KR20210049802A - 이뮤노글로불린 결합 단백질 및 그것을 사용한 어피니티 담체 - Google Patents

이뮤노글로불린 결합 단백질 및 그것을 사용한 어피니티 담체 Download PDF

Info

Publication number
KR20210049802A
KR20210049802A KR1020217004997A KR20217004997A KR20210049802A KR 20210049802 A KR20210049802 A KR 20210049802A KR 1020217004997 A KR1020217004997 A KR 1020217004997A KR 20217004997 A KR20217004997 A KR 20217004997A KR 20210049802 A KR20210049802 A KR 20210049802A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
amino acid
acid sequence
seq
substitution
asn
Prior art date
Application number
KR1020217004997A
Other languages
English (en)
Inventor
도모아키 하가
다카시 이치이
슌스케 오노기
šœ스케 오노기
사토시 나카무라
도시나리 혼다
도모유키 가미데
Original Assignee
제이에스알 가부시끼가이샤
제이에스알 마이크로 엔.브이.
제이에스알 마이크로, 인크.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 제이에스알 가부시끼가이샤, 제이에스알 마이크로 엔.브이., 제이에스알 마이크로, 인크. filed Critical 제이에스알 가부시끼가이샤
Publication of KR20210049802A publication Critical patent/KR20210049802A/ko

Links

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/38—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving specific interaction not covered by one or more of groups B01D15/265 - B01D15/36
    • B01D15/3804—Affinity chromatography
    • B01D15/3809—Affinity chromatography of the antigen-antibody type, e.g. protein A, G, L chromatography
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/281—Sorbents specially adapted for preparative, analytical or investigative chromatography
    • B01J20/286—Phases chemically bonded to a substrate, e.g. to silica or to polymers
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3231—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the coating or impregnating layer
    • B01J20/3242—Layers with a functional group, e.g. an affinity material, a ligand, a reactant or a complexing group
    • B01J20/3268—Macromolecular compounds
    • B01J20/3272—Polymers obtained by reactions otherwise than involving only carbon to carbon unsaturated bonds
    • B01J20/3274—Proteins, nucleic acids, polysaccharides, antibodies or antigens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/305—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F)
    • C07K14/31—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F) from Staphylococcus (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K17/00—Carrier-bound or immobilised peptides; Preparation thereof

Abstract

알칼리 내성이 향상된 어피니티 담체의 제공. 변이 폴리펩티드쇄를 포함하는 이뮤노글로불린 결합 단백질 및 당해 이뮤노글로불린 결합 단백질을 결합한 고상 담체를 포함하는 어피니티 담체. 해당 변이 폴리펩티드쇄는, 서열 번호 1 내지 6 및 57 내지 62 중 어느 것으로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 85％의 동일성을 갖고 또한 소여의 변이를 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 이뮤노글로불린 결합 활성을 갖는다.

