JPWO2019244961A1 - 変異ｖｈｈ抗体を用いたアフィニティー担体 - Google Patents

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Abstract

変異ＶＨＨ抗体を用いたアフィニティー担体の提供。固相担体と、該固相担体に結合したイムノグロブリン結合タンパク質とを含み、該イムノグロブリン結合タンパク質が、配列番号２２のアミノ酸配列の１２７〜１８４位、及び配列番号２３のアミノ酸配列の１３〜２１０位からなる群より選択される少なくとも１つの領域におけるエピトープを認識する、ＶＨＨ抗体の変異体又はその断片を含む、アフィニティー担体。

Description

本発明は、変異ＶＨＨ抗体を用いたアフィニティー担体、ならびに該アフィニティー担体を用いた目的物質の単離方法に関する。
抗体医薬に代表されるタンパク質製剤は、基本的にモノクローナル抗体であり、細胞培養技術を用いて大量に生産されている。これら抗体医薬の製造工程における初期精製工程には、アフィニティークロマトグラフィーが一般的に利用される。現在、上市されている主要な抗体医薬は免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）サブクラスであり、その初期精製にはグラム陽性細菌スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）によって生産される細胞壁タンパク質の１種であるプロテインＡをリガンドとして用いたアフィニティークロマトグラフィーが広く利用されている。一方で、近年、抗体医薬の高機能化を目的として、部分化抗体、抗体薬物複合体、二重特異性抗体などの改変抗体の開発が盛んに行われている。これら改変抗体のアフィニティー精製のために、プロテインＡと異なる性質のリガンドを利用したアフィニティー担体も開発され、上市されている。
ＶＨＨ（variable domain of heavy chain of heavy chain antibody）は、偶蹄目ラクダ科動物（フタコブラクダ、ヒトコブラクダ、ラマ等）の血清中に含まれる、軽鎖を持たない重鎖抗体の可変領域を含むドメインである。ＶＨＨは、抗原に結合できる免疫グロブリンフラグメントとして最小の単位であり、抗体医薬やアフィニティー担体のリガンドとして有用である。
本発明は、抗体結合性リガンドとして有用なＶＨＨ抗体変異体を固定化したアフィニティー担体を提供する。
本発明は、以下を提供する。
〔１〕アフィニティー担体であって、
固相担体と、該固相担体に結合したイムノグロブリン結合タンパク質とを含み、
該イムノグロブリン結合タンパク質が、配列番号２２のアミノ酸配列の１２７〜１８４位、及び配列番号２３のアミノ酸配列の１３〜２１０位からなる群より選択される少なくとも１つの領域におけるエピトープを認識する、ＶＨＨ抗体の変異体又はその断片を含む、
アフィニティー担体。
〔２〕前記ＶＨＨ抗体変異体が、変異前のＶＨＨ抗体に対して、少なくとも１個のヒスチジンが挿入されているか又は少なくとも１個のアミノ酸残基がヒスチジンに置換されている相補性決定領域を有する、〔１〕記載のアフィニティー担体。
〔３〕前記変異前のＶＨＨ抗体が、配列番号１〜４のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも８５％同一なアミノ酸配列からなり、かつトラスツズマブのＦａｂ領域に対して親和性を有するポリペプチドである、〔２〕記載のアフィニティー担体。
〔４〕前記相補性決定領域がＣＤＲ３である、〔２〕又は〔３〕記載のアフィニティー担体。
〔５〕前記ＶＨＨ抗体変異体が、前記配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一なアミノ酸配列において、配列番号１のアミノ酸配列の９７位に相当する位置、１００位に相当する位置及び１０２位に相当する位置からなる群より選択される少なくとも１つの位置におけるアミノ酸残基がヒスチジンに置換されているアミノ酸配列からなるポリペプチドである、〔４〕記載のアフィニティー担体。
〔６〕前記配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一なアミノ酸配列が、配列番号１の２６〜３５位領域に相当するＣＤＲ１領域に配列番号１０のアミノ酸配列を、配列番号１の５１〜６５位領域に相当するＣＤＲ２領域に配列番号１１のアミノ酸配列を、配列番号１の９６〜１０７位領域に相当するＣＤＲ３領域に配列番号１２のアミノ酸配列を有し、
前記配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一なアミノ酸配列が、配列番号２の２６〜３７位領域に相当するＣＤＲ１領域に配列番号１３のアミノ酸配列を、配列番号２の５３〜６８位領域に相当するＣＤＲ２領域に配列番号１４のアミノ酸配列を、配列番号２の９９〜１１８位領域に相当するＣＤＲ３領域に配列番号１５のアミノ酸配列を有し、
前記配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一なアミノ酸配列が、配列番号３の２６〜３５位領域に相当するＣＤＲ１領域に配列番号１６のアミノ酸配列を、配列番号３の５１〜６６位領域に相当するＣＤＲ２領域に配列番号１７のアミノ酸配列を、配列番号３の９７〜１１６位領域に相当するＣＤＲ３領域に配列番号１８のアミノ酸配列を有し、
前記配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一なアミノ酸配列が、配列番号４の２６〜３５位領域に相当するＣＤＲ１領域に配列番号１９のアミノ酸配列を、配列番号４の５１〜６６位領域に相当するＣＤＲ２領域に配列番号２０のアミノ酸配列を、配列番号４の９７〜１１６位領域に相当するＣＤＲ３領域に配列番号２１のアミノ酸配列を有する、
〔３〕〜〔５〕のいずれか１項記載のアフィニティー担体。
〔７〕前記ＶＨＨ抗体変異体が、前記変異前のＶＨＨ抗体のアミノ酸配列における少なくとも１個のリジンがアルギニンに置換されているアミノ酸配列からなる、〔２〕〜〔６〕のいずれか１項記載のアフィニティー担体。
〔８〕前記ＶＨＨ抗体変異体が、変異前のＶＨＨ抗体のアミノ酸配列における少なくとも１個のリジンがアルギニンに置換されているアミノ酸配列からなる、〔１〕記載のアフィニティー担体。
〔９〕前記変異前のＶＨＨ抗体が、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一なアミノ酸配列からなり、トラスツズマブのＦａｂ領域に対して親和性を有するポリペプチドである、〔８〕記載のアフィニティー担体。
〔１０〕前記ＶＨＨ抗体変異体が、前記配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一なアミノ酸配列において、配列番号１のアミノ酸配列の４３位に相当する位置、５３位に相当する位置、６４位に相当する位置、７５位に相当する位置及び８６位に相当する位置からなる群より選択される少なくとも１つの位置にアルギニンを有するアミノ酸配列からなるポリペプチドである、〔９〕記載のアフィニティー担体。
〔１１〕前記配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一なアミノ酸配列が、配列番号１の２６〜３５位領域に相当するＣＤＲ１領域に配列番号１０のアミノ酸配列を、配列番号１の５１〜６５位領域に相当するＣＤＲ２領域に配列番号１１のアミノ酸配列を、配列番号１の９６〜１０７位領域に相当するＣＤＲ３領域に配列番号１２のアミノ酸配列を有する、〔９〕又は〔１０〕記載のアフィニティー担体。
〔１２〕アフィニティー担体であって、
固相担体と、該固相担体に結合したイムノグロブリン結合タンパク質とを含み、
該イムノグロブリン結合タンパク質が、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一なアミノ酸配列であって、配列番号１のアミノ酸配列の９７位に相当する位置、１００位に相当する位置及び１０２位に相当する位置からなる群より選択される少なくとも１つの位置にヒスチジンを有するアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む、
アフィニティー担体。
〔１３〕前記配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一なアミノ酸配列が、配列番号１の２６〜３５位領域に相当するＣＤＲ１領域に配列番号１０のアミノ酸配列を、配列番号１の５１〜６５位領域に相当するＣＤＲ２領域に配列番号１１のアミノ酸配列を、配列番号１の９６〜１０７位領域に相当するＣＤＲ３領域に配列番号１２のアミノ酸配列を有する、〔１２〕記載のアフィニティー担体。
〔１４〕前記イムノグロブリン結合タンパク質が配列番号５〜８のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む、〔１２〕記載のアフィニティー担体。
〔１５〕アフィニティー担体であって、
固相担体と、該固相担体に結合したイムノグロブリン結合タンパク質とを含み、
