의 개략적인 구조도는 도 4에 나타내었다. 적어도 하나의 CH1 및 적어도 하나의 CL이 티틴-T 쇄/옵스큐린-O 쇄 또는 티틴-T 쇄/옵스큐린-유사-O 쇄로 대체된 다른 도메인-조작 항체로는, 한쪽의 CH1 및 CL이 티틴-T 쇄/옵스큐린-O 쇄 또는 티틴-T 쇄/옵스큐린-유사-O 쇄로 대체된 2가 항체, 양쪽의 CH1 및 CL이 티틴-T 쇄/옵스큐린-O 쇄 또는 티틴-T 쇄/옵스큐린-유사-O 쇄로 대체된 이중특이성 항체, 2개의 CH1/CL이 티틴-T 쇄/옵스큐린-O 쇄 또는 티틴-T 쇄/옵스큐린-유사-O 쇄로 대체된 F(ab)2 단편, 또는 1개 또는 2개 또는 3개의 CH1/CL이 티틴-T 쇄/옵스큐린-O 쇄 또는 티틴-T 쇄/옵스큐린-유사-O 쇄로 대체된 F(ab)3 단편이 포함되지만, 이로 제한되지는 않는다.
"티틴(Titin)"은 복잡한 분자 접힘 구조를 갖는 거대 육종 단백질이다. 이는 두꺼운 근원섬유를 Z-선에 연결시켜 근원섬유의 완전성 및 안정성을 유지하는 등의 기능을 갖는 것으로 알려져 있다. 티틴은 골격근 섬유에서 세 번째로 풍부한 단백질로 분자량이 2700 kDa(25000개 이상의 아미노산)이고 길이가 1 μm로 근섬유분절의 약 절반이다.
"티틴 Ig-유사 152 도메인"은 옵스큐린 Ig-유사 1 도메인 또는 옵스큐린-유사 Ig-유사 1 도메인에 결합하여 복합체를 형성할 수 있는, 티틴 Ig-유사 152 도메인으로 명명된 티틴 단백질의 Ig-유사 도메인이다(RCSB PDB 데이터베이스에서 이용가능함).
"티틴-T 쇄" 또는 "T 쇄"는 티틴 단백질에 티틴 Ig-유사 152 도메인을 포함하는 78 내지 118개 아미노산 길이의 펩티드 단편 또는 그의 기능성 변이체를 지칭하며, 여기서 티틴-T 쇄는 옵스큐린 Ig-유사 1 도메인 또는 옵스큐린-유사 Ig-유사 1 도메인에 결합하여 이량체화된 복합체를 형성할 수 있다. T 쇄의 기능성 변이체는 야생형 T 쇄의 아미노산 일부의 돌연변이를 통해 수득되지만 여전히 옵스큐린 Ig-유사 1 도메인 또는 옵스큐린-유사 Ig-유사 1 도메인에 결합하여 이량체화된 복합체를 형성하는 펩티드를 갖는다. 본 개시내용에서, 티틴-T 쇄는 항원에 대한 항체의 결합에 영향을 미치지 않으면서 항체의 CH1 또는 CL 도메인을 대체하는데 사용될 수 있다. 티틴 Ig-유사 152 도메인의 아미노산 일부는 옵스큐린 Ig-유사 1 도메인 또는 옵스큐린-유사 Ig-유사 1 도메인에 결합하여 복합체를 형성하는 기능을 유지하면서 돌연변이될 수 있다. 예를 들어, 적합한 길이의 아미노산이 티틴 Ig-유사 152 도메인의 C-말단 및/또는 N-말단에 부가되거나 절두되며; 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산 잔기가 부가되거나 절두될 수 있고; 예를 들어, 티틴 Ig-유사 152 도메인의 N-말단에 바로 인접한 5개의 야생형 티틴 단백질의 5개 아미노산 "KAGIR"이 티틴 Ig-유사 152 도메인의 N-말단에 부가되고, 이는 옵스큐린 Ig-유사 1 도메인 또는 옵스큐린-유사 Ig-유사 1 도메인에 결합하여 복합체를 형성하는 기능을 여전히 가지고 있다. 티틴 Ig-유사 152 도메인의 아미노산에 다른 돌연변이가 또한 이루어질 수 있다, 예를 들어, 특정 아미노산이 쇄간 다이설파이드 결합을 증가시키고, 복합체 안정성을 향상시키도록 돌연변이될 수 있다. 일부 실시양태에서, 티틴-T 쇄는 서열번호 32 또는 그의 돌연변이된 서열의 위치 7 내지 60에 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 티틴-T 쇄는 서열번호 32 또는 그의 돌연변이된 서열의 위치 1 내지 96의 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 티틴-T 쇄는 위치 60 및 64로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 위치에 아미노산 잔기 치환을 갖는, 예를 들어, 60S 및 64T로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기 치환을 갖는 서열번호 32의 변이체이다. 일부 실시양태에서, 티틴-T 쇄는 위치 60 및 64로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 위치에 아미노산 잔기 치환을 가지고, 추가로 위치 3, 8, 11, 13, 20, 22, 25, 26, 39, 40, 42, 45, 47, 49, 56, 58, 66, 70, 75, 77, 79, 81, 82, 83 및 84로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 위치에 아미노산 잔기 치환을 갖는 서열번호 32의 변이체이고; 예를 들어, 변이체는 3W, 8C, 11I, 13L, 20C, 22M/22C, 25S, 26C, 39T, 40S, 42K, 45S, 47E, 49G, 56S, 58E, 66S/66K, 70R, 75V, 77S, 79T, 81R, 82M, 83D 및 84L로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기 치환을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 티틴-T 쇄는 서열번호 32 또는 그의 돌연변이된 서열의 위치 7 내지 60에 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 티틴-T 쇄는 서열번호 32 또는 그의 돌연변이된 서열의 위치 1 내지 96에 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드이다.
"옵스큐린(Obscurin)"은 OBSCN 유전자에 의해 암호화되는 단백질이며 거대 사르코신 신호전달 단백질 계열에 속한다. 옵스큐린은 심장 및 골격근에서 발현되며 근섬유분절 구성시 근원섬유의 조직에 중요한 역할을 한다. 옵스큐린은 sANK1의 분해를 방지할 수 있는 근세포질 레티큘린 sANK1의 주요 세포질 리간드이고(문헌[Lange S et al., Molecular Biology of the Cell., 23(13): 2490-504]); 옵스큐린은 근세포질 세망 도메인과 근세포질 세망 도메인 사이의 신호전달 링크로서 작용하며(문헌[Bagnato P et al., The Journal of Cell Biology., 160(2): 245-53]). 옵스큐린은 근원섬유 구성시 새로운 근섬유분절의 형성에 참여한다(문헌[Borisov AB, et al., Biochemical and Biophysical Research Communications., 310(3): 910-918]).
"옵스큐린 Ig-유사 1 도메인"은 옵스큐린 Ig-유사 1 도메인으로 명명된 옵스큐린 단백질의 Ig-유사 도메인으로, 티틴 Ig-유사 152 도메인에 결합하여 이량체화된 복합체를 형성할 수 있다(RCSB PDB 데이터베이스에서 이용가능함).
"옵스큐린-O 쇄" 또는 "O 쇄"는 티틴 Ig-유사 152 도메인에 결합하여 이량체화된 복합체를 형성할 수 있는, 옵스큐린 단백질에 옵스큐린 Ig-유사 1 도메인를 포함하는 87 내지 117개 아미노산 길이의 펩티드 단편 또는 그의 기능성 변이체를 의미한다. 옵스큐린-O 쇄의 기능성 변이체는 야생형 O 쇄의 아미노산 일부에 대한 돌연변이를 통해 수득되지만, 여전히 티틴 Ig-유사 152 도메인에 결합하여 이량체화된 복합체를 형성하는 펩티드를 갖는다. 본 개시내용에서, 옵스큐린-O 쇄는 항원에 대한 항체의 결합에 영향을 미치지 않고 항체의 CH1 또는 CL 도메인을 대체할 수 있다. 옵스큐린 Ig-유사 1 도메인의 아미노산 일부는 티틴 Ig-유사 152 도메인에 결합하여 복합체를 형성하는 기능을 계속 유지하면서 돌연변이될 수 있다. 예를 들어, 적절한 길이의 아미노산이 옵스큐린-O 도메인의 C-말단 및/또는 N-말단에 부가되거나 절두된다, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산이 부가되거나 절두된다; 예를 들어, 옵스큐린 Ig-유사 1 도메인의 N-말단에 바로 인접한 5개의 야생형 옵스큐린 단백질의 5개 아미노산 "DQPQF"는 여전히 옵스큐린-O 도메인에 결합하여 이량체화된 복합체를 형성하는 기능을 가지면서 옵스큐린-O 도메인의 N-말단에 부가된다. 옵스큐린 Ig-유사 1 도메인의 아미노산 일부에 다른 돌연변이가 또한 이루어질 수 있다, 예를 들어, 특정 아미노산이 쇄간 다이설파이드 결합을 증가시키고 항체 안정성을 향상시키도록 돌연변이될 수 있다. 일부 실시양태에서, 옵스큐린-O 쇄는 위치 13, 32, 48, 66, 82 및 93으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 위치에 아미노산 잔기 치환을 갖는, 예를 들어, 13S, 32F, 48V, 66C, 82H 및 93C로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기 치환을 갖는 서열번호 33의 변이체이고; 일부 실시양태에서, 옵스큐린-O 쇄는 위치 2, 3, 7, 9, 11, 12, 13, 14, 17, 20, 22, 25, 30, 32, 34, 36, 41, 42, 44, 45, 53, 58, 62, 67, 69, 76, 88, 89, 92, 94 및 97로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 위치에 아미노산 잔기 치환을 추가로 갖는, 예를 들어, 2E, 3C, 7K/7R, 9C, 11L, 12S, 13Y, 14T, 17E, 20L, 22M/22S, 25S, 30D, 32P, 34E, 36T, 41K, 42L, 44I, 45T, 53L, 58V, 62E/62K/62H, 67Q/67T, 69S, 76S, 88C, 89L, 92E, 94G 및 97G로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기 치환을 추가로 갖는 서열번호 33의 변이체이다. 일부 실시양태에서, 옵스큐린-O 쇄는 서열번호 33의 위치 3 내지 90에 아미노산을 포함하는 폴리펩티드 또는 그의 돌연변이된 서열이다.
"옵스큐린-유사 1"은 인간 염색체 2q35의 SPEG에 위치한 OBSL1 유전자에 의해 암호화되는 단백질이며 옵스큐린과 밀접하게 관련된다. "옵스큐린-유사 1"의 대안적인 스플라이싱은 130kD 내지 230kD 범위의 예측 분자량을 갖는 다중 이소형을 생성한다(문헌[Geisler SB et al., (2007)., Genomics., 89(4): 521-531]).
"옵스큐린-유사 Ig-유사 1 도메인"은 옵스큐린-유사 Ig-유사 1 도메인으로 명명된 옵스큐린-유사 1 단백질의 Ig-유사 도메인으로, 티틴 Ig-유사 152 도메인에 결합하여 복합체를 형성할 수 있다(RCSB PDB 데이터베이스에서 이용가능함).
"옵스큐린-유사 O 쇄" 또는 "OL 쇄"는 옵스큐린-유사 1 단백질에 옵스큐린-유사 Ig-유사 1 도메인을 포함하는 78 내지 118개 아미노산 길이의 펩티드 단편 또는 그의 기능성 변이체를 지칭한다. 옵스큐린-유사-O 쇄는 티틴 Ig-유사 152 도메인에 결합하여 이량체화된 복합체를 형성할 수 있다. 옵스큐린-유사-O 쇄의 기능성 변이체는 야생형 OL 쇄의 아미노산 일부에 대한 돌연변이를 통해 수득되지만 여전히 티틴 Ig-유사 152 도메인에 결합하여 이량체화 폴리펩티드를 형성하는 펩티드를 갖는다. 본 개시내용에서, 옵스큐린-유사-O 쇄는 항체의 VH 및 VL에 의한 항원-결합 부위의 형성 및 항체와 항원의 결합에 영향을 주지 않으면서 항체의 CH1 또는 CL 도메인을 대체할 수 있다. 옵스큐린-유사 Ig-유사 1 도메인의 아미노산 일부는 티틴 Ig-유사 152 도메인에 결합하여 이량체화된 복합체를 형성하는 기능을 유지하면서 돌연변이될 수 있다. 예를 들어, 적절한 길이의 아미노산이 옵스큐린-O 도메인의 C-말단 및/또는 N-말단에 부가되거나 절두된다, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산이 부가되거나 절두된다. 옵스큐린-유사 Ig-유사 1 도메인의 아미노산 일부에 다른 돌연변이가 또한 이루어질 수 있다, 예를 들어, 쇄간 다이설파이드 결합을 증가시키고 항체 안정성을 향상시키도록 특정 아미노산이 돌연변이될 수 있다. 일부 실시양태에서, 옵스큐린-유사-O 쇄는 위치 6, 26, 74, 77, 84 및 86으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 위치에 아미노산 잔기 치환을 갖는, 예를 들어, 6E, 26S, 74C, 77S, 84C 및 86C로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기 치환을 갖는 서열번호 34의 변이체이다. 일부 실시양태에서, 옵스큐린-유사-O 쇄는 서열번호 34의 위치 4 내지 91에 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드 또는 그의 돌연변이된 서열이다.
일부 실시양태에서, 티틴 Ig-유사 152 도메인, 옵스큐린 Ig-유사 1 도메인 및/또는 옵스큐린-유사 Ig-유사 1 도메인의 아미노산 일부가 돌연변이되고, 이는 여전히 티틴 Ig-유사 152 도메인을 옵스큐린 Ig-유사 1 도메인과 결합시켜 복합체를 형성하는 능력을 가지거나, 티틴 Ig-유사 152 도메인을 옵스큐린-유사 1 도메인과 결합시켜 복합체를 형성하는 능력을 갖는다. 일부 실시양태에서, 티틴-T 쇄/옵스큐린-O 쇄 이량체화 폴리펩티드 및 티틴-T 쇄/옵스큐린-유사-O 쇄 이량체화 폴리펩티드가 개시되며, 여기서 티틴-T 쇄의 위치 7 내지 15, 19 내지 24, 26, 55, 59 및 60에 하나 이상의 잔기가 옵스큐린-O 쇄의 위치 3 내지 6, 9, 41, 73, 75 및 80 내지 90의 하나 이상의 잔기와 연결되고, 티틴-T 쇄의 위치 1, 7 내지 10, 13 내지 16, 19 내지 26, 59 내지 60 및 96의 하나 이상의 잔기는 옵스큐린-유사-O 쇄의 위치 4 내지 5, 10, 12 내지 13, 74, 76, 78 및 82 내지 91의 하나 이상의 잔기에 연결되며; 티틴-T 쇄의 잔기 위치는 서열번호 32 서열에 대한 천연 서열번호 위치이고; 옵스큐린-O 쇄의 잔기 위치는 서열번호 33 서열에 대한 천연 서열번호 위치이고; 옵스큐린-유사-O 쇄의 잔기 위치는 서열번호 34 서열에 대한 천연 서열번호 위치이다.
"Fab"는 면역글로불린의 VH 및 CH1(Fab 중쇄)과 VL 및 CL(Fab 경쇄)로 이루어진 단백질을 지칭한다.
"도메인-조작 Fab" 또는 "FabV"는 CL 및/또는 CH1이 다른 도메인 또는 펩티드 단편으로 대체된 Fab의 폴리펩티드 단편을 지칭한다. 도메인-조작된 Fab에서, VH 및 VL은 여전히 상호작용하여 항원-결합 부위를 형성하고 항원에 결합하는 능력을 유지할 수 있다. 일부 실시양태에서, 도메인-조작된 Fab는 다가 항체(예를 들어, 2가 항체 또는 3가 항체)의 일부일 수 있다. 일부 다른 실시양태에서, 도메인-조작된 Fab 단편은 단일 항원-결합 분자이다. 일부 실시양태에서, Fab의 CH1/CL은 티틴-T 쇄/옵스큐린-O 쇄 또는 티틴-T 쇄/옵스큐린-유사-O 쇄로 대체되고, 도메인-조작된 Fab의 개략적인 구조도는 도 2에 나타내었다.
"특이성 항체" 또는 "특이적으로 결합된 항체"라는 용어는 표적 항원 또는 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 지칭한다. 항체는, 항체가 결합하는 상이한 표적 항원 또는 상이한 에피토프의 수에 따라 단일특이성 항체, 이중특이성 항체, 삼중특이성 항체, 사중특이성 항체, ..., 다중특이성(2개 이상의 상이한 표적 항원 또는 동일한 항원의 상이한 에피토프에 결합하는) 항체로 분류된다. 예를 들어, "이중특이성 항체"는 2개의 상이한 항원 또는 동일한 항원의 2개의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 지칭한다. 다양한 구조의 이중특이성 항체가 선행 기술에서 개시되었으며; 이중특이성 항체는 IgG 분자의 완전성에 따라 IgG-유사 이중특이성 항체와 항체-단편형 이중특이성 항체로 분류될 수 있고; 이중특이성 항체는 항원-결합 영역의 수에 따라 2가, 3가, 4가, ..., 다중특이성(2가 또는 그 이상) 항체로 분류될 수 있으며; 이중특이성 항체는 그 구조가 대칭인지 비대칭인지에 따라 대칭형 이중특이성 항체 및 비대칭형 이중특이성 항체로 분류될 수 있다. 그 중에서, Fc 단편이 결여된 Fab 단편과 같이, 하나의 분자 내에 2개 이상의 Fab 단편을 연결시켜 형성된 항체 단편을 기반으로 하는 이중특이성 항체는 면역원성이 낮고, 분자량이 작으며, 종양 조직 투과성이 높고, 상기 유형의 전형적인 항체 구조는 F(ab)2, scFv-Fab 및 (scFv)2-Fab와 같은 이중특이성 항체를 포함하고; IgG 유사 이중특이성 항체(예를 들어, Fc 단편을 갖는 항체)는 상대적으로 큰 분자량을 가지며, Fc 단편은 이후의 항체 정제를 촉진하고 용해도 및 안정성을 증가시키며, Fc 단편은 수용체 FcRn에 추가로 결합하여 항체의 혈청 반감기를 증가시킬 수 있고, 이중특이성 항체의 전형적인 구조 모델은 KiH, CrossMAb, Triomab quadroma, FcΔAdp, ART-Ig, BiMAb, Biclonics, BEAT, DuoBody, Azymetric, XmAb, 2:1 TCB, 1Fab-IgG TDB, FynomAb, 투-인-원/DAF, scFv-Fab-IgG, DART-Fc, LP-DART, CODV-Fab-TL, HLE-BiTE, F(ab)2-CrossMAb, IgG-(scFv)2, Bs4Ab, DVD-Ig, 4가-DART-Fc, (scFv)4-Fc, CODV-Ig, mAb2 및 F(ab)4-CrossMAb(문헌[Aran F. Labrijn et al., Nature Reviews Drug Discovery, volume 18, pages 585-608(2019)]; 문헌[Chen S1 et al., J Immunol Res., Feb. 11, 2019: 4516041] 참조)와 같은 이중특이성 항체를 포함한다.
용어 "1가", "2가", "3가" 또는 "다가" 항체는 특정 수의 항원-결합 부위가 항체에 존재하는 항체를 지칭한다. 예를 들어, "1가 항체"는 항체에 1개 항원-결합 부위의 존재를 나타내고, "2가 항체"는 항체에 2개 항원-결합 부위의 존재를 나타내고, "3가 항체"는 항체에 3개의 항원-결합 부위의 존재를 나타내며, "다가 항체"는 항체에 다수(예를 들어, 2개 이상)의 항원-결합 부위의 존재를 나타낸다.
용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 본원에서 상호교환적으로 사용되며 아미노산 잔기의 중합체를 지칭한다. 상기 용어는 하나 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 천연 아미노산의 인공적인 화학적 모방물인 아미노산 중합체뿐만 아니라 천연 아미노산 중합체 및 비-천연 아미노산 중합체에도 적용된다. 달리 명시되지 않는 한, 특정 폴리펩티드 서열은 또한 그의 보존적으로 변형된 변이체를 함축적으로 포함한다.
용어 "항원-결합 도메인"은 항원에 특이적으로 결합하는 항원-결합 분자(예를 들어, 항체) 내의 영역을 의미하며, 이는 항원에 직접 결합할 수 있는 리간드-결합 도메인, 또는 항원에 직접 결합할 수 있는 항체의 가변 영역을 포함하는 도메인의 모이어티일 수 있다. 용어 "항원-결합 모이어티"는 항원-결합 도메인을 포함하는 항원-결합 분자(예를 들어, 항체)의 모이어티를 지칭한다.
용어 "융합" 또는 "연결"은 성분들(예를 들어, 2개의 폴리펩티드)이 직접 연결되거나 하나 이상의 링커를 통해 공유 결합에 의해 연결되는 것을 의미한다. 링커가 펩티드 링커인 경우, 공유 결합은 펩티드 결합이다.
"상호작용 도메인"이라는 용어는 2개 이상의 동종 또는 이종 폴리펩티드의 상호작용 또는 결합을 촉진할 수 있는 폴리펩티드의 도메인을 지칭한다. 예를 들어, 상호작용 도메인은 서로 결합하여 이량체를 형성하는 이량체화 도메인이다. 단백질간 상호작용 도메인은 2개 이상의 단백질 사이의 상호작용 또는 결합을 촉진하는 폴리펩티드의 도메인, 예를 들어, 상호작용을 통해 티틴 단백질의 티틴 Ig-유사 152 도메인과 복합체를 형성할 수 있는 옵스큐린-유사 단백질의 옵스큐린-유사 Ig-유사 1 도메인이다. 일부 실시양태에서, 티틴-T 쇄와 상호작용하는 도메인은 옵스큐린-O 쇄 또는 옵스큐린-유사-O 쇄이다.
"이량체화 폴리펩티드"라는 용어는 공유 또는 비공유 상호작용을 통해 2개의 폴리펩티드를 결합시켜 형성된 이량체 폴리펩티드(이량체화된 복합체로도 지칭됨)를 지칭한다. 동종이량체는 2개의 동일한 폴리펩티드로부터 형성된 이량체이고, 이종이량체는 2개의 상이한 폴리펩티드로부터 형성된 이량체이다. 폴리펩티드는 임의의 적합한 수단, 예를 들어. 링커, 다이설파이드 결합, 수소 결합, 정전기적 상호작용, 염다리(salt bridge), 소수성-친수성 상호작용, 또는 이들의 조합을 통해 결속되거나 연결되거나 결합될 수 있다. 예시적으로, 2개의 폴리펩티드 분자는 천연 쇄간 결합을 통해 이량체를 형성할 수 있고, 비천연 쇄간 결합을 통해서도 이량체를 형성할 수 있다. 본 개시내용의 일부 실시양태에서, 이량체화 폴리펩티드 티틴-T 쇄 및 옵스큐린-O 쇄, 또는 이량체화 폴리펩티드 티틴-T 쇄 및 옵스큐린-유사-O 쇄는 천연 쇄간 결합을 통해 이량체를 형성할 수 있다. 또한, 서로 결합하여 이량체를 형성하는 두 도메인의 경우, 6 Å 이내(특히 4.5 Å 이내) 거리에서 분리되어 있는 제1 도메인과 제2 도메인의 접촉 계면 잔기가 이들 두 도메인의 결합을 유지하는데 중요한 역할을 한다는 것은 당해 분야의 숙련자에게 잘 알려져 있다(문헌[Yan, Changhui et al., "Characterization of Protein-Protein Interfaces", The Protein Journal, vol., 27, 1 (2008): 59-70]). 본 개시내용에서, MOE(분자 작동 환경(molecular operating environment)) 시스템에 의해 티틴-T 쇄를 옵스큐린-O 쇄와 결합시키고 티틴-T 쇄를 옵스큐린-유사-O 쇄와 결합시켜 형성된 이량체화 복합체에 대한 분석을 통해(도 1a 및 도 1b 참조), 티틴-T 쇄의 위치 7 내지 15, 19 내지 24, 26, 55, 59 및 60에서의 하나 이상의 잔기 및 옵스큐린-O 쇄의 위치 3 내지 6, 9, 41, 73, 75 및 80 내지 90에서의 하나 이상의 잔기가 서로 상호작용하고, 티틴-T 쇄의 위치 1, 7 내지 10, 13 내지 16, 19 내지 26, 59 내지 60 및 96에서의 하나 이상의 잔기 및 옵스큐린-유사-O 쇄의 위치 4 내지 5, 10, 12 내지 13, 74, 76, 78 및 82 내지 91에서의 하나 이상의 잔기가 서로 상호작용하며(결합 부위는 도 16a 및 도 16b 참조), 여기서 상기 이량체화 복합체의 상기 위치의 접촉 계면 잔기는 4.5 Å 이내의 거리로 분리되어 있으며, 이는 이들 두 도메인의 결합을 유지하는데 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌다. 본 개시내용에서, 일부 실시양태에서, 티틴-T 쇄 및 옵스큐린-O 쇄, 또는 티틴-T 쇄 및 옵스큐린-유사-O 쇄는 비천연 쇄간 결합을 통해 이량체를 형성하며, 여기서 이량체는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 비천연 쇄간 결합을 포함한다. 티틴-T 쇄와 옵스큐린-O 쇄 사이 또는 티틴-T 쇄와 옵스큐린-유사-O 쇄 사이의 다이설파이드 결합은 티틴-T 쇄, 옵스큐린-O 쇄 또는 옵스큐린-유사-O 쇄의 일부 아미노산을 돌연변이시킴으로써 더욱 안정하게 됨으로써, 이들 사이에 안정화된 이량체의 형성을 촉진할 수 있다. 본 개시내용의 일부 실시양태에서, 2개의 쇄간 결합은 티틴-T 쇄의 위치 8, 20, 22, 25, 26 및 39로 이루어진 군에서 선택된 위치, 및/또는 옵스큐린-O 쇄의 위치 3, 9, 25, 66, 76, 88 및 93으로 이루어진 군에서 선택된 위치에서 하나 이상의 아미노산 잔기를 돌연변이시킴으로써 더욱 안정하게 되거나; 또는 2개의 쇄간 결합은 티틴-T 쇄의 위치 8, 20, 22, 25, 26 및 39로 이루어진 군에서 선택된 위치, 및/또는 옵스큐린-유사-O 쇄의 위치 6, 26, 74, 77, 84 및 86으로 이루어진 군에서 선택된 위치에서 하나 이상의 아미노산 잔기를 돌연변이시킴으로써 더욱 안정하게 된다.
본 개시내용에서, "불일치"는 2개 이상의 동종 또는 이종 폴리펩티드가 상호작용하거나 결합되어 바람직하지 않은 이량체 또는 다량체 쌍을 형성하는 것을 의미한다. "불일치가 발생할 가능성이 더 적다"는 것은, 예를 들어, 폴리펩티드 A1, B1 및 B2가 동시-발현될 때 A1-B1 이량체가 생성되는 것이 바람직하고, A1-B2 이량체가 생성되는 것은 바람직하지 않으며, 최종 생성된 A1-B1 이량체의 발현량이 A1-B2 이량체의 발현량보다 큰 경우, A1 및 B1이 우선적으로 쌍을 이루는, 즉, A1과 B1 사이에서 불일치가 발생할 가능성이 더 적은 것으로 간주됨을 의미한다. 본 개시내용에서, 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 이량체화 폴리펩티드 티틴-T 쇄 및 옵스큐린-O 쇄 또는 이량체화 폴리펩티드 티틴-T 쇄 및 옵스큐린-유사-O 쇄를 포함하는 이중특이성 항체에서, 불일치가 VH1과 VL2 사이 및/또는 VL1과 VH2 사이에서 발생할 가능성이 더 적고; 우선적으로 쌍을 이루는 것은 VH1과 VL1 사이, 및 VH2와 VL2 사이에서 발생한다.
"다이설파이드 결합"은 R-S-S-R' 구조에서 황 원자 사이에 형성된 공유 결합을 지칭한다. 아미노산 시스테인은 제2 티올기, 예를 들어, 또 다른 시스테인 잔기의 티올기와 다이설파이드 결합을 형성할 수 있는 티올기를 포함한다. 각각 2개의 폴리펩티드 쇄에 위치한 2개의 시스테인 잔기의 티올기 사이에 다이설파이드 결합이 형성됨으로써 쇄간 가교 또는 쇄간 결합을 형성할 수 있다.
정전기적 상호작용은 비공유 상호작용으로, 단백질 접힘, 안정성, 유연성 및 기능에 중요한 역할을 하며, 이온 상호작용, 수소 결합 및 할로겐 결합을 포함한다. 정전기적 상호작용은, 예를 들어, 첫 번째 쇄의 Lys와 Asp 사이, Lys와 Glu 사이, Glu와 Arg 사이 또는 Glu 또는 Trp 사이 및 두 번째 쇄의 Arg, Val 또는 Thr 사이의 폴리펩티드에서 생성될 수 있다.
염다리는 주로 Asp 또는 Glu의 음이온성 카복실레이트로부터 및 Lys의 양이온성 암모늄 또는 Arg의 구아니딜기로부터 발생하는 근거리의 정전기적 상호작용이며, 천연 단백질 구조에서 공간적으로 근접한 반대 전하를 띠는 한 쌍의 잔기이다. 소수성 계면의 하전되고 극성인 잔기는 결합을 위한 핫스팟(hot spot)으로 작용할 수 있다. His, Tyr 및 Ser과 같은 이온화가능한 측쇄를 갖는 잔기들도 염다리 형성에 참여할 수 있다.
친수성 상호작용은 극성 기를 가진 분자가 물에 대한 친화력이 크고 수소 결합을 통해 물과 일시적인 결합을 형성할 수 있음을 의미한다. 소수성 상호작용은 비극성 분자 사이의 비공유 상호작용이다. 이들 비극성 분자(예를 들어, 소수성 잔기로도 알려진, 일부 중성 아미노산 잔기)는 수성 환경에서 서로 응집되어 물과 멀리 떨어져 있는 경향이 있다. 예를 들어, 소수성 상호작용은 첫 번째 쇄의 Val, Tyr 및 Ala 중 하나 이상과 두 번째 쇄의 Val, Leu 및 Trp 중 하나 이상 사이, 또는 첫 번째 쇄의 His 및 Ala와 두 번째 쇄의 Thr 및 Phe 사이에 형성될 수 있다(문헌[Brinkmann et al., 2017] 참조).
"수소 결합"이라는 용어는 수소 원자가 질소, 산소 또는 불소와 같은 고도로 음전성인 원자에 공유 결합될 때 두 극성 기 사이의 정전기적 인력에 의해 형성된다. 수소 결합은 폴리펩티드의 두 잔기의 주쇄 산소(예를 들어, 칼코겐 기)와 아미드 수소(질소 기) 사이에 형성될 수 있다, 예를 들어, 수소 결합은 Asn의 질소 기와 His의 산소 기 사이에, 또는 Asn의 산소 기와 Lys의 질소 기 사이에 형성될 수 있다. 수소 결합 사이의 상호작용은 반데르발스(Van der Waals) 상호작용보다 강하지만 공유 결합 또는 이온 결합 사이의 상호 작용보다 약하며, 2차 및 3차 구조를 유지하는데 중요한다. 예를 들어, 아미노산 잔기의 간격이 위치 i와 i+4 사이에 규칙적으로 존재할 때 α-나선이 형성되고, 2개의 펩티드가 적어도 2개 또는 3개의 주쇄 수소 결합을 통해 연결될 때 길이가 3 내지 10개 아미노산인 펩티드 단편에 의해 형성된 꼬인 접힘 시트는 β-시트이다.
"비천연 쇄간 결합"은 야생형 폴리펩티드 중합체에서는 발견되지 않는 쇄간 결합을 지칭한다. 예를 들어, 하나의 폴리펩티드의 돌연변이된 아미노산 잔기와 야생형 아미노산 잔기 또는 또 다른 폴리펩티드의 돌연변이된 아미노산 잔기 사이에 비천연 쇄간 결합이 형성될 수 있다. 특정 실시양태에서, 적어도 하나의 비천연 쇄간 결합은 아미노산 돌연변이 후에 형성된 "다이설파이드 결합"이다.
"접촉 계면"이라는 용어는 폴리펩티드가 서로 접촉하거나 상호작용하는 폴리펩티드 상의 특정 영역을 지칭한다. 접촉 계면은 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하며, 상호작용이 일어날 때, 특정 폴리펩티드 상의 접촉 계면의 아미노산 잔기는 이들이 접촉하고 있는 상응하는 아미노산 잔기와 상호작용할 수 있다. 접촉 계면의 아미노산 잔기는 연속 또는 불연속 서열일 수 있다. 예를 들어, 계면이 3차원인 경우, 계면 내의 아미노산 잔기는 선형 서열의 상이한 위치에서 분리될 수 있다.
"링커"라는 용어는 2개의 폴리펩티드 단편을 연결하는 링커 단위를 지칭한다. 링커는 일반적으로 링커의 사용으로 인해 단백질 도메인의 원래 기능이 손실되지 않도록 어느 정도 유연성을 갖는다. 여기서, 동일한 구조에 존재하는 링커는 동일하거나 상이할 수 있다. 링커는 하나 이상의 아미노산, 전형적으로 약 1 내지 30개, 2 내지 24개, 또는 3 내지 15개의 아미노산을 포함하는 펩티드 링커일 수 있다. 본원에서 사용된 링커는 동일하거나 상이할 수 있다. 일부 실시양태에서, 링커는 (GxS)y 링커로부터 선택되고, 여기서 x는 1 내지 5의 정수로 이루어진 군에서 선택되고, y는 0 내지 6의 정수로 이루어진 군에서 선택되며, y가 0일 때, 링커는 결합이고, 2개의 폴리펩티드 쇄는 결합에 의해 직접 연결되고; 일부 실시양태에서, (GxS)y 링커가 제공되며, 여기서 x는 1 내지 5의 정수이고(예를 들어, x는 4), y는 1 내지 6(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6)에서 선택된 정수이고; 예를 들어, 링커는 "GGGGS"(서열번호 175) 또는 "GGGGSGGGGS"(서열번호 176) 폴리펩티드이다. 일부 다른 실시양태에서, 링커는 중쇄 불변 영역 CH1의 C-말단 절두 서열(즉, CH1의 C-말단 부분을 절두하고 CH1의 N-말단 부분을 보유함으로써 형성된 펩티드 서열)이고, 여기서, 예를 들어, CH1의 C-말단 절두 서열은 CH1의 N-말단의 위치 1 내지 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20의 아미노산 잔기로부터 형성된 폴리펩티드, 예를 들어, 위치 1 내지 5의 아미노산 잔기로부터 형성된 폴리펩티드 "ASTKG"(서열번호 173)이다)이거나; 또는 경쇄 불변 영역 CL의 C-말단 절두 서열(즉, CL의 C-말단 부분을 절두하고 CL의 N-말단 부분을 보유함으로써 형성된 펩티드 서열)이고, 여기서, 예를 들어, CL의 C-말단 절두 서열은 CL의 N-말단의 위치 1 내지 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20의 아미노산 잔기로부터 형성된 폴리펩티드, 예를 들어, 위치 1 내지 5의 아미노산 잔기로부터 형성된 "RTVAS"(서열번호 174)이다. 일부 실시양태에서, 링커 1은 "ASTKG" 폴리펩티드이고 링커 2는 "RTVAS" 폴리펩티드이거나, 링커 1 및 링커 2는 둘 다 "GGGGS" 폴리펩티드 또는 "GGGGSGGGGS" 폴리펩티드이다.
"Tm"은 용해 및 변성(내인성 형광) 온도이다. 단백질이 변성(가열 또는 변성제에 의해)되면 3차 구조가 개방되고 방향족 아미노산 미세환경이 변화되어 방출 형광 스펙트럼이 변화된다. 본 개시내용에서, Tm1은 형광값이 최대값의 절반으로 변하는 온도를 지칭한다.
"Tonset"는 변성의 시작 온도이다. 이는 단백질이 변성되기 시작하는 온도, 즉, 형광값이 변하기 시작하는 온도를 지칭한다.
"Tagg"는 응집 시작 온도이다. 샘플이 응집되기 시작하는 온도는 정적 광산란에 의해 266 nm 및 473 nm의 두 파장에서 응집체를 검출하여 모니터링한다. Tagg 266은 266 nm에서 모니터링되는 응집 시작 온도를 지칭한다.
"SEC 순도(%)" 또는 "SEC %"는 SEC 단량체 함량의 백분율을 지칭한다. SEC % = A 단량체/A 전체 × 100%(A 단량체는 샘플 중 주 피크 단량체의 피크 면적을 나타내고, A 전체는 모든 피크들의 면적의 합을 나타낸다)이다. 본 개시내용에서, 항체의 SEC%는 분자 배제 크로마토그래피(겔 기공의 기공 크기와 중합체 샘플 분자 코일의 크기 사이의 상대적인 관계에 의해 용질의 분리를 분석하는 방법)에 의해 측정할 수 있다. SEC 측정을 위한 기기는, 예를 들어, Agilent 1260; 컬럼: 워터스, XBrige BEH200A SEC(300 × 7.8 mm, 3.5 μm)이다.
"NR-CE-SDS %" 또는 "NR-CE-SDS 순도(%)"는 비환원 모세관 전기영동에 의한 순도 백분율을 지칭한다. NR-CE-SDS % = A 주 피크/A 전체 × 100% (주 피크는 경쇄 주 피크 면적 + 중쇄 주 피크 면적을 나타내고, A 전체는 모든 피크 면적의 합을 나타낸다)이다. 본 개시내용에서, 항체의 NR-CE-SDS%는 NR-CE 모세관 겔 전기영동(겔을 지지 매체로서 모세관으로 옮기고 샘플을 특정 전압 하에서 분자량에 따라 분리하는 전기영동 방법)에 의해 측정할 수 있다. NR-CE-SDS 측정을 위한 기기는, 예를 들어, Beckman 모델 플러스 800이다.