Description

이뮤노글로불린 결합 단백질 및 그것을 사용한 어피니티 담체
본 발명은 이뮤노글로불린 결합 단백질, 그것을 사용한 어피니티 담체, 그리고 해당 어피니티 담체를 사용한 항체의 단리 방법에 관한 것이다.
항체는 근년, 연구용 시약, 항체 의약 등에 널리 이용되고 있다. 이들 시약이나 의약용의 항체는 일반적으로 어피니티 크로마토그래피에 의한 정제를 거쳐서 제조된다. 항체의 어피니티 정제에는, 이뮤노글로불린과 특이적으로 결합하는 물질인 리간드를 고정화한 칼럼이 사용되고, 해당 리간드에는 일반적으로 단백질 A 등의 이뮤노글로불린 결합 단백질이 사용된다.
단백질 A는 그람 양성 세균 스타필로코커스·아우레우스(Staphylococcus aureus) 유래의 세포벽 단백질이다. 단백질 A는 E 도메인, D 도메인, A 도메인, B 도메인 및 C 도메인이라고 불리는 5개의 이뮤노글로불린 결합 도메인을 갖고, 각 도메인은 단독으로 이뮤노글로불린에 결합할 수 있다. 단백질 A의 천연형 이뮤노글로불린 결합 도메인과 함께, 이들에 단백질 공학적 개변을 가한 개변 이뮤노글로불린 결합 도메인도 또한 어피니티 정제용의 리간드로서 이용되고 있다.
항체의 어피니티 정제용 칼럼은 통상 알칼리 용액으로 세정되어서 반복 사용된다. 그러나, 단백질 A의 천연형 이뮤노글로불린 결합 도메인은 알칼리 내성이 낮기 때문에, 해당 천연형 도메인을 고정화한 어피니티 정제용 칼럼은 반복 사용 동안에 항체 결합성이 크게 저하된다. 그래서, 알칼리 내성을 향상시킨 개변 단백질 A 도메인이 개발되어 왔다. 예를 들어, 단백질 A의 이뮤노글로불린 결합 도메인이 그의 아미노산 서열의 29위치의 Gly를 Ala로 치환함으로써, 화학적인 안정성이 향상되는 것은 널리 알려져 있다(비특허문헌 1). 특허문헌 1에는, 이뮤노글로불린 결합 도메인의 아미노산 서열 중의 Asn을 Gln 및 Cys 이외의 아미노산으로 치환하거나, 또는 결실시킴으로써, 해당 도메인의 알칼리 내성을 향상시키는 방법이 개시되어 있다. 또한, 특허문헌 2에는 단백질 A의 C, B 또는 Z 도메인에 있어서, N 말단으로부터 위치 1 또는 2로 시작하는 3 이상의 연속된 아미노산을 결실시킴으로써, 해당 도메인의 알칼리 내성을 향상시키는 방법이 개시되어 있다.
국제 공개 공보 제2000/023580호 국제 공개 공보 제2013/109302호
Journal of Chromatography B, 2007, 848(1): 40-47
알칼리 내성이 보다 향상된 어피니티 담체가 요구되고 있다. 본 발명은 이뮤노글로불린 결합 도메인 유래의 알칼리 내성이 향상된 변이 폴리펩티드쇄를 함유하는 이뮤노글로불린 결합 단백질, 및 그것을 사용한 어피니티 담체를 제공한다. 또한 본 발명은, 해당 어피니티 담체를 사용한 항체의 단리 방법을 제공한다.
본 발명은, 이하를 제공한다.
〔1〕 서열 번호 1 내지 6 및 57 내지 62 중 어느 것의 아미노산 서열과 적어도 85％의 동일성을 갖는 아미노산 서열이며, 또한 이하의 (a) 내지 (f)로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 변이를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄를 포함하는, 이뮤노글로불린 결합 단백질:
(a) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 3위치, 6위치, 11위치에 상당하는 위치로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 위치에 있어서의 아미노산 잔기의, 다른 아미노산 잔기로의 치환 혹은 결실, 또는 당해 위치의 전 혹은 후의 위치로의 다른 아미노산 잔기의 삽입;
(b) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 24위치 및 25위치에 상당하는 위치로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 위치에 있어서의 아미노산 잔기의, 다른 아미노산 잔기로의 치환 혹은 결실, 또는 당해 위치의 전 혹은 후의 위치로의 다른 아미노산 잔기의 삽입;
(c) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 39위치에 상당하는 위치에 있어서의 아미노산 잔기의, 다른 아미노산 잔기로의 치환 혹은 결실, 또는 당해 위치의 전 혹은 후의 위치로의 다른 아미노산 잔기의 삽입;
(d) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 46위치에 상당하는 위치에 있어서의 아미노산 잔기의, 다른 아미노산 잔기로의 치환 혹은 결실, 또는 당해 위치의 전 혹은 후의 위치로의 다른 아미노산 잔기의 삽입;
(e) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 4위치, 49위치 및 58위치에 상당하는 위치로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 위치에 있어서의 아미노산 잔기의, 다른 아미노산 잔기로의 치환 혹은 결실, 또는 당해 위치의 전 혹은 후의 위치로의 다른 아미노산 잔기의 삽입; 및
(f) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 23위치에 상당하는 위치에 있어서의 아미노산 잔기의, 다른 아미노산 잔기로의 치환 혹은 결실, 또는 당해 위치의 전 혹은 후의 위치로의 다른 아미노산 잔기의 삽입.
〔2〕 상기 폴리펩티드쇄가, 서열 번호 3의 아미노산 서열과 적어도 85％의 동일성을 갖고 또한 상기 (a) 내지 (f)로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 변이를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄인, 〔1〕에 기재된 이뮤노글로불린 결합 단백질.
〔3〕 상기 (a) 내지 (f)로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 변이가,
(a1) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 3위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Gln으로의 치환;
(a2) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 3위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Ala로의 치환;
(a3) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 3위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Asp로의 치환;
(a4) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 6위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Gln으로의 치환;
(a5) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 6위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Ala로의 치환;
(a6) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 6위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Asp로의 치환;
(a7) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Gln으로의 치환;
(a8) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Ala로의 치환;
(a9) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Arg로의 치환;
(a10) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Asp로의 치환;
(a11) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Cys로의 치환;
(a12) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Glu로의 치환;
(a13) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 His로의 치환;
(a14) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Ile로의 치환;
(a15) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Leu로의 치환;
(a16) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Lys로의 치환;
(a17) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Met로의 치환;
(a18) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Phe로의 치환;
(a19) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Thr로의 치환;
(a20) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Trp로의 치환;
(a21) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Tyr로의 치환;
(a22) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Val로의 치환;
(b1) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 24위치에 상당하는 위치에 있어서의 Glu로부터 Asp로의 치환;
(b2) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 25위치에 상당하는 위치에 있어서의 Glu로부터 Asp로의 치환;
(c1) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 39위치에 상당하는 위치에 있어서의 Ser로부터 Lys로의 치환;
(c2) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 39위치에 상당하는 위치에 있어서의 Ser로부터 Arg로의 치환;
(d1) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 46위치에 상당하는 위치에 있어서의 Ala로부터 Asp로의 치환;
(d2) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 46위치에 상당하는 위치에 있어서의 Ala로부터 Glu로의 치환;
(d3) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 46위치에 상당하는 위치에 있어서의 Ala로부터 Lys로의 치환;
(d4) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 46위치에 상당하는 위치에 있어서의 Ala로부터 Arg로의 치환;
(e1) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 4위치에 상당하는 위치에 있어서의 Lys의 결실;
(e2) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 49위치에 상당하는 위치에 있어서의 Lys로부터 Arg로의 치환;
(e3) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 58위치에 상당하는 위치에 있어서의 Lys의 결실;
(e4) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 58위치에 상당하는 위치에 있어서의 Lys로부터 Arg로의 치환;
(f1) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 23위치에 상당하는 위치에 있어서의 Thr로부터 Arg로의 치환;
(f2) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 23위치에 상당하는 위치에 있어서의 Thr로부터 Leu로의 치환; 및
(f3) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 23위치에 상당하는 위치에 있어서의 Thr로부터 Ser로의 치환
으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 변이인, 〔1〕 또는 〔2〕에 기재된 이뮤노글로불린 결합 단백질.
〔4〕 상기 (a) 내지 (f)로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 변이가,
(a1) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 3위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Gln으로의 치환;
(a2) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 3위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Ala로의 치환;
(a3) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 3위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Asp로의 치환;
(a4) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 6위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Gln으로의 치환;
(a5) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 6위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Ala로의 치환;
(a6) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 6위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Asp로의 치환;
(a7) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Gln으로의 치환;
(a8) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Ala로의 치환;
(a9) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Arg로의 치환;
(a10) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Asp로의 치환;
(a11) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Cys로의 치환;
(a12) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Glu로의 치환;
(a13) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 His로의 치환;
(a14) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Ile로의 치환;
(a15) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Leu로의 치환;
(a16) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Lys로의 치환;
(a17) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Met로의 치환;
(a18) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Phe로의 치환;
(a19) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Thr로의 치환;
(a20) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Trp로의 치환;
(a21) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Tyr로의 치환;
(a22) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Val로의 치환;
(a23) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 3위치, 6위치 및 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Gln으로의 치환;
(a24) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 3위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Ala로의 치환, 및 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Gln으로의 치환;
(a25) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 3위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Asp로의 치환, 및 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Gln으로의 치환;
(a26) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 6위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Asp로의 치환, 및 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Gln으로의 치환;
(a27) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 3위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Asp로의 치환, 6위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Asp로의 치환, 및 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Gln으로의 치환;
(a28) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 3위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Ala로의 치환, 6위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Asp로의 치환, 및 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Gln으로의 치환;
(b1) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 24위치에 상당하는 위치에 있어서의 Glu로부터 Asp로의 치환;
(b2) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 25위치에 상당하는 위치에 있어서의 Glu로부터 Asp로의 치환;
(c1) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 39위치에 상당하는 위치에 있어서의 Ser로부터 Lys로의 치환;
(c2) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 39위치에 상당하는 위치에 있어서의 Ser로부터 Arg로의 치환;
(d1) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 46위치에 상당하는 위치에 있어서의 Ala로부터 Asp로의 치환;
(d2) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 46위치에 상당하는 위치에 있어서의 Ala로부터 Glu로의 치환;
(d3) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 46위치에 상당하는 위치에 있어서의 Ala로부터 Lys로의 치환;
(d4) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 46위치에 상당하는 위치에 있어서의 Ala로부터 Arg로의 치환;
(e1) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 4위치에 상당하는 위치에 있어서의 Lys의 결실;
(e2) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 49위치에 상당하는 위치에 있어서의 Lys로부터 Arg로의 치환;
(e3) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 58위치에 상당하는 위치에 있어서의 Lys의 결실;
(e4) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 58위치에 상당하는 위치에 있어서의 Lys로부터 Arg로의 치환,
(f1) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 23위치에 상당하는 위치에 있어서의 Thr로부터 Arg로의 치환;
(f2) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 23위치에 상당하는 위치에 있어서의 Thr로부터 Leu로의 치환; 및
(f3) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 23위치에 상당하는 위치에 있어서의 Thr로부터 Ser로의 치환;
(g1) (a7)과 (f1)의 조합;
(g2) (a7)과 (f2)의 조합;
(g3) (a7)과 (f3)의 조합;
(g4) (a7)과 (e2)의 조합;
(g5) (a7)과 (e4)의 조합;
(g6) (a7)과 (f1)과 (e2)의 조합;
(g7) (a7)과 (f2)와 (e2)의 조합; 및
(g8) (a7)과 (f3)과 (e2)의 조합
중 어느 1종인, 〔3〕에 기재된 이뮤노글로불린 결합 단백질.
〔5〕 상기 (a) 내지 (f)로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 변이가, 서열 번호 3의 아미노산 서열의 3위치, 6위치, 11위치, 24위치, 25위치, 39위치, 46위치, 4위치, 49위치, 58위치 및 23위치 중 적어도 2개의 위치에 상당하는 위치에 있어서의 아미노산 잔기의, 다른 아미노산 잔기로의 치환 혹은 결실, 또는 당해 위치의 전 혹은 후의 위치로의 다른 아미노산 잔기의 삽입을 포함하는, 〔1〕 내지 〔4〕 중 어느 한 항에 기재된 이뮤노글로불린 결합 단백질.
〔6〕 상기 적어도 1종의 변이가 상기 (a23) 내지 (a28) 중 어느 것이거나, 또는 상기 (a1) 내지 (a28) 중 어느 하나와 상기 (b1) 내지 (f3) 중 어느 하나 이상의 조합인, 〔5〕에 기재된 이뮤노글로불린 결합 단백질.
〔7〕 상기 아미노산 서열의 동일성이 적어도 90％인, 〔1〕 내지 〔6〕 중 어느 한 항에 기재된 이뮤노글로불린 결합 단백질.
〔8〕 상기 폴리펩티드쇄가, 서열 번호 3의 아미노산 서열의 1위치에 상당하는 위치에 있어서의 아미노산 잔기의 Val로의 치환, 및/또는 서열 번호 3의 아미노산 서열의 29위치에 상당하는 위치에 있어서의 아미노산 잔기의 Ala로의 치환을 더 포함하는, 〔1〕 내지 〔7〕 중 어느 한 항에 기재된 이뮤노글로불린 결합 단백질.
〔9〕 상기 폴리펩티드쇄를 2개 이상 포함하는, 〔1〕 내지 〔8〕 중 어느 한 항에 기재된 이뮤노글로불린 결합 단백질.
〔10〕 〔1〕 내지 〔9〕 중 어느 한 항에 기재된 이뮤노글로불린 결합 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드.
〔11〕 〔10〕에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
〔12〕 〔11〕에 기재된 벡터를 포함하는 형질 전환체.
〔13〕 고상 담체와, 해당 고상 담체에 결합한 〔1〕 내지 〔9〕 중 어느 한 항에 기재된 이뮤노글로불린 결합 단백질을 포함하는, 어피니티 담체.
〔14〕 〔13〕에 기재된 어피니티 담체를 포함하는, 크로마토그래피 칼럼.
〔15〕 〔13〕에 기재된 어피니티 담체 또는 〔14〕에 기재된 크로마토그래피 칼럼을 사용하는, 항체 또는 그의 단편의 단리 방법.
〔16〕 〔1〕 내지 〔9〕 중 어느 한 항에 기재된 이뮤노글로불린 결합 단백질을, 〔12〕에 기재된 형질 전환체 혹은 무세포 단백질 합성계에 있어서 발현시키거나, 또는 화학 합성하는 것을 포함하는, 이뮤노글로불린 결합 단백질의 제조 방법.
〔17〕 변이 폴리펩티드쇄의 제조 방법이며,
서열 번호 1 내지 6 및 57 내지 62 중 어느 것의 아미노산 서열 또는 이들과 적어도 85％의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 이뮤노글로불린 결합 활성을 갖는 폴리펩티드쇄에 대하여, 이하의 (a) 내지 (f)로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 변이를 도입하는 것을 포함하는, 방법:
(a) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 3위치, 6위치, 11위치에 상당하는 위치로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 위치에 있어서의 아미노산 잔기의, 다른 아미노산 잔기로의 치환 혹은 결실, 또는 당해 위치의 전 혹은 후의 위치로의 다른 아미노산 잔기의 삽입;
(b) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 24위치 및 25위치에 상당하는 위치로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 위치에 있어서의 아미노산 잔기의, 다른 아미노산 잔기로의 치환 혹은 결실, 또는 당해 위치의 전 혹은 후의 위치로의 다른 아미노산 잔기의 삽입;
(c) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 39위치에 상당하는 위치에 있어서의 아미노산 잔기의, 다른 아미노산 잔기로의 치환 혹은 결실, 또는 당해 위치의 전 혹은 후의 위치로의 다른 아미노산 잔기의 삽입;
(d) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 46위치에 상당하는 위치에 있어서의 아미노산 잔기의, 다른 아미노산 잔기로의 치환 혹은 결실, 또는 당해 위치의 전 혹은 후의 위치로의 다른 아미노산 잔기의 삽입;
(e) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 4위치, 49위치 및 58위치에 상당하는 위치로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 위치에 있어서의 아미노산 잔기의, 다른 아미노산 잔기로의 치환 혹은 결실, 또는 당해 위치의 전 혹은 후의 위치로의 다른 아미노산 잔기의 삽입; 및
(f) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 23위치에 상당하는 위치에 있어서의 아미노산 잔기의, 다른 아미노산 잔기로의 치환 혹은 결실, 또는 당해 위치의 전 혹은 후의 위치로의 다른 아미노산 잔기의 삽입.
〔18〕 고상 담체에, 〔1〕 내지 〔9〕 중 어느 한 항에 기재된 이뮤노글로불린 결합 단백질을 고정화하는 것을 포함하는, 어피니티 담체의 제조 방법.
본 발명의 변이 폴리펩티드쇄 및 그것을 함유하는 이뮤노글로불린 결합 단백질은 이뮤노글로불린 결합을 갖고, 또한 알칼리 내성이 향상되어 있다. 따라서 본 발명의 이뮤노글로불린 결합 단백질은 어피니티 리간드로서 유용하다. 해당 이뮤노글로불린 결합 단백질을 고정화한 본 발명의 어피니티 담체는, 알칼리성 용액을 사용한 반복의 세정(Cleaning-in-place, 이후 CIP라고도 칭한다)을 실시한 후에 있어서도 이뮤노글로불린 결합 활성을 유지할 수 있다.
본 명세서에 있어서, 아미노산 서열이나 뉴클레오티드 서열의 동일성은 칼린과 아르튀르에 의한 알고리즘 BLAST(Pro.Natl.Acad.Sci.USA, 1993, 90: 5873-5877)를 사용하여 결정할 수 있다. 이 BLAST 알고리즘에 기초하여, BLASTN, BLASTX, BLASTP, TBLASTN 및 TBLASTX라고 불리는 프로그램이 개발되어 있다(J.Mol.Biol., 1990, 215: 403-410). 이들 프로그램을 사용하는 경우에는, 각 프로그램의 디폴트 파라미터를 사용할 수 있다. 이들의 해석 방법의 구체적인 방법은 공지이다([www.ncbi.nlm.nih.gov] 참조).
본 명세서에 있어서, 아미노산 서열 및 뉴클레오티드 서열에 관한 「적어도 85％의 동일성」이란, 85％ 이상의 동일성, 바람직하게는 90％ 이상의 동일성, 보다 바람직하게는 95％ 이상의 동일성, 더욱 바람직하게는 97％ 이상의 동일성, 더욱 바람직하게는 98％ 이상의 동일성, 한층 바람직하게는 99％ 이상의 동일성을 말한다. 또한, 아미노산 서열 및 뉴클레오티드 서열에 관한 「적어도 90％의 동일성」이란, 90％ 이상의 동일성, 바람직하게는 95％ 이상의 동일성, 더욱 바람직하게는 97％ 이상의 동일성, 더욱 바람직하게는 98％ 이상의 동일성, 한층 바람직하게는 99％ 이상의 동일성을 말한다.
본 명세서에 있어서, 아미노산 서열 및 뉴클레오티드 서열 상의 「상당하는 위치」는 목적 서열과 참조 서열(예를 들어, 서열 번호 3의 아미노산 서열)을, 각 아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 서열 중에 존재하는 보존 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드에 최대의 상동성을 부여하도록 정렬(얼라인먼트)시킴으로써 결정할 수 있다. 얼라인먼트는 공지된 알고리즘을 사용하여 실행할 수 있고, 그 수순은 당업자에게 공지이다. 예를 들어, 얼라인먼트는 Clustal W 멀티플 얼라인먼트 프로그램(Thompson, J. D. et al, 1994, Nucleic Acids Res., 22: 4673-4680)을 디폴트 설정으로 사용함으로써 행할 수 있다. Clustal W는 예를 들어 유럽 바이오인포매틱스 연구소(European Bioinformatics Institute: EBI [www.ebi.ac.uk/index.html])나, 국립 유전학 연구소가 운영하는 일본 DNA 데이터 뱅크(DDBJ [www.ddbj.nig.ac.jp/index.html])의 웹 사이트 상에서 이용할 수 있다.
본 명세서에 있어서, 아미노산 잔기는 다음 약호로도 기재된다: 알라닌(Ala 또는 A), 아르기닌(Arg 또는 R), 아스파라긴(Asn 또는 N), 아스파르트산(Asp 또는 D), 시스테인(Cys 또는 C), 글루타민(Gln 또는 Q), 글루탐산(Glu 또는 E), 글리신(Gly 또는 G), 히스티딘(His 또는 H), 이소류신(Ile 또는 I), 류신(Leu 또는 L), 리신(Lys 또는 K), 메티오닌(Met 또는 M), 페닐알라닌(Phe 또는 F), 프롤린(Pro 또는 P), 세린(Ser 또는 S), 트레오닌(Thr 또는 T), 트립토판(Trp 또는 W), 티로신(Tyr 또는 Y), 발린(Val 또는 V) 및 임의의 아미노산 잔기(Xaa 또는 X). 또한 본 명세서에 있어서 펩티드의 아미노산 서열은 통상법에 따라, 아미노 말단(이하 N 말단이라고 한다)이 좌측, 카르복실 말단(이하 C 말단이라고 한다)이 우측에 위치하도록 기재된다.
본 명세서에 있어서, 아미노산 서열의 특정한 위치에 대한 「전」 및 「후」의 위치란, 각각, 해당 특정 위치의 N 말단측 및 C 말단측에 인접하는 위치를 말한다. 예를 들어, 특정 위치의 「전」 및 「후」의 위치에 아미노산 잔기를 삽입하는 경우, 해당 특정 위치의 N 말단측 및 C 말단측에 인접하는 위치에, 삽입 후의 아미노산 잔기가 배치된다.