該イムノグロブリン結合タンパク質が、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一なアミノ酸配列であって、配列番号１のアミノ酸配列の４３位に相当する位置、５３位に相当する位置、６４位に相当する位置、７５位に相当する位置及び８６位に相当する位置からなる群より選択される少なくとも１つの位置にアルギニンを有するアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む、
アフィニティー担体。
〔１６〕前記配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一なアミノ酸配列が、配列番号１の２６〜３５位領域に相当するＣＤＲ１領域に配列番号１０のアミノ酸配列を、配列番号１の５１〜６５位領域に相当するＣＤＲ２領域に配列番号１１のアミノ酸配列を、配列番号１の９６〜１０７位領域に相当するＣＤＲ３領域に配列番号１２のアミノ酸配列を有する、〔１５〕記載のアフィニティー担体。
〔１７〕前記イムノグロブリン結合タンパク質が配列番号９のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む、〔１５〕記載のアフィニティー担体。
〔１８〕〔１〕〜〔１７〕のいずれかに記載のアフィニティー担体を用いる、イムノグロブリン又はその断片の単離方法。
本発明のアフィニティー担体は、親抗体と比べてイムノグロブリンの溶出挙動もしくは結合容量が向上している。本発明のアフィニティー担体により、イムノグロブリン又はその断片の製造効率を向上させることができる。
本発明のＶＨＨ抗体変異体のイムノグロブリン結合解離挙動。横軸の「ｐＨ２．０」は、ｐＨ２．０の溶離液を流した時間を表す。 本発明のＶＨＨ抗体変異体をリガンドとするアフィニティー担体からのイムノグロブリン溶出挙動。
本願明細書において、「イムノグロブリン結合タンパク質」とは、イムノグロブリン又はその断片に対する結合活性を有するタンパク質をいう。本明細書において、「イムノグロブリン」（Ｉｇ）は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、及びこれらのサブクラス等の任意のクラスのイムノグロブリンを含む。本明細書において、イムノグロブリンの断片としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、還元型ＩｇＧ（ｒＩｇＧ）等の抗原認識部位を有するイムノグロブリンの重鎖と軽鎖の複合体を含むイムノグロブリン断片が挙げられる。
本明細書において、「抗体」とは、イムノグロブリンの可変領域に位置する少なくとも１つの抗原認識部位を介してポリヌクレオチド等の標的に特異的に結合可能な分子をいう。本明細書における「抗体」は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、及びこれらのサブクラス等の任意のクラスのイムノグロブリン、その断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｒＩｇＧ等）、１本鎖抗体（ＳｃＦｖ）、重鎖抗体、ＶＨＨ（variable domain of heavy chain of heavy chain antibody）抗体、これらの変異体などを含み得る。また本明細書における「抗体」は、ヒト化抗体等のキメラ抗体、抗体複合体、および抗原認識部位を含む他のイムノグロブリン修飾体などであってもよい。
本明細書において、「ＶＨＨ抗体」とは、重鎖抗体の重鎖可変ドメイン（ＶＨＨ）を含む抗体をいい、好ましくはＶＨＨからなるシングルドメイン抗体をいう。重鎖抗体はラクダ科動物等から見出されており、本発明で用いるＶＨＨ抗体は、好ましくはラクダ科動物由来である。本発明で使用されるＶＨＨ抗体には、重鎖抗体の定常領域のフラグメントが含まれていてもよい。
本明細書において、ラクダ科動物としては、フタコブラクダ、ヒトコブラクダ、ラマ、アルパカ、ビクーニャ、グアナコなどが挙げられ、好ましくはアルパカが挙げられる。
本明細書において、「抗体医薬」とは、抗体を主成分とする医薬をいう。多くの場合、該主成分の抗体はモノクローナル抗体である。抗体医薬としては、抗がん剤であるリツキシマブ（リツキサン（登録商標））、トラスツズマブ（ハーセプチン（登録商標））、ベバシズマブ（アバスチン（登録商標））、抗リウマチ薬であるインフリキシマブ（レミケード（登録商標））、アダリムマブ（ヒュミラ（登録商標））、血管新生阻害剤であるラニビズマブ（ルセンティス（登録商標））、等が上市されているが、本明細書で言及する抗体医薬は、これらに限定されるものではない。
本願明細書において、「エピトープ」とは、抗原上における、抗体に認識されて結合される抗体との相互作用部位をいう。
本明細書において、アミノ酸配列やヌクレオチド配列の同一性は、カーリンとアルチュールによるＢＬＡＳＴアルゴリズム（Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90:5873-5877）を用いて決定することができる。このＢＬＡＳＴアルゴリズムに基づいて、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ、ＢＬＡＳＴＰ、ＴＢＬＡＳＴＮ及びＴＢＬＡＳＴＸとよばれるプログラムが開発されている（J. Mol. Biol., 1990, 215:403-410）。これらのプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いることができる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（www.ncbi.nlm.nih.gov参照）。
本明細書において、アミノ酸配列及びヌクレオチド配列に関する「少なくとも８５％の同一性」とは、８５％以上の同一性、好ましくは９０％以上の同一性、より好ましくは９５％以上の同一性、さらに好ましくは９７％以上の同一性、さらに好ましくは９８％以上の同一性、なお好ましくは９９％以上、なお好ましくは１００％の同一性をいう。
本明細書において、アミノ酸配列及びヌクレオチド配列上の「相当する位置」は、目的配列と参照配列（例えば、配列番号１のアミノ酸配列）とを、各アミノ酸配列又はヌクレオチド配列中に存在する保存アミノ酸残基又はヌクレオチドに最大の相同性を与えるように整列（アラインメント）させることにより決定することができる。アラインメントは、公知のアルゴリズムを用いて実行することができ、その手順は当業者に公知である。例えば、アラインメントは、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗマルチプルアラインメントプログラム（Thompson, J. D. et al, 1994, Nucleic Acids Res., 22:4673-4680）をデフォルト設定で用いることにより行うことができる。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗは、例えば、欧州バイオインフォマティクス研究所（European Bioinformatics Institute: EBI [www.ebi.ac.uk/index.html]）や、国立遺伝学研究所が運営する日本ＤＮＡデータバンク（DDBJ [www.ddbj.nig.ac.jp/Welcome-j.html]）のウェブサイト上で利用することができる。
本明細書において、アミノ酸残基は次の略号でも記載される：アラニン（Ａｌａ又はＡ）、アルギニン（Ａｒｇ又はＲ）、アスパラギン（Ａｓｎ又はＮ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ又はＤ）、システイン（Ｃｙｓ又はＣ）、グルタミン（Ｇｌｎ又はＱ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ又はＥ）、グリシン（Ｇｌｙ又はＧ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ又はＨ）、イソロイシン（Ｉｌｅ又はＩ）、ロイシン（Ｌｅｕ又はＬ）、リジン（Ｌｙｓ又はＫ）、メチオニン（Ｍｅｔ又はＭ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ又はＦ）、プロリン（Ｐｒｏ又はＰ）、セリン（Ｓｅｒ又はＳ）、トレオニン（Ｔｈｒ又はＴ）、トリプトファン（Ｔｒｐ又はＷ）、チロシン（Ｔｙｒ又はＹ）、バリン（Ｖａｌ又はＶ）；及び任意のアミノ酸残基（Ｘａａ又はＸ）。また本明細書において、ペプチドのアミノ酸配列は、常法に従って、アミノ末端（以下Ｎ末端という）が左側、カルボキシル末端（以下Ｃ末端という）が右側に位置するように記載される。
本発明が提供するアフィニティー担体は、固相担体と、該固相担体に結合したイムノグロブリン結合タンパク質とを含む。本発明のアフィニティー担体に含まれる該イムノグロブリン結合タンパク質は、１個以上のＶＨＨ抗体変異体又はその断片を含み、好ましくは１個以上のＶＨＨ抗体変異体を含む。該イムノグロブリン結合タンパク質が２個以上のＶＨＨ抗体変異体又はその断片を含む場合、各変異体又はその断片は、直接又はリンカーペプチドを介して互いに連結されていることが好ましい。一実施形態において、該イムノグロブリン結合タンパク質は、１個以上のＶＨＨ抗体変異体又はその断片から本質的に構成される。別の実施形態において、該イムノグロブリン結合タンパク質は、１個以上のＶＨＨ抗体変異体又はその断片、及びリンカーペプチドから本質的に構成される。