본 개시내용의 항체는 동물로부터 유래된 항체(예를 들어, 뮤린, 가금, 토끼, 낙타 및 원숭이로부터 유래된 항체), 키메라 항체, 인간화 항체 및 완전 인간 항체일 수 있다.
용어 "키메라" 항체는 항체 중 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 공급원 또는 종으로부터 유래되는 한편, 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지 부분은 또 다른 상이한 공급원 또는 종으로부터 유래된 항체를 지칭한다.
용어 "인간화" 항체는 인간에서 면역원성이 낮으면서도 비-인간 항체의 반응성을 유지하는 항체를 지칭한다. 예를 들어, 이것은 비-인간 CDR 영역을 유지하고 항체의 나머지 부분을 인간 대응물(즉, 불변 영역, 및 가변 영역의 프레임워크 영역 부분)로 대체함으로써 달성될 수 있다.
용어 "인간 항체", "인간-유래 항체", "완전 인간 항체" 및 "완전한 인간 항체"는 상호교환적으로 사용되고 가변 영역 및 불변 영역이 인간 서열인 항체를 지칭한다. 상기 용어는 인간 유전자로부터 유래되지만, 예를 들어, 가능한 면역원성을 감소시키거나, 친화도를 증가시키거나, 바람직하지 않은 접힘을 야기할 수 있는 시스테인을 제거하거나, 글리코실화 부위를 생성하도록 변경된 서열을 갖는 항체를 포함한다. 상기 용어는 인간 세포의 특징이 아닌 글리코실화를 제공할 수 있는 비-인간 세포에서 재조합적으로 생성된 항체를 포함한다. 상기 용어는 또한 인간 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 유전자좌의 일부 또는 전부를 포함하는 유전자전이 마우스에서 배양된 항체를 포함한다. 인간 항체의 의미는 구체적으로 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화 항체를 배제한다.
"친화도"라는 용어는 분자(예를 들어, 항체)의 단일 결합 부위와 그의 결합 상대(예를 들어, 항원) 사이의 비공유 상호작용의 전체 강도를 지칭한다. 달리 나타내지 않는 한, 본원에 사용된 바와 같이, 결합 "친화도"는 결합 쌍의 구성원(예를 들어, 항체와 항원) 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 내부 결합 친화도를 지칭한다. 리간드 Y에 대한 분자 X의 친화도는 일반적으로 해리 상수(KD)로 나타낼 수 있다. 친화도는 본원에 기재된 방법을 포함하여 당해 분야에 공지된 통상적인 방법으로 측정할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "kassoc" 또는 "ka"는 특정 항체-항원 상호작용의 결합 속도를 지칭하는 반면, "kdis" 또는 "kd"는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 속도를 지칭한다. "KD"라는 용어는 kd 대 ka의 비(즉, kd/ka)로부터 수득되고 몰 농도(M)로 나타내는 해리 상수를 지칭한다. 항체의 KD 값은 당해 분야에 잘 알려진 방법을 사용하여 측정할 수 있다. 예를 들어, 표면 플라즈몬 공명은 시스템과 같은 바이오센싱 시스템을 사용하여 측정하거나, 용액 내 친화도는 용액 평형 적정(SET)에 의해 측정한다.
"효과기 기능"이라는 용어는 항체의 Fc 영역(천연 서열 Fc 영역 또는 아미노산 서열 변이체 Fc 영역)에 기인할 수 있고 항체 이소타입에 따라 달라질 수 있는 생물학적 활성을 지칭한다. 항체의 효과기 기능의 예로는 C1q 결합 및 보체-의존성 세포독성, Fc 수용체 결합, 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC), 식균작용, 세포 표면 수용체(예를 들어, B 세포 수용체)의 하향-조절 및 B 세포 활성화가 포함되지만, 이로 제한되지는 않는다.
"단일클론 항체"라는 용어는 실질적으로 동종 항체 집단을 지칭한다, 즉 집단에 포함된 항체 분자의 아미노산 서열은 존재할 수 있는 소수의 천연 돌연변이를 제외하고는 동일한다. 대조적으로, 다중클론 항체 제제는 일반적으로 상이한 에피토프에 특이적인 가변 도메인에 상이한 아미노산 서열을 갖는 다수의 상이한 항체를 포함한다. "단일클론성"은 실질적으로 동종 항체 집단에서 수득된 항체의 특성을 지칭하며, 임의의 특정 방법에 의한 항체 생산을 요구하는 것으로 해석되어서는 안된다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용에 의해 제공되는 항체는 단일클론 항체이다.
용어 "항원"은 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체 포함)과 같은, 선택적 결합제에 의해 결합될 수 있고 그렇지 않으면 항원에 결합할 수 있는 항체를 생산하기 위해 동물에서 사용될 수 있는 분자 또는 분자의 일부를 지칭한다. 항원은 상이한 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체)과 상호작용할 수 있는 하나 이상의 에피토프를 가질 수 있다.
"에피토프"라는 용어는 항체 또는 그의 항원-결합 단편에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 상의 부분 또는 영역을 지칭한다. 에피토프는 연속적인 아미노산 스트링(선형 에피토프)으로부터 형성될 수 있거나, 또는 예를 들어 항원의 접힘(즉, 단백질성 항원의 3차 접힘에 의해)으로 인해 공간적으로 근접하게 되는 비연속 아미노산(형태적 에피토프)을 포함할 수 있다. 형태적 에피토프와 선형 에피토프 사이의 차이는 변성 용매의 존재하에서 형태적 에피토프에 대한 항체의 결합이 손실된다는 것이다. 에피토프는 독특한 공간 형태로 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 또는 8 내지 10개의 아미노산을 포함한다. 특정 에피토프에 결합하는 항체(즉, 동일한 에피토프에 결합하는 항체)에 대한 스크리닝은, 예를 들어, 알라닌 스캐닝, 펩티드 블롯팅, 펩티드 절단 분석, 에피토프 절제, 에피토프 추출, 항원의 화학적 변형(문헌[Prot. Sci. 9 (2000) 487-496]) 및 교차-차단을 포함하지만 이로 제한되지 않는 당해 분야의 통상적인 방법을 사용하여 수행될 수 있다.
"특이적으로 결합할 수 있는", "특이적으로 결합하는" 또는 "결합하는"이란 용어는 항체가 특정 항원 또는 항원 내의 에피토프에 다른 항원 또는 에피토프보다 더 높은 친화도로 결합할 수 있음을 의미한다. 일반적으로, 항체는 약 1×10-7 이하(예를 들어, 약 1×10-8 M 이하)의 평형 해리 상수(KD)로 항원 또는 항원 내 에피토프에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항원에 대한 항체의 결합에 대한 KD는 비특이적 항원(예를 들어, BSA 또는 카제인)에 대한 항체의 결합에 대한 KD의 10% 이하(예를 들어, 1%)이다. KD는 공지된 방법을 사용하여, 예를 들어, BIACORE® 표면 플라즈몬 공명 분석에 의해 측정할 수 있다. 그러나, 항원 또는 항원 내 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체는 다른 관련 항원에 대해, 예를 들어, 인간 또는 원숭이, 예를 들어, 마카카 파시쿨라리스(Macaca fascicularis)(사이노몰구스, cyno), 판 트로글로다이테스(Pan troglodytes)(침팬지, chimp) 또는 비단마모셋(Callithrix jacchus)(코먼마모셋(commonmarmoset), 마모셋)과 같은 다른 종(상동성)의 상응하는 항원에 대해 교차-반응성을 가질 수 있다.
"항체-의존성 세포 독성", "항체-의존성 세포-매개 세포독성" 또는 "ADCC"라는 용어는 세포 사멸을 유도하는 메커니즘으로, 이는 효과기 세포상에서 발현된 Fcγ 수용체(FcγR)를 통해 항체-코팅된 표적 세포와 용해 활성을 갖는 효과기 세포, 예를 들면, 자연살해세포(NK), 단핵구, 대식세포 및 호중구와의 상호 작용에 따라 달라진다. 예를 들어, NK 세포는 FcγRIIIa를 발현하는 반면, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIIIa를 발현한다. 본원에서 제공되는 항체의 ADCC 활성은 항원을 발현하는 세포를 표적 세포로 사용하고 NK 세포를 효과기 세포로 사용하여 시험관내 분석으로 평가할 수 있다. 세포 용해는 용해된 세포로부터 표지(예를 들어, 방사성 기질, 형광 염료 또는 천연 세포내 단백질)의 방출을 기준으로 검출한다.
"항체-의존성 세포 식균작용"("ADCP")이란 용어는 항체-코팅된 표적 세포가 대식세포 또는 수지상 세포와 같은 식세포의 내재화에 의해 제거되는 메커니즘을 지칭한다.
"보체-의존성 세포독성" 또는 "CDC"라는 용어는 표적-결합 항체의 Fc 효과기 도메인이 보체 성분 C1q에 결합하여 이를 활성화시키고, 이어서 C1q가 보체 연쇄반응(cascade)을 활성화시켜 표적 세포의 사멸을 야기하는, 세포 사멸 유도 메카니즘을 지칭한다. 보체의 활성화는 또한 백혈구의 보체 수용체(예를 들어, CR3)에 결합함으로써 CDC를 촉진하는 표적 세포의 표면에 보체 성분의 침착을 야기할 수 있다.
용어 "핵산"은 본원에서 용어 "폴리뉴클레오티드"와 상호교환적으로 사용되며 단일-가닥 또는 이중-가닥 형태의 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 및 그의 중합체를 지칭한다. 상기 용어는 합성, 천연 및 비천연이고, 참조 핵산과 유사한 결합 성질을 가지고, 참조 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 대사되는 공지된 뉴클레오티드 유사체 또는 변형된 주쇄 잔기 또는 결합을 포함하는 핵산을 포함한다. 이러한 유사체의 예로는 포스포로티오에이트, 포스포르아미데이트, 메틸포스포네이트, 키랄-메틸포스포네이트, 2-O-메틸 리보뉴클레오티드 및 펩티드-핵산(PNA)이 포함되지만 이로 제한되지는 않는다. "단리된" 핵산은 그의 자연 환경의 구성요소로부터 분리된 핵산 분자를 지칭한다. 단리된 핵산은, 일반적으로 핵산 분자를 포함하는 세포에 포함된 핵산 분자를 포함하지만, 핵산 분자는 염색체외로 또는 그의 천연 염색체 위치와 상이한 염색체 위치에 존재한다. 폴리펩티드 또는 융합 단백질을 암호화하는 단리된 핵산은 단일 벡터 또는 별도의 벡터 내의 하나 이상의 상기와 같은 핵산 분자 및 숙주 세포의 하나 이상의 위치에 존재하는 하나 이상의 상기와 같은 핵산 분자를 포함하여, 폴리펩티드 또는 융합 단백질을 암호화하는 하나 이상의 핵산 분자를 지칭한다. 달리 명시되지 않는 한, 특정 핵산 서열은 또한 그의 보존적으로 변형된 변이체(예를 들어, 축퇴 코돈 치환) 및 상보적 서열뿐만 아니라 명시적으로 표시된 서열을 함축적으로 포함한다. 구체적으로, 하기에서 상술하는 바와 같이, 축퇴 코돈 치환은 하나 이상의 선택된(또는 모든) 코돈의 세 번째 위치가 혼합된 염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 생성함으로써 이루어질 수 있다.
서열 "동일성"이라는 용어는, 최대 % 서열 동일성을 달성하기 위해 필요한 만큼 갭이 도입되고 서열 동일성의 일부로서 보존적 치환을 고려하지 않으면서. 두 서열이 최적으로 정렬될 때 두 서열의 아미노산/핵산이 등가의 위치에서 동일한 정도(백분율)를 나타낸다. % 서열 동일성을 측정하기 위해, 당해 분야의 숙련자에게 공지된 기술, 예를 들어, BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 또는 Megalign(DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 정렬을 수행할 수 있다. 당해 분야의 숙련자는 정렬된 서열의 전체 길이의 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여 정렬 측정에 적합한 매개변수를 결정할 수 있다.
본 개시내용에서, 예를 들어, "XX 서열에 대한 위치"란 XX 서열에 상응하는 시험 서열의 위치, 즉 시험 서열이 최고의 % 동일성을 얻기 위해 XX 서열과 최적으로 정렬될 때 두 서열의 상대적인 위치를 지칭한다. 예를 들어, 티틴-T 쇄에서, 서열번호 32 서열의 천연 서열번호 위치 1에 대해 서열번호 127의 천연 서열번호 위치는 위치 6이고; 또 다른 예를 들면, 옵스큐린-O 쇄에서, 서열번호 33 서열의 천연 서열번호 위치 3에 대해 서열번호 128의 천연 서열번호 위치는 위치 8이다.
용어 "벡터"는 그에 연결된 또 다른 폴리뉴클레오티드를 수송할 수 있는 폴리뉴클레오티드 분자를 의미한다. 벡터의 한 유형은 "플라스미드"로, 이는 추가 DNA 분절이 접합될 수 있는 원형 이중-가닥 DNA 루프를 지칭한다. 또 다른 유형의 벡터는 아데노-관련 바이러스 벡터(AAV 또는 AAV2)와 같은 바이러스 벡터이며, 여기서는 추가 DNA 분절이 바이러스 게놈에 접합될 수 있다. 특정 벡터는 그것이 도입되는 숙주 세포에서 자율 복제가 가능하다(예를 들어, 세균 복제 기점을 갖는 세균 벡터 및 에피솜 포유동물 벡터). 다른 벡터(예를 들어, 비-에피솜 포유동물 벡터)는 숙주 세포 내로 도입시 숙주 세포의 게놈 내에 통합될 수 있으며, 이로써 숙주 게놈과 함께 복제된다. 용어 "발현 벡터" 또는 "발현 구조물"은 숙주 세포로 형질전환될 수 있고 그에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 이종 암호화 영역의 발현을 (숙주 세포와 함께) 지시 및/또는 조절하는 핵산 서열을 포함하는 벡터를 지칭한다. 발현 구조물은 전사 및 번역에 영향을 미치거나 이를 조절하고 인트론의 존재 하에서 그에 작동 가능하게 연결된 암호화 영역의 RNA 스플라이싱에 영향을 미치는 서열을 포함할 수 있지만 이로 제한되지는 않는다.
"숙주 세포", "숙주 세포주" 및 "숙주 세포 배양물"이란 용어는 상호교환적으로 사용되며, 외인성 핵산이 도입된 세포(이러한 세포의 자손 포함)를 지칭한다. 숙주 세포에는 계대수에 관계없이 1차 형질전환된 세포 및 그로부터 유래된 자손을 포함하는 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"가 포함된다. 자손은 핵산 함량 면에서 모세포와 정확히 동일하지 않을 수 있으며 돌연변이를 함유할 수 있다. 초기 형질전환된 세포로 이루어진 군에서 스크리닝되거나 선택된 세포와 동일한 기능 또는 생물 활성을 갖는 돌연변이 자손이 여기에 포함된다. 숙주 세포에는 원핵 및 진핵 숙주 세포가 포함되며, 여기서 진핵 숙주 세포에는 포유동물 세포, 곤충 세포주, 식물 세포 및 진균 세포가 포함되나 이로 제한되지는 않는다. 포유동물 숙주 세포로는 인간, 마우스, 래트, 개, 원숭이, 돼지, 염소, 소, 말 및 햄스터 세포가 포함되며, 여기에는 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, NSO, SP2 세포, HeLa 세포, 베이비 햄스터 신장(BHK) 세포, 원숭이 신장 세포(COS), 인간 간세포 암종 세포(예를 들어, Hep G2), A549 세포, 3T3 세포 및 HEK-293 세포가 포함되지만 이로 제한되지는 않는다. 진균 세포에는, 예를 들어, 피키아파스토리스(Pichiapastoris), 피키아 핀란디카(Pichia finlandica), 피키아 트레할로필라(Pichia trehalophila), 피키아 코클라마에(Pichia koclamae), 피키아 멤브라나에파시엔스(Pichia membranaefaciens), 피키아 미누타(Pichia minuta)(오가테아 미누타(Ogataea minuta), 피키아 린드네리(Pichia lindneri), 피키아오푼티에(Pichiaopuntiae), 피키아 써모톨레란스(Pichia thermotolerans), 피키아 살리크타리아(Pichia salictaria), 피키아 구에르쿰(Pichia guercuum), 피키아 피즈페리(Pichia pijperi), 피키아 스티프티스(Pichia stiptis), 피키아 메탄올리카(Pichia methanolica), 피키아(Pichia), 사카로마이세스세레비지에 (Saccharomycescerevisiae), 사카로마이세스(Saccharomyces), 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 아스퍼질루스 니둘란스(Aspergillus nidulans), 아스퍼질루스 니거(Aspergillus niger), 아스퍼질루스 오리제(Aspergillus oryzae), 트리코더마 리세이(Trichoderma reesei), 크리소스포리움 룩노웬스(Chrysosporium lucknowense), 푸사리움 종(Fusarium sp.), 프사리움 그라미늄(Fusarium gramineum), 푸사리움 베네나툼(Fusarium venenatum), 피스코미트렐라 파텐스(Physcomitrella patens), 및 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa), 피키아, 임의의 사카로마이에스, 한세눌라 폴리모르파, 임의의 클루이베로마이세스, 칸디다 알비칸스, 임의의 아스퍼질루스, 트리코더마 리세이, 크리소스포리움 룩노웬스, 임의의 푸사리움, 야로위아 리포라이티카(Yarrowia lipolytica) 및 뉴로스포라 크라사를 포함하여, 효모 및 사상 진균 세포가 포함된다.
본원에 사용된 바와 같이, "세포", "세포주" 및 "세포 배양물"이란 표현은 상호교환적으로 사용되며, 이러한 모든 명칭에는 이들의 자손이 포함된다. 따라서, "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"라는 단어는 계대수에 관계없이 1차 대상 세포 및 그로부터 유래된 배양물을 포함한다. 또한 의도적이거나 우연한 돌연변이로 인해 모든 자손이 정확히 동일한 DNA 함량을 갖지는 않는 것으로 이해된다. 그로부터 선택된 원래의 형질전환 세포와 동일한 기능 또는 생물 활성을 갖는 변이체 자손이 포함된다.
"선택적" 또는 "선택적으로"는 그 뒤에 설명되는 사건 또는 상황이 발생할 수는 있지만 반드시 그런 것은 아니며 그 설명이 그 사건 또는 상황이 발생하거나 발생하지 않는 경우를 포함하는 것을 의미한다.
용어 "약학 조성물"은 본원에 기재된 항원-결합 분자 중 하나 이상 및 다른 화학 성분, 예를 들어, 생리적/약학적으로 허용되는 담체 및 부형제를 포함하는 혼합물을 지칭한다.
"약학적으로 허용되는 담체"라는 용어는 활성 성분과 상이하고 대상에게 독성이 없는 약학 제형중의 성분을 지칭한다. 약학적으로 허용되는 담체에는 완충제, 부형제, 안정화제 또는 보존제가 포함되지만 이로 제한되지는 않는다.
"대상" 또는 "개체"라는 용어에는 인간 및 비-인간 동물이 둘 다 포함된다. 비-인간 동물에는 비-인간 영장류(예를 들어, 사이노몰구스 원숭이), 양, 개, 소, 닭, 양서류 및 파충류와 같은 모든 척추동물(예를 들어, 포유동물 및 비-포유동물)이 포함된다. 명시되지 않는 한, "환자" 및 "대상"이란 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "사이노몰구스 원숭이(cyno)" 또는 "사이노몰구스"는 마카카 파시쿨라리스(Macaca Fascularis)를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 개체 또는 대상은 인간이다.
"투여하는" 또는 "제공하는"은, 동물, 인간, 실험 대상, 세포, 조직, 기관 또는 생물학적 유체에 적용될 때, 외인성 약물, 치료제, 진단제 또는 조성물과 동물, 인간, 대상, 세포, 조직, 기관 또는 생물학적 유체와의 접촉을 지칭한다.
용어 "샘플"은 대상으로부터 단리된 유사한 유체, 세포 또는 조직뿐만 아니라 대상 내에 존재하는 유체, 세포 또는 조직의 수집물을 지칭한다. 예시적인 샘플은 생물학적 유체(예를 들면, 혈액; 혈청; 장액; 혈장; 림프; 소변; 타액; 낭포성 체액; 눈물; 배설물; 가래; 분비 조직 및 기관의 점막 분비물; 질 분비물; 복수; 흉막 내 체액; 심낭; 복막; 복강 및 기타 체강; 기관지 세척액에서 채취한 체액; 윤활액; 대상 또는 생물학적 공급원과 접촉하는 액체 용액, 예를 들어, 세포 및 기관 배양 배지(세포 또는 기관 조정 배지 포함); 세척액, 등), 조직 생검 샘플, 미세침 천자, 외과적으로 절제된 조직, 기관 배양물 또는 세포 배양물이다.
"치료" 또는 "치료하다"(및 그의 문법적 변형)는 예방을 위해 또는 임상 병리학 과정 중에 수행될 수 있는, 치료받는 개체의 자연 경과를 변경하려는 시도의 임상 개입을 지칭한다. 치료의 바람직한 효과에는 질환의 발생 또는 재발 예방, 증상 완화, 질환의 간접적인 병리학적 결과의 완화/감소, 전이 예방, 질환 진행 속도의 감소, 질환 상태의 개선 또는 완화, 및 예후의 퇴행 또는 개선이 포함되지만 이로 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 질환의 발병을 지연시키거나 질환의 진행을 늦추는데 사용된다.
"효과량"은 일반적으로 증상의 중증도 및/또는 빈도를 감소시키고, 증상 및/또는 근본 원인을 제거하고, 증상 및/또는 근본 원인의 출현을 예방하고/하거나, 질환 상태로 인해 발생하거나 이와 관련된 손상(예를 들어, 폐 질환)을 완화 또는 개선하는데 충분한 양이다. 일부 실시양태에서, 효과량은 치료 효과량 또는 예방 효과량이다. "치료 효과량"은 질환 상태 또는 병태, 특히 질환 상태와 관련된 상태 또는 병태를 치료하거나, 그렇지 않으면 질환 상태 또는 어떤 식으로든 질환과 관련된 임의의 다른 바람직하지 않은 증상의 진행을 예방, 저지, 지연 또는 역전시키기에 충분한 양이다. "예방 효과량"은 대상에게 투여되었을 때 미리 결정된 예방 효과, 예를 들어, 질환 상태의 발병(또는 재발)을 예방 또는 지연시키거나, 질환 상태 또는 관련된 증상의 발병(또는 재발) 가능성을 감소시키는 양이다. 완전한 치료 또는 예방 효과는 1회 용량을 투여한 후에 반드시 나타나는 것은 아니며 일련의 용량을 투여한 후에 나타날 수도 있다. 따라서, 치료 또는 예방 효과량은 하나 이상의 용량으로 투여될 수 있다. "치료 효과량" 및 "예방 효과량"은 개체의 질환 상태, 연령, 성별 및 체중, 및 개체에서 목적하는 반응을 유도하는 치료제 또는 치료제 조합의 능력과 같은 다양한 요인에 따라 달라질 수 있다. 효과적인 치료제 또는 치료제 조합의 예시적인 지표는, 예를 들어, 환자의 개선된 건강 상태를 포함한다.
본 개시내용의 이량체화 폴리펩티드 및 이를 포함하는 항원-결합 분자
하나의 양태에서, 본 개시내용에서는 상이한 이량체화 폴리펩티드가 설계된다. 이량체화 폴리펩티드는 각각 티틴-T 쇄 및 옵스큐린-O 쇄 또는 옵스큐린-유사-O 쇄를 포함하며, 항원에 대한 항체의 결합에 영향을 미치지 않으면서 다중특이성 항체(예를 들어, 이중특이성 항체)의 중쇄/경쇄 간의 불일치를 완화하기 위해 항체의 CH1/CL을 대체하는데 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 티틴-T 쇄 및 옵스큐린-O 쇄 또는 옵스큐린-유사-O 쇄를 포함하는 이량체화 폴리펩티드를 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 이량체화 폴리펩티드를 제공하며, 여기서 전술한 티틴-T 쇄는 위치 8, 20, 22, 25, 26 및 39로 이루어진 군에서 선택된 위치에 하나 이상의 아미노산 잔기 대체를 가지고/가지거나, 옵스큐린-O 쇄는 위치 3, 9, 25, 76 및 88로 이루어진 군에서 선택된 위치에 하나 이상의 아미노산 잔기 돌연변이를 가지거나; 또는 티틴-T 쇄는 위치 8, 20, 22, 25, 26 및 39로 이루어진 군에서 선택된 위치에 하나 이상의 아미노산 잔기 돌연변이를 가지고/가지거나, 옵스큐린-유사-O 쇄는 위치 6, 26, 74, 77, 84 및 86으로 이루어진 군에서 선택된 위치에 하나 이상의 아미노산 잔기 돌연변이를 가지고; 티틴-T 쇄에서의 돌연변이 위치는 서열번호 32 서열에 대한 천연 서열번호 위치이고; 옵스큐린-O 쇄에서의 돌연변이 위치는 서열번호 33 서열에 대한 천연 서열번호 위치이고; 옵스큐린-유사-O 쇄에서의 돌연변이 위치는 서열번호 34 서열에 대한 천연 서열번호 위치이다.
일부 특정 실시양태에서, 전술한 티틴-T 쇄는 8C, 20C, 22C, 25S, 26C 및 39T로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기 치환을 가지고/가지거나, 옵스큐린-O 쇄는 3C, 9C, 25S, 76S 및 88C로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기 치환을 가지거나; 또는 티틴-T 쇄는 8C, 20C, 22C, 25S, 26C 및 39T로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기 치환을 가지고/가지거나, 옵스큐린-유사-O 쇄는 6E, 26S, 74C, 77S, 84C 및 86C로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기 돌연변이를 갖는다. 일부 실시양태에서, 티틴-T 쇄 및 옵스큐린-O 쇄, 또는 티틴-T 쇄 및 옵스큐린-유사-O 쇄는 다음의 아미노산 잔기 치환을 갖는다: 티틴-T 쇄에 대해 25S, 39T 및 8C의 치환, 및 옵스큐린-O 쇄에 대해 88C의 치환; 티틴-T 쇄에 대해 25S, 39T 및 20C의 치환, 및 옵스큐린-O 쇄에 대해 3C의 치환; 티틴-T 쇄에 대해 25S, 39T 및 26C의 치환, 및 옵스큐린-O 쇄에 대해 9C의 치환; 티틴-T 쇄에 대해 25S, 39T 및 8C의 치환, 및 옵스큐린-O 쇄에 대해 25S, 76S 및 88C의 치환; 티틴-T 쇄에 대해 25S, 39T 및 20C의 치환, 및 옵스큐린-O 쇄에 대해 25S, 76S 및 3C의 치환; 티틴-T 쇄에 대해 25S, 39T 및 26C의 치환, 및 옵스큐린-O 쇄에 대해 25S, 76S 및 9C의 치환; 티틴-T 쇄에 대해 25S, 39T 및 8C의 치환, 및 옵스큐린-유사-O 쇄에 대해 6E 및 74C의 치환; 티틴-T 쇄에 대해 25S, 39T 및 20C의 치환, 및 옵스큐린-유사-O 쇄에 대해 6E 및 84C의 치환; 티틴-T 쇄에 대해 25S, 39T 및 22C의 치환, 및 옵스큐린-유사-O 쇄에 대해 6E 및 86C의 치환; 티틴-T 쇄에 대해 25S, 39T 및 8C의 치환, 및 옵스큐린-유사-O 쇄에 대해 6E, 26S, 77S 및 74C의 치환; 티틴-T 쇄에 대해 25S, 39T 및 20C의 치환, 및 옵스큐린-유사-O 쇄에 대해 6E, 26S, 77S 및 84C의 치환; 또는 티틴-T 쇄에 대해 25S, 39T 및 22C의 치환, 및 옵스큐린-유사-O 쇄에 대해 6E, 26S, 77S 및 86C의 치환. 일부 실시양태에서, 티틴-T는 서열번호 32 또는 127에 기초하여 전술한 위치 치환을 가지고; 옵스큐린-O 쇄는 서열번호 33 또는 128에 기초하여 전술한 위치 치환을 가지며; 옵스큐린-유사-O 쇄는 서열번호 34에 기초하여 전술한 위치 치환을 갖는다.
일부 실시양태에서, 전술한 옵스큐린-O 쇄가 위치 7, 11 및 62로 이루어진 군에서 선택된 위치에 하나 이상의 아미노산 잔기 돌연변이를 갖는, 전술한 이량체화 폴리펩티드가 제공된다. 일부 실시양태에서, 옵스큐린은-O 쇄는 7R 또는 7K, 62K 또는 62H, 및 11L로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기 치환을 가지고; 일부 실시양태에서, 티틴-T 쇄는 25S, 39T 및 8C의 치환을 가지고, 옵스큐린-O 쇄는 25S, 76S, 88C, 7K 및 62K의 치환을 가지거나; 티틴-T 쇄는 25S, 39T 및 8C의 치환을 가지고, 옵스큐린-O 쇄는 25S, 76S, 88C, 7K 및 62H의 치환을 가지거나; 티틴-T 쇄는 25S, 39T 및 8C의 치환을 가지고, 옵스큐린-O 쇄는 25S, 76S, 88C, 11L 및 62K의 치환을 가지거나; 또는 티틴-T 쇄는 25S, 39T 및 8C의 치환을 가지고, 옵스큐린-O 쇄는 25S, 76S, 88C, 11L 및 62H의 치환을 갖는다. 일부 실시양태에서, 옵스큐린-O 쇄는 서열번호 33 또는 45에 기초하여 전술한 위치 치환을 갖는다. 티틴-T 쇄에서의 치환 위치는 서열번호 32 서열에 대한 천연 서열번호 위치이고; 옵스큐린-O 쇄에서의 치환 위치는 서열번호 33 서열에 대한 천연 서열번호 위치이다.
일부 실시양태에서, 전술한 티틴-T 쇄가 위치 3, 11, 13, 22, 40, 42, 45, 47, 49, 56, 58, 66, 70, 75, 77, 79, 81, 82, 83 및 84로 이루어진 군에서 선택된 위치에 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 가지고/가지거나, 옵스큐린-O 쇄가 위치 2, 11, 12, 13, 14, 17, 20, 22, 30, 32, 34, 36, 41, 42, 44, 45, 53, 58, 62, 67, 69, 89, 92, 94 및 97로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 갖는, 전술한 이량체화 폴리펩티드가 제공된다. 티틴-T 쇄에서의 돌연변이 위치는 서열번호 35 서열에 대한 천연 서열번호 위치이며; 옵스큐린-O 쇄에서의 돌연변이 위치는 서열번호 50 서열에 대한 천연 서열번호 위치이다. 일부 실시양태에서, 티틴-T 쇄는 3W, 11I, 13L, 22M, 40S, 42K, 45S, 47E, 49G, 56S, 58E, 66S 또는 66K, 70R, 75V, 77S, 79T, 81R, 82M, 83D 및 84L로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 치환을 가지고/가지거나, 옵스큐린-O 쇄는 2E, 11K, 12S, 13Y, 14T, 17E, 20L, 22M 또는 22S, 30D, 32P, 34E, 36T, 41K, 42L, 44I, 45T, 53L, 58V, 62E, 67Q 또는 67T, 69S, 89L, 92E, 94G 및 97G로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는다. 일부 실시양태에서, 티틴-T 쇄는 66S 및 77S의 아미노산 치환을 가지고/가지거나, 옵스큐린-O 쇄는 11K, 12S, 13Y, 14T 및 22S의 아미노산 치환을 가지거나; 티틴-T 쇄는 66K, 70R, 79T 및 81R의 아미노산 치환을 가지고/가지거나, 옵스큐린-O 쇄는 2E, 17E, 30D, 32P, 34E, 36T, 44I, 45T, 58V. 62E, 67Q, 69S 및 97G의 아미노산 치환을 가지거나; 티틴-T 쇄는 3W, 11I, 13L, 22M 및 82M의 아미노산 치환을 가지고/가지거나, 옵스큐린-O 쇄는 20L, 22M 및 53L의 아미노산 치환을 가지거나; 티틴-T 쇄는 11I, 66K, 79T 및 81R의 아미노산 치환을 가지고/가지거나, 옵스큐린-O 쇄는 41K, 45T, 67Q, 69S 및 89L의 아미노산 치환을 가지거나; 티틴-T 쇄는 40S, 42K, 45S, 47E, 49G, 56S, 58E, 75V, 83D 및 84L의 아미노산 치환을 가지고/가지거나 옵스큐린-O 쇄는 42L, 45T, 67T, 69S, 92E 및 94G의 아미노산 치환을 가지거나; 티틴-T 쇄는 47E, 49G, 56S, 58E 및 75V의 아미노산 치환을 가지고/가지거나, 옵스큐린-O 쇄는 42L, 45T, 67T, 69S, 92E 및 94G의 아미노산 치환을 가지거나; 티틴-T 쇄는 56S, 58E 및 75V의 아미노산 치환을 가지고/가지거나, 옵스큐린-O 쇄는 42L, 45T, 67T, 69S, 92E 및 94G의 아미노산 치환을 가지거나; 또는 티틴-T 쇄는 56S, 58E, 66S, 및 77S의 아미노산 치환을 가지고/가지거나, 옵스큐린-O 쇄는 12S, 13Y, 22S, 42L, 45T, 67Q, 69S, 92E 및 94G의 아미노산 치환을 가지고; 티틴-T 쇄에서의 치환 위치는 서열번호 35 서열에 대한 천연 서열번호 위치이고; 옵스큐린-O 쇄에서의 치환 위치는 서열번호 50 서열에 대한 천연 서열번호 위치이다. 일부 실시양태에서, 티틴-T 쇄는 서열번호 35에 기초하여 아미노산 치환을 가지고, 옵스큐린-O 쇄는 서열번호 50에 기초하여 아미노산 치환을 갖는다.
일부 실시양태에서, 티틴-T 쇄가 위치 60 및 64로 이루어진 군에서 선택된 위치에 하나 이상의 아미노산 잔기 돌연변이를 추가로 포함하고/하거나, 옵스큐린-O 쇄가 위치 13, 32, 48, 66, 82 및 93으로 이루어진 군에서 선택된 위치에 하나 이상의 아미노산 잔기 돌연변이를 가지고; 티틴-T 쇄의 아미노산 잔기 위치가 서열번호 32 서열에 대한 천연 서열번호 위치이고; 옵스큐린-O 쇄의 아미노산 잔기 위치가 서열번호 33에 대한 천연 서열번호 위치인, 전술한 이량체화 폴리펩티드가 제공된다. 일부 실시양태에서, 티틴-T 쇄가 60S 및 64T로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상(예를 들어, 1 또는 2개)의 아미노산 잔기 치환을 가지고/가지거나, 옵스큐린-O 쇄가 13S, 32F, 48V, 66C, 82H 및 93C로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6개 이상)의 아미노산 잔기 치환을 가지고; 티틴-T 쇄의 아미노산 잔기 위치가 서열번호 32 서열에 대한 천연 서열번호 위치이고; 옵스큐린-O 쇄의 아미노산 잔기 위치가 서열번호 33의 서열에 대한 천연 서열번호 위치전술한 이량체화 폴리펩티드가 제공된다. 일부 실시양태에서, 티틴-T 쇄가 위치 60S 및 64T에 아미노산 잔기 치환을 가지고/가지거나, 옵스큐린-O 쇄가 a) 내지 c): a) 위치 13S 및 48V에서의 아미노산 잔기 치환, b) 위치 13S, 32F, 48V 및 82H에서의 아미노산 잔기 치환, 및 c) 위치 13S, 32F, 48V, 66C, 82H 및 93C에서의 아미노산 잔기 치환 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 잔기 치환을 가지고; 티틴-T 쇄의 아미노산 잔기 위치가 서열번호 32 서열에 대한 천연 서열번호 위치이고; 옵스큐린-O 쇄의 아미노산 잔기 위치가 서열번호 33에 대한 천연 서열번호 위치 전술한 이량체화 폴리펩티드가 제공된다. 일부 실시양태에서, 전술한 티틴-T 쇄가 서열번호 32, 68 또는 127에서 60S 및 64T로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기 치환을 가지고, 옵스큐린-O 쇄가 서열번호 33, 80 또는 128에서 13S, 32F, 48V, 66C, 82H 및 93C로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기 치환을 갖는, 전술한 이량체화 폴리펩티드가 제공된다. 티틴-T 쇄의 아미노산 잔기 위치는 서열번호 32 서열에 대한 천연 서열번호 위치이고; 옵스큐린-O 쇄의 아미노산 잔기 위치는 서열번호 33 서열에 대한 천연 서열번호 위치이다.
