JPWO2020040307A1 - イムノグロブリン結合タンパク質、及びそれを用いたアフィニティー担体 - Google Patents
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Abstract
Description
〔1〕 配列番号1〜6及び57〜62のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列であって、且つ以下の(a)〜(f)からなる群より選択される少なくとも1種の変異を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド鎖を含む、イムノグロブリン結合タンパク質:
(a)配列番号3のアミノ酸配列の3位、6位、11位に相当する位置からなる群より選択される少なくとも1つの位置におけるアミノ酸残基の、他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置への他のアミノ酸残基の挿入;
(b)配列番号3のアミノ酸配列の24位及び25位に相当する位置からなる群より選択される少なくとも1つの位置におけるアミノ酸残基の、他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置への他のアミノ酸残基の挿入;
(c)配列番号3のアミノ酸配列の39位に相当する位置におけるアミノ酸残基の、他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置への他のアミノ酸残基の挿入;
(d)配列番号3のアミノ酸配列の46位に相当する位置におけるアミノ酸残基の、他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置への他のアミノ酸残基の挿入;
(e)配列番号3のアミノ酸配列の4位、49位及び58位に相当する位置からなる群より選択される少なくとも1つの位置におけるアミノ酸残基の、他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置への他のアミノ酸残基の挿入;及び
(f)配列番号3のアミノ酸配列の23位に相当する位置におけるアミノ酸残基の、他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置への他のアミノ酸残基の挿入。
〔2〕前記ポリペプチド鎖が、配列番号3のアミノ酸配列と少なくとも85%の同一性を有し且つ前記(a)〜(f)からなる群より選択される少なくとも1種の変異を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド鎖である、〔1〕記載のイムノグロブリン結合タンパク質。
〔3〕前記(a)〜(f)からなる群より選択される少なくとも1種の変異が、
(a1)配列番号3のアミノ酸配列の3位に相当する位置におけるAsnからGlnへの置換;
(a2)配列番号3のアミノ酸配列の3位に相当する位置におけるAsnからAlaへの置換;
(a3)配列番号3のアミノ酸配列の3位に相当する位置におけるAsnからAspへの置換;
(a4)配列番号3のアミノ酸配列の6位に相当する位置におけるAsnからGlnへの置換;
(a5)配列番号3のアミノ酸配列の6位に相当する位置におけるAsnからAlaへの置換;
(a6)配列番号3のアミノ酸配列の6位に相当する位置におけるAsnからAspへの置換;
(a7)配列番号3のアミノ酸配列の11位に相当する位置におけるAsnからGlnへの置換;
(a8)配列番号3のアミノ酸配列の11位に相当する位置におけるAsnからAlaへの置換;
(a9)配列番号3のアミノ酸配列の11位に相当する位置におけるAsnからArgへの置換;
(a10)配列番号3のアミノ酸配列の11位に相当する位置におけるAsnからAspへの置換;
(a11)配列番号3のアミノ酸配列の11位に相当する位置におけるAsnからCysへの置換;
(a12)配列番号3のアミノ酸配列の11位に相当する位置におけるAsnからGluへの置換;
(a13)配列番号3のアミノ酸配列の11位に相当する位置におけるAsnからHisへの置換;
(a14)配列番号3のアミノ酸配列の11位に相当する位置におけるAsnからIleへの置換;
(a15)配列番号3のアミノ酸配列の11位に相当する位置におけるAsnからLeuへの置換;
(a16)配列番号3のアミノ酸配列の11位に相当する位置におけるAsnからLysへの置換;
(a17)配列番号3のアミノ酸配列の11位に相当する位置におけるAsnからMetへの置換;
(a18)配列番号3のアミノ酸配列の11位に相当する位置におけるAsnからPheへの置換;
(a19)配列番号3のアミノ酸配列の11位に相当する位置におけるAsnからThrへの置換;
(a20)配列番号3のアミノ酸配列の11位に相当する位置におけるAsnからTrpへの置換;
(a21)配列番号3のアミノ酸配列の11位に相当する位置におけるAsnからTyrへの置換;
(a22)配列番号3のアミノ酸配列の11位に相当する位置におけるAsnからValへの置換;
(b1)配列番号3のアミノ酸配列の24位に相当する位置におけるGluからAspへの置換;
(b2)配列番号3のアミノ酸配列の25位に相当する位置におけるGluからAspへの置換;
(c1)配列番号3のアミノ酸配列の39位に相当する位置におけるSerからLysへの置換;
(c2)配列番号3のアミノ酸配列の39位に相当する位置におけるSerからArgへの置換;
(d1)配列番号3のアミノ酸配列の46位に相当する位置におけるAlaからAspへの置換;
(d2)配列番号3のアミノ酸配列の46位に相当する位置におけるAlaからGluへの置換;
(d3)配列番号3のアミノ酸配列の46位に相当する位置におけるAlaからLysへの置換;
(d4)配列番号3のアミノ酸配列の46位に相当する位置におけるAlaからArgへの置換;
(e1)配列番号3のアミノ酸配列の4位に相当する位置におけるLysの欠失;
(e2)配列番号3のアミノ酸配列の49位に相当する位置におけるLysからArgへの置換;
(e3)配列番号3のアミノ酸配列の58位に相当する位置におけるLysの欠失;
(e4)配列番号3のアミノ酸配列の58位に相当する位置におけるLysからArgへの置換、
(f1)配列番号3のアミノ酸配列の23位に相当する位置におけるThrからArgへの置換;
(f2)配列番号3のアミノ酸配列の23位に相当する位置におけるThrからLeuへの置換;及び
(f3)配列番号3のアミノ酸配列の23位に相当する位置におけThrからSerへの置換、
からなる群より選択される少なくとも1種の変異である、〔1〕又は〔2〕記載のイムノグロブリン結合タンパク質。
〔4〕前記(a)〜(f)からなる群より選択される少なくとも1種の変異が、
(a1)配列番号3のアミノ酸配列の3位に相当する位置におけるAsnからGlnへの置換;
(a2)配列番号3のアミノ酸配列の3位に相当する位置におけるAsnからAlaへの置換;
(a3)配列番号3のアミノ酸配列の3位に相当する位置におけるAsnからAspへの置換;
(a4)配列番号3のアミノ酸配列の6位に相当する位置におけるAsnからGlnへの置換;
(a5)配列番号3のアミノ酸配列の6位に相当する位置におけるAsnからAlaへの置換;
(a6)配列番号3のアミノ酸配列の6位に相当する位置におけるAsnからAspへの置換;
(a7)配列番号3のアミノ酸配列の11位に相当する位置におけるAsnからGlnへの置換;
(a8)配列番号3のアミノ酸配列の11位に相当する位置におけるAsnからAlaへの置換;
(a9)配列番号3のアミノ酸配列の11位に相当する位置におけるAsnからArgへの置換;
(a10)配列番号3のアミノ酸配列の11位に相当する位置におけるAsnからAspへの置換;
(a11)配列番号3のアミノ酸配列の11位に相当する位置におけるAsnからCysへの置換;
(a12)配列番号3のアミノ酸配列の11位に相当する位置におけるAsnからGluへの置換;
(a13)配列番号3のアミノ酸配列の11位に相当する位置におけるAsnからHisへの置換;
(a14)配列番号3のアミノ酸配列の11位に相当する位置におけるAsnからIleへの置換;