本発明のアフィニティー担体に含まれる該ＶＨＨ抗体変異体又はその断片は、イムノグロブリンのＦａｂ領域にあるエピトープに対して特異的に結合する。この結合特性は、従来リガンドとして一般的に使用されてきた、イムノグロブリンＦｃ領域に結合するプロテインＡドメインとは異なる。したがって、該ＶＨＨ抗体変異体又はその断片を用いたアフィニティー精製により、Ｆｃ領域を有する完全体の抗体分子だけでなく、Ｆａｂのような断片化抗体をも単離することが可能になる。
本発明で用いられるＶＨＨ抗体変異体又はその断片は、配列番号２２のアミノ酸配列の１２７〜１８４位、及び配列番号２３のアミノ酸配列の１３〜２１０位からなる群より選択される少なくとも１つの領域、好ましくは両領域におけるエピトープを認識する。これらのエピトープ領域はそれぞれ、トラスツズマブのＦａｂの軽鎖（配列番号２２）内領域、及び重鎖（配列番号２３）内領域に相当する。より詳細には、該ＶＨＨ抗体変異体又はその断片の認識するエピトープは、配列番号２２のアミノ酸配列の１２７−１２９位、１５７−１５８位、１８０−１８２位、及び１８４位、ならびに配列番号２３のアミノ酸配列の１３位、１１９−１２５位、１５０−１５１位、１５３位、１７７−１８２位、及び２１０位からなる群より選択される少なくとも１つの部位であり、好ましくはそれらの複数の部位、より好ましくはそれらの部位の全部である。
本発明で用いられるＶＨＨ抗体変異体の元となる変異前のＶＨＨ抗体を、本明細書において「親ＶＨＨ抗体」と呼ぶことがある。当該本発明のＶＨＨ抗体変異体の親ＶＨＨ抗体の例としては、野生型重鎖抗体由来のＶＨＨ抗体（野生型ＶＨＨ抗体とも呼ぶ）、及び該野生型ＶＨＨ抗体と同じ抗原結合性を有するその変異体が挙げられる。
当該親ＶＨＨ抗体の好ましい例としては、配列番号１〜４のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。配列番号１〜４は、トラスツズマブのＦａｂ領域に対して親和性を有する、ラクダ科動物由来の野生型ＶＨＨ抗体のアミノ酸配列を表す。したがって、本発明の変異体の親ＶＨＨ抗体のさらなる例としては、配列番号１〜４のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも８５％同一なアミノ酸配列からなり、かつトラスツズマブのＦａｂ領域に対して親和性を有するポリペプチドが挙げられる。より好ましくは、当該親ＶＨＨ抗体は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一なアミノ酸配列からなり、かつトラスツズマブのＦａｂ領域に対して親和性を有するポリペプチドである。好ましくは、該親ＶＨＨ抗体はラクダ科動物由来のＶＨＨ抗体であり、したがって、本発明で用いられるＶＨＨ抗体変異体は、好ましくはラクダ科動物由来のＶＨＨ抗体の変異体である。
配列番号１〜４のアミノ酸配列からなる親ＶＨＨ抗体は、そのアミノ酸配列中に、ＣＤＲ１〜３の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する：
配列番号１のＶＨＨ抗体は、配列番号１の２６〜３５位に配列番号１０のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、５１〜６５位に配列番号１１のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、９６〜１０７位に配列番号１２のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を有する；
配列番号２のＶＨＨ抗体は、配列番号２の２６〜３７位に配列番号１３のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、５３〜６８位に配列番号１４のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、９９〜１１８位に配列番号１５のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を有する；
配列番号３のＶＨＨ抗体は、配列番号３の２６〜３５位に配列番号１６のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、５１〜６６位に配列番号１７のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、９７〜１１６位に配列番号１８のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を有する；
配列番号４のＶＨＨ抗体は、配列番号４の２６〜３５位に配列番号１９のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、５１〜６６位に配列番号２０のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、９７〜１１６位に配列番号２１のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を有する。
好ましくは、配列番号１〜４のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも８５％同一なアミノ酸配列からなり、かつトラスツズマブのＦａｂ領域に対して親和性を有するポリペプチドである親ＶＨＨ抗体は、配列番号１〜４の親ＶＨＨ抗体と同等の相補性決定領域ＣＤＲ１〜３を有する：
好ましくは、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一なアミノ酸配列からなり、かつトラスツズマブのＦａｂ領域に対して親和性を有するポリペプチドは、配列番号１の２６〜３５位に相当する領域に配列番号１０のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、５１〜６５位に相当する領域に配列番号１１のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、９６〜１０７位に相当する領域に配列番号１２のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を有する；
好ましくは、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一なアミノ酸配列からなり、かつトラスツズマブのＦａｂ領域に対して親和性を有するポリペプチドは、配列番号２の２６〜３７位に相当する領域に配列番号１３のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、５３〜６８位に相当する領域に配列番号１４のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、９９〜１１８位に相当する領域に配列番号１５のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を有する；
好ましくは、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一なアミノ酸配列からなり、かつトラスツズマブのＦａｂ領域に対して親和性を有するポリペプチドは、配列番号３の２６〜３５位に相当する領域に配列番号１６のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、５１〜６６位に相当する領域に配列番号１７のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、９７〜１１６位に相当する領域に配列番号１８のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を有する；
好ましくは、配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一なアミノ酸配列からなり、かつトラスツズマブのＦａｂ領域に対して親和性を有するポリペプチドは、配列番号４の２６〜３５位に相当する領域に配列番号１９のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、５１〜６６位に相当する領域に配列番号２０のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、９７〜１１６位に相当する領域に配列番号２１のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を有する。
本発明で用いられるＶＨＨ抗体変異体は、上記親ＶＨＨ抗体のアミノ酸残基を変異させることによって得られる。一実施形態において、当該ＶＨＨ抗体変異体は、親ＶＨＨ抗体のＣＤＲに対して少なくとも１個のＨｉｓを挿入するか、又は親ＶＨＨ抗体のＣＤＲにおいて少なくとも１個のアミノ酸残基をＨｉｓに置換することによって得られる。このようにして得られるＶＨＨ抗体変異体を、以下の本明細書において、「本発明のＨｉｓ変異体」と呼ぶことがある。該Ｈｉｓの挿入又は置換がなされる親ＶＨＨ抗体のＣＤＲは、好ましくは、上述したＣＤＲ１〜３からなる群より選択される少なくとも１つであればよく、より好ましくはＣＤＲ３である。