일부 실시양태에서, 전술한 이량체화 폴리펩티드가 제공되며, 여기서 티틴-T 쇄의 위치 7 내지 15, 19 내지 24, 26, 55, 59 및 60으로 이루어진 군에서 선택된 위치의 하나 이상의 잔기는 옵스큐린-O 쇄의 위치 3 내지 6, 9, 41, 73, 75 및 80 내지 90으로 이루어진 군에서 선택된 위치의 하나 이상의 잔기에 결합하여 이량체화 복합체를 형성하거나, 또는 티틴-T 쇄의 위치 1, 7 내지 10, 13 내지 16, 19 내지 26, 59 내지 60 및 96으로 이루어진 군에서 선택된 위치의 하나 이상의 잔기는 옵스큐린-유사-O 쇄의 위치 4 내지 5, 10, 12 내지 13, 74, 76, 78 및 82 내지 91로 이루어진 군에서 선택된 위치의 하나 이상의 잔기에 결합하여 이량체화 복합체를 형성하고; 티틴-T 쇄의 잔기 위치는 서열번호 32 서열에 대한 천연 서열번호 위치이고; 옵스큐린-O 쇄의 잔기 위치는 서열번호 33 서열에 대한 천연 서열번호 위치이며; 옵스큐린-유사-O 쇄의 잔기 위치는 서열번호 34 서열에 대한 천연 서열번호 위치이다. 일부 실시양태에서, 티틴-T 쇄는 서열번호 32의 위치 7 내지 60에 아미노산 또는 그의 돌연변이체를 포함하고, 옵스큐린-O 쇄는 서열번호 33의 위치 3 내지 90에 아미노산 또는 그의 돌연변이체를 포함하거나; 또는 티틴-T 쇄는 서열번호 32의 위치 1 내지 96에 아미노산 또는 그의 돌연변이체를 포함하고, 옵스큐린-유사-O 쇄는 서열번호 34의 위치 4 내지 91에 아미노산 또는 그의 돌연변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 티틴-T 쇄 및 옵스큐린-O 쇄, 또는 티틴-T 쇄 및 옵스큐린-유사-O 쇄를 포함하는 이량체화 폴리펩티드가 제공되며, 여기서: i) 티틴-T 쇄는 서열번호 32의 변이체이고, 상기 변이체는 서열번호 32와 비교하여 위치 60 및 64로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 위치에 아미노산 잔기 치환을 가지고/가지거나, ii) 옵스큐린-O 쇄는 서열번호 33의 변이체이고, 상기 변이체는 서열번호 33과 비교하여 위치 13, 32, 48, 66, 82 및 93으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 위치에 아미노산 잔기 치환을 가지며; a) 변이체가 위치 13, 48, 66, 82 또는 93에 아미노산 잔기 치환을 갖지 않고 위치 32에 아미노산 잔기 치환을 갖는 경우, 위치 32의 아미노산 치환은 32P가 아니고; b) 변이체가 위치 32, 48, 66, 82 또는 93에 아미노산 잔기 치환을 갖지 않고 위치 13에 아미노산 잔기 치환을 갖는 경우, 위치 13의 아미노산 치환은 13Y가 아니며; c) 변이체가 위치 48, 66, 82 또는 93에 아미노산 잔기 치환을 갖지 않고 위치 13 및 32에 아미노산 잔기 치환을 갖는 경우, 위치 13의 아미노산 잔기 치환은 13Y가 아니며, 위치 32의 아미노산 잔기 치환은 32P가 아니다.
일부 실시양태에서, 서열번호 32의 변이체가 서열번호 32와 비교하여 60S 및 64T로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기 치환을 가지고/가지거나, 서열번호 33의 변이체가 서열번호 33과 비교하여 13S, 32F, 48V, 66C, 82H 및 93C로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기 치환을 갖는 이량체화 폴리펩티드가 제공된다.
일부 실시양태에서, 서열번호 32의 변이체는 서열번호 32와 비교하여 60S 및 64T의 아미노산 치환을 가지고/가지거나, 서열번호 33의 변이체는 서열번호 32와 비교하여 a) 내지 c): a) 32F 및 48V; b) 13S, 32F, 48V 및 82H; 및 c) 13S, 32F, 48V, 66C, 82H 및 93C 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 잔기 치환을 갖는다.
일부 실시양태에서, 이량체화 폴리펩티드로서, 서열번호 32의 변이체가 서열번호 32와 비교하여 위치 3, 8, 11, 13, 20, 22, 25, 26, 39, 40, 42, 45, 47, 49, 56, 58, 66, 70, 75, 77, 79, 81, 82, 83 및 84로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 위치에 아미노산 잔기 치환을 추가로 가지고; 일부 실시양태에서, 서열번호 32의 변이체가 서열번호 32와 비교하여 3W, 8C, 11I, 13L, 20C, 22M/22C, 25S, 26C, 39T, 40S, 42K, 45S, 47E, 49G, 56S, 58E, 66S/66K, 70R, 75V, 77S, 79T, 81R, 82M, 83D 및 84L로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기 치환을 추가로 가지고; 일부 실시양태에서, 서열번호 32의 변이체가 서열번호 32와 비교하여 a) 내지 l): a) 8C, 25S 및 39T; b) 20C, 25S 및 39T; c) 25S, 26C 및 39T; d) 22C, 25S 및 39T; e) 8C, 25S, 39T, 66S 및 77S; f) 8C, 25S, 39T, 66K, 70R, 79T 및 81R; g) 3W, 8C, 11I, 13L, 22M, 25S, 39T 및 82M; h) 8C, 11I, 25S, 39T, 66K, 79T 및 81R; i) 8C, 25S, 39T, 40S, 42K, 45S, 47E, 49G, 56S, 58E, 75V, 83D 및 84L, j) 8C, 25S, 39T, 47E, 49G, 56S, 58E 및 75V; k) 8C, 25S, 39T, 56S, 58E 및 75V; 및 l) 8C, 25S, 39T, 56S, 58E, 66S 및 77S 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 잔기 치환을 추가로 가지고; 일부 실시양태에서, 서열번호 32의 변이체가 서열번호 32와 비교하여 A) 내지 C): A) 8C, 11I, 25S, 39T, 60S, 64T, 66K, 79T 및 81R; B) 8C, 11I, 20C, 25S, 39T, 60S, 64T, 66K, 79T 및 81R; 및 C) 8C, 11I, 25S, 26C, 39T, 60S, 64T, 66K, 79T 및 81R 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 잔기 치환을 갖는 이량체화 폴리펩티드가 제공된다.
일부 실시양태에서, 서열번호 33의 변이체가 서열번호 33과 비교하여 위치 2, 3, 7, 9, 11, 12, 13, 14, 17, 20, 22, 25, 30, 32, 34, 36, 41, 42, 44, 45, 53, 58, 62, 67, 69, 76, 88, 89, 92, 94 및 97로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 위치에 아미노산 잔기 치환을 추가로 갖는 이량체화 폴리펩티드가 제공된다. 일부 실시양태에서, 서열번호 33의 변이체는 서열번호 33과 비교하여 2E, 3C, 7K/7R, 9C, 11L, 12S, 13Y, 14T, 17E, 20L, 22M/22S, 25S, 30D, 32P, 34E, 36T, 41K, 42L, 44I, 45T, 53L, 58V, 62E/62K/62H, 67Q/67T, 69S, 76S, 88C, 89L, 92E, 94G 및 97G로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기 치환을 추가로 갖는다. 일부 실시양태에서, 서열번호 33의 변이체는 서열번호 33과 비교하여 다음 A) 내지 R) 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 잔기 치환을 추가로 갖는다: A) 88C; B) 3C; C) 9C; D) 25S, 76S 및 88C; E) 25S, 76S 및 3C; F) 25S, 76S 및 9C; G) 7K, 25S, 62K, 76S 및 88C; H) 7K, 25S, 62H, 76S 및 88C; I) 7R, 25S, 62K, 76S 및 88C; J) 7R, 25S, 62H, 76S 및 88C; K) 11L, 25S, 62K, 76S 및 88C; L) 11L, 25S, 62H, 76S 및 88C; M) 12S, 13Y, 14T, 22S, 25S, 62K, 76S 및 88C; N) 2E, 11L, 17E, 25S, 30D, 32P, 34E, 36T, 44I, 45T, 58V, 62E, 67Q, 69S, 76S, 88C 및 97G; O) 11L, 20L, 22M, 25S, 53L, 62K, 76S 및 88C; P) 11L, 25S, 41K, 45T, 62K, 67Q, 69S, 76S, 88C 및 89L; Q) 11L, 25S, 42L, 45T, 62K, 67T, 69S, 76S, 88C, 92E 및 94G; 및 R) 11L, 12S, 13Y, 22S, 25S, 42L, 45T, 62K, 67Q, 69S, 76S, 88C, 92E 및 94G. 일부 실시양태에서, 서열번호 33의 변이체는 서열번호 33과 비교하여 다음 a) 내지 j) 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 잔기 치환을 갖는다: a) 25S, 32F, 41K, 45T, 48V, 62K, 67Q, 69S, 76S, 88C 및 89L; b) 13S, 25S, 32F, 41K, 45T, 48V, 62K, 67Q, 69S, 76S, 82H, 88C 및 89L; c) 3C, 13S, 25S, 32F, 41K, 45T, 48V, 62K, 67Q, 69S, 76S, 82H, 88C 및 89L; d) 9C, 13S, 25S, 32F, 41K, 45T, 48V, 62K, 67Q, 69S, 76S, 82H, 88C 및 89L; e) 13S, 32F, 41K, 45T, 48V, 62K, 67Q, 69S, 82H, 88C 및 89L; f) 3C, 13S, 32F, 41K, 45T, 48V, 62K, 67Q, 69S, 82H, 88C 및 89L, g) 9C, 13S, 32F, 41K, 45T, 48V, 62K, 67Q, 69S, 82H, 88C 및 89L; h) 13S, 25S, 32F, 41K, 45T, 48V, 62K, 66C, 67Q, 69S, 76S, 82H, 88C, 89L 및 93C; i) 3C, 13S, 25S, 32F, 41K, 45T, 48V, 62K, 66C, 67Q, 69S, 76S, 82H, 88C, 89L 및 93C; 및 j) 9C, 13S, 25S, 32F, 41K, 45T, 48V, 62K, 66C, 67Q, 69S, 76S, 82H, 88C, 89L 및 93C.
일부 실시양태에서, 옵스큐린-유사-O 쇄가 서열번호 34 또는 그의 변이체이고, 서열번호 34의 변이체가 서열번호 34와 비교하여 위치 6, 26, 74, 77, 84 및 86으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 위치에 아미노산 잔기 치환을 갖는 이량체화 폴리펩티드가 제공된다. 일부 실시양태에서, 서열번호 34의 변이체는 서열번호 34와 비교하여 6E, 26S, 74C, 77S, 84C 및 86C로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기 치환을 갖는다. 일부 실시양태에서, 서열번호 34의 변이체는 서열번호 34와 비교하여 다음 A) 내지 F) 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 잔기 치환을 갖는다: A) 6E 및 74C, B) 6E 및 84C, C) 6E 및 86C, D) 6E, 26S, 77S 및 74C, E) 6E, 26S, 77S 및 84C, F ) 6E, 26S, 77S 및 86C.
일부 실시양태에서, 이량체화 폴리펩티드로서, 티틴-T 쇄가 서열번호 32, 68, 또는 127의 변이체이고, 여기서 서열번호 32의 변이체는 서열번호 32와 비교하여 60S 및 64T로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기 치환을 가지고; 서열번호 68의 변이체는 서열번호 68과 비교하여 60S 및 64T로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기 치환을 가지고; 서열번호 127의 변이체는 서열번호 127과 비교하여 60S 및 64T로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기 치환을 가지며; 옵스큐린-O 쇄가 서열번호 33, 80 또는 128의 변이체이고, 여기서 서열번호 33의 변이체는 서열번호 33과 비교하여 13S, 32F, 48V, 66C, 82H, 및 93C로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기 치환을 가지고; 서열번호 80의 변이체는 서열번호 80과 비교하여 13S, 32F, 48V, 66C, 82H 및 93C로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기 치환을 가지고; 서열번호 128의 변이체는 서열번호 128과 비교하여 13S, 32F, 48V, 66C, 82H 및 93C로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기 치환을 갖는 이량체화 폴리펩티드가 제공된다.
일부 실시양태에서, 제1 중쇄, 제1 경쇄, 제2 중쇄, 및 제2 경쇄를 포함하는, 상기 중 어느 하나에 따른 항원-결합 분자가 제공되며, 여기서,
a. 제1 중쇄는 N-말단에서 C-말단의 순서로 [VH1]-[링커 1]-[티틴-T 쇄]-[Fc1]을 포함하고,
제1 경쇄는 N-말단에서 C-말단의 순서로 [VL1]-[링커 2]-[옵스큐린-O 쇄]를 포함하고,
제2 중쇄는 N-말단에서 C-말단의 순서로 [VH2]-[CH1]-[Fc2]를 포함하고,
제2 경쇄는 N-말단에서 C-말단의 순서로 [VL2]-[CL]을 포함하거나; 또는
b. 제1 중쇄는 N-말단에서 C-말단의 순서로 [VH1]-[링커 1]-[옵스큐린-O 쇄]-[Fc1]을 포함하고,
제1 경쇄는 N-말단에서 C-말단의 순서로 [VL1]-[링커 2]-[티틴-T 쇄]를 포함하고,
제2 중쇄는 N-말단에서 C-말단의 순서로 [VH2]-[CH1]-[Fc2]를 포함하고,
제2 경쇄는 N-말단에서 C-말단의 순서로 [VL2]-[CL]을 포함하고;
여기서, 상기 링커 1 및 링커 2는 동일하거나 상이하고; 일부 실시양태에서, Fc1 및 Fc2는 각각 독립적으로 동종이량체화를 감소시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 가지고; 일부 실시양태에서, 링커 1 및 링커 2가 제공되며, 여기서: A) 링커 1 및 링커 2는 둘 다 (GxS)y 링커이고, 여기서 x는 1 내지 5의 정수(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 또는 5)로 이루어진 군에서 선택되고, y는 0 내지 6의 정수(예를 들어, 0, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6)로 이루어진 군에서 선택되거나(여기서: y가 0인 경우, 링커는 결합이다); 또는 B) 링커 1은 CH1의 C-말단 절두 서열이고, 링커 2는 CL의 C-말단 절두 서열이며; 일부 실시양태에서, 링커 1 및 링커 2는 A) 내지 C): A) 서열번호 173에 제시된 서열을 갖는 링커 1 및 서열번호 174에 제시된 서열을 갖는 링커 2; B) 둘 다 서열번호 175에 제시된 서열을 갖는 링커 1 및 링커 2; 및 C) 둘 다 서열번호 176에 제시된 서열을 갖는 링커 1 및 링커 2 중 어느 하나로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, Fc1은 놉-인투-홀 기술에 따른 돌기 구조를 가지고, Fc2는 놉-인투-홀 기술에 따른 기공 구조를 가지거나, 또는 Fc1은 놉-인투-홀 기술에 따른 기공 구조를 가지고, Fc2는 놉-인투-홀 기술에 따른 돌기 구조를 갖는다. 일부 실시양태에서, Fc1은 354, 356, 358 및 366으로 이루어진 군에서 선택된 위치에 하나 이상의 아미노산 치환을 가지고, Fc2는 349, 356, 358, 366, 368 및 407로 이루어진 군에서 선택된 위치에 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는다. 일부 실시양태에서, Fc2는 354, 356, 358 및 366으로 이루어진 군에서 선택된 위치에 하나 이상의 아미노산 치환을 가지고, Fc1은 349, 356, 358, 366, 368 및 407로 이루어진 군에서 선택된 위치에 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는다. 일부 실시양태에서, Fc1은 354C, 356E, 358M 및 366W로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 치환을 가지고, Fc2는 349C, 356E, 358M, 366S, 368A 및 407V로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는다. 일부 실시양태에서, Fc2는 354C, 356E, 358M 및 366W로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 치환을 가지고, Fc1은 349C, 356E, 358M, 366S, 368A 및 407V로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는다. 일부 실시양태에서, Fc1은 354C, 356E, 358M 및 366W의 아미노산 치환을 포함하고, Fc2는 349C, 356E, 358M, 366S, 368A 및 407V의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, Fc2는 354C, 356E, 358M 및 366W의 아미노산 치환을 포함하고, Fc1은 349C, 356E, 358M, 366S, 368A 및 407V의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, Fc1은 서열번호 177에 제시되어 있고, Fc2는 서열번호 178에 제시되어 있거나; 또는 Fc2는 서열번호 177에 제시되어 있고, Fc1은 서열번호 178에 제시되어 있다.
일부 실시양태에서, 제1 중쇄, 제1 경쇄, 제2 중쇄, 및 제2 경쇄를 포함하는, 상기 중 어느 하나에 따른 항원-결합 분자가 제공되며, 여기서,
a. 제1 중쇄는 N-말단에서 C-말단의 순서로 [VH1]-[링커 1]-[티틴-T 쇄]-[Fc1]을 포함하고,
제1 경쇄는 N-말단에서 C-말단의 순서로 [VL1]-[링커 2]-[옵스큐린-유사-O 쇄]를 포함하고,
제2 중쇄는 N-말단에서 C-말단의 순서로 [VH2]-[CH1]-[Fc2]를 포함하고,
제2 경쇄는 N-말단에서 C-말단의 순서로 [VL2]-[CL]을 포함하거나; 또는
b. 제1 중쇄는 N-말단에서 C-말단의 순서로 [VH1]-[링커 1]-[옵스큐린-유사-O 쇄]-[Fc1]을 포함하고,
제1 경쇄는 N-말단에서 C-말단의 순서로 [VL1]-[링커 2]-[티틴-T 쇄]를 포함하고,
제2 중쇄는 N-말단에서 C-말단의 순서로 [VH2]-[CH1]-[Fc2]를 포함하고,
제2 경쇄는 N-말단에서 C-말단의 순서로 [VL2]-[CL]을 포함하고;
여기서, 상기 링커 1 및 링커 2는 동일하거나 상이하고; 일부 실시양태에서, Fc1 및 Fc2는 각각 독립적으로 동종이량체화를 감소시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 가지고; 일부 실시양태에서, 링커 1 및링커 2가 제공되며, 여기서: A) 링커 1 및 링커 2는 둘 다 (GxS)y 링커이고, 여기서 x는 1 내지 5의 정수(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 또는 5)로 이루어진 군에서 선택되고, y는 0 내지 6의 정수(예를 들어, 0, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6)로 이루어진 군에서 선택되거나(여기서: y가 0인 경우, 링커는 결합이다); 또는 B) 링커 1은 CH1의 C-말단 절두 서열이고, 링커 2는 CL의 C-말단 절두 서열이며; 일부 실시양태에서, 링커 1 및 링커 2는 A) 내지 C): A) 서열번호 173에 제시된 서열을 갖는 링커 1 및 서열번호 174에 제시된 서열을 갖는 링커 2; B) 둘 다 서열번호 175에 제시된 서열을 갖는 링커 1 및 링커 2; 및 C) 둘 다 서열번호 176에 제시된 서열을 갖는 링커 1 및 링커 2 중 어느 하나로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, Fc1은 놉-인투-홀 기술에 따른 돌기 구조를 가지고, Fc2는 놉-인투-홀 기술에 따른 기공 구조를 가지거나, 또는 Fc1은 놉-인투-홀 기술에 따른 기공 구조를 가지고, Fc2는 놉-인투-홀 기술에 따른 돌기 구조를 갖는다. 일부 실시양태에서, Fc1은 354, 356, 358 및 366으로 이루어진 군에서 선택된 위치에 하나 이상의 아미노산 치환을 가지고, Fc2는 349, 356, 358, 366, 368 및 407로 이루어진 군에서 선택된 위치에 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는다. 일부 실시양태에서, Fc2는 354, 356, 358 및 366으로 이루어진 군에서 선택된 위치에 하나 이상의 아미노산 치환을 가지고, Fc1은 349, 356, 358, 366, 368 및 407로 이루어진 군에서 선택된 위치에 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는다. 일부 실시양태에서, Fc1은 354C, 356E, 358M 및 366W로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 치환을 가지고, Fc2는 349C, 356E, 358M, 366S, 368A 및 407V로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는다. 일부 실시양태에서, Fc2는 354C, 356E, 358M 및 366W로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 치환을 가지고, Fc1은 349C, 356E, 358M, 366S, 368A 및 407V로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는다. 일부 실시양태에서, Fc1은 354C, 356E, 358M 및 366W의 아미노산 치환을 포함하고, Fc2는 349C, 356E, 358M, 366S, 368A 및 407V의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, Fc2는 354C, 356E, 358M 및 366W의 아미노산 치환을 포함하고, Fc1은 349C, 356E, 358M, 366S, 368A 및 407V의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, Fc1은 서열번호 177에 제시되어 있고, Fc2는 서열번호 178에 제시되어 있거나; 또는 Fc2는 서열번호 177에 제시되어 있고, Fc1은 서열번호 178에 제시되어 있다.
Fc 영역의 변형
하나의 양태에서, 본 개시내용의 Fc 영역은 Fc 수용체에 대한 결합, 예를 들어, Fcγ 수용체에 대한 결합을 감소시키고 효과기 기능을 감소시키거나 제거하는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 천연 IgG Fc 영역, 특히 IgG1 Fc 영역 또는 IgG4 Fc 영역은 본 개시내용의 융합 단배질이 항원을 발현하는 세포보다는 Fc 수용체를 발현하는 세포를 표적화하도록 할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 조작된 Fc 영역은 Fc 수용체에 대한 감소된 결합 친화도 및/또는 감소된 효과기 기능을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 조작된 Fc 영역은 천연 Fc 영역과 비교하여 Fc 수용체에 대한 결합 친화도에 50%, 80%, 90% 또는 95% 이상의 감소를 나타낸다. 일부 실시양태에서, Fc 수용체는 Fcγ 수용체이다. 일부 실시양태에서, Fc 수용체는 인간 Fcγ 수용체, 예를 들어, FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIB 또는 FcγRIIIa이다. 일부 실시양태에서, 조작된 Fc 영역은 또한 천연 Fc 영역과 비교하여 보체(예를 들어, C1q)에 대한 감소된 결합 친화도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 조작된 Fc 영역은 천연 Fc 영역과 비교하여 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 대한 감소된 결합 친화도를 갖지 않는다. 일부 실시양태에서, 조작된 Fc 영역은 감소된 효과기 기능을 가지며, 이는 다음 중 하나 이상을 포함할 수 있으나 이로 제한되지는 않는다: 보체-의존성 세포독성(CDC)의 감소, 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC)의 감소, 항체-의존성 세포 식균작용(ADCP)의 감소, 사이토카인 분비의 감소, 항원 제시 세포에 의한 면역 복합체-매개 항원 흡수의 감소, NK 세포에 대한 결합의 감소, 대식세포에 대한 결합의 감소, 단핵구에 대한 결합의 감소, 다형핵 세포에 대한 결합의 감소, 직접 신호전달-유도성 세포사멸의 감소, 수지상 세포 성숙의 감소 및 T 세포 프라이밍의 감소. IgG1 Fc 영역의 경우, 위치 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329와 같은 위치에서의 아미노산 잔기 치환은 효과기 기능을 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, Fc 영역은 인간 IgG1 Fc 영역이고, 위치 234 및 235의 아미노산 잔기는, EU 인덱스에 따라 번호가 지정될 때, A이다. IgG4 Fc 영역의 경우, 위치 228과 같은 위치에서의 아미노산 잔기 치환은 효과기 기능을 감소시킬 수 있다.
항원-결합 분자는 Fc 영역의 2개 서브유닛에 융합된 상이한 항원-결합 도메인을 포함할 수 있으며, 따라서 바람직하지 않은 동종이량체화를 초래할 수 있다. 수율 및 순도를 향상시키기 위해서는, 본 개시내용의 항원-결합 분자의 Fc 영역에 이종이량체화를 촉진하는 변형을 도입하는 것이 유리할 것이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 Fc 영역은 제1 서브유닛의 계면에 돌기 구조(놉) 및 제2 서브유닛의 계면에 기공 구조(홀); 또는 제1 서브유닛의 계면에 기공 구조(홀) 및 제2 서브유닛의 계면에 돌기 구조(놉)를 도입하는 것을 포함하는 놉-앤-홀(KIH) 기술에 따른 변형을 포함한다. 이와 같이, 돌기 구조가 기공 구조 내에 위치하게 됨으로써 이종이량체의 형성을 촉진하고 동종이중체의 생성을 억제할 수 있다. 돌기 구조는 제1 서브유닛의 계면에 있는 작은 아미노산 측쇄를 더 큰 측쇄(예를 들어, 티로신 또는 트립토판)로 대체함으로써 구성된다. 기공 구조는 큰 아미노산 측쇄를 더 작은 아미노산 측쇄(예를 들어, 알라닌 또는 트레오닌)로 대체함으로써 제2 서브유닛의 계면에서 생성된다. 돌기 및 기공 구조는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 변경하여 제조된다. 예시적으로, 선택적인 아미노산 치환이 하기 표 2에 나와 있다:
[표 2] KIH 돌연변이의 조합
놉-인투-홀 기술 이외에, 이종이량체화를 달성하기 위해 다중특이성 항체 중쇄의 CH3 도메인을 변형시키는 다른 기술들도 당해 분야에 공지되어 있다(예를 들어, WO 96/27011, WO 98/050431, EP 1870459, WO 2007/110205, WO 007/147901, WO 2009/089004, WO 2010/129304, WO 2011/90754, WO 2011/143545, WO 2012/058768, WO 2013/157954 및 WO 013/096291).
Fc 영역의 C-말단은 아미노산 잔기 PGK로 종결되는 온전한 C-말단 또는 단축된 C-말단, 예를 들어, 1개 또는 2개의 C-말단 아미노산 잔기가 제거된 단축된 C-말단일 수 있다. 바람직한 양태에서, 중쇄의 C-말단은 PG로 종결되는 단축된 C-말단이다. 따라서, 일부 실시양태에서, 온전한 항체의 조성물은 모든 K447 잔기 및/또는 G446 + K447 잔기가 제거된 항체 집단을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 온전한 항체의 조성물은 K447 잔기 및/또는 G446 + K447 잔기가 제거되지 않은 항체 집단을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 온전한 항체의 조성물은 K447 잔기 및/또는 G446 + K447 잔기가 있거나 없는 항체의 혼합물을 갖는 항체 집단을 포함한다.
재조합 방법
항원-결합 분자 또는 폴리펩티드는 재조합 방법을 사용하여 생산될 수 있다. 이들 방법을 위해, 폴리펩티드 또는 항원-결합 분자를 암호화하는 하나 이상의 단리된 핵산이 제공된다.
한 실시양태에서, 본 개시내용은 전술한 폴리펩티드 또는 항원-결합 분자를 암호화하는 단리된 핵산을 제공한다. 상기 핵산은 각각 독립적으로 전술한 폴리펩티드 쇄 중 어느 하나를 암호화할 수 있다. 또 다른 양태에서, 본 개시내용은 상기 핵산을 포함하는 하나 이상의 벡터(예를 들어, 발현 벡터)를 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 개시내용은 상기 핵산을 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 한 실시양태에서, 상기에 제공된 바와 같은 폴리펩티드 또는 항원-결합 분자를 암호화하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 발현에 적합한 조건 하에서 배양하고, 선택적으로 숙주 세포(또는 숙주 세포 배지)로부터 항체를 단리하는 단계를 포함하는, 폴리펩티드 또는 항원-결합 분자를 제조하는 방법이 제공된다.
폴리펩티드 또는 항원-결합 분자의 재조합 생산을 위해, 단백질을 암호화하는 핵산을 단리하고, 숙주 세포에서의 추가 클로닝 및/또는 발현을 위해 하나 이상의 벡터에 삽입한다. 상기 핵산은 통상적인 절차를 사용하여 쉽게 단리하고 서열분석할 수 있거나, 재조합 방법에 의해 생산하거나 화학적 합성에 의해 수득할 수 있다.
폴리펩티드 또는 항원-결합 단백질을 암호화하는 벡터를 클로닝하거나 발현시키기에 적합한 숙주 세포에는 본원에 기술된 원핵 또는 진핵 세포가 포함된다. 예를 들어, 폴리펩티드 또는 항원-결합 분자는 특히 글리코실화 및 Fc 효과기 기능이 필요하지 않은 경우 세균에서 생산할 수 있다. 발현 후, 폴리펩티드 또는 항원-결합 분자는 가용성 분획 중 세균 세포 페이스트로부터 단리할 수 있으며 추가로 정제할 수 있다.
원핵생물 이외에, 사상균 또는 효모와 같은 진핵 미생물은 진균 및 효모 균주를 비롯한 항원-결합 분자를 암호화하는 벡터에 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 항원-결합 분자의 발현에 적합한 숙주 세포는 또한 다세포 유기체(무척추동물 및 척추동물)로부터 얻을 수 있으며; 무척추동물 세포의 예로는 식물 세포 및 곤충 세포가 포함된다. 특히 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포의 형질감염을 위해 곤충 세포와 조합하여 사용될 수 있는 다수의 바큘로바이러스 균주가 동정되었고; 식물 세포 배양물도 또한 숙주로서 사용될 수 있으며(예를 들어, US 5959177, US 6040498, US 6420548, US 7125978 및 US 6417429 참조); 척추동물 세포, 예를 들어, 현탁액에서의 성장에 적응된 포유동물 세포주도 또한 숙주로 사용될 수 있다. 적합한 포유동물 숙주 세포주의 다른 예로는 SV40-형질전환 원숭이 신장 CV1 세포주(COS-7); 인간 배아 신장 세포주(293 또는 293T 세포); 베이비 햄스터 신장 세포(BHK); 마우스 세르톨리 세포(TM4 세포); 원숭이 신장 세포(CV1); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(VERO-76); 인간 자궁경부암 세포(HELA); 개 신장 세포(MDCK); 버팔로 래트 간 세포(BRL3A); 인간 폐 세포(W138); 인간 간 세포(Hep G2); 마우스 유방 종양 세포(MMT 060562); TRI 세포; MRC5 세포; 및 FS4 세포가 포함된다. 다른 적합한 포유동물 숙주 세포주로는 DHFR-CHO 세포를 포함한 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포; 및 Y0, NS0 및 Sp2/0과 같은 골수종 세포주가 포함된다. 항체 생산에 적합한 특정 포유동물 숙주 세포주의 검토를 위해서는, 예를 들어, 문헌[Yazaki, P. and Wu, A.M., Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (eds.), Humana Press, Totowa, NJ (2004), pp. 255-268]을 참조하시오.
분석
본원에 제공된 폴리펩티드 또는 항원-결합 분자는 당해 분야에 공지된 다양한 분석에 의해 물리/화학적 특성 및/또는 생물 활성에 대해 확인하거나, 스크리닝하거나 특성화할 수 있다. 하나의 양태에서, 본 개시내용의 폴리펩티드 또는 항원-결합 분자는, 예를 들어, ELISA, 웨스턴 블롯 등과 같은 공지된 방법에 의해 활성에 대해 시험한다.
치료 방법 및 투여 경로
본원에 제공된 임의의 항원-결합 분자를 치료 방법에 사용할 수 있다. 또 다른 양태에서, 본 개시내용은 약제의 생산 또는 제조에 있어서 항원-결합 분자의 용도를 제공한다. 일부 실시양태에서, 하나의 상기와 같은 실시양태에서, 용도는 대상에게 효과량의 적어도 하나의 추가 치료제(예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 추가 치료제)를 투여하는 것을 추가로 포함한다. 임의의 상기 실시양태에 따른 "대상"은 인간일 수 있다.
또 다른 양태에서, 예를 들어, 임의의 상기 약학적 용도 또는 치료 방법을 위한 항원-결합 분자를 포함하는 약학 조성물이 제공된다. 하나의 실시양태에서, 약학 조성물은 본원에 제공된 임의의 항원-결합 분자 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 약학 조성물은 적어도 하나의 추가 치료제를 추가로 포함한다.
본 개시내용의 항원-결합 분자는 단독으로 또는 치료를 위해 다른 약제와 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 개시내용의 항체는 적어도 하나의 추가 치료제와 공-투여될 수 있다.
본 개시내용의 항원-결합 분자(및 임의의 추가 치료제)는 비경구, 폐내 및 비강내 투여, 및 국소 치료에 필요한 경우 병변내 투여를 포함하여 임의의 적합한 수단에 의해 투여될 수 있다. 비경구 주입에는 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여가 포함된다. 투여는 부분적으로 투여가 단기인지 장기인지에 따라 임의의 적합한 경로, 예를 들어, 정맥내 또는 피하 주사와 같은 주사에 의해 수행될 수 있다. 단일 투여 또는 여러 시점에서의 다중 투여, 볼루스(bolus) 투여 및 펄스 주입을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 투여 일정이 본원에서 고려된다.
본 개시내용의 항원-결합 분자는 우수 의료 관행(Good Medical Practice)에 부합하는 방식으로 제형화되고 투여되며 적용될 것이다. 이와 관련하여 고려되는 요인들로는 치료될 특정 병태, 치료될 특정 포유동물, 개별 환자의 임상 상태, 병태의 원인, 약제 전달 부위, 투여 방법, 투여 시기, 및 의료 종사자에게 알려진 기타 요인이 포함된다. 폴리펩티드 또는 융합 단백질은 병태를 예방 또는 치료하기 위해 현재 사용되는 하나 이상의 약제를 포함하거나 포함하지 않고 제형화될 수 있다. 이러한 추가 약제의 효과량은 약학 조성물에 존재하는 양, 병태 또는 치료 유형 및 기타 요인에 따라 달라진다. 이들은 일반적으로 본원에 기재된 바와 동일한 투여량 및 투여 경로로 사용되거나, 본원에 기재된 투여량의 약 1% 내지 99%로, 또는 다른 투여량으로, 경험적으로/임상적으로 적절한 것으로 결정된 임의의 경로에 의해 사용된다.
질환의 예방 또는 치료를 위해, 본 개시내용의 항원-결합 분자의 적절한 투여량(단독으로 또는 하나 이상의 추가 치료제와 함께 사용될 때)은 치료될 질환의 유형, 치료 분자의 유형, 질환의 중증도 및 경과, 투여 목적(예방 또는 치료), 이전 치료, 임상 병력 및 환자의 치료 분자에 대한 반응, 및 주치의의 재량에 따라 달라질 것이다. 치료 분자는 하나 또는 일련의 치료로 환자에게 적합하게 투여된다.
제품
본 개시내용의 또 다른 양태에서, 상기 병태의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 물질을 포함하는 제품이 제공된다. 제품은 용기, 및 용기 상에 있거나 용기와 결합된 라벨 또는 패키지 삽입물을 포함한다. 적합한 용기로는, 예를 들어, 병, 바이알, 주사기, IV 용액 주머니 등이 포함된다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 재료로 제조될 수 있다. 용기는 단독으로 또는 다른 조성물과 함께 질환의 치료, 예방 및/또는 진단에 효과적인 조성물을 함유하며, 멸균 접근 포트를 가질 수 있다(예를 들어, 용기는 피하 주사 바늘에 의해 관통될 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용액 주머니 또는 바이알일 수 있다). 조성물 중 적어도 하나의 활성제는 본 개시내용의 항원-결합 분자이다. 라벨 또는 패키지 삽입물은 조성물이 선택된 병태를 치료하는데 사용된다는 것을 나타낸다. 추가로, 제품은 (a) 본 개시내용의 항원-결합 분자를 포함하는 조성물을 함유하는 제1 용기; 및 (b) 다른 세포독성제 또는 추가 치료제를 포함하는 조성물을 함유하는 제2 용기를 포함할 수 있다. 본 개시내용의 상기 실시양태에서 제품은 조성물이 특정 병태를 치료하는 데 사용될 수 있음을 나타내는 패키지 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 제품은 약학적으로 허용되는 완충액을 함유하는 제2(또는 제3) 용기를 추가로 포함할 수 있다. 상업적인 관점 및 사용자의 관점에서, 상기 제품은 필요에 따라 기타 완충제, 희석제, 필터, 바늘 및 주사기를 포함한 기타 물질을 추가로 포함할 수 있다.
실시예에 사용된 항체는 특정 항원을 표적으로 하지만, 당해 분야의 숙련자는 본 개시내용의 교지에 비추어, 기술적 효과가 특정 CDR 서열 및 특정 항원 서열과 무관하게 달성되지만, CH1/CL을 티틴 T 쇄/옵스큐린-O 쇄 또는 티틴 T 쇄/옵스큐린-유사-O 쇄로 치환시켜 중쇄/경쇄 사이의 불일치를 개선하는 이점이 있음을 이해할 수 있을 것이다.
실시예 및 시험예
본 개시내용은 하기의 실시예 및 시험예를 참조하여 하기에 추가로 설명되지만, 이는 본 개시내용을 제한하지 않는다. 본 개시내용의 실시예 및 시험예에서 구체적인 조건을 명시하지 않은 실험 방법은 일반적으로 문헌[Antibodies: A Laboratory Manual and Molecular Cloning: A Laboratory Manual by Cold Spring Harbor Laboratory]와 같은 통상적인 조건하에서, 또는 출발 물질 또는 상업적 제품의 제조사에 의해 권장되는 조건하에서 수행된다. 특정 출처가 명시되지 않은 시약은 상업적으로 시판되는 통상적인 시약이다.
실시예 1: 항체 또는 폴리펩티드 단백질의 제조 방법
본 방법은, PCR에 의해 유전자 단편(예를 들어, 항체 VH/VK 유전자 단편)을 구축하기 위한 프라이머를 설계하고, 유전자 단편을 발현 벡터(예를 들어, pHr(신호 펩티드 및 불변 영역 유전자(예, CH1-Fc/CL) 단편) 함유)를 사용한 상동성 재조합에 적용하여 발현 벡터(예를 들어, VH-CH1-Fc-pHr/VK-CL-pHr)를 구축하고, 구축된 발현 벡터를 원핵생물 또는 진핵생물에 도입하여 발현시킨 후, 최종적으로 생성물을 정제하여 목적하는 항체 또는 폴리펩티드 단백질을 수득하는 것을 포함한다. 제한하지 않고, 항체 불변 영역은 인간 κ 및 λ 쇄의 경쇄 불변 영역 및 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4의 중쇄 불변 영역으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 비제한적 예로는 중쇄 불변 영역의 위치 L234A/L235A 또는 L234F/L235E에서의 돌연변이와 같은 인간 항체 불변 영역에 대한 최적화 설계가 추가로 포함된다. 예시적으로, 항체 경쇄/중쇄 불변 영역 서열은 다음과 같다:
> IgG1 중쇄 불변 영역(hIgG1로 약칭):
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호 1).