(a15)配列番号3のアミノ酸配列の11位に相当する位置におけるAsnからLeuへの置換;
(a16)配列番号3のアミノ酸配列の11位に相当する位置におけるAsnからLysへの置換;
(a17)配列番号3のアミノ酸配列の11位に相当する位置におけるAsnからMetへの置換;
(a18)配列番号3のアミノ酸配列の11位に相当する位置におけるAsnからPheへの置換;
(a19)配列番号3のアミノ酸配列の11位に相当する位置におけるAsnからThrへの置換;
(a20)配列番号3のアミノ酸配列の11位に相当する位置におけるAsnからTrpへの置換;
(a21)配列番号3のアミノ酸配列の11位に相当する位置におけるAsnからTyrへの置換;
(a22)配列番号3のアミノ酸配列の11位に相当する位置におけるAsnからValへの置換;
(a23)配列番号3のアミノ酸配列の3位、6位及び11位に相当する位置におけるAsnからGlnへの置換;
(a24)配列番号3のアミノ酸配列の3位に相当する位置におけるAsnからAlaへの置換、及び11位に相当する位置におけるAsnからGlnへの置換;
(a25)配列番号3のアミノ酸配列の3位に相当する位置におけるAsnからAspへの置換、及び11位に相当する位置におけるAsnからGlnへの置換;
(a26)配列番号3のアミノ酸配列の6位に相当する位置におけるAsnからAspへの置換、及び11位に相当する位置におけるAsnからGlnへの置換;
(a27)配列番号3のアミノ酸配列の3位に相当する位置におけるAsnからAspへの置換、6位に相当する位置におけるAsnからAspへの置換、及び11位に相当する位置におけるAsnからGlnへの置換;
(a28)配列番号3のアミノ酸配列の3位に相当する位置におけるAsnからAlaへの置換、6位に相当する位置におけるAsnからAspへの置換、及び11位に相当する位置におけるAsnからGlnへの置換;
(b1)配列番号3のアミノ酸配列の24位に相当する位置におけるGluからAspへの置換;
(b2)配列番号3のアミノ酸配列の25位に相当する位置におけるGluからAspへの置換;
(c1)配列番号3のアミノ酸配列の39位に相当する位置におけるSerからLysへの置換;
(c2)配列番号3のアミノ酸配列の39位に相当する位置におけるSerからArgへの置換;
(d1)配列番号3のアミノ酸配列の46位に相当する位置におけるAlaからAspへの置換;
(d2)配列番号3のアミノ酸配列の46位に相当する位置におけるAlaからGluへの置換;
(d3)配列番号3のアミノ酸配列の46位に相当する位置におけるAlaからLysへの置換;
(d4)配列番号3のアミノ酸配列の46位に相当する位置におけるAlaからArgへの置換;
(e1)配列番号3のアミノ酸配列の4位に相当する位置におけるLysの欠失;
(e2)配列番号3のアミノ酸配列の49位に相当する位置におけるLysからArgへの置換;
(e3)配列番号3のアミノ酸配列の58位に相当する位置におけるLysの欠失;
(e4)配列番号3のアミノ酸配列の58位に相当する位置におけるLysからArgへの置換;
(f1)配列番号3のアミノ酸配列の23位に相当する位置におけるThrからArgへの置換;
(f2)配列番号3のアミノ酸配列の23位に相当する位置におけるThrからLeuへの置換;
(f3)配列番号3のアミノ酸配列の23位に相当する位置におけThrからSerへの置換;
(g1) (a7)と(f1)の組み合わせ;
(g2) (a7)と(f2)の組み合わせ;
(g3) (a7)と(f3)の組み合わせ;
(g4) (a7)と(e2)の組み合わせ;
(g5) (a7)と(e4)の組み合わせ;
(g6) (a7)と(f1)と(e2)の組み合わせ;
(g7) (a7)と(f2)と(e2)の組み合わせ;及び
(g8) (a7)と(f3)と(e2)の組み合わせ、
のいずれか1種である、〔3〕記載のイムノグロブリン結合タンパク質。
〔5〕前記(a)〜(f)からなる群より選択される少なくとも1種の変異が、配列番号3のアミノ酸配列の3位、6位、11位、24位、25位、39位、46位、4位、49位、58位及び23位のうちの少なくとも2つの位置に相当する位置におけるアミノ酸残基の、他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置への他のアミノ酸残基の挿入を含む、〔1〕〜〔4〕のいずれか1項記載のイムノグロブリン結合タンパク質。
〔6〕前記少なくとも1種の変異が、前記(a23)〜(a28)のいずれかであるか、又は前記(a1)〜(a28)のいずれか1つと前記(b1)〜(f3)のいずれか1つ以上との組み合わせである、〔5〕記載のイムノグロブリン結合タンパク質。
〔7〕前記アミノ酸配列の同一性が少なくとも90%である、〔1〕〜〔6〕のいずれか1項記載のイムノグロブリン結合タンパク質。
〔8〕前記ポリペプチド鎖が、配列番号3のアミノ酸配列の1位に相当する位置におけるアミノ酸残基のValへの置換、及び/又は配列番号3のアミノ酸配列の29位に相当する位置におけるアミノ酸残基のAlaへの置換をさらに含む、〔1〕〜〔7〕のいずれか1項記載のイムノグロブリン結合タンパク質。
〔9〕前記ポリペプチド鎖を2個以上含む、〔1〕〜〔8〕のいずれか1項記載のイムノグロブリン結合タンパク質。
〔10〕〔1〕〜〔9〕のいずれか1項記載のイムノグロブリン結合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
〔11〕〔10〕記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
〔12〕〔11〕記載のベクターを含む形質転換体。
〔13〕固相担体と、該固相担体に結合した〔1〕〜〔9〕のいずれか1項記載のイムノグロブリン結合タンパク質とを含む、アフィニティー担体。
〔14〕〔13〕のアフィニティー担体を含む、クロマトグラフィーカラム。
〔15〕〔13〕記載のアフィニティー担体又は〔14〕記載のクロマトグラフィーカラムを用いる、抗体又はその断片の単離方法。
〔16〕〔1〕〜〔9〕のいずれか1項記載のイムノグロブリン結合タンパク質を、〔12〕記載の形質転換体、もしくは無細胞タンパク質合成系において発現させるか、又は化学合成することを含む、イムノグロブリン結合タンパク質の製造方法。
〔17〕変異ポリペプチド鎖の製造方法であって、
配列番号1〜6及び57〜62のいずれかのアミノ酸配列又はこれらと少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つイムノグロブリン結合活性を有するポリペプチド鎖に対して、以下の(a)〜(f)からなる群より選択される少なくとも1種の変異を導入することを含む、方法:
(a)配列番号3のアミノ酸配列の3位、6位、11位に相当する位置からなる群より選択される少なくとも1つの位置におけるアミノ酸残基の、他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置への他のアミノ酸残基の挿入;
(b)配列番号3のアミノ酸配列の24位及び25位に相当する位置からなる群より選択される少なくとも1つの位置におけるアミノ酸残基の、他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置への他のアミノ酸残基の挿入;
(c)配列番号3のアミノ酸配列の39位に相当する位置におけるアミノ酸残基の、他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置への他のアミノ酸残基の挿入;
(d)配列番号3のアミノ酸配列の46位に相当する位置におけるアミノ酸残基の、他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置への他のアミノ酸残基の挿入;
(e)配列番号3のアミノ酸配列の4位、49位及び58位に相当する位置からなる群より選択される少なくとも1つの位置におけるアミノ酸残基の、他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置への他のアミノ酸残基の挿入;及び
(f)配列番号3のアミノ酸配列の23位に相当する位置におけるアミノ酸残基の、他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置への他のアミノ酸残基の挿入。