好ましい実施形態において、本発明のＨｉｓ変異体は、配列番号１〜４のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一なアミノ酸配列からなり、かつトラスツズマブのＦａｂ領域に対して親和性を有するポリペプチドのＣＤＲ３に対して、少なくとも１個のＨｉｓを挿入するか、又は該ＣＤＲ３において、少なくとも１個のアミノ酸残基をＨｉｓに置換することによって得られる。より好ましい実施形態において、本発明のＨｉｓ変異体は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一なアミノ酸配列からなり、かつトラスツズマブのＦａｂ領域に対して親和性を有するポリペプチドのＣＤＲ３において、少なくとも１個のアミノ酸残基をＨｉｓに置換することによって得られる。さらに好ましい実施形態において、本発明のＨｉｓ変異体は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一なアミノ酸配列からなり、かつトラスツズマブのＦａｂ領域に対して親和性を有するポリペプチドのＣＤＲ３において、配列番号１のアミノ酸配列の９７位に相当する位置、１００位に相当する位置及び１０２位に相当する位置からなる群より選択される少なくとも１つの位置におけるアミノ酸残基をＨｉｓに置換することによって得られる。好ましくは、Ｈｉｓに置換されるべきアミノ酸残基は、配列番号１の９７位に相当する位置のアミノ酸残基、１００位に相当する位置のアミノ酸残基、１０２位に相当する位置のアミノ酸残基、又は１００位及び１０２位に相当する位置のアミノ酸残基である。
かくして得られた本発明のＨｉｓ変異体は、親ＶＨＨ抗体に対して少なくとも１個のＨｉｓが挿入されているか又は少なくとも１個のアミノ酸残基がＨｉｓに置換されているＣＤＲを有する。好ましくは、本発明のＨｉｓ変異体は、親ＶＨＨ抗体に対して少なくとも１個のＨｉｓが挿入されているか又は少なくとも１個のアミノ酸残基がＨｉｓに置換されているＣＤＲ３を有する。より好ましくは、本発明のＨｉｓ変異体は、親ＶＨＨ抗体に対して少なくとも１個のアミノ酸残基がＨｉｓに置換されているＣＤＲ３を有する。本発明のＨｉｓ変異体は、好ましくは、上述したＨｉｓの挿入又は置換以外は、親ＶＨＨ抗体と同一なアミノ酸配列のＣＤＲを有する。好ましくは、該親ＶＨＨ抗体は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一なアミノ酸配列からなり、かつトラスツズマブのＦａｂ領域に対して親和性を有するポリペプチドである。
好ましい実施形態において、本発明のＨｉｓ変異体は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一なアミノ酸配列であって、配列番号１のアミノ酸配列の９７位に相当する位置、１００位に相当する位置及び１０２位に相当する位置からなる群より選択される少なくとも１つの位置にＨｉｓを有するアミノ酸配列からなる。より好ましくは、本発明のＨｉｓ変異体は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一で、かつ配列番号１の２６〜３５位に相当する領域に配列番号１０のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、５１〜６５位に相当する領域に配列番号１１のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、９６〜１０７位に相当する領域に配列番号１２のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を有するアミノ酸配列であって、ただし配列番号１のアミノ酸配列の９７位に相当する位置、１００位に相当する位置及び１０２位に相当する位置からなる群より選択される少なくとも１つの位置にＨｉｓを有するアミノ酸配列からなる。さらに好ましくは、本発明のＨｉｓ変異体は、配列番号１のアミノ酸配列であって、その９７位に相当する位置、１００位に相当する位置、１０２位に相当する位置、又は１００位及び１０２位に相当する位置にＨｉｓを有するアミノ酸配列からなる。当該Ｈｉｓ変異体のアミノ酸配列と配列番号１のアミノ酸配列との同一性は、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上である。
本発明のＨｉｓ変異体の好ましい例としては、配列番号５〜８のアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。
本発明のＨｉｓ変異体は、上述した本発明で用いられるＶＨＨ抗体変異体が認識するエピトープを認識する。好ましくは、本発明のＨｉｓ変異体は、トラスツズマブのＦａｂ領域に結合することができる。
さらなる実施形態において、本発明で用いられるＶＨＨ抗体変異体は、親ＶＨＨ抗体のアミノ酸配列における少なくとも１個のＬｙｓをＡｒｇに置換することによって得られる。このようにして得られるＶＨＨ抗体変異体を、以下の本明細書において、「本発明のＡｒｇ変異体」と呼ぶことがある。
好ましい実施形態において、本発明のＡｒｇ変異体は、配列番号１〜４のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一なアミノ酸配列からなり、かつトラスツズマブのＦａｂ領域に対して親和性を有するポリペプチドのアミノ酸配列において、少なくとも１個のＬｙｓをＡｒｇに置換することによって得られる。より好ましい実施形態において、本発明のＡｒｇ変異体は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一なアミノ酸配列からなり、かつトラスツズマブのＦａｂ領域に対して親和性を有するポリペプチドのアミノ酸配列において、配列番号１のアミノ酸配列の４３位に相当する位置、５３位に相当する位置、６４位に相当する位置、７５位に相当する位置及び８６位に相当する位置からなる群より選択される少なくとも１つの位置におけるＬｙｓをＡｒｇに置換することによって得られる。好ましくは、配列番号１の４３位、５３位、６４位、７５位及び８６位に相当する位置のＬｙｓが、Ａｒｇに置換される。
かくして得られた本発明のＡｒｇ変異体は、親ＶＨＨ抗体のアミノ酸配列における少なくとも１個のＬｙｓがＡｒｇに置換されているアミノ酸配列からなる。本発明のＡｒｇ変異体は、好ましくは、上述したＡｒｇ置換以外は、親ＶＨＨ抗体と同一なアミノ酸配列のＣＤＲを有する。好ましくは、該親ＶＨＨ抗体は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一なアミノ酸配列からなり、かつトラスツズマブのＦａｂ領域に対して親和性を有するポリペプチドである。
好ましい実施形態において、本発明のＡｒｇ変異体は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一なアミノ酸配列であって、配列番号１のアミノ酸配列の４３位に相当する位置、５３位に相当する位置、６４位に相当する位置、７５位に相当する位置及び８６位に相当する位置からなる群より選択される少なくとも１つの位置にＡｒｇを有するアミノ酸配列からなる。より好ましくは、本発明のＡｒｇ変異体は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一で、かつ配列番号１の２６〜３５位に相当する領域に配列番号１０のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、５１〜６５位に相当する領域に配列番号１１のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、９６〜１０７位に相当する領域に配列番号１２のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を有するアミノ酸配列であって、ただし配列番号１のアミノ酸配列の４３位に相当する位置、５３位に相当する位置、６４位に相当する位置、７５位に相当する位置及び８６位に相当する位置からなる群より選択される少なくとも１つの位置にＡｒｇを有するアミノ酸配列からなる。さらに好ましくは、本発明のＡｒｇ変異体は、配列番号１のアミノ酸配列であって、その４３位、５３位、６４位、７５位及び８６位に相当する位置にＡｒｇを有するアミノ酸配列からなる。当該Ａｒｇ変異体のアミノ酸配列と配列番号１のアミノ酸配列との同一性は、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上である。
本発明のＡｒｇ変異体の好ましい例としては、配列番号９のアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。
本発明のＡｒｇ変異体は、上述した本発明で用いられるＶＨＨ抗体変異体が認識するエピトープを認識する。好ましくは、本発明のＡｒｇ変異体は、トラスツズマブのＦａｂ領域に結合することができる。