참고: 서열에서, 단일 밑줄친 부분은 CH1을 나타내고, 점으로 밑줄친 부분은 CH2를 나타내며, 이탤릭체 부분은 CH3을 나타낸다.
> 놉-IgG1 중쇄 불변 영역(놉-IgG1로 약칭):
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK GQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호 2).
참고: 서열에서, 단일 밑줄친 부분은 CH1을 나타내고, 점으로 밑줄친 부분은 CH2를 나타내며, 이탤릭체 부분은 CH3을 나타낸다.
> 홀-IgG1 중쇄 불변 영역(홀-IgG1로 약칭):
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK GQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호 3).
참고: 서열에서, 단일 밑줄친 부분은 CH1을 나타내고, 점으로 밑줄친 부분은 CH2를 나타내며, 이탤릭체 부분은 CH3을 나타낸다.
> 카파 경쇄 불변 영역(카파 또는 hκ로 약칭):
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호 4).
> 람다 경쇄 불변 영역(람다 또는 hλ로 약칭):
GQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS (서열번호 5).
> 홀-IgG1 중쇄 불변 영역의 Fc 부분의 아미노산 서열:
DKTHTCPPCPAPEAAGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK GQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호 177).
> 놉-IgG1 중쇄 불변 영역의 Fc 부분의 아미노산 서열:
DKTHTCPPCPAPEAAGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK GQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호 178).
> IgG1 중쇄 불변 영역의 CH1 부분의 아미노산 서열:
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC (서열번호 179).
본 개시내용의 실시예 또는 시험예에 언급된 B7H3 및 CD3과 같은 항원에 대한 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 다음과 같다:
> F0 항체의 VH의 아미노산 서열:
QVQLVQSGGGVVQPGTSLRLSCAASGFIFSSSAMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYVDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSARLYASFDYWGQGALVTVSS (서열번호 6).
> F0 항체의 VL의 아미노산 서열:
DTVVTQEPSFSVSPGGTVTLTCGLSSGSVSTSHYPSWYQQTPGQAPRMLIYNTNTRSSGVPDRFSGSILGNKAALTITGAQADDESDYYCAIHVDRDIWVFGGGTKLTVL (서열번호 7).
> N0 항체의 VH의 아미노산 서열:
DVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAGSGFTSSLSWMSWLRQAPGKGLEWVANINQDGSEKNYVDSVKGRFTISRDNAQNSLYLQMSSLRAEDTAVYYCARGLWTFDSWGQGTLLTVSP (서열번호 8).
> N0 항체의 VL의 아미노산 서열:
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQNINNRFLAWYQQRPGQAPRLLIYAASSRATGVPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEAEDFAMYHCQQYGSFPRTFGQGTMVDIK (서열번호 9).
> S0 항체의 VH의 아미노산 서열:
EVQLQESGPGLVKPGGSLSLSCAASGFVFSSYDMSWVRQTPERGLEWVAYISSGGGITYAPSTVKGRFTVSRDNAKNTLYLQMNSLTSEDTAVYYCAAHYFGSSGPFAYWGQGTLVTVSS (서열번호 10).
> S0 항체의 VL의 아미노산 서열:
DIQMTQSPASLSASVGDRVTITCRASENIFSYLAWYQQKPGKSPKLLVYNTRTLAEGVPSRFSGSGSGTDFSLTISSLQPEDFATYYCQHHYGTPFTFGSGTKLEIK (서열번호 11).
> V0 항체의 VH의 아미노산 서열:
QVQLQQSAAELARPGASVKMSCKASGYSFTSYTIHWVKQRPGQGLEWIGYINPNSRNTDYNQKFKDETTLTADRSSSTAYMQLISLTSEDSAVYYCARYSGSTPYWYFDVWGAGTTVTVSS (서열번호 12).
> V0 항체의 VL의 아미노산 서열:
QIVLTQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSVSVSGTSHSLTISRVEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELK (서열번호 13).
> J0 항체의 VH의 아미노산 서열:
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYWMHWVRQAPGKGLEWVGHIKSKTDAGTTDYAAPVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCAREIYYYAFDSWGQGTLVTVSS (서열번호 14).
> J0 항체의 VL의 아미노산 서열:
SYELTQPLSVSVALGQTARITCSGDNIGSKYVHWYQQKPGQAPVLVIYGDNERPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRAQAGDEADYYCQAADWVDFYVFGGGTKLTVL (서열번호 15).
> H0 항체의 VH의 아미노산 서열:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSHYYMAWVRQAPGKGLEWVTSISYEGDITYYGDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCASQTLRESFDYWGQGTLVTVSS (서열번호 16).
> H0 항체의 VL의 아미노산 서열:
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDIANYLSWYQQKPGKSPKLLIYGTSNLEVGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQDKEFPRTFGGGTKVEIK (서열번호 17).
> R0 항체의 VH의 아미노산 서열:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGLSLTSNSVNWIRQAPGKGLEWVGLIWSNGDTDYNSAIKSRFTISRDTSKSTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAREYYGYFDYWGQGTLVTVSS (서열번호 18).
> R0 항체의 VL의 아미노산 서열:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCLASEGISSYLAWYQQKPGKAPKLLIYGANSLQTGVPSRFSGSGSATDYTLTISSLQPEDFATYYCQQSYKFPNTFGQGTKVEVK (서열번호 19).
> Bmab(B0으로 약칭) 항체의 VH의 아미노산 서열:
QVQLQQSGAEVKKPGSSVRVSCKASGGTFNNNAINWVRQAPGQGLEWMGGIIPMFGTAKYSQNFQGRVAITADESTGTASMELSSLRSEDTAVYYCARSRDLLLFPHHALSPWGRGTMVTVSS (서열번호 20).
> Bmab(B0으로 약칭) 항체의 VL의 아미노산 서열:
SSELTQDPAVSVALGQTVRVTCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCSSRDSSGNHWVFGGGTELTVL (서열번호 21).
> Umab(U0으로 약칭) 항체의 VH의 아미노산 서열:
EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTTYWLGWVRQMPGKGLDWIGIMSPVDSDIRYSPSFQGQVTMSVDKSITTAYLQWNSLKASDTAMYYCARRRPGQGYFDFWGQGTLVTVSS (서열번호 22).
> Umab(U0으로 약칭) 항체의 VL의 아미노산 서열:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPEKAPKSLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNIYPYTFGQGTKLEIK (서열번호 23).
> Dmab(D0으로 약칭) 항체의 VH의 아미노산 서열:
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSGITGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPGTTVIMSWFDPWGQGTLVTVSS (서열번호 24).
> Dmab(D0으로 약칭) 항체의 VL의 아미노산 서열:
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVRGRYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVFYCQQYGSSPRTFGQGTKVEIK (서열번호 25).
> Tmab(I0으로 약칭) 항체의 VH의 아미노산 서열:
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLIGYDLNWIRQPPGKGLEWIGIIWGDGTTDYNSAVKSRVTISKDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGGYWYATSYYFDYWGQGTLVTVSS (서열번호 26).
> Tmab(I0으로 약칭) 항체의 VL의 아미노산 서열:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISNNLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRFHSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQEHTLPYTFGQGTKLEIK (서열번호 27).
> C0 항체의 VH의 아미노산 서열:
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYHMNWVRQAPGQRLEWMGDINPDIGGTSYNQNFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARWDFDSFANWGQGTLVTVSS (서열번호 28).
> C0 항체의 VL의 아미노산 서열:
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVSIIGTNLIHWYQQKPGQPPKLLIYHASNLETGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCLQSRKIPYTFGGGTKVEIK (서열번호 29).
> A0 항체의 VH의 아미노산 서열:
EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNEYISYWAYWGQGTLVTVSS (서열번호 105).
> A0 항체의 VL의 아미노산 서열:
QTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVL (서열번호 106).
전술한 항체 F0, N0, S0, V0, J0, H0, R0, B0, U0, D0, I0, C0 및 A0의 중쇄 불변 영역 서열은 IgG1 중쇄 불변 영역(서열번호 1)이고, 항체 N0, S0, H0, R0, U0, I0 및 C0의 경쇄 불변 영역 서열은 카파 경쇄 불변 영역(서열번호 4)이고; 항체 F0, V0, J0, B0, D0 및 A0의 경쇄 불변 영역 서열은 람다 경쇄 불변 영역(서열번호 5)이다.
또한, hB7H3 항원 단백질의 서열은 다음과 같다:
LEVQVPEDPVVALVGTDATLCCSFSPEPGFSLAQLNLIWQLTDTKQLVHSFAEGQDQGSAYANRTALFPDLLAQGNASLRLQRVRVADEGSFTCFVSIRDFGSAAVSLQVAAPYSKPSMTLEPNKDLRPGDTVTITCSSYQGYPEAEVFWQDGQGVPLTGNVTTSQMANEQGLFDVHSILRVVLGANGTYSCLVRNPVLQQDAHSSVTITPQRSPTGAVEVQVPEDPVVALVGTDATLRCSFSPEPGFSLAQLNLIWQLTDTKQLVHSFTEGRDQGSAYANRTALFPDLLAQGNASLRLQRVRVADEGSFTCFVSIRDFGSAAVSLQVAAPYSKPSMTLEPNKDLRPGDTVTITCSSYRGYPEAEVFWQDGQGVPLTGNVTTSQMANEQGLFDVHSVLRVVLGANGTYSCLVRNPVLQQDAHGSVTITGQPMT DYKDDDDKHHHHHH (서열번호 111).
hCD3 항원 단백질은 hCD3 항원의 δ 서브유닛과 ε 서브유닛으로 이루어진 이종이량체로서, 여기서 hCD3 항원의 δ 서브유닛의 서열은 다음과 같다:
FKIPIEELEDRVFVNCNTSITWVEGTVGTLLSDITRLDLGKRILDPRGIYRCNGTDIYKDKESTVQVHYRMCQSCVELDPATVASAENAQCEKELQALEKENAQLEWELQALEKELAQDYKDDDDK (서열번호 112);
hCD3 항원의 ε 서브유닛의 서열은 다음과 같다:
DGNEEMGGITQTPYKVSISGTTVILTCPQYPGSEILWQHNDKNIGGDEDDKNIGSDEDHLSLKEFSELEQSGYYVCYPRGSKPEDANFYLYLRARVCENCMEMDAKNAQCKKKLQALKKKNAQLKWKLQALKKKLAQHHHHHH (서열번호 113).
실시예 2: 항체 CH1/CL 도메인의 대체
CH1/CL 도메인-조작 항체를 수득하기 위해, 항체의 CH1/CL 도메인을 천연 티틴/옵스큐린 복합체, 티틴/옵스큐린-유사 O 복합체, 및 IL6Ra/IL6Rb 복합체 각각에서 천연적 분자간 상호작용을 갖는 Ig-유사 도메인으로 대체하였다.
IL6Ra/IL6Rb 복합체에서, 항체 CH1 또는 CL을 대체하기 위한 IL6Ra 단백질의 Ig-유사 도메인은 IL6Ra.0 쇄이고, 항체 CL 또는 CH1을 대체하기 위한 IL6Rb 단백질의 Ig-유사 도메인은 IL6Rb.0 쇄이며; 티틴/옵스큐린 복합체에서, 항체 CH1 또는 CL을 대체하기 위한 티틴 단백질의 Ig-유사 도메인(티틴 Ig-유사 152 도메인)은 T.0 쇄이고, 항체 CL 또는 CH1을 대체하기 위한 옵스큐린 단백질의 Ig-유사 도메인Ig 유사 도메인(옵스큐린 Ig-유사 152 도메인)은 O.0 쇄이고; 티틴/옵스큐린-유사 O 복합체에서, 항체 CH1 또는 CL을 대체하기 위한 옵스큐린- 유사 단백질의 Ig-유사 도메인(옵스큐린-유사-Ig-유사-1 도메인)은 OL.0 쇄이고, 항체 CL 또는 CH1을 대체하기 위한 티틴 단백질의 Ig-유사 도메인(티틴 Ig-유사 152 도메인)은 T.0 쇄이며, 여기서:
> IL6Ra.0 쇄의 서열은 다음과 같다:
GILQPDPPANITVTAVARNPRWLSVTWQDPHSWNSSFYRLRFELRYRAERSKTFTTWMVKDLQHHCVIHDAWSGLRHVVQLRAQEEFGQGEWSEWSPEAMGTPW (서열번호 30);
> IL6Rb.0 쇄의 서열은 다음과 같다:
FDPVYKVKPNPPHNLSVINSEELSSILKLTWTNPSIKSVIILKYNIQYRTKDASTWSQIPPEDTASTRSSFTVQDLKPFTEYVFRIRCMKEDGKGYWSDWSEEASGIT (서열번호 31);
> T.0 쇄의 서열은 다음과 같다:
GIPPKIEALPSDISIDEGKVLTVACAFTGEPTPEVTWSCGGRKIHSQEQGRFHIENTDDLTTLIIMDVQKQDGGLYTLSLGNEFGSDSATVNIHIRSI (서열번호 32);
> O.0 쇄의 서열은 다음과 같다:
SGAPRFLTRPKAFVVSVGKDATLSCQIVGNPTPQVSWEKDQQPVAAGARFRLAQDGDLYRLTILDLALGDSGQYVCRARNAIGEAFAAVGLQVDAEA (서열번호 33);
> OL.0 쇄의 서열은 다음과 같다:
QGSPPCFLRFPRPVRVVSGAEAELKCVVLGEPPPVVVWEKGGQQLAASERLSFPADGAEHGLLLTAALPTDAGVYVCRARNAAGEAYAAAAVTVLEPP (서열번호 34).
CH1/CL이 대체된 다수의 항체를 구축하고, 항체의 순도 및 상응하는 항원에 대한 항체의 결합 활성을 분석하였다(분석 방법은 본 개시내용의 시험예 2 및 4 참조). 실험 결과는 하기 표 3에 나타내었다. 실험 결과는, 상이한 항원에 결합한 F0, V0, S0, N0, J0, H0, R0 및 C0와 같은 항체의 CH1/CL 도메인이 동시에 T.0 쇄/O.0 쇄 또는 T.0 쇄/OL.0 쇄로 대체된 후에도 항체가 여전히 우수한 결합 활성을 유지하고 높은 순도를 가졌음을 보여주었다.
[표 3] 항체의 순도 및 항원 결합 분석 결과
참고: 예를 들어, F1은 F0 항체의 중쇄 CH1을 IL6Rb.0 쇄(서열번호 31)로 대체하고 경쇄 CL을 IL6Ra.0 쇄(서열번호 30)로 대체하여 수득된 항체를 나타내며, 다른 부분은 F0의 부분과 동일하게 유지되었고, 다른 부분도 마찬가지이다. 표에서, "-"는 검출되지 않음을 나타내고, SEC는 크기 배제 크로마토그래피에 의해 측정된 항체의 순도를 나타낸다(NA는 저발현으로 인해 검출되지 않음을 나타냄).
실시예 3: CH1/CL 도메인-조작 항체에 대한 최적화 설계
I. 티틴 Ig-유사 152 도메인(T.0 쇄), 옵스큐린 Ig-유사 1 도메인(O.0 쇄) 및 옵스큐린-유사 Ig-유사 1 도메인(OL.0 쇄)의 개별 아미노산 잔기에 대한 돌연변이
예시적으로, 첫째, T.0 쇄, O.0 쇄 및 OL.0 쇄의 아미노산 잔기를 쇄간 다이설파이드 결합을 증가시키도록 돌연변이시켰으며; 둘째로, 도메인의 다른 개별 아미노산, 예를 들어, 옵스큐린 Ig-유사 1 도메인의 위치 7, 62 및 11의 아미노산도 돌연변이시켰으며; 티틴 Ig-유사 152 도메인의 N-말단에 바로 인접한 5개의 야생형 티틴 단백질 중 5개의 아미노산 "KAGIR(서열번호 180)"을 티틴 Ig-유사 152 도메인의 N-말단에 부가시켰고; 옵스큐린 Ig-유사 1 도메인의 N-말단에 바로 인접한 5개의 야생형 옵스큐린 단백질 중 5개의 아미노산 "DQPQF(서열번호 181)"를 옵스큐린 Ig-유사 도메인의 N-말단에 부가시켰다. 구체적인 도메인 최적화 설계를 표 4-1 내지 4-3에 나타내었다.
[표 4-1] T.0 쇄의 아미노산 돌연변이
참고: 표에서, 예를 들어, T.1에 대한 돌연변이 방식 "C25S, C39T, A8C"는 T.0(서열번호 32) 서열의 위치 25의 아미노산 잔기가 C에서 S로 돌연변이되었고, 위치 39의 아미노산 잔기가 C에서 T로 돌연변이되었으며, 위치 8의 아미노산 잔기가 C에서 A로 돌연변이되었음을 나타내고; T.6에 대한 돌연변이 방식 "N-말단 + 티틴_KAGIR"은 5개의 아미노산 "KAGIR"이 T.0(서열번호 32) 서열의 N-말단에 부가되었음을 나타내고; 다른 경우도 마찬가지이다.
[표 4-2] O.0 쇄의 아미노산 돌연변이
참고: 표에서, O.1에 대한 돌연변이 방식 "A88C"는 O.0(서열번호 33) 서열의 위치 88의 아미노산 잔기가 A에서 C로 돌연변이되었고; O.11에 대한 돌연변이 방식 "C25S, C76S, A88C, N-말단 + 옵스큐린_DQPQF"는 O.0(서열번호 33) 서열에 C25S, C76S 및 A88C 아미노산 돌연변이가 일어났으며, 5개 아미노산 "DQPQF"가 O.0의 N-말단에 첨가되었음을 나타내고; 다른 경우도 마찬가지이다.
[표 4-3] OL.0 쇄의 아미노산 돌연변이
참고: 표에서, 예를 들어, OL.1에 대한 돌연변이 방식 "C6E, V74C"는 OL.0(서열번호 34) 서열의 위치 6의 아미노산 잔기가 C에서 E로 돌연변이되었고, 위치 74의 아미노산 잔기가 V에서 C로 돌연변이되었음을 나타내며; 다른 경우도 마찬가지이다.
돌연변이 후 티틴-T 쇄, 옵스큐린-O 쇄 및 옵스큐린-유사-O 쇄의 서열은 다음과 같다:
> T.1(C25S, C39T 및 A8C의 돌연변이를 갖는 T.0)
GIPPKIECLPSDISIDEGKVLTVASAFTGEPTPEVTWSTGGRKIHSQEQGRFHIENTDDLTTLIIMDVQKQDGGLYTLSLGNEFGSDSATVNIHIRSI (서열번호 35);
> T.2 (C25S, C39T 및 V20C의 돌연변이를 갖는 T.0)
GIPPKIEALPSDISIDEGKCLTVASAFTGEPTPEVTWSTGGRKIHSQEQGRFHIENTDDLTTLIIMDVQKQDGGLYTLSLGNEFGSDSATVNIHIRSI (서열번호 36);
> T.3 (C25S, C39T 및 A26C의 돌연변이를 갖는 T.0)
GIPPKIEALPSDISIDEGKVLTVASCFTGEPTPEVTWSTGGRKIHSQEQGRFHIENTDDLTTLIIMDVQKQDGGLYTLSLGNEFGSDSATVNIHIRSI (서열번호 37);
> T.4 (C25S, C39T및 T22C의 돌연변이를 갖는 T.0)
GIPPKIEALPSDISIDEGKVLCVASAFTGEPTPEVTWSTGGRKIHSQEQGRFHIENTDDLTTLIIMDVQKQDGGLYTLSLGNEFGSDSATVNIHIRSI (서열번호 38);
> T.5 (C25S, C39T 및 A8C의 돌연변이를 갖는 T.0; KAGIR이 N-말단에 부가됨)
KAGIRGIPPKIECLPSDISIDEGKVLTVASAFTGEPTPEVTWSTGGRKIHSQEQGRFHIENTDDLTTLIIMDVQKQDGGLYTLSLGNEFGSDSATVNIHIRSI (서열번호 39);
> T.6 (KAGIR이 N-말단에 부가된 T.0)
KAGIRGIPPKIEALPSDISIDEGKVLTVACAFTGEPTPEVTWSCGGRKIHSQEQGRFHIENTDDLTTLIIMDVQKQDGGLYTLSLGNEFGSDSATVNIHIRSI (서열번호 127);
> T.1-L1 (C25S, C39T 및 A8C의 돌연변이를 갖는 T.0; (G4S)1 링커가 N-말단에 부가됨)
GGGGSGIPPKIECLPSDISIDEGKVLTVASAFTGEPTPEVTWSTGGRKIHSQEQGRFHIENTDDLTTLIIMDVQKQDGGLYTLSLGNEFGSDSATVNIHIRSI (서열번호 40);
> T.1-L2 (C25S, C39T 및 A8C의 돌연변이를 갖는 T.0; (G4S)2 링커가 N-말단에 부가됨)
GGGGSGGGGSGIPPKIECLPSDISIDEGKVLTVASAFTGEPTPEVTWSTGGRKIHSQEQGRFHIENTDDLTTLIIMDVQKQDGGLYTLSLGNEFGSDSATVNIHIRSI (서열번호 41);
> O.1 (A88C 돌연변이를 갖는 O.0)
SGAPRFLTRPKAFVVSVGKDATLSCQIVGNPTPQVSWEKDQQPVAAGARFRLAQDGDLYRLTILDLALGDSGQYVCRARNAIGEAFACVGLQVDAEA (서열번호 42);
> O.2 (A3C 돌연변이를 갖는 O.0)
SGCPRFLTRPKAFVVSVGKDATLSCQIVGNPTPQVSWEKDQQPVAAGARFRLAQDGDLYRLTILDLALGDSGQYVCRARNAIGEAFAAVGLQVDAEA (서열번호 43);
> O.3 (R9C 돌연변이를 갖는 O.0)
SGAPRFLTCPKAFVVSVGKDATLSCQIVGNPTPQVSWEKDQQPVAAGARFRLAQDGDLYRLTILDLALGDSGQYVCRARNAIGEAFAAVGLQVDAEA (서열번호 44);
> O.4 (C25S, C76S 및 A88C의 돌연변이를 갖는 O.0)
SGAPRFLTRPKAFVVSVGKDATLSSQIVGNPTPQVSWEKDQQPVAAGARFRLAQDGDLYRLTILDLALGDSGQYVSRARNAIGEAFACVGLQVDAEA (서열번호 45);
> O.5 (C25S, C76S 및 A3C의 돌연변이를 갖는 O.0)
SGCPRFLTRPKAFVVSVGKDATLSSQIVGNPTPQVSWEKDQQPVAAGARFRLAQDGDLYRLTILDLALGDSGQYVSRARNAIGEAFAAVGLQVDAEA (서열번호 46);
> O.6 (C25S, C76S및 R9C의 돌연변이를 갖는 O.0)
SGAPRFLTCPKAFVVSVGKDATLSSQIVGNPTPQVSWEKDQQPVAAGARFRLAQDGDLYRLTILDLALGDSGQYVSRARNAIGEAFAAVGLQVDAEA (서열번호 47);
> O.7 (C25S, C76S, A88C, L7K 및 T62K의 돌연변이를 갖는 O.0)
SGAPRFKTRPKAFVVSVGKDATLSSQIVGNPTPQVSWEKDQQPVAAGARFRLAQDGDLYRLKILDLALGDSGQYVSRARNAIGEAFACVGLQVDAEA (서열번호 48);
> O.8 (C25S, C76S, A88C, L7K 및 T62H의 돌연변이를 갖는 O.0)
SGAPRFKTRPKAFVVSVGKDATLSSQIVGNPTPQVSWEKDQQPVAAGARFRLAQDGDLYRLHILDLALGDSGQYVSRARNAIGEAFACVGLQVDAEA (서열번호 49);
> O.9 (C25S, C76S, A88C, K11L 및 T62K의 돌연변이를 갖는 O.0)
SGAPRFLTRPLAFVVSVGKDATLSSQIVGNPTPQVSWEKDQQPVAAGARFRLAQDGDLYRLKILDLALGDSGQYVSRARNAIGEAFACVGLQVDAEA (서열번호 50);
> O.10 (C25S, C76S, A88C, K11L 및 T62H의 돌연변이를 갖는 O.0)
SGAPRFLTRPLAFVVSVGKDATLSSQIVGNPTPQVSWEKDQQPVAAGARFRLAQDGDLYRLHILDLALGDSGQYVSRARNAIGEAFACVGLQVDAEA (서열번호 51);
> O.11 (C25S, C76S 및 A88C의 돌연변이를 갖는 O.0; DQPQF가 N-말단에 부가됨)
DQPQFSGAPRFLTRPKAFVVSVGKDATLSSQIVGNPTPQVSWEKDQQPVAAGARFRLAQDGDLYRLTILDLALGDSGQYVSRARNAIGEAFACVGLQVDAEA (서열번호 52);
> O.12 (C25S, C76S, A88C, L7K 및 T62K의 돌연변이를 갖는 O.0; DQPQF가 N-말단에 부가됨)
DQPQFSGAPRFKTRPKAFVVSVGKDATLSSQIVGNPTPQVSWEKDQQPVAAGARFRLAQDGDLYRLKILDLALGDSGQYVSRARNAIGEAFACVGLQVDAEA (서열번호 53);
> O.13 (C25S, C76S, A88C, L7K 및 T62H의 돌연변이를 갖는 O.0; DQPQF가 N-말단에 부가됨)
DQPQFSGAPRFKTRPKAFVVSVGKDATLSSQIVGNPTPQVSWEKDQQPVAAGARFRLAQDGDLYRLHILDLALGDSGQYVSRARNAIGEAFACVGLQVDAEA (서열번호 54);
> O.14 (C25S, C76S, A88C, L7R 및 T62K의 돌연변이를 갖는 O.0; DQPQF가 N-말단에 부가됨)
DQPQFSGAPRFRTRPKAFVVSVGKDATLSSQIVGNPTPQVSWEKDQQPVAAGARFRLAQDGDLYRLKILDLALGDSGQYVSRARNAIGEAFACVGLQVDAEA (서열번호 55);
> O.15 (C25S, C76S, A88C, L7R 및 T62H의 돌연변이를 갖는 O.0; DQPQF가 N-말단에 부가됨)
DQPQFSGAPRFRTRPKAFVVSVGKDATLSSQIVGNPTPQVSWEKDQQPVAAGARFRLAQDGDLYRLHILDLALGDSGQYVSRARNAIGEAFACVGLQVDAEA (서열번호 56);
> O.16 (DQPQF가 N-말단에 부가된 O.0)
DQPQFSGAPRFLTRPKAFVVSVGKDATLSCQIVGNPTPQVSWEKDQQPVAAGARFRLAQDGDLYRLTILDLALGDSGQYVCRARNAIGEAFAAVGLQVDAEA (서열번호 128);
> O.4-L1 (C25S, C76S 및 A88C의 돌연변이를 갖는 O.0; (G4S)1 링커가 N-말단에 부가됨)
GGGGSSGAPRFLTRPKAFVVSVGKDATLSSQIVGNPTPQVSWEKDQQPVAAGARFRLAQDGDLYRLTILDLALGDSGQYVSRARNAIGEAFACVGLQVDAEA (서열번호 57);
> O.4-L2 (C25S, C76S 및 A88C의 돌연변이를 갖는 O.0; (G4S)2 링커가 N-말단에 부가됨)
GGGGSGGGGSSGAPRFLTRPKAFVVSVGKDATLSSQIVGNPTPQVSWEKDQQPVAAGARFRLAQDGDLYRLTILDLALGDSGQYVSRARNAIGEAFACVGLQVDAEA (서열번호 58);
> OL.1 (C6E 및 V74C의 돌연변이를 갖는 OL.0)
QGSPPEFLRFPRPVRVVSGAEAELKCVVLGEPPPVVVWEKGGQQLAASERLSFPADGAEHGLLLTAALPTDAGCYVCRARNAAGEAYAAAAVTVLEPP (서열번호 59);
> OL.2 (C6E 및 G84C의 돌연변이를 갖는 OL.0)
QGSPPEFLRFPRPVRVVSGAEAELKCVVLGEPPPVVVWEKGGQQLAASERLSFPADGAEHGLLLTAALPTDAGVYVCRARNAACEAYAAAAVTVLEPP (서열번호 60);
> OL.3 (C6E 및 A86C의 돌연변이를 갖는 OL.0)
QGSPPEFLRFPRPVRVVSGAEAELKCVVLGEPPPVVVWEKGGQQLAASERLSFPADGAEHGLLLTAALPTDAGVYVCRARNAAGECYAAAAVTVLEPP (서열번호 61);
> OL.4 (C6E, C26S, C77S 및 V74C의 돌연변이를 갖는 OL.0)
QGSPPEFLRFPRPVRVVSGAEAELKSVVLGEPPPVVVWEKGGQQLAASERLSFPADGAEHGLLLTAALPTDAGCYVSRARNAAGEAYAAAAVTVLEPP (서열번호 62);
> OL.5 (C6E, C26S, C77S 및 G84C의 돌연변이를 갖는 OL.0)
QGSPPEFLRFPRPVRVVSGAEAELKSVVLGEPPPVVVWEKGGQQLAASERLSFPADGAEHGLLLTAALPTDAGVYVSRARNAACEAYAAAAVTVLEPP (서열번호 63);
> OL.6 (C6E, C26S, C77S 및 A86C의 돌연변이를 갖는 OL.0)
QGSPPEFLRFPRPVRVVSGAEAELKSVVLGEPPPVVVWEKGGQQLAASERLSFPADGAEHGLLLTAALPTDAGVYVSRARNAAGECYAAAAVTVLEPP (서열번호 64).
참고: 상기 서열들에서, 이중으로 밑줄 친 부분은 링커 서열을 나타낸다.
CH1/CL이 대체된 항체는 전술한 티틴-T 쇄, 옵스큐린-O 쇄, 및 옵스큐린-유사-O 쇄를 사용하여 구축하였으며(구체적인 대체는 표 5 참조), 상응하는 항원에 대한 최적화 후 돌연변이 항체 각각의 결합 활성을 본 개시내용의 시험예 4의 방법으로 분석하였다. 실험 결과는 표 5에 나타내었다. 결과는 변형된 항체가 우수한 항원-결합 활성을 유지하였음을 보여주었다.
[표 5] 항체에 대한 항원 결합 분석 결과
참고: 예를 들어, 표에서 항체 "F5"는 F0 항체의 중쇄 CH1을 T.1 쇄(서열번호 35)로 대체하고 경쇄 CL을 O.1 쇄(서열번호 42)로 대체하여 수득된 항체를 나타내고, 나머지 부분은 F0과 동일하며; 다른 경우도 마찬가지이다.
또한, 전술한, 돌연변이되거나 도메인-조작된 티틴-T 쇄 및 옵스큐린-O 쇄를 이용하여 CH1/CL이 대체된 항체를 구축하고, CH1/CL이 대체된 다른 항체의 기능적 활성을 본 개시내용의 시험예 2 및 시험예 4의 방법으로 분석하였다. 실험 결과는 표 6에 나타내었다. 실험 결과는 CH1/CL이 대체된 항체가 여전히 우수한 항원 결합 활성을 유지하고 상대적으로 높은 순도 SEC(%)를 가졌음을 보여주었다.
[표 6] 도메인-조작 항체의 순도 및 결합 활성에 대한 분석 결과
참고: 예를 들어, 표에서 항체 "F16"은 F0 항체의 중쇄 CH1을 T.5 쇄(서열번호 39)로 대체하고 경쇄 CL을 O.4 쇄(서열번호 45)로 대체하여 수득된 항체를 나타내고, 다른 부분은 F0와 동일하게 유지되었으며; 다른 경우도 마찬가지이다.
II. 티틴 Ig-유사 152 도메인 및 옵스큐린 Ig-유사 1 도메인의 다른 아미노산에 대한 돌연변이
티틴 Ig-유사 152 도메인 및 옵스큐린 Ig-유사 1 도메인의 아미노산 돌연변이에 대한 구체적인 설계를 표 7에 나타내었다.
[표 7] T.1 쇄/O.9 쇄의 아미노산 돌연변이에 대한 설계
참고: 표에서, 예를 들어, T.7은 T.1(서열번호L 35) 서열에서 M66S 및 T77S의 아미노산 돌연변이에 의해 수득된 티틴-T 쇄를 나타내고; O.23은 O.9(서열번호 50)에 A12S, F13Y, T22S, Q42L, A45T, A67Q, G69S, Q92E 및 D94G의 아미노산 돌연변이 후 N-말단에 "DQPQF" 서열의 부가에 의해 수득된 옵스큐린-O 쇄를 나타내며, 다른 경우도 마찬가지이다.
T.1 쇄 및 O.9 쇄의 돌연변이 서열은 다음과 같다:
> T.7 (M66S 및 T77S 돌연변이를 갖는 T.1)
GIPPKIECLPSDISIDEGKVLTVASAFTGEPTPEVTWSTGGRKIHSQEQGRFHIENTDDLTTLIISDVQKQDGGLYSLSLGNEFGSDSATVNIHIRSI (서열번호 65);
> T.8 (M66K, K70R, S79T, 및 G81R 돌연변이를 갖는 T.1)
GIPPKIECLPSDISIDEGKVLTVASAFTGEPTPEVTWSTGGRKIHSQEQGRFHIENTDDLTTLIIKDVQRQDGGLYTLTLRNEFGSDSATVNIHIRSI (서열번호 66);
> T.9 (P3W, S11I, I13L, T22M, 및 N82M 돌연변이를 갖는 T.1)
GIWPKIECLPIDLSIDEGKVLMVASAFTGEPTPEVTWSTGGRKIHSQEQGRFHIENTDDLTTLIIMDVQKQDGGLYTLSLGMEFGSDSATVNIHIRSI (서열번호 67);
> T.10 (S11I, M66K, S79T, 및 G81R 돌연변이를 갖는 T.1)
GIPPKIECLPIDISIDEGKVLTVASAFTGEPTPEVTWSTGGRKIHSQEQGRFHIENTDDLTTLIIKDVQKQDGGLYTLTLRNEFGSDSATVNIHIRSI (서열번호 68);
> T.11 (G40S, R42K, H45S, Q47E, Q49G, N56S, D58E, L75V, E83D, 및 F84L 돌연변이를 갖는 T.1)
GIPPKIECLPSDISIDEGKVLTVASAFTGEPTPEVTWSTSGKKISSEEGGRFHIESTEDLTTLIIMDVQKQDGGVYTLSLGNDLGSDSATVNIHIRSI (서열번호 69);
> T.12 (Q47E, Q49G, N56S, D58E, 및 L75V의 돌연변이를 갖는 T.1)
GIPPKIECLPSDISIDEGKVLTVASAFTGEPTPEVTWSTGGRKIHSEEGGRFHIESTEDLTTLIIMDVQKQDGGVYTLSLGNEFGSDSATVNIHIRSI (서열번호 70);
> T.13 (N56S, D58E, 및 L75V의 돌연변이를 갖는 T.1)
GIPPKIECLPSDISIDEGKVLTVASAFTGEPTPEVTWSTGGRKIHSQEQGRFHIESTEDLTTLIIMDVQKQDGGVYTLSLGNEFGSDSATVNIHIRSI (서열번호 71);
> T.14 (N56S, D58E, M66S, 및 T77S의 돌연변이를 갖는 T.1)
GIPPKIECLPSDISIDEGKVLTVASAFTGEPTPEVTWSTGGRKIHSQEQGRFHIESTEDLTTLIISDVQKQDGGLYSLSLGNEFGSDSATVNIHIRSI (서열번호 72);
> T.15 (N56S, D58E, M66S, 및 T77S, N-말단 + KAGIR의 돌연변이를 갖는 T.1)
KAGIRGIPPKIECLPSDISIDEGKVLTVASAFTGEPTPEVTWSTGGRKIHSQEQGRFHIESTEDLTTLIISDVQKQDGGLYSLSLGNEFGSDSATVNIHIRSI (서열번호 74);
> T.10-L1 (S11I, M66K, S79T, 및 G81R, + (G4S)1 링커 서열의 돌연변이를 갖는 T.1)
GGGGSGIPPKIECLPIDISIDEGKVLTVASAFTGEPTPEVTWSTGGRKIHSQEQGRFHIENTDDLTTLIIKDVQKQDGGLYTLTLRNEFGSDSATVNIHIRSI (서열번호 73);
> T.15-L1 (N56S, D58E, M66S, 및 T77S, N-말단 + KAGIR, + (G4S)1 링커 서열의 돌연변이를 갖는 T.1)
GGGGSKAGIRGIPPKIECLPSDISIDEGKVLTVASAFTGEPTPEVTWSTGGRKIHSQEQGRFHIESTEDLTTLIISDVQKQDGGLYSLSLGNEFGSDSATVNIHIRSI (서열번호 75);
> T.14-L1 (N56S, D58E, M66S, 및 T77S, + (G4S)1 링커 서열의 돌연변이를 갖는 T.1)
GGGGSGIPPKIECLPSDISIDEGKVLTVASAFTGEPTPEVTWSTGGRKIHSQEQGRFHIESTEDLTTLIISDVQKQDGGLYSLSLGNEFGSDSATVNIHIRSI (서열번호 76);
> O.17 (L11K, A12S, F13Y, V14T, 및 T22S의 돌연변이를 갖는 O.9)
SGAPRFLTRPKSYTVSVGKDASLSSQIVGNPTPQVSWEKDQQPVAAGARFRLAQDGDLYRLKILDLALGDSGQYVSRARNAIGEAFACVGLQVDAEA (서열번호 77);
> O.18 (G2E, V17E, N30D, T32P, Q34E, S36T, V44I, A45T, L58V, K62E, A67Q, G69S, 및 A97G의 돌연변이를 갖는 O.9)
SEAPRFLTRPLAFVVSEGKDATLSSQIVGDPPPEVTWEKDQQPITAGARFRLAQDGDVYRLEILDLQLSDSGQYVSRARNAIGEAFACVGLQVDAEG (서열번호 78);
> O.19 (D20L, T22M, 및 A53L의 돌연변이를 갖는 O.9)
SGAPRFLTRPLAFVVSVGKLAMLSSQIVGNPTPQVSWEKDQQPVAAGARFRLLQDGDLYRLKILDLALGDSGQYVSRARNAIGEAFACVGLQVDAEA (서열번호 79);
> O.20 (Q41K, A45T, A67Q, G69S, 및 V89L의 돌연변이를 갖는 O.9)
SGAPRFLTRPLAFVVSVGKDATLSSQIVGNPTPQVSWEKDKQPVTAGARFRLAQDGDLYRLKILDLQLSDSGQYVSRARNAIGEAFACLGLQVDAEA (서열번호 80);
> O.21 (Q42L, A45T, A67T, G69S, Q92E, 및 D94G의 돌연변이를 갖는 O.9)
SGAPRFLTRPLAFVVSVGKDATLSSQIVGNPTPQVSWEKDQLPVTAGARFRLAQDGDLYRLKILDLTLSDSGQYVSRARNAIGEAFACVGLEVGAEA (서열번호 81);
> O.22 (A12S, F13Y, T22S, Q42L, A45T, A67Q, G69S, Q92E, 및 D94G의 돌연변이를 갖는 O.9)
SGAPRFLTRPLSYVVSVGKDASLSSQIVGNPTPQVSWEKDQLPVTAGARFRLAQDGDLYRLKILDLQLSDSGQYVSRARNAIGEAFACVGLEVGAEA (서열번호 82);
> O.23 (A12S, F13Y, T22S, Q42L, A45T, A67Q, G69S, Q92E, 및 D94G, N-말단 + DQPQF의 돌연변이를 갖는 O.9)
DQPQFSGAPRFLTRPLSYVVSVGKDASLSSQIVGNPTPQVSWEKDQLPVTAGARFRLAQDGDLYRLKILDLQLSDSGQYVSRARNAIGEAFACVGLEVGAEA (서열번호 85);
> O.20-L1 (Q41K, A45T, A67Q, G69S, 및 V89L + (G4S)1 링커 서열의 돌연변이를 갖는 O.9)
GGGGSSGAPRFLTRPLAFVVSVGKDATLSSQIVGNPTPQVSWEKDKQPVTAGARFRLAQDGDLYRLKILDLQLSDSGQYVSRARNAIGEAFACLGLQVDAEA (서열번호 83);
> O.22-L1 (A12S, F13Y, T22S, Q42L, A45T, A67Q, G69S, Q92E, 및 D94G, + (G4S)1 링커 서열의 돌연변이를 갖는 O.9)
GGGGSSGAPRFLTRPLSYVVSVGKDASLSSQIVGNPTPQVSWEKDQLPVTAGARFRLAQDGDLYRLKILDLQLSDSGQYVSRARNAIGEAFACVGLEVGAEA (서열번호 84);
> O.23-L1 (A12S, F13Y, T22S, Q42L, A45T, A67Q, G69S, Q92E, 및 D94G, N-말단 + DQPQF; + (G4S)1 링커 서열의 돌연변이를 갖는 O.9)
GGGGSDQPQFSGAPRFLTRPLSYVVSVGKDASLSSQIVGNPTPQVSWEKDQLPVTAGARFRLAQDGDLYRLKILDLQLSDSGQYVSRARNAIGEAFACVGLEVGAEA (서열번호 86).