본 명세서에 있어서 「이뮤노글로불린 결합 단백질」이란, 항체 혹은 그의 단편에 대한 결합 활성을 갖는 단백질을 말한다. 본 명세서에 있어서의 「항체」는, 예를 들어 IgG, IgA, IgD, IgE, IgM, 및 이들의 서브클래스 등의 임의의 클래스의 이뮤노글로불린, 그의 단편, 그것들의 변이체를 포함할 수 있다. 또한 본 명세서에 있어서의 「항체」는 인간화 항체 등의 키메라 항체, 항체 복합체 및 항원 인식 부위를 포함하는 다른 이뮤노글로불린 수식체 등이어도 된다. 또한 본 명세서에 있어서의 「항체의 단편」은 항원 인식 부위를 포함하는 항체의 단편이어도 되고, 항원 인식 부위를 포함하지 않는 항체의 단편이어도 된다. 항원 인식 부위를 포함하지 않는 항체의 단편으로서는, 예를 들어 이뮤노글로불린의 Fc 영역만을 포함하는 단백질, Fc 융합 단백질, 및 그것들의 변이체나 수식체 등을 들 수 있다.
본 명세서에 있어서 「이뮤노글로불린 결합 도메인」이란, 이뮤노글로불린 결합 단백질에 포함되는, 단독으로 이뮤노글로불린(또는 항체 혹은 항체의 단편) 결합 활성을 갖는 폴리펩티드의 기능 단위를 말한다. 해당 「이뮤노글로불린 결합 도메인」의 바람직한 예로서는, 단백질 A의 이뮤노글로불린 결합 도메인, 그리고 이뮤노글로불린 결합 활성을 갖는 그의 변이체를 들 수 있다.
1. 이뮤노글로불린 결합 단백질
본 발명의 이뮤노글로불린 결합 단백질은 스타필로코커스·아우레우스(Staphylococcus aureus)의 단백질 A(이하, SpA라고도 한다)의 이뮤노글로불린 결합 도메인에서 유래되는 변이 폴리펩티드쇄를 적어도 하나 포함한다. 본 발명의 이뮤노글로불린 결합 단백질에 포함되는 해당 변이 폴리펩티드쇄는 이뮤노글로불린 결합 활성을 갖는 폴리펩티드쇄이고, 이하의 본 명세서에 있어서 「본 발명의 변이 이뮤노글로불린 결합 도메인」이라고도 칭해진다. 당해 본 발명의 변이 이뮤노글로불린 결합 도메인은, 부모 도메인인 SpA 유래의 이뮤노글로불린 결합 도메인 또는 그의 변이체에 소정의 변이를 가함으로써 얻을 수 있다. 당해 본 발명의 변이 이뮤노글로불린 결합 도메인은 이뮤노글로불린 결합 활성을 갖고, 또한 부모 도메인과 비교하여 알칼리 내성이 향상되어 있다. 당해 본 발명의 변이 이뮤노글로불린 결합 도메인을 함유하는 본 발명의 이뮤노글로불린 결합 단백질은, 어피니티 담체의 리간드로서 사용할 수 있다.
본 발명의 변이 이뮤노글로불린 결합 도메인의 부모 도메인으로서는, SpA의 이뮤노글로불린 결합 도메인, 예를 들어 A 도메인, B 도메인, C 도메인, D 도메인, E 도메인 또는 B 도메인의 개변형 도메인인 Z 도메인, 및 그것들의 변이체를 들 수 있다. 이 중, B 도메인, Z 도메인, C 도메인 및 그의 변이체가 바람직하고, C 도메인 및 그의 변이체가 보다 바람직하다.
SpA의 B 도메인, Z 도메인, C 도메인, D 도메인, A 도메인 및 E 도메인, 그리고 그것들의 변이체는 본 발명의 변이 이뮤노글로불린 결합 도메인의 부모 도메인으로서 사용될 수 있다. SpA의 B 도메인은 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄이다. 해당 B 도메인의 변이체로서는, 서열 번호 1의 아미노산 서열과 적어도 85％의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 이뮤노글로불린 결합 활성을 갖는 폴리펩티드쇄를 들 수 있다. SpA의 Z 도메인은 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄이다. 해당 Z 도메인의 변이체로서는, 서열 번호 2의 아미노산 서열과 적어도 85％의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 이뮤노글로불린 결합 활성을 갖는 폴리펩티드쇄를 들 수 있다. SpA의 C 도메인은 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄이다. 해당 C 도메인의 변이체로서는, 서열 번호 3의 아미노산 서열과 적어도 85％의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 이뮤노글로불린 결합 활성을 갖는 폴리펩티드쇄를 들 수 있다. SpA의 D 도메인은 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄이다. 해당 D 도메인의 변이체로서는, 서열 번호 4의 아미노산 서열과 적어도 85％의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 이뮤노글로불린 결합 활성을 갖는 폴리펩티드쇄를 들 수 있다. SpA의 A 도메인은 서열 번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄이다. 해당 A 도메인의 변이체로서는, 서열 번호 5의 아미노산 서열과 적어도 85％의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 이뮤노글로불린 결합 활성을 갖는 폴리펩티드쇄를 들 수 있다. SpA의 E 도메인은 서열 번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄이다. 해당 E 도메인의 변이체로서는, 서열 번호 6의 아미노산 서열과 적어도 85％의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 이뮤노글로불린 결합 활성을 갖는 폴리펩티드쇄를 들 수 있다.
따라서, 본 발명에 있어서의 바람직한 부모 도메인의 예로서는, 서열 번호 1 내지 6 중 어느 것의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄, 및 서열 번호 1 내지 6 중 어느 것의 아미노산 서열과 적어도 85％의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 이뮤노글로불린 결합 활성을 갖는 폴리펩티드쇄를 들 수 있다. 보다 바람직한 부모 도메인의 예로서는, 서열 번호 1 내지 3 중 어느 것의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄, 및 서열 번호 1 내지 3 중 어느 것의 아미노산 서열과 적어도 85％의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 이뮤노글로불린 결합 활성을 갖는 폴리펩티드쇄를 들 수 있다. 더욱 바람직한 부모 도메인의 예로서는, 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄, 및 서열 번호 3의 아미노산 서열과 적어도 85％의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 이뮤노글로불린 결합 활성을 갖는 폴리펩티드쇄를 들 수 있다.
형질 전환체에 있어서의 단백질의 발현량의 증가의 관점(PNAS, 1989, 86: 8247-8251, Fig. 2)이나, 복수의 도메인을 연결한 이뮤노글로불린 결합 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드의 제작이 용이하게 되는 관점(WO2010/110288)으로부터, 당해 부모 도메인은, 서열 번호 3의 아미노산 서열의 1위치에 상당하는 위치에 있어서의 Ala로부터 Val로의 치환을 포함하고 있어도 된다. 또한, 이뮤노글로불린 결합 단백질의 화학적인 안정성이 향상되고 알칼리 내성이 증대하는 관점에서, 당해 부모 도메인은, 서열 번호 3의 아미노산 서열의 29위치에 상당하는 위치에 있어서의 Gly로부터 Ala로의 치환을 더 포함하고 있어도 된다(비특허문헌 1).
천연 이뮤노글로불린 결합 도메인의 N 말단 영역이 결실된, 당해 천연 이뮤노글로불린 결합 도메인보다 안정성이 높은 단백질 구조를 갖는 이뮤노글로불린 결합 도메인 변이체가 보고되어 있다(WO2013/109302, WO2017/194596 등). 따라서, 당해 부모 도메인은 이뮤노글로불린 결합 활성을 갖는 한에 있어서, 서열 번호 1 내지 6 중 어느 것의 아미노산 서열의 N 말단으로부터 적어도 2잔기(예를 들어, 2 잔기, 4잔기, 6잔기 또는 7잔기)에 상당하는 아미노산 잔기를 결실한 이뮤노글로불린 결합 도메인 변이체여도 된다. 그러한 부모 도메인의 예로서는, 서열 번호 57 내지 62의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄를 들 수 있고, 이들은 각각 서열 번호 1 내지 6의 아미노산 서열의 N 말단 2 내지 7잔기를 결실한 변이 이뮤노글로불린 결합 도메인이다.
따라서, 상술한 부모 도메인에 관한 서열 번호 1 내지 6 중 어느 것의 아미노산 서열과 적어도 85％의 동일성을 갖는 아미노산 서열은, 서열 번호 57 내지 62 중 어느 것의 아미노산 서열, 또는 이것과 적어도 85％의 동일성을 갖는 아미노산 서열이어도 된다. 또한, 해당 서열 번호 1 내지 6 중 어느 것의 아미노산 서열과 적어도 85％의 동일성을 갖는 아미노산 서열은, 서열 번호 3의 아미노산 서열의 1위치에 상당하는 위치에 Val을 포함하거나, 및/또는 서열 번호 3의 아미노산 서열의 29위치에 상당하는 위치에 Ala를 포함하고 있어도 된다.
당해 SpA의 이뮤노글로불린 결합 도메인의 변이체는 SpA의 이뮤노글로불린 결합 도메인의 아미노산 서열에 대하여, 아미노산 잔기의 삽입, 삭제, 치환 또는 결실이나, 아미노산 잔기의 화학적 수식 등의 개변을 실시함으로써 제작할 수 있다. 아미노산 잔기의 삽입, 삭제, 치환 또는 결실의 수단으로서는, 해당 도메인을 코드하는 폴리뉴클레오티드에 대한 부위 특이적 돌연변이(Site-specific mutation) 등의 공지된 수단을 들 수 있다.
본 발명의 변이 이뮤노글로불린 결합 도메인은 상술한 부모 도메인에 대하여, 이하의 (a) 내지 (f):
(a) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 3위치, 6위치 및 11위치에 상당하는 위치로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 위치에 있어서의 아미노산 잔기의, 다른 아미노산 잔기로의 치환 혹은 결실, 또는 당해 위치의 전 혹은 후의 위치로의 다른 아미노산 잔기의 삽입;
(b) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 24위치 및 25위치에 상당하는 위치로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 위치에 있어서의 아미노산 잔기의, 다른 아미노산 잔기로의 치환 혹은 결실, 또는 당해 위치의 전 혹은 후의 위치로의 다른 아미노산 잔기의 삽입;
(c) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 39위치에 상당하는 위치에 있어서의 아미노산 잔기의, 다른 아미노산 잔기로의 치환 혹은 결실, 또는 당해 위치의 전 혹은 후의 위치로의 다른 아미노산 잔기의 삽입;
(d) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 46위치에 상당하는 위치에 있어서의 아미노산 잔기의, 다른 아미노산 잔기로의 치환 혹은 결실, 또는 당해 위치의 전 혹은 후의 위치로의 다른 아미노산 잔기의 삽입;
(e) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 4위치, 49위치 및 58위치에 상당하는 위치로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 위치에 있어서의 아미노산 잔기의 다른 아미노산 잔기로의 치환 혹은 결실, 또는 당해 위치의 전 혹은 후의 위치로의 다른 아미노산 잔기의 삽입; 및
(f) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 23위치에 상당하는 위치에 있어서의 아미노산 잔기의, 다른 아미노산 잔기로의 치환 혹은 결실, 또는 당해 위치의 전 혹은 후의 위치로의 다른 아미노산 잔기의 삽입
으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 변이를 도입하여 얻어진 폴리펩티드쇄이다.
당해 (a)의 변이는, 서열 번호 3의 아미노산 서열의 3위치, 6위치 및 11위치에 상당하는 위치로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 위치에 있어서의 아미노산 잔기의, 다른 아미노산 잔기로의 치환 혹은 결실, 또는 당해 위치의 전 혹은 후의 위치로의 다른 아미노산 잔기의 삽입이다. 해당 3위치, 6위치 및 11위치에 상당하는 위치에 있어서, 해당 치환 전의 아미노산 잔기는 바람직하게는 Asn이고, 이것들과 치환되는 해당 다른 아미노산 잔기는 바람직하게는 Ser 이외의 아미노산 잔기이고, 보다 바람직하게는 Ala, Arg, Asp, Cys, Gln, Glu, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Thr, Trp, Tyr 또는 Val이고, 더욱 바람직하게는 Gln이다. 당해 (a)의 변이는, 서열 번호 3의 아미노산 서열의 3위치, 6위치 또는 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 아미노산 잔기의 단독 변이여도 되지만, 해당 3위치, 6위치 및 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 아미노산 잔기 중 2개 또는 3개가 변이된 다중 변이여도 된다. 예를 들어, 당해 (a)의 변이는 서열 번호 3의 아미노산 서열의 3위치, 6위치 또는 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 아미노산 잔기의 단독 치환이어도 되지만, 해당 3위치, 6위치 및 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 아미노산 잔기 중 2개 또는 3개를 치환한 다중 치환이어도 된다. 바람직하게는, 당해 (a)의 변이는 (a1) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 3위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Gln으로의 치환, (a2) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 3위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Ala로의 치환, (a3) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 3위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Asp로의 치환, (a4) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 6위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Gln으로의 치환, (a5) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 6위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Ala로의 치환, (a6) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 6위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Asp로의 치환, (a7) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Gln으로의 치환, (a8) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Ala로의 치환, (a9) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Arg로의 치환, (a10) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Asp로의 치환, (a11) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Cys로의 치환, (a12) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Glu로의 치환, (a13) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 His로의 치환, (a14) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Ile로의 치환, (a15) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Leu로의 치환, (a16) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Lys로의 치환, (a17) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Met로의 치환, (a18) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Phe로의 치환, (a19) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Thr로의 치환, (a20) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Trp로의 치환, (a21) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Tyr로의 치환, (a22) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Val로의 치환, (a23) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 3위치, 6위치 및 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Gln으로의 치환, (a24) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 3위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Ala로의 치환, 및 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Gln으로의 치환, (a25) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 3위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Asp로의 치환, 및 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Gln으로의 치환, (a26) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 6위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Asp로의 치환, 및 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Gln으로의 치환, (a27) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 3위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Asp로의 치환, 6위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Asp로의 치환, 및 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Gln으로의 치환, 또는 (a28) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 3위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Ala로의 치환, 6위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Asp로의 치환, 및 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Gln으로의 치환이다.
당해 (b)의 변이는, 서열 번호 3의 아미노산 서열의 24위치 및 25위치에 상당하는 위치로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 위치에 있어서의 아미노산 잔기의, 다른 아미노산 잔기로의 치환 혹은 결실, 또는 당해 위치의 전 혹은 후의 위치로의 다른 아미노산 잔기의 삽입이다. 해당 24위치 및 25위치에 상당하는 위치에 있어서, 해당 치환 전의 아미노산 잔기는 바람직하게는 Glu이고, 이것들과 치환되는 해당 다른 아미노산 잔기는 바람직하게는 Asp이다. 당해 (b)의 변이는, 서열 번호 3의 아미노산 서열의 24위치 또는 25위치에 상당하는 위치에 있어서의 아미노산 잔기의 단독 변이여도 되지만, 해당 24위치 및 25위치에 상당하는 위치에 있어서의 아미노산 잔기의 양쪽이 변이된 이중 변이여도 된다. 예를 들어 당해 (b)의 변이는, 서열 번호 3의 아미노산 서열의 24위치 또는 25위치에 상당하는 위치에 있어서의 아미노산 잔기의 단독 치환이어도 되지만, 해당 24위치 및 25위치에 상당하는 위치에 있어서의 아미노산 잔기의 양쪽을 치환한 이중 치환이어도 된다. 바람직하게는, 당해 (b)의 변이는 (b1) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 24위치에 상당하는 위치에 있어서의 Glu로부터 Asp로의 치환, 또는 (b2) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 25위치에 상당하는 위치에 있어서의 Glu로부터 Asp로의 치환이다.
당해 (c)의 변이는, 서열 번호 3의 아미노산 서열의 39위치에 상당하는 위치에 있어서의 아미노산 잔기의, 다른 아미노산 잔기로의 치환 혹은 결실, 또는 당해 위치의 전 혹은 후의 위치로의 다른 아미노산 잔기의 삽입이다. 해당 39위치에 상당하는 위치에 있어서, 해당 치환 전의 아미노산 잔기는 바람직하게는 Ser이고, 이것과 치환되는 당해 다른 아미노산 잔기는 바람직하게는 Lys 또는 Arg이다. 바람직하게는, 당해 (c)의 변이는 (c1) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 39위치에 상당하는 위치에 있어서의 Ser로부터 Lys로의 치환, 또는 (c2) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 39위치에 상당하는 위치에 있어서의 Ser으로부터 Arg로의 치환이다.
당해 (d)의 변이는, 서열 번호 3의 아미노산 서열의 46위치에 상당하는 위치에 있어서의 아미노산 잔기의, 다른 아미노산 잔기로의 치환 혹은 결실, 또는 당해 위치의 전 혹은 후의 위치로의 다른 아미노산 잔기의 삽입이다. 해당 46위치에 상당하는 위치에 있어서, 해당 치환 전의 아미노산 잔기는 바람직하게는 Ala이고, 이것과 치환되는 당해 다른 아미노산 잔기는 바람직하게는 Asp, Glu, Lys 또는 Arg이고, 보다 바람직하게는 Asp, Glu 또는 Arg이다. 바람직하게는, 당해 (d)의 변이는 (d1) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 46위치에 상당하는 위치에 있어서의 Ala로부터 Asp로의 치환, (d2) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 46위치에 상당하는 위치에 있어서의 Ala로부터 Glu로의 치환, (d3) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 46위치에 상당하는 위치에 있어서의 Ala로부터 Lys로의 치환, 또는 (d4) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 46위치에 상당하는 위치에 있어서의 Ala로부터 Arg로의 치환이다.
당해 (e)의 변이는, 서열 번호 3의 아미노산 서열의 4위치, 49위치 및 58위치에 상당하는 위치로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 위치에 있어서의 아미노산 잔기의 다른 아미노산 잔기로의 치환 혹은 결실, 또는 당해 위치의 전 혹은 후의 위치로의 다른 아미노산 잔기의 삽입이다. 해당 4위치, 49위치 및 58위치에 상당하는 위치에 있어서의 결실 아미노산 잔기는 바람직하게는 Lys이다. 해당 4위치, 49위치 및 58위치에 상당하는 위치에 있어서, 해당 치환 전의 아미노산 잔기는 바람직하게는 Lys이고, 이것들과 치환되는 당해 다른 아미노산 잔기는 바람직하게는 Arg이다. 당해 (e)의 변이는, 서열 번호 3의 아미노산 서열의 4위치, 49위치 또는 58위치에 상당하는 위치에 있어서의 아미노산 잔기의 단독 변이여도 되지만, 해당 4위치, 49위치 및 58위치에 상당하는 위치에 있어서의 아미노산 잔기 중 2개 또는 3개가 변이된 다중 변이여도 된다. 예를 들어 당해 (e)의 변이는, 서열 번호 3의 아미노산 서열의 4위치, 49위치 또는 58위치에 상당하는 위치에 있어서의 아미노산 잔기 단독에서의 결실 또는 치환이어도 되지만, 해당 4위치, 49위치 또는 58위치에 상당하는 위치에 있어서의 아미노산 잔기 중 2개 또는 3개를 결실 또는 치환한 다중 변이여도 된다. 바람직하게는, 당해 (e)의 변이는 (e1) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 4위치에 상당하는 위치에 있어서의 Lys의 결실, (e2) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 49위치에 상당하는 위치에 있어서의 Lys로부터 Arg로의 치환, (e3) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 58위치에 상당하는 위치에 있어서의 Lys의 결실, 또는 (e4) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 58위치에 상당하는 위치에 있어서의 Lys로부터 Arg로의 치환이다.
당해 (f)의 변이는, 서열 번호 3의 아미노산 서열의 23위치에 상당하는 위치에 있어서의 아미노산 잔기의, 다른 아미노산 잔기로의 치환 혹은 결실, 또는 당해 위치의 전 혹은 후의 위치로의 다른 아미노산 잔기의 삽입이다. 해당 23위치에 상당하는 위치에 있어서, 해당 치환 전의 아미노산 잔기는 바람직하게는 Thr이고, 이것과 치환되는 당해 다른 아미노산 잔기는 바람직하게는 Arg, Leu 또는 Ser이다. 바람직하게는, 당해 (f)의 변이는 (f1) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 23위치에 상당하는 위치에 있어서의 Thr로부터 Arg로의 치환, (f2) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 23위치에 상당하는 위치에 있어서의 Thr로부터 Leu로의 치환, 또는 (f3) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 23위치에 상당하는 위치에 있어서의 Thr로부터 Ser로의 치환이다.
바람직한 실시 형태에 있어서, 본 발명의 변이 이뮤노글로불린 결합 도메인은 서열 번호 1 내지 6 중 어느 것의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄에 대하여, 당해 (a) 내지 (f)로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 변이를 도입함으로써 제조된다. 다른 바람직한 실시 형태에 있어서, 본 발명의 변이 이뮤노글로불린 결합 도메인은 서열 번호 1 내지 6 중 어느 것의 아미노산 서열과 적어도 85％의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 이뮤노글로불린 결합 활성을 갖는 폴리펩티드쇄에 대하여, 당해 (a) 내지 (f)로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 변이를 도입함으로써 제조된다.
보다 바람직한 실시 형태에 있어서, 본 발명의 변이 이뮤노글로불린 결합 도메인은 서열 번호 1 내지 3 중 어느 것의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄에 대하여, 당해 (a) 내지 (f)로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 변이를 도입함으로써 제조된다.
다른 보다 바람직한 실시 형태에 있어서, 본 발명의 변이 이뮤노글로불린 결합 도메인은 서열 번호 1 내지 3 중 어느 것의 아미노산 서열과 적어도 85％의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 이뮤노글로불린 결합 활성을 갖는 폴리펩티드쇄에 대하여, 당해 (a) 내지 (f)로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 변이를 도입함으로써 제조된다.
더욱 바람직한 실시 형태에 있어서, 본 발명의 변이 이뮤노글로불린 결합 도메인은 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄, 또는 이것과 적어도 85％의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고 또한 이뮤노글로불린 결합 활성을 갖는 폴리펩티드쇄에 대하여, 당해 (a) 내지 (f)로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 변이를 도입함으로써 제조된다.
해당 도입되는 변이는 해당 (a) 내지 (f) 중 어느 1종이어도 되고, 2종 이상의 조합(즉, 서열 번호 3의 아미노산 서열의 3위치, 6위치, 11위치, 24위치, 25위치, 39위치, 46위치, 4위치, 49위치, 58위치 및 23위치 중 적어도 2개의 위치에 상당하는 위치에 있어서의 아미노산 잔기의 변이)이어도 되고, 바람직하게는 상기 (a1), (a2), (a3), (a4), (a5), (a6), (a7), (a8), (a9), (a10), (a11), (a12), (a13), (a14), (a15), (a16), (a17), (a18), (a19), (a20), (a21), (a22), (b1), (b2), (c1), (c2), (d1), (d2), (d3), (d4), (e1), (e2), (e3), (e4), (f1), (f2) 및 (f3)으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종, 또는 2종 이상의 변이의 조합이다. 해당 2종 이상의 변이의 조합의 예로서는, 상기 (a23) 내지 (a28)을 들 수 있다. 해당 2종 이상의 변이의 조합의 다른 예로서는, 상기 (a1) 내지 (a28) 중 어느 하나와 상기 (b1) 내지 (f3) 중 어느 하나 이상의 조합을 들 수 있고, 바람직하게는 상기 (a1) 내지 (a22) 중 어느 하나와 상기 (e1) 내지 (f3) 중 어느 하나 이상의 조합을 들 수 있고, 보다 바람직하게는 상기 (a7) 내지 (a22) 중 어느 하나와 상기 (e2), (e4), (f1), (f2) 및 (f3) 중 어느 하나 이상의 조합을 들 수 있고, 더욱 바람직하게는 상기 (a7)과 상기 (e2), (e4), (f1), (f2) 및 (f3) 중 어느 하나 이상의 조합을 들 수 있고, 더욱 바람직하게는 이하를 들 수 있다:
(g1) 상기 (a7)과 (f1)의 조합;
(g2) 상기 (a7)과 (f2)의 조합;
(g3) 상기 (a7)과 (f3)의 조합;
(g4) 상기 (a7)과 (e2)의 조합;
(g5) 상기 (a7)과 (e4)의 조합;
(g6) 상기 (a7)과 (f1)과 (e2)의 조합;
(g7) 상기 (a7)과 (f2)와 (e2)의 조합; 및
(g8) 상기 (a7)과 (f3)과 (e2)의 조합.