さらなる実施形態において、本発明で用いられるＶＨＨ抗体変異体は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一なアミノ酸配列からなり、かつトラスツズマブのＦａｂ領域に対して親和性を有するポリペプチドのアミノ酸配列において、配列番号１のアミノ酸配列の８４位に相当する位置のＳｅｒを他のアミノ酸残基で置換することによって得られる。このようにして得られるＶＨＨ抗体変異体を、以下の本明細書において、「本発明のＳ８４Ｘ変異体」と呼ぶことがある。好ましくは、該８４位に相当する位置のＳｅｒと置換されるアミノ酸残基は、Ａｌａ、Ｖａｌ又はＴｈｒである。
かくして得られた本発明のＳ８４Ｘ変異体は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一なアミノ酸配列であって、配列番号１のアミノ酸配列の８４位に相当する位置にＡｌａ、Ｖａｌ又はＴｈｒを有するアミノ酸配列からなる。より好ましくは、本発明のＳ８４Ｘ変異体は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一で、かつ配列番号１の２６〜３５位に相当する領域に配列番号１０のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、５１〜６５位に相当する領域に配列番号１１のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、９６〜１０７位に相当する領域に配列番号１２のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を有するアミノ酸配列であって、かつ配列番号１のアミノ酸配列の８４位に相当する位置にＡｌａ、Ｖａｌ又はＴｈｒを有するアミノ酸配列からなる。当該Ｓ８４Ｘ変異体のアミノ酸配列と配列番号１のアミノ酸配列との同一性は、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上である。
本発明のＳ８４Ｘ変異体は、上述した本発明で用いられるＶＨＨ抗体変異体が認識するエピトープを認識する。好ましくは、本発明のＳ８４Ｘ変異体は、トラスツズマブのＦａｂ領域に結合することができる。
本発明で用いられるＶＨＨ抗体変異体は、上述した本発明のＨｉｓ変異体、本発明のＡｒｇ変異体、もしくは本発明のＳ８４Ｘ変異体であってもよく、又はそれらの変異を組み合わせた多重変異体であってもよい。好ましくは、該多重変異体は、該Ｈｉｓ変異体かつＡｒｇ変異体である多重変異体である。いずれの場合であっても、該ＶＨＨ抗体変異体は、上述したエピトープを認識し、好ましくはトラスツズマブのＦａｂ領域に結合することができる。
本発明で用いられるＶＨＨ抗体変異体の断片は、上述した本発明のＨｉｓ変異体、本発明のＡｒｇ変異体、もしくは本発明のＳ８４Ｘ変異体の断片、又はそれらの多重変異体の断片であり得る。本発明で用いられる該ＶＨＨ抗体変異体の断片は、上述した本発明で用いられるＶＨＨ抗体変異体が認識するエピトープを認識し、好ましくはトラスツズマブのＦａｂ領域に結合することができる。
本発明で用いられるＶＨＨ抗体変異体又はその断片は、当該分野で公知の手法、例えばアミノ酸配列に基づく化学合成法、リコンビナント法などにより製造することができる。例えば、該ＶＨＨ抗体変異体又はその断片は、該変異体又はその断片をコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡ等）をベクターに組み込み、このベクターで宿主細胞を形質転換し、得られた形質転換体を培地中で培養し、発現した抗体又はその断片を回収することにより得ることができる。当該ＶＨＨ抗体変異体又はその断片をコードするポリヌクレオチドは、親ＶＨＨ抗体をコードするポリヌクレオチドに対して、そのコードするポリペプチドに上述したＨｉｓの挿入又は置換やＡｒｇの置換などが生じるように変異導入することによって得ることができる。ポリヌクレオチドに対する変異導入のための具体的な手法としては、部位特異的突然変異、相同組換え法、ＳＯＥ（ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｂｙ ｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）−ＰＣＲ法（Ｇｅｎｅ，１９８９，７７：６１−６８）などを挙げることができる。ポリヌクレオチドに対する変異導入の詳細な手順は当業者に周知である。
形質転換に用いられる宿主としては、大腸菌などの細菌、酵母、真菌などの微生物が挙げられ、大腸菌が好ましい。形質転換に用いられるベクターとしては、宿主細胞内で複製可能な既知のベクター（プラスミド等）のいずれをも用いることができ、発現ベクターが好ましい。好ましい発現ベクターとしては、宿主細胞内で複製可能な既知のベクターのいずれをも用いることができ、例えば、米国特許第５，１５１，３５０号明細書に記載されているプラスミドや、Ｓａｍｂｒｏｏｋら編集のＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， ２００１）などに記載されているプラスミドが挙げられる。形質転換の手段としては、各宿主に応じて当該技術分野において知られるいずれの方法を用いてもよく、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら編集のＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１）などに記載されている公知の方法を利用することができる。得られた形質転換体（例えば微生物細胞）を培養して発現されたタンパク質を回収する方法は、当業者によく知られている。あるいは、該ＶＨＨ抗体変異体又はその断片は、無細胞タンパク質合成系を用いて発現させてもよい。
本発明のアフィニティー担体に用いるイムノグロブリン結合タンパク質として、２個以上の当該ＶＨＨ抗体変異体又はその断片を含むイムノグロブリン結合タンパク質を製造する場合、該ＶＨＨ抗体変異体又はその断片をコードするポリヌクレオチドを２個以上連結したポリヌクレオチドを作製し、これを前述した手順でベクターに組み込み、該ベクターで宿主細胞を形質転換し、得られた形質転換体を培養して、発現した目的タンパク質を回収すればよい。
したがって、本発明はまた、上述した本発明で用いられるＶＨＨ抗体変異体をコードするポリヌクレオチド、それを含むベクター、及び該ポリヌクレオチド又はベクターを含む形質転換体を提供する。
上述したＶＨＨ抗体変異体又はその断片を含むイムノグロブリン結合タンパク質は、アフィニティーリガンドとして使用することができる。本発明のイムノグロブリン結合タンパク質を固相担体に固定化することによって、本発明のアフィニティー担体を製造することができる。本発明のアフィニティー担体に用いられる固相担体は、好ましくは不溶性担体である。好ましくは、本発明のアフィニティー担体は、アフィニティークロマトグラフィー用担体である。
当該固相担体としては、合成高分子系支持体、天然高分子系支持体等の有機系支持体；無機系支持体；これらを組み合わせた有機−有機複合系支持体や有機−無機複合系支持体等が挙げられる。合成高分子系支持体としては、例えば、ポリビニルアルコール類、ポリ（メタ）アクリレート類、ポリ（メタ）アクリルアミド類、ポリスチレン類、エチレン−無水マレイン酸共重合物等で構成されるものが挙げられる。天然高分子系支持体としては、例えば、アガロース、デキストラン、マンナン、セルロース等の多糖類で構成されるものが挙げられる。また、これを物理架橋や化学架橋したものでもよい。無機系支持体としては、ガラスビーズ、シリカゲル、金属、金属酸化物等で構成されるものが挙げられる。これらの中でも、流速特性の観点から、合成高分子系支持体が好ましい。本発明のアフィニティー担体は、支持体として合成高分子系支持体を使用した場合でも、防汚性を充分に備える。合成高分子系支持体としては、単官能不飽和モノマーと多官能不飽和モノマーとの共重合体が好ましく、単官能不飽和モノマーとしては、エポキシ基又は開環エポキシ基をもつ単官能不飽和モノマーが好ましい。多官能不飽和モノマーの使用量は、単官能不飽和モノマー１００質量部に対して、通常１〜１００質量部、好ましくは１〜５０質量部である。
支持体は、非多孔質でも多孔質でもよいが、多孔質であることが好ましい。また、支持体の形態は、粒子状、モノリス状、板状、チップ状、繊維状、膜状（中空糸を含む）等のいずれでもよいが、標的物質捕捉特性の観点から、粒子状、モノリス状、板状、繊維状、膜状が好ましく、粒子状がより好ましい。
支持体が粒子である場合、その粒径は、流速特性の観点から、好ましくは３０μｍ以上であり、また、標的物質捕捉特性の観点から、好ましくは３００μｍ以下である。斯かる粒径は、重合する際の条件や分級等により調整できる。なお、本発明における「粒径」とは、レーザ回折散乱式粒度分布測定装置により得られる体積平均粒子径を意味する。
支持体が多孔質粒子である場合、その比表面積は、孔径１０〜５０００ｎｍの範囲に相当するポアを測定したときに、ポアサイズ１０ｎｍ〜５０００ｎｍにおける比表面積で、好ましくは７０ｍ2／ｇ以上であり、より好ましくは９０ｍ2／ｇ以上である。なお、本発明における「比表面積」とは、水銀ポロシメータにより得られる細孔径１０〜５０００ｎｍの細孔の有する表面積を粒子の乾燥質量で除した値である。
支持体は、市販品を用いても、常法に従い合成したものを用いてもよい。例えば、合成高分子系支持体は、特公昭５８−０５８０２６号公報、特開昭５３−０９０９９１号公報等に記載の公知の方法に従って得ることができる。