참고: 상기 서열에서, 이중으로 밑줄친 부분은 링커 서열을 나타낸다.
CH1/CL이 대체된 항체는 돌연변이되거나 도메인-조작된 티틴-T 쇄 및 옵스큐린-O 쇄를 이용하여 구축하였고, CH1/CL이 대체된 항체의 항원에 대한 결합 활성은 본 개시내용의 시험예 4의 방법으로 분석하였다. 실험 결과는 표 8에 나타내었다. 결과는 CH1/CL이 티틴-T 쇄/옵스큐린-O 쇄로 대체된 후에도 항체가 여전히 우수한 항원-결합 활성을 유지하였음을 보여주었다.
[표 8] 항체에 대한 항원 결합 분석 결과
참고: 표에서, 예를 들어, 표 중의 항체 "B1"은 B0 항체의 중쇄 CH1을 T.1 쇄(서열번호 35)로 대체하고 경쇄 CL을 O.9 쇄(서열번호 50)로 대체하여 수득된 항체를 나타내고, 다른 부분은 B0의 부분과 동일하며; 다른 경우도 마찬가지이다.
또한, 본 개시내용의 시험예 1의 방법으로 도메인-조작 항체의 단백질 발현 수준을 분석하였다. 실험 결과는 표 9에 나타내었다. 결과는 티틴-T 쇄/옵스큐린-O 쇄의 일부 아미노산 돌연변이에 의해 항체의 발현 수준이 크게 향상되었음을 보여주었다.
[표 9] CH1/CL 도메인-조작 항체의 발현 수준
참고: 표에서, 예를 들어, 표 중의 항체 "B1"은 B0 항체의 중쇄 CH1을 T.1 쇄(서열번호 35)로 대체하고 경쇄 CL을 O.9 쇄(서열번호 50)로 대체하여 수득된 항체를 나타내고, 다른 부분은 B0의 부분과 동일하며; 다른 경우도 마찬가지이다.
III. 신규 티틴-T 쇄/옵스큐린-O 쇄
1. 티틴-T 쇄/옵스큐린-O 쇄의 아미노산 돌연변이 설계
T.10/O.20에 기초하여 티틴-T 쇄/옵스큐린-O 쇄에 다음의 돌연변이를 수행하였다. 구체적인 아미노산 돌연변이는 표 10에 나타내었다:
[표 10] 티틴-T 쇄/옵스큐린-O 쇄의 아미노산 돌연변이에 대한 설계
참고: 예를 들어, 표에서 T.16은 T.10(서열번호 68)에서 L60S 및 I64T의 아미노산 잔기 치환을 수행하여 형성된 티틴-T 쇄를 나타내며; 다른 경우도 마찬가지이다.
아미노산 잔기 치환 후의 티틴-T 쇄/옵스큐린-O 쇄의 서열은 다음과 같다:
> T.16 (L60S 및 I64T의 돌연변이를 갖는 T.10)
GIPPKIECLPIDISIDEGKVLTVASAFTGEPTPEVTWSTGGRKIHSQEQGRFHIENTDDSTTLTIKDVQKQDGGLYTLTLRNEFGSDSATVNIHIRSI (서열번호 129)
> T.17 (V20C, L60S 및 I64T의 돌연변이를 갖는 T.10)
GIPPKIECLPIDISIDEGKCLTVASAFTGEPTPEVTWSTGGRKIHSQEQGRFHIENTDDSTTLTIKDVQKQDGGLYTLTLRNEFGSDSATVNIHIRSI (서열번호 130)
> T.18 (A26C, L60S, 및 I64T의 돌연변이를 갖는 T.10)
GIPPKIECLPIDISIDEGKVLTVASCFTGEPTPEVTWSTGGRKIHSQEQGRFHIENTDDSTTLTIKDVQKQDGGLYTLTLRNEFGSDSATVNIHIRSI (서열번호 131)
> O.24 (L11K, T32F, 및 A48V의 돌연변이를 갖는 O.20)
SGAPRFLTRPKAFVVSVGKDATLSSQIVGNPFPQVSWEKDKQPVTAGVRFRLAQDGDLYRLKILDLQLSDSGQYVSRARNAIGEAFACLGLQVDAEA (서열번호 132)
> O.25 (L11K, F13S, T32F, A48V, 및 I82H의 돌연변이를 갖는 O.20)
SGAPRFLTRPKASVVSVGKDATLSSQIVGNPFPQVSWEKDKQPVTAGVRFRLAQDGDLYRLKILDLQLSDSGQYVSRARNAHGEAFACLGLQVDAEA (서열번호 133)
> O.26 (A3C, L11K, F13S, T32F, A48V, 및 I82H의 돌연변이를 갖는 O.20)
SGCPRFLTRPKASVVSVGKDATLSSQIVGNPFPQVSWEKDKQPVTAGVRFRLAQDGDLYRLKILDLQLSDSGQYVSRARNAHGEAFACLGLQVDAEA (서열번호 134)
> O.27 (R9C, L11K, F13S, T32F, A48V, 및 I82H의 돌연변이를 갖는 O.20)
SGAPRFLTCPKASVVSVGKDATLSSQIVGNPFPQVSWEKDKQPVTAGVRFRLAQDGDLYRLKILDLQLSDSGQYVSRARNAHGEAFACLGLQVDAEA (서열번호 135)
> O.28 (S25C, S76C, L11K, F13S, T32F, A48V, 및 I82H의 돌연변이를 갖는 O.20)
SGAPRFLTRPKASVVSVGKDATLSCQIVGNPFPQVSWEKDKQPVTAGVRFRLAQDGDLYRLKILDLQLSDSGQYVCRARNAHGEAFACLGLQVDAEA (서열번호 136)
> O.29 (A3C, S25C, S76C, L11K, F13S, T32F, A48V, 및 I82H의 돌연변이를 갖는 O.20)
SGCPRFLTRPKASVVSVGKDATLSCQIVGNPFPQVSWEKDKQPVTAGVRFRLAQDGDLYRLKILDLQLSDSGQYVCRARNAHGEAFACLGLQVDAEA (서열번호 137)
> O.30 (R9C, S25C, S76C, L11K, F13S, T32F, A48V, 및 I82H의 돌연변이를 갖는 O.20)
SGAPRFLTCPKASVVSVGKDATLSCQIVGNPFPQVSWEKDKQPVTAGVRFRLAQDGDLYRLKILDLQLSDSGQYVCRARNAHGEAFACLGLQVDAEA (서열번호 138)
> O.31 (L66C, V93C, L11K, F13S, T32F, A48V, 및 I82H의 돌연변이를 갖는 O.20)
SGAPRFLTRPKASVVSVGKDATLSSQIVGNPFPQVSWEKDKQPVTAGVRFRLAQDGDLYRLKILDCQLSDSGQYVSRARNAHGEAFACLGLQCDAEA (서열번호 139)
> O.32 (A3C, L66C, V93C, L11K, F13S, T32F, A48V, 및 I82H의 돌연변이를 갖는 O.20)
SGCPRFLTRPKASVVSVGKDATLSSQIVGNPFPQVSWEKDKQPVTAGVRFRLAQDGDLYRLKILDCQLSDSGQYVSRARNAHGEAFACLGLQCDAEA (서열번호 140)
> O.33 (R9C, L66C, V93C, L11K, F13S, T32F, A48V, 및 I82H의 돌연변이를 갖는 O.20)
SGAPRFLTCPKASVVSVGKDATLSSQIVGNPFPQVSWEKDKQPVTAGVRFRLAQDGDLYRLKILDCQLSDSGQYVSRARNAHGEAFACLGLQCDAEA (서열번호 141)
2. 티틴-T 쇄/옵스큐린-O 쇄에 의해 구축된 DI 이중특이성 항체 및 분석
hNGF 및 hRANKL에 대한 DI 이중특이성 항체의 구축: 하기에 기재된 바와 같은 제1 중쇄, 제2 중쇄, 제1 경쇄 및 제2 경쇄를 포함하는 DI-2 내지 DI-20:
제1 중쇄는 N-말단에서 C-말단의 순서로 [VH1]-[링커 1]-[옵스큐린-O 쇄]-[링커 3]-[Fc1]을 포함하고,
제1 경쇄는 N-말단에서 C-말단의 순서로 [VL1]-[링커 2]-[티틴-T 쇄]를 포함하고,
제2 중쇄는 N-말단에서 C-말단의 순서로 [VH2]-[CH1]-[Fc2]를 포함하고,
제2 경쇄는 N-말단에서 C-말단의 순서로 [VL2]-[CL]을 포함하며;
여기서, VH1 및 VL1은 I0의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역이고, VH2 및 VL2는 D0의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역이고, VH1은 서열번호 26에 제시된 아미노산 서열을 가지고, VL1은 서열번호 27에 제시된 아미노산 서열을 가지고, VH2는 서열번호 24에 제시된 아미노산 서열을 가지고, VL2는 서열번호 25에 제시된 아미노산 서열을 가지며; Fc1(서열번호 177에 제시된 아미노산 서열을 가짐)은 홀 돌연변이를 함유하는 IgG1의 Fc의 제1 서브유닛이고, Fc2(서열번호 178에 제시된 아미노산 서열을 가짐)는 놉 돌연변이를 함유하는 IgG1의 제2 서브유닛이며; CH1은 서열번호 179에 제시된 아미노산 서열을 가지고, CL은 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 가지며; 옵스큐린-O 쇄의 N-말단은 링커 1을 통해 VH1에 연결되고, 옵스큐린-O 쇄의 C-말단은 결합(즉, 링커 3은 결합임)을 통해 Fc1에 연결되며, 티틴-T 쇄의 N-말단은 링커 2를 통해 VL1에 연결된다. 본 실시예의 상이한 DI 이중특이성 항체의 옵스큐린-O 쇄/티틴-T 쇄, 링커 1 및 링커 2의 구조를 표 11에 나타내었다.
[표 11] DI 이중특이성 항체의 옵스큐린-O 쇄/티틴-T 쇄 및 링커
본 개시내용의 시험예 4의 방법으로 이중특이성 항체 DI-2 내지 DI-20의 그 항원에 대한 결합 활성을 분석하였다. 또한, 열안정성 시험을 DI-2, DI-4 내지 DI-8, DI-10 내지 DI-16, 및 DI-20에 다음의 방법으로 수행하였다: 항체를 PBS 용액으로 각각 5 mg/mL의 농도로 희석하고, Unit(부하량: 9 μL, 매개변수 설정: 시작 온도: 20℃; 배양: 0초; 속도: 0.3℃/분; 플레이트 유지: 5초; 종료 온도: 95℃)를 사용하여 열 안정성에 대해 시험하였다. 실험 결과는 표 12 및 13에 나타내었다. 실험 결과는 변형된 이중특이성 항체의 항원에 대한 결합 활성이 크게 변하지 않았으며; 한편으로, DI-4 내지 DI-8, DI-10 내지 DI-16, DI-20은 DI-2에 비해 Tm1(℃)과 Tonset(℃)이 크게 향상되어 이중특이성 항체가 더 우수한 열 안정성을 가짐을 보여주었다.
[표 12] DI 이중특이성 항체에 대한 결합 활성 분석
[표 13] DI 이중특이성 항체에 대한 열 안정성 시험 결과
또한, DI 이중특이성 항체의 용액을 pH 5.5의 10 mM 아세트산 및 9% 슈크로스를 함유하는 완충액을 사용하여 제형화하고(자세한 내용은 표 14 참조), 용액을 40℃의 배양기에서 4주 동안 배양하였다. 4주차에 배양 종료 후, 이중특이성 항체를 배양 시작때의 농도로 농축하고, 용액의 침전을 관찰하였다. 실험 결과는 하기 표 14에 나타내었다. 실험 결과는 DI-2 이중특이성 항체 군의 용액에서는 침전이 발생하였으므로, DI-3 내지 DI-7이 DI-2보다 더 우수한 안정성을 가짐을 보여주었다.
[표 14] DI 이중특이성 항체 용액의 침전
3. 티틴-T 쇄/옵스큐린-O 쇄에 의해 구축된 PL 이중특이성 항체 및 분석
hPDL1 및 hCTLA4에 대한 PL 이중특이성 항체의 구축: 하기에 기재된 바와 같은 제1 중쇄, 제2 중쇄, 제1 경쇄 및 제2 경쇄를 포함하는 PL-1 내지 PL-19:
제1 중쇄는 N-말단에서 C-말단의 순서로 [VH1]-[링커 1]-[옵스큐린-O 쇄]-[링커 3]-[Fc1]을 포함하고,
제1 경쇄는 N-말단에서 C-말단의 순서로 [VL1]-[링커 2]-[티틴-T 쇄]를 포함하고,
제2 중쇄는 N-말단에서 C-말단의 순서로 [VH2]-[CH1]-[Fc2]를 포함하고,
제2 경쇄는 N-말단에서 C-말단의 순서로 [VL2]-[CL]을 포함하며;
여기서, VH1 및 VL1은 P0 항체(즉, WO2020177733A1호의 h1831K 항체)의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역이고, VH2 및 VL2는 L0 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역이고, VH1은 서열번호 156에 제시된 아미노산 서열을 가지고, VL1은 서열번호 155에 제시된 아미노산 서열을 가지고, VH2는 서열번호 169에 제시된 아미노산 서열을 가지고, VL2는 서열번호 170에 제시된 아미노산 서열을 가지며; Fc1(서열번호 178에 제시된 아미노산 서열을 가짐)은 놉 돌연변이를 함유하는 IgG1의 Fc의 제1 서브유닛이고, Fc2(서열번호 177에 제시된 아미노산 서열을 가짐)는 홀 돌연변이를 함유하는 IgG1의 Fc의 제2 서브유닛이며; CH1은 서열번호 179에 제시된 아미노산 서열을 가지고, CL은 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 가지며; 옵스큐린-O 쇄의 N-말단은 링커 1을 통해 VH1에 연결되고, 옵스큐린-O 쇄의 C-말단은 결합(즉, 링커 3은 결합임)을 통해 Fc1에 직접 연결되며, 티틴-T 쇄의 N-말단은 링커 2를 통해 VL1에 연결된다. 상이한 PL 이중특이성 항체의 옵스큐린-O 쇄/티틴-T 쇄, 링커 1 및 링커 2의 구조를 표 15에 나타내었다.
[표 15] PL 이중특이성 항체의 옵스큐린-O 쇄/티틴-T 쇄 및 링커
항-CTLA-4 항체 이필리무맙(Ipilimumab)(L0로 약칭, 상품명: Yervoy)의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역은 다음과 같다:
L0의 중쇄 가변 영역:
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYTMHWVRQAPGKGLEWVTFISYDGNNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAIYYCARTGWLGPFDYWGQGTLVTVSS (서열번호 169)
L0의 경쇄 가변 영역:
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVGSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGAFSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPWTFGQGTKVEIK (서열번호 170)
PL-1의 4개 쇄들의 서열은 다음과 같이 나타낸다:
PL-1의 제1 중쇄의 아미노산 서열:
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWMGRITPSSGFAMYNEKFKNRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGGSSYDYFDYWGQGTTVTVSSGGGGSSGAPRFLTRPLAFVVSVGKDATLSSQIVGNPTPQVSWEKDKQPVTAGARFRLAQDGDLYRLKILDLQLSDSGQYVSRARNAIGEAFACLGLQVDAEADKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호 142)
PL-1의 제1 경쇄의 아미노산 서열:
DIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASESVSIHGTHLMHWYQQKPGQPPKLLIYAASKLESGVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEAEDTANYYCQQSFEDPLTFGQGTKLEIKGGGGSGIPPKIECLPIDISIDEGKVLTVASAFTGEPTPEVTWSTGGRKIHSQEQGRFHIENTDDLTTLIIKDVQKQDGGLYTLTLRNEFGSDSATVNIHIRSI (서열번호 143)
PL-1의 제2 중쇄의 아미노산 서열:
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYTMHWVRQAPGKGLEWVTFISYDGNNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAIYYCARTGWLGPFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호 144)
PL-1의 제2 경쇄의 아미노산 서열:
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVGSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGAFSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호 145)
참고: 상기 서열에서, 굵은 부분은 가변 영역을 나타내고, 점으로 밑줄친 부분은 Fc 부분을 나타내며, 물결선 부분은 CH1을 나타내고, 점선으로 밑줄친 부분은 CL을 나타내고, 이중으로 밑줄친 부분은 링커를 나타내며, 단일 밑줄친 부분은 옵스큐린-O 쇄/티틴-T 쇄를 나타낸다.
PL 이중특이성 항체의 결합 활성은 본 개시내용의 시험예 4의 ELISA 분석으로 시험하였다(여기서, hPDL1 및 hCTLA4 항원은 Sino biology에서 구입하였다). 또한, 하기의 과정으로 고처리량 시차 주사 형광측정법(UN쇄ED, 사양: Unit)을 이용하여 PL 이중특이성 항체에 열안정성 시험을 수행하였다: PBS(포스페이트 완충 식염수) 용액에 희석된 각각의 샘플 9 μL(PL 이중특이성 항체 농도: 1.4 내지 3 mg/mL)를 다음과 같은 매개변수 설정: 시작 온도: 25℃, 배양: 180초, 속도: 0.3℃/분, 플레이트 유지: 3초, 종료 온도: 95℃로 샘플 웰에 부하하고, 기기를 작동시켰다. 실험 결과는 Uncle Analysis 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.
실험 결과는 표 16 및 17에 나타내었다. 실험 결과는 신규 티틴-T 쇄/옵스큐린-O 쇄로 구축된 PL 이중특이성 항체가 여전히 항원에 대한 우수한 결합 활성을 가졌으며; 한편으로, PL-2 내지 PL-19는 PL-1에 비해 상당히 개선된 Tm1(℃), Tagg 266(℃) 및 Tonset(℃)을 가지므로, 이중특이성 항체가 더 우수한 열 안정성을 가짐을 보여주었다.
[표 16] PL 이중특이성 항체에 대한 항원 결합 분석 결과
[표 17] PL 이중특이성 항체에 대한 열안정성 시험 결과
4. 티틴-T 쇄/옵스큐린-O 쇄로 구축된 HJ 이중특이성 항체 및 분석
hIL5 및 hTSLP에 대한 HJ 이중특이성 항체의 구축: 하기에 기재된 바와 같은 제1 중쇄, 제2 중쇄, 제1 경쇄 및 제2 경쇄를 포함하는 HJ-3 내지 HJ-11:
제1 중쇄는 N-말단에서 C-말단의 순서로 [VH1]-[링커 1]-[티틴-T 쇄]-[링커 3]-[Fc1]을 포함하고,
제1 경쇄는 N-말단에서 C-말단의 순서로 [VL1]-[링커 2]-[옵스큐린-O 쇄]를 포함하고,
제2 중쇄는 N-말단에서 C-말단의 순서로 [VH2]-[CH1]-[Fc2]를 포함하고,
제2 경쇄는 N-말단에서 C-말단의 순서로 [VL2]-[CL]을 포함하며;
여기서, VH1 및 VL1은 H0 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역이고, VH2 및 VL2는 J1 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역이고, VH1은 서열번호 16에 제시된 아미노산 서열을 가지고, VL1은 서열번호 17에 제시된 아미노산 서열을 가지고, VH2는 서열번호 171에 제시된 아미노산 서열을 가지고, VL2는 서열번호 172에 제시된 아미노산 서열을 가지며; Fc1(서열번호 178에 제시된 아미노산 서열을 가짐)은 놉 돌연변이를 함유하는 IgG1의 Fc의 제1 서브유닛이고, Fc2(서열번호 177에 제시된 아미노산 서열을 가짐)는 홀 돌연변이를 함유하는 IgG1의 Fc의 제2 서브유닛이며; CH1은 서열번호 179에 제시된 아미노산 서열을 가지고, CL은 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 가지며; 티틴-T 쇄의 N-말단은 링커 1을 통해 VH1에 연결되고, 티틴-T 쇄의 C-말단은 결합(즉, 링커 3은 결합임)을 통해 Fc1에 직접 연결되며. 옵스큐린-O의 N-말단은 링커 2를 통해 VL1에 연결된다. 상이한 HJ 이중특이성 항체들의 티틴-T 쇄/옵스큐린-O 쇄, 링커 1 및 링커 2의 구조를 표 18에 나타내었다.
[표 18] HJ 이중특이성 항체의 옵스큐린-O 쇄/티틴-T 쇄 및 링커
hIL5 및 hTSLP 항원에 대한 이중특이성 항체 HJ-3, 및 HJ-5 내지 HJ-11의 결합 활성을 본 개시내용의 시험예 4의 방법으로 분석하였다. 또한, 열 안정성 시험을 하기의 과정으로 이중특이성 항체에 수행하였다: HJ 이중특이성 항체의 희석물을 pH 5.5의 10 mM 아세트산 및 9% 슈크로스를 함유하는 완충액을 사용하여 제형화하였고; 이중특이성 항체를 한외여과 및 농축에 의해 농축하여 HJ 이중특이성 항체의 상이한 농도의 용액(HJ 이중특이성 항체 농도는 표 19-2에 나타냄)을 수득하였고; 농축된 용액을 40℃의 배양기에서 배양하고, 샘플을 제0일(즉, 40℃에서 배양 시작 전, D0), 제7일(40℃에서 배양 7일째, D7), 제14일(40℃에서 배양 14일째, D14), 제21일(40℃에서 배양 21일째, D21) 및 제28일(40℃에서 배양 28일째, D28)에 SEC 순도에 대해 시험하였으며; 40℃에서 28일간 배양한 후, 비환원 CE-SDS 순도 측정을 위해 샘플을 즉시 채취하였다.
실험 결과는 하기 표 19-1 및 19-2에 나타내었다. 실험 결과는 본 개시내용에서 구축된 HJ 이중특이성 항체의 항원에 대한 결합 활성이 크게 변하지 않았으며; 한편으로, HJ-5 내지 HJ-11 이중특이성 항체가 HJ-3보다 우수한 열 안정성을 가짐을 보여주었다.
[표 19-1] HJ 이중특이성 항체에 대한 결합 활성 분석
[표 19-2] HJ 이중특이성 항체에 대한 가속화 안정성 시험 결과
참고: D28 △ SEC 순도(%) = D0 SEC 순도(%) - D28 SEC 순도(%)
실시예 4. CH1/CL 도메인-조작 항체의 반감기
항체의 CH1/CL이 티틴-T 쇄/옵스큐린-O 쇄 또는 티틴-T 쇄/옵스큐린-유사-O 쇄로 대체된 후 동물에서 항체의 안정성이 영향을 받았는지 평가하기 위해, CH1/CL 대체 전과 후에 래트에서 항체의 반감기를 측정하였다. 예시적으로, F0 항체의 CH1/CL이 T.1/O.9로 대체된 항체 F20 및 C0 항체의 CH1/CL이 T.1/O.9로 대체된 항체 C3의 래트에서의 반감기를 측정하였다. 구체적인 절차는 다음과 같았다:
3 mpk의 항체를 래트에게 정맥내 투여하였고, 항응고제 없이, 투여 후 5분, 8시간, 1일, 2일, 4일, 7일, 10일, 14일, 21일 및 28일에 전혈 0.3 mL를 수집하였다. 채혈 후, 혈액을 4℃에서 30분간 방치하고 1000 g에서 15분간 원심분리하고, 상등액(혈청)을 EP 튜브에 넣어 -80℃에서 저장하였다. 각 시점에서 항체 약물 농도 분석 방법은 샌드위치 ELISA였다. 구체적으로, ELISA 플레이트를 상응하는 항원으로 코팅하고, 4℃에서 밤새 배양한 다음, 세척 완충액으로 세척하고, 차단 완충액을 첨가하고, 플레이트를 실온에서 1 내지 3시간 동안 배양한 다음, 세척 완충액으로 세척하였으며; 100 μL의 표준 또는 시험 혈청 샘플을 첨가하고, 플레이트를 37℃에서 3시간 동안 배양한 다음 세척 완충액으로 세척하였고; 미리 흡수된 2차 항체 항-인간 IgG FC(HRP) 마우스(Abcam, Cat. No. ab98624, 1:10000 희석)를 첨가하고, 플레이트를 37℃에서 1 내지 1.5시간 동안 배양한 다음, 완충액으로 세척하였고; TMB를 첨가하고, 플레이트를 실온에서 어두운 상태에서 10분 동안 배양하였고; 정지 완충액을 첨가하고, OD450 값을 판독하였다.
실험 결과는 표 20에 나타내었다. 결과는 항체의 CH1/CL을 티틴-T 쇄/옵스큐린-O 쇄로 대체한 후에도 항체가 여전히 래트에서 원래 항체와 동일한 반감기를 유지하여 CH1/CL이 대체된 후의 항체가 원래의 항체만큼 생체내에서 우수한 안정성을 가졌음을 보여주었다.
[표 20] CH1/CL 도메인이 대체된 항체의 반감기
실시예 5: 이중특이성 항체의 구축 및 검출
제1 항원에 결합하는 항체 및 제2 항원 A에 결합하는 항체를 이용하여 중첩 신장(overlap extension) PCR에 의해 이중특이성 항체를 구축하였다. 예시적으로, 다양한 이중특이성 항체가 구축되었다.
I. 이중특이성 항체의 구축
먼저, D0 항체의 1개의 중쇄(Fc 영역에 놉 변형 함유) 및 1개의 경쇄, 및 도메인-조작 I0 항체(CH1/CL이 티틴-T 쇄/옵스큐린-O 쇄로 대체되고 Fc 영역은 홀 변형을 포함함)의 1개의 중쇄 및 1개의 경쇄를 포함하는 DI-1 이중특이성 항체를 구축하였다. DI-1 이중특이성 항체는 IgG-유사 이중특이성 항체이며, 개략적인 구조도를 도 5에 나타내었으며, DI-1의 4개 쇄의 서열은 다음과 같다:
DI-1 쇄 1의 아미노산 서열(DI-1-H1):
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSGITGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPGTTVIMSWFDPWGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK GQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호 87).
참고: 서열에서, 굵은 부분은 D0의 VH를 나타내고, 단일 밑줄친 부분은 CH1을 나타내고, 점으로 밑줄친 부분은 CH2를 나타내고, 이탤릭체 부분은 CH3을 나타낸다.
DI-1 쇄 2의 아미노산 서열(DI-1-L1):
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVRGRYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVFYCQQYGSSPRTFGQGTKVEIK RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호 88).
참고: 서열에서, 굵은 부분은 D0의 VL을 나타내고, 단일 밑줄친 부분은 D0의 경쇄 불변 영역 CL을 나타낸다.
DI-1 쇄 3의 아미노산 서열(DI-1-H2):
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLIGYDLNWIRQPPGKGLEWIGIIWGDGTTDYNSAVKSRVTISKDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGGYWYATSYYFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGIPPKIECLPIDISIDEGKVLTVASAFTGEPTPEVTWSTGGRKIHSQEQGRFHIENTDDLTTLIIKDVQKQDGGLYTLTLRNEFGSDSATVNIHIRSIDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK GQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호 89).
참고: 서열에서, 굵은 부분은 I0의 VH를 나타내고, 단일 밑줄친 부분은 T.10을 나타내고, 이중으로 밑줄친 부분은 링커 서열을 나타내며, 점으로 밑줄친 부분은 CH2를 나타내고, 이탤릭체 부분은 CH3을 나타내고, 이중으로 밑줄친 부분은 링커 서열을 나타낸다.
DI-1 쇄 4의 아미노산 서열(DI-1-L2):
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISNNLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRFHSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQEHTLPYTFGQGTKLEIKGGGGSSGAPRFLTRPLAFVVSVGKDATLSSQIVGNPTPQVSWEKDKQPVTAGARFRLAQDGDLYRLKILDLQLSDSGQYVSRARNAIGEAFACLGLQVDAEA (서열번호 90).
참고: 서열에서, 굵은 부분은 I0의 VL을 나타내고, 단일 밑줄친 부분은 O.20을 나타내며, 이중으로 밑줄친 부분은 링커 서열을 나타낸다.
또한, B0로부터 또는 B0 및 U0의 도메인-조작 항체로부터 또는 U0의 도메인-조작 항체로부터 IgG-유사 BU 이중특이성 항체를 구축하였다(예시적으로, BU5의 개략적인 구조도를 도 8에 나타내었다). 수득된 이중특이성 항체의 4개 쇄의 서열은 하기 표 21에 나타내었다:
[표 21] IgG-유사 BU 이중특이성 항체의 서열 목록
참고: 서열에서, 굵은 부분은 가변 영역 서열을 나타내고, 단일 밑줄친 부분은 CH1 또는 티틴-T 쇄를 나타내며, 점으로 밑줄친 부분은 CH2를 나타내고, 이탤릭체 부분은 CH3을 나타내고, 이중으로 밑줄친 부분은 CL 또는 옵스큐린-O 쇄를 나타내고, 점선으로 밑줄친 부분은 링커 L1을 나타낸다.
또한, FA-1 이중특이성 항체를 구축하였다. FA-1 이중특이성 항체는 A0 항체의 중쇄(Fc 영역에 놉 변형) 및 경쇄, 및 F0 도메인-조작 항체의 중쇄(Fc 영역에 홀 변형, CH1을 T.10-L1로 대체) 및 경쇄(CL을 O.20-L1로 대체)로 이루어진 IgG-유사 FA-1 이중특이성 항체이다. FA-1의 4개 쇄의 서열을 하기 표 22에 나타내었다.
FA-1의 쇄 1(F0의 중쇄 CH1이 T.10-L1로 대체되고 Fc 영역은 놉 변형을 포함함):
QVQLVQSGGGVVQPGTSLRLSCAASGFIFSSSAMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYVDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSARLYASFDYWGQGALVTVSSGGGGSGIPPKIECLPIDISIDEGKVLTVASAFTGEPTPEVTWSTGGRKIHSQEQGRFHIENTDDLTTLIIKDVQKQDGGLYTLTLRNEFGSDSATVNIHIRSIDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK GQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호 107)
FA-1의 쇄 2(F0의 경쇄 CL이 O.20-L1로 대체됨):
DTVVTQEPSFSVSPGGTVTLTCGLSSGSVSTSHYPSWYQQTPGQAPRMLIYNTNTRSSGVPDRFSGSILGNKAALTITGAQADDESDYYCAIHVDRDIWVFGGGTKLTVLGGGGSSGAPRFLTRPLAFVVSVGKDATLSSQIVGNPTPQVSWEKDKQPVTAGARFRLAQDGDLYRLKILDLQLSDSGQYVSRARNAIGEAFACLGLQVDAEA (서열번호 108)
FA-1의 쇄 3(A0의 중쇄가 놉 변형을 포함함):
EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNEYISYWAYWGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK GQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호 109)
FA-1의 쇄 4 (A0의 경쇄):
QTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호 110)
참고: 상기 서열에서, 굵은 부분은 가변 영역 서열을 나타내고, 단일 밑줄친 부분은 CH1 또는 티틴-T 쇄를 나타내며, 점으로 밑줄친 부분은 CH2를 나타내고, 이탤릭체 부분은 CH3를 나타내고, 이중으로 밑줄친 부분은 CL 또는 옵스큐린-O 쇄를 나타내며, 점선으로 밑줄친 부분은 링커 L1을 나타낸다.
II. 이중특이성 항체의 검출
본 개시내용의 시험예 3의 방법으로 DI-1을 검출하고, DI-1의 4개 쇄를 세포에 동시-형질감염시켜 발현시킨 다음 질량 분석을 실시하였다. 실험 결과는 표 22 및 도 6a 내지 6c에 나타내었다. 질량 분석 결과는 동종이량체 및 불일치 분자가 검출되지 않았으며, 즉 DI-1이 정확하게 구성되었음을 보여주었다.
[표 22] DI-1에 대한 질량 분석 데이터
또한, 본 개시내용의 시험예 3 및 시험예 2의 방법으로 BU5의 발현을 검출하였다. 먼저, B0 및 U0를 대조군으로 하여, 이중특이성 항체의 발현을 위해 BU5의 4개 쇄를 세포 내로 동시-형질감염시켰다. 그런 다음, 발현 생성물에 순도 측정 및 질량 분석을 실시하였다. 실험 결과는 표 23 및 도 9a 내지 9c에 나타내었다. 실험 결과는 이중특이성 항체 BU5가 성공적으로 발현되었으며, BU5의 4개 쇄가 불일치 없이 표적 분자에 성공적으로 구성되었음을 보여주었다. 이중특이성 항체 BU5는 SEC%가 88%로 높은 순도를 나타내었다.
[표 23] BU5에 대한 질량 분석 결과
참고: 표에서, "√"는 정확한 쌍(pairing)을 나타낸다.
또한, 구축된 BU1 내지 BU4 이중특이성 항체를 본 개시내용의 시험예 2 및 시험예 4의 방법으로 순도 및 항원 결합 활성에 대해 검출하였다. 실험 결과는 표 24에 나타내었다. 실험 결과는 CH1/CL이 대체된 이중특이성 항체가 여전히 우수한 항원 결합 활성을 유지하였고 높은 항체 순도를 가졌음을 보여주었다.
[표 24] 항체의 항원 결합 활성 및 순도에 대한 검출 결과
시험예
시험예 1: 항체의 발현 수준 측정 방법
HEK293E 세포를 단일클론 항체 또는 이중특이성 항체의 발현 플라스미드로 형질감염시키고, 6일 후 발현 상등액을 수집하고 고속으로 원심분리하여 불순물을 제거하였다. 상등액을 각각 단백질 A 컬럼(GE Healthcare)을 사용하여 정제하였다. A280 판독값이 기준선으로 떨어질 때까지 컬럼을 PBS로 세척하고, 컬럼을 100 mM 아세테이트 완충액(pH 3.5)으로 세척하고 1M 트리스-HCl, pH 8.0으로 중화시켰다. 최종 정제에 의해 수득된 항체의 양/발현량으로부터 항체의 발현 수준을 정량하였다.