〔18〕固相担体に、〔1〕〜〔9〕のいずれか1項記載のイムノグロブリン結合タンパク質を固定化することを含む、アフィニティー担体の製造方法。
本発明のイムノグロブリン結合タンパク質は、スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)のプロテインA(以下、SpAともいう)のイムノグロブリン結合ドメインに由来する変異ポリペプチド鎖を、少なくとも1つ含む。本発明のイムノグロブリン結合タンパク質に含まれる該変異ポリペプチド鎖は、イムノグロブリン結合活性を有するポリペプチド鎖であり、以下の本明細書において、「本発明の変異イムノグロブリン結合ドメイン」とも称される。当該本発明の変異イムノグロブリン結合ドメインは、親ドメインであるSpA由来のイムノグロブリン結合ドメイン又はその変異体に、所定の変異を加えることによって得ることができる。当該本発明の変異イムノグロブリン結合ドメインは、イムノグロブリン結合活性を有し、且つ親ドメインと比べてアルカリ耐性が向上している。当該本発明の変異イムノグロブリン結合ドメインを含有する本発明のイムノグロブリン結合タンパク質は、アフィニティー担体のリガンドとして使用することができる。
(a)配列番号3のアミノ酸配列の3位、6位及び11位に相当する位置からなる群より選択される少なくとも1つの位置におけるアミノ酸残基の、他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置への他のアミノ酸残基の挿入;
(b)配列番号3のアミノ酸配列の24位及び25位に相当する位置からなる群より選択される少なくとも1つの位置におけるアミノ酸残基の、他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置への他のアミノ酸残基の挿入;
(c)配列番号3のアミノ酸配列の39位に相当する位置におけるアミノ酸残基の、他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置への他のアミノ酸残基の挿入;
(d)配列番号3のアミノ酸配列の46位に相当する位置におけるアミノ酸残基の、他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置への他のアミノ酸残基の挿入;
(e)配列番号3のアミノ酸配列の4位、49位及び58位に相当する位置からなる群より選択される少なくとも1つの位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置への他のアミノ酸残基の挿入;及び
(f)配列番号3のアミノ酸配列の23位に相当する位置におけるアミノ酸残基の、他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置への他のアミノ酸残基の挿入、
からなる群より選択される少なくとも1種の変異を導入して得られたポリペプチド鎖である。
より好ましい実施形態において、本発明の変異イムノグロブリン結合ドメインは、配列番号1〜3のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチド鎖に対して、当該(a)〜(f)からなる群より選択される少なくとも1種の変異を導入することによって製造される。
別のより好ましい実施形態において、本発明の変異イムノグロブリン結合ドメインは、配列番号1〜3のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つイムノグロブリン結合活性を有するポリペプチド鎖に対して、当該(a)〜(f)からなる群より選択される少なくとも1種の変異を導入することによって製造される。
さらに好ましい実施形態において、本発明の変異イムノグロブリン結合ドメインは、配列番号3のアミノ酸配列からなるポリペプチド鎖、又はこれと少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列からなり且つイムノグロブリン結合活性を有するポリペプチド鎖に対して、当該(a)〜(f)からなる群より選択される少なくとも1種の変異を導入することによって製造される。
該導入される変異は、該(a)〜(f)のいずれか1種であっても、2種以上の組み合わせ(すなわち、配列番号3のアミノ酸配列の3位、6位、11位、24位、25位、39位、46位、4位、49位、58位及び23位のうちの少なくとも2つの位置に相当する位置におけるアミノ酸残基の変異)であってもよく、好ましくは、上記(a1)、(a2)、(a3)、(a4)、(a5)、(a6)、(a7)、(a8)、(a9)、(a10)、(a11)、(a12)、(a13)、(a14)、(a15)、(a16)、(a17)、(a18)、(a19)、(a20)、(a21)、(a22)、(b1)、(b2)、(c1)、(c2)、(d1)、(d2)、(d3)、(d4)、(e1)、(e2)、(e3)、(e4)、(f1)、(f2)及び(f3)からなる群より選択される少なくとも1種、又は2種以上の変異の組み合わせである。該2種以上の変異の組み合わせの例としては、上記(a23)〜(a28)が挙げられる。該2種以上の変異の組み合わせの別の例としては、上記(a1)〜(a28)のいずれか1つと上記(b1)〜(f3)のいずれか1つ以上との組み合わせが挙げられ、好ましくは上記(a1)〜(a22)のいずれか1つと上記(e1)〜(f3)のいずれか1つ以上との組み合わせが挙げられ、より好ましくは上記(a7)〜(a22)のいずれか1つと上記(e2)、(e4)、(f1)、(f2)及び(f3)のいずれか1つ以上との組み合わせが挙げられ、さらに好ましくは上記(a7)と上記(e2)、(e4)、(f1)、(f2)及び(f3)のいずれか1つ以上との組み合わせが挙げられ、さらに好ましくは、以下が挙げられる:
(g1) 上記(a7)と(f1)の組み合わせ;
(g2) 上記(a7)と(f2)の組み合わせ;
(g3) 上記(a7)と(f3)の組み合わせ;
(g4) 上記(a7)と(e2)の組み合わせ;
(g5) 上記(a7)と(e4)の組み合わせ;
(g6) 上記(a7)と(f1)と(e2)の組み合わせ;
(g7) 上記(a7)と(f2)と(e2)の組み合わせ;及び
(g8) 上記(a7)と(f3)と(e2)の組み合わせ。
本発明の変異イムノグロブリン結合ドメインのより好ましい例としては、配列番号1〜3のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも85%の同一性を有し且つ上記(a)〜(f)からなる群より選択される少なくとも1種の変異を有するアミノ酸配列からなり、イムノグロブリン結合活性を有するポリペプチド鎖が挙げられる。
本発明の変異イムノグロブリン結合ドメインのさらに好ましい例としては、配列番号3のアミノ酸配列と少なくとも85%の同一性を有し且つ上記(a)〜(f)からなる群より選択される少なくとも1種の変異を有するアミノ酸配列からなり、イムノグロブリン結合活性を有するポリペプチド鎖が挙げられる。
該(a)〜(f)からなる群より選択される少なくとも1種の変異は、好ましくは、上記(a1)、(a2)、(a3)、(a4)、(a5)、(a6)、(a7)、(a8)、(a9)、(a10)、(a11)、(a12)、(a13)、(a14)、(a15)、(a16)、(a17)、(a18)、(a19)、(a20)、(a21)、(a22)、(b1)、(b2)、(c1)、(c2)、(d1)、(d2)、(d3)、(d4)、(e1)、(e2)、(e3)、(e4)、(f1)、(f2)及び(f3)からなる群より選択される少なくとも1種であり、より好ましくは、上記(a1)、(a2)、(a3)、(a4)、(a5)、(a6)、(a7)、(a8)、(a9)、(a10)、(a11)、(a12)、(a13)、(a14)、(a15)、(a16)、(a17)、(a18)、(a19)、(a20)、(a21)、(a22)、(a23)、(a24)、(a25)、(a26)、(a27)、(a28)、(b1)、(b2)、(c1)、(c2)、(d1)、(d2)、(d3)、(d4)、(e1)、(e2)、(e3)、(e4)、(f1)、(f2)、(f3)、(g1)、(g2)、(g3)、(g4)、(g5)、(g6)、(g7)、又は(g8)である。別の一例において、該(a)〜(f)からなる群より選択される少なくとも1種の変異は、該(a1)〜(g8)の変異のうちのいずれか1種を含むが、該(a1)〜(g8)の変異のうちの他の変異を含まない。さらに別の一例において、該(a)〜(f)からなる群より選択される少なくとも1種の変異は、該(e2)、(e3)もしくは(e4)の単独変異のみの場合、又は(e2)と(e3)もしくは(e2)と(e4)の二重変異のみの場合を含まないことがある。