바람직한 실시 형태에 있어서, 해당 (a) 내지 (f)로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 변이는, 상기 (a1), (a2), (a3), (a4), (a5), (a6), (a7), (a8), (a9), (a10), (a11), (a12), (a13), (a14), (a15), (a16), (a17), (a18), (a19), (a20), (a21), (a22), (a23), (a24), (a25), (a26), (a27), (a28), (b1), (b2), (c1), (c2), (d1), (d2), (d3), (d4), (e1), (e2), (e3), (e4), (f1), (f2), (f3), (g1), (g2), (g3), (g4), (g5), (g6), (g7) 또는 (g8)이다. 다른 일례에 있어서, 해당 (a) 내지 (f)로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 변이는 해당 (a1) 내지 (g8)의 변이 중 어느 1종을 포함하지만, 해당 (a1) 내지 (g8)의 변이 중 다른 변이를 포함하지 않는다. 또한 다른 일례에 있어서, 해당 (a) 내지 (f)로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 변이는 해당 (e2), (e3) 혹은 (e4)의 단독 변이만인 경우, 또는 (e2)와 (e3) 혹은 (e2)와 (e4)의 이중 변이만인 경우를 포함하지 않는 경우가 있다.
부모 도메인을 변이시키는 수단으로서는, 해당 부모 도메인을 코드하는 폴리뉴클레오티드에 대하여 원하는 아미노산 잔기의 치환, 결실, 삽입 등이 발생하도록 변이 도입하는 방법을 들 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 변이 도입을 위한 구체적인 방법으로서는, 부위 특이적 돌연변이, 상동 재조합법, SOE(splicing by overlap extension)-PCR법(Gene, 1989, 77: 61-68) 등을 들 수 있고, 이들의 상세한 수순은 당업자에게 주지이다.
제조된 본 발명의 변이 이뮤노글로불린 결합 도메인은 이뮤노글로불린 결합 활성을 갖고, 이뮤노글로불린 결합 도메인으로서 기능한다. 또한 본 발명의 변이 이뮤노글로불린 결합 도메인은 변이 전의 도메인(부모 도메인)과 비교하여 알칼리 내성이 향상되어 있다. 따라서, 이들 본 발명의 변이 이뮤노글로불린 결합 도메인은 어피니티 리간드로서 적합하게 사용할 수 있다.
상기 수순에서 얻어지는 본 발명의 변이 이뮤노글로불린 결합 도메인의 바람직한 예로서는, 서열 번호 1 내지 6 중 어느 것의 아미노산 서열과 적어도 85％의 동일성을 갖고 또한 상기 (a) 내지 (f)로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 변이를 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 이뮤노글로불린 결합 활성을 갖는 폴리펩티드쇄를 들 수 있다.
본 발명의 변이 이뮤노글로불린 결합 도메인의 보다 바람직한 예로서는, 서열 번호 1 내지 3 중 어느 것의 아미노산 서열과 적어도 85％의 동일성을 갖고 또한 상기 (a) 내지 (f)로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 변이를 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 이뮤노글로불린 결합 활성을 갖는 폴리펩티드쇄를 들 수 있다.
본 발명의 변이 이뮤노글로불린 결합 도메인의 더욱 바람직한 예로서는, 서열 번호 3의 아미노산 서열과 적어도 85％의 동일성을 갖고 또한 상기 (a) 내지 (f)로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 변이를 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 이뮤노글로불린 결합 활성을 갖는 폴리펩티드쇄를 들 수 있다.
해당 (a) 내지 (f)로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 변이는 바람직하게는 상기 (a1), (a2), (a3), (a4), (a5), (a6), (a7), (a8), (a9), (a10), (a11), (a12), (a13), (a14), (a15), (a16), (a17), (a18), (a19), (a20), (a21), (a22), (b1), (b2), (c1), (c2), (d1), (d2), (d3), (d4), (e1), (e2), (e3), (e4), (f1), (f2) 및 (f3)으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종이고, 보다 바람직하게는 상기 (a1), (a2), (a3), (a4), (a5), (a6), (a7), (a8), (a9), (a10), (a11), (a12), (a13), (a14), (a15), (a16), (a17), (a18), (a19), (a20), (a21), (a22), (a23), (a24), (a25), (a26), (a27), (a28), (b1), (b2), (c1), (c2), (d1), (d2), (d3), (d4), (e1), (e2), (e3), (e4), (f1), (f2), (f3), (g1), (g2), (g3), (g4), (g5), (g6), (g7) 또는 (g8)이다. 다른 일례에 있어서, 해당 (a) 내지 (f)로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 변이는 해당 (a1) 내지 (g8)의 변이 중 어느 1종을 포함하지만, 해당 (a1) 내지 (g8)의 변이 중 다른 변이를 포함하지 않는다. 또한 다른 일례에 있어서, 해당 (a) 내지 (f)로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 변이는, 해당 (e2), (e3) 혹은 (e4)의 단독 변이만인 경우, 또는 (e2)와 (e3) 혹은 (e2)와 (e4)의 이중 변이만인 경우를 포함하지 않는 경우가 있다.
혹은, 본 발명의 변이 이뮤노글로불린 결합 도메인의 바람직한 예로서는, 서열 번호 1 내지 6 중 어느 것의 아미노산 서열과 적어도 85％의 동일성을 갖고, 또한 하기 (A1) 내지 (F3):
(A1) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 3위치에 상당하는 위치에 있어서의 Gln;
(A2) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 3위치에 상당하는 위치에 있어서의 Ala;
(A3) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 3위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asp;
(A4) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 6위치에 상당하는 위치에 있어서의 Gln;
(A5) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 6위치에 상당하는 위치에 있어서의 Ala;
(A6) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 6위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asp;
(A7) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Gln;
(A8) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Ala;
(A9) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Arg;
(A10) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asp;
(A11) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Cys;
(A12) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Glu;
(A13) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 His;
(A14) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Ile;
(A15) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Leu;
(A16) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Lys;
(A17) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Met;
(A18) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Phe;
(A19) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Thr;
(A20) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Trp;
(A21) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Tyr;
(A22) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Val;
(B1) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 24위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asp;
(B2) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 25위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asp;
(C1) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 39위치에 상당하는 위치에 있어서의 Lys;
(C2) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 39위치에 상당하는 위치에 있어서의 Arg;
(D1) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 46위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asp;
(D2) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 46위치에 상당하는 위치에 있어서의 Glu;
(D3) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 46위치에 상당하는 위치에 있어서의 Lys;
(D4) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 46위치에 상당하는 위치에 있어서의 Arg;
(E1) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 4위치에 상당하는 위치에 있어서의 Lys의 결실;
(E2) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 49위치에 상당하는 위치에 있어서의 Arg;
(E3) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 58위치에 상당하는 위치에 있어서의 Lys의 결실;
(E4) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 58위치에 상당하는 위치에 있어서의 Arg;
(F1) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 23위치에 상당하는 위치에 있어서의 Arg;
(F2) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 23위치에 상당하는 위치에 있어서의 Leu; 및
(F3) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 23위치에 상당하는 위치에 있어서의 Ser로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 아미노산 잔기, 또는 이들 아미노산 잔기의 2종 이상의 조합을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄를 들 수 있다. 해당 서열 번호 1 내지 6 중 어느 것의 아미노산 서열과 적어도 85％의 동일성을 갖는 아미노산 서열은, 바람직하게는 서열 번호 1 내지 3 중 어느 것의 아미노산 서열과 적어도 85％의 동일성을 갖는 아미노산 서열이고, 보다 바람직하게는 서열 번호 3의 아미노산 서열과 적어도 85％의 동일성을 갖는 아미노산 서열이다.
해당 2종 이상의 아미노산 잔기의 조합의 예로서는, 하기 (A23) 내지 (A28)을 들 수 있다:
(A23) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 3위치, 6위치 및 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Gln;
(A24) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 3위치에 상당하는 위치에 있어서의 Ala, 6위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asp, 및 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Gln;
(A25) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 3위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asp 및 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Gln;
(A26) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 6위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asp 및 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Gln;
(A27) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 3위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asp, 6위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asp, 및 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Gln;
(A28) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 3위치에 상당하는 위치에 있어서의 Ala, 6위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asp, 및 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Gln.
해당 2종 이상의 아미노산 잔기의 조합의 다른 예로서는, 상기 (A1) 내지 (A28) 중 어느 하나와 상기 (B1) 내지 (F3) 중 어느 하나 이상의 조합을 들 수 있고, 바람직하게는 상기 (A1) 내지 (A22) 중 어느 하나와 상기 (E1) 내지 (F3) 중 어느 하나 이상의 조합을 들 수 있고, 보다 바람직하게는 상기 (A7) 내지 (A22) 중 어느 하나와 상기 (E2), (E4), (F1), (F2) 및 (F3) 중 어느 하나 이상의 조합을 들 수 있고, 더욱 바람직하게는 상기 (A7)과 상기 (E2), (E4), (F1), (F2) 및 (F3) 중 어느 하나 이상의 조합을 들 수 있고, 더욱 바람직하게는 이하를 들 수 있다:
(G1) 상기 (A7) 및 (F1);
(G2) 상기 (A7) 및 (F2);
(G3) 상기 (A7) 및 (F3);
(G4) 상기 (A7) 및 (E2);
(G5) 상기 (A7) 및 (E4);
(G6) 상기 (A7), (F1) 및 (E2);
(G7) 상기 (A7), (F2) 및 (E2); 또는
(G8) 상기 (A7), (F3) 및 (E2).
혹은, 본 발명의 변이 이뮤노글로불린 결합 도메인의 보다 바람직한 예로서는, 서열 번호 1 내지 6 중 어느 것의 아미노산 서열과 적어도 85％의 동일성을 갖고, 또한 하기:
(A1) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 3위치에 상당하는 위치에 있어서의 Gln;
(A2) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 3위치에 상당하는 위치에 있어서의 Ala;
(A3) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 3위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asp;
(A4) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 6위치에 상당하는 위치에 있어서의 Gln;
(A5) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 6위치에 상당하는 위치에 있어서의 Ala;
(A6) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 6위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asp;
(A7) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Gln;
(A8) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Ala;
(A9) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Arg;
(A10) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asp;
(A11) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Cys;
(A12) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Glu;
(A13) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 His;
(A14) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Ile;
(A15) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Leu;
(A16) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Lys;
(A17) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Met;
(A18) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Phe;
(A19) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Thr;
(A20) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Trp;
(A21) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Tyr;
(A22) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Val;
(A23) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 3위치, 6위치 및 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Gln;
(A24) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 3위치에 상당하는 위치에 있어서의 Ala 및 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Gln;
(A25) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 3위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asp 및 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Gln;
(A26) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 6위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asp 및 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Gln;
(A27) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 3위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asp, 6위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asp, 및 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Gln;
(A28) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 3위치에 상당하는 위치에 있어서의 Ala, 6위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asp, 및 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Gln;
(B1) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 24위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asp;
(B2) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 25위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asp;
(C1) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 39위치에 상당하는 위치에 있어서의 Lys;
(C2) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 39위치에 상당하는 위치에 있어서의 Arg;
(D1) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 46위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asp;
(D2) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 46위치에 상당하는 위치에 있어서의 Glu;
(D3) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 46위치에 상당하는 위치에 있어서의 Lys;
(D4) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 46위치에 상당하는 위치에 있어서의 Arg;
(E1) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 4위치에 상당하는 위치에 있어서의 Lys의 결실;
(E2) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 49위치에 상당하는 위치에 있어서의 Arg;
(E3) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 58위치에 상당하는 위치에 있어서의 Lys의 결실;
(E4) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 58위치에 상당하는 위치에 있어서의 Arg;
(F1) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 23위치에 상당하는 위치에 있어서의 Arg;
(F2) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 23위치에 상당하는 위치에 있어서의 Leu;
(F3) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 23위치에 상당하는 위치에 있어서의 Ser;
(G1) 상기 (A7) 및 (F1);
(G2) 상기 (A7) 및 (F2);
(G3) 상기 (A7) 및 (F3);
(G4) 상기 (A7) 및 (E2);
(G5) 상기 (A7) 및 (E4);
(G6) 상기 (A7), (F1) 및 (E2);
(G7) 상기 (A7), (F2) 및 (E2); 또는
(G8) 상기 (A7), (F3) 및 (E2)
를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄를 들 수 있다. 해당 서열 번호 1 내지 6 중 어느 것의 아미노산 서열과 적어도 85％의 동일성을 갖는 아미노산 서열은, 바람직하게는 서열 번호 1 내지 3 중 어느 것의 아미노산 서열과 적어도 85％의 동일성을 갖는 아미노산 서열이고, 보다 바람직하게는 서열 번호 3의 아미노산 서열과 적어도 85％의 동일성을 갖는 아미노산 서열이다. 다른 일례에 있어서, 본 발명의 변이 이뮤노글로불린 결합 도메인은 상기 (A1) 내지 (G8)의 아미노산 잔기 또는 그의 결실 중 어느 1종을 포함하지만, 해당 (A1) 내지 (G8)의 아미노산 잔기 또는 결실 중 다른 아미노산 잔기 또는 결실을 포함하지 않는다. 또한 다른 일례에 있어서, 본 발명의 변이 이뮤노글로불린 결합 도메인이 갖는 (A1) 내지 (F3)으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 아미노산 잔기 혹은 그의 결실은, (E2) K49R, (E3) ΔK58, 또는 (E4) K58R의 단독 변이, 또는 K49RΔK58, 혹은 K49RK58R의 이중 변이를 포함하지 않는 경우가 있다.
본 발명의 변이 이뮤노글로불린 결합 도메인에 있어서, 당해 서열 번호 1 내지 6 중 어느 것의 아미노산 서열과 적어도 85％의 동일성을 갖는 아미노산 서열은, 서열 번호 57 내지 62 중 어느 것의 아미노산 서열과 적어도 85％의 동일성을 갖는 아미노산 서열일 수 있다. 또한, 본 발명의 변이 이뮤노글로불린 결합 도메인에 있어서, 당해 서열 번호 1 내지 3 중 어느 것의 아미노산 서열과 적어도 85％의 동일성을 갖는 아미노산 서열은, 서열 번호 57 내지 59 중 어느 것의 아미노산 서열과 적어도 85％의 동일성을 갖는 아미노산 서열일 수 있다. 단, 이들 서열 번호 57 내지 62의 아미노산 서열과 적어도 85％의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 본 발명의 변이 이뮤노글로불린 결합 도메인은, 상술한 (a) 내지 (f)의 변이 중, 서열 번호 3의 아미노산 서열의 3위치 및 4위치에 상당하는 위치에 있어서의 아미노산 잔기의 변이를 포함하지 않는 경우가 있다.
바람직하게는 본 발명의 변이 이뮤노글로불린 결합 도메인은, 서열 번호 3의 아미노산 서열의 1위치에 상당하는 위치에 있어서의 Val을 포함하거나, 및/또는 서열 번호 3의 아미노산 서열의 29위치에 상당하는 위치에 있어서의 Ala를 포함한다.
본 발명의 변이 이뮤노글로불린 결합 도메인의 더욱 바람직한 예로서는, 서열 번호 7 내지 53 중 어느 것의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄를 들 수 있다.
본 발명의 이뮤노글로불린 결합 단백질은 상술한 본 발명의 변이 이뮤노글로불린 결합 도메인을 1개 이상 포함하고 있으면 된다. 바람직하게는, 본 발명의 이뮤노글로불린 결합 단백질은 본 발명의 변이 이뮤노글로불린 결합 도메인을 2개 이상, 보다 바람직하게는 3개 이상, 더욱 바람직하게는 4개 이상, 더욱 바람직하게는 5개 이상, 더욱 바람직하게는 6개 이상 포함한다. 한편, 본 발명의 이뮤노글로불린 결합 단백질은, 본 발명의 변이 이뮤노글로불린 결합 도메인을 바람직하게는 12개 이하, 보다 바람직하게는 8개 이하, 더욱 바람직하게는 7개 이하 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 이뮤노글로불린 결합 단백질은, 본 발명의 변이 이뮤노글로불린 결합 도메인을 바람직하게는 2 내지 12개, 보다 바람직하게는 3 내지 8개, 더욱 바람직하게는 4 내지 7개 포함한다. 본 발명의 이뮤노글로불린 결합 단백질이 2개 이상의 본 발명의 변이 이뮤노글로불린 결합 도메인을 포함하는 경우, 그것들의 변이 이뮤노글로불린 결합 도메인은 동일한 종류의 것이어도 되고, 다른 종류의 것이어도 되지만, 바람직하게는 동일한 종류이다.
본 발명의 이뮤노글로불린 결합 단백질은 상술한 본 발명의 변이 이뮤노글로불린 결합 도메인 이외의, 다른 이뮤노글로불린 결합 도메인을 포함하고 있어도 된다. 당해 다른 도메인의 예로서는, 천연형 SpA 이뮤노글로불린 결합 도메인(예를 들어, SpA의 B 도메인, Z 도메인, C 도메인 또는 D 도메인), 또는 본 발명의 변이 이뮤노글로불린 결합 도메인 이외의 그것들의 변이체를 들 수 있다.
본 발명의 이뮤노글로불린 결합 단백질의 바람직한 예로서는, 2개 이상의 본 발명의 변이 이뮤노글로불린 결합 도메인의 아미노산 서열이 직쇄상으로 연결된 폴리펩티드를 들 수 있다. 본 발명의 이뮤노글로불린 결합 단백질에 포함되는 해당 변이 이뮤노글로불린 결합 도메인의 수는 바람직하게는 2 내지 12개, 보다 바람직하게는 3 내지 8개, 더욱 바람직하게는 4 내지 7개이다. 본 발명의 이뮤노글로불린 결합 단백질의 보다 바람직한 예로서는, 각각이 서열 번호 7 내지 53의 아미노산 서열로부터 선택되는 2개 이상의 아미노산 서열이 직쇄상으로 연결된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 들 수 있다. 본 발명의 이뮤노글로불린 결합 단백질의 더욱 바람직한 예로서는, 각각이 서열 번호 7 내지 53의 아미노산 서열로부터 선택되는 2 내지 12개, 더욱 바람직하게는 3 내지 8개, 한층 바람직하게는 4 내지 7개의 아미노산 서열이 직쇄상으로 연결된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 들 수 있다. 더욱 바람직한 예로서는, 서열 번호 7 내지 53 중 어느 것의 아미노산 서열이 2 내지 12개, 더욱 바람직하게는 3 내지 8개, 한층 바람직하게는 4 내지 7개 직쇄상으로 연결된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 들 수 있다. 그러나, 본 발명의 단백질의 바람직한 예는 이들에 한정되지 않는다. 또한, 본 발명에 있어서 아미노산 서열이 「직쇄상으로 연결」이란, 2개 이상의 아미노산 서열이 링커를 개재하여 또는 링커를 개재하지 않고 직렬로 연결된 구조를 의미한다. 예를 들어 링커를 개재하는 경우, 「직쇄상으로 연결」이란, 1개의 아미노산 서열의 C 말단과 다른 아미노산 서열의 N 말단이 링커를 개재하여 직렬로 연결된 구조를 의미하고, 한편 링커를 개재하지 않는 경우, 「직쇄상으로 연결」이란, 1개의 아미노산 서열의 C 말단과 다른 아미노산 서열의 N 말단이 펩티드 결합에 의해 직렬로 연결된 구조를 의미한다.
본 발명의 이뮤노글로불린 결합 단백질의 담체로의 고정화량 증대, 담체로의 결합점의 증가, 항체 결합 용량의 증대 등의 관점에서, 본 발명의 이뮤노글로불린 결합 단백질에 포함되는 이뮤노글로불린 결합 도메인의 N 말단, C 말단 및 도메인 사이 중 어느 1개소 이상에, 임의의 아미노산 잔기 또는 펩티드를 부가 또는 삽입해도 된다. 당해 부가 또는 삽입되는 아미노산 잔기 또는 펩티드의 바람직한 예로서는, Cys, Lys, Pro, (Pro)m, (Ala-Pro)n 및 (Glu-Ala-Ala-Ala-Lys)p(m은 2 내지 300, 바람직하게는 12 내지 24의 정수이고, n은 4 이상의 정수, 바람직하게는 4 내지 10의 정수이고, p는 2 이상의 정수, 바람직하게는 2 내지 6의 정수이다)를 들 수 있다.