시험예 2: 항체의 순도 검출 방법
항체 순도는 SEC-HPLC를 사용하여 모니터링하였다. Waters Xbridge BEH 200A SEC 컬럼을 적용한 Waters e2695 크로마토그래피를 사용하여 기기 작동 지침에 따라 검출을 수행하고, PBS를 이동상으로 취하고(묽은 염산을 사용하여 pH를 6.8로 조정함), 100 μg의 단백질을 주입하고, 0.5 mL/분의 유량으로 구배 용출을 수행하였다. 항체의 순도는 전체 피크 면적에 대한 주 피크의 피크 면적의 백분율(SEC(%))로 나타내었다.
시험예 3: 질량 분석에 의한 항체 검출 방법
(I) 샘플 준비:
1. 탈글리코실화된 온전한 분자량의 측정: 발현된 항체 30 μg을 취하고 동결건조한 후 10 μL의 8 M Gua-HCl을 첨가하고, 혼합물을 70℃ 수조에서 10분간 변성시켰다. 90 μL의 증류수를 첨가하고, 그로부터 30 μL를 취하고, 0.8 μL의 PNG 효소 F(펩티드 N-글리코시다제 F)를 첨가하고, 혼합물을 37℃의 수조에서 2시간 동안 배양하였다. 탈글리코실화된 온전한 분자량을 측정하기 위해 생성물 0.5 μg을 취하였다.
2. 탈클리코실화된 환원 분자량의 측정: 발현된 항체 30 μg을 취하고 동결건조한 후 10 μL의 8 M Gua-HCl을 첨가하고, 혼합물을 70℃ 수조에서 10분간 변성시켰다. 90 μL의 증류수를 첨가하고 그로부터 30 μL를 취한 후 0.8 μL의 PNG 효소 F(펩타이드 N-글리코시다제 F)를 첨가하고, 그로부터 30 μL를 취하고, 0.8 μL의 PNG 효소 F(펩티드 N-글리코시다제 F)를 첨가하고, 혼합물을 37℃의 수조에서 2시간 동안 환원시켰다. 이어서, 2 μL의 0.025 M DTT를 첨가하고, 혼합물을 70℃의 수조에서 10분간 환원시켰다. 탈글리코실화된 환원된 분자량을 측정하기 위해 생성물 0.5 μg을 취하였다.
(II) 크로마토그래피-질량 분석 조건:
크로마토그래피 조건:
크로마토그래피 컬럼: Poroshell 300SB-C8 5 μm 2.1 × 75 mm
이동상: A: 0.1% HCOOH/H2O B: 0.1% HCOOH/CAN
컬럼 온도: 75℃
구배: 표 25 참조.
[표 25] 크로마토그래피 구배
질량 분석 조건:
질량 분석기: Agilent 6530 Q-TOF LC-MS
이온화 모드 ESI
획득 모드: 1GHz(질량 범위: 500 내지 5000 m/z)
건조 가스 온도: 325℃
건조 가스 유량: 10 L/분
분무기: 40 psi
피복 가스 온도: 350℃
피복 가스 유량: 12 L/분
스프레이 전압: 500 V
모세관 전압: 3,500 V
절단 전압: 200 V
스키머 전압: 65 V
RF 전압: 7500 V
시험 항체에 질량 분석을 실시하였다. 실험 결과는 CH1/CL을 티틴-T/옵스큐린-O로 대체한 후에도 항체가 정확하게 구성된 상태로 유지된 것을 보여주었다.
시험예 4: 항체 결합 활성의 검출 방법
막 단백질 표적에 대한 항체의 항원에 대한 결합 활성은 FACS로 검출할 수 있다. 예를 들어, C0, N0, F0, V0, S0, 및 이들의 CH1/CL 도메인-조작 항체는 FACS로 검출할 수 있다. FACS 완충액(98% PBS, 2% FBS)에 재현탁된 세포(2×106개 세포/mL, 90 μL)를 96-웰 U자형 바닥 플레이트(corning, 3795)에 첨가하고, 구배 희석된 항체 10 μL를 첨가하였다. 혼합물을 4℃에서 1시간 동안 배양하고 FACS 완충액으로 2회 세척한 후, Alexa Fluor 488 염소 항-인간 IgG(H+L)(invitrogen, Cat # 2015982, 1:1000 희석)를 각각의 웰에 첨가하였다. 혼합물을 4℃에서 1시간 동안 배양하고 2회 세척한 후, 세포를 FACS 완충액에 재현탁시켰다. 마지막으로, FACS CantoII(BD)를 사용하여 형광 신호 값을 판독하였다. 마지막으로, FlowJo 7.6과 Graphpad Prism 5를 사용하여 데이터를 처리하고 분석하였다.
가용성 단백질을 표적으로 하는 항체의 경우, 가용성 단백질에 대한 항체의 결합 활성을 ELISA로 검출하였다. 예를 들어, D0, I0, B0, U0, H0, R0 및 J0, 및 이들의 CH1/CL 도메인-조작 항체는 ELISA로 검출할 수 있다. 구체적인 절차는 다음과 같다: 단백질을 pH 7.4의 PBS 완충액(BasalMedia, B320)을 사용하여 1 μg/mL로 희석하고, 96-웰 마이크로플레이트(Corning, 9018)에 100 μL/웰로 첨가하고, 4℃에서 밤새 배양하였다. 액체를 폐기한 후, PBS로 희석한 5% 탈지유(BD, 232100) 300 μL를 각 웰에 첨가하여 차단시키고, 37℃에서 2시간 동안 배양하였다. 차단이 완료된 후, 차단 용액을 폐기하고; 플레이트를 PBST 완충액(pH 7.4, 0.1% 트윈-20을 함유하는 PBS)으로 3회 세척하였다. 구배로 희석된 항체 용액 100 μL를 각 웰에 첨가하고, 혼합물을 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 배양이 완료된 후, 플레이트를 PBST로 3회 세척하였다. 100 μL의 마우스 항-인간 IgG(H+L)(Jackson ImmunoResearch, 209-035-088, 1:8000 희석)을 각 웰에 첨가하고, 혼합물을 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 플레이트를 PBST로 3회 세척하였다. 100 μL의 TMB 발색 기질(KPL, 5120-0077)을 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 실온에서 10 내지 15분 동안 배양하였다. 각 웰에 50 μL의 1 M H2SO4를 첨가하여 반응을 중단시켰다. 450 nm에서의 흡광도 값을 마이크로플레이트 판독기에서 판독하고, 항원에 대한 항체의 결합 곡선을 소프트웨어로 맞춤화(fitting)하고, EC50 값을 계산하였다.
본 시험예의 항체에 상응하는 항원은 다음과 같았다: D0 및 그의 CH1/CL 도메인-조작 항체에 결합하는 항원은 hRANKL(Sino biological에서 입수가능, 11682-HNCH)이었고; I0 및 그의 CH1/CL 도메인-조작 항체에 결합하는 항원은 hNGF(Sino biological에서 입수가능, 11050-HNAC)였으며; B0 및 그의 CH1/CL 도메인-조작 항체에 결합하는 항원은 hBAFF(Sino biological에서 입수가능, 10056-HNCH)였으며; U0 및 그의 CH1/CL 도메인-조작 항체에 결합하는 항원은 hP40(Sino biological에서 입수가능, 10052-H08H)이었고; H0 및 R0 및 그의 CH1/CL 도메인-조작 항체에 결합하는 항원은 hIL-5(R&D 시스템에서 입수가능, 205-IL-025/CF)였으며; J0 및 그의 CH1/CL 도메인-조작 항체에 결합하는 항원은 hTSLP(Sino biological에서 입수가능, 16135-H08H)였으며; C0 및 N0 및 그의 CH1/CL 도메인-조작 항체에 결합하는 항원은 CEA(CEA를 과발현하는 세포 MKN45(Nanjing Cobioer로부터 입수가능, CBP60488))였고; F0, V0 및 S0, 및 그의 CH1/CL 도메인-조작 항체에 결합하는 항원은 B7H3(B7H3을 과발현하는 재조합 세포주 CT26-B7H3(CT26은 China Academy of Cell Bank에서 수득하였고 B7H3의 서열은 XP_005254757.1의 ID를 가짐)이었다.
시험예 5: CH1/CL 도메인-조작 항체의 불일치 검출
I. 상이한 항체들의 경쇄/중쇄 교차-불일치 분자의 발현 검출 방법
본 실험에서는, CH1/CL을 티틴-T 쇄/옵스큐린-O 쇄 또는 티틴-T 쇄/옵스큐린-유사-O 쇄로 대체하는 것이 중쇄/경쇄 불일치를 효과적으로 감소시킬 수 있는지 확인하기 위해 상이한 항체들의 경쇄/중쇄 쌍의 발현을 분석하였다. 구체적으로, 형질감염된 세포에 의해 항체가 발현되었을 때, D0 및 I0의 중쇄/경쇄가 각각 교환되어(즉, I/D-1(D0의 중쇄 + I0의 경쇄); I/D-2(I0의 중쇄 + D0의 경쇄)) 교차-불일치 분자가 야생형 CH1 및 CL로부터 형성되는지 여부를 측정하였고; 한편으로, D0의 CH1/CL이 티틴-T 쇄/옵스큐린-O 쇄로 대체된(D0의 중쇄 CH1이 T.10으로 대체되고, 경쇄 CL이 O.20으로 대체됨) 도메인-조작 항체 D3, 및 I0의 CH1/CL이 티틴-T 쇄/옵스큐린-O 쇄로 대체된(I0의 중쇄 CH1이 T.10으로 대체되고 경쇄 CL이 O.20으로 대체됨) O.20으로 대체됨) 도메인-조작 항체 I3의 중쇄 및 경쇄를 각각 교환하여 불일치 분자를 구축하였다: I/D-3(D0의 중쇄 + I3의 경쇄), I/D-4(D3의 중쇄 + I0의 경쇄), I/D-5(I0의 중쇄 + I3의 경쇄) 및 I/D-6(I3의 중쇄 + D0의 경쇄). 구축된 항체의 개략적인 구조도를 도 7에 나타내었다.
항체의 발현 수준은 시험예 1의 방법으로 측정하였고, 발현 생성물을 시험예 3의 방법으로 질량 분석을 실시하여 불일치 분자가 형성되는지 확인하였다. 실험 결과는 표 26에 나타내었다. 실험 결과는 D0의 중쇄 + I0의 경쇄 또는 I0 + D0의 경쇄를 동시-발현시킨 경우, 온전한 IgG 분자(150 kDa)가 각각 74.4 mg/L 및 73.8 mg/L의 높은 발현 수준으로 형성될 수 있음을 보여주었으며; LC-MS 결과는 수득된 단백질이 불일치된 IgG 분자임을 보여주었으며, 이는 CH1-CL이 조작되거나 대체되지 않으면 이중특이성 항체의 4개의 상이한 중쇄 및 경쇄가 동시-발현될 때 대량의 경쇄/중쇄 불일치 분자가 형성될 수 있음을 보여주었다. CH1/CL이 티틴-T 쇄/옵스큐린-O 쇄로 치환된 후, I/D-3(D0의 중쇄 + I3의 경쇄), I/D-4(D3의 중쇄 + I0의 경쇄), I/D-5(I0의 중쇄 + I3의 경쇄) 및 I/D-6(I3의 중쇄 + D0의 경쇄)의 4가지 불일치 발현 형태에서 표적 분자(150 kDa)가 생성되지 않았으며, 두 중쇄의 소량의 오류 분자(분자량은 100 kDa였음)를 형성한, D3의 중쇄와 I0의 경쇄의 결합을 제외하고는 불일치 분자가 다른 3개 형태에서는 생성되지 않아서, 조작된 비-상동성 쌍이 IgG 구조 형태에서 불일치 분자를 형성할 수 없음을 시시하였다. 따라서, CH1-CL을 티틴-T 쇄/옵스큐린-O 쇄로 대체하면 IgG 유사 이중특이성 항체의 경쇄/중쇄 사이에 비-상동 교차-쌍 분자의 형성을 효과적으로 방지하거나 감소시킬 수 있다.
[표 26] 상이한 경쇄/중쇄 교차-쌍 항체의 발현 수준 및 질량 분석
참고: 표에서 "√"는 불일치 분자가 검출되었음을 나타내고 "×"는 불일치 분자가 검출되지 않았음을 나타낸다.
II. 이중특이성 항체의 경쇄/중쇄 불일치의 발현 검출 방법
본 실시예에서는, CH1/CL을 티틴-T 쇄/옵스큐린-O 쇄로 대체하면 불일치가 발생하지 않거나 불일치가 감소되는지를 확인하기 위해, 세 가지 경쇄/중쇄 교차-쌍 발현 형태를 설계하였다. 구체적으로, 항체 발현을 위해 2개의 상이한 중쇄 및 1개의 동일한 VL-CL 경쇄를 세포에 동시-형질감염시키거나, CL이 옵스큐린-O 쇄로 대체된 2개의 상이한 중쇄 및 1개의 동일한 경쇄를 항체 발현을 위해 세포에 동시-형질감염시키거나, 2개의 상이한 중쇄 및 2개의 상이한 경쇄를 항체 발현을 위해 세포에 동시-형질감염시켰다(구체적인 쌍에 대해서는 표 27 참조).
이어서, 발현 생성물에 질량 분석을 실시하고(방법에 대해서는 본 개시내용의 시험예 3 참조), 항체 순도 SEC를 검출하였다(방법에 대해서는 본 개시내용의 시험예 2 참조). 실험 결과는 표 27에 나타내었다. 결과는 CL이 옵스큐린-O 쇄로 대체된 경쇄와 CL이 대체되지 않은 경쇄를 함께 첨가하면 정확한 분자가 형성되는 반면, CL이 대체되지 않은 경쇄 하나만 추가되거나 CL이 옵스큐린-O 쇄로 대체된 경쇄 하나만 추가된 경우 교차-쌍에서 정확한 표적 분자가 확인되지 않았다. 이는 CL이 옵스큐린-O 쇄로 대체된 경쇄가 CH1이 티틴-T 쇄로 대체된 중쇄에 더 용이하게 결합되어 분자를 형성하지만. CH1이 티틴-T 쇄로 대체되지 않은 중쇄와 교차-불일치되지 않을 것이고; CL이 옵스큐린-O 쇄로 대체되지 않은 경쇄는 CH1이 티틴-T 쇄로 대체되지 않은 중쇄에 더 용이하게 결합되지만, CH1이 티틴-T 쇄로 대체된 중쇄에는 결합되지 않음을 시사하였다.
[표 27] 이중특이성 항체의 경쇄/중쇄 불일치 검출 결과
참고: 표에서, "√"는 4개 쇄-쌍을 이룬 분자가 검출되었음을 나타내고, "-"는 4개 쇄-쌍을 이룬 분자가 검출되지 않았음을 나타낸다.
시험예 6: 항원에 대한 이중특이성 항체의 친화도 검출
항원 단백질에 대한 시험 항체의 친화도는 Biacore T200(GE) 기기를 사용하여 측정하였다. 인간 항-포획 키트(GE, Cat # BR-1008-39)의 설명서의 방법에 따라, 단백질 A 바이오센서 칩(Cat # 29127556, GE)을 시험 항체의 친화성 포획에 사용한 다음, 일련의 농도 구배하에 가용성 항원을 칩 표면에 관류시키고, Biacore T200 기기를 반응 신호의 실시간 검출에 사용하여 결합-해리 곡선을 수득하였다. 매 주기마다 해리가 완료된 후, 바이오센서 칩을 글리신-염산 재생 용액(pH 1.5, Cat # BR-1003-54, GE)으로 세척하였다. 실험에서 수득된 데이터는 (1:1) Langmuir 모델을 사용하는 GE 소프트웨어인 BIAevaluation 버전 4.1을 사용하여 맞춤화시켜 친화도 값을 수득하였다. 실험 결과는 표 28에 나타내었다.
실험 결과는 본 개시내용의 도메인-조작된 이중특이성 항체가 그의 항원에 대한 2개의 단일클론 모 항체의 친화도를 충분히 유지한다는 것을 보여주었다. 이 실험에는, 항원 hRANKL(Sino biological에서 입수가능, 11682-HNCH), hNGF(Sino biological에서 입수가능, 11050-HNAC), hBAFF(Sino biological에서 입수가능, 10056-HNCH), hP40(Sino biological에서 입수가능, 10052-H08H), hB7H3(실험실에서 제조, 서열은 서열번호 111에 제시되어 있음), 및 hCD3(실험실에서 제조, hCD3의 δ 서브유닛(서열은 서열번호 112에 제시되어 있음)과 ε 서브유닛(서열은 서열번호 113에 제시되어 있음)으로 이루어진 이종이량체)이 포함되었다.
[표 28] 이중특이성 항체의 친화도 검출 결과
시험예 7: CH1/CL 도메인-조작된 이중특이성 항체의 항원 결합 분석
본 개시내용의 CH1-CL 도메인-조작된 이중특이성 항체가 2개의 표적 항원에 동시에 결합할 수 있는지 확인하기 위해 Biacore T200(GE) 기기를 사용하여 항원 단백질에 대한 시험 항체의 친화도를 측정하였다. 구체적인 실험 단계는 다음과 같다: 단백질 A 바이오센서 칩(Cat # 29127556, GE)을 항체 BU5의 친화성 포획에 사용한 다음, 이중특이성 항체의 첫 번째 항원 분자 hP40(Sino biological에서 입수가능, 10052-H08H)을 칩 표면에 관류시켜 포화상태에 도달한 후, 두 번째 항원 분자 hBAFF(Sino biological에서 입수가능, 10056-HNCH)를 특정 농도로 주입하고, 반응 신호의 실시간 검출에 Biacore T200 기기를 사용하여, 결합-해리 곡선을 수득하였다. 매 주기마다 해리가 완료된 후, 바이오센서 칩을 글리신-염산 재생 용액(pH 1.5, Cat # BR-1003-54, GE)으로 세척하였다. (1:1) Langmuir 모델을 사용하는 GE 소프트웨어인 BIAevaluation 버전 4.1을 사용하여 데이터를 맞춤화시켰다. 그런 다음, 단백질 A 바이오센서 칩(Cat # 29127556, GE)을 항체 BU5의 친화성 포획에 사용한 후, 이중특이성 항체의 첫 번째 항원 분자 hP40(Sino biological에서 입수가능, 10052-H08H)을 칩의 표면에 관류시켜 포화상태에 도달한 후, 두 번째 항원 분자 hBAFF(Sino biological에서 입수가능, 10056-HNCH)를 특정 농도로 주입하고, Biacore T200 기기를 반응 신호의 실시간 검출에 사용하여, 결합-해리 곡선을 수득하였다. 매 주기마다 해리가 완료된 후, 바이오센서 칩을 글리신-염산 재생 용액(pH 1.5, Cat # BR-1003-54, GE)으로 세척하였다. (1:1) Langmuir 모델을 사용하는 GE 소프트웨어인 BIAevaluation 버전 4.1을 사용하여 데이터를 맞춤화시켰다.
실험 결과는 표 29에 나타내었다. 실험 결과는 이중특이성 항체 BU5가 항원 hP40에 결합한 후 항원 hBAFF에 계속 결합하여 포화상태에 도달할 수 있으며, 단일클론 항체 B0에 필적하는 hBAFF에 대한 재결합 능력을 가짐을 보여주었다. 유사하게, 이중특이성 항체 BU5는 항원 hBAFF에 결합한 후 항원 hP40에 계속 결합하여 포화상태에 도달할 수 있었고, U0에 필적하는 hP40에 재결합하는 능력을 가졌다. 이는 CH1/CL이 티틴-T 쇄/옵스큐린-O 쇄로 대체된 본 개시내용의 이중특이성 항체가 2개의 표적 항원에 동시에 결합할 수 있음을 시사한다.
[표 29] 항체 친화도 검출 결과
시험예 8: DI-1 이중특이성 항체의 파골세포 분화 실험
Raw264.7 세포(Chinese Academy of Cell Bank, SCSP-5036)를 절단하고 계수를 위해 재현탁시켰다. 세포를 24-웰 세포 배양 플레이트(Corning, 3524)에 플레이팅하고 37℃의 세포 배양기에서 밤새 배양하였다. 다음날, 항체 용액을 상이한 농도로 희석하고, RANKL(Sino biological, 11682-HNCH)과 균질하게 혼합하고, 혼합물을 세포 배양 플레이트에 첨가하여 최종 농도가 50 ng/mL가 되도록 하고, 37℃에서 배양하였다. 96시간 후, 24-웰 플레이트의 용액을 제거하고, 각 웰에 100 μL의 세포 용해 완충액(Beyotime, P0013J)을 첨가하고, 혼합물을 피펫팅하여 균질하게 혼합하였다. 용해물을 EP 튜브에 옮기고 12000 g에서 5분간 원심분리하고, 설명서에 기재된 방법에 따라 항-타르타르산 포스파타제 시험 키트(Beyotime, P0332)를 사용하여 검출하기 위해 상등액을 취하였다. 405 nm에서의 흡광도 값을 마이크로플레이트 판독기에서 판독하였다. 측정된 값을 소프트웨어로 맞춤화하여 곡선을 수득하고, IC50 값을 계산하였다. 실험 결과는 도 10에 나타내었다. 실험 결과는 CH1/CL이 대체된 이중특이성 항체 DI-1이 우수한 활성을 유지하였으며 파골세포 분화를 효과적으로 억제하였음을 보여주었다.
시험예 9: DI-1 이중특이성 항체의 TF1 세포 증식 실험
세포 수준에서 항체의 활성을 NGF-유도된 TF-1 세포(ATCC, CRL-2003) 증식 실험에서 평가하였다. 실험 절차는 다음과 같다: TF1 세포를 절단 및 수집하고, 계수를 위해 재현탁시키고, 96-웰 플레이트(Corning, 3903)에 플레이팅하고, 37℃의 배양기에서 밤새 배양하였다. 다음날, 항체 용액을 상이한 농도로 희석하고 NGF(Sino biological, 11050-HNAC)와 균일하게 혼합하고, 혼합물을 세포 배양 플레이트에 첨가하여 최종 농도가 10 ng/mL가 되도록 하고, 배양기에서 배양하였다. 72시간 후에, 세포 배양 플레이트를 제거하고, Cell-titer Glo(Promega, G755B) 분석 용액 50 μL를 각 웰에 첨가하고, 혼합물을 진탕기에서 10분간 배양하고 실온에서 10분간 방치하였다. 마이크로플레이트 판독기(PerkinElmer, Victor3)를 사용하여 발광 신호를 검출하였다. 검출된 신호값을 소프트웨어를 사용하여 맞춤화하여 곡선 그래프를 수득하고, IC50 값을 계산하였다. 실험 결과는 도 11에 나타내었다. 실험 결과는 CH1/CL이 대체된 이중특이성 항체 DI-1이 우수한 활성을 가졌음을 보여주었다.
시험예 10: CH1/CL이 대체된 이중특이성 항체의 경쇄 및 중쇄 불일치 검출
CH1/CL이 티틴-T 쇄/옵스큐린-O 쇄 또는 TCRα/TCRβ로 대체된 이중특이성 항체의 경쇄 및 중쇄 불일치를 분석하기 위해 하기의 실험을 수행하였다. 구체적인 실험은 다음과 같았다:
I. 이중특이성 항체의 4개 쇄의 동시-발현시 경쇄 및 중쇄 불일치 실험
H0 또는 J1의 CH1/CL을 TCRα/TCRβ로 대체하여 각각 4개의 쇄로 구성된 이중특이성 항체 HJ-1 및 HJ-2를 구축하였고, H0 또는 J1의 CH1/CL을 티틴-T 쇄/옵스큐린-O 쇄로 대체하여 4개의 쇄로 구성된 이중특이성 항체 HJ-3 및 HJ-4를 구축하였다. 이중특이성 항체의 개략적인 구조도는 도 12에 나타내었으며, 이중특이성 항체의 전장 서열은 표 30에 나타내었다:
[표 30] 이중특이성 항체의 서열 목록
참고: 서열에서, 굵은 부분은 TCR 서열의 티틴-T 쇄/옵스큐린-O 쇄 부분을 나타내고, 점으로 밑줄친 부분은 Fc 또는 CL 불변 영역 부분을 나타내고, 단일 밑줄친 부분은 가변 영역 부분을 나타내고, 점선으로 밑줄친 부분은 링커 L1을 나타낸다.
J1의 중쇄:
EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSNYLIEWVRQAPGQGLEWIGVIDPGVGDTNYNENFKGRATLTADKSTSTAYIELSSLRSEDTAVYYCAREDNTGTAFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
(서열번호 126).
J1의 경쇄:
SIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKASQSVSSDVTWYLQKPGQSPQLLIYYVSEHYTGVPDRFSGSGYGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQHHRFPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
(서열번호 117).
J1의 중쇄 가변 영역:
EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSNYLIEWVRQAPGQGLEWIGVIDPGVGDTNYNENFKGRATLTADKSTSTAYIELSSLRSEDTAVYYCAREDNTGTAFDYWGQGTTVTVSS
(서열번호 171).
J1의 경쇄 가변 영역:
SIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKASQSVSSDVTWYLQKPGQSPQLLIYYVSEHYTGVPDRFSGSGYGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQHHRFPLTFGQGTKLEIK
(서열번호 172).
HJ-1, HJ-2, HJ-3 및 HJ-4의 4개 쇄를 세포에 동시-형질감염시켜 발현시킨 후, 발현 생성물에 질량 분석(방법에 대해서는 본 개시내용의 시험예 3 참조)을 실시하여 경쇄 및 중쇄 불일치 분자가 있는지를 측정하였다. 실험 결과는 도 13a 내지 13d 및 표 31에 나타내었다.
[표 31] 이중특이성 항체의 발현 생성물의 질량 분석 실험 결과
참고: 표에서, "√"는 분자가 검출되었음을 나타내고, "×"는 분자가 검출되지 않았음을 나타내며, "HJ(1 + 2 + 3 + 4)"는 그 왼쪽에 1, 2, 3 및 4로 번호가 매겨진 4개의 상응하는 쇄에 의해 형성된 이중특이성 항체를 나타내고, "불일치 분자 1(1 + 2 + 3 + 3)"은 그 왼쪽에 1, 2, 3 및 3으로 번호가 매겨진 4개의 상응하는 쇄에 의해 형성된 불일치 분자 1을 나타내며; "불일치 분자 2(1 + 2 + 4 + 4)"는 그 왼쪽에 1, 2, 4 및 4로 번호가 매겨진 4개의 상응하는 쇄에 의해 형성된 불일치 분자 2를 나타낸다.
실험 결과는 CH1/CL이 TCRβ/TCRα로 대체된 이중특이성 항체의 4개의 쇄를 동시-형질감염시켜 발현시켰을 때, 항체의 경쇄와 중쇄가 불일치되었음을 보여주었다. 그러나, CH1/CL이 티틴-T 쇄/옵스큐린-O 쇄로 대체된 이중특이성 항체는 경쇄 및 중쇄 불일치가 없었다. 이는 본 개시내용의 CH1/CL이 티틴-T 쇄/옵스큐린-O 쇄로 대체된 이중특이성 항체가 경쇄 및 중쇄 불일치를 감소시키는 탁월한 능력을 가짐을 시사하였다.
II. 3개의 쇄가 동시-발현된 이중특이성 항체의 실험
본 실험에서는, 야생형 경쇄(VL-CL)가 CH1이 TCRβ 또는 티틴-T 쇄로 대체된 중쇄와 결합하여 불일치 분자를 형성하는지를 확인하기 위해, 3개의 쇄(CH1이 TCRβ 또는 티틴-T 쇄로 대체된 1개의 중쇄, CH1이 대체되지 않은 1개의 중쇄, 및 CL이 대체되지 않은 1개의 야생형 경쇄(VL-CL); 특정 서열은 표 30에 나타냄)를 세포내에 동시-형질감염시켜 발현시키고, 발현 생성물에 질량 분석(방법은 본 개시내용의 시험 실시예 3 참조)을 실시하고, 항체 순도 SEC를 측정하였다(방법은 본 개시내용의 시험예 2 참조). 실험 결과는 도 14a, 도 14b, 도 15a, 도 15b 및 표 32에 나타내었다.
[표 32] 3개의 쇄가 동시-발현된 이중특이성 항체에 대한 실험 결과
참고: 표에서, "√"는 분자가 검출되었음을 나타내고, "X"는 분자가 검출되지 않았음을 나타내며, "분자(1 + 2 + 3)"은 그 왼쪽에 1, 2 및 3으로 번호 매겨진 3개의 상응하는 쇄에 의해 형성된 분자를 나타내고, "불일치 분자(1 + 2 + 3 + 3)"은 그 왼쪽에 4개의 상응하는 쇄 1, 2, 3 및 3에 의해 형성된 불일치 분자를 나타낸다.
실험 결과는 VL-CL이 CH1이 TCRβ로 대체된 중쇄에 쉽게 결합하여 2개의 동일한 경쇄를 갖는 불일치 분자를 발현하였음을 보여주었다. 그러나, VL-CL 경쇄는 CH1이 티틴-T 쇄로 대체된 중쇄와 결합하지 않아 2개의 동일한 경쇄를 갖는 불일치 분자를 형성했으며, 이는 중쇄의 CH1이 본 개시내용의 티틴-T 쇄로 대체된 이중특이성 항체가 중쇄의 CH1이 TCRβ로 대체된 이중특이성 항체와 비교하여 경쇄 및 중쇄 불일치를 감소시키는 보다 탁월한 능력을 가짐을 간접적으로 시사하였다.
시험예 11: CH1/CL이 대체된 (FabV) 2 -IgG 이중특이성 항체
I. CH1/CL이 대체된 PDL1-TIGIT 이중특이성 항체의 구축
국제 특허출원 WO2019062832A1호에 개시된 항-TIGIT 항체(항체 이름: h1708-04) 및 국제 특허출원 WO2020177733A1호에 개시된 항-PDL1 항체(항체 이름: h1831K)를 사용하여, CH1/CL이 티틴-T 쇄/옵스큐린-O 쇄(T.10/O.24)로 대체된 (FabV)2-IgG 형태의 항-PDL1-TIGIT 이중특이성 항체 P-O-T를 구축하였다(개략적인 구조도는 도 17에 나타내었음). P-O-T는 2개의 동일한 경쇄 1, 2개의 동일한 경쇄 2, 및 2개의 동일한 중쇄를 포함하고, P-O-T의 폴리펩티드 쇄의 아미노산 서열은 다음과 같이 나타낸다:
P-O-T의 경쇄 1:
DIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASESVSIHGTHLMHWYQQKPGQPPKLLIYAASKLESGVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEAEDTANYYCQQSFEDPLTFGQGTKLEIKGGGGSGIPPKIECLPIDISIDEGKVLTVASAFTGEPTPEVTWSTGGRKIHSQEQGRFHIENTDDLTTLIIKDVQKQDGGLYTLTLRNEFGSDSATVNIHIRSI (서열번호 146)
(참고: 단일 밑줄친 부분은 경쇄 가변 영역 VL1 부분(h1831K의 VL과 동일)을 나타내고, 점으로 밑줄친 부분은 링커 부분을 나타내고, 점선은 T.10 부분을 나타낸다)
P-O-T의 경쇄 2:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIYSYLAWYQQKPGKSPKLLIYNARTLAEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQYHSGSPLPFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호 147)
(참고: 단일 밑줄친 부분은 경쇄 가변 영역 VL2 부분(h1708-04의 VL과 동일)을 나타내고, 물결선 부분은 경쇄 불변 영역(h1708-04의 CL과 동일)을 나타낸다)
P-O-T의 중쇄:
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWMGRITPSSGFAMYNEKFKNRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGGSSYDYFDYWGQGTTVTVSSGGGGSSGAPRFLTRPKAFVVSVGKDATLSSQIVGNPFPQVSWEKDKQPVTAGVRFRLAQDGDLYRLKILDLQLSDSGQYVSRARNAIGEAFACLGLQVDAEAGGGGSEVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMHWVRQAPGQGLEWMGRIDPDSTGSKYNEKFKTRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREGAYGYYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호 148)
(참고: 단일 밑줄친 부분은 중쇄 가변 영역 VH1 부분(h1831K의 VH와 동일)을 나타내고, 이중으로 밑줄친 부분은 중쇄 가변 영역 VH2 부분(h1708-04의 VH와 동일)을 나타내며, 점선 부분은 O.24 부분을 나타내고, 점선 부분은 링커 부분을 나타내고, 물결선 부분은 중쇄 불변 영역 부분(h1708-04의 중쇄 불변 영역과 동일)을 나타낸다)
h1831K(P-IgG1) 및 h1708-04(T-IgG1)의 서열은 다음과 같다:
h1708-04의 경쇄:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIYSYLAWYQQKPGKSPKLLIYNARTLAEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQYHSGSPLPFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호 149)
h1708-04의 중쇄:
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMHWVRQAPGQGLEWMGRIDPDSTGSKYNEKFKTRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREGAYGYYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호 150)
h1831K의 경쇄:
DIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASESVSIHGTHLMHWYQQKPGQPPKLLIYAASKLESGVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEAEDTANYYCQQSFEDPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호 151)
h1831K의 중쇄:
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWMGRITPSSGFAMYNEKFKNRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGGSSYDYFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호 152)
참고: 상기 서열에서, 단일 밑줄친 부분은 가변 영역을 나타내고, 물결선 부분은 불변 영역을 나타낸다.
또한, h1708-04 및 h1831K의 가변영역 및 CDR의 서열(표 33 참조)은 다음과 같다:
h1708-04의 경쇄 가변 영역:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIYSYLAWYQQKPGKSPKLLIYNARTLAEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQYHSGSPLPFGGGTKVEIK (서열번호 153)
h1708-04의 중쇄 가변 영역:
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMHWVRQAPGQGLEWMGRIDPDSTGSKYNEKFKTRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREGAYGYYFDYWGQGTLVTVSS (서열번호 154)
h1831K의 경쇄 가변 영역:
DIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASESVSIHGTHLMHWYQQKPGQPPKLLIYAASKLESGVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEAEDTANYYCQQSFEDPLTFGQGTKLEIK (서열번호 155)
h1831K의 중쇄 가변 영역:
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWMGRITPSSGFAMYNEKFKNRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGGSSYDYFDYWGQGTTVTVSS (서열번호 156)
[표 33] 항체 중쇄 및 경쇄 CDR 영역의 서열
참고: CDR 영역의 서열은 Kabat 번호지정 체계에 따라 결정되었다.
II. CH1/CL이 대체된 PDL1-TIGIT 이중특이성 항체의 PDL1 및 TIGIT에 결합하는 능력 분석
본 개시내용의 이중특이성 분자 P-O-T, 인간 PDL1-his(hPDL1, Cat. No. 10084-H08H, S.B) 및 인간 TIGIT-his(hTIGIT, Cat. No. 10917-H08H, S.B)의 친화도를 Biacore T200을 사용하여 측정하였다. 구체적으로, 단백질 A 바이오센서 칩(Cat. No. 29127556, GE)을 IgG의 친화성 포획에 사용한 후, 고농도 항원 1(hPDL1 100 nM 또는 hTIGIT 100 nM)을 칩 표면에 180초에 걸쳐 관류시켜 항원 1에 대한 항체 부위를 포화시킨 후, 항원 2(hTIGIT 또는 hPDL1)를 주입하고, Biacore T200 기기를 반응 신호의 실시간 검출에 사용하여 결합-해리 곡선을 수득하였다. 매 주기마다 해리가 완료된 후, 바이오센서 칩을 pH 1.5의 10 mM Gly-HCl로 세척하여 재생시켰다. 데이터는 1:1 모델을 사용하여 맞춤화시켰다. 결과는 하기 표 34에 나타내었다:
[표 34] 시험 항체 hPDL1 및 hTIGIT의 친화도 분석 결과
분석 결과는 CH1/CL이 티틴-T 쇄/옵스큐린-O 쇄로 대체된 (FabV)2-IgG 이중특이성 항체 P-O-T가 hPDL1 및 hTIGIT에 대해 우수한 결합 능력을 가졌으며, 한편으로 하나의 항원에 대한 P-O-T의 결합은 다른 항원에 대한 P-O-T의 결합에 영향을 미치지 않았음을 보여주었다.
III. PD-1에 대한 PD-L1의 결합 및 CD155에 대한 TIGIT의 결합에 대한, CH1/CL이 대체된 PDL1-TIGIT 이중특이성 항체의 차단 효과 분석
하기에 기재된 시험관내 세포 분석을 이용하여 PD-1에 대한 PD-L1의 결합 및 CD155에 대한 TIGIT의 결합에 대한 시험 항체의 차단 효과를 측정할 수 있으며, 그 활성은 EC50 값으로 표현될 수 있다. 실험 첫날, 인간 CD155를 안정하게 발현하는 CHOK1/PD-L1 세포(Promega, CS187108)를, 각 웰에 100 μL의 세포 현탁액으로, 10% FBS(Gibco, 10099-141) 및 4000 세포/웰 밀도의 항생제를 함유하는 F-12 영양소 혼합물(Gibco, 11765-054) 완전 배지를 함유한 96-웰 플레이트에 접종하였다. 플레이트를 밤새 배양하기 위해 5% CO2 하에 37℃의 세포 배양기에 두었다. 다음날, 플레이트의 배지를 피펫팅으로 폐기하고, 구배로 희석된 시험 항체 40 μL를 2% FBS(Gibco, 10099-141)를 함유하는 RPMI(Gibco, 11875119)로 제형화하고, 동일 배지에 재현탁된, 인간 TIGIT 및 인간 CD226을 안정적으로 발현하는 Jurkat/PD-1/NFAT-luc2 세포(Promega, CS187102) 40 μL를 각 웰에 50,000 세포로 각 웰에 첨가하였다. 항체의 최종 농도는 100 nM으로부터 3배 구배 희석으로 수득된 9개의 농도점이었으며, 무항체 대조군 세포 웰 및 무세포 대조군 웰을 설정하였다. 플레이트를 5% CO2 하에 37℃ 배양기에 넣어 6시간 동안 배양하였다. 6시간 후에, 96-웰 세포 배양 플레이트를 취하고, Bio-Glo™ 루시퍼라제 분석(Promega, G7573)의 기질 40 μL를 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 10분 동안 방치한 후, 마이크로플레이트 판독기(PerkinElmer, VICTOR 3)에서 발광 신호값을 판독하였다. 대조군 웰에 의해 항체의 각 농도에 대해 상대적 활성화 수준을 계산하였다. GraphPad Prism을 이용하여 항체의 로그 농도 및 상대적 활성화 수준을 기준으로 곡선 맞춤(curve fitting)을 수행하고, EC50 값을 계산하였다.