(A1)配列番号3のアミノ酸配列の3位に相当する位置におけるGln;
(A2)配列番号3のアミノ酸配列の3位に相当する位置におけるAla;
(A3)配列番号3のアミノ酸配列の3位に相当する位置におけるAsp;
(A4)配列番号3のアミノ酸配列の6位に相当する位置におけるGln;
(A5)配列番号3のアミノ酸配列の6位に相当する位置におけるAla;
(A6)配列番号3のアミノ酸配列の6位に相当する位置におけるAsp;
(A7)配列番号3のアミノ酸配列の11位に相当する位置におけるGln;
(A8)配列番号3のアミノ酸配列の11位に相当する位置におけるAla;
(A9)配列番号3のアミノ酸配列の11位に相当する位置におけるArg;
(A10)配列番号3のアミノ酸配列の11位に相当する位置におけるAsp;
(A11)配列番号3のアミノ酸配列の11位に相当する位置におけるCys;
(A12)配列番号3のアミノ酸配列の11位に相当する位置におけるGlu;
(A13)配列番号3のアミノ酸配列の11位に相当する位置におけるHis;
(A14)配列番号3のアミノ酸配列の11位に相当する位置におけるIle;
(A15)配列番号3のアミノ酸配列の11位に相当する位置におけるLeu;
(A16)配列番号3のアミノ酸配列の11位に相当する位置におけるLys;
(A17)配列番号3のアミノ酸配列の11位に相当する位置におけるMet;
(A18)配列番号3のアミノ酸配列の11位に相当する位置におけるPhe;
(A19)配列番号3のアミノ酸配列の11位に相当する位置におけるThr;
(A20)配列番号3のアミノ酸配列の11位に相当する位置におけるTrp;
(A21)配列番号3のアミノ酸配列の11位に相当する位置におけるTyr;
(A22)配列番号3のアミノ酸配列の11位に相当する位置におけるVal;
(B1)配列番号3のアミノ酸配列の24位に相当する位置におけるAsp;
(B2)配列番号3のアミノ酸配列の25位に相当する位置におけるAsp;
(C1)配列番号3のアミノ酸配列の39位に相当する位置におけるLys;
(C2)配列番号3のアミノ酸配列の39位に相当する位置におけるArg;
(D1)配列番号3のアミノ酸配列の46位に相当する位置におけるAsp;
(D2)配列番号3のアミノ酸配列の46位に相当する位置におけるGlu;
(D3)配列番号3のアミノ酸配列の46位に相当する位置におけるLys;
(D4)配列番号3のアミノ酸配列の46位に相当する位置におけるArg;
(E1)配列番号3のアミノ酸配列の4位に相当する位置におけるLysの欠失;
(E2)配列番号3のアミノ酸配列の49位に相当する位置におけるArg;
(E3)配列番号3のアミノ酸配列の58位に相当する位置におけるLysの欠失;
(E4)配列番号3のアミノ酸配列の58位に相当する位置におけるArg;
(F1)配列番号3のアミノ酸配列の23位に相当する位置におけるArg;
(F2)配列番号3のアミノ酸配列の23位に相当する位置におけるLeu;及び
(F3)配列番号3のアミノ酸配列の23位に相当する位置におけるSer、
からなる群より選択される少なくとも1つのアミノ酸残基、又はこれらのアミノ酸残基の2種以上の組み合わせを有するアミノ酸配列からなるポリペプチド鎖が挙げられる。該配列番号1〜6のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列は、好ましくは配列番号1〜3のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列であり、より好ましくは配列番号3のアミノ酸配列と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列である。
該2種以上のアミノ酸残基の組み合わせの例としては、下記(A23)〜(A28)が挙げられる:
(A23)配列番号3のアミノ酸配列の3位、6位及び11位に相当する位置におけるGln;
(A24)配列番号3のアミノ酸配列の3位に相当する位置におけるAla、6位に相当する位置におけるAsp、及び11位に相当する位置におけるGln;
(A25)配列番号3のアミノ酸配列の3位に相当する位置におけるAsp、及び11位に相当する位置におけるGln;
(A26)配列番号3のアミノ酸配列の6位に相当する位置におけるAsp、及び11位に相当する位置におけるGln;
(A27)配列番号3のアミノ酸配列の3位に相当する位置におけるAsp、6位に相当する位置におけるAsp、及び11位に相当する位置におけるGln;
(A28)配列番号3のアミノ酸配列の3位に相当する位置におけるAla、6位に相当する位置におけるAsp、及び11位に相当する位置におけるGln。
該2種以上のアミノ酸残基の組み合わせの別の例としては、上記(A1)〜(A28)のいずれか1つと上記(B1)〜(F3)のいずれか1つ以上との組み合わせが挙げられ、好ましくは上記(A1)〜(A22)のいずれか1つと上記(E1)〜(F3)のいずれか1つ以上との組み合わせが挙げられ、より好ましくは上記(A7)〜(A22)のいずれか1つと上記(E2)、(E4)、(F1)、(F2)及び(F3)のいずれか1つ以上との組み合わせが挙げられ、さらに好ましくは上記(A7)と上記(E2)、(E4)、(F1)、(F2)及び(F3)のいずれか1つ以上との組み合わせが挙げられ、さらに好ましくは、以下が挙げられる:
(G1) 上記(A7)及び(F1);
(G2) 上記(A7)及び(F2);
(G3) 上記(A7)及び(F3);
(G4) 上記(A7)及び(E2);
(G5) 上記(A7)及び(E4);
(G6) 上記(A7)、(F1)及び(E2);
(G7) 上記(A7)、(F2)及び(E2);又は
(G8) 上記(A7)、(F3)及び(E2)。
(A1)配列番号3のアミノ酸配列の3位に相当する位置におけるGln;
(A2)配列番号3のアミノ酸配列の3位に相当する位置におけるAla;
(A3)配列番号3のアミノ酸配列の3位に相当する位置におけるAsp;
(A4)配列番号3のアミノ酸配列の6位に相当する位置におけるGln;
(A5)配列番号3のアミノ酸配列の6位に相当する位置におけるAla;
(A6)配列番号3のアミノ酸配列の6位に相当する位置におけるAsp;
(A7)配列番号3のアミノ酸配列の11位に相当する位置におけるGln;
(A8)配列番号3のアミノ酸配列の11位に相当する位置におけるAla;
(A9)配列番号3のアミノ酸配列の11位に相当する位置におけるArg;
(A10)配列番号3のアミノ酸配列の11位に相当する位置におけるAsp;
(A11)配列番号3のアミノ酸配列の11位に相当する位置におけるCys;
(A12)配列番号3のアミノ酸配列の11位に相当する位置におけるGlu;
(A13)配列番号3のアミノ酸配列の11位に相当する位置におけるHis;
(A14)配列番号3のアミノ酸配列の11位に相当する位置におけるIle;
(A15)配列番号3のアミノ酸配列の11位に相当する位置におけるLeu;
(A16)配列番号3のアミノ酸配列の11位に相当する位置におけるLys;
(A17)配列番号3のアミノ酸配列の11位に相当する位置におけるMet;
(A18)配列番号3のアミノ酸配列の11位に相当する位置におけるPhe;
(A19)配列番号3のアミノ酸配列の11位に相当する位置におけるThr;
(A20)配列番号3のアミノ酸配列の11位に相当する位置におけるTrp;
(A21)配列番号3のアミノ酸配列の11位に相当する位置におけるTyr;
(A22)配列番号3のアミノ酸配列の11位に相当する位置におけるVal;
(A23)配列番号3のアミノ酸配列の3位、6位及び11位に相当する位置におけるGln;
(A24)配列番号3のアミノ酸配列の3位に相当する位置におけるAla、及び11位に相当する位置におけるGln;