当該固相担体へのリガンド（イムノグロブリン結合タンパク質）の結合方法としては、タンパク質を担体に固定化する一般的方法を用いて行うことができる。例えば、カルボキシ基を有する担体を用い、このカルボキシ基をＮ−ヒドロキシコハク酸イミドにより活性化させリガンドのアミノ基と反応させる方法；アミノ基又はカルボキシ基を有する担体を用い、水溶性カルボジイミド等の脱水縮合剤存在下でリガンドのカルボキシ基又はアミノ基と反応させアミド結合を形成する方法；水酸基を有する担体を用い、臭化シアン等のハロゲン化シアンで活性化させてリガンドのアミノ基と反応させる方法；担体の水酸基をトシル化又はトレシル化しリガンドのアミノ基と反応させる方法；ビスエポキシド、エピクロロヒドリン等によりエポキシ基を担体に導入し、リガンドのアミノ基、水酸基又はチオール基と反応させる方法；エポキシ基を有する担体を用い、リガンドのアミノ基又、水酸基又はチオール基と反応させる方法、などが挙げられる。上記のうち、反応を実施する水溶液中での安定性の観点からは、エポキシ基を介してリガンドを結合させる方法が望ましい。
エポキシ基が開環して生成する開環エポキシ基であるアルコール性水酸基は、担体表面を親水化し、タンパク質などの非特異吸着を防止すると共に、水中で担体の靱性を向上させ、高流速下の担体の破壊を防止する役割を果たす。したがって、リガンドを固定化させた後の担体中にリガンドと結合していない残余のエポキシ基が存在している場合、当該残余のエポキシ基を開環させることが好ましい。担体中のエポキシ基の開環方法としては、例えば、水溶媒中で、酸又はアルカリにより、加熱又は室温で該担体を撹拌する方法を挙げることができる。また、メルカプトエタノール、チオグリセロール等のメルカプト基を有するブロッキング剤やモノエタノールアミン等のアミノ基を有するブロッキング剤で、エポキシ基を開環させても良い。より好ましい開環エポキシ基は、担体に含まれるエポキシ基をチオグリセロールにより開環させて得られる開環エポキシ基である。チオグリセロールは、原料としてメルカプトエタノール等よりも毒性が低く、またチオグリセロールが付加したエポキシ開環基は、アミノ基を有するブロッキング剤による開環基よりも非特異吸着が低い上に、動的結合量が高くなる、といった利点を有する。
必要に応じて、固相担体とリガンドの間に任意の長さの分子（スペーサー）を導入してもよい。スペーサーの例としては、ポリメチレン鎖、ポリエチレングリコール鎖、糖類などが挙げられる。
本発明のアフィニティー担体は、完全体のイムノグロブリン分子だけでなく、Ｆａｂ等の断片化抗体をも単離することができる。したがって、本発明はさらに、本発明のアフィニティー担体を用いる、イムノグロブリン又はその断片の単離方法を提供する。本発明で単離されるイムノグロブリン又はその断片は、好ましくは抗体であり、より好ましい例としては、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、及びこれらのサブクラス等の任意のクラスのイムノグロブリン、ならびにその断片（例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｒＩｇＧ等）が挙げられる。
本発明の一実施形態に係るイムノグロブリン又はその断片の単離方法を説明する。本実施形態に係るイムノグロブリン又はその断片の単離方法は、好適には、リガンド（上述したＶＨＨ抗体変異体又はその断片を含むイムノグロブリン結合タンパク質）を固定化したアフィニティー担体に、目的物質（イムノグロブリン又はその断片）を含有する試料を通液し、該担体に該目的物質を吸着させる工程（第一の工程）、及び、該担体から該目的物質を溶出させる工程（第二の工程）を含む。
当該第一の工程では、本発明のアフィニティー担体を充填したカラム等に、目的物質を含有する試料を、該目的物質がリガンドに吸着する条件にて流す。この第一の工程では、試料中の目的物質以外の物質のほとんどは、リガンドに吸着されずカラムを通過する。この後、必要に応じて、リガンドに弱く保持された一部の物質を除去するため、担体をＮａＣｌなどの塩を含む中性の緩衝液で洗浄してもよい。
当該第二の工程では、酸性の溶離液を流し、リガンドに吸着された目的物質を溶出させる。この溶出液を回収することで、試料から目的とするイムノグロブリン又はその断片を単離することができる。該溶離液のｐＨは、好ましくは２以上、より好ましくは２．５以上、さらに好ましくは３以上であり、一方、好ましくは５以下、より好ましくは４．５以下、さらに好ましくは４以下である。例えば、該溶離液のｐＨは、好ましくは２〜５、より好ましくは２〜４．５、より好ましくは２〜４、さらに好ましくは２．５〜５、さらに好ましくは２．５〜４．５、さらに好ましくは２．５〜４、なお好ましくは３〜５、なお好ましくは３〜４．５、なお好ましくは３〜４である。
本発明によるイムノグロブリン又はその断片の単離方法の一実施形態において、単離されたイムノグロブリン又はその断片は、抗体医薬として使用される。したがって、一実施形態において、本発明は、本発明のアフィニティー担体を用いる抗体医薬の製造方法を提供する。当該方法の手順は、抗体医薬に使用すべき目的のイムノグロブリン又はその断片を含有する試料を用いる以外は、基本的に上述したイムノグロブリン又はその断片の単離方法の手順と同様である。
以下、本発明を、実施例を挙げてさらに具体的に説明する。また、以下の記載は本発明の態様を概括的に示すものであり、特に理由なく、かかる記載により本発明は限定されるものではない。
参考例１ 多孔質粒子の合成
（１）３６０ｇの純水にポリビニルアルコール（クラレ社製 ＰＶＡ−２１７）３．５８ｇを添加し、加熱撹拌してポリビニルアルコールを溶解させ、冷却した後、ドデシル硫酸ナトリウム（和光純薬工業製）０．３６ｇ、硫酸ナトリウム（和光純薬工業製）０．３６ｇ、及び亜硝酸ナトリウム（和光純薬工業製）０．１８ｇを添加し、撹拌して水溶液Ｓを調製した。
（２）グリシジルメタクリレート（三菱レーヨン社製）１２．００ｇ及びジビニルベンゼン（新日鐵化学社製）１．３３ｇからなる単量体組成物を、ジイソブチルケトン（三井化学社製）２４．４３ｇに溶解させ、単量体溶液を調製した。
（３）該水溶液Ｓを、５００ｍＬセパラブルフラスコ内に全量投入し、温度計、撹拌翼及び冷却管を装着して、温水バスにセットし、窒素雰囲気下で撹拌を開始した。このセパラブルフラスコ内に該単量体溶液を全量投入して、温水バスにより加温した。内温が８５℃に到達したところで２，２’−アゾイソブチロニトリル（和光純薬工業社製）０．５３ｇを添加した。
（４）得られた反応液を、８６℃に温度を維持しながら、３時間撹拌した。次いで、反応液を冷却した後、ろ過し、純水とエタノールで洗浄した。洗浄した粒子を純水に分散させてデカンテーションを３回行い、小粒子を除いた。次いで、粒子の濃度が１０質量％となるように粒子を純水に分散させ、分散液Ａを得た。
（５）ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル６６．００ｇ、硫酸ナトリウム（和光純薬工業製）４５．７０ｇからなる組成物を、０．１Ｍ炭酸バッファー３８８．３ｇと混合させ、水溶液Ｅを調製した。
（６）チオグリコール酸（和光純薬工業製）２３．０３ｇ、硫酸ナトリウム（和光純薬工業製）７．１０ｇを純水に溶解させ、水酸化ナトリウム（和光純薬工業製）を加えてｐＨ８．３、５００ｍＬとした水溶液Ｃを調製した。
（７）水溶液Ｅ及び分散液Ａを吸引濾過したろ物を１Ｌのプラスチックボトルに加え、ローター式攪拌機にセットし、室温条件下で撹拌を開始した。２時間後、液をろ過し、純水で洗浄した。
（８）該ろ物１７．００ｇと水溶液Ｃ全量を１Ｌのプラスチックボトルに加え、ローター式攪拌機にセットし、室温条件下で撹拌を開始した。４時間後、液をろ過し、純水、１６ｖｏｌ％エタノールで洗浄した。次いで、粒子体積が５０％（ｖ／ｖ）となるように、粒子を１６ｖｏｌ％エタノールに分散させ、多孔質粒子（ＰＢ）分散液を得た。
実施例１ ＶＨＨ抗体の作製
（１）ＶＨＨ抗体２ｂＳ１３の作製
配列番号１のアミノ酸配列からなり、トラスツズマブ（ハーセプチン（登録商標））に結合する、ラクダ科動物野生型重鎖抗体由来ＶＨＨ抗体２ｂＳ１３と、そのＣ末端に連結したＰＢ固定化用リンカーペプチドとをコードするプラスミドを調製した。このプラスミドを用いて大腸菌コンピテントセルＢＬ２１（ＤＥ３）（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ製）を形質転換した。得られた形質転換体を、吸光度（ＯＤ６００）が約１０に到達するまで３７℃でインキュベートし、その後、終濃度で１ｍＭになるようにＩＰＴＧ（和光純薬工業製）を添加し、さらに５時間３７℃でインキュベートして、組換えＶＨＨ抗体タンパク質を発現させた。タンパク質発現後、細胞を遠心分離により回収し、ｐＨ８．５のトリス緩衝液中に分散させ、ホモジナイザーを用いて細胞を破壊した。得られた菌体破壊固形分をグアニジン塩酸塩（和光純薬）の変性剤含有溶液で分散させ、ＢｉｏＰｒｏ ＳおよびＢｉｏＰｒｏ Ｑ（株式会社ワイエムシィ）によって２ｂＳ１３を精製した。精製したタンパク質を、２０ｍＭリン酸緩衝液に対して複数回の透析を行いリフォールディングした。
（２）Ｈｉｓ置換変異ＶＨＨ抗体の作製