결과는 도 18에 나타내었다. 실험 결과는 CH1/CL이 대체된 PDL1-TIGIT 이중특이성 항체가 PDL1 단일클론 항체 및 TIGIT 단일클론 항체와 비교하여 중첩된 차단 활성을 가졌음을 보여주었다.
IV. 투베르쿨린-자극 말초혈 단핵 세포에 대한 항체의 활성화
하기에 기재된 시험관내 세포 분석을 이용하여 투베르쿨린-자극된 말초혈 단핵 세포(PBMC)에 의한 IFN-γ 분비에 대한 시험 항체의 활성화를 측정하였으며, 그 활성은 EC50 값으로 나타낼 수 있다. 실험 첫날, 사용 설명서에 따라 SepMateTM-50 분리 튜브(STEMCELL, 86450)를 사용하여 신선한 건강한 인간 혈액에서 PBMC를 분리하였다. 세포를, 10% FBS(Gibco, 10099-141)를 함유하는 RPMI 배지(Gibco, 11875119) 및 800배 희석한 투베르쿨린(Synbiotics, 97-8800)을 함유한 6-웰 플레이트에 4×106개 세포/웰의 밀도로, 각 웰에 2 mL의 세포 현탁액으로 접종하였다. 플레이트를 5일 동안 배양하기 위해 5% CO2 세포하에 37℃의 배양기에 두었다. 4일째에, 인간 CD155/PVR 단백질(Acro, CD5-H5223)을 PBS로 2.5 μg/mL로 희석하고 96-웰 세포 배양 플레이트에 100 μL/웰로 첨가하고, 플레이트를 밤새 코팅하기 위해 4℃ 냉장고에 두었다. 5일째에, 단백질-코팅된 96-웰 세포 배양 플레이트를 PBS로 2회 세척하고, 투베르쿨린-자극 PBMC를 수집하고 10% FBS 함유 RPMI 배지를 함유한 96-웰 플레이트에 1x105개 세포/웰 농도로, 각 웰에 90 μL의 세포 현탁액으로 접종하였다. 이어서, PBS로 희석한 시험 항체 10 μL를 각 웰에 첨가하였다. 항체의 최종 농도는 200 nM으로부터 3배 연속 희석하여 수득된 9개의 농도점이었다. 무항체 대조군 세포 웰을 설정하였다. 웰 플레이트를 5% CO2 하에 37℃의 세포 배양기에 넣고 3일 동안 배양하였다. 8일째에, 96-웰 세포 배양 플레이트를 250 g에서 5분간 원심분리하고, 상등액을 새로운 96-웰 플레이트로 옮기고 인간 IFN-γ ELISA 키트(NeoBioscience, EHC102g.96.10)로 20배 희석하였다. 상등액중 IFN-γ 함량을 측정하였다. 대조군 웰에 의해 항체 처리군에 대한 상대적 활성화 수준을 계산하였다. Graphpad Prism 5를 이용하여 항체의 농도 및 상응하는 상대적 활성 수준을 기준으로 곡선 맞춤을 수행하고 EC50 값을 계산하였다.
실험 결과는 도 19에 나타내었다. 실험 결과는 CH1/CL이 대체된 PDL1-TIGIT 이중특이성 항체가 단일클론 항체에 비해 면역억제를 더 우수하게 차단하고 IFN-γ 분비를 촉진할 수 있었음을 보여주었다.
V. CH1/CL이 대체된 PDL1-TIGIT 이중특이성 항체의 생체내 효능 분석
본 실험에서는, PD-L1과 TIGIT의 조합의 효능을 PDL1-TIGIT 이중특이성 항체와 비교하기 위해, 인간 PD-1-TIGIT 이중-유전자전이 마우스에 인간 PD-L1으로 안정하게 형질감염된 MC38-HL1 세포를 접종하고, 종양이 형성되었을 때 군으로 분류하였다.
SCXK(베이징) 2015-0008의 허가 번호하에, 6 내지 8주령되고 체중 약 16 내지 18 g의 암컷 PD-1-TIGIT 이중-유전자전이 마우스 82마리를 Biocytogen에서 구입하고, 20 내지 25℃의 온도 및 40 내지 60%의 습도에서 SPF-등급 환경에서 5마리 마우스/케이지로 수용하였다. 마우스를 약 10일 동안 적응시켰다. 100 μL의 MC38-HL1 세포(2.0 x 105개 세포)를 82마리의 hPD-1/TIGIT 이중-유전자전이 마우스의 오른쪽 옆구리에 피하 접종하였다. 종양(약 110 mm3)이 형성된 후, 종양이 너무 크거나 너무 작은 마우스를 제외시키고, 나머지 마우스를 종양 부피에 따라 무작위로 5개 군, 즉 음성 대조군 C25-IgG1(무관한 표적 IgG1 단백질) 군, P-IgG1 + T-IgG1 군, P-O-T 군, P-IgG1 군 및 T-IgG1 군으로(각각의 군에 8마리 마우스) 분류되었다. 구체적인 정보는 표 35에 나타내었다. 실험 당일에, 항체를 매주 1회씩 총 3주간 복강내 주사로 투여하였다. 종양 부피 및 체중은 일주일에 2회 측정하였으며 데이터를 기록하였다.
[표 35] MC38-HL1 마우스에서 이종이식 종양의 종양 억제 실험을 위한 군 분류
참고: 표에서, ip는 복강내 주사를 나타내고, qw는 주 1회를 나타낸다.
데이터는 Excel 통계 소프트웨어를 사용하여 기록하였다: 평균값은 avg로 계산하였고; SD 값은 STDEV로 계산하였으며; SEM 값은 STDEV/SQRT(군당 동물 수)로 계산하였고; Graphpad Prism 소프트웨어를 플로팅에 사용하였고, 데이터의 통계 분석은 2원 ANOVA, 1월 ANOVA, 또는 t-검정을 이용하여 수행하였다.
종양 부피(V)는 V = 1/2 × Llong × Lshort 2로 계산하였다.
상대적 종양 증식률 T/C(%) = (T - T0)/(C - C0) × 100%, 여기서 T 및 C는 각각 실험 종료시 처리군 및 대조군의 동물의 종양 부피이고; T0 및 C0는 각각 실험 시작시 처리군 및 대조군의 동물의 종양 부피이다.
결과는 표 36 및 도 20에 나타내었다.
[표 36] MC38-HL1 마우스에서 이종이식 종양에 대한 항체의 종양 성장 억제율(%)
실험 결과는 22일째에, 음성 대조군인 C25-IgG1 군에 비해 9 mg/kg의 P-IgG1과 9 mg/kg의 T-IgG1의 조합 군이 43%의 종양 성장 억제율을 나타내었고, 5 mg/kg의 P-O-T 군이 55%의 종양 억제율을 나타내었음을 보여주었다. 그러므로, 이들은 P-IgG1 단독 및 T-IgG1 단독 군에 비해 현저히 우수한 종양 억제 효과하에, MC38-HL1 종양의 성장을 유의하게 억제할 수 있었다.
SEQUENCE LISTING <110> JIANGSU HENGRUI PHARMACEUTICALS CO., LTD. SHANGHAI HENGRUI PHARMACEUTICAL CO., LTD. <120> ANTIGEN-BINDING MOLECULE <130> 722049CPCT <140> PCT/CN2022/092529 <141> 2022-05-12 <150> CN 202110527339.7 <151> 2021-05-14 <160> 181 <170> SIPOSequenceListing 1.0 <210> 1 <211> 330 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <223> Heavy chain constant region sequence of IgG1 <400> 1 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 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Asp 1 5 10 15 Glu Gly Lys Val Leu Thr Val Ala Ser Ala Phe Thr Gly Glu Pro Thr 20 25 30 Pro Glu Val Thr Trp Ser Thr Gly Gly Arg Lys Ile His Ser Gln Glu 35 40 45 Gln Gly Arg Phe His Ile Glu Asn Thr Asp Asp Leu Thr Thr Leu Ile 50 55 60 Ile Met Asp Val Gln Lys Gln Asp Gly Gly Leu Tyr Thr Leu Ser Leu 65 70 75 80 Gly Asn Glu Phe Gly Ser Asp Ser Ala Thr Val Asn Ile His Ile Arg 85 90 95 Ser Ile <210> 36 <211> 98 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <223> T.2 chain sequence <400> 36 Gly Ile Pro Pro Lys Ile Glu Ala Leu Pro Ser Asp Ile Ser Ile Asp 1 5 10 15 Glu Gly Lys Cys Leu Thr Val Ala Ser Ala Phe Thr Gly Glu Pro Thr 20 25 30 Pro Glu Val Thr Trp Ser Thr Gly Gly Arg Lys Ile His Ser Gln Glu 35 40 45 Gln Gly Arg Phe His Ile Glu Asn Thr Asp Asp Leu Thr Thr Leu Ile 50 55 60 Ile Met Asp Val Gln Lys Gln Asp Gly Gly Leu Tyr Thr Leu Ser Leu 65 70 75 80 Gly Asn Glu Phe Gly Ser Asp Ser Ala Thr Val Asn Ile His Ile Arg 85 90 95 Ser Ile <210> 37 <211> 98 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <223> T.3 chain sequence <400> 37 Gly Ile Pro Pro Lys Ile Glu Ala Leu Pro Ser Asp Ile Ser Ile Asp 1 5 10 15 Glu Gly Lys Val Leu Thr Val Ala Ser Cys Phe Thr Gly Glu Pro Thr 20 25 30 Pro Glu Val Thr Trp Ser Thr Gly Gly Arg Lys Ile His Ser Gln Glu 35 40 45 Gln Gly Arg Phe His Ile Glu Asn Thr Asp Asp Leu Thr Thr Leu Ile 50 55 60 Ile Met Asp Val Gln Lys Gln Asp Gly Gly Leu Tyr Thr Leu Ser Leu 65 70 75 80 Gly Asn Glu Phe Gly Ser Asp Ser Ala Thr Val Asn Ile His Ile Arg 85 90 95 Ser Ile <210> 38 <211> 98 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <223> T.4 chain sequence <400> 38 Gly Ile Pro Pro Lys Ile Glu Ala Leu Pro Ser Asp Ile Ser Ile Asp 1 5 10 15 Glu Gly Lys Val Leu Cys Val Ala Ser Ala Phe Thr Gly Glu Pro Thr 20 25 30 Pro Glu Val Thr Trp Ser Thr Gly Gly Arg Lys Ile His Ser Gln Glu 35 40 45 Gln Gly Arg Phe His Ile Glu Asn Thr Asp Asp Leu Thr Thr Leu Ile 50 55 60 Ile Met Asp Val Gln Lys Gln Asp Gly Gly Leu Tyr Thr Leu Ser Leu 65 70 75 80 Gly Asn Glu Phe Gly Ser Asp Ser Ala Thr Val Asn Ile His Ile Arg 85 90 95 Ser Ile <210> 39 <211> 103 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <223> T.5 chain sequence <400> 39 Lys Ala Gly Ile Arg Gly Ile Pro Pro Lys Ile Glu Cys Leu Pro Ser 1 5 10 15 Asp Ile Ser Ile Asp Glu Gly Lys Val Leu Thr Val Ala Ser Ala Phe 20 25 30 Thr Gly Glu Pro Thr Pro Glu Val Thr Trp Ser Thr Gly Gly Arg Lys 35 40 45 Ile His Ser Gln Glu Gln Gly Arg Phe His Ile Glu Asn Thr Asp Asp 50 55 60 Leu Thr Thr Leu Ile Ile Met Asp Val Gln Lys Gln Asp Gly Gly Leu 65 70 75 80 Tyr Thr Leu Ser Leu Gly Asn Glu Phe Gly Ser Asp Ser Ala Thr Val 85 90 95 Asn Ile His Ile Arg Ser Ile 100 <210> 40 <211> 103 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <223> T.1-L1 chain sequence <400> 40 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ile Pro Pro Lys Ile Glu Cys Leu Pro Ser 1 5 10 15 Asp Ile Ser Ile Asp Glu Gly Lys Val Leu Thr Val Ala Ser Ala Phe 20 25 30 Thr Gly Glu Pro Thr Pro Glu Val Thr Trp Ser Thr Gly Gly Arg Lys 35 40 45 Ile His Ser Gln Glu Gln 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<220> <221> DOMAIN <223> O.3 chain sequence <400> 44 Ser Gly Ala Pro Arg Phe Leu Thr Cys Pro Lys Ala Phe Val Val Ser 1 5 10 15 Val Gly Lys Asp Ala Thr Leu Ser Cys Gln Ile Val Gly Asn Pro Thr 20 25 30 Pro Gln Val Ser Trp Glu Lys Asp Gln Gln Pro Val Ala Ala Gly Ala 35 40 45 Arg Phe Arg Leu Ala Gln Asp Gly Asp Leu Tyr Arg Leu Thr Ile Leu 50 55 60 Asp Leu Ala Leu Gly Asp Ser Gly Gln Tyr Val Cys Arg Ala Arg Asn 65 70 75 80 Ala Ile Gly Glu Ala Phe Ala Ala Val Gly Leu Gln Val Asp Ala Glu 85 90 95 Ala <210> 45 <211> 97 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <223> O.4 chain sequence <400> 45 Ser Gly Ala Pro Arg Phe Leu Thr Arg Pro Lys Ala Phe Val Val Ser 1 5 10 15 Val Gly Lys Asp Ala Thr Leu Ser Ser Gln Ile Val Gly Asn Pro Thr 20 25 30 Pro Gln Val Ser Trp Glu Lys Asp Gln Gln Pro Val Ala Ala Gly Ala 35 40 45 Arg Phe Arg Leu Ala Gln Asp Gly Asp Leu Tyr Arg Leu Thr Ile Leu 50 55 60 Asp Leu Ala Leu Gly Asp Ser Gly Gln Tyr Val Ser Arg Ala Arg Asn 65 70 75 80 Ala Ile Gly Glu Ala Phe Ala Cys Val Gly Leu Gln Val Asp Ala Glu 85 90 95 Ala <210> 46 <211> 97 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <223> O.5 chain sequence <400> 46 Ser Gly Cys Pro Arg Phe Leu Thr Arg Pro Lys Ala Phe Val Val Ser 1 5 10 15 Val Gly Lys Asp Ala Thr Leu Ser Ser Gln Ile Val Gly Asn Pro Thr 20 25 30 Pro Gln Val Ser Trp Glu Lys Asp Gln Gln Pro Val Ala Ala Gly Ala 35 40 45 Arg Phe Arg Leu Ala Gln Asp Gly Asp Leu Tyr Arg Leu Thr Ile Leu 50 55 60 Asp Leu Ala Leu Gly Asp Ser Gly Gln Tyr Val Ser Arg Ala Arg Asn 65 70 75 80 Ala Ile Gly Glu Ala Phe Ala Ala Val Gly Leu Gln Val Asp Ala Glu 85 90 95 Ala <210> 47 <211> 97 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <223> O.6 chain sequence <400> 47 Ser Gly Ala Pro Arg Phe Leu Thr Cys Pro Lys Ala Phe Val Val Ser 1 5 10 15 Val Gly Lys Asp Ala Thr Leu Ser Ser Gln Ile Val Gly Asn Pro Thr 20 25 30 Pro Gln Val Ser Trp Glu Lys Asp Gln Gln Pro Val Ala Ala Gly Ala 35 40 45 Arg Phe Arg Leu Ala Gln Asp Gly Asp Leu Tyr Arg Leu Thr Ile Leu 50 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Gln Gln Pro Val Ala Ala Gly Ala 35 40 45 Arg Phe Arg Leu Ala Gln Asp Gly Asp Leu Tyr Arg Leu His Ile Leu 50 55 60 Asp Leu Ala Leu Gly Asp Ser Gly Gln Tyr Val Ser Arg Ala Arg Asn 65 70 75 80 Ala Ile Gly Glu Ala Phe Ala Cys Val Gly Leu Gln Val Asp Ala Glu 85 90 95 Ala <210> 50 <211> 97 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <223> O.9 chain sequence <400> 50 Ser Gly Ala Pro Arg Phe Leu Thr Arg Pro Leu Ala Phe Val Val Ser 1 5 10 15 Val Gly Lys Asp Ala Thr Leu Ser Ser Gln Ile Val Gly Asn Pro Thr 20 25 30 Pro Gln Val Ser Trp Glu Lys Asp Gln Gln Pro Val Ala Ala Gly Ala 35 40 45 Arg Phe Arg Leu Ala Gln Asp Gly Asp Leu Tyr Arg Leu Lys Ile Leu 50 55 60 Asp Leu Ala Leu Gly Asp Ser Gly Gln Tyr Val Ser Arg Ala Arg Asn 65 70 75 80 Ala Ile Gly Glu Ala Phe Ala Cys Val Gly Leu Gln Val Asp Ala Glu 85 90 95 Ala <210> 51 <211> 97 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <223> O.10 chain sequence <400> 51 Ser Gly Ala Pro Arg Phe Leu Thr Arg Pro Leu Ala Phe Val Val Ser 1 5 10 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Sequence <220> <221> DOMAIN <223> O.12 chain sequence <400> 53 Asp Gln Pro Gln Phe Ser Gly Ala Pro Arg Phe Lys Thr Arg Pro Lys 1 5 10 15 Ala Phe Val Val Ser Val Gly Lys Asp Ala Thr Leu Ser Ser Gln Ile 20 25 30 Val Gly Asn Pro Thr Pro Gln Val Ser Trp Glu Lys Asp Gln Gln Pro 35 40 45 Val Ala Ala Gly Ala Arg Phe Arg Leu Ala Gln Asp Gly Asp Leu Tyr 50 55 60 Arg Leu Lys Ile Leu Asp Leu Ala Leu Gly Asp Ser Gly Gln Tyr Val 65 70 75 80 Ser Arg Ala Arg Asn Ala Ile Gly Glu Ala Phe Ala Cys Val Gly Leu 85 90 95 Gln Val Asp Ala Glu Ala 100 <210> 54 <211> 102 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <223> O.13 chain sequence <400> 54 Asp Gln Pro Gln Phe Ser Gly Ala Pro Arg Phe Lys Thr Arg Pro Lys 1 5 10 15 Ala Phe Val Val Ser Val Gly Lys Asp Ala Thr Leu Ser Ser Gln Ile 20 25 30 Val Gly Asn Pro Thr Pro Gln Val Ser Trp Glu Lys Asp Gln Gln Pro 35 40 45 Val Ala Ala Gly Ala Arg Phe Arg Leu Ala Gln Asp Gly Asp Leu Tyr 50 55 60 Arg Leu His Ile Leu Asp Leu Ala Leu Gly Asp Ser Gly Gln Tyr Val 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Gln Gln Pro 35 40 45 Val Ala Ala Gly Ala Arg Phe Arg Leu Ala Gln Asp Gly Asp Leu Tyr 50 55 60 Arg Leu His Ile Leu Asp Leu Ala Leu Gly Asp Ser Gly Gln Tyr Val 65 70 75 80 Ser Arg Ala Arg Asn Ala Ile Gly Glu Ala Phe Ala Cys Val Gly Leu 85 90 95 Gln Val Asp Ala Glu Ala 100 <210> 57 <211> 102 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <223> O.4-L1 chain sequence <400> 57 Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gly Ala Pro Arg Phe Leu Thr Arg Pro Lys 1 5 10 15 Ala Phe Val Val Ser Val Gly Lys Asp Ala Thr Leu Ser Ser Gln Ile 20 25 30 Val Gly Asn Pro Thr Pro Gln Val Ser Trp Glu Lys Asp Gln Gln Pro 35 40 45 Val Ala Ala Gly Ala Arg Phe Arg Leu Ala Gln Asp Gly Asp Leu Tyr 50 55 60 Arg Leu Thr Ile Leu Asp Leu Ala Leu Gly Asp Ser Gly Gln Tyr Val 65 70 75 80 Ser Arg Ala Arg Asn Ala Ile Gly Glu Ala Phe Ala Cys Val Gly Leu 85 90 95 Gln Val Asp Ala Glu Ala 100 <210> 58 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <223> O.4-L2 chain sequence <400> 58 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gly Ala Pro Arg Phe 1 5 10 15 Leu Thr Arg Pro Lys Ala Phe Val Val Ser Val Gly Lys Asp Ala Thr 20 25 30 Leu Ser Ser Gln Ile Val Gly Asn Pro Thr Pro Gln Val Ser Trp Glu 35 40 45 Lys Asp Gln Gln Pro Val Ala Ala Gly Ala Arg Phe Arg Leu Ala Gln 50 55 60 Asp Gly Asp Leu Tyr Arg Leu Thr Ile Leu Asp Leu Ala Leu Gly Asp 65 70 75 80 Ser Gly Gln Tyr Val Ser Arg Ala Arg Asn Ala Ile Gly Glu Ala Phe 85 90 95 Ala Cys Val Gly Leu Gln Val Asp Ala Glu Ala 100 105 <210> 59 <211> 98 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <223> OL.1 chain sequence <400> 59 Gln Gly Ser Pro Pro Glu Phe Leu Arg Phe Pro Arg Pro Val Arg Val 1 5 10 15 Val Ser Gly Ala Glu Ala Glu Leu Lys Cys Val Val Leu Gly Glu Pro 20 25 30 Pro Pro Val Val Val Trp Glu Lys Gly Gly Gln Gln Leu Ala Ala Ser 35 40 45 Glu Arg Leu Ser Phe Pro Ala Asp Gly Ala Glu His Gly Leu Leu Leu 50 55 60 Thr Ala Ala Leu Pro Thr Asp Ala Gly Cys Tyr Val Cys Arg Ala Arg 65 70 75 80 Asn Ala Ala Gly Glu Ala Tyr Ala Ala Ala Ala Val Thr Val Leu Glu 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Asp Ala Gly Val Tyr Val Cys Arg Ala Arg 65 70 75 80 Asn Ala Ala Gly Glu Cys Tyr Ala Ala Ala Ala Val Thr Val Leu Glu 85 90 95 Pro Pro <210> 62 <211> 98 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <223> OL.4 chain sequence <400> 62 Gln Gly Ser Pro Pro Glu Phe Leu Arg Phe Pro Arg Pro Val Arg Val 1 5 10 15 Val Ser Gly Ala Glu Ala Glu Leu Lys Ser Val Val Leu Gly Glu Pro 20 25 30 Pro Pro Val Val Val Trp Glu Lys Gly Gly Gln Gln Leu Ala Ala Ser 35 40 45 Glu Arg Leu Ser Phe Pro Ala Asp Gly Ala Glu His Gly Leu Leu Leu 50 55 60 Thr Ala Ala Leu Pro Thr Asp Ala Gly Cys Tyr Val Ser Arg Ala Arg 65 70 75 80 Asn Ala Ala Gly Glu Ala Tyr Ala Ala Ala Ala Val Thr Val Leu Glu 85 90 95 Pro Pro <210> 63 <211> 98 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <223> OL.5 chain sequence <400> 63 Gln Gly Ser Pro Pro Glu Phe Leu Arg Phe Pro Arg Pro Val Arg Val 1 5 10 15 Val Ser Gly Ala Glu Ala Glu Leu Lys Ser Val Val Leu Gly Glu Pro 20 25 30 Pro Pro Val Val Val Trp Glu Lys Gly Gly Gln Gln Leu Ala Ala Ser 35 40 45 Glu Arg Leu Ser Phe Pro Ala Asp Gly Ala Glu His Gly Leu Leu Leu 50 55 60 Thr Ala Ala Leu Pro Thr Asp Ala Gly Val Tyr Val Ser Arg Ala Arg 65 70 75 80 Asn Ala Ala Cys Glu Ala Tyr Ala Ala Ala Ala Val Thr Val Leu Glu 85 90 95 Pro Pro <210> 64 <211> 98 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <223> OL.6 chain sequence <400> 64 Gln Gly Ser Pro Pro Glu Phe Leu Arg Phe Pro Arg Pro Val Arg Val 1 5 10 15 Val Ser Gly Ala Glu Ala Glu Leu Lys Ser Val Val Leu Gly Glu Pro 20 25 30 Pro Pro Val Val Val Trp Glu Lys Gly Gly Gln Gln Leu Ala Ala Ser 35 40 45 Glu Arg Leu Ser Phe Pro Ala Asp Gly Ala Glu His Gly Leu Leu Leu 50 55 60 Thr Ala Ala Leu Pro Thr Asp Ala Gly Val Tyr Val Ser Arg Ala Arg 65 70 75 80 Asn Ala Ala Gly Glu Cys Tyr Ala Ala Ala Ala Val Thr Val Leu Glu 85 90 95 Pro Pro <210> 65 <211> 98 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <223> T.7 chain sequence <400> 65 Gly Ile Pro Pro Lys Ile Glu Cys Leu Pro Ser Asp Ile Ser Ile Asp 1 5 10 15 Glu Gly Lys Val Leu Thr Val Ala Ser Ala Phe Thr Gly Glu Pro Thr 20 25 30 Pro Glu Val Thr Trp Ser Thr Gly Gly Arg Lys Ile His Ser Gln Glu 35 40 45 Gln Gly Arg Phe His Ile Glu Asn Thr Asp Asp Leu Thr Thr Leu Ile 50 55 60 Ile Ser Asp Val Gln Lys Gln Asp Gly Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Leu 65 70 75 80 Gly Asn Glu Phe Gly Ser Asp Ser Ala Thr Val Asn Ile His Ile Arg 85 90 95 Ser Ile <210> 66 <211> 98 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <223> T.8 chain sequence <400> 66 Gly Ile Pro Pro Lys Ile Glu Cys Leu Pro Ser Asp Ile Ser Ile Asp 1 5 10 15 Glu Gly Lys Val Leu Thr Val Ala Ser Ala Phe Thr Gly Glu Pro Thr 20 25 30 Pro Glu Val Thr Trp Ser Thr Gly Gly Arg Lys Ile His Ser Gln Glu 35 40 45 Gln Gly Arg Phe His Ile Glu Asn Thr Asp Asp Leu Thr Thr Leu Ile 50 55 60 Ile Lys Asp Val Gln Arg Gln Asp Gly Gly Leu Tyr Thr Leu Thr Leu 65 70 75 80 Arg Asn Glu Phe Gly Ser Asp Ser Ala Thr Val Asn Ile His Ile Arg 85 90 95 Ser Ile <210> 67 <211> 98 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <223> T.9 chain sequence <400> 67 Gly Ile Trp Pro Lys Ile Glu Cys Leu Pro Ile Asp Leu Ser Ile Asp 1 5 10 15 Glu Gly Lys Val Leu Met Val Ala Ser Ala Phe Thr Gly Glu Pro Thr 20 25 30 Pro Glu Val Thr Trp Ser Thr Gly Gly Arg Lys Ile His Ser Gln Glu 35 40 45 Gln Gly Arg Phe His Ile Glu Asn Thr Asp Asp Leu Thr Thr Leu Ile 50 55 60 Ile Met Asp Val Gln Lys Gln Asp Gly Gly Leu Tyr Thr Leu Ser Leu 65 70 75 80 Gly Met Glu Phe Gly Ser Asp Ser Ala Thr Val Asn Ile His Ile Arg 85 90 95 Ser Ile <210> 68 <211> 98 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <223> T.10 chain sequence <400> 68 Gly Ile Pro Pro Lys Ile Glu Cys Leu Pro Ile Asp Ile Ser Ile Asp 1 5 10 15 Glu Gly Lys Val Leu Thr Val Ala Ser Ala Phe Thr Gly Glu Pro Thr 20 25 30 Pro Glu Val Thr Trp Ser Thr Gly Gly Arg Lys Ile His Ser Gln Glu 35 40 45 Gln Gly Arg Phe His Ile Glu Asn Thr Asp Asp Leu Thr Thr Leu Ile 50 55 60 Ile Lys Asp Val Gln Lys Gln Asp Gly Gly Leu Tyr Thr Leu Thr Leu 65 70 75 80 Arg Asn Glu Phe Gly Ser Asp Ser Ala Thr 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Ile Met Asp Val Gln Lys Gln Asp Gly Gly Val Tyr Thr Leu Ser Leu 65 70 75 80 Gly Asn Glu Phe Gly Ser Asp Ser Ala Thr Val Asn Ile His Ile Arg 85 90 95 Ser Ile <210> 71 <211> 98 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <223> T.13 chain sequence <400> 71 Gly Ile Pro Pro Lys Ile Glu Cys Leu Pro Ser Asp Ile Ser Ile Asp 1 5 10 15 Glu Gly Lys Val Leu Thr Val Ala Ser Ala Phe Thr Gly Glu Pro Thr 20 25 30 Pro Glu Val Thr Trp Ser Thr Gly Gly Arg Lys Ile His Ser Gln Glu 35 40 45 Gln Gly Arg Phe His Ile Glu Ser Thr Glu Asp Leu Thr Thr Leu Ile 50 55 60 Ile Met Asp Val Gln Lys Gln Asp Gly Gly Val Tyr Thr Leu Ser Leu 65 70 75 80 Gly Asn Glu Phe Gly Ser Asp Ser Ala Thr Val Asn Ile His Ile Arg 85 90 95 Ser Ile <210> 72 <211> 98 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <223> T.14 chain sequence <400> 72 Gly Ile Pro Pro Lys Ile Glu Cys Leu Pro Ser Asp Ile Ser Ile Asp 1 5 10 15 Glu Gly Lys Val Leu Thr Val Ala Ser Ala Phe Thr Gly Glu Pro Thr 20 25 30 Pro Glu Val Thr Trp Ser Thr Gly Gly Arg Lys Ile His Ser Gln Glu 35 40 45 Gln Gly Arg Phe His Ile Glu Ser Thr Glu Asp Leu Thr Thr Leu Ile 50 55 60 Ile Ser Asp Val Gln Lys Gln Asp Gly Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Leu 65 70 75 80 Gly Asn Glu Phe Gly Ser Asp Ser Ala Thr Val Asn Ile His Ile Arg 85 90 95 Ser Ile <210> 73 <211> 103 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <223> T.10-L1 sequence <400> 73 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ile Pro Pro Lys Ile Glu Cys Leu Pro Ile 1 5 10 15 Asp Ile Ser Ile Asp Glu Gly Lys Val Leu Thr Val Ala Ser Ala Phe 20 25 30 Thr Gly Glu Pro Thr Pro Glu Val Thr Trp Ser Thr Gly Gly Arg Lys 35 40 45 Ile His Ser Gln Glu Gln Gly Arg Phe His Ile Glu Asn Thr Asp Asp 50 55 60 Leu Thr Thr Leu Ile Ile Lys Asp Val Gln Lys Gln Asp Gly Gly Leu 65 70 75 80 Tyr Thr Leu Thr Leu Arg Asn Glu Phe Gly Ser Asp Ser Ala Thr Val 85 90 95 Asn Ile His Ile Arg Ser Ile 100 <210> 74 <211> 103 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <223> T.15 chain sequence <400> 74 Lys Ala Gly Ile Arg Gly Ile Pro Pro 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Pro Gln Val Ser Trp Glu Lys Asp Gln Gln Pro Val Ala Ala Gly Ala 35 40 45 Arg Phe Arg Leu Leu Gln Asp Gly Asp Leu Tyr Arg Leu Lys Ile Leu 50 55 60 Asp Leu Ala Leu Gly Asp Ser Gly Gln Tyr Val Ser Arg Ala Arg Asn 65 70 75 80 Ala Ile Gly Glu Ala Phe Ala Cys Val Gly Leu Gln Val Asp Ala Glu 85 90 95 Ala <210> 80 <211> 97 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <223> O.20 chain sequence <400> 80 Ser Gly Ala Pro Arg Phe Leu Thr Arg Pro Leu Ala Phe Val Val Ser 1 5 10 15 Val Gly Lys Asp Ala Thr Leu Ser Ser Gln Ile Val Gly Asn Pro Thr 20 25 30 Pro Gln Val Ser Trp Glu Lys Asp Lys Gln Pro Val Thr Ala Gly Ala 35 40 45 Arg Phe Arg Leu Ala Gln Asp Gly Asp Leu Tyr Arg Leu Lys Ile Leu 50 55 60 Asp Leu Gln Leu Ser Asp Ser Gly Gln Tyr Val Ser Arg Ala Arg Asn 65 70 75 80 Ala Ile Gly Glu Ala Phe Ala Cys Leu Gly Leu Gln Val Asp Ala Glu 85 90 95 Ala <210> 81 <211> 97 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <223> O.21 chain sequence <400> 81 Ser Gly Ala Pro Arg Phe Leu Thr Arg Pro 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Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <223> O.20-L1 chain sequence <400> 83 Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gly Ala Pro Arg Phe Leu Thr Arg Pro Leu 1 5 10 15 Ala Phe Val Val Ser Val Gly Lys Asp Ala Thr Leu Ser Ser Gln Ile 20 25 30 Val Gly Asn Pro Thr Pro Gln Val Ser Trp Glu Lys Asp Lys Gln Pro 35 40 45 Val Thr Ala Gly Ala Arg Phe Arg Leu Ala Gln Asp Gly Asp Leu Tyr 50 55 60 Arg Leu Lys Ile Leu Asp Leu Gln Leu Ser Asp Ser Gly Gln Tyr Val 65 70 75 80 Ser Arg Ala Arg Asn Ala Ile Gly Glu Ala Phe Ala Cys Leu Gly Leu 85 90 95 Gln Val Asp Ala Glu Ala 100 <210> 84 <211> 102 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <223> O.22-L1 chain sequence <400> 84 Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gly Ala Pro Arg Phe Leu Thr Arg Pro Leu 1 5 10 15 Ser Tyr Val Val Ser Val Gly Lys Asp Ala Ser Leu Ser Ser Gln Ile 20 25 30 Val Gly Asn Pro Thr Pro Gln Val Ser Trp Glu Lys Asp Gln Leu Pro 35 40 45 Val Thr Ala Gly Ala Arg Phe Arg Leu Ala Gln Asp Gly Asp Leu Tyr 50 55 60 Arg Leu Lys Ile Leu Asp Leu Gln Leu Ser Asp Ser 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Pro Gln Val Ser Trp Glu 35 40 45 Lys Asp Gln Leu Pro Val Thr Ala Gly Ala Arg Phe Arg Leu Ala Gln 50 55 60 Asp Gly Asp Leu Tyr Arg Leu Lys Ile Leu Asp Leu Gln Leu Ser Asp 65 70 75 80 Ser Gly Gln Tyr Val Ser Arg Ala Arg Asn Ala Ile Gly Glu Ala Phe 85 90 95 Ala Cys Val Gly Leu Glu Val Gly Ala Glu Ala 100 105 <210> 87 <211> 452 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> CHAIN <223> Sequence of DI-1 chain 1 (DI-1-H1) <400> 87 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Thr Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asp Pro Gly Thr Thr Val Ile Met Ser Trp Phe Asp Pro Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 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Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 290 295 300 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 340 345 350 Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 355 360 365 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 Lys <210> 127 <211> 103 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <223> T.6 chain sequence <400> 127 Lys Ala Gly Ile Arg Gly Ile Pro Pro Lys Ile Glu Ala Leu Pro Ser 1 5 10 15 Asp 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<212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <223> T.16 chain sequence <400> 129 Gly Ile Pro Pro Lys Ile Glu Cys Leu Pro Ile Asp Ile Ser Ile Asp 1 5 10 15 Glu Gly Lys Val Leu Thr Val Ala Ser Ala Phe Thr Gly Glu Pro Thr 20 25 30 Pro Glu Val Thr Trp Ser Thr Gly Gly Arg Lys Ile His Ser Gln Glu 35 40 45 Gln Gly Arg Phe His Ile Glu Asn Thr Asp Asp Ser Thr Thr Leu Thr 50 55 60 Ile Lys Asp Val Gln Lys Gln Asp Gly Gly Leu Tyr Thr Leu Thr Leu 65 70 75 80 Arg Asn Glu Phe Gly Ser Asp Ser Ala Thr Val Asn Ile His Ile Arg 85 90 95 Ser Ile <210> 130 <211> 98 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <223> T.17 chain sequence <400> 130 Gly Ile Pro Pro Lys Ile Glu Cys Leu Pro Ile Asp Ile Ser Ile Asp 1 5 10 15 Glu Gly Lys Cys Leu Thr Val Ala Ser Ala Phe Thr Gly Glu Pro Thr 20 25 30 Pro Glu Val Thr Trp Ser Thr Gly Gly Arg Lys Ile His Ser Gln Glu 35 40 45 Gln Gly Arg Phe His Ile Glu Asn Thr Asp Asp Ser Thr Thr Leu Thr 50 55 60 Ile Lys Asp Val Gln Lys Gln Asp Gly Gly Leu Tyr Thr Leu 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Ser Gly Ala Pro Arg Phe Leu Thr Arg Pro Lys Ala Ser Val Val Ser 1 5 10 15 Val Gly Lys Asp Ala Thr Leu Ser Cys Gln Ile Val Gly Asn Pro Phe 20 25 30 Pro Gln Val Ser Trp Glu Lys Asp Lys Gln Pro Val Thr Ala Gly Val 35 40 45 Arg Phe Arg Leu Ala Gln Asp Gly Asp Leu Tyr Arg Leu Lys Ile Leu 50 55 60 Asp Leu Gln Leu Ser Asp Ser Gly Gln Tyr Val Cys Arg Ala Arg Asn 65 70 75 80 Ala His Gly Glu Ala Phe Ala Cys Leu Gly Leu Gln Val Asp Ala Glu 85 90 95 Ala <210> 137 <211> 97 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <223> O.29 chain sequence <400> 137 Ser Gly Cys Pro Arg Phe Leu Thr Arg Pro Lys Ala Ser Val Val Ser 1 5 10 15 Val Gly Lys Asp Ala Thr Leu Ser Cys Gln Ile Val Gly Asn Pro Phe 20 25 30 Pro Gln Val Ser Trp Glu Lys Asp Lys Gln Pro Val Thr Ala Gly Val 35 40 45 Arg Phe Arg Leu Ala Gln Asp Gly Asp Leu Tyr Arg Leu Lys Ile Leu 50 55 60 Asp Leu Gln Leu Ser Asp Ser Gly Gln Tyr Val Cys Arg Ala Arg Asn 65 70 75 80 Ala His Gly Glu Ala Phe Ala Cys Leu Gly Leu Gln Val Asp Ala Glu 85 90 95 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Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 172 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <223> Sequence of light chain variable region of J1 <400> 172 Ser Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asp 20 25 30 Val Thr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Val Ser Glu His Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala 65 70 75 80 Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His His Arg Phe Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 173 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <223> Amino acid sequence of C-terminal truncated sequence 1 of CH1 <400> 173 Ala Ser Thr Lys Gly 1 5 <210> 174 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <223> Amino acid sequence of C-terminal truncated sequence 1 of CL <400> 174 Arg Thr Val Ala Ser 1 5 <210> 175 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <223> Amino acid sequence of linker sequence 1 <400> 175 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 176 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <223> Amino acid sequence of linker sequence 2 <400> 176 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 177 <211> 227 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <223> Sequence of Fc portion of heavy chain constant region of hole-IgG1 <400> 177 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly 1 5 10 15 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 65 70 75 80 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125 Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser 130 135 140 Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 145 150 155 160 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 165 170 175 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val 180 185 190 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 195 200 205 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 210 215 220 Pro Gly Lys 225 <210> 178 <211> 227 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <223> Sequence of Fc portion of heavy chain constant region of knob-IgG1 <400> 178 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly 1 5 10 15 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 65 70 75 80 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125 Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser 130 135 140 Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 145 150 155 160 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 165 170 175 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 180 185 190 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 195 200 205 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 210 215 220 Pro Gly Lys 225 <210> 179 <211> 103 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <223> Sequence of CH1 portion of heavy chain constant region of IgG1 <400> 179 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 100 <210> 180 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Titin N-terminal 5AA <400> 180 Lys Ala Gly Ile Arg 1 5 <210> 181 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Obscurin N-terminal 5AA <400> 181 Asp Gln Pro Gln Phe 1 5

Claims (22)

  1. 티틴(Titin)-T 쇄 및 옵스큐린(Obscurin)-O 쇄, 또는 티틴-T 쇄 및 옵스큐린-유사-O 쇄를 포함하는 이량체화 폴리펩티드로서,
    i) 티틴-T 쇄가 서열번호 32의 변이체이고, 이때 상기 변이체가 서열번호 32와 비교하여 위치 60 및 64로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 아미노산 잔기 치환을 갖고/갖거나;
    ii) 옵스큐린-O 쇄가 서열번호 33의 변이체이고, 이때 상기 변이체가 서열번호 33과 비교하여 위치 13, 32, 48, 66, 82 및 93으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 아미노산 잔기 치환을 갖되;
    a) 변이체가 위치 13, 48, 66, 82 또는 93에 아미노산 잔기 치환을 갖지 않고 위치 32에 아미노산 잔기 치환을 가질 때, 위치 32의 아미노산 치환은 32P가 아니고;
    b) 변이체가 위치 32, 48, 66, 82 또는 93에 아미노산 잔기 치환을 갖지 않고 위치 13에 아미노산 잔기 치환을 가질 때, 위치 13의 아미노산 치환은 13Y가 아니고;
    c) 변이체가 위치 48, 66, 82 또는 93에 아미노산 잔기 치환을 갖지 않고 위치 13 및 32에 아미노산 잔기 치환을 가질 때, 위치 13의 아미노산 잔기 치환은 13Y가 아니고, 위치 32의 아미노산 잔기 치환은 32P가 아닌,
    이량체화 폴리펩티드.