(A25)配列番号3のアミノ酸配列の3位に相当する位置におけるAsp、及び11位に相当する位置におけるGln;
(A26)配列番号3のアミノ酸配列の6位に相当する位置におけるAsp、及び11位に相当する位置におけるGln;
(A27)配列番号3のアミノ酸配列の3位に相当する位置におけるAsp、6位に相当する位置におけるAsp、及び11位に相当する位置におけるGln;
(A28)配列番号3のアミノ酸配列の3位に相当する位置におけるAla、6位に相当する位置におけるAsp、及び11位に相当する位置におけるGln;
(B1)配列番号3のアミノ酸配列の24位に相当する位置におけるAsp;
(B2)配列番号3のアミノ酸配列の25位に相当する位置におけるAsp;
(C1)配列番号3のアミノ酸配列の39位に相当する位置におけるLys;
(C2)配列番号3のアミノ酸配列の39位に相当する位置におけるArg;
(D1)配列番号3のアミノ酸配列の46位に相当する位置におけるAsp;
(D2)配列番号3のアミノ酸配列の46位に相当する位置におけるGlu;
(D3)配列番号3のアミノ酸配列の46位に相当する位置におけるLys;
(D4)配列番号3のアミノ酸配列の46位に相当する位置におけるArg;
(E1)配列番号3のアミノ酸配列の4位に相当する位置におけるLysの欠失;
(E2)配列番号3のアミノ酸配列の49位に相当する位置におけるArg;
(E3)配列番号3のアミノ酸配列の58位に相当する位置におけるLysの欠失;
(E4)配列番号3のアミノ酸配列の58位に相当する位置におけるArg;
(F1)配列番号3のアミノ酸配列の23位に相当する位置におけるArg;
(F2)配列番号3のアミノ酸配列の23位に相当する位置におけるLeu;
(F3)配列番号3のアミノ酸配列の23位に相当する位置におけるSer;
(G1) 上記(A7)及び(F1);
(G2) 上記(A7)及び(F2);
(G3) 上記(A7)及び(F3);
(G4) 上記(A7)及び(E2);
(G5) 上記(A7)及び(E4);
(G6) 上記(A7)、(F1)及び(E2);
(G7) 上記(A7)、(F2)及び(E2);又は
(G8) 上記(A7)、(F3)及び(E2)、
を含むアミノ酸配列からなるポリペプチド鎖が挙げられる。該配列番号1〜6のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列は、好ましくは配列番号1〜3のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列であり、より好ましくは配列番号3のアミノ酸配列と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列である。別の一例において、本発明の変異イムノグロブリン結合ドメインは、上記(A1)〜(G8)のアミノ酸残基又はその欠失のうちのいずれか1種を含むが、該(A1)〜(G8)のアミノ酸残基又は欠失のうちの他のアミノ酸残基又は欠失を含まない。さらに別の一例において、本発明の変異イムノグロブリン結合ドメインの有する(A1)〜(F3)からなる群より選択される少なくとも1つのアミノ酸残基もしくはその欠失は、(E2)K49R、(E3)ΔK58、又は(E4)K58Rの単独変異、又はK49RΔK58、もしくはK49RK58Rの二重変異を含まないことがある。
本発明のイムノグロブリン結合タンパク質は、当該分野で公知の手法、例えばアミノ酸配列に基づく化学合成法や、リコンビナント法などにより製造することができる。例えば、本発明のイムノグロブリン結合タンパク質は、Frederick M. AusbelらによるCurrent Protocols In Molecular Biologyや、Sambrookら編集のMolecular Cloning(Cold Spring Harbor Laboratory Press,3rd edition,2001)などに記載されている公知の遺伝子組換え技術を利用して製造することができる。すなわち、本発明のイムノグロブリン結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターを大腸菌などの宿主に形質転換し、得られた組換え体を適切な液体培地で培養することにより、培養後の細胞から、目的のタンパク質を大量且つ経済的に取得することができる。好ましい発現ベクターとしては、宿主細胞内で複製可能な既知のベクターのいずれをも用いることができ、例えば、米国特許第5,151,350号明細書に記載されているプラスミドや、Sambrookら編集のMolecular Cloning(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3rd edition, 2001)などに記載されているプラスミドが挙げられる。また、形質転換のための宿主としては、特に限定されないが、大腸菌などのバクテリア、真菌類、昆虫細胞、哺乳類細胞等の組換えタンパク質を発現させるために用いられる公知の宿主を用いることができる。宿主中に核酸を導入することにより宿主を形質転換させるためには、各宿主に応じて当該技術分野において知られるいずれの方法を用いてもよく、例えば、Sambrookら編集のMolecular Cloning(Cold Spring Harbor Laboratory Press,3rd edition,2001)などに記載されている公知の方法を利用することができる。得られた形質転換体(好ましくは細菌等の細胞)を培養して発現されたタンパク質を回収する方法は、当業者によく知られている。あるいは、本発明のイムノグロブリン結合タンパク質は、無細胞タンパク質合成系を用いて発現させてもよい。
本発明のイムノグロブリン結合タンパク質は、アフィニティーリガンドとして使用することができる。本発明のイムノグロブリン結合タンパク質を固相担体に固定化することによって、該本発明のイムノグロブリン結合タンパク質をリガンドとしたアフィニティー担体を製造することができる。当該アフィニティー担体は、本発明のイムノグロブリン結合タンパク質をリガンドとする担体であり、イムノグロブリン結合活性を有する。また当該アフィニティー担体は、野生型プロテインAやそのドメインをリガンドとする担体に比べて、アルカリ耐性が向上している。
本発明の一実施形態に係る抗体又はその断片(以下、単に抗体と表記する。)の単離方法を説明する。本実施形態に係る抗体の単離方法は、好適には、本発明のイムノグロブリン結合タンパク質を固定化したアフィニティー担体に、抗体を含有する試料を通液し、該担体に該抗体を吸着させる工程(第一の工程)、及び、該担体から該抗体を溶出させる工程(第二の工程)を含み、好ましくは該第二の工程の後に、該担体をアルカリ性液で洗浄する工程(第三の工程)をさらに含む。
(1)360gの純水にポリビニルアルコール(クラレ社製 PVA−217)3.58gを添加し、加熱撹拌してポリビニルアルコールを溶解させ、冷却した後、ドデシル硫酸ナトリウム(和光純薬工業製)0.36g、硫酸ナトリウム(和光純薬工業製)0.36g、及び亜硝酸ナトリウム(和光純薬工業製)0.18gを添加し、撹拌して水溶液Sを調製した。
(2)グリシジルメタクリレート(三菱ケミカル株式会社製)12.00g及びジビニルベンゼン(新日鐵化学社製)1.33gからなる単量体組成物を、ジイソブチルケトン(三井化学社製)24.43gに溶解させ、単量体溶液を調製した。
(3)(1)で得た水溶液Sを、セパラブルフラスコ内に全量投入し、温度計、撹拌翼及び冷却管を装着して、温水バスにセットし、窒素雰囲気下で撹拌を開始した。セパラブルフラスコ内に(2)で得た単量体溶液を全量投入して、温水バスにより加温した。内温が85℃に到達したところで2,2’−アゾイソブチロニトリル(和光純薬工業社製)0.53gを添加した。
(4)(3)で得た反応液を、86℃に温度を維持しながら、3時間撹拌した。次いで、反応液を冷却した後、ろ過し、純水とエタノールで洗浄した。洗浄した粒子を純水に分散させてデカンテーションを3回行い、小粒子を除いた。次いで、粒子の濃度が10質量%となるように粒子を純水に分散させ、多孔質粒子(PB)分散液を得た。
イムノグロブリン結合タンパク質PrAt−0〜32を取得した。PrAt−0は、プロテインAのCドメイン(配列番号3)のA1V/G29A変異体(アルカリ耐性向上変異体;非特許文献1)がペプチド結合によって直列に連結したホモテトラマーを含むイムノグロブリン結合タンパク質である。PrAt−1〜32は、PrAt−0の各イムノグロブリン結合ドメインに対して表1記載の変異を導入した変異体である。
イムノグロブリン結合タンパク質PrAp−0〜39を取得した。PrAp−0は、プロテインAのCドメイン(配列番号3)のA1V/G29A変異体がペプチド結合によって直列に連結したホモペンタマーを含むイムノグロブリン結合タンパク質であり、PrAp−21は、プロテインAのCドメイン(配列番号3)のA1V/G29A変異体がペプチド結合によって直列に連結したホモペンタマーのC末端にシステイン(C)を連結したイムノグロブリン結合タンパク質である。PrAp−1〜20は、PrAp−0の各イムノグロブリン結合ドメインに対して表2記載の変異を導入した変異体であり、PrAp−22〜41は、PrAp−21の各イムノグロブリン結合ドメインに対して表3記載の変異を導入した変異体である。
イムノグロブリン結合タンパク質PrAh−0〜41を取得した。PrAh−0は、プロテインAのCドメイン(配列番号3)のA1V/G29A変異体がペプチド結合によって直列に連結したホモヘキサマーを含むイムノグロブリン結合タンパク質であり、PrAh−21は、プロテインAのCドメイン(配列番号3)のA1V/G29A変異体がペプチド結合によって直列に連結したホモヘキサマーのC末端にシステイン(C)を連結したイムノグロブリン結合タンパク質である。PrAh−1〜20は、PrAh−0の各イムノグロブリン結合ドメインに対して表4記載の変異を導入した変異体であり、PrAh−22〜41は、PrAh−21の各イムノグロブリン結合ドメインに対して表5記載の変異を導入した変異体である。
参考例1で取得した多孔質粒子(PB)8mgに対して、実施例1で調製したPrAt−0を1.16mg溶解した、1.1M硫酸ナトリウムを含む0.1M炭酸緩衝液(pH8.8)450μLを加え、混合液を25℃で5時間振盪して、PrAt−0をPBに結合させた。粒子に残存するエポキシ基をチオグリセロールを用いてブロッキングした後、0.5M NaOH及び0.1Mクエン酸バッファー(pH3.2)を用いて粒子を洗浄し、リガンド固定化粒子(PrAt−0/PB)を得た。同様の手順で、PrAt−1〜32のいずれかが結合したリガンド固定化粒子(PrAt−1/PB〜PrAt−32/PB)を得た。また、同様の手順でPrAp−0〜41のいずれかが結合したリガンド固定化粒子(PrAp−0/PB〜PrAp−41/PB)を得た。さらに、同様の手順でPrAh−0〜41のいずれかが結合したリガンド固定化粒子(PrAh−0/PB〜PrAh−41/PB)を得た。
イムノグロブリン結合タンパク質PrAs−0〜22を取得した。PrAs−0は、プロテインAのCドメイン(配列番号3)のA1V/G29A変異体のN末端に6回繰り返しヒスチジンタグ(HHHHHH配列)を連結したイムノグロブリン結合タンパク質である。PrAs−1〜22は、PrAs−0の各イムノグロブリン結合ドメインに対して表6記載の変異を導入した変異体である。
実施例4で作製した、変異ドメインを含むリガンド固定化粒子PrAt−1/PB〜PrAt−29/PBについて、親ドメインを含むリガンド固定化粒子PrAt−0に対する相対アルカリ耐性を評価した。
2mgのリガンド固定化粒子(PrAt−0/PB)に2.0mgのIgGを含む20mMリン酸バッファー(pH7.5)400μLを添加し、30分間インキュベートした。次いで20mMリン酸バッファー(pH7.5)400μLで洗浄した後、50mMクエン酸ナトリウムバッファー(pH2.5)400μLを添加し、IgGを含む溶出液を回収した。溶出液中のIgG量を吸光度測定により算出し、溶出IgG量と担体体積からPrAt−0/PBの静的結合容量(SBC)を求めた。同様の手順で、PrAt−1/PB〜PrAt−29/PBのSBCを求めた。また、同様の手順で、PrAh−21/PB〜PrAh−41/PBのSBCを求めた。
2mgのリガンド固定化粒子(PrAt−0/PB)を1.0M NaOHで平衡化させた後、24時間インキュベートした。次いで20mMリン酸バッファー(pH7.5)で粒子を平衡化させた後、2.0mgのIgGを含む20mMリン酸バッファー(pH7.5)400μLを添加し、30分間インキュベートした。次いで20mMリン酸バッファー(pH7.5)400μLで洗浄した後、50mMクエン酸ナトリウムバッファー(pH2.5)400μLを添加し、IgGを含む溶出液を回収した。溶出液中のIgG量を吸光度測定により算出し、溶出IgG量と担体体積からアルカリに暴露したPrAt−0/PBのSBCを求めた。同様の手順で、アルカリに暴露したPrAt−1〜29/PBのSBCを求めた。各リガンド固定化粒子について、(1)で求めたSBCに対するアルカリ暴露後のSBCの相対値(SBC維持率)を算出し、次いで以下の式に従って各リガンド固定化粒子(PrAt−1〜29)のPrAt−0に対する相対アルカリ耐性(%)を算出した。
相対アルカリ耐性(%)=(PrAt−N(N=1〜29)のSBC維持率)/(PrAt−0のSBC維持率)×100
(2)と同様の手順でアルカリに暴露したPrAh−21〜38/PBのSBCを求め、PrAh−22〜38のPrAh−21に対する相対アルカリ耐性(%)を算出した。
リガンド固定化粒子(PrAh−21/PB及びPrAh−39〜41/PB)を、(2)と同様の手順で、ただし1.0M NaOHの代わりに0.5M NaOHで平衡化させた後、24時間インキュベートした。その後は、(2)と同様の方法で、アルカリに暴露したPrAh−21、及び39〜41/PBのSBCを求め、PrAh−39〜41のPrAh−21に対する相対アルカリ耐性(%)を算出した。
実施例5で作製した、変異ドメインを含むイムノグロブリン結合タンパク質PrAs−1〜PrAs−19について、親ドメインを含むイムノグロブリン結合タンパク質PrAs−0に対する相対アルカリ耐性を評価した。
0.13mgのイムノグロブリン結合タンパク質(PrAs−0及びPrAs−1〜19)を1.0M水酸化ナトリウム水溶液中でインキュベートした。インキュベート開始直後又はインキュベート開始24時間後に、液を1.0Mクエン酸により中和した。次いで中和溶液を、0.1%ウシ血清由来アルブミン(和光純薬工業社製)及び0.02%Triton X−100(和光純薬工業社製)を含むD−PBSバッファーを用いてタンパク質濃度10μg/mLに希釈し、試料溶液を調製した。これら試料溶液について、PrAs−N(N=0〜19)を水酸化ナトリウム中でインキュベート開始直後に中和した試料溶液をPrAs−Naとし、インキュベート開始24時間後に中和した試料溶液をPrAs−Nbとする。
1.0mgのIgGを3.9μgのEZ−Link NHS−PEG4−Biotin(Thermo Fisher Scientific社製)と反応させ、IgGをビオチン化した。これをOctet RED 96eシステム(Pall ForteBio社製)を用いてストレプトアビジンバイオセンサー(Pall ForteBio社製)に接触させ、センサー上にIgGを固定化した。
Octet RED 96eシステムを用いてIgG結合バイオセンサーを試料溶液に接触させて、センサー上のIgGにイムノグロブリン結合タンパク質を結合させた。センサグラムから結合速度を決定し、PrAs−Naの結合速度に対するPrAs−Nbの結合速度の相対値(結合速度維持率)を算出した。次いで、以下の式に従って各イムノグロブリン結合タンパク質(PrAs−0〜19)のPrAs−0に対する相対アルカリ耐性(%)を算出した。
相対アルカリ耐性(%)={(PrAs−N(N=1〜19)の結合速度維持率)/(PrAs−0の結合速度維持率)}×100
PrAs−N(N=0〜19)の結合速度維持率=(PrAs−N(N=0〜19)bの結合速度)/(PrAs−N(N=0〜19)aの結合速度)
実施例5で作製したイムノグロブリン結合タンパク質(PrAs−0及びPrAs−20〜22)について、0.5M水酸化ナトリウム水溶液中でインキュベートしたこと以外は試験例2と同様の手順で、アルカリ耐性を算出した。相対アルカリ耐性の測定結果を表11に示す。PrAs−20〜22は、相対アルカリ耐性がPrAs−0と比較して21〜31%向上していたことから、変異導入前と比べアルカリ耐性が高いことが示された。
Claims (18)
- 配列番号1〜6及び57〜62のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列であって、且つ以下の(a)〜(f)からなる群より選択される少なくとも1種の変異を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド鎖を含む、イムノグロブリン結合タンパク質:
(a)配列番号3のアミノ酸配列の3位、6位、11位に相当する位置からなる群より選択される少なくとも1つの位置におけるアミノ酸残基の、他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置への他のアミノ酸残基の挿入;
(b)配列番号3のアミノ酸配列の24位及び25位に相当する位置からなる群より選択される少なくとも1つの位置におけるアミノ酸残基の、他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置への他のアミノ酸残基の挿入;
(c)配列番号3のアミノ酸配列の39位に相当する位置におけるアミノ酸残基の、他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置への他のアミノ酸残基の挿入;
(d)配列番号3のアミノ酸配列の46位に相当する位置におけるアミノ酸残基の、他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置への他のアミノ酸残基の挿入;
(e)配列番号3のアミノ酸配列の4位、49位及び58位に相当する位置からなる群より選択される少なくとも1つの位置におけるアミノ酸残基の、他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置への他のアミノ酸残基の挿入;及び
(f)配列番号3のアミノ酸配列の23位に相当する位置におけるアミノ酸残基の、他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置への他のアミノ酸残基の挿入。 - 前記ポリペプチド鎖が、配列番号3のアミノ酸配列と少なくとも85%の同一性を有し且つ前記(a)〜(f)からなる群より選択される少なくとも1種の変異を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド鎖である、請求項1記載のイムノグロブリン結合タンパク質。
- 前記(a)〜(f)からなる群より選択される少なくとも1種の変異が、
(a1)配列番号3のアミノ酸配列の3位に相当する位置におけるAsnからGlnへの置換;
(a2)配列番号3のアミノ酸配列の3位に相当する位置におけるAsnからAlaへの置換;
(a3)配列番号3のアミノ酸配列の3位に相当する位置におけるAsnからAspへの置換;
(a4)配列番号3のアミノ酸配列の6位に相当する位置におけるAsnからGlnへの置換;
(a5)配列番号3のアミノ酸配列の6位に相当する位置におけるAsnからAlaへの置換;
(a6)配列番号3のアミノ酸配列の6位に相当する位置におけるAsnからAspへの置換;
(a7)配列番号3のアミノ酸配列の11位に相当する位置におけるAsnからGlnへの置換;
(a8)配列番号3のアミノ酸配列の11位に相当する位置におけるAsnからAlaへの置換;
(a9)配列番号3のアミノ酸配列の11位に相当する位置におけるAsnからArgへの置換;
(a10)配列番号3のアミノ酸配列の11位に相当する位置におけるAsnからAspへの置換;
(a11)配列番号3のアミノ酸配列の11位に相当する位置におけるAsnからCysへの置換;
(a12)配列番号3のアミノ酸配列の11位に相当する位置におけるAsnからGluへの置換;
(a13)配列番号3のアミノ酸配列の11位に相当する位置におけるAsnからHisへの置換;
(a14)配列番号3のアミノ酸配列の11位に相当する位置におけるAsnからIleへの置換;
(a15)配列番号3のアミノ酸配列の11位に相当する位置におけるAsnからLeuへの置換;
(a16)配列番号3のアミノ酸配列の11位に相当する位置におけるAsnからLysへの置換;
(a17)配列番号3のアミノ酸配列の11位に相当する位置におけるAsnからMetへの置換;
(a18)配列番号3のアミノ酸配列の11位に相当する位置におけるAsnからPheへの置換;
(a19)配列番号3のアミノ酸配列の11位に相当する位置におけるAsnからThrへの置換;
(a20)配列番号3のアミノ酸配列の11位に相当する位置におけるAsnからTrpへの置換;
(a21)配列番号3のアミノ酸配列の11位に相当する位置におけるAsnからTyrへの置換;
(a22)配列番号3のアミノ酸配列の11位に相当する位置におけるAsnからValへの置換;
(b1)配列番号3のアミノ酸配列の24位に相当する位置におけるGluからAspへの置換;
(b2)配列番号3のアミノ酸配列の25位に相当する位置におけるGluからAspへの置換;
(c1)配列番号3のアミノ酸配列の39位に相当する位置におけるSerからLysへの置換;
(c2)配列番号3のアミノ酸配列の39位に相当する位置におけるSerからArgへの置換;
(d1)配列番号3のアミノ酸配列の46位に相当する位置におけるAlaからAspへの置換;
(d2)配列番号3のアミノ酸配列の46位に相当する位置におけるAlaからGluへの置換;
(d3)配列番号3のアミノ酸配列の46位に相当する位置におけるAlaからLysへの置換;
(d4)配列番号3のアミノ酸配列の46位に相当する位置におけるAlaからArgへの置換;
(e1)配列番号3のアミノ酸配列の4位に相当する位置におけるLysの欠失;
(e2)配列番号3のアミノ酸配列の49位に相当する位置におけるLysからArgへの置換;
(e3)配列番号3のアミノ酸配列の58位に相当する位置におけるLysの欠失;
(e4)配列番号3のアミノ酸配列の58位に相当する位置におけるLysからArgへの置換、
(f1)配列番号3のアミノ酸配列の23位に相当する位置におけるThrからArgへの置換;
(f2)配列番号3のアミノ酸配列の23位に相当する位置におけるThrからLeuへの置換;及び
(f3)配列番号3のアミノ酸配列の23位に相当する位置におけThrからSerへの置換、
からなる群より選択される少なくとも1種の変異である、請求項1又は2記載のイムノグロブリン結合タンパク質。 - 前記(a)〜(f)からなる群より選択される少なくとも1種の変異が、
(a1)配列番号3のアミノ酸配列の3位に相当する位置におけるAsnからGlnへの置換;
(a2)配列番号3のアミノ酸配列の3位に相当する位置におけるAsnからAlaへの置換;
(a3)配列番号3のアミノ酸配列の3位に相当する位置におけるAsnからAspへの置換;
(a4)配列番号3のアミノ酸配列の6位に相当する位置におけるAsnからGlnへの置換;
(a5)配列番号3のアミノ酸配列の6位に相当する位置におけるAsnからAlaへの置換;
(a6)配列番号3のアミノ酸配列の6位に相当する位置におけるAsnからAspへの置換;
(a7)配列番号3のアミノ酸配列の11位に相当する位置におけるAsnからGlnへの置換;
(a8)配列番号3のアミノ酸配列の11位に相当する位置におけるAsnからAlaへの置換;
(a9)配列番号3のアミノ酸配列の11位に相当する位置におけるAsnからArgへの置換;
(a10)配列番号3のアミノ酸配列の11位に相当する位置におけるAsnからAspへの置換;
(a11)配列番号3のアミノ酸配列の11位に相当する位置におけるAsnからCysへの置換;
(a12)配列番号3のアミノ酸配列の11位に相当する位置におけるAsnからGluへの置換;
(a13)配列番号3のアミノ酸配列の11位に相当する位置におけるAsnからHisへの置換;
(a14)配列番号3のアミノ酸配列の11位に相当する位置におけるAsnからIleへの置換;
(a15)配列番号3のアミノ酸配列の11位に相当する位置におけるAsnからLeuへの置換;
(a16)配列番号3のアミノ酸配列の11位に相当する位置におけるAsnからLysへの置換;
(a17)配列番号3のアミノ酸配列の11位に相当する位置におけるAsnからMetへの置換;
(a18)配列番号3のアミノ酸配列の11位に相当する位置におけるAsnからPheへの置換;
(a19)配列番号3のアミノ酸配列の11位に相当する位置におけるAsnからThrへの置換;
(a20)配列番号3のアミノ酸配列の11位に相当する位置におけるAsnからTrpへの置換;
(a21)配列番号3のアミノ酸配列の11位に相当する位置におけるAsnからTyrへの置換;
(a22)配列番号3のアミノ酸配列の11位に相当する位置におけるAsnからValへの置換;
(a23)配列番号3のアミノ酸配列の3位、6位及び11位に相当する位置におけるAsnからGlnへの置換;
(a24)配列番号3のアミノ酸配列の3位に相当する位置におけるAsnからAlaへの置換、及び11位に相当する位置におけるAsnからGlnへの置換;
(a25)配列番号3のアミノ酸配列の3位に相当する位置におけるAsnからAspへの置換、及び11位に相当する位置におけるAsnからGlnへの置換;
(a26)配列番号3のアミノ酸配列の6位に相当する位置におけるAsnからAspへの置換、及び11位に相当する位置におけるAsnからGlnへの置換;
(a27)配列番号3のアミノ酸配列の3位に相当する位置におけるAsnからAspへの置換、6位に相当する位置におけるAsnからAspへの置換、及び11位に相当する位置におけるAsnからGlnへの置換;
(a28)配列番号3のアミノ酸配列の3位に相当する位置におけるAsnからAlaへの置換、6位に相当する位置におけるAsnからAspへの置換、及び11位に相当する位置におけるAsnからGlnへの置換;
(b1)配列番号3のアミノ酸配列の24位に相当する位置におけるGluからAspへの置換;
(b2)配列番号3のアミノ酸配列の25位に相当する位置におけるGluからAspへの置換;
(c1)配列番号3のアミノ酸配列の39位に相当する位置におけるSerからLysへの置換;
(c2)配列番号3のアミノ酸配列の39位に相当する位置におけるSerからArgへの置換;
(d1)配列番号3のアミノ酸配列の46位に相当する位置におけるAlaからAspへの置換;
(d2)配列番号3のアミノ酸配列の46位に相当する位置におけるAlaからGluへの置換;
(d3)配列番号3のアミノ酸配列の46位に相当する位置におけるAlaからLysへの置換;
(d4)配列番号3のアミノ酸配列の46位に相当する位置におけるAlaからArgへの置換;
(e1)配列番号3のアミノ酸配列の4位に相当する位置におけるLysの欠失;
(e2)配列番号3のアミノ酸配列の49位に相当する位置におけるLysからArgへの置換;
(e3)配列番号3のアミノ酸配列の58位に相当する位置におけるLysの欠失;
(e4)配列番号3のアミノ酸配列の58位に相当する位置におけるLysからArgへの置換;
(f1)配列番号3のアミノ酸配列の23位に相当する位置におけるThrからArgへの置換;
(f2)配列番号3のアミノ酸配列の23位に相当する位置におけるThrからLeuへの置換;
(f3)配列番号3のアミノ酸配列の23位に相当する位置におけThrからSerへの置換;
(g1) (a7)と(f1)の組み合わせ;
(g2) (a7)と(f2)の組み合わせ;
(g3) (a7)と(f3)の組み合わせ;
(g4) (a7)と(e2)の組み合わせ;
(g5) (a7)と(e4)の組み合わせ;
(g6) (a7)と(f1)と(e2)の組み合わせ;
(g7) (a7)と(f2)と(e2)の組み合わせ;及び
(g8) (a7)と(f3)と(e2)の組み合わせ、
のいずれか1種である、請求項3記載のイムノグロブリン結合タンパク質。 - 前記(a)〜(f)からなる群より選択される少なくとも1種の変異が、配列番号3のアミノ酸配列の3位、6位、11位、24位、25位、39位、46位、4位、49位、58位及び23位のうちの少なくとも2つの位置に相当する位置におけるアミノ酸残基の、他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置への他のアミノ酸残基の挿入を含む、請求項1〜4のいずれか1項記載のイムノグロブリン結合タンパク質。
- 前記少なくとも1種の変異が、前記(a23)〜(a28)のいずれかであるか、又は前記(a1)〜(a28)のいずれか1つと前記(b1)〜(f3)のいずれか1つ以上との組み合わせである、請求項5記載のイムノグロブリン結合タンパク質。
- 前記アミノ酸配列の同一性が少なくとも90%である、請求項1〜6のいずれか1項記載のイムノグロブリン結合タンパク質。
- 前記ポリペプチド鎖が、配列番号3のアミノ酸配列の1位に相当する位置におけるアミノ酸残基のValへの置換、及び/又は配列番号3のアミノ酸配列の29位に相当する位置におけるアミノ酸残基のAlaへの置換をさらに含む、請求項1〜7のいずれか1項記載のイムノグロブリン結合タンパク質。
- 前記ポリペプチド鎖を2個以上含む、請求項1〜8のいずれか1項記載のイムノグロブリン結合タンパク質。
- 請求項1〜9のいずれか1項記載のイムノグロブリン結合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
- 請求項10記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- 請求項11記載のベクターを含む形質転換体。
- 固相担体と、該固相担体に結合した請求項1〜9のいずれか1項記載のイムノグロブリン結合タンパク質とを含む、アフィニティー担体。
- 請求項13のアフィニティー担体を含む、クロマトグラフィーカラム。
- 請求項13記載のアフィニティー担体又は請求項14記載のクロマトグラフィーカラムを用いる、抗体又はその断片の単離方法。
- 請求項1〜9のいずれか1項記載のイムノグロブリン結合タンパク質を、請求項12記載の形質転換体、もしくは無細胞タンパク質合成系において発現させるか、又は化学合成することを含む、イムノグロブリン結合タンパク質の製造方法。
- 変異ポリペプチド鎖の製造方法であって、
配列番号1〜6及び57〜62のいずれかのアミノ酸配列又はこれらと少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つイムノグロブリン結合活性を有するポリペプチド鎖に対して、以下の(a)〜(f)からなる群より選択される少なくとも1種の変異を導入することを含む、方法:
(a)配列番号3のアミノ酸配列の3位、6位、11位に相当する位置からなる群より選択される少なくとも1つの位置におけるアミノ酸残基の、他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置への他のアミノ酸残基の挿入;
(b)配列番号3のアミノ酸配列の24位及び25位に相当する位置からなる群より選択される少なくとも1つの位置におけるアミノ酸残基の、他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置への他のアミノ酸残基の挿入;
(c)配列番号3のアミノ酸配列の39位に相当する位置におけるアミノ酸残基の、他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置への他のアミノ酸残基の挿入;
(d)配列番号3のアミノ酸配列の46位に相当する位置におけるアミノ酸残基の、他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置への他のアミノ酸残基の挿入;
(e)配列番号3のアミノ酸配列の4位、49位及び58位に相当する位置からなる群より選択される少なくとも1つの位置におけるアミノ酸残基の、他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置への他のアミノ酸残基の挿入;及び
(f)配列番号3のアミノ酸配列の23位に相当する位置におけるアミノ酸残基の、他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置への他のアミノ酸残基の挿入。 - 固相担体に、請求項1〜9のいずれか1項記載のイムノグロブリン結合タンパク質を固定化することを含む、アフィニティー担体の製造方法。
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