2. 이뮤노글로불린 결합 단백질의 제조
본 발명의 이뮤노글로불린 결합 단백질은 당해 분야에서 공지된 방법, 예를 들어 아미노산 서열에 기초하는 화학 합성법이나, 재조합법 등에 의해 제조할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 이뮤노글로불린 결합 단백질은 Frederick M. Ausbel들에 의한 Current Protocols In Molecular Biology나, Sambrook들 편집의 Molecular Cloning(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3rd edition, 2001) 등에 기재되어 있는 공지된 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있다. 즉, 본 발명의 이뮤노글로불린 결합 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 발현 벡터를 대장균 등의 숙주에 형질 전환하고, 얻어진 재조합체를 적절한 액체 배지에서 배양함으로써, 배양 후의 세포로부터, 목적으로 하는 단백질을 대량으로 또한 경제적으로 취득할 수 있다. 바람직한 발현 벡터로서는, 숙주 세포 내에서 복제 가능한 기지의 벡터 중 어느 것도 사용할 수 있고, 예를 들어 미국 특허 제5,151,350호 명세서에 기재되어 있는 플라스미드나, Sambrook들 편집의 Molecular Cloning(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3rd edition, 2001) 등에 기재되어 있는 플라스미드를 들 수 있다. 또한, 형질 전환을 위한 숙주로서는 특별히 한정되지 않지만, 대장균 등의 박테리아, 진균류, 곤충 세포, 포유류 세포 등의 재조합 단백질을 발현시키기 위하여 사용되는 공지된 숙주를 사용할 수 있다. 숙주 중에 핵산을 도입함으로써 숙주를 형질 전환시키기 위해서는, 각 숙주에 따라서 당해 기술분야에 있어서 알려져 있는 어느 방법을 사용해도 되고, 예를 들어 Sambrook들 편집의 Molecular Cloning(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3rd edition, 2001) 등에 기재되어 있는 공지된 방법을 이용할 수 있다. 얻어진 형질 전환체(바람직하게는 세균 등의 세포)를 배양하여 발현된 단백질을 회수하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 혹은, 본 발명의 이뮤노글로불린 결합 단백질은 무세포 단백질 합성계를 사용하여 발현시켜도 된다.
따라서 본 발명은 또한, 본 발명의 이뮤노글로불린 결합 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드(DNA 등), 그것을 포함하는 벡터, 및 그것들을 포함하는 형질 전환체를 제공한다.
3. 어피니티 담체
본 발명의 이뮤노글로불린 결합 단백질은 어피니티 리간드로서 사용할 수 있다. 본 발명의 이뮤노글로불린 결합 단백질을 고상 담체에 고정화함으로써, 해당 본 발명의 이뮤노글로불린 결합 단백질을 리간드로 한 어피니티 담체를 제조할 수 있다. 당해 어피니티 담체는 본 발명의 이뮤노글로불린 결합 단백질을 리간드로 하는 담체이고, 이뮤노글로불린 결합 활성을 갖는다. 또한 당해 어피니티 담체는 야생형 단백질 A나 그의 도메인을 리간드로 하는 담체에 비하여, 알칼리 내성이 향상되어 있다.
본 발명의 어피니티 담체에 포함되는 고상 담체의 형상으로서는, 입자, 막, 플레이트, 튜브, 바늘상, 섬유상 등의 임의의 형태일 수 있다. 해당 담체는 다공성이어도 되고 비다공성이어도 된다. 이들 담체는 충전 베드로서 사용할 수도 있고, 또는 현탁 형태로 사용할 수도 있다. 현탁 형태에는 유동층(expanded bed) 및 순수한 현탁물로서 알려지는 것이 포함되고, 해당 형태 중에서는 입자가 자유롭게 운동할 수 있다. 모놀리스, 충전층 및 유동층의 경우, 분리 수순은 일반적으로 농도 구배에 의한 종래의 크로마토그래피법을 따른다. 순수한 현탁물의 경우에는 회분법이 사용된다. 바람직하게는, 당해 담체는 충전제이다. 혹은, 담체는 칩, 모세관 또는 필터와 같은 형태여도 된다.
일 실시 형태에 있어서, 당해 고상 담체는 입자의 경우, 입경이 바람직하게는 20㎛ 이상 200㎛ 이하이다. 예를 들어 담체가 합성 폴리머인 경우, 입경은 바람직하게는 20㎛ 이상, 보다 바람직하게는 30㎛ 이상, 또한 바람직하게는 100㎛ 이하, 보다 바람직하게는 80㎛ 이하, 예를 들어 바람직하게는 20 내지 100㎛, 보다 바람직하게는 30 내지 80㎛이다. 예를 들어 담체가 다당인 경우, 입경이 바람직하게는 50㎛ 이상, 보다 바람직하게는 60㎛ 이상, 또한 바람직하게는 200㎛ 이하, 보다 바람직하게는 150㎛ 이하, 예를 들어 바람직하게는 50 내지 200㎛, 보다 바람직하게는 60 내지 150㎛이다. 입경이 20㎛ 미만이면, 고유속 하에서 칼럼 압력이 높아지고 실용에 견디지 못한다. 입경이 200㎛를 초과하면, 이뮤노글로불린이 어피니티 담체에 결합하는 양(결합 용량)이 떨어지는 경우가 있다. 또한, 본 명세서에 있어서의 「입경」이란, ISO 13320 및 JIS Z 8825-1에 준한 레이저 회절법으로 측정한 체적 평균 입경을 의미한다. 구체적으로는, 레이저 산란 회절법 입도 분포 측정 장치(예를 들어, LS 13 320((주)베크만·콜터 등))에 의해 입경 분포를 측정하고, Fluid R.I. Real 1. 333, Sample R.I. Real 1.54 Imaginary 0 등을 광학 모델로서 사용하고, 체적 기준의 입도 분포를 측정하여 구해지는 평균 입경을 말한다.
일 실시 형태에 있어서, 당해 고상 담체는 다공질이고, 바람직하게는 50㎡/g 이상, 보다 바람직하게는 80㎡/g 이상, 또한 바람직하게는 150㎡/g 이하, 보다 바람직하게는 130㎡/g 이하, 예를 들어 바람직하게는 50 내지 150㎡/g, 보다 바람직하게는 80 내지 130㎡/g의 비표면적을 갖는다. 여기서, 비표면적이 50㎡/g 미만이면 결합 용량이 떨어지는 경우가 있고, 한편 150㎡/g을 초과하면, 담체의 강도가 떨어지기 때문에 고유속 하에서 담체가 파괴되어서 칼럼 압력이 상승하는 경우가 있다. 또한, 본 명세서에 있어서의 「비표면적」이란, 수은 포로시미터에 의해 얻어지는 세공 직경 10 내지 5000nm의 세공이 갖는 표면적을 입자의 건조 중량으로 제산한 값이다.
일 실시 형태에 있어서, 당해 고상 담체는 체적 평균 세공 직경이 바람직하게는 100nm 이상 1500nm 이하이다. 예를 들어 담체가 합성 폴리머인 경우, 체적 평균 세공 직경은 바람직하게는 100nm 이상, 보다 바람직하게는 200nm 이상, 또한 바람직하게는 400nm 이하, 보다 바람직하게는 300nm 이하이고, 예를 들어 바람직하게는 100 내지 400nm, 더욱 바람직하게는 200 내지 300nm이다. 예를 들어 담체가 다당인 경우, 체적 평균 세공 직경은 바람직하게는 500nm 이상, 보다 바람직하게는 800nm 이상, 또한 바람직하게는 1500nm 이하, 보다 바람직하게는 1400nm 이하이고, 예를 들어 바람직하게는 500 내지 1500nm, 더욱 바람직하게는 800 내지 1400nm이다. 여기서 체적 평균 세공 직경이 100nm 미만이면, 고유속 하의 결합 용량 저하가 현저해지는 경우가 있고, 한편 1500nm를 초과하면, 유속에 관계없이 결합 용량이 저하되는 경우가 있다. 또한, 본 명세서에 있어서의 「체적 평균 세공 직경」이란, 수은 포로시미터에 의해 얻어지는 세공 직경 10 내지 5000nm의 세공의 체적 평균 세공 직경이다.
당해 고상 담체가 상기 범위의 입경, 비표면적 및 세공 직경 분포를 만족시키는 경우, 정제 대상 용액의 유로가 되는 입자 간의 간극 및 입자 내의 비교적 큰 세공 직경과, 정제 대상 분자의 결합 표면적의 밸런스가 최적화되어, 고유속 하의 결합 용량이 높은 레벨로 유지된다.
당해 고상 담체의 재질로서는 예를 들어 친수성 표면을 갖는 폴리머이고, 예를 들어 친수화 처리에 의해 외표면에(및 존재하는 경우에는 내표면에도) 히드록시기(-OH), 카르복시기(-COOH), 아미노카르보닐기(-CONH2 또는 N 치환형), 아미노기(-NH2 또는 치환형), 또는 올리고 혹은 폴리에틸렌옥시기를 갖는 폴리머이다. 일 실시 형태에 있어서, 해당 폴리머는 폴리메타크릴레이트, 폴리아크릴아미드, 폴리스티렌, 폴리비닐알코올계 등의 합성 폴리머일 수 있고, 바람직하게는 다관능 (메트)아크릴레이트, 디비닐벤젠 등의 다관능 모노머로 가교된 공중합체와 같은 합성 폴리머이다. 이러한 합성 폴리머는 공지된 방법에 의해 용이하게 제조된다(예를 들어, J.MATER. CHEM1991, 1(3): 371-374에 기재된 방법을 참조하기 바란다). 혹은, 토요펄(도소사)과 같은 시판품도 사용된다. 다른 실시 형태에 있어서의 폴리머는 덱스트란, 전분, 셀룰로오스, 풀루란, 아가로오스 등의 다당류이다. 이러한 다당류는 공지된 방법에 의해 용이하게 제조된다(예를 들어 일본 특허 제4081143호에 기재된 방법을 참조하기 바란다). 혹은, 세파로스(GE 헬스케어 바이오사이언스사)와 같은 시판품도 사용된다. 그 밖의 실시 형태에서는 실리카, 산화지르코늄 등의 무기 담체여도 된다.
일 실시 형태에 있어서, 당해 고상 담체로서 사용되는 다공성 입자의 일 구체예로서는, 예를 들어 20 내지 50질량％의 가교성 비닐 단량체와 3 내지 80질량％의 에폭시기 함유 비닐 단량체, 20 내지 80질량％의 디올기 함유 비닐 단량체와의 공중합체를 함유하고, 입경이 20 내지 80㎛이고, 비표면적이 50 내지 150㎡/g이고, 체적 평균 세공 직경이 100 내지 400nm인 다공성 유기 중합체 입자를 들 수 있다.
또한, 당해 고상 담체를 수은 포로시미터로 측정한 경우의 세공 직경 10 내지 5000nm의 세공의 침입 체적(세공 체적)은 바람직하게는 1.3mL/g 이상, 7.0mL/g 이하이다. 예를 들어 담체가 합성 폴리머인 경우, 세공 체적은 바람직하게는 1.3mL/g 이상, 또한 바람직하게는 7.0mL/g 이하, 보다 바람직하게는 5.0mL/g 이하, 더욱 바람직하게는 2.5mL/g 이하이고, 예를 들어 바람직하게는 1.3 내지 7.0mL/g, 보다 바람직하게는 1.3 내지 5.0mL/g, 더욱 바람직하게는 1.3 내지 2.5mL/g이다. 또한, 예를 들어 담체가 다당인 경우, 세공 체적은 바람직하게는 3.0 내지 6.0mL/g이다.
당해 고상 담체로의 리간드(즉 본 발명의 이뮤노글로불린 결합 단백질)의 결합 방법으로서는, 단백질을 담체에 고정화하는 일반적 방법을 사용하여 행할 수 있다. 예를 들어 카르복시기를 갖는 담체를 사용하고, 이 카르복시기를 N-히드록시숙신산이미드에 의해 활성화시켜 리간드의 아미노기와 반응시키는 방법; 아미노기 또는 카르복시기를 갖는 담체를 사용하고, 수용성 카르보디이미드 등의 탈수 축합제 존재 하에서 리간드의 카르복시기 또는 아미노기와 반응시켜 아미드 결합을 형성하는 방법; 수산기를 갖는 담체를 사용하고, 브롬화시안 등의 할로겐화시안으로 활성화시켜서 리간드의 아미노기와 반응시키는 방법; 담체의 수산기를 토실화 또는 트레실화하고 리간드의 아미노기와 반응시키는 방법; 비스에폭시드, 에피클로로히드린 등에 의해 에폭시기를 담체에 도입하고, 리간드의 아미노기, 수산기 또는 티올기와 반응시키는 방법; 에폭시기를 갖는 담체를 사용하고, 리간드의 아미노기, 수산기 또는 티올기와 반응시키는 방법 등을 들 수 있다. 상기 중, 반응을 실시하는 수용액 중에서의 안정성의 관점에서는, 에폭시기를 개재하여 리간드를 결합시키는 방법이 바람직하다.
에폭시기가 개환하여 생성되는 개환 에폭시기인 수산기는 담체 표면을 친수화하고, 단백질 등의 비특이 흡착을 방지함과 함께, 수중에서 담체의 인성을 향상시켜, 고유속 하의 담체의 파괴를 방지하는 역할을 한다. 따라서, 리간드를 고정화시킨 후의 담체 중에 리간드와 결합하고 있지 않은 잔여의 에폭시기가 존재하고 있는 경우, 당해 잔여의 에폭시기를 개환시키는 것이 바람직하다. 담체 중의 에폭시기의 개환 방법으로서는, 예를 들어 수용매 중에서 산 또는 알칼리에 의해, 가열 또는 실온에서 해당 담체를 교반하는 방법을 들 수 있다. 또한, 머캅토에탄올, 티오글리세롤 등의 머캅토기를 갖는 블로킹제나 모노에탄올아민 등의 아미노기를 갖는 블로킹제로 에폭시기를 개환시켜도 된다. 보다 바람직한 개환 에폭시기는, 담체에 포함되는 에폭시기를 티오글리세롤에 의해 개환시켜서 얻어지는 개환 에폭시기이다. 티오글리세롤은 원료로서 머캅토에탄올 등보다 독성이 낮고, 또한 티오글리세롤이 부가된 에폭시 개환기는 아미노기를 갖는 블로킹제에 의한 개환기보다 비특이 흡착이 낮은 데다, 동적 결합량이 높아진다고 하는 이점을 갖는다.
필요에 따라 고상 담체와 리간드 사이에 임의의 길이의 분자(스페이서)를 도입해도 된다. 스페이서의 예로서는 폴리메틸렌쇄, 폴리에틸렌글리콜쇄, 당류 등을 들 수 있다.
본 발명의 어피니티 담체는 알칼리 내성이 향상된 리간드를 갖고 있기 때문에, 예를 들어 어피니티 정제에 있어서의 해당 담체의 반복 이용을 위한 알칼리성 조건 하에서의 세정(예를 들어 0.01 내지 1.0M 수산화나트륨 등의 알칼리성 용액을 사용한 세정)에 대해서도 성능의 현저한 저하가 없다.
4. 항체 또는 그의 단편의 단리 방법
본 발명의 일 실시 형태에 따른 항체 또는 그의 단편(이하, 단순히 항체라고 표기한다)의 단리 방법을 설명한다. 본 실시 형태에 따른 항체의 단리 방법은, 적합하게는 본 발명의 이뮤노글로불린 결합 단백질을 고정화한 어피니티 담체에 항체를 함유하는 시료를 통액하고, 해당 담체에 해당 항체를 흡착시키는 공정(제1 공정) 및 해당 담체로부터 해당 항체를 용출시키는 공정(제2 공정)을 포함하고, 바람직하게는 해당 제2 공정 후에, 해당 담체를 알칼리성액으로 세정하는 공정(제3 공정)을 더 포함한다.
당해 제1 공정에서는, 본 발명의 어피니티 담체를 충전한 칼럼 등에 항체를 함유하는 시료를, 리간드(본 발명의 이뮤노글로불린 결합 단백질)에 항체가 흡착하는 조건에서 흘린다. 이 제1 공정에서는, 시료 중의 항체 이외의 물질의 대부분은 리간드에 흡착되지 않고 칼럼을 통과한다. 이 후, 필요에 따라 리간드에 약하게 유지된 일부의 물질을 제거하기 위해서, 담체를 NaCl 등의 염을 포함하는 중성의 완충액으로 세정해도 된다.
제2 공정에서는, pH2 내지 5의 적절한 완충액을 흘리고, 리간드에 흡착된 항체를 용출시킨다. 이 용출액을 회수함으로써, 시료로부터 항체를 단리할 수 있다.
항체의 순도를 높이기 위해서, 상기 제2 공정에서 얻어진 용출액에 포함되는 항체를 더 정제해도 된다. 항체의 정제는 예를 들어 양이온 교환 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피, 믹스 모드 크로마토그래피, 친수성 상호 작용 크로마토그래피, 소수성 상호 작용 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피 등을 단독으로 또는 적절히 조합하여 사용하여 행할 수 있다. 예를 들어 해당 제2 공정으로 얻어진 용출액을 양이온 교환 크로마토그래피, 계속하여 음이온 교환 크로마토그래피에 가함으로써 항체를 정제할 수 있다. 양이온 교환 크로마토그래피는 SP-세파로스 FF(GE 헬스케어 바이오사이언스사제), BioPro IEX S(YMC사제), BioPro IEX SmartSep S(YMC사제) 등을 사용하여 행할 수 있다. 음이온 교환 크로마토그래피는 Q-세파로스 FF(GE 헬스케어 바이오사이언스사제), BioPro IEX Q(YMC사제), BioPro IEX SmartSep Q(YMC사제) 등을 사용하여 행할 수 있다.
본 실시 형태에 따른 항체의 단리 방법에 있어서는, 바람직하게는 상기 제2 공정에 이어 제3 공정이 행하여진다. 제3 공정에서는, 알칼리성 용액으로 해당 어피니티 담체를 세정(CIP 세정)한다. 제3 공정에 사용되는 알칼리성 용액으로서는, 예를 들어 수산화나트륨 수용액, 수산화칼륨 수용액, 트리에틸아민, 수산화테트라부틸암모늄 등을 들 수 있다. 또한, 제3 공정에서 사용되는 해당 알칼리성 용액 중의 알칼리염의 몰 농도는 하한값이 0.001M 이상, 바람직하게는 0.01M 이상, 보다 바람직하게는 0.1M 이상이고, 상한값이 6.0M 이하, 바람직하게는 4.0M 이하, 보다 바람직하게는 2.0M 이하이다. 사용되는 해당 알칼리성 용액의 pH로서는, 하한값이 pH11.0 이상, 바람직하게는 pH12.0 이상, 보다 바람직하게는 pH12.5 이상이고, 상한값이 pH16.0 이하, 바람직하게는 pH15.5 이하, 보다 바람직하게는 pH15.0 이하이다.
본 발명의 어피니티 담체는 단백질 리간드의 알칼리 내성 향상에 의해 상기 제3 공정에서의 세정 후에도 항체 결합 활성을 안정적으로 유지하고 있기 때문에, 항체 단리에 반복하여 사용할 수 있다.
본 발명의 항체의 단리 방법의 일 실시 형태에 있어서, 단리된 항체는 항체 의약으로서 사용된다. 따라서 일 실시 형태에 있어서, 본 발명은 본 발명의 어피니티 담체를 사용하는 항체 의약의 제조 방법을 제공한다. 당해 방법의 수순은 목적으로 하는 항체 의약을 함유하는 시료를 사용하는 것 이외에는, 기본적으로 상술한 항체의 단리 방법의 수순과 마찬가지이다.
실시예
이하, 본 발명을 실시예를 들어서 더욱 구체적으로 설명한다. 또한, 이하의 기재는 본 발명의 양태를 개괄적으로 나타내는 것이고, 특별한 이유 없이, 이러한 기재에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
참고예 1 다공질 입자의 합성
(1) 360g의 순수에 폴리비닐알코올(쿠라레사제 PVA-217) 3.58g을 첨가하고, 가열 교반하여 폴리비닐알코올을 용해시키고, 냉각한 후, 도데실황산나트륨(와코 쥰야꾸 고교제) 0.36g, 황산나트륨(와코 쥰야꾸 고교제) 0.36g 및 아질산나트륨(와코 쥰야꾸 고교제) 0.18g을 첨가하고, 교반하여 수용액 S를 조제하였다.
(2) 글리시딜메타크릴레이트(미쓰비시 케미컬 가부시키가이샤제) 12.00g 및 디비닐벤젠(신닛테츠 가가쿠사제) 1.33g을 포함하는 단량체 조성물을, 디이소부틸케톤(미쯔이 가가꾸사제) 24.43g에 용해시켜 단량체 용액을 조제하였다.
(3) (1)에서 얻은 수용액 S를 세퍼러블 플라스크 내에 전량 투입하고, 온도계, 교반 날개 및 냉각관을 장착하여 온수 배스에 세팅하고, 질소 분위기 하에서 교반을 개시하였다. 세퍼러블 플라스크 내에 (2)에서 얻은 단량체 용액을 전량 투입하고, 온수 배스에 의해 가온하였다. 내온이 85℃에 도달한 시점에서 2,2'-아조이소부티로니트릴(와코 쥰야꾸 고교사제) 0.53g을 첨가하였다.
(4) (3)에서 얻은 반응액을 86℃로 온도를 유지하면서, 3시간 교반하였다. 이어서 반응액을 냉각한 후, 여과하고, 순수와 에탄올로 세정하였다. 세정한 입자를 순수에 분산시켜서 데칸테이션을 3회 행하고, 소입자를 제거하였다. 이어서, 입자의 농도가 10질량％가 되도록 입자를 순수에 분산시켜, 다공질 입자(PB) 분산액을 얻었다.
실시예 1 이뮤노글로불린 결합 단백질(PrAt-0 내지 32)의 제작
이뮤노글로불린 결합 단백질 PrAt-0 내지 32를 취득하였다. PrAt-0은 단백질 A의 C 도메인(서열 번호 3)의 A1V/G29A 변이체(알칼리 내성 향상 변이체; 비특허문헌 1)가 펩티드 결합에 의해 직렬로 연결된 동형 사량체를 포함하는 이뮤노글로불린 결합 단백질이다. PrAt-1 내지 32는, PrAt-0의 각 이뮤노글로불린 결합 도메인에 대하여 표 1에 기재된 변이를 도입한 변이체이다.
Figure pct00001
PrAt-0 내지 32의 발현과 정제는 각각 이하와 같이 행하였다. PrAt-0 내지 32를 코드하는 플라스미드를 사용하여 대장균 BL21(DE3)(NEW ENGLAND BIOLABS사제)을 형질 전환하고, 얻어진 형질 전환체를 부영양 배지 중 37℃에서 대수 증식기까지 배양하였다. 그 후, 배지에 최종 농도 1mM 이소프로필-β-티오갈락토피라노시드(와코 쥰야꾸 고교사제)를 첨가하고, 추가로 37℃에서 4시간 배양함으로써, 목적 단백질을 발현시켰다. 계속하여 배양액을 원심 분리하여 상청을 제거하고, 얻어진 균체에 난백 유래 리소자임(와코 쥰야꾸 고교사제) 및 폴리옥시에틸렌(10)옥틸페닐에테르(와코 쥰야꾸 고교사제)를 포함하는 pH9.5의 30mM 트리스 완충액을 첨가하여 균체를 파쇄하였다. 얻어진 세포 파쇄액으로부터, 양이온 교환 크로마토그래피(SP-세파로스 FF, GE 헬스케어 바이오사이언스사제) 및 음이온 교환 크로마토그래피(Q-세파로스 FF, GE 헬스케어 바이오사이언스사제)에 의해 재조합 이뮤노글로불린 결합 단백질을 정제하였다. 정제한 이뮤노글로불린 결합 단백질을 10mM 시트르산 완충액 pH6.0에 대하여 투석하였다. SDS-PAGE에 의해 확인된 재조합형 이뮤노글로불린 결합 단백질의 순도는 95％ 이상이었다.
실시예 2 이뮤노글로불린 결합 단백질(PrAp-0 내지 41)의 제작
이뮤노글로불린 결합 단백질 PrAp-0 내지 39를 취득하였다. PrAp-0은 단백질 A의 C 도메인(서열 번호 3)의 A1V/G29A 변이체가 펩티드 결합에 의해 직렬로 연결된 동형 오량체를 포함하는 이뮤노글로불린 결합 단백질이고, PrAp-21은 단백질 A의 C 도메인(서열 번호 3)의 A1V/G29A 변이체가 펩티드 결합에 의해 직렬로 연결된 동형 오량체의 C 말단에 시스테인(C)을 연결한 이뮤노글로불린 결합 단백질이다. PrAp-1 내지 20은, PrAp-0의 각 이뮤노글로불린 결합 도메인에 대하여 표 2에 기재된 변이를 도입한 변이체이고, PrAp-22 내지 41은, PrAp-21의 각 이뮤노글로불린 결합 도메인에 대하여 표 3에 기재된 변이를 도입한 변이체이다.
Figure pct00002
Figure pct00003
PrAp-0 내지 41의 발현과 정제는 PrAt-0 내지 32와 마찬가지로 행하였다. SDS-PAGE에 의해 확인된 재조합형 이뮤노글로불린 결합 단백질의 순도는 95％ 이상이었다.
실시예 3 이뮤노글로불린 결합 단백질(PrAh-0 내지 41)의 제작
이뮤노글로불린 결합 단백질 PrAh-0 내지 41을 취득하였다. PrAh-0은, 단백질 A의 C 도메인(서열 번호 3)의 A1V/G29A 변이체가 펩티드 결합에 의해 직렬로 연결된 동형 육량체를 포함하는 이뮤노글로불린 결합 단백질이고, PrAh-21은, 단백질 A의 C 도메인(서열 번호 3)의 A1V/G29A 변이체가 펩티드 결합에 의해 직렬로 연결된 동형 육량체의 C 말단에 시스테인(C)을 연결한 이뮤노글로불린 결합 단백질이다. PrAh-1 내지 20은, PrAh-0의 각 이뮤노글로불린 결합 도메인에 대하여 표 4에 기재된 변이를 도입한 변이체이고, PrAh-22 내지 41은, PrAh-21의 각 이뮤노글로불린 결합 도메인에 대하여 표 5에 기재된 변이를 도입한 변이체이다.
Figure pct00004
Figure pct00005
PrAh-0 내지 41의 발현과 정제는 PrAt-0 내지 32와 마찬가지로 행하였다. SDS-PAGE에 의해 확인된 재조합형 이뮤노글로불린 결합 단백질의 순도는 95％ 이상이었다.
실시예 4 리간드 고정화 입자의 조제
참고예 1에서 취득한 다공질 입자(PB) 8mg에 대하여, 실시예 1에서 조제한 PrAt-0을 1.16mg 용해한, 1.1M 황산나트륨을 포함하는 0.1M 탄산 완충액(pH8.8) 450μL를 첨가하고, 혼합액을 25℃에서 5시간 진탕하여 PrAt-0을 PB에 결합시켰다. 입자에 잔존하는 에폭시기를 티오글리세롤을 사용하여 블로킹한 후, 0.5M NaOH 및 0.1M 시트르산 버퍼(pH3.2)를 사용하여 입자를 세정하고, 리간드 고정화 입자(PrAt-0/PB)를 얻었다. 마찬가지의 수순으로, PrAt-1 내지 32 중 어느 것이 결합된 리간드 고정화 입자(PrAt-1/PB 내지 PrAt-32/PB)를 얻었다. 또한, 마찬가지의 수순으로 PrAp-0 내지 41 중 어느 것이 결합된 리간드 고정화 입자(PrAp-0/PB 내지 PrAp-41/PB)를 얻었다. 또한, 마찬가지의 수순으로 PrAh-0 내지 41 중 어느 것이 결합된 리간드 고정화 입자(PrAh-0/PB 내지 PrAh-41/PB)를 얻었다.
실시예 5 이뮤노글로불린 결합 단백질(PrAs-0 내지 22)의 제작
이뮤노글로불린 결합 단백질 PrAs-0 내지 22를 취득하였다. PrAs-0은, 단백질 A의 C 도메인(서열 번호 3)의 A1V/G29A 변이체의 N 말단에 6회 반복하여 히스티딘 태그(HHHHHH 배열)를 연결한 이뮤노글로불린 결합 단백질이다. PrAs-1 내지 22는, PrAs-0의 각 이뮤노글로불린 결합 도메인에 대하여 표 6에 기재된 변이를 도입한 변이체이다.
Figure pct00006
PrAs-0 내지 22의 발현과 정제는, 어피니티 크로마토그래피(HisTrap FF, GE 헬스케어 바이오사이언스사제)에 의해 재조합 이뮤노글로불린 결합 단백질을 정제한 것 이외에는, PrAt-0 내지 32와 마찬가지로 행하였다. SDS-PAGE에 의해 확인된 재조합형 이뮤노글로불린 결합 단백질의 순도는 95％ 이상이었다.
시험예 1
실시예 4에서 제작한 변이 도메인을 포함하는 리간드 고정화 입자 PrAt-1/PB 내지 PrAt-29/PB에 대해서, 부모 도메인을 포함하는 리간드 고정화 입자 PrAt-0에 대한 상대 알칼리 내성을 평가하였다.
(1) 정적 결합 용량(SBC)의 측정
2mg의 리간드 고정화 입자(PrAt-0/PB)에 2.0mg의 IgG를 포함하는 20mM 인산 버퍼(pH7.5) 400μL를 첨가하고, 30분간 인큐베이트 하였다. 이어서 20mM 인산 버퍼(pH7.5) 400μL로 세정한 후, 50mM 시트르산나트륨 버퍼(pH2.5) 400μL를 첨가하고, IgG를 포함하는 용출액을 회수하였다. 용출액 내의 IgG양을 흡광도 측정에 의해 산출하고, 용출 IgG양과 담체 체적으로부터 PrAt-0/PB의 정적 결합 용량(SBC)을 구하였다. 마찬가지의 수순으로, PrAt-1/PB 내지 PrAt-29/PB의 SBC를 구하였다. 또한, 마찬가지의 수순으로, PrAh-21/PB 내지 PrAh-41/PB의 SBC를 구하였다.
(2) 알칼리 내성의 평가: PrAt-1 내지 29
2mg의 리간드 고정화 입자(PrAt-0/PB)를 1.0M NaOH로 평형화시킨 후, 24시간 인큐베이트 하였다. 이어서 20mM 인산 버퍼(pH7.5)로 입자를 평형화시킨 후, 2.0mg의 IgG를 포함하는 20mM 인산 버퍼(pH7.5) 400μL를 첨가하고, 30분간 인큐베이트 하였다. 이어서 20mM 인산 버퍼(pH7.5) 400μL로 세정한 후, 50mM 시트르산나트륨 버퍼(pH2.5) 400μL를 첨가하고, IgG를 포함하는 용출액을 회수하였다. 용출액 중의 IgG양을 흡광도 측정에 의해 산출하고, 용출 IgG양과 담체 체적으로부터 알칼리에 폭로한 PrAt-0/PB의 SBC를 구하였다. 마찬가지의 수순으로, 알칼리에 폭로한 PrAt-1 내지 29/PB의 SBC를 구하였다. 각 리간드 고정화 입자에 대해서, (1)에서 구한 SBC에 대한 알칼리 폭로 후의 SBC의 상대값(SBC 유지율)을 산출하고, 이어서 이하의 식을 따라서 각 리간드 고정화 입자(PrAt-1 내지 29)의 PrAt-0에 대한 상대 알칼리 내성(％)을 산출하였다.
상대 알칼리 내성(％)=(PrAt-N(N=1 내지 29)의 SBC 유지율)/(PrAt-0의 SBC 유지율)×100
(3) 알칼리 내성의 평가: PrAh-22 내지 38
(2)와 마찬가지의 수순으로 알칼리에 폭로한 PrAh-21 내지 38/PB의 SBC를 구하고, PrAh-22 내지 38의 PrAh-21에 대한 상대 알칼리 내성(％)을 산출하였다.
(4) 알칼리 내성의 평가: PrAh-39 내지 41
리간드 고정화 입자(PrAh-21/PB 및 PrAh-39 내지 41/PB)를 (2)와 마찬가지의 수순으로, 단 1.0M NaOH 대신에 0.5M NaOH로 평형화시킨 후, 24시간 인큐베이트 하였다. 그 후는 (2)와 마찬가지의 방법으로, 알칼리에 폭로한 PrAh-21 및 39 내지 41/PB의 SBC를 구하고, PrAh-39 내지 41의 PrAh-21에 대한 상대 알칼리 내성(％)을 산출하였다.
(1)에서 측정한 SBC 및 (2) 내지 (4)에서 측정한 상대 알칼리 내성의 측정 결과를 표 7 내지 9에 나타내었다. PrAt-1 내지 29/PB의 SBC는 PrAt-0/PB와 비교하여 큰 상이는 보이지 않았다. 한편, PrAt-1 내지 29/PB의 상대 알칼리 내성은 PrAt-0/PB와 비교해서 14 내지 64％ 향상되어 있었다. 또한, PrAh-22 내지 38/PB는, SBC는 PrAh-21/PB와 비교하여 큰 상이는 보이지 않은 한편, 상대 알칼리 내성은 PrAh-21/PB와 비교해서 28 내지 69％ 향상되어 있었다. 또한, PrAh-39 내지 41/PB는, SBC는 PrAh-21/PB와 비교하여 큰 상이는 보이지 않은 한편, 상대 알칼리 내성은 PrAh-21/PB와 비교해서 22 내지 26％ 향상되어 있었다. 이들의 결과로부터, 변이 도메인을 포함하는 실시예 1 내지 3의 이뮤노글로불린 결합 단백질은 변이 도입 전과 비교하여 알칼리 내성이 높고, 1.0M 또는 0.5M 수산화나트륨에 24시간 폭로한다고 하는 비교적 가혹한 조건에 둔 후에도 항체 결합 활성을 유지할 수 있는 것이 나타났다.
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
시험예 2
실시예 5에서 제작한 변이 도메인을 포함하는 이뮤노글로불린 결합 단백질 PrAs-1 내지 PrAs-19에 대해서, 부모 도메인을 포함하는 이뮤노글로불린 결합 단백질 PrAs-0에 대한 상대 알칼리 내성을 평가하였다.
(1) 시료 용액의 조제
0.13mg의 이뮤노글로불린 결합 단백질(PrAs-0 및 PrAs-1 내지 19)을 1.0M 수산화나트륨 수용액 중에서 인큐베이트 하였다. 인큐베이트 개시 직후 또는 인큐베이트 개시 24시간 후에, 액을 1.0M 시트르산에 의해 중화하였다. 이어서 중화 용액을, 0.1％ 소 혈청 유래 알부민(와코 쥰야꾸 고교사제) 및 0.02％ Triton X-100(와코 쥰야꾸 고교사제)을 포함하는 D-PBS 버퍼를 사용하여 단백질 농도 10μg/mL에 희석하고, 시료 용액을 조제하였다. 이들 시료 용액에 대해서, PrAs-N(N=0 내지 19)을 수산화나트륨 중에서 인큐베이트 개시 직후에 중화한 시료 용액을 PrAs-Na로 하고, 인큐베이트 개시 24시간 후에 중화한 시료 용액을 PrAs-Nb로 한다.
(2) IgG 결합 바이오센서의 조제
1.0mg의 IgG를 3.9μg의 EZ-Link NHS-PEG4-Biotin(Thermo Fisher Scientific사제)과 반응시켜, IgG를 비오틴화하였다. 이것을 Octet RED 96e 시스템(Pall ForteBio사제)을 사용하여 스트렙트아비딘 바이오센서(Pall ForteBio사제)에 접촉시켜, 센서 상에 IgG를 고정화하였다.
(3) 알칼리 내성의 평가
Octet RED 96e 시스템을 사용하여 IgG 결합 바이오센서를 시료 용액에 접촉시켜서, 센서 상의 IgG에 이뮤노글로불린 결합 단백질을 결합시켰다. 센서 그램으로부터 결합 속도를 결정하고, PrAs-Na의 결합 속도에 대한 PrAs-Nb의 결합 속도의 상대값(결합 속도 유지율)을 산출하였다. 이어서, 이하의 식을 따라서 각 이뮤노글로불린 결합 단백질(PrAs-0 내지 19)의 PrAs-0에 대한 상대 알칼리 내성(％)을 산출하였다.
상대 알칼리 내성(％)={(PrAs-N(N=1 내지 19)의 결합 속도 유지율)/(PrAs-0의 결합 속도 유지율)}×100
PrAs-N(N=0 내지 19)의 결합 속도 유지율=(PrAs-N(N=0 내지 19)b의 결합 속도)/(PrAs-N(N=0 내지 19)a의 결합 속도)