  2. 제1항에 있어서,
    서열번호 32의 변이체가 60S 및 64T로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기 치환을 갖고/갖거나, 서열번호 33의 변이체가 13S, 32F, 48V, 66C, 82H 및 93C로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기 치환을 갖고;
    바람직하게는, 서열번호 32의 변이체가 60S 및 64T의 아미노산 잔기 치환을 갖고/갖거나, 서열번호 33의 변이체가 다음 a) 내지 c) 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 잔기 치환을 갖는,
    이량체화 폴리펩티드:
    a) 32F 및 48V;
    b) 13S, 32F, 48V 및 82H; 및
    c) 13S, 32F, 48V, 66C, 82H 및 93C.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    서열번호 32의 변이체가 서열번호 32와 비교하여 위치 3, 8, 11, 13, 20, 22, 25, 26, 39, 40, 42, 45, 47, 49, 56, 58, 66, 70, 75, 77, 79, 81, 82, 83 및 84로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 아미노산 잔기 치환을 추가로 갖고;
    바람직하게는, 서열번호 32의 변이체가 서열번호 32와 비교하여 3W, 8C, 11I, 13L, 20C, 22M/22C, 25S, 26C, 39T, 40S, 42K, 45S, 47E, 49G, 56S, 58E, 66S/66K, 70R, 75V, 77S, 79T, 81R, 82M, 83D 및 84L로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기 치환을 추가로 포함하고;
    보다 바람직하게는, 서열번호 32의 변이체가 서열번호 32와 비교하여 다음 a) 내지 l) 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 잔기 치환을 추가로 포함하고:
    a) 8C, 25S 및 39T;
    b) 20C, 25S 및 39T;
    c) 25S, 26C 및 39T;
    d) 22C, 25S 및 39T;
    e) 8C, 25S, 39T, 66S 및 77S;
    f) 8C, 25S, 39T, 66K, 70R, 79T 및 81R;
    g) 3W, 8C, 11I, 13L, 22M, 25S, 39T 및 82M;
    h) 8C, 11I, 25S, 39T, 66K, 79T 및 81R;
    i) 8C, 25S, 39T, 40S, 42K, 45S, 47E, 49G, 56S, 58E, 75V, 83D 및 84L;
    j) 8C, 25S, 39T, 47E, 49G, 56S, 58E 및 75V;
    k) 8C, 25S, 39T, 56S, 58E 및 75V; 및
    I) 8C, 25S, 39T, 56S, 58E, 66S 및 77S;
    가장 바람직하게는, 서열번호 32의 변이체가 서열번호 32와 비교하여 다음 A) 내지 C) 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 잔기 치환을 갖는,
    이량체화 폴리펩티드:
    A) 8C, 11I, 25S, 39T, 60S, 64T, 66K, 79T 및 81R;
    B) 8C, 11I, 20C, 25S, 39T, 60S, 64T, 66K, 79T 및 81R; 및
    C) 8C, 11I, 25S, 26C, 39T, 60S, 64T, 66K, 79T 및 81R.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    서열번호 33의 변이체가 서열번호 33과 비교하여 위치 2, 3, 7, 9, 11, 12, 13, 14, 17, 20, 22, 25, 30, 32, 34, 36, 41, 42, 44, 45, 53, 58, 62, 67, 69, 76, 88, 89, 92, 94 및 97로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 아미노산 잔기 치환을 추가로 갖고;
    바람직하게는, 서열번호 33의 변이체가 서열번호 33과 비교하여 2E, 3C, 7K/7R, 9C, 11L, 12S, 13Y, 14T, 17E, 20L, 22M/22S, 25S, 30D, 32P, 34E, 36T, 41K, 42L, 44I, 45T, 53L, 58V, 62E/62K/62H, 67Q/67T, 69S, 76S, 88C, 89L, 92E, 94G 및 97G로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기 치환을 추가로 갖고;
    보다 바람직하게는, 서열번호 33의 변이체가 서열번호 33과 비교하여 다음 A) 내지 R) 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 잔기 치환을 추가로 갖고:
    A) 88C;
    B) 3C;
    C) 9C;
    D) 25S, 76S 및 88C;
    E) 25S, 76S 및 3C;
    F) 25S, 76S 및 9C;
    G) 7K, 25S, 62K, 76S 및 88C;
    H) 7K, 25S, 62H, 76S 및 88C;
    I) 7R, 25S, 62K, 76S 및 88C;
    G) 7R, 25S, 62H, 76S 및 88C;
    K) 11L, 25S, 62K, 76S 및 88C;
    L) 11L, 25S, 62H, 76S 및 88C;
    M) 12S, 13Y, 14T, 22S, 25S, 62K, 76S 및 88C;
    N) 2E, 11L, 17E, 25S, 30D, 32P, 34E, 36T, 44I, 45T, 58V, 62E, 67Q, 69S, 76S, 88C 및 97G;
    O) 11L, 20L, 22M, 25S, 53L, 62K, 76S 및 88C;
    P) 11L, 25S, 41K, 45T, 62K, 67Q, 69S, 76S, 88C 및 89L;
    Q) 11L, 25S, 42L, 45T, 62K, 67T, 69S, 76S, 88C, 92E 및 94G; 및
    R) 11L, 12S, 13Y, 22S, 25S, 42L, 45T, 62K, 67Q, 69S, 76S, 88C, 92E 및 94G;
    가장 바람직하게는, 서열번호 33의 변이체가 서열번호 33과 비교하여 다음 a) 내지 j) 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 잔기 치환을 갖는,
    이량체화 폴리펩티드:
    a) 25S, 32F, 41K, 45T, 48V, 62K, 67Q, 69S, 76S, 88C 및 89L;
    b) 13S, 25S, 32F, 41K, 45T, 48V, 62K, 67Q, 69S, 76S, 82H, 88C 및 89L;
    c) 3C, 13S, 25S, 32F, 41K, 45T, 48V, 62K, 67Q, 69S, 76S, 82H, 88C 및 89L;
    d) 9C, 13S, 25S, 32F, 41K, 45T, 48V, 62K, 67Q, 69S, 76S, 82H, 88C 및 89L;
    e) 13S, 32F, 41K, 45T, 48V, 62K, 67Q, 69S, 82H, 88C 및 89L;
    f) 3C, 13S, 32F, 41K, 45T, 48V, 62K, 67Q, 69S, 82H, 88C 및 89L;
    g) 9C, 13S, 32F, 41K, 45T, 48V, 62K, 67Q, 69S, 82H, 88C 및 89L;
    h) 13S, 25S, 32F, 41K, 45T, 48V, 62K, 66C, 67Q, 69S, 76S, 82H, 88C, 89L 및 93C;
    i) 3C, 13S, 25S, 32F, 41K, 45T, 48V, 62K, 66C, 67Q, 69S, 76S, 82H, 88C, 89L 및 93C; 및
    j) 9C, 13S, 25S, 32F, 41K, 45T, 48V, 62K, 66C, 67Q, 69S, 76S, 82H, 88C, 89L 및 93C.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    옵스큐린-유사-O 쇄가 서열번호 34 또는 그의 변이체이고, 서열번호 34의 변이체가 위치 6, 26, 74, 77, 84 및 86으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 아미노산 잔기 치환을 갖고;
    바람직하게는, 서열번호 34의 변이체가 6E, 26S, 74C, 77S, 84C 및 86C로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기 치환을 갖고;
    보다 바람직하게는, 서열번호 34의 변이체가 다음 A) 내지 F) 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 잔기 치환을 갖는,
    이량체화 폴리펩티드:
    A) 6E 및 74C;
    B) 6E 및 84C;
    C) 6E 및 86C;
    D) 6E, 26S, 77S 및 74C;
    E) 6E, 26S, 77S 및 84C; 및
    F) 6E, 26S, 77S 및 86C.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    티틴-T 쇄가 서열번호 32, 68 또는 127의 변이체이고, 상기 변이체가 60S 및 64T로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기 치환을 갖고; 옵스큐린-O 쇄가 서열번호 33, 80 또는 128의 변이체이고, 상기 변이체가 13S, 32F, 48V, 66C, 82H 및 93C로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기 치환을 갖고;
    바람직하게는, 티틴-T 쇄가 서열번호 129 내지 서열번호 131의 아미노산 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 85% 서열 동일성을 갖고, 옵스큐린-O 쇄가 서열번호 132 내지 서열번호 141의 아미노산 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 85% 서열 동일성을 갖고;
    보다 바람직하게는, 티틴-T 쇄가 서열번호 129 내지 서열번호 131 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 갖고, 옵스큐린-O 쇄가 서열번호 132 내지 서열번호 141 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 갖는,
    이량체화 폴리펩티드.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 이량체화 폴리펩티드를 포함하는 항원-결합 분자.
  8. 제7항에 있어서,
    제1 항원-결합 모이어티를 포함하고, 제1 항원-결합 모이어티가, 중쇄 가변 영역 VH1, 경쇄 가변 영역 VL1 및 이량체화 폴리펩티드를 포함하지만, 경쇄 불변 영역 CL 또는 중쇄 불변 영역 CH1은 포함하지 않는 도메인-조작된 Fab를 포함하고, VH1 및 VL1이 각각 링커를 통해 이량체화 폴리펩티드의 펩티드 쇄 중 어느 하나에 연결되고;
    바람직하게는, VH1의 C-말단이 링커를 통해 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 이량체화 폴리펩티드의 티틴-T 쇄의 N-말단에 융합되고, VL1의 C-말단이 링커를 통해 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 이량체화 폴리펩티드의 옵스큐린-O 쇄 또는 옵스큐린-유사-O 쇄의 N-말단에 융합되거나;
    VL1의 C-말단이 링커를 통해 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 이량체화 폴리펩티드의 티틴-T 쇄의 N-말단에 융합되고, VH1의 C-말단이 링커를 통해 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 이량체화 폴리펩티드의 옵스큐린-O 쇄 또는 옵스큐린-유사-O 쇄의 N-말단에 융합되는,
    항원-결합 분자.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서,
    다음을 포함하는 제1 항원-결합 모이어티를 포함하는 항원-결합 분자:
    a. N-말단에서 C-말단의 순서로 [VH1]-[링커 1]-[티틴-T 쇄]의 펩티드 쇄, 및 N-말단에서 C-말단의 순서로 [VL1]-[링커 2]-[옵스큐린-O 쇄 또는 옵스큐린-유사-O 쇄]의 펩티드 쇄; 또는
    b. N-말단에서 C-말단의 순서로 [VH1]-[링커 1]-[옵스큐린-O 쇄 또는 옵스큐린-유사-O 쇄]의 펩티드 쇄, 및 N-말단에서 C-말단의 순서로 [VL1]-[링커 2]-[티틴-T 쇄]의 펩티드 쇄
    [이때, 링커 1 및 링커 2는 동일하거나 상이하고;
    티틴-T 쇄 및 옵스큐린-O-쇄 또는 옵스큐린-유사-O-쇄는 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같고;
    바람직하게는,
    A) 링커 1 및 링커 2는 둘 다 (GxS)y 링커이고, 이때 x는 1 내지 5의 정수로 이루어진 군으로부터 선택되고, y는 0 내지 6의 정수로 이루어진 군으로부터 선택되거나,
    B) 링커 1은 CH1의 C-말단 절두 서열(truncated sequence)이고, 링커 2는 CL의 C-말단 절두 서열이고;
    보다 바람직하게는,
    A) 링커 1은 서열번호 173에 제시되고; 링커 2는 서열번호 174에 제시되거나;
    B) 링커 1 및 링커 2는 둘 다 서열번호 175에 제시되거나;
    C) 링커 1 및 링커 2는 둘 다 서열번호 176에 제시된다].
  10. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    Fc 영역을 추가로 포함하고, Fc 영역이 서로 결합할 수 있는 제1 서브유닛 Fc1 및 제2 서브유닛 Fc2를 포함하고;
    바람직하게는, Fc 영역이 동종이량체화를 감소시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 갖고/갖거나; Fc 영역이 Fc 수용체에 대한 Fc 영역의 결합을 감소시킬 수 있는 하나 이상의 아미노산 치환을 갖고;
    보다 바람직하게는, Fc1이 놉-앤-홀(knob-and-hole) 기술에 따른 돌기 구조를 갖고, Fc2가 놉-앤-홀 기술에 따른 기공(pore) 구조를 갖거나; Fc2가 놉-앤-홀 기술에 따른 돌기 구조를 갖고, Fc1이 놉-앤-홀 기술에 따른 기공 구조를 갖고;
    가장 바람직하게는, Fc1이 서열번호 177에 제시된 서열을 갖고, Fc2가 서열번호 178에 제시된 서열을 갖거나; Fc1이 서열번호 178에 제시된 서열을 갖고, Fc2가 서열번호 177에 제시된 서열을 갖는,
    항원-결합 분자.
  11. 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    제1 항원-결합 모이어티 및 제2 항원-결합 모이어티를 포함하고, 이때 제2 항원-결합 모이어티가 중쇄 가변 영역 VH2 및 경쇄 가변 영역 VL2를 포함하고, 제1 항원-결합 모이어티 및 제2 항원-결합 모이어티가 상이한 항원에 또는 동일한 항원상의 상이한 에피토프에 결합하고;
    바람직하게는, 제2 항원-결합 모이어티가 Fab를 포함하는,
    항원-결합 분자.
  12. 제11항에 있어서,
    제1 중쇄, 제1 경쇄, 제2 중쇄, 및 제2 경쇄를 포함하고; 이때
    a. 제1 중쇄가 N-말단에서 C-말단의 순서로 [VH1]-[링커 1]-[티틴-T 쇄]-[링커 3]-[Fc1]을 포함하고,
    제1 경쇄가 N-말단에서 C-말단의 순서로 [VL1]-[링커 2]-[옵스큐린-O 쇄 또는 옵스큐린-유사-O 쇄]를 포함하고,
    제2 중쇄가 N-말단에서 C-말단의 순서로 [VH2]-[CH1]-[Fc2]를 포함하고,
    제2 경쇄가 N-말단에서 C-말단의 순서로 [VL2]-[CL]을 포함하거나;
    b. 제1 중쇄가 N-말단에서 C-말단의 순서로 [VH1]-[링커 1]-[옵스큐린-O 쇄 또는 옵스큐린-유사-O 쇄]-[링커 3]-[Fc1]을 포함하고,
    제1 경쇄가 N-말단에서 C-말단의 순서로 [VL1]-[링커 2]-[티틴-T 쇄]를 포함하고,
    제2 중쇄가 N-말단에서 C-말단의 순서로 [VH2]-[CH1]-[Fc2]를 포함하고,
    제2 경쇄가 N-말단에서 C-말단의 순서로 [VL2]-[CL]을 포함하고;
    링커 1, 링커 2 및 링커 3은 동일하거나 상이하고;
    바람직하게는, Fc1 및 Fc2가 각각 독립적으로 동종이량체화를 감소시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 갖고;
    보다 바람직하게는,
    A) 링커 1, 링커 2 및 링커 3이 모두 (GxS)y이고, 이때 x가 1 내지 5의 정수로 이루어진 군으로부터 선택되고, y가 0 내지 6의 정수로 이루어진 군으로부터 선택되거나;
    B) 링커 1이 CH1의 C-말단 절두 서열이고, 링커 2가 CL의 C-말단 절두 서열이고, 링커 3이 (GxS)y 링커이고, 이때 x가 1 내지 5의 정수로 이루어진 군으로부터 선택되고, y가 0 내지 6의 정수로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    가장 바람직하게는,
    A) 링커 1이 서열번호 173에 제시되고; 링커 2가 서열번호 174에 제시되고; 링커 3이 결합이거나;
    B) 링커 1 및 링커 2가 둘 다 서열번호 175에 제시되고; 링커 3이 결합이거나;
    C) 링커 1 및 링커 2가 둘 다 서열번호 176에 제시되고; 링커 3이 결합인,
    항원-결합 분자.
  13. 제12항에 있어서,
    (I) 항원-결합 분자가 NGF 및 RANKL에 결합할 수 있고;
    바람직하게는, 항원-결합 분자가 제1 중쇄, 제1 경쇄, 제2 중쇄 및 제2 경쇄를 포함하고, 이때
    제1 중쇄가 N-말단에서 C-말단의 순서로 [VH1]-[링커 1]-[옵스큐린-O 쇄]-[링커 3]-[Fc1]을 포함하고,
    제1 경쇄가 N-말단에서 C-말단의 순서로 [VL1]-[링커 2]-[티틴-T 쇄]를 포함하고,
    제2 중쇄가 N-말단에서 C-말단의 순서로 [VH2]-[CH1]-[Fc2]를 포함하고,
    제2 경쇄가 N-말단에서 C-말단의 순서로 [VL2]-[CL]을 포함하고;
    VH1이 VL1과 NGF에 결합하는 제1 항원-결합 모이어티를 형성하고, VH2가 VL2와 RANKL에 결합하는 제2 항원-결합 모이어티를 형성하거나;
    VH1이 VL1과 RANKL에 결합하는 제1 항원-결합 모이어티를 형성하고, VH2가 VL2와 NGF에 결합하는 제2 항원-결합 모이어티를 형성하고;
    보다 바람직하게는, VH1이 서열번호 26에 제시된 서열을 갖고, VL1이 서열번호 27에 제시된 서열을 갖고, VH2가 서열번호 24에 제시된 서열을 갖고, VL2가 서열번호 25에 제시된 서열을 갖거나;
    VH1이 서열번호 24에 제시된 서열을 갖고, VL1이 서열번호 25에 제시된 서열을 갖고, VH2가 서열번호 26에 제시된 서열을 갖고, VL2가 서열번호 27에 제시된 서열을 갖고;
    옵스큐린-O 쇄가 서열번호 132 내지 141 중 어느 하나에 제시된 서열을 갖고, 티틴-T 쇄가 서열번호 129 내지 131 중 어느 하나에 제시된 서열을 갖고;
    가장 바람직하게는, Fc1이 서열번호 177에 제시된 서열을 갖고; Fc2가 서열번호 178에 제시된 서열을 갖고; CH1이 서열번호 179에 제시된 서열을 갖고; CL이 서열번호 4에 제시된 서열을 갖고; 링커 3이 결합이고; 링커 1 및 링커 2가 a) 둘 다 서열번호 175에 제시된 링커 1 및 링커 2; 및 b) 서열번호 173에 제시된 링커 1 및 서열번호 174에 제시된 링커 2로 이루어진 군으로부터 선택되거나;
    (II) 항원-결합 분자가 PDL1 및 CTLA4에 결합할 수 있고;
    바람직하게는, 항원-결합 분자가 제1 중쇄, 제1 경쇄, 제2 중쇄 및 제2 경쇄를 포함하고, 이때
    제1 중쇄가 N-말단에서 C-말단의 순서로 [VH1]-[링커 1]-[옵스큐린-O 쇄]-[링커 3]-[Fc1]을 포함하고,
    제1 경쇄가 N-말단에서 C-말단의 순서로 [VL1]-[링커 2]-[티틴-T 쇄]를 포함하고,
    제2 중쇄가 N-말단에서 C-말단의 순서로 [VH2]-[CH1]-[Fc2]를 포함하고,
    제2 경쇄가 N-말단에서 C-말단의 순서로 [VL2]-[CL]을 포함하고;
    VH1이 VL1과 PDL1에 결합하는 제1 항원-결합 모이어티를 형성하고, VH2가 VL2와 CTLA4에 결합하는 제2 항원-결합 모이어티를 형성하거나;
    VH1이 VL1과 CTLA4에 결합하는 제1 항원-결합 모이어티를 형성하고, VH2가 VL2와 PDL1에 결합하는 제2 항원-결합 모이어티를 형성하고;
    보다 바람직하게는, VH1이 서열번호 156에 제시된 서열을 갖고, VL1이 서열번호 155에 제시된 서열을 갖고, VH2가 서열번호 169에 제시된 서열을 갖고, VL2가 서열번호 170에 제시된 서열을 갖거나;
    VH1이 서열번호 169에 제시된 서열을 갖고, VL1이 서열번호 170에 제시된 서열을 갖고, VH2가 서열번호 156에 제시된 서열을 갖고, VL2가 서열번호 155에 제시된 서열을 갖고;
    옵스큐린-O 쇄가 서열번호 132 내지 141 중 어느 하나에 제시된 서열을 갖고, 티틴-T 쇄가 서열번호 129 내지 131 중 어느 하나에 제시된 서열을 갖고;
    가장 바람직하게는, Fc1이 서열번호 178에 제시된 서열을 갖고; Fc2가 서열번호 177에 제시된 서열을 갖고; CH1이 서열번호 179에 제시된 서열을 갖고; CL이 서열번호 4에 제시된 서열을 갖고; 링커 3이 결합이고; 링커 1 및 링커 2가 a) 둘 다 서열번호 175에 제시된 링커 1 및 링커 2; 및 b) 서열번호 173에 제시된 링커 1 및 서열번호 174에 제시된 링커 2로 이루어진 군으로부터 선택되거나;
    (III) 항원-결합 분자가 IL5 및 TSLP에 결합할 수 있고;
    바람직하게는, 항원-결합 분자가 제1 중쇄, 제1 경쇄, 제2 중쇄 및 제2 경쇄를 포함하고, 이때
    제1 중쇄가 N-말단에서 C-말단의 순서로 [VH1]-[링커 1]-[티틴-T 쇄]-[링커 3]-[Fc1]을 포함하고;
    제1 경쇄가 N-말단에서 C-말단의 순서로 [VL1]-[링커 2]-[옵스큐린-O 쇄]를 포함하고;
    제2 중쇄가 N-말단에서 C-말단의 순서로 [VH2]-[CH1]-[Fc2]를 포함하고;
    제2 경쇄가 N-말단에서 C-말단의 순서로 [VL2]-[CL]을 포함하고;
    VH1이 VL1과 IL5에 결합하는 제1 항원-결합 모이어티를 형성하고, VH2가 VL2와 TSLP에 결합하는 제2 항원-결합 모이어티를 형성하거나;
    VH1이 VL1과 TSLP에 결합하는 제1 항원-결합 모이어티를 형성하고, VH2가 VL2와 IL5에 결합하는 제2 항원-결합 모이어티를 형성하고;
    보다 바람직하게는, VH1이 서열번호 16에 제시된 서열을 갖고, VL1이 서열번호 17에 제시된 서열을 갖고, VH2가 서열번호 171에 제시된 서열을 갖고, VL2가 서열번호 172에 제시된 서열을 갖거나;
    VH1이 서열번호 171에 제시된 서열을 갖고, VL1이 서열번호 172에 제시된 서열을 갖고, VH2가 서열번호 16에 제시된 서열을 갖고, VL2가 서열번호 17에 제시된 서열을 갖고;
    옵스큐린-O 쇄가 서열번호 132 내지 141 중 어느 하나에 제시된 서열을 갖고, 티틴-T 쇄가 서열번호 129 내지 131 중 어느 하나에 제시된 서열을 갖고;
    가장 바람직하게는, Fc1이 서열번호 178에 제시된 서열을 갖고; Fc2가 서열번호 177에 제시된 서열을 갖고; CH1이 서열번호 179에 제시된 서열을 갖고; CL이 서열번호 4에 제시된 서열을 갖고; 링커 3이 결합이고; 링커 1 및 링커 2가 a) 둘 다 서열번호 175에 제시된 서열을 갖는 링커 1 및 링커 2; 및 b) 서열번호 173에 제시된 서열을 갖는 링커 1 및 서열번호 174에 제시된 서열을 갖는 링커 2로 이루어진 군으로부터 선택되는,
    항원-결합 분자.
  14. 제11항에 있어서,
    다음을 포함하는, 항원-결합 분자:
    a. N-말단에서 C-말단의 순서로 [VH1]-[링커 1]-[티틴-T 쇄]-[링커 3]-[VH2]-[CH1]-[Fc1]을 포함하는 제1 중쇄;
    N-말단에서 C-말단의 순서로 [VH1]-[링커 1]-[티틴-T 쇄]-[링커 3]-[VH2]-[CH1]-[Fc2]를 포함하는 제2 중쇄;
    N-말단에서 C-말단의 순서로 [VL1]-[링커 2]-[옵스큐린-O 쇄 또는 옵스큐린-유사-O 쇄]를 포함하는 제1 경쇄; 및
    N-말단에서 C-말단의 순서로 [VL2]-[CL]을 포함하는 제2 경쇄; 또는
    b. N-말단에서 C-말단의 순서로 [VH1]-[링커 1]-[옵스큐린-O 쇄 또는 옵스큐린-유사-O 쇄]-[링커 3]-[VH2]-[CH1]-[Fc1]을 포함하는 제1 중쇄;
    N-말단에서 C-말단의 순서로 [VH1]-[링커 1]-[옵스큐린-O 쇄 또는 옵스큐린-유사-O 쇄]-[링커 3]-[VH2]-[CH1]-[Fc2]를 포함하는 제2 중쇄;
    N-말단에서 C-말단의 순서로 [VL1]-[링커 2]-[티틴-T 쇄]를 포함하는 제1 경쇄; 및
    N-말단에서 C-말단의 순서로 [VL2]-[CL]을 포함하는 제2 경쇄
    [이때, 링커 1, 링커 2 및 링커 3은 동일하거나 상이하고;
    바람직하게는, Fc1 및 Fc2는 동일하거나, Fc1 및 Fc2는 각각 독립적으로 동종이량체화를 감소시키는 하나 이상의 아미노산 잔기 치환을 갖고;
    보다 바람직하게는,
    A) 링커 1, 링커 2 및 링커 3은 모두 (GxS)y 링커이고, 이때 x는 1 내지 5의 정수로 이루어진 군으로부터 선택되고, y는 0 내지 6의 정수로 이루어진 군으로부터 선택되고; 바람직하게는, 모두는 서열번호 175 또는 서열번호 176에 제시되거나,
    B) 링커 1은 CH1의 C-말단 절두 서열이고, 바람직하게는 링커 1은 서열번호 173에 제시되고; 링커 2는 CL의 C-말단 절두 서열이고, 바람직하게는 링커 2는 서열번호 174에 제시되고; 링커 3은 (GxS)y 링커이고, 이때 x는 1 내지 5의 정수로 이루어진 군으로부터 선택되고, y는 0 내지 6의 정수로 이루어진 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 링커 3은 서열번호 175 또는 서열번호 176에 제시되고;
    가장 바람직하게는, 항원-결합 분자는 PDL1 및 TIGIT에 결합할 수 있다].
  15. PDL1에 특이적으로 결합할 수 있는 제1 항원-결합 모이어티 및 TIGIT에 특이적으로 결합할 수 있는 제2 항원-결합 모이어티를 포함하는 항원-결합 분자로서,
    제1 항원-결합 모이어티가 중쇄 가변 영역 VH1 및 경쇄 가변 영역 VL1을 포함하고, 제2 항원-결합 모이어티가 중쇄 가변 영역 VH2 및 경쇄 가변 영역 VL2를 포함하고; 이때
    VH1이 각각 서열번호 163, 서열번호 164 및 서열번호 165에 제시된 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하고, VL1이 각각 서열번호 166, 서열번호 167 및 서열번호 168에 제시된 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하고/하거나;
    VH2가 각각 서열번호 157, 서열번호 158 및 서열번호 159에 제시된 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하고, VL2가 각각 서열번호 160, 서열번호 161 및 서열번호 162에 제시된 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하고;
    바람직하게는,
    VH1이 서열번호 156에 제시된 서열 또는 서열번호 156에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 갖고, VL1이 서열번호 155에 제시된 서열 또는 서열번호 155에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 갖고/갖거나;
    VH2가 서열번호 154에 제시된 서열 또는 서열번호 154에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 갖고, VL2가 서열번호 153에 제시된 서열 또는 서열번호 153에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 갖고;
    보다 바람직하게는, 항원-결합 분자가
    서열번호 148에 제시된 서열 또는 서열번호 148에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 갖는 중쇄;
    서열번호 146에 제시된 서열 또는 서열번호 146에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 갖는 제1 경쇄; 및
    서열번호 147에 제시된 서열 또는 서열번호 147에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 갖는 제2 경쇄를 갖는,
    항원-결합 분자.
  16. 중쇄 불변 영역 CH1 및 경쇄 불변 영역 CL이 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 이량체화 폴리펩티드로 대체되고,
    바람직하게는, 중쇄 불변 영역 CH1이 티틴-T-쇄로 대체되고, 경쇄 불변 영역 CL이 옵스큐린-O 쇄로 대체되거나; 경쇄 불변 영역 CL이 티틴-T 쇄로 대체되고, 중쇄 불변 영역 CH1이 옵스큐린-O 쇄로 대체된,
    도메인-조작 항체.
  17. 제7항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 항원-결합 분자 또는 제16항에 따른 도메인-조작 항체; 및
    하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제
    를 포함하는 약학 조성물.
  18. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 이량체화 폴리펩티드의, 다중특이성 항체의 제조시 경쇄/중쇄 불일치(mispairing)의 감소에서의, 바람직하게는 이중특이성 항체의 제조시 경쇄/중쇄 불일치의 감소에서의 용도.
  19. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 이량체화 폴리펩티드, 제7항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 항원-결합 분자 또는 제16항에 따른 도메인-조작 항체를 암호화하는 핵산 분자.
  20. 제19항에 따른 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포.
  21. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 이량체화 폴리펩티드, 제7항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 항원-결합 분자 또는 제16항에 따른 도메인-조작 항체의 제조 방법으로서,
    제20항에 따른 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
    상기 이량체화 폴리펩티드, 상기 항원-결합 분자 또는 상기 도메인-조작 항체를 정제 및 단리하는 단계
    를 포함하는 제조 방법.
  22. 제7항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 항원-결합 분자, 제16항에 따른 도메인-조작 항체 또는 제17항에 따른 약학 조성물의, 질환 또는 병태를 치료 또는 예방하기 위한 약제의 제조에서의 용도.
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Family Cites Families (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
CA2288600C (en) 1997-05-02 2010-06-01 Genentech, Inc. A method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components
US6040498A (en) 1998-08-11 2000-03-21 North Caroline State University Genetically engineered duckweed
KR100797667B1 (ko) 1999-10-04 2008-01-23 메디카고 인코포레이티드 외래 유전자의 전사를 조절하는 방법
US7125978B1 (en) 1999-10-04 2006-10-24 Medicago Inc. Promoter for regulating expression of foreign genes
ES2592271T3 (es) 2005-03-31 2016-11-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Métodos de producción de polipéptidos mediante la regulación de la asociación de los polipéptidos
AR060070A1 (es) 2006-03-24 2008-05-21 Merck Patent Gmbh Dominios proteicos heterodimericos obtenidos por ingenieria
WO2007147901A1 (en) 2006-06-22 2007-12-27 Novo Nordisk A/S Production of bispecific antibodies
EP2235064B1 (en) 2008-01-07 2015-11-25 Amgen Inc. Method for making antibody fc-heterodimeric molecules using electrostatic steering effects
EP2424567B1 (en) 2009-04-27 2018-11-21 OncoMed Pharmaceuticals, Inc. Method for making heteromultimeric molecules
AU2010343057B2 (en) 2009-12-29 2017-02-23 Aptevo Research And Development Llc Heterodimer binding proteins and uses thereof
WO2011143545A1 (en) 2010-05-14 2011-11-17 Rinat Neuroscience Corporation Heterodimeric proteins and methods for producing and purifying them
BR112013011811A2 (pt) 2010-11-05 2023-02-23 Zymeworks Inc Modelo de anticorpo heterodimérico estável com mutações no domínio fc
KR20210074395A (ko) * 2011-11-30 2021-06-21 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 면역 복합체를 형성하는 세포내로의 운반체（캐리어）를 포함하는 의약
LT2794905T (lt) 2011-12-20 2020-07-10 Medimmune, Llc Modifikuoti polipeptidai, skirti bispecifinių antikūnų karkasams
KR102382304B1 (ko) 2012-04-20 2022-04-04 메뤼스 엔.페. Ig-유사 분자의 제조방법 및 제조수단
WO2014001325A1 (en) * 2012-06-27 2014-01-03 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for making antibody fc-region conjugates comprising at least one binding entity that specifically binds to a target and uses thereof
WO2016172485A2 (en) * 2015-04-24 2016-10-27 Genentech, Inc. Multispecific antigen-binding proteins
MA44054A (fr) * 2015-12-18 2018-10-24 Biogen Ma Inc Plateforme d'anticorps bispécifique
SG11202002261VA (en) 2017-09-22 2020-04-29 Wuxi Biologics Ireland Ltd Novel bispecific polypeptide complexes
US11512129B2 (en) 2017-09-29 2022-11-29 Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd. TIGIT antibody, antigen-binding fragment thereof, and medical use thereof
AU2020233058A1 (en) 2019-03-06 2021-09-30 Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd. Bifunctional fusion protein and pharmaceutical use thereof

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