２ｂＳ１３のＣＤＲ３のアミノ酸残基をＨｉｓに置換した変異ＶＨＨ抗体を作製した。配列番号１の９７位アミノ酸残基をＨｉｓに置換した変異ＶＨＨ抗体２ｂＳ１３−９７Ｈをコードするプラスミド、配列番号１の１００位アミノ酸残基をＨｉｓに置換した変異ＶＨＨ抗体２ｂＳ１３−１００Ｈをコードするプラスミド、配列番号１の１０２位アミノ酸残基をＨｉｓに置換した変異ＶＨＨ抗体２ｂＳ１３−１０２Ｈをコードするプラスミド、及び配列番号１の１００位及び１０２位に相当する位置のアミノ酸残基をＨｉｓに置換した変異ＶＨＨ抗体２ｂＳ１３−１００−１０２Ｈをコードするプラスミドを調製した。これらのプラスミドを用いて、（１）と同様の手順でＣＤＲ３におけるＨｉｓ置換を有する変異ＶＨＨ抗体タンパク質２ｂＳ１３−９７Ｈ（配列番号５）、２ｂＳ１３−１００Ｈ（配列番号６）、２ｂＳ１３−１０２Ｈ（配列番号７）、及び２ｂＳ１３−１００−１０２Ｈ（配列番号８）を調製した。
（３）Ａｒｇ置換変異ＶＨＨ抗体の作製
２ｂＳ１３に含まれるＬｙｓをＡｒｇに置換した変異ＶＨＨ抗体を作製した。２ｂＳ１３のアミノ酸配列に含まれる５つのＬｙｓ（配列番号１の４３位、５３位、６４位、７５位及び８６位Ｌｙｓ）をＡｒｇに置換した変異ＶＨＨ抗体２ｂＳ１３−ＫＲ５をコードするプラスミドを調製した。このプラスミドを用いて、（１）と同様の手順で変異ＶＨＨ抗体タンパク質２ｂＳ１３−ＫＲ５（配列番号９）を調製した。
実施例２ アフィニティー担体の調製
Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（和光純薬工業製）０．２２ｇ、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（和光純薬工業製）０．９５ｇからなる単量体組成物を０．０２Ｍ ＭＥＳバッファー（ｐＨ５．５）１．８４ｇに溶解させ、単量体溶液を調製した。該単量体溶液を参考例１で取得した多孔質粒子（ＰＢ）０．５ｇと混合し、ローター式攪拌機にセットし、室温条件下で撹拌を開始した。３０分後、液をろ過し、０．０２Ｍ ＭＥＳバッファー（ｐＨ５．５）、及びリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．５）で洗浄した。得られたろ物と実施例１で調製したいずれかのＶＨＨ抗体とを、多孔質粒子１ｇあたりのタンパク質量が０．１２ｇになるように、０．０２Ｍリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．５）に混和した。これを２５℃で５時間振盪して多孔質粒子にＶＨＨ抗体を固定化させて、ＶＨＨ抗体をリガンドとするアフィニティークロマトグラフィー用担体（２ｂＳ１３／ＰＢ、２ｂＳ１３−９７Ｈ／ＰＢ、２ｂＳ１３−１００Ｈ／ＰＢ、２ｂＳ１３−１０２Ｈ／ＰＢ、２ｂＳ１３−１００−１０２Ｈ／ＰＢ、及び２ｂＳ１３−ＫＲ５）を得た。これら粒子に残存するＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミド基を、トリスヒドロキシメチルアミノメタンを用いてブロッキングした。その後、０．００１Ｍ ＮａＯＨ及び０．１Ｍクエン酸バッファー（ｐＨ２．５）を用いて粒子を洗浄し、最終的にＰＢＳに懸濁した。
試験例１ ＶＨＨ抗体の抗原エピトープの特定
実施例１で調製したＶＨＨ抗体が認識するエピトープを調べた。
（１）ＶＨＨ抗体とトラスツズマブとの複合体結晶の取得
モノクローナル抗体トラスツズマブ（ハーセプチン（登録商標））をパパインで消化し、Ｆａｂを調製した。得られたトラスツズマブＦａｂとラクダ科動物野生型重鎖抗体由来のＶＨＨ抗体２ｂＳ１３（配列番号１）とを混合し、ＨＰＬＣにより複合体を分取した。該複合体を用いて、タンパク質結晶化分注システム Ｇｒｙｐｈｏｎ（Ａｒｔ Ｒｏｂｂｉｎｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社）による結晶化を行い、ＶＨＨ抗体２ｂＳ１３とトラスツズマブＦａｂの複合体の結晶を得た。
（２）ＶＨＨ抗体とトラスツズマブの複合体の立体構造の評価
得られた複合体結晶のＸ線回折データから、複合体のモデリングと精密化を行った。該モデルとＶＨＨ抗体、トラスツズマブＦａｂそれぞれのモデルから、それぞれのタンパク質を構成する各アミノ酸残基の複合体形成前後のＡｃｃｅｓｓｉｂｌｅ ｓｕｒｆａｃｅ ａｒｅａ（以下、ＡＳＡとする）の変化を算出した。トラスツズマブＦａｂの軽鎖（配列番号２２）及び重鎖（配列番号２３）のアミノ酸配列上におけるＡＳＡの変化が１以上であった位置の残基を表１に示す。ＡＳＡの変化が１以上の場合、ＶＨＨ抗体とトラスツズマブＦａｂとの間で相互作用が生じていると考えられ、斯かる位置の残基はエピトープであると解される。これらの結果から、該ＶＨＨ抗体が、プロテインＡのようなＦｃ領域に結合する抗体ではなく、Ｆａｂを認識する抗体であることが示された。
Figure 2019244961
試験例２ Ｈｉｓ置換変異ＶＨＨ抗体のＩｇ結合解離挙動の評価
実施例１で調製した２ｂＳ１３、２ｂＳ１３−９７Ｈ、２ｂＳ１３−１００Ｈ、及び２ｂＳ１３−１０２Ｈについて、Ｉｇ結合能を、Ｂｉａｃｏｒｅ（ＧＥヘルスケア社）を用いて評価した。該ＶＨＨ抗体をＨＢＳ−ＥＰ（１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、及び０．００５％ Ｔｗｅｅｎ−２０）に分散させ、１２．５〜１５０ｎＭのＶＨＨ抗体溶液を作製した。Ｂｉａｃｏｒｅセンサーチップに、試験例１で調製したトラスツズマブＦａｂを固定化し、これに該ＶＨＨ抗体溶液をアプライした。測定はｐＨ７．４の中性条件下で行われた。結合及び解離挙動にＢｉｎｄｉｎｇ ｍｏｄｅｌを用いたカーブフィッティングを適応し、結合速度定数（Ｋｏｎ）及び結合解離定数（Ｋｏｆｆ）、親和性（ＫＤ）を評価した。さらに、このセンサーチップを酸性の溶離液（１０ｍＭ Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ＋０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ２．０）で洗浄してシグナルを測定し、得られたシグナル形状より、酸によるＩｇ溶出挙動を調べた。溶離液で洗浄した直後のシグナルの減衰が早いほど、酸性条件下で抗体固定化センサーチップからＶＨＨ抗体が脱離し易い、すなわちＶＨＨ抗体のＩｇ溶出効率が高いことを示す。
測定結果を表２及び図１に示す。表２に示されるように、変異ＶＨＨ抗体はいずれも、中性条件下でトラスツズマブＦａｂに対して親抗体２ｂＳ１３と同等のＫＤ値を有し、変異ＶＨＨ抗体が親抗体と同等のＩｇ結合能を有していることが示された。また、変異ＶＨＨ抗体はいずれも、親抗体２ｂＳ１３と比べて、酸性の溶離液による洗浄直後（図１中四角で囲んだ領域）でのシグナルの減衰率が高く、親抗体と比べて酸性条件下でのＩｇ溶出挙動が向上していたことが示された。
Figure 2019244961
試験例３ Ｈｉｓ置換変異ＶＨＨ抗体を用いたアフィニティー担体のＩｇ溶出能
実施例２で得られたアフィニティー担体２ｂＳ１３／ＰＢ、２ｂＳ１３−１００Ｈ／ＰＢ、及び２ｂＳ１３−１００−１０２Ｈ／ＰＢを充填したカラムを用いてアフィニティークロマトグラフィーを行い、酸性条件下での担体からのＩｇ溶出能を評価した。全てのクロマトグラフィー実験は、ＡＫＴＡ ａｖａｎｔ １５０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）にて行った。クロマトグラフィー用カラムは、Ｔｒｉｃｏｒｎ ５／５０ カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて、実施例２で得られたアフィニティー担体を充填した（カラムボリューム１ｍＬ）。担体に結合させるＩｇには、試験例１と同じトラスツズマブＦａｂを用いた。ローディング液には、ｐＨ７．５のクエン酸ナトリウム緩衝液を、溶離液には、ｐＨ３．０及び２．５のクエン酸ナトリウム緩衝液を順に用いた。カラムからの溶出物のＯＤ２８０を逐次モニターすることで、溶出物中のＩｇ量を測定した。ｐＨ３．０溶出液及びｐＨ２．５溶離液で溶出した画分のうち、ＯＤ２８０の値が０．１２ＡＵ以上の画分の体積を調べた。
カラムからの溶出物のＯＤ２８０の変化を図２に示す。Ｈｉｓ置換のないリガンドを用いた担体２ｂＳ１３／ＰＢは、ｐＨ３．０でＩｇをほとんど溶出せず、さらにｐＨを２．５まで下げてもＩｇの溶出量はわずかであった。これに対し、Ｈｉｓ置換変異のあるリガンドを用いた担体２ｂＳ１３−１００Ｈ／ＰＢでは、結合するＩｇのほとんどがｐＨ３．０で溶出された。さらに、二重Ｈｉｓ置換変異体を用いた担体２ｂＳ１３−１００−１０２Ｈ／ＰＢは、ｐＨ３．０で結合するＩｇのほぼ全てを溶出した。
表３は、担体に結合したＩｇの溶出に要した溶離液の量を示す。Ｈｉｓ置換変異のあるリガンドを用いた担体は、ｐＨ３．０の溶離液で充分量のＩｇを溶出することができた。リガンドのＨｉｓ置換の数が多くなると、Ｉｇ溶出に必要な溶離液の量はさらに減少した。一方、Ｈｉｓ置換のないリガンドを用いた担体は、ｐＨ２．５以上の溶離液を多量に使用しても充分量のＩｇを溶出することができなかった。
Figure 2019244961
試験例４ Ａｒｇ置換変異ＶＨＨ抗体を用いたアフィニティー担体のＩｇ結合能
（１）リガンド固定化量の測定
実施例２で調製した、変異ＶＨＨ抗体２ｂＳ１３又は２ｂＳ１３−ＫＲ５が固定化されたアフィニティー担体１ｍｇを用いてＢＣＡタンパク質アッセイを行った。検量線に基づいてリガンド固定化量を決定した。
（２）静的結合容量（ＳＢＣ）の測定
（１）で調製したＶＨＨ抗体が固定化されたマトリックス３ｍｇに、リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．５）に溶解した、試験例１と同じトラスツズマブＦａｂ ０．５ｇを添加し、振盪機を用いて２５℃で撹拌した。１時間後に溶液をろ過し、リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．５）で洗浄し、洗浄液をろ液と混合した。得られた水溶液のＯＤ２８０を測定し、漏出したＦａｂ量を決定した。初期添加Ｆａｂ量から漏出したＦａｂ量を差し引くことで、静的結合容量（ＳＢＣ）を算出した。
測定結果を表４に示す。表４に示すデータは、各担体についての３回の測定結果とその平均値である。
Figure 2019244961

Claims (18)

  1. アフィニティー担体であって、
    固相担体と、該固相担体に結合したイムノグロブリン結合タンパク質とを含み、
    該イムノグロブリン結合タンパク質が、配列番号２２のアミノ酸配列の１２７〜１８４位、及び配列番号２３のアミノ酸配列の１３〜２１０位からなる群より選択される少なくとも１つの領域におけるエピトープを認識する、ＶＨＨ抗体の変異体又はその断片を含む、
    アフィニティー担体。
  2. 前記ＶＨＨ抗体変異体が、変異前のＶＨＨ抗体に対して、少なくとも１個のヒスチジンが挿入されているか又は少なくとも１個のアミノ酸残基がヒスチジンに置換されている相補性決定領域を有する、請求項１記載のアフィニティー担体。
  3. 前記変異前のＶＨＨ抗体が、配列番号１〜４のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも８５％同一なアミノ酸配列からなり、かつトラスツズマブのＦａｂ領域に対して親和性を有するポリペプチドである、請求項２記載のアフィニティー担体。
  4. 前記相補性決定領域がＣＤＲ３である、請求項２又は３記載のアフィニティー担体。
  5. 前記ＶＨＨ抗体変異体が、前記配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一なアミノ酸配列において、配列番号１のアミノ酸配列の９７位に相当する位置、１００位に相当する位置及び１０２位に相当する位置からなる群より選択される少なくとも１つの位置におけるアミノ酸残基がヒスチジンに置換されているアミノ酸配列からなるポリペプチドである、請求項４記載のアフィニティー担体。
  6. 前記配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一なアミノ酸配列が、配列番号１の２６〜３５位領域に相当するＣＤＲ１領域に配列番号１０のアミノ酸配列を、配列番号１の５１〜６５位領域に相当するＣＤＲ２領域に配列番号１１のアミノ酸配列を、配列番号１の９６〜１０７位領域に相当するＣＤＲ３領域に配列番号１２のアミノ酸配列を有し、
    前記配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一なアミノ酸配列が、配列番号２の２６〜３７位領域に相当するＣＤＲ１領域に配列番号１３のアミノ酸配列を、配列番号２の５３〜６８位領域に相当するＣＤＲ２領域に配列番号１４のアミノ酸配列を、配列番号２の９９〜１１８位領域に相当するＣＤＲ３領域に配列番号１５のアミノ酸配列を有し、
    前記配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一なアミノ酸配列が、配列番号３の２６〜３５位領域に相当するＣＤＲ１領域に配列番号１６のアミノ酸配列を、配列番号３の５１〜６６位領域に相当するＣＤＲ２領域に配列番号１７のアミノ酸配列を、配列番号３の９７〜１１６位領域に相当するＣＤＲ３領域に配列番号１８のアミノ酸配列を有し、
    前記配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一なアミノ酸配列が、配列番号４の２６〜３５位領域に相当するＣＤＲ１領域に配列番号１９のアミノ酸配列を、配列番号４の５１〜６６位領域に相当するＣＤＲ２領域に配列番号２０のアミノ酸配列を、配列番号４の９７〜１１６位領域に相当するＣＤＲ３領域に配列番号２１のアミノ酸配列を有する、
    請求項３〜５のいずれか１項記載のアフィニティー担体。
  7. 前記ＶＨＨ抗体変異体が、前記変異前のＶＨＨ抗体のアミノ酸配列における少なくとも１個のリジンがアルギニンに置換されているアミノ酸配列からなる、請求項２〜６のいずれか１項記載のアフィニティー担体。
  8. 前記ＶＨＨ抗体変異体が、変異前のＶＨＨ抗体のアミノ酸配列における少なくとも１個のリジンがアルギニンに置換されているアミノ酸配列からなる、請求項１記載のアフィニティー担体。
  9. 前記変異前のＶＨＨ抗体が、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一なアミノ酸配列からなり、トラスツズマブのＦａｂ領域に対して親和性を有するポリペプチドである、請求項８記載のアフィニティー担体。
  10. 前記ＶＨＨ抗体変異体が、前記配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一なアミノ酸配列において、配列番号１のアミノ酸配列の４３位に相当する位置、５３位に相当する位置、６４位に相当する位置、７５位に相当する位置及び８６位に相当する位置からなる群より選択される少なくとも１つの位置にアルギニンを有するアミノ酸配列からなるポリペプチドである、請求項９記載のアフィニティー担体。
  11. 前記配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一なアミノ酸配列が、配列番号１の２６〜３５位領域に相当するＣＤＲ１領域に配列番号１０のアミノ酸配列を、配列番号１の５１〜６５位領域に相当するＣＤＲ２領域に配列番号１１のアミノ酸配列を、配列番号１の９６〜１０７位領域に相当するＣＤＲ３領域に配列番号１２のアミノ酸配列を有する、請求項９又は１０記載のアフィニティー担体。
  12. アフィニティー担体であって、
    固相担体と、該固相担体に結合したイムノグロブリン結合タンパク質とを含み、
    該イムノグロブリン結合タンパク質が、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一なアミノ酸配列であって、配列番号１のアミノ酸配列の９７位に相当する位置、１００位に相当する位置及び１０２位に相当する位置からなる群より選択される少なくとも１つの位置にヒスチジンを有するアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む、
    アフィニティー担体。
  13. 前記配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一なアミノ酸配列が、配列番号１の２６〜３５位領域に相当するＣＤＲ１領域に配列番号１０のアミノ酸配列を、配列番号１の５１〜６５位領域に相当するＣＤＲ２領域に配列番号１１のアミノ酸配列を、配列番号１の９６〜１０７位領域に相当するＣＤＲ３領域に配列番号１２のアミノ酸配列を有する、請求項１２記載のアフィニティー担体。
  14. 前記イムノグロブリン結合タンパク質が配列番号５〜８のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む、請求項１２記載のアフィニティー担体。
  15. アフィニティー担体であって、
    固相担体と、該固相担体に結合したイムノグロブリン結合タンパク質とを含み、
    該イムノグロブリン結合タンパク質が、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一なアミノ酸配列であって、配列番号１のアミノ酸配列の４３位に相当する位置、５３位に相当する位置、６４位に相当する位置、７５位に相当する位置及び８６位に相当する位置からなる群より選択される少なくとも１つの位置にアルギニンを有するアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む、
    アフィニティー担体。
  16. 前記配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一なアミノ酸配列が、配列番号１の２６〜３５位領域に相当するＣＤＲ１領域に配列番号１０のアミノ酸配列を、配列番号１の５１〜６５位領域に相当するＣＤＲ２領域に配列番号１１のアミノ酸配列を、配列番号１の９６〜１０７位領域に相当するＣＤＲ３領域に配列番号１２のアミノ酸配列を有する、請求項１５記載のアフィニティー担体。
  17. 前記イムノグロブリン結合タンパク質が配列番号９のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む、請求項１５記載のアフィニティー担体。
  18. 請求項１〜１７のいずれかに記載のアフィニティー担体を用いる、イムノグロブリン又はその断片の単離方法。
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