상대 알칼리 내성의 측정 결과를 표 10에 나타내었다. PrAs-17 내지 19의 상대 알칼리 내성이 PrAs-0과 비교하여 저하되어 있었던 한편, PrAs-1 내지 16의 상대 알칼리 내성은 PrAs-0과 비교하여 60 내지 338％ 향상되어 있었다. 이들의 결과로부터, 변이 도메인을 포함하는 이뮤노글로불린 결합 단백질 PrAs-1 내지 16은 변이 도입 전과 비교하여 알칼리 내성이 높고, 1.0M 수산화나트륨에 24시간 폭로한다고 하는 비교적 가혹한 조건에 둔 후에도 항체 결합 활성을 유지할 수 있는 것이 나타났다.
Figure pct00010
시험예 3
실시예 5에서 제작한 이뮤노글로불린 결합 단백질(PrAs-0 및 PrAs-20 내지 22)에 대해서, 0.5M 수산화나트륨 수용액 중에서 인큐베이트 한 것 이외에는 시험예 2와 마찬가지의 수순으로 알칼리 내성을 산출하였다. 상대 알칼리 내성의 측정 결과를 표 11에 나타내었다. PrAs-20 내지 22는 상대 알칼리 내성이 PrAs-0과 비교해서 21 내지 31％ 향상되어 있었던 점에서, 변이 도입 전과 비교하여 알칼리 내성이 높은 것이 나타났다.
Figure pct00011
SEQUENCE LISTING <110> JSR Corporation <110> JSR Micro, Inc. <110> JSR Micro NV <120> Immunoglobrin Binding Protein and Affinity Support using the same <130> JSR0092 <150> JP 2018-157620 <151> 2018-08-24 <150> JP 2019-073529 <151> 2019-04-08 <160> 62 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 58 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <220> <223> Protein A, B domain <400> 1 Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 2 <211> 58 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <220> <223> Protein A, Z domain <400> 2 Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 3 <211> 58 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <220> <223> Protein A, C domain <400> 3 Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 4 <211> 61 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <220> <223> Protein A, D domain <400> 4 Ala Asp Ala Gln Gln Asn Asn Phe Asn Lys Asp Gln Gln Ser Ala Phe 1 5 10 15 Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Ala Gln Arg Asn Gly 20 25 30 Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Thr Asn Val Leu 35 40 45 Gly Glu Ala Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys 50 55 60 <210> 5 <211> 58 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <220> <223> Protein A, A domain <400> 5 Ala Asp Asn Asn Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 6 <211> 56 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <220> <223> Protein A, E domain <400> 6 Ala Gln His Asp Glu Ala Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Gln Val Leu Asn 1 5 10 15 Met Pro Asn Leu Asn Ala Asp Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu 20 25 30 Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Val Leu Gly Glu Ala Gln Lys 35 40 45 Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 7 <211> 58 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <220> <223> N3Q variant domain <400> 7 Val Asp Gln Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 8 <211> 57 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <220> <223> delta-K4 variant domain <400> 8 Val Asp Asn Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu 1 5 10 15 His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser 20 25 30 Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys 35 40 45 Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 9 <211> 58 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <220> <223> N6Q variant domain <400> 9 Val Asp Asn Lys Phe Gln Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 10 <211> 58 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <220> <223> N11Q variant domain <400> 10 Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Gln Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 11 <211> 58 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <220> <223> N3Q, N6Q, N11Q variant domain <400> 11 Val Asp Gln Lys Phe Gln Lys Glu Gln Gln Gln Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 12 <211> 58 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <220> <223> E24D variant domain <400> 12 Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Asp Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 13 <211> 58 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <220> <223> E25D variant domain <400> 13 Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 14 <211> 58 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <220> <223> S39K variant domain <400> 14 Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Lys Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 15 <211> 58 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <220> <223> S39R variant domain <400> 15 Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Arg Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 16 <211> 58 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <220> <223> A46D variant domain <400> 16 Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Asp Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 17 <211> 58 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <220> <223> A46E variant domain <400> 17 Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Glu Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 18 <211> 58 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <220> <223> A46K variant domain <400> 18 Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Lys Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 19 <211> 58 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <220> <223> A46R variant domain <400> 19 Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Arg Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 20 <211> 58 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <220> <223> K49R variant domain <400> 20 Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Arg Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 21 <211> 58 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <220> <223> K58R variant domain <400> 21 Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Arg 50 55 <210> 22 <211> 57 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <220> <223> delta-K58 variant domain <400> 22 Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro 50 55 <210> 23 <211> 58 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <220> <223> N3A, N11Q variant domain <400> 23 Val Asp Ala Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Gln Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 24 <211> 58 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <220> <223> N3D, N11Q variant domain <400> 24 Val Asp Asp Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Gln Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 25 <211> 58 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <220> <223> N6D, N11Q variant domain <400> 25 Val Asp Asn Lys Phe Asp Lys Glu Gln Gln Gln Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 26 <211> 58 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <220> <223> N3D, N6D, N11Q variant domain <400> 26 Val Asp Asp Lys Phe Asp Lys Glu Gln Gln Gln Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 27 <211> 58 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <220> <223> N3A, N6D, N11Q variant domain <400> 27 Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu Gln Gln Gln Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 28 <211> 58 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <220> <223> N11Q, T23R variant domain <400> 28 Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Gln Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Arg Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 29 <211> 58 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <220> <223> N11Q, T23L variant domain <400> 29 Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Gln Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Leu Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 30 <211> 58 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <220> <223> N11Q, T23S variant domain <400> 30 Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Gln Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Ser Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 31 <211> 58 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <220> <223> N11Q, K49R variant domain <400> 31 Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Gln Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Arg Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 32 <211> 58 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <220> <223> N11Q, T23R, K49R variant domain <400> 32 Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Gln Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Arg Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Arg Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 33 <211> 58 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <220> <223> N11Q, T23L, K49R variant domain <400> 33 Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Gln Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Leu Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Arg Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 34 <211> 58 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <220> <223> N11Q, T23S, K49R variant domain <400> 34 Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Gln Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Ser Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Arg Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 35 <211> 58 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <220> <223> N11Q, K58R variant domain <400> 35 Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Gln Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Arg 50 55 <210> 36 <211> 58 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <220> <223> T23R variant domain <400> 36 Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Arg Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 37 <211> 58 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <220> <223> T23L variant domain <400> 37 Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Leu Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 38 <211> 58 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <220> <223> T23S variant domain <400> 38 Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Ser Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 39 <211> 58 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <220> <223> N11A variant domain <400> 39 Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 40 <211> 58 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <220> <223> N11R variant domain <400> 40 Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Arg Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 41 <211> 58 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <220> <223> N11D variant domain <400> 41 Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asp Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 42 <211> 58 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <220> <223> N11C variant domain <400> 42 Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Cys Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 43 <211> 58 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <220> <223> N11E variant domain <400> 43 Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Glu Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 44 <211> 58 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <220> <223> N11H variant domain <400> 44 Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln His Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 45 <211> 58 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <220> <223> N11I variant domain <400> 45 Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Ile Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 46 <211> 58 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <220> <223> N11L variant domain <400> 46 Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Leu Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 47 <211> 58 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <220> <223> N11K variant domain <400> 47 Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Lys Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 48 <211> 58 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <220> <223> N11M variant domain <400> 48 Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Met Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 49 <211> 58 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <220> <223> N11F variant domain <400> 49 Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Phe Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 50 <211> 58 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <220> <223> N11T variant domain <400> 50 Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Thr Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 51 <211> 58 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <220> <223> N11W variant domain <400> 51 Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Trp Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 52 <211> 58 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <220> <223> N11Y variant domain <400> 52 Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Tyr Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 53 <211> 58 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <220> <223> N11V variant domain <400> 53 Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Val Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 54 <211> 58 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <220> <223> N11G variant domain <400> 54 Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Gly Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 55 <211> 58 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <220> <223> N11P variant domain <400> 55 Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Pro Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 56 <211> 58 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <220> <223> N11S variant domain <400> 56 Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 57 <211> 54 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <220> <223> Protein A, B domain variant <400> 57 Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro 1 5 10 15 Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp 20 25 30 Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn 35 40 45 Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 <210> 58 <211> 54 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <220> <223> Protein A, Z domain variant <400> 58 Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro 1 5 10 15 Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp 20 25 30 Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn 35 40 45 Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 <210> 59 <211> 54 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <220> <223> Protein A, C domain variant <400> 59 Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro 1 5 10 15 Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp 20 25 30 Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn 35 40 45 Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 <210> 60 <211> 54 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <220> <223> Protein A, D domain variant <400> 60 Phe Asn Lys Asp Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro 1 5 10 15 Asn Leu Asn Glu Ala Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp 20 25 30 Asp Pro Ser Gln Ser Thr Asn Val Leu Gly Glu Ala Lys Lys Leu Asn 35 40 45 Glu Ser Gln Ala Pro Lys 50 <210> 61 <211> 54 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <220> <223> Protein A, A domain variant <400> 61 Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro 1 5 10 15 Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp 20 25 30 Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ser Glu Ala Lys Lys Leu Asn 35 40 45 Glu Ser Gln Ala Pro Lys 50 <210> 62 <211> 54 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <220> <223> Protein A, E domain variant <400> 62 His Asp Glu Ala Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Gln Val Leu Asn Met Pro 1 5 10 15 Asn Leu Asn Ala Asp Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp 20 25 30 Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Val Leu Gly Glu Ala Gln Lys Leu Asn 35 40 45 Asp Ser Gln Ala Pro Lys 50

Claims (18)

  1. 서열 번호 1 내지 6 및 57 내지 62 중 어느 것의 아미노산 서열과 적어도 85％의 동일성을 갖는 아미노산 서열이며, 또한 이하의 (a) 내지 (f)로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 변이를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄를 포함하는, 이뮤노글로불린 결합 단백질:
    (a) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 3위치, 6위치, 11위치에 상당하는 위치로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 위치에 있어서의 아미노산 잔기의, 다른 아미노산 잔기로의 치환 혹은 결실, 또는 당해 위치의 전 혹은 후의 위치로의 다른 아미노산 잔기의 삽입;
    (b) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 24위치 및 25위치에 상당하는 위치로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 위치에 있어서의 아미노산 잔기의, 다른 아미노산 잔기로의 치환 혹은 결실, 또는 당해 위치의 전 혹은 후의 위치로의 다른 아미노산 잔기의 삽입;
    (c) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 39위치에 상당하는 위치에 있어서의 아미노산 잔기의, 다른 아미노산 잔기로의 치환 혹은 결실, 또는 당해 위치의 전 혹은 후의 위치로의 다른 아미노산 잔기의 삽입;
    (d) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 46위치에 상당하는 위치에 있어서의 아미노산 잔기의, 다른 아미노산 잔기로의 치환 혹은 결실, 또는 당해 위치의 전 혹은 후의 위치로의 다른 아미노산 잔기의 삽입;
    (e) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 4위치, 49위치 및 58위치에 상당하는 위치로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 위치에 있어서의 아미노산 잔기의, 다른 아미노산 잔기로의 치환 혹은 결실, 또는 당해 위치의 전 혹은 후의 위치로의 다른 아미노산 잔기의 삽입; 및
    (f) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 23위치에 상당하는 위치에 있어서의 아미노산 잔기의, 다른 아미노산 잔기로의 치환 혹은 결실, 또는 당해 위치의 전 혹은 후의 위치로의 다른 아미노산 잔기의 삽입.
  2. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩티드쇄가, 서열 번호 3의 아미노산 서열과 적어도 85％의 동일성을 갖고 또한 상기 (a) 내지 (f)로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 변이를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄인, 이뮤노글로불린 결합 단백질.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 (a) 내지 (f)로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 변이가,
    (a1) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 3위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Gln으로의 치환;
    (a2) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 3위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Ala로의 치환;
    (a3) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 3위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Asp로의 치환;
    (a4) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 6위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Gln으로의 치환;
    (a5) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 6위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Ala로의 치환;
    (a6) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 6위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Asp로의 치환;
    (a7) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Gln으로의 치환;
    (a8) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Ala로의 치환;
    (a9) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Arg로의 치환;
    (a10) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Asp로의 치환;
    (a11) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Cys로의 치환;
    (a12) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Glu로의 치환;
    (a13) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 His로의 치환;
    (a14) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Ile로의 치환;
    (a15) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Leu로의 치환;
    (a16) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Lys로의 치환;
    (a17) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Met로의 치환;
    (a18) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Phe로의 치환;
    (a19) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Thr로의 치환;
    (a20) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Trp로의 치환;
    (a21) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Tyr로의 치환;
    (a22) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Val로의 치환;
    (b1) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 24위치에 상당하는 위치에 있어서의 Glu로부터 Asp로의 치환;
    (b2) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 25위치에 상당하는 위치에 있어서의 Glu로부터 Asp로의 치환;
    (c1) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 39위치에 상당하는 위치에 있어서의 Ser로부터 Lys로의 치환;
    (c2) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 39위치에 상당하는 위치에 있어서의 Ser로부터 Arg로의 치환;
    (d1) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 46위치에 상당하는 위치에 있어서의 Ala로부터 Asp로의 치환;
    (d2) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 46위치에 상당하는 위치에 있어서의 Ala로부터 Glu로의 치환;
    (d3) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 46위치에 상당하는 위치에 있어서의 Ala로부터 Lys로의 치환;
    (d4) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 46위치에 상당하는 위치에 있어서의 Ala로부터 Arg로의 치환;
    (e1) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 4위치에 상당하는 위치에 있어서의 Lys의 결실;
    (e2) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 49위치에 상당하는 위치에 있어서의 Lys로부터 Arg로의 치환;
    (e3) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 58위치에 상당하는 위치에 있어서의 Lys의 결실;
    (e4) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 58위치에 상당하는 위치에 있어서의 Lys로부터 Arg로의 치환;
    (f1) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 23위치에 상당하는 위치에 있어서의 Thr로부터 Arg로의 치환;
    (f2) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 23위치에 상당하는 위치에 있어서의 Thr로부터 Leu로의 치환; 및
    (f3) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 23위치에 상당하는 위치에 있어서의 Thr로부터 Ser로의 치환
    으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 변이인, 이뮤노글로불린 결합 단백질.
  4. 제3항에 있어서, 상기 (a) 내지 (f)로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 변이가,
    (a1) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 3위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Gln으로의 치환;
    (a2) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 3위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Ala로의 치환;
    (a3) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 3위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Asp로의 치환;
    (a4) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 6위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Gln으로의 치환;
    (a5) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 6위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Ala로의 치환;
    (a6) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 6위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Asp로의 치환;
    (a7) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Gln으로의 치환;
    (a8) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Ala로의 치환;
    (a9) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Arg로의 치환;
    (a10) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Asp로의 치환;
    (a11) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Cys로의 치환;
    (a12) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Glu로의 치환;
    (a13) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 His로의 치환;
    (a14) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Ile로의 치환;
    (a15) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Leu로의 치환;
    (a16) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Lys로의 치환;
    (a17) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Met로의 치환;
    (a18) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Phe로의 치환;
    (a19) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Thr로의 치환;
    (a20) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Trp로의 치환;
    (a21) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Tyr로의 치환;
    (a22) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Val로의 치환;
    (a23) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 3위치, 6위치 및 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Gln으로의 치환;
    (a24) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 3위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Ala로의 치환, 및 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Gln으로의 치환;
    (a25) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 3위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Asp로의 치환, 및 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Gln으로의 치환;
    (a26) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 6위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Asp로의 치환, 및 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Gln으로의 치환;
    (a27) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 3위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Asp로의 치환, 6위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Asp로의 치환, 및 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Gln으로의 치환;
    (a28) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 3위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Ala로의 치환, 6위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Asp로의 치환, 및 11위치에 상당하는 위치에 있어서의 Asn으로부터 Gln으로의 치환;
    (b1) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 24위치에 상당하는 위치에 있어서의 Glu로부터 Asp로의 치환;
    (b2) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 25위치에 상당하는 위치에 있어서의 Glu로부터 Asp로의 치환;
    (c1) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 39위치에 상당하는 위치에 있어서의 Ser로부터 Lys로의 치환;
    (c2) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 39위치에 상당하는 위치에 있어서의 Ser로부터 Arg로의 치환;
    (d1) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 46위치에 상당하는 위치에 있어서의 Ala로부터 Asp로의 치환;
    (d2) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 46위치에 상당하는 위치에 있어서의 Ala로부터 Glu로의 치환;
    (d3) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 46위치에 상당하는 위치에 있어서의 Ala로부터 Lys로의 치환;
    (d4) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 46위치에 상당하는 위치에 있어서의 Ala로부터 Arg로의 치환;
    (e1) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 4위치에 상당하는 위치에 있어서의 Lys의 결실;
    (e2) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 49위치에 상당하는 위치에 있어서의 Lys로부터 Arg로의 치환;
    (e3) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 58위치에 상당하는 위치에 있어서의 Lys의 결실;
    (e4) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 58위치에 상당하는 위치에 있어서의 Lys로부터 Arg로의 치환;
    (f1) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 23위치에 상당하는 위치에 있어서의 Thr로부터 Arg로의 치환;
    (f2) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 23위치에 상당하는 위치에 있어서의 Thr로부터 Leu로의 치환; 및
    (f3) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 23위치에 상당하는 위치에 있어서의 Thr로부터 Ser로의 치환;
    (g1) (a7)과 (f1)의 조합;
    (g2) (a7)과 (f2)의 조합;
    (g3) (a7)과 (f3)의 조합;
    (g4) (a7)과 (e2)의 조합;
    (g5) (a7)과 (e4)의 조합;
    (g6) (a7)과 (f1)과 (e2)의 조합;
    (g7) (a7)과 (f2)와 (e2)의 조합; 및
    (g8) (a7)과 (f3)과 (e2)의 조합
    중 어느 1종인, 이뮤노글로불린 결합 단백질.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 (a) 내지 (f)로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 변이가, 서열 번호 3의 아미노산 서열의 3위치, 6위치, 11위치, 24위치, 25위치, 39위치, 46위치, 4위치, 49위치, 58위치 및 23위치 중 적어도 2개의 위치에 상당하는 위치에 있어서의 아미노산 잔기의, 다른 아미노산 잔기로의 치환 혹은 결실, 또는 당해 위치의 전 혹은 후의 위치로의 다른 아미노산 잔기의 삽입을 포함하는, 이뮤노글로불린 결합 단백질.
  6. 제5항에 있어서, 상기 적어도 1종의 변이가 상기 (a23) 내지 (a28) 중 어느 것이거나, 또는 상기 (a1) 내지 (a28) 중 어느 하나와 상기 (b1) 내지 (f3) 중 어느 하나 이상의 조합인, 이뮤노글로불린 결합 단백질.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아미노산 서열의 동일성이 적어도 90％인, 이뮤노글로불린 결합 단백질.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드쇄가, 서열 번호 3의 아미노산 서열의 1위치에 상당하는 위치에 있어서의 아미노산 잔기의 Val로의 치환, 및/또는 서열 번호 3의 아미노산 서열의 29위치에 상당하는 위치에 있어서의 아미노산 잔기의 Ala로의 치환을 더 포함하는, 이뮤노글로불린 결합 단백질.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드쇄를 2개 이상 포함하는, 이뮤노글로불린 결합 단백질.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 기재된 이뮤노글로불린 결합 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드.
  11. 제10항에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  12. 제11항에 기재된 벡터를 포함하는 형질 전환체.
  13. 고상 담체와, 해당 고상 담체에 결합한 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 기재된 이뮤노글로불린 결합 단백질을 포함하는, 어피니티 담체.
  14. 제13항에 기재된 어피니티 담체를 포함하는, 크로마토그래피 칼럼.
  15. 제13항에 기재된 어피니티 담체 또는 제14항에 기재된 크로마토그래피 칼럼을 사용하는, 항체 또는 그의 단편의 단리 방법.
  16. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 기재된 이뮤노글로불린 결합 단백질을, 제12항에 기재된 형질 전환체 혹은 무세포 단백질 합성계에 있어서 발현시키거나, 또는 화학 합성하는 것을 포함하는, 이뮤노글로불린 결합 단백질의 제조 방법.
  17. 변이 폴리펩티드쇄의 제조 방법이며,
    서열 번호 1 내지 6 및 57 내지 62 중 어느 것의 아미노산 서열 또는 이들과 적어도 85％의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 이뮤노글로불린 결합 활성을 갖는 폴리펩티드쇄에 대하여, 이하의 (a) 내지 (f)로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 변이를 도입하는 것을 포함하는, 방법:
    (a) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 3위치, 6위치, 11위치에 상당하는 위치로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 위치에 있어서의 아미노산 잔기의, 다른 아미노산 잔기로의 치환 혹은 결실, 또는 당해 위치의 전 혹은 후의 위치로의 다른 아미노산 잔기의 삽입;
    (b) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 24위치 및 25위치에 상당하는 위치로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 위치에 있어서의 아미노산 잔기의, 다른 아미노산 잔기로의 치환 혹은 결실, 또는 당해 위치의 전 혹은 후의 위치로의 다른 아미노산 잔기의 삽입;
    (c) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 39위치에 상당하는 위치에 있어서의 아미노산 잔기의, 다른 아미노산 잔기로의 치환 혹은 결실, 또는 당해 위치의 전 혹은 후의 위치로의 다른 아미노산 잔기의 삽입;
    (d) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 46위치에 상당하는 위치에 있어서의 아미노산 잔기의, 다른 아미노산 잔기로의 치환 혹은 결실, 또는 당해 위치의 전 혹은 후의 위치로의 다른 아미노산 잔기의 삽입;
    (e) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 4위치, 49위치 및 58위치에 상당하는 위치로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 위치에 있어서의 아미노산 잔기의, 다른 아미노산 잔기로의 치환 혹은 결실, 또는 당해 위치의 전 혹은 후의 위치로의 다른 아미노산 잔기의 삽입; 및
    (f) 서열 번호 3의 아미노산 서열의 23위치에 상당하는 위치에 있어서의 아미노산 잔기의, 다른 아미노산 잔기로의 치환 혹은 결실, 또는 당해 위치의 전 혹은 후의 위치로의 다른 아미노산 잔기의 삽입.
  18. 고상 담체에, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항 기재된 이뮤노글로불린 결합 단백질을 고정화하는 것을 포함하는, 어피니티 담체의 제조 방법.
KR1020217004997A 2018-08-24 2019-08-23 이뮤노글로불린 결합 단백질 및 그것을 사용한 어피니티 담체 KR20210049802A (ko)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2018157620 2018-08-24
JPJP-P-2018-157620 2018-08-24
JP2019073529 2019-04-08
JPJP-P-2019-073529 2019-04-08
PCT/JP2019/033138 WO2020040307A1 (ja) 2018-08-24 2019-08-23 イムノグロブリン結合タンパク質、及びそれを用いたアフィニティー担体

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20210049802A true KR20210049802A (ko) 2021-05-06

Family

ID=69593027

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020217004997A KR20210049802A (ko) 2018-08-24 2019-08-23 이뮤노글로불린 결합 단백질 및 그것을 사용한 어피니티 담체

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20210179671A1 (ko)
EP (1) EP3842536A4 (ko)
JP (2) JP7335881B2 (ko)
KR (1) KR20210049802A (ko)
CN (1) CN112639099A (ko)
TW (1) TW202024328A (ko)
WO (1) WO2020040307A1 (ko)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB202113626D0 (en) 2021-09-24 2021-11-10 Cytiva Bioprocess R & D Ab FC binding polypeptides
CN113999294B (zh) * 2021-12-30 2022-03-29 苏州纳微科技股份有限公司 免疫球蛋白结合蛋白及其应用
GB202203478D0 (en) 2022-03-14 2022-04-27 Cytiva Bioprocess R & D Ab Vh3 binding polypeptides
CN114605508B (zh) * 2022-05-11 2022-07-29 北京达成生物科技有限公司 能够结合于抗体分子Fc区域的抗体结合蛋白及其应用
WO2024029394A1 (ja) * 2022-08-01 2024-02-08 Jsr株式会社 クロマトグラフィー用担体の製造方法及びクロマトグラフィー用担体
CN115850408A (zh) * 2022-09-01 2023-03-28 西安蓝晓科技新材料股份有限公司 一种多肽、融合型多聚体蛋白质及其用途
CN117700501A (zh) * 2022-09-13 2024-03-15 普米斯生物技术(珠海)有限公司 免疫球蛋白结合蛋白及其应用
CN116217680B (zh) * 2023-01-10 2024-02-02 珠海冀百康生物科技有限公司 碱稳定性高的免疫球蛋白结合蛋白及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000023580A1 (en) 1998-10-21 2000-04-27 Affibody Technology Sweden Ab A method of affinity separation and ligands for use therein
WO2013109302A2 (en) 2011-06-08 2013-07-25 Emd Millipore Corporation Chromatography matrices including novel staphylococcus aureus protein a based ligands

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5151350A (en) 1982-10-27 1992-09-29 Repligen Corporation Cloned genes encoding recombinant protein a
SE9601368D0 (sv) 1996-04-11 1996-04-11 Pharmacia Biotech Ab Process for the production of a porous cross-linked polysaccharide gel
SE0200943D0 (sv) * 2002-03-25 2002-03-25 Amersham Biosciences Ab Mutant protein
EP1869071B1 (en) * 2005-03-01 2010-12-01 Affibody AB Tnf-alpha binding polypeptide, uses thereof and methods employing it
EP1966246A4 (en) 2005-12-05 2010-01-06 Trinity Biosystems Inc METHOD AND COMPOSITIONS FOR NEEDLE-FREE ADMINISTRATION OF ANTIBODIES
JP4179517B2 (ja) * 2006-02-21 2008-11-12 プロテノバ株式会社 イムノグロブリン親和性リガンド
JP5229888B2 (ja) 2008-09-30 2013-07-03 独立行政法人産業技術総合研究所 弱酸性域での易解離性を向上したプロテインａ変異型タンパク質及び抗体捕捉剤
SG195555A1 (en) 2008-12-24 2013-12-30 Emd Millipore Corp Caustic stable chromatography ligands
CN102272145B (zh) 2009-01-12 2014-07-30 通用电气健康护理生物科学股份公司 亲和色谱基质
US9403883B2 (en) 2009-03-24 2016-08-02 Kaneka Corporation Protein having affinity for immunoglobulin, and immunoglobulin-binding affinity ligand
EP2614371B1 (en) 2010-09-06 2017-04-05 GE Healthcare Bio-Sciences AB Method for labeling of compounds
EP2655404B1 (en) 2010-12-21 2017-11-15 The University of Western Ontario Novel alkali-resistant variants of protein a and their use in affinity chromatography
JP5933526B2 (ja) * 2011-03-25 2016-06-08 株式会社カネカ 免疫グロブリン結合性新規ポリペプチド
CN104640983A (zh) * 2012-09-21 2015-05-20 株式会社钟化 亲和分离基质用蛋白质配体
JP6544808B2 (ja) 2013-07-10 2019-07-17 ジーイー・ヘルスケア・バイオプロセス・アールアンドディ・アクチボラグ 突然変異免疫グロブリン結合ポリペプチド
EP3042954A4 (en) 2013-09-06 2017-03-22 Kaneka Corporation Dissociation capacity-boosted ligand for affinity dissociation matrix
US11566082B2 (en) 2014-11-17 2023-01-31 Cytiva Bioprocess R&D Ab Mutated immunoglobulin-binding polypeptides
KR20170115535A (ko) * 2015-02-05 2017-10-17 미쯔비시 케미컬 주식회사 면역 글로불린에 친화성을 갖는 단백질, 및 그것을 사용한 친화성 분리제, 액체 크로마토그래피용 칼럼
JP6705806B2 (ja) * 2015-03-26 2020-06-03 Jsr株式会社 イムノグロブリン結合タンパク質およびそれを用いたアフィニティー担体
DK3455244T3 (da) 2016-05-11 2022-06-07 Cytiva Bioprocess R & D Ab Muterede immunoglobulin-bindende polypeptider
KR101857953B1 (ko) 2016-07-06 2018-05-16 아미코젠주식회사 알칼리 내성이 증가된 변이 면역글로불린 결합 단백질

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000023580A1 (en) 1998-10-21 2000-04-27 Affibody Technology Sweden Ab A method of affinity separation and ligands for use therein
WO2013109302A2 (en) 2011-06-08 2013-07-25 Emd Millipore Corporation Chromatography matrices including novel staphylococcus aureus protein a based ligands

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Journal of Chromatography B, 2007, 848(1): 40-47

Also Published As

Publication number Publication date
TW202024328A (zh) 2020-07-01
EP3842536A4 (en) 2023-01-18
EP3842536A1 (en) 2021-06-30
CN112639099A (zh) 2021-04-09
US20210179671A1 (en) 2021-06-17
JP2023118846A (ja) 2023-08-25
JPWO2020040307A1 (ja) 2021-08-26
WO2020040307A1 (ja) 2020-02-27
JP7335881B2 (ja) 2023-08-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR20210049802A (ko) 이뮤노글로불린 결합 단백질 및 그것을 사용한 어피니티 담체
CN111108113B (zh) 免疫球蛋白结合蛋白质和使用其的亲和载体
CN105457612B (zh) 包括基于金黄色葡萄球菌a蛋白的新配体的层析基质
KR101461772B1 (ko) 친화성 크로마토그래피용 담체 및 면역 글로불린을 단리하는 방법
KR102577963B1 (ko) 이뮤노글로불린 결합 단백질 및 그것을 사용한 친화성 담체
CN111148753B (zh) 免疫球蛋白结合蛋白质和使用其的亲和载体
KR20180004851A (ko) 친화성 크로마토그래피용 충전제 및 면역글로불린을 단리하는 방법
KR102578538B1 (ko) 친화성 담체 및 이뮤노글로불린을 단리하는 방법
US20220242975A1 (en) Immunoglobulin-binding protein and affinity support using same
JP2020198783A (ja) アフィニティークロマトグラフィーリガンド

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination