TW202024328A - 免疫球蛋白結合蛋白質，及使用其之親和擔體 - Google Patents
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Abstract
本發明係提供耐鹼性提升之親和擔體。一種親和擔體，其包含：包含變異多肽鏈之免疫球蛋白結合蛋白質，及結合該免疫球蛋白結合蛋白質之固相擔體。該變異多肽鏈係由與序列編號1~6及57~62中之任一者所示之胺基酸序列具有至少85%的同一性且具有給定的變異之胺基酸序列所組成，具有免疫球蛋白結合活性。
Description
本發明係關於免疫球蛋白結合蛋白質，使用其之親和擔體，以及使用該親和擔體之抗體之單離方法。
抗體在近年來已被廣泛利用於研究用試藥、抗體醫藥等。此等試藥或醫藥用之抗體一般係歷經透過親和層析之精製而予以製造。在抗體的親和精製中，係使用將屬於會與免疫球蛋白進行特異性結合之物質之配位子加以固定化而得之管柱，在該配位子中，一般係使用蛋白A等免疫球蛋白結合蛋白質。
蛋白A為源自革蘭氏陽性細菌金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)之細胞壁蛋白質。蛋白A具有被稱為E結構域、D結構域、A結構域、B結構域及C結構域之5個免疫球蛋白結合結構域，各結構域可單獨結合至免疫球蛋白。連同蛋白A的天然型免疫球蛋白結合結構域，對此等施加蛋白質工學改造而得之改造免疫球蛋白結合結構域亦同樣已被利用作為親和精製用之配位子。
抗體的親和精製用管柱通常係以鹼性溶液洗淨並重複使用。但是，由於蛋白A的天然型免疫球蛋白結合結構域係耐鹼性較低，因而將該天然型結構域加以固定化而得之親和精製用管柱在重複使用之間，抗體結合性會大幅降低。於是，已開發出使耐鹼性提升之改造蛋白A結構域。例如，廣泛已知蛋白A的免疫球蛋白結合結構域會因將其胺基酸序列的29位之Gly取代成Ala，而化學安定性提升(非專利文獻1)。在專利文獻1中，已揭示藉由將免疫球蛋白結合結構域之胺基酸序列中之Asn取代成Gln及Cys以外之胺基酸，或者使其發生缺失，而使該結構域的耐鹼性提升之手法。再者，在專利文獻2中，已揭示藉由在蛋白A的C、B或Z結構域中，使自N末端起由位置1或2開始之3個以上連續的胺基酸發生缺失，而使該結構域的耐鹼性提升之手法。
[先前技術文獻]
[專利文獻]
[專利文獻1]國際公開公報第2000/023580號
[專利文獻2]國際公開公報第2013/109302號
[非專利文獻]
[非專利文獻1]Journal of Chromatography B, 2007, 848(1):40-47
[發明所欲解決之課題]
正謀求耐鹼性更加提升之親和擔體。本發明係提供含有源自免疫球蛋白結合結構域之耐鹼性提升之變異多肽鏈之免疫球蛋白結合蛋白質，及使用其之親和擔體。此外，本發明係提供使用該親和擔體之抗體之單離方法。
[解決課題之手段]
本發明係提供以下者。
[1]一種免疫球蛋白結合蛋白質，其包含多肽鏈，該多肽鏈係由屬於與序列編號1~6及57~62中之任一者的胺基酸序列具有至少85%的同一性之胺基酸序列，且具有選自由以下(a)~(f)所組成之群組之至少1種變異之胺基酸序列所組成：
(a)在選自由相當於序列編號3的胺基酸序列的3位、6位、11位之位置所組成之群組之至少一個位置之胺基酸殘基的成為其他胺基酸殘基的取代或缺失，或其他胺基酸殘基向該位置之前或後之位置的插入；
(b)在選自由相當於序列編號3的胺基酸序列的24位及25位之位置所組成之群組之至少一個位置之胺基酸殘基的成為其他胺基酸殘基的取代或缺失，或其他胺基酸殘基向該位置之前或後之位置的插入；
(c)在相當於序列編號3的胺基酸序列的39位之位置之胺基酸殘基的成為其他胺基酸殘基的取代或缺失，或其他胺基酸殘基向該位置之前或後之位置的插入；
(d)在相當於序列編號3的胺基酸序列的46位之位置之胺基酸殘基的成為其他胺基酸殘基的取代或缺失，或其他胺基酸殘基向該位置之前或後之位置的插入；
(e)在選自由相當於序列編號3的胺基酸序列的4位、49位及58位之位置所組成之群組之至少一個位置之胺基酸殘基的成為其他胺基酸殘基的取代或缺失，或其他胺基酸殘基向該位置之前或後之位置的插入；以及
(f)在相當於序列編號3的胺基酸序列的23位之位置之胺基酸殘基的成為其他胺基酸殘基的取代或缺失，或其他胺基酸殘基向該位置之前或後之位置的插入。
[2]如[1]所記載之免疫球蛋白結合蛋白質，其中，前述多肽鏈為由與序列編號3的胺基酸序列具有至少85%的同一性且具有選自由前述(a)~(f)所組成之群組之至少1種變異之胺基酸序列所組成之多肽鏈。
[3]如[1]或[2]所記載之免疫球蛋白結合蛋白質，其中，選自由前述(a)~(f)所組成之群組之至少1種變異為選自由下列者所組成之群組之至少1種變異：
(a1
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的3位之位置之由Asn成為Gln的取代；
(a2
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的3位之位置之由Asn成為Ala的取代；
(a3
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的3位之位置之由Asn成為Asp的取代；
(a4
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的6位之位置之由Asn成為Gln的取代；
(a5
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的6位之位置之由Asn成為Ala的取代；
(a6
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的6位之位置之由Asn成為Asp的取代；
(a7
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的11位之位置之由Asn成為Gln的取代；
(a8
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的11位之位置之由Asn成為Ala的取代；
(a9
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的11位之位置之由Asn成為Arg的取代；
(a10
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的11位之位置之由Asn成為Asp的取代；
(a11
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的11位之位置之由Asn成為Cys的取代；
(a12
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的11位之位置之由Asn成為Glu的取代；
(a13
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的11位之位置之由Asn成為His的取代；
(a14
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的11位之位置之由Asn成為Ile的取代；
(a15
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的11位之位置之由Asn成為Leu的取代；
(a16
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的11位之位置之由Asn成為Lys的取代；
(a17
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的11位之位置之由Asn成為Met的取代；
(a18
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的11位之位置之由Asn成為Phe的取代；
(a19
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的11位之位置之由Asn成為Thr的取代；
(a20
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的11位之位置之由Asn成為Trp的取代；
(a21
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的11位之位置之由Asn成為Tyr的取代；
(a22
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的11位之位置之由Asn成為Val的取代；
(b1
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的24位之位置之由Glu成為Asp的取代；
(b2
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的25位之位置之由Glu成為Asp的取代；
(c1
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的39位之位置之由Ser成為Lys的取代；
(c2
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的39位之位置之由Ser成為Arg的取代；
(d1
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的46位之位置之由Ala成為Asp的取代；
(d2
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的46位之位置之由Ala成為Glu的取代；
(d3
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的46位之位置之由Ala成為Lys的取代；
(d4
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的46位之位置之由Ala成為Arg的取代；
(e1
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的4位之位置之Lys的缺失；
(e2
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的49位之位置之由Lys成為Arg的取代；
(e3
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的58位之位置之Lys的缺失；
(e4
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的58位之位置之由Lys成為Arg的取代；
(f1
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的23位之位置之由Thr成為Arg的取代；
(f2
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的23位之位置之由Thr成為Leu的取代；以及
(f3
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的23位之位置之由Thr成為Ser的取代。
[4]如[3]所記載之免疫球蛋白結合蛋白質，其中，選自由前述(a)~(f)所組成之群組之至少1種變異為下列者中之任1種：
(a1
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的3位之位置之由Asn成為Gln的取代；
(a2
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的3位之位置之由Asn成為Ala的取代；
(a3
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的3位之位置之由Asn成為Asp的取代；
(a4
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的6位之位置之由Asn成為Gln的取代；
(a5
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的6位之位置之由Asn成為Ala的取代；
(a6
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的6位之位置之由Asn成為Asp的取代；
(a7
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的11位之位置之由Asn成為Gln的取代；
(a8
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的11位之位置之由Asn成為Ala的取代；
(a9
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的11位之位置之由Asn成為Arg的取代；
(a10
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的11位之位置之由Asn成為Asp的取代；
(a11
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的11位之位置之由Asn成為Cys的取代；
(a12
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的11位之位置之由Asn成為Glu的取代；
(a13
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的11位之位置之由Asn成為His的取代；
(a14
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的11位之位置之由Asn成為Ile的取代；
(a15
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的11位之位置之由Asn成為Leu的取代；
(a16
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的11位之位置之由Asn成為Lys的取代；
(a17
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的11位之位置之由Asn成為Met的取代；
(a18
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的11位之位置之由Asn成為Phe的取代；
(a19
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的11位之位置之由Asn成為Thr的取代；
(a20
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的11位之位置之由Asn成為Trp的取代；
(a21
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的11位之位置之由Asn成為Tyr的取代；
(a22
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的11位之位置之由Asn成為Val的取代；
(a23
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的3位、6位及11位之位置之由Asn成為Gln的取代；
(a24
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的3位之位置之由Asn成為Ala的取代，及在相當於11位之位置之由Asn成為Gln的取代；
(a25
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的3位之位置之由Asn成為Asp的取代，及在相當於11位之位置之由Asn成為Gln的取代；
(a26
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的6位之位置之由Asn成為Asp的取代，及在相當於11位之位置之由Asn成為Gln的取代；
(a27
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的3位之位置之由Asn成為Asp的取代，在相當於6位之位置之由Asn成為Asp的取代，及在相當於11位之位置之由Asn成為Gln的取代；
(a28
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的3位之位置之由Asn成為Ala的取代，在相當於6位之位置之由Asn成為Asp的取代，及在相當於11位之位置之由Asn成為Gln的取代；
(b1
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的24位之位置之由Glu成為Asp的取代；
(b2
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的25位之位置之由Glu成為Asp的取代；
(c1
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的39位之位置之由Ser成為Lys的取代；
(c2
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的39位之位置之由Ser成為Arg的取代；
(d1
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的46位之位置之由Ala成為Asp的取代；
(d2
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的46位之位置之由Ala成為Glu的取代；
(d3
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的46位之位置之由Ala成為Lys的取代；
(d4
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的46位之位置之由Ala成為Arg的取代；
(e1
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的4位之位置之Lys的缺失；
(e2
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的49位之位置之由Lys成為Arg的取代；
(e3
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的58位之位置之Lys的缺失；
(e4
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的58位之位置之由Lys成為Arg的取代；
(f1
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的23位之位置之由Thr成為Arg的取代；
(f2
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的23位之位置之由Thr成為Leu的取代；
(f3
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的23位之位置之由Thr成為Ser的取代；
(g1
)(a7
)與(f1
)之組合；
(g2
)(a7
)與(f2
)之組合；
(g3
)(a7
)與(f3
)之組合；
(g4
)(a7
)與(e2
)之組合；
(g5
)(a7
)與(e4
)之組合；
(g6
)(a7
)與(f1
)與(e2
)之組合；
(g7
)(a7
)與(f2
)與(e2
)之組合；以及
(g8
)(a7
)與(f3
)與(e2
)之組合。
[5]如[1]~[4]中任一項所記載之免疫球蛋白結合蛋白質，其中，選自由前述(a)~(f)所組成之群組之至少1種變異包含在相當於序列編號3的胺基酸序列的3位、6位、11位、24位、25位、39位、46位、4位、49位、58位及23位中之至少二個位置之位置之胺基酸殘基的成為其他胺基酸殘基的取代或缺失，或其他胺基酸殘基向該位置之前或後之位置的插入。
[6]如[5]所記載之免疫球蛋白結合蛋白質，其中，前述至少1種變異為前述(a23
)~(a28
)中之任一者，或前述(a1
)~(a28
)中之任1者與前述(b1
)~(f3
)中之任1者以上之組合。
[7]如[1]~[6]中任一項所記載之免疫球蛋白結合蛋白質，其中，前述胺基酸序列的同一性至少為90%。
[8]如[1]~[7]中任一項所記載之免疫球蛋白結合蛋白質，其中，前述多肽鏈進一步包含在相當於序列編號3的胺基酸序列的1位之位置之胺基酸殘基的成為Val的取代，及/或在相當於序列編號3的胺基酸序列的29位之位置之胺基酸殘基的成為Ala的取代。
[9]如[1]~[8]中任一項所記載之免疫球蛋白結合蛋白質，其中，包含2個以上前述多肽鏈。
[10]一種多核苷酸，其編碼出[1]~[9]中任一項所記載之免疫球蛋白結合蛋白質。
[11]一種載體，其包含[10]所記載之多核苷酸。
[12]一種轉形體，其包含[11]所記載之載體。
[13]一種親和擔體，其包含固相擔體，及結合至該固相擔體之[1]~[9]中任一項所記載之免疫球蛋白結合蛋白質。
[14]一種層析管柱，其包含[13]之親和擔體。
[15]一種抗體或其片段之單離方法，其使用[13]所記載之親和擔體或[14]所記載之層析管柱。
[16]一種免疫球蛋白結合蛋白質之製造方法，其包含在[12]所記載之轉形體，或無細胞蛋白質合成系統中使[1]~[9]中任一項所記載之免疫球蛋白結合蛋白質進行表現，或者將該免疫球蛋白結合蛋白質進行化學合成。
[17]一種變異多肽鏈之製造方法，該方法包含對由序列編號1~6及57~62中之任一者的胺基酸序列或與此等具有至少85%的同一性之胺基酸序列所組成，且具有免疫球蛋白結合活性之多肽鏈，導入選自由以下(a)~(f)所組成之群組之至少1種變異：
(a)在選自由相當於序列編號3的胺基酸序列的3位、6位、11位之位置所組成之群組之至少一個位置之胺基酸殘基的成為其他胺基酸殘基的取代或缺失，或其他胺基酸殘基向該位置之前或後之位置的插入；
(b)在選自由相當於序列編號3的胺基酸序列的24位及25位之位置所組成之群組之至少一個位置之胺基酸殘基的成為其他胺基酸殘基的取代或缺失，或其他胺基酸殘基向該位置之前或後之位置的插入；
(c)在相當於序列編號3的胺基酸序列的39位之位置之胺基酸殘基的成為其他胺基酸殘基的取代或缺失，或其他胺基酸殘基向該位置之前或後之位置的插入；
(d)在相當於序列編號3的胺基酸序列的46位之位置之胺基酸殘基的成為其他胺基酸殘基的取代或缺失，或其他胺基酸殘基向該位置之前或後之位置的插入；
(e)在選自由相當於序列編號3的胺基酸序列的4位、49位及58位之位置所組成之群組之至少一個位置之胺基酸殘基的成為其他胺基酸殘基的取代或缺失，或其他胺基酸殘基向該位置之前或後之位置的插入；以及
(f)在相當於序列編號3的胺基酸序列的23位之位置之胺基酸殘基的成為其他胺基酸殘基的取代或缺失，或其他胺基酸殘基向該位置之前或後之位置的插入。
[18]一種親和擔體之製造方法，其包含將[1]~[9]中任一項所記載之免疫球蛋白結合蛋白質固定化至固相擔體。
[發明效果]
本發明之變異多肽鏈及含有其之免疫球蛋白結合蛋白質具有免疫球蛋白結合活性，且耐鹼性提升。從而，本發明之免疫球蛋白結合蛋白質有用於作為親和配位子。將該免疫球蛋白結合蛋白質加以固定化而得之本發明之親和擔體係即便在實施使用鹼性溶液之重複洗淨(Cleaning-in-place，之後亦稱為CIP)後亦可維持免疫球蛋白結合活性。
在本說明書中，胺基酸序列或核苷酸序列的同一性可使用Karlin及Altschul所得之演算法BLAST(Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90:5873-5877)予以決定。已基於此BLAST演算法，開發出被稱為BLASTN、BLASTX、BLASTP、TBLASTN及TBLASTX之程式(J. Mol. Biol., 1990, 215:403-410)。在使用此等程式之情況，可使用各程式之預設參數。此等解析方法之具體的手法係屬公知(參照[www.ncbi.nlm.nih.gov])。
在本說明書中，所謂與胺基酸序列及核苷酸序列相關之「至少85%的同一性」，係指85%以上的同一性，較佳為90%以上的同一性，更佳為95%以上的同一性，再佳為97%以上的同一性，再佳為98%以上的同一性，再更佳為99%以上的同一性。此外，所謂與胺基酸序列及核苷酸序列相關之「至少90%的同一性」，係指90%以上的同一性，較佳為95%以上的同一性，再佳為97%以上的同一性，再佳為98%以上的同一性，再更佳為99%以上的同一性。
在本說明書中，胺基酸序列及核苷酸序列上之「相當之位置」可藉由使目標序列與參照序列(例如序列編號3的胺基酸序列)以對各胺基酸序列或核苷酸序列中所存在之保留胺基酸殘基或核苷酸給予最大的相同性之方式進行排列(比對)而予以決定。比對可使用公知的演算法實行，其順序對熟習該項技術者而言屬公知。例如，比對可藉由以預設設定使用Clustal W多重比對程式(Thompson, J. D. et al, 1994, Nucleic Acids Res., 22:4673-4680)而施行。Clustal W可例如在歐洲生物資訊研究所(European Bioinformatics Institute：EBI[www.ebi.ac.uk/index.html])或日本國立遺傳學研究所管理之日本DNA資料庫(DDBJ[www.ddbj.nig.ac.jp/index.html])的網站上進行利用。
在本說明書中，胺基酸殘基亦以下列簡寫符號記載：丙胺酸(Ala或A)，精胺酸(Arg或R)，天冬醯胺酸(Asn或N)，天冬胺酸(Asp或D)，半胱胺酸(Cys或C)，麩醯胺酸(Gln或Q)，麩胺酸(Glu或E)，甘胺酸(Gly或G)，組胺酸(His或H)，異白胺酸(Ile或I)，白胺酸(Leu或L)，離胺酸(Lys或K)，甲硫胺酸(Met或M)，苯丙胺酸(Phe或F)，脯胺酸(Pro或P)，絲胺酸(Ser或S)，蘇胺酸(Thr或T)，色胺酸(Trp或W)，酪胺酸(Tyr或Y)，纈胺酸(Val或V)，及任意的胺基酸殘基(Xaa或X)。此外，在本說明書中，胜肽之胺基酸序列係依常法以胺基末端(以下稱為N末端)位於左側，羧基末端(以下稱為C末端)位於右側之方式加以記載。
在本說明書中，所謂相對於胺基酸序列的特定位置之「前」及「後」之位置，係分別指鄰接於該特定位置的N末端側及C末端側之位置。例如，在胺基酸殘基向特定位置之「前」及「後」之位置插入之情況，插入後之胺基酸殘基係配置於鄰接於該特定位置的N末端側及C末端側之位置。
在本說明書中，所謂「免疫球蛋白結合蛋白質」，係指具有對抗體或其片段之結合活性之蛋白質。本說明書中之「抗體」可包含例如IgG、IgA、IgD、IgE、IgM及此等之次類別等任意類別的免疫球蛋白，其片段，該等之變異體。此外，本說明書中之「抗體」亦可為人類化抗體等嵌合抗體，抗體複合體，及包含抗原識別部位之其他免疫球蛋白修飾體等。此外，本說明書中之「抗體的片段」可為包含抗原識別部位之抗體的片段，亦可為不包含抗原識別部位之抗體的片段。作為不包含抗原識別部位之抗體的片段，可列舉例如僅由免疫球蛋白的Fc區域所組成之蛋白質，Fc融合蛋白質，及該等之變異體或修飾體等。
在本說明書中，所謂「免疫球蛋白結合結構域」，係指免疫球蛋白結合蛋白質中所包含之單獨具有免疫球蛋白(或者抗體或抗體的片段)結合活性之多肽的機能單位。作為該「免疫球蛋白結合結構域」之較佳例，可列舉蛋白A的免疫球蛋白結合結構域，以及具有免疫球蛋白結合活性之其變異體。
1.免疫球蛋白結合蛋白質
本發明之免疫球蛋白結合蛋白質包含至少一個源自於金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的蛋白A(以下，亦稱為SpA)的免疫球蛋白結合結構域之變異多肽鏈。本發明之免疫球蛋白結合蛋白質中所包含之該變異多肽鏈為具有免疫球蛋白結合活性之多肽鏈，在以下本說明書中，亦稱為「本發明之變異免疫球蛋白結合結構域」。該本發明之變異免疫球蛋白結合結構域可藉由在屬於親結構域之源自SpA之免疫球蛋白結合結構域或其變異體中加入給定的變異而獲得。該本發明之變異免疫球蛋白結合結構域具有免疫球蛋白結合活性，且與親結構域相比，耐鹼性提升。含有該本發明之變異免疫球蛋白結合結構域之本發明之免疫球蛋白結合蛋白質可使用作為親和擔體之配位子。
作為本發明之變異免疫球蛋白結合結構域之親結構域，可列舉SpA的免疫球蛋白結合結構域，例如A結構域、B結構域、C結構域、D結構域、E結構域或屬於B結構域之改造型結構域之Z結構域及該等之變異體。該等之中，較佳為B結構域、Z結構域、C結構域及其變異體，更佳為C結構域及其變異體。
SpA的B結構域、Z結構域、C結構域、D結構域、A結構域及E結構域以及該等之變異體可使用作為本發明之變異免疫球蛋白結合結構域之親結構域。SpA的B結構域為由序列編號1的胺基酸序列所組成之多肽鏈。作為該B結構域之變異體，可列舉由與序列編號1的胺基酸序列具有至少85%的同一性之胺基酸序列所組成，且具有免疫球蛋白結合活性之多肽鏈。SpA的Z結構域為由序列編號2的胺基酸序列所組成之多肽鏈。作為該Z結構域之變異體，可列舉由與序列編號2的胺基酸序列具有至少85%的同一性之胺基酸序列所組成，且具有免疫球蛋白結合活性之多肽鏈。SpA的C結構域為由序列編號3的胺基酸序列所組成之多肽鏈。作為該C結構域之變異體，可列舉由與序列編號3的胺基酸序列具有至少85%的同一性之胺基酸序列所組成，且具有免疫球蛋白結合活性之多肽鏈。SpA的D結構域為由序列編號4的胺基酸序列所組成之多肽鏈。作為該D結構域之變異體，可列舉由與序列編號4的胺基酸序列具有至少85%的同一性之胺基酸序列所組成，且具有免疫球蛋白結合活性之多肽鏈。SpA的A結構域為由序列編號5的胺基酸序列所組成之多肽鏈。作為該A結構域之變異體，可列舉由與序列編號5的胺基酸序列具有至少85%的同一性之胺基酸序列所組成，且具有免疫球蛋白結合活性之多肽鏈。SpA的E結構域為由序列編號6的胺基酸序列所組成之多肽鏈。作為該E結構域之變異體，可列舉由與序列編號6的胺基酸序列具有至少85%的同一性之胺基酸序列所組成，且具有免疫球蛋白結合活性之多肽鏈。
從而，作為本發明中之較佳的親結構域之例，可列舉由序列編號1~6中之任一者的胺基酸序列所組成之多肽鏈，及由與序列編號1~6中之任一者的胺基酸序列具有至少85%的同一性之胺基酸序列所組成，且具有免疫球蛋白結合活性之多肽鏈。作為更佳的親結構域之例，可列舉由序列編號1~3中之任一者的胺基酸序列所組成之多肽鏈，及由與序列編號1~3中之任一者的胺基酸序列具有至少85%的同一性之胺基酸序列所組成，且具有免疫球蛋白結合活性之多肽鏈。作為再佳的親結構域之例，可列舉由序列編號3的胺基酸序列所組成之多肽鏈，及由與序列編號3的胺基酸序列具有至少85%的同一性之胺基酸序列所組成，且具有免疫球蛋白結合活性之多肽鏈。
由轉形體中之蛋白質的表現量增加之觀點(PNAS, 1989, 86:8247-8251, Fig.2)，或編碼出連結複數個結構域而得之免疫球蛋白結合蛋白質之多核苷酸的製作變得容易之觀點(WO2010/110288)而言，該親結構域亦可包含在相當於序列編號3的胺基酸序列的1位之位置之由Ala成為Val的取代。此外，由免疫球蛋白結合蛋白質的化學安定性提升且耐鹼性增大之觀點而言，該親結構域亦可進一步包含在相當於序列編號3的胺基酸序列的29位之位置之由Gly成為Ala的取代(非專利文獻1)。
已報導天然免疫球蛋白結合結構域的N末端區域發生缺失之具有相比於該天然免疫球蛋白結合結構域而言安定性更高的蛋白質結構之免疫球蛋白結合結構域變異體(WO2013/109302、WO2017/194596等)。從而，該親結構域在具有免疫球蛋白結合活性之前提下，亦可為使相當於序列編號1~6中之任一者的胺基酸序列的N末端起至少2個殘基(例如2個殘基、4個殘基、6個殘基或7個殘基)之胺基酸殘基發生缺失而得之免疫球蛋白結合結構域變異體。作為該種親結構域之例，可列舉由序列編號57~62的胺基酸序列所組成之多肽鏈，此等分別為使序列編號1~6的胺基酸序列的N末端2~7個殘基發生缺失而得之變異免疫球蛋白結合結構域。
從而，針對上述之親結構域之與序列編號1~6中之任一者的胺基酸序列具有至少85%的同一性之胺基酸序列亦可為序列編號57~62中之任一者的胺基酸序列，或與此等具有至少85%的同一性之胺基酸序列。再者，該與序列編號1~6中之任一者的胺基酸序列具有至少85%的同一性之胺基酸序列亦可在相當於序列編號3的胺基酸序列的1位之位置包含Val，及/或在相當於序列編號3的胺基酸序列的29位之位置包含Ala。
該SpA的免疫球蛋白結合結構域之變異體可藉由對SpA的免疫球蛋白結合結構域之胺基酸序列施以胺基酸殘基的插入、刪除、取代或缺失，或胺基酸殘基的化學修飾等改造而予以製作。作為胺基酸殘基的插入、刪除、取代或缺失之手段，可列舉對編碼出該結構域之多核苷酸之部位特異突變(Site-specific mutation)等公知的手段。
本發明之變異免疫球蛋白結合結構域為對上述之親結構域，導入選自由以下(a)~(f)所組成之群組之至少1種變異所獲得之多肽鏈：
(a)在選自由相當於序列編號3的胺基酸序列的3位、6位及11位之位置所組成之群組之至少一個位置之胺基酸殘基的成為其他胺基酸殘基的取代或缺失，或其他胺基酸殘基向該位置之前或後之位置的插入；
(b)在選自由相當於序列編號3的胺基酸序列的24位及25位之位置所組成之群組之至少一個位置之胺基酸殘基的成為其他胺基酸殘基的取代或缺失，或其他胺基酸殘基向該位置之前或後之位置的插入；
(c)在相當於序列編號3的胺基酸序列的39位之位置之胺基酸殘基的成為其他胺基酸殘基的取代或缺失，或其他胺基酸殘基向該位置之前或後之位置的插入；
(d)在相當於序列編號3的胺基酸序列的46位之位置之胺基酸殘基的成為其他胺基酸殘基的取代或缺失，或其他胺基酸殘基向該位置之前或後之位置的插入；
(e)在選自由相當於序列編號3的胺基酸序列的4位、49位及58位之位置所組成之群組之至少一個位置之胺基酸殘基的成為其他胺基酸殘基的取代或缺失，或其他胺基酸殘基向該位置之前或後之位置的插入；以及
(f)在相當於序列編號3的胺基酸序列的23位之位置之胺基酸殘基的成為其他胺基酸殘基的取代或缺失，或其他胺基酸殘基向該位置之前或後之位置的插入。
該(a)之變異為在選自由相當於序列編號3的胺基酸序列的3位、6位及11位之位置所組成之群組之至少一個位置之胺基酸殘基的成為其他胺基酸殘基的取代或缺失，或其他胺基酸殘基向該位置之前或後之位置的插入。在該相當於3位、6位及11位之位置，該取代前之胺基酸殘基較佳為Asn，對此等進行取代之該其他胺基酸殘基較佳為Ser以外之胺基酸殘基，更佳為Ala、Arg、Asp、Cys、Gln、Glu、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Thr、Trp、Tyr或Val，再佳為Gln。該(a)之變異可為在相當於序列編號3的胺基酸序列的3位、6位或11位之位置之胺基酸殘基的單獨變異，亦可為在該相當於3位、6位及11位之位置之胺基酸殘基中之2個或3個發生變異而得之多重變異。例如，該(a)之變異可為在相當於序列編號3的胺基酸序列的3位、6位或11位之位置之胺基酸殘基的單獨取代，亦可為將在該相當於3位、6位及11位之位置之胺基酸殘基中之2個或3個進行取代而得之多重取代。較佳係該(a)之變異為(a1
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的3位之位置之由Asn成為Gln的取代，(a2
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的3位之位置之由Asn成為Ala的取代，(a3
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的3位之位置之由Asn成為Asp的取代，(a4
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的6位之位置之由Asn成為Gln的取代，(a5
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的6位之位置之由Asn成為Ala的取代，(a6
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的6位之位置之由Asn成為Asp的取代，(a7
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的11位之位置之由Asn成為Gln的取代，(a8
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的11位之位置之由Asn成為Ala的取代，(a9
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的11位之位置之由Asn成為Arg的取代，(a10
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的11位之位置之由Asn成為Asp的取代，(a11
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的11位之位置之由Asn成為Cys的取代，(a12
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的11位之位置之由Asn成為Glu的取代，(a13
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的11位之位置之由Asn成為His的取代，(a14
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的11位之位置之由Asn成為Ile的取代，(a15
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的11位之位置之由Asn成為Leu的取代，(a16
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的11位之位置之由Asn成為Lys的取代，(a17
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的11位之位置之由Asn成為Met的取代，(a18
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的11位之位置之由Asn成為Phe的取代，(a19
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的11位之位置之由Asn成為Thr的取代，(a20
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的11位之位置之由Asn成為Trp的取代，(a21
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的11位之位置之由Asn成為Tyr的取代，(a22
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的11位之位置之由Asn成為Val的取代，(a23
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的3位、6位及11位之位置之由Asn成為Gln的取代，(a24
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的3位之位置之由Asn成為Ala的取代，及在相當於11位之位置之由Asn成為Gln的取代，(a25
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的3位之位置之由Asn成為Asp的取代，及在相當於11位之位置之由Asn成為Gln的取代，(a26
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的6位之位置之由Asn成為Asp的取代，及在相當於11位之位置之由Asn成為Gln的取代，(a27
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的3位之位置之由Asn成為Asp的取代，在相當於6位之位置之由Asn成為Asp的取代，及在相當於11位之位置之由Asn成為Gln的取代，或(a28
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的3位之位置之由Asn成為Ala的取代，在相當於6位之位置之由Asn成為Asp的取代，及在相當於11位之位置之由Asn成為Gln的取代。
該(b)之變異為在選自由相當於序列編號3的胺基酸序列的24位及25位之位置所組成之群組之至少一個位置之胺基酸殘基的成為其他胺基酸殘基的取代或缺失，或其他胺基酸殘基向該位置之前或後之位置的插入。在該相當於24位及25位之位置，該取代前之胺基酸殘基較佳為Glu，對此等進行取代之該其他胺基酸殘基較佳為Asp。該(b)之變異可為在相當於序列編號3的胺基酸序列的24位或25位之位置之胺基酸殘基的單獨變異，亦可為在該相當於24位及25位之位置之胺基酸殘基兩者發生變異而得之二重變異。例如，該(b)之變異可為在相當於序列編號3的胺基酸序列的24位或25位之位置之胺基酸殘基的單獨取代，亦可為將在該相當於24位及25位之位置之胺基酸殘基兩者進行取代而得之二重取代。較佳係該(b)之變異為(b1
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的24位之位置之由Glu成為Asp的取代，或(b2
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的25位之位置之由Glu成為Asp的取代。
該(c)之變異為在相當於序列編號3的胺基酸序列的39位之位置之胺基酸殘基的成為其他胺基酸殘基的取代或缺失，或其他胺基酸殘基向該位置之前或後之位置的插入。在該相當於39位之位置，該取代前之胺基酸殘基較佳為Ser，對此進行取代之該其他胺基酸殘基較佳為Lys或Arg。較佳係該(c)之變異為(c1
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的39位之位置之由Ser成為Lys的取代，或(c2
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的39位之位置之由Ser成為Arg的取代。
該(d)之變異為在相當於序列編號3的胺基酸序列的46位之位置之胺基酸殘基的成為其他胺基酸殘基的取代或缺失，或其他胺基酸殘基向該位置之前或後之位置的插入。在該相當於46位之位置，該取代前之胺基酸殘基較佳為Ala，對此進行取代之該其他胺基酸殘基較佳為Asp、Glu、Lys或Arg，更佳為Asp、Glu或Arg。較佳係該(d)之變異為(d1
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的46位之位置之由Ala成為Asp的取代，(d2
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的46位之位置之由Ala成為Glu的取代，(d3
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的46位之位置之由Ala成為Lys的取代，或(d4
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的46位之位置之由Ala成為Arg的取代。
該(e)之變異為在選自由相當於序列編號3的胺基酸序列的4位、49位及58位之位置所組成之群組之至少一個位置之胺基酸殘基的成為其他胺基酸殘基的取代或缺失，或其他胺基酸殘基向該位置之前或後之位置的插入。在該相當於4位、49位及58位之位置之缺失胺基酸殘基較佳為Lys。在該相當於4位、49位及58位之位置，該取代前之胺基酸殘基較佳為Lys，對此等進行取代之該其他胺基酸殘基較佳為Arg。該(e)之變異可為在相當於序列編號3的胺基酸序列的4位、49位或58位之位置之胺基酸殘基的單獨變異，亦可為在該相當於4位、49位及58位之位置之胺基酸殘基中之2個或3個發生變異而得之多重變異。例如，該(e)之變異可為在相當於序列編號3的胺基酸序列的4位、49位或58位之位置之胺基酸殘基單獨的缺失或取代，亦可為使在該相當於4位、49位或58位之位置之胺基酸殘基中之2個或3個發生缺失或取代而得之多重變異。較佳係該(e)之變異為(e1
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的4位之位置之Lys的缺失，(e2
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的49位之位置之由Lys成為Arg的取代，(e3
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的58位之位置之Lys的缺失，或(e4
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的58位之位置之由Lys成為Arg的取代。
該(f)之變異為在相當於序列編號3的胺基酸序列的23位之位置之胺基酸殘基的成為其他胺基酸殘基的取代或缺失，或其他胺基酸殘基向該位置之前或後之位置的插入。在該相當於23位之位置，該取代前之胺基酸殘基較佳為Thr，對此進行取代之該其他胺基酸殘基較佳為Arg、Leu或Ser。較佳係該(f)之變異為(f1
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的23位之位置之由Thr成為Arg的取代，(f2
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的23位之位置之由Thr成為Leu的取代，或(f3
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的23位之位置之由Thr成為Ser的取代。
在較佳實施形態中，本發明之變異免疫球蛋白結合結構域係藉由對由序列編號1~6中之任一者的胺基酸序列所組成之多肽鏈，導入該選自由(a)~(f)所組成之群組之至少1種變異而予以製造。在另一較佳實施形態中，本發明之變異免疫球蛋白結合結構域係藉由對由與序列編號1~6中之任一者的胺基酸序列具有至少85%的同一性之胺基酸序列所組成，且具有免疫球蛋白結合活性之多肽鏈，導入該選自由(a)~(f)所組成之群組之至少1種變異而予以製造。
在更佳實施形態中，本發明之變異免疫球蛋白結合結構域係藉由對由序列編號1~3中之任一者的胺基酸序列所組成之多肽鏈，導入該選自由(a)~(f)所組成之群組之至少1種變異而予以製造。
在另一更佳實施形態中，本發明之變異免疫球蛋白結合結構域係藉由對由與序列編號1~3中之任一者的胺基酸序列具有至少85%的同一性之胺基酸序列所組成，且具有免疫球蛋白結合活性之多肽鏈，導入該選自由(a)~(f)所組成之群組之至少1種變異而予以製造。
在再佳實施形態中，本發明之變異免疫球蛋白結合結構域係藉由對由序列編號3的胺基酸序列所組成之多肽鏈，或由與此具有至少85%的同一性之胺基酸序列所組成且具有免疫球蛋白結合活性之多肽鏈，導入該選自由(a)~(f)所組成之群組之至少1種變異而予以製造。
該所導入之變異可為該(a)~(f)中之任1種，亦可為2種以上之組合(即，在相當於序列編號3的胺基酸序列的3位、6位、11位、24位、25位、39位、46位、4位、49位、58位及23位中之至少二個位置之位置之胺基酸殘基的變異)，較佳為選自由上述(a1
)、(a2
)、(a3
)、(a4
)、(a5
)、(a6
)、(a7
)、(a8
)、(a9
)、(a10
)、(a11
)、(a12
)、(a13
)、(a14
)、(a15
)、(a16
)、(a17
)、(a18
)、(a19
)、(a20
)、(a21
)、(a22
)、(b1
)、(b2
)、(c1
)、(c2
)、(d1
)、(d2
)、(d3
)、(d4
)、(e1
)、(e2
)、(e3
)、(e4
)、(f1
)、(f2
)及(f3
)所組成之群組之至少1種，或2種以上變異之組合。作為該2種以上變異之組合之例，可列舉上述(a23
)~(a28
)。作為該2種以上變異之組合之另一例，可列舉上述(a1
)~(a28
)中之任1者與上述(b1
)~(f3
)中之任1者以上之組合，較佳可列舉上述(a1
)~(a22
)中之任1者與上述(e1
)~(f3
)中之任1者以上之組合，更佳可列舉上述(a7
)~(a22
)中之任1者與上述(e2
)、(e4
)、(f1
)、(f2
)及(f3
)中之任1者以上之組合，再佳可列舉上述(a7
)與上述(e2
)、(e4
)、(f1
)、(f2
)及(f3
)中之任1者以上之組合，再佳可列舉以下者：
(g1
)上述(a7
)與(f1
)之組合；
(g2
)上述(a7
)與(f2
)之組合；
(g3
)上述(a7
)與(f3
)之組合；
(g4
)上述(a7
)與(e2
)之組合；
(g5
)上述(a7
)與(e4
)之組合；
(g6
)上述(a7
)與(f1
)與(e2
)之組合；
(g7
)上述(a7
)與(f2
)與(e2
)之組合；以及
(g8
)上述(a7
)與(f3
)與(e2
)之組合。
在較佳實施形態中，該選自由(a)~(f)所組成之群組之至少1種變異為上述(a1
)、(a2
)、(a3
)、(a4
)、(a5
)、(a6
)、(a7
)、(a8
)、(a9
)、(a10
)、(a11
)、(a12
)、(a13
)、(a14
)、(a15
)、(a16
)、(a17
)、(a18
)、(a19
)、(a20
)、(a21
)、(a22
)、(a23
)、(a24
)、(a25
)、(a26
)、(a27
)、(a28
)、(b1
)、(b2
)、(c1
)、(c2
)、(d1
)、(d2
)、(d3
)、(d4
)、(e1
)、(e2
)、(e3
)、(e4
)、(f1
)、(f2
)、(f3
)、(g1
)、(g2
)、(g3
)、(g4
)、(g5
)、(g6
)、(g7
)或(g8
)。在另一例中，該選自由(a)~(f)所組成之群組之至少1種變異包含該(a1
)~(g8
)之變異中之任1種，但不包含該(a1
)~(g8
)之變異中之其他變異。在又另一例中，該選自由(a)~(f)所組成之群組之至少1種變異有時不包含僅該(e2
)、(e3
)或(e4
)之單獨變異之情況，或者僅(e2
)與(e3
)或(e2
)與(e4
)之二重變異之情況。
作為使親結構域發生變異之手段，可列舉對編碼出該親結構域之多核苷酸，以產生所期望的胺基酸殘基的取代、缺失、插入等之方式進行變異導入之方法。作為用於對多核苷酸之變異導入之具體的手法，可列舉部位特異突變、相同重組法、SOE(splicing by overlap extension)-PCR法(Gene, 1989, 77:61-68)等，此等之詳細順序屬熟習該項技術者所周知。
所製造之本發明之變異免疫球蛋白結合結構域具有免疫球蛋白結合活性，作為免疫球蛋白結合結構域發揮機能。此外，本發明之變異免疫球蛋白結合結構域與變異前之結構域(親結構域)相比，耐鹼性提升。從而，此等本發明之變異免疫球蛋白結合結構域可適合地使用作為親和配位子。
作為以上述順序所獲得之本發明之變異免疫球蛋白結合結構域之較佳例，可列舉由與序列編號1~6中之任一者的胺基酸序列具有至少85%的同一性且具有選自由上述(a)~(f)所組成之群組之至少1種變異之胺基酸序列所組成，具有免疫球蛋白結合活性之多肽鏈。
作為本發明之變異免疫球蛋白結合結構域之更佳例，可列舉由與序列編號1~3中之任一者的胺基酸序列具有至少85%的同一性且具有選自由上述(a)~(f)所組成之群組之至少1種變異之胺基酸序列所組成，具有免疫球蛋白結合活性之多肽鏈。
作為本發明之變異免疫球蛋白結合結構域之再佳例，可列舉由與序列編號3的胺基酸序列具有至少85%的同一性且具有選自由上述(a)~(f)所組成之群組之至少1種變異之胺基酸序列所組成，具有免疫球蛋白結合活性之多肽鏈。
該選自由(a)~(f)所組成之群組之至少1種變異較佳為選自由上述(a1
)、(a2
)、(a3
)、(a4
)、(a5
)、(a6
)、(a7
)、(a8
)、(a9
)、(a10
)、(a11
)、(a12
)、(a13
)、(a14
)、(a15
)、(a16
)、(a17
)、(a18
)、(a19
)、(a20
)、(a21
)、(a22
)、(b1
)、(b2
)、(c1
)、(c2
)、(d1
)、(d2
)、(d3
)、(d4
)、(e1
)、(e2
)、(e3
)、(e4
)、(f1
)、(f2
)及(f3
)所組成之群組之至少1種，更佳為上述(a1
)、(a2
)、(a3
)、(a4
)、(a5
)、(a6
)、(a7
)、(a8
)、(a9
)、(a10
)、(a11
)、(a12
)、(a13
)、(a14
)、(a15
)、(a16
)、(a17
)、(a18
)、(a19
)、(a20
)、(a21
)、(a22
)、(a23
)、(a24
)、(a25
)、(a26
)、(a27
)、(a28
)、(b1
)、(b2
)、(c1
)、(c2
)、(d1
)、(d2
)、(d3
)、(d4
)、(e1
)、(e2
)、(e3
)、(e4
)、(f1
)、(f2
)、(f3
)、(g1
)、(g2
)、(g3
)、(g4
)、(g5
)、(g6
)、(g7
)或(g8
)。在另一例中，該選自由(a)~(f)所組成之群組之至少1種變異包含該(a1
)~(g8
)之變異中之任1種，但不包含該(a1
)~(g8
)之變異中之其他變異。在又另一例中，該選自由(a)~(f)所組成之群組之至少1種變異有時不包含僅該(e2
)、(e3
)或(e4
)之單獨變異之情況，或者僅(e2
)與(e3
)或(e2
)與(e4
)之二重變異之情況。
或者，作為本發明之變異免疫球蛋白結合結構域之較佳例，可列舉由與序列編號1~6中之任一者的胺基酸序列具有至少85%的同一性，且具有選自由下述(A1
)~(F3
)所組成之群組之至少一個胺基酸殘基，或此等胺基酸殘基中之2種以上之組合之胺基酸序列所組成之多肽鏈：
(A1
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的3位之位置之Gln；
(A2
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的3位之位置之Ala；
(A3
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的3位之位置之Asp；
(A4
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的6位之位置之Gln；
(A5
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的6位之位置之Ala；
(A6
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的6位之位置之Asp；
(A7
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的11位之位置之Gln；
(A8
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的11位之位置之Ala；
(A9
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的11位之位置之Arg；
(A10
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的11位之位置之Asp；
(A11
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的11位之位置之Cys；
(A12
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的11位之位置之Glu；
(A13
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的11位之位置之His；
(A14
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的11位之位置之Ile；
(A15
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的11位之位置之Leu；
(A16
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的11位之位置之Lys；
(A17
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的11位之位置之Met；
(A18
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的11位之位置之Phe；
(A19
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的11位之位置之Thr；
(A20
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的11位之位置之Trp；
(A21
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的11位之位置之Tyr；
(A22
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的11位之位置之Val；
(B1
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的24位之位置之Asp；
(B2
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的25位之位置之Asp；
(C1
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的39位之位置之Lys；
(C2
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的39位之位置之Arg；
(D1
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的46位之位置之Asp；
(D2
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的46位之位置之Glu；
(D3
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的46位之位置之Lys；
(D4
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的46位之位置之Arg；
(E1
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的4位之位置之Lys的缺失；
(E2
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的49位之位置之Arg；
(E3
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的58位之位置之Lys的缺失；
(E4
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的58位之位置之Arg；
(F1
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的23位之位置之Arg；
(F2
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的23位之位置之Leu；以及
(F3
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的23位之位置之Ser。
該與序列編號1~6中之任一者的胺基酸序列具有至少85%的同一性之胺基酸序列較佳為與序列編號1~3中之任一者的胺基酸序列具有至少85%的同一性之胺基酸序列，更佳為與序列編號3的胺基酸序列具有至少85%的同一性之胺基酸序列。
作為該2種以上胺基酸殘基之組合之例，可列舉下述(A23
)~(A28
)：
(A23
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的3位、6位及11位之位置之Gln；
(A24
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的3位之位置之Ala，在相當於6位之位置之Asp，及在相當於11位之位置之Gln；
(A25
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的3位之位置之Asp，及在相當於11位之位置之Gln；
(A26
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的6位之位置之Asp，及在相當於11位之位置之Gln；
(A27
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的3位之位置之Asp，在相當於6位之位置之Asp，及在相當於11位之位置之Gln；
(A28
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的3位之位置之Ala，在相當於6位之位置之Asp，及在相當於11位之位置之Gln。
作為該2種以上胺基酸殘基之組合之另一例，可列舉上述(A1
)~(A28
)中之任1者與上述(B1
)~(F3
)中之任1者以上之組合，較佳可列舉上述(A1
)~(A22
)中之任1者與上述(E1
)~(F3
)中之任1者以上之組合，更佳可列舉上述(A7
)~(A22
)中之任1者與上述(E2
)、(E4
)、(F1
)、(F2
)及(F3
)中之任1者以上之組合，再佳可列舉上述(A7
)與上述(E2
)、(E4
)、(F1
)、(F2
)及(F3
)中之任1者以上之組合，再佳可列舉以下者：
(G1
)上述(A7
)與(F1
)；
(G2
)上述(A7
)與(F2
)；
(G3
)上述(A7
)與(F3
)；
(G4
)上述(A7
)與(E2
)；
(G5
)上述(A7
)與(E4
)；
(G6
)上述(A7
)、(F1
)與(E2
)；
(G7
)上述(A7
)、(F2
)與(E2
)；或
(G8
)上述(A7
)、(F3
)與(E2
)。
或者，作為本發明之變異免疫球蛋白結合結構域之更佳例，可列舉由與序列編號1~6中之任一者的胺基酸序列具有至少85%的同一性，且包含下述者之胺基酸序列所組成之多肽鏈：
(A1
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的3位之位置之Gln；
(A2
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的3位之位置之Ala；
(A3
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的3位之位置之Asp；
(A4
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的6位之位置之Gln；
(A5
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的6位之位置之Ala；
(A6
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的6位之位置之Asp；
(A7
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的11位之位置之Gln；
(A8
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的11位之位置之Ala；
(A9
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的11位之位置之Arg；
(A10
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的11位之位置之Asp；
(A11
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的11位之位置之Cys；
(A12
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的11位之位置之Glu；
(A13
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的11位之位置之His；
(A14
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的11位之位置之Ile；
(A15
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的11位之位置之Leu；
(A16
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的11位之位置之Lys；
(A17
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的11位之位置之Met；
(A18
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的11位之位置之Phe；
(A19
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的11位之位置之Thr；
(A20
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的11位之位置之Trp；
(A21
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的11位之位置之Tyr；
(A22
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的11位之位置之Val；
(A23
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的3位、6位及11位之位置之Gln；
(A24
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的3位之位置之Ala，及在相當於11位之位置之Gln；
(A25
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的3位之位置之Asp，及在相當於11位之位置之Gln；
(A26
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的6位之位置之Asp，及在相當於11位之位置之Gln；
(A27
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的3位之位置之Asp，在相當於6位之位置之Asp，及在相當於11位之位置之Gln；
(A28
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的3位之位置之Ala，在相當於6位之位置之Asp，及在相當於11位之位置之Gln；
(B1
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的24位之位置之Asp；
(B2
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的25位之位置之Asp；
(C1
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的39位之位置之Lys；
(C2
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的39位之位置之Arg；
(D1
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的46位之位置之Asp；
(D2
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的46位之位置之Glu；
(D3
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的46位之位置之Lys；
(D4
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的46位之位置之Arg；
(E1
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的4位之位置之Lys的缺失；
(E2
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的49位之位置之Arg；
(E3
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的58位之位置之Lys的缺失；
(E4
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的58位之位置之Arg；
(F1
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的23位之位置之Arg；
(F2
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的23位之位置之Leu；
(F3
)在相當於序列編號3的胺基酸序列的23位之位置之Ser；
(G1
)上述(A7
)與(F1
)；
(G2
)上述(A7
)與(F2
)；
(G3
)上述(A7
)與(F3
)；
(G4
)上述(A7
)與(E2
)；
(G5
)上述(A7
)與(E4
)；
(G6
)上述(A7
)、(F1
)與(E2
)；
(G7
)上述(A7
)、(F2
)與(E2
)；或
(G8
)上述(A7
)、(F3
)與(E2
)。
該與序列編號1~6中之任一者的胺基酸序列具有至少85%的同一性之胺基酸序列較佳為與序列編號1~3中之任一者的胺基酸序列具有至少85%的同一性之胺基酸序列，更佳為與序列編號3的胺基酸序列具有至少85%的同一性之胺基酸序列。在另一例中，本發明之變異免疫球蛋白結合結構域包含上述(A1
)~(G8
)之胺基酸殘基或其缺失中之任1種，但不包含該(A1
)~(G8
)之胺基酸殘基或缺失中之其他胺基酸殘基或缺失。在又另一例中，本發明之變異免疫球蛋白結合結構域所具有之選自由(A1
)~(F3
)所組成之群組之至少一個胺基酸殘基或其缺失有時不包含(E2
)K49R、(E3
)ΔK58或(E4
)K58R之單獨變異，或者K49RΔK58或K49RK58R之二重變異。
在本發明之變異免疫球蛋白結合結構域中，該與序列編號1~6中之任一者的胺基酸序列具有至少85%的同一性之胺基酸序列可為與序列編號57~62中之任一者的胺基酸序列具有至少85%的同一性之胺基酸序列。此外，在本發明之變異免疫球蛋白結合結構域中，該與序列編號1~3中之任一者的胺基酸序列具有至少85%的同一性之胺基酸序列可為與序列編號57~59中之任一者的胺基酸序列具有至少85%的同一性之胺基酸序列。惟，此等由與序列編號57~62的胺基酸序列具有至少85%的同一性之胺基酸序列所組成之本發明之變異免疫球蛋白結合結構域有時不包含上述之(a)~(f)之變異中，在相當於序列編號3的胺基酸序列的3位及4位之位置之胺基酸殘基的變異。
較佳係本發明之變異免疫球蛋白結合結構域包含在相當於序列編號3的胺基酸序列的1位之位置之Val，及/或在相當於序列編號3的胺基酸序列的29位之位置之Ala。
作為本發明之變異免疫球蛋白結合結構域之再佳例，可列舉由序列編號7~53中之任一者的胺基酸序列所組成之多肽鏈。
本發明之免疫球蛋白結合蛋白質只要包含上述之本發明之變異免疫球蛋白結合結構域1個以上即可。較佳係本發明之免疫球蛋白結合蛋白質包含本發明之變異免疫球蛋白結合結構域2個以上，更佳為3個以上，再佳為4個以上，再佳為5個以上，再佳為6個以上。另一方面，本發明之免疫球蛋白結合蛋白質包含本發明之變異免疫球蛋白結合結構域較佳為12個以下，更佳為8個以下，再佳為7個以下。例如，本發明之免疫球蛋白結合蛋白質包含本發明之變異免疫球蛋白結合結構域較佳為2~12個，更佳為3~8個，再佳為4~7個。在本發明之免疫球蛋白結合蛋白質包含2個以上本發明之變異免疫球蛋白結合結構域之情況，該等變異免疫球蛋白結合結構域可為相同種類者，亦可為不同種類者，較佳為相同種類。
本發明之免疫球蛋白結合蛋白質亦可包含上述之本發明之變異免疫球蛋白結合結構域以外之其他免疫球蛋白結合結構域。作為該其他結構域之例，可列舉天然型SpA免疫球蛋白結合結構域(例如SpA的B結構域、Z結構域、C結構域或D結構域)，或本發明之變異免疫球蛋白結合結構域以外之該等之變異體。
作為本發明之免疫球蛋白結合蛋白質之較佳例，可列舉2個以上本發明之變異免疫球蛋白結合結構域之胺基酸序列直鏈狀地連結而得之多肽。本發明之免疫球蛋白結合蛋白質中所包含之該變異免疫球蛋白結合結構域的數量較佳為2~12個，更佳為3~8個，再佳為4~7個。作為本發明之免疫球蛋白結合蛋白質之更佳例，可列舉由各自選自序列編號7~53的胺基酸序列之2個以上胺基酸序列直鏈狀地連結而得之胺基酸序列所組成之多肽。作為本發明之免疫球蛋白結合蛋白質之再佳例，可列舉由各自選自序列編號7~53的胺基酸序列之2~12個，再佳為3~8個，再更佳為4~7個胺基酸序列直鏈狀地連結而得之胺基酸序列所組成之多肽。作為再佳例，可列舉由序列編號7~53中之任一者的胺基酸序列2~12個，再佳為3~8個，再更佳為4~7個直鏈狀地連結而得之胺基酸序列所組成之多肽。然而，本發明之蛋白質之較佳例並不限定於此等。另外，在本發明中，所謂胺基酸序列「直鏈狀地連結」，係意味2個以上胺基酸序列經由連結子或未經由連結子直列地連結而得之結構。例如，在經由連結子之情況，所謂「直鏈狀地連結」，係意味1個胺基酸序列的C末端與另一胺基酸序列的N末端經由連結子直列地連結而得之結構，另一方面，在未經由連結子之情況，所謂「直鏈狀地連結」，係意味1個胺基酸序列的C末端與另一胺基酸序列的N末端藉由胜肽鍵直列地連結而得之結構。
由本發明之免疫球蛋白結合蛋白質對擔體之固定化量增大、對擔體之結合點增加、抗體結合容量增大等之觀點而言，亦可在本發明之免疫球蛋白結合蛋白質中所包含之免疫球蛋白結合結構域的N末端、C末端及結構域間中之任1處以上，附加或插入任意的胺基酸殘基或胜肽。作為該所附加或插入之胺基酸殘基或胜肽之較佳例，可列舉Cys、Lys、Pro、(Pro)m、(Ala-Pro)n及(Glu-Ala-Ala-Ala-Lys)p(m為2~300，較佳為12~24的整數，n為4以上的整數，較佳為4~10的整數，p為2以上的整數，較佳為2~6的整數)。
2.免疫球蛋白結合蛋白質的製造
本發明之免疫球蛋白結合蛋白質可藉由該領域中所公知的手法，例如基於胺基酸序列之化學合成法，或重組體法等予以製造。例如，本發明之免疫球蛋白結合蛋白質可利用Frederick M. Ausbel等人所得之Current Protocols In Molecular Biology，或Sambrook等人編輯之Molecular Cloning(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3rd edition, 2001)等所記載之公知的基因重組技術予以製造。即，藉由將含有編碼出本發明之免疫球蛋白結合蛋白質之多核苷酸之表現載體轉形至大腸菌等宿主中，將所獲得之重組體以適切的液體培養基進行培養，便可自培養後之細胞中大量且經濟地取得目標蛋白質。作為較佳的表現載體，可使用能夠在宿主細胞內進行複製之既知的載體中之任何者，可列舉例如美國專利第5,151,350號說明書中所記載之質體，或Sambrook等人編輯之Molecular Cloning(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3rd edition, 2001)等中所記載之質體。此外，作為用於轉形之宿主，並無特別限定，可使用大腸菌等細菌、真菌類、昆蟲細胞、哺乳類細胞等用於使重組蛋白質進行表現之公知的宿主。為了將核酸導入至宿主中而藉此使宿主轉形，可因應各宿主而使用該技術領域中所知之任何方法，例如可利用Sambrook等人編輯之Molecular Cloning(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3rd edition, 2001)等中所記載之公知的方法。將所獲得之轉形體(較佳為細菌等細胞)進行培養並將所表現出之蛋白質加以回收之方法係屬熟習該項技術者所熟知。或者，本發明之免疫球蛋白結合蛋白質亦可使用無細胞蛋白質合成系統使其進行表現。
從而，本發明復提供編碼出本發明之免疫球蛋白結合蛋白質之多核苷酸(DNA等)，包含其之載體，及包含該等之轉形體。
3.親和擔體
本發明之免疫球蛋白結合蛋白質可使用作為親和配位子。藉由將本發明之免疫球蛋白結合蛋白質固定化至固相擔體，便可製造以該本發明之免疫球蛋白結合蛋白質作為配位子之親和擔體。該親和擔體為以本發明之免疫球蛋白結合蛋白質作為配位子之擔體，具有免疫球蛋白結合活性。此外，該親和擔體與以野生型蛋白A或其結構域作為配位子之擔體相比，耐鹼性提升。
作為本發明之親和擔體中所包含之固相擔體的形狀，可為粒子、膜、板、管、針狀、纖維狀等任意的形態。該擔體可為多孔性，亦可為非多孔性。此等擔體亦可使用作為填充床，或者亦可以懸浮形態使用。在懸浮形態中包含已知作為流動層(expanded bed)及純懸浮物者，在該形態中，粒子可自由地運動。在單塊(monolith)、填充床及流動層之情況，分離順序一般係依照透過濃度梯度之以往的層析法。在純懸浮物之情況，係使用批次法。較佳係該擔體為填充劑。或者，擔體亦可為諸如晶片、毛細管或過濾器之形態。
在一實施形態中，在該固相擔體為粒子之情況，粒徑較佳為20μm以上且200μm以下。例如，在擔體為合成聚合物之情況，粒徑較佳為20μm以上，更佳為30μm以上，且較佳為100μm以下，更佳為80μm以下，例如，較佳為20~100μm，更佳為30~80μm。例如，在擔體為多醣之情況，粒徑較佳為50μm以上，更佳為60μm以上，且較佳為200μm以下，更佳為150μm以下，例如，較佳為50~200μm，更佳為60~150μm。若粒徑未滿20μm，則在高流速下管柱壓力變高，不耐實用。若粒徑超過200μm，則會有免疫球蛋白結合至親和擔體之量(結合容量)較差之情形。另外，本說明書中之所謂「粒徑」，係意味以按照ISO 13320及JIS Z 8825-1之雷射繞射法進行測定而得之體積平均粒徑。具體而言，係指藉由雷射散射繞射法粒度分佈測定裝置(例如LS 13 320(Beckman Coulter(股)等)測定粒徑分佈，使用Fluid R.I. Real 1.333、Sample R.I. Real 1.54 Imaginary 0等作為光學模型，測定體積基準之粒度分佈所求出之平均粒徑。
在一實施形態中，該固相擔體為多孔質，具有較佳為50m2
/g以上，更佳為80m2
/g以上，且較佳為150m2
/g以下，更佳為130m2
/g以下，例如，較佳為50~150m2
/g，更佳為80~130m2
/g的比表面積。在此處，若比表面積未滿50m2
/g，則會有結合容量較差之情形，另一方面，若超過150m2
/g，則由於擔體的強度較差，因而會有在高流速下擔體被破壞而管柱壓力上升之情形。另外，本說明書中之所謂「比表面積」，係將藉由水銀孔隙度計所獲得之細孔徑10~5000nm的細孔所具有之表面積除以粒子的乾燥重量而得之值。
在一實施形態中，該固相擔體係體積平均細孔徑較佳為100nm以上且1500nm以下。例如，在擔體為合成聚合物之情況，體積平均細孔徑較佳為100nm以上，更佳為200nm以上，且較佳為400nm以下，更佳為300nm以下，例如，較佳為100~400nm，再佳為200~300nm。例如，在擔體為多醣之情況，體積平均細孔徑較佳為500nm以上，更佳為800nm以上，且較佳為1500nm以下，更佳為1400nm以下，例如，較佳為500~1500nm，再佳為800~1400nm。在此處，若體積平均細孔徑未滿100nm，則會有高流速下之結合容量降低變得顯著之情形，另一方面，若超過1500nm，則會有無論流速為何，結合容量都降低之情形。另外，本說明書中之所謂「體積平均細孔徑」，係藉由水銀孔隙度計所獲得之細孔徑10~5000nm的細孔的體積平均細孔徑。
在該固相擔體滿足上述範圍的粒徑、比表面積及細孔徑分佈之情況，成為精製對象溶液的流路之粒子間之間隙及粒子內之比較大的細孔徑與精製對象分子的結合表面積之平衡獲得最適化，高流速下之結合容量維持於高水平。
作為該固相擔體的材質，係例如為具有親水性表面之聚合物，例如藉由親水化處理而在外表面(以及在存在之情況亦在內表面)具有羥基(-OH)、羧基(-COOH)、胺基羰基(-CONH2
，或N取代型)、胺基(-NH2
，或取代型)或寡或聚乙烯氧基之聚合物。在一實施形態中，該聚合物可為聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯醯胺、聚苯乙烯、聚乙烯醇系等合成聚合物，較佳為諸如由多官能(甲基)丙烯酸酯、二乙烯基苯等多官能單體進行交聯而得之共聚物之合成聚合物。該種合成聚合物係藉由公知的方法輕易地製造(請參照例如J. MATER. CHEM 1991, 1(3):371-374中所記載之方法)。或者，亦可使用諸如Toyopearl(東曹公司)之市售品。其他實施形態中之聚合物為葡聚糖、澱粉、纖維素、普魯蘭多醣(pullulan)、瓊脂糖等多醣類。該種多醣類係藉由公知的方法輕易地製造(請參照例如日本專利第4081143號中所記載之方法)。或者，亦可使用諸如Sepharose(GE Healthcare Biosciences公司)之市售品。在其他實施形態中，亦可為氧化矽、氧化鋯等無機擔體。
在一實施形態中，作為被使用作為該固相擔體之多孔性粒子之一具體例，可列舉例如含有20~50質量%的交聯性乙烯基單體與3~80質量%的含環氧基之乙烯基單體、20~80質量%的含二醇基之乙烯基單體之共聚物，粒徑為20~80μm，比表面積為50~150m2
/g，體積平均細孔徑為100~400nm之多孔性有機聚合物粒子。
另外，在以水銀孔隙度計測定該固相擔體之情況之細孔徑10~5000nm的細孔的浸入體積(細孔體積)較佳為1.3mL/g以上且7.0mL/g以下。例如，在擔體為合成聚合物之情況，細孔體積較佳為1.3mL/g以上，且較佳為7.0mL/g以下，更佳為5.0mL/g以下，再佳為2.5mL/g以下，例如，較佳為1.3~7.0mL/g，更佳為1.3~5.0mL/g，再佳為1.3~2.5mL/g。此外，例如，在擔體為多醣之情況，細孔體積較佳為3.0~6.0mL/g。
作為配位子(即，本發明之免疫球蛋白結合蛋白質)結合至該固相擔體之方法，可使用將蛋白質固定化至擔體之一般方法施行。可列舉例如使用具有羧基之擔體，藉由N-羥基琥珀酸醯亞胺使此羧基活化，使其與配位子之胺基進行反應之方法；使用具有胺基或羧基之擔體，在水溶性碳二亞胺等脫水縮合劑存在下使其與配位子之羧基或胺基進行反應，形成醯胺鍵之方法；使用具有羥基之擔體，以溴化氰等鹵化氰使其活化並使其與配位子之胺基進行反應之方法；將擔體之羥基進行對甲苯磺醯化或三氟乙磺醯化，使其與配位子之胺基進行反應之方法；藉由雙環氧化物、表氯醇等將環氧基導入至擔體中，使其與配位子之胺基、羥基或硫醇基進行反應之方法；使用具有環氧基之擔體，使其與配位子之胺基、羥基或硫醇基進行反應之方法，等。上述之中，由在實施反應之水溶液中之安定性之觀點而言，較理想為經由環氧基使配位子進行結合之方法。
屬於環氧基進行開環所生成之開環環氧基之羥基係發揮下列作用：將擔體表面親水化，防止蛋白質等的非特異吸附，同時在水中使擔體的韌性提升，防止高流速下之擔體的破壞。從而，在未與配位子進行結合之剩餘的環氧基存在於使配位子進行固定化後之擔體中之情況，較佳係使該剩餘的環氧基進行開環。作為擔體中之環氧基之開環方法，可列舉例如在水溶媒中，藉由酸或鹼，於加熱或室溫將該擔體進行攪拌之方法。此外，亦可以巰基乙醇、硫代甘油等具有巰基之封閉劑(blocking agent)或單乙醇胺等具有胺基之封閉劑使環氧基進行開環。更佳的開環環氧基為藉由硫代甘油使擔體中所包含之環氧基進行開環所獲得之開環環氧基。硫代甘油作為原料相比於巰基乙醇等而言毒性較低，此外，硫代甘油加成而得之環氧開環基相比於透過具有胺基之封閉劑所得之開環基而言具有非特異吸附較低，而且動態結合量變高之優點。
視需要亦可在固相擔體與配位子之間導入任意長度的分子(間隔子)。作為間隔子之例，可列舉聚亞甲基鏈、聚乙二醇鏈、糖類等。
由於本發明之親和擔體具有耐鹼性提升之配位子，因而即便面對例如親和精製中之為了重複利用該擔體而在鹼性條件下之洗淨(例如使用0.01~1.0M氫氧化鈉等鹼性溶液之洗淨)，亦不會性能明顯降低。
4.抗體或其片段之單離方法
對本發明之一實施形態所涉及之抗體或其片段(以下，僅記為抗體。)之單離方法進行說明。本實施形態所涉及之抗體之單離方法較宜包含將含有抗體之試料通液至將本發明之免疫球蛋白結合蛋白質加以固定化而得之親和擔體中，使該抗體吸附於該擔體之步驟(第一步驟)，以及使該抗體自該擔體中溶出之步驟(第二步驟)，較佳係在該第二步驟之後，進一步包含將該擔體以鹼性液洗淨之步驟(第三步驟)。
在該第一步驟中，以抗體會吸附於配位子(本發明之免疫球蛋白結合蛋白質)之條件將含有抗體之試料流至已填充本發明之親和擔體之管柱等中。在此第一步驟中，試料中之抗體以外之物質幾乎未吸附於配位子而通過管柱。然後，視需要亦可將擔體以包含NaCl等鹽之中性緩衝液洗淨，以便去除微弱地保持在配位子之一部分物質。
在第二步驟中，流入pH 2~5的適切的緩衝液，使吸附於配位子之抗體溶出。藉由將此溶出液加以回收，便可自試料中單離出抗體。
為了提高抗體的純度，亦可進一步將上述第二步驟中所獲得之溶出液中所包含之抗體進行精製。抗體的精製可單獨或適宜組合使用例如陽離子交換層析、陰離子交換層析、混合模式層析、親水性相互作用層析、疏水性相互作用層析、尺寸排除層析等而施行。例如，藉由對該第二步驟中所獲得之溶出液施加陽離子交換層析，繼而陰離子交換層析，便可將抗體進行精製。陽離子交換層析可使用SP-Sepharose FF(GE Healthcare Biosciences公司製)、BioPro IEX S(YMC公司製)、BioPro IEX SmartSep S(YMC公司製)等施行。陰離子交換層析可使用Q-Sepharose FF(GE Healthcare Biosciences公司製)、BioPro IEX Q(YMC公司製)、BioPro IEX SmartSep Q(YMC公司製)等施行。
在本實施形態所涉及之抗體之單離方法中，較佳係接續上述第二步驟而施行第三步驟。在第三步驟中，以鹼性溶液將該親和擔體洗淨(CIP洗淨)。作為第三步驟中所使用之鹼性溶液，可列舉例如氫氧化鈉水溶液、氫氧化鉀水溶液、三乙基胺、氫氧化四丁基銨等。此外，第三步驟中所使用之該鹼性溶液中之鹼鹽的莫耳濃度，下限值為0.001M以上，較佳為0.01M以上，更佳為0.1M以上，上限值為6.0M以下，較佳為4.0M以下，更佳為2.0M以下。作為所使用之該鹼性溶液的pH，下限值為pH 11.0以上，較佳為pH 12.0以上，更佳為pH 12.5以上，上限值為pH 16.0以下，較佳為pH 15.5以下，更佳為pH 15.0以下。
本發明之親和擔體係由於蛋白質配位子的耐鹼性提升，即便在上述第三步驟中之洗淨後亦安定地保持抗體結合活性，因而可重複使用於抗體單離。
在本發明之抗體之單離方法之一實施形態中，所單離出之抗體可使用作為抗體醫藥。從而，在一實施形態中，本發明係提供使用本發明之親和擔體之抗體醫藥之製造方法。該方法之順序係除了使用含有目標抗體醫藥之試料以外，基本上與上述之抗體之單離方法之順序相同。
[實施例]
以下，列舉實施例來進一步具體地說明本發明。此外，以下記載係概括性地示出本發明之態樣，並無特別理由，本發明並不受到該等記載所限定。
＜參考例1：多孔質粒子的合成＞
(1)在360g的純水中添加聚乙烯醇(Kuraray公司製 PVA-217)3.58g，加熱攪拌而使聚乙烯醇溶解，加以冷卻後，添加十二烷基硫酸鈉(和光純藥工業製)0.36g、硫酸鈉(和光純藥工業製)0.36g及亞硝酸鈉(和光純藥工業製)0.18g，進行攪拌而調製水溶液S。
(2)使由甲基丙烯酸縮水甘油酯(三菱Chemical股份有限公司製)12.00g及二乙烯基苯(新日鐵化學公司製)1.33g所組成之單體組成物溶解於二異丁基酮(三井化學公司製)24.43g中，調製單體溶液。
(3)將(1)中所獲得之水溶液S全量投入至可分離式燒瓶內，安裝溫度計、攪拌翼及冷卻管，設置於溫水浴中，於氮環境下開始進行攪拌。將(2)中所獲得之單體溶液全量投入至可分離式燒瓶內，藉由溫水浴進行加溫。在內溫到達85℃之後添加2,2’-偶氮異丁腈(和光純藥工業公司製)0.53g。
(4)一面將(3)中所獲得之反應液維持溫度於86℃，一面攪拌3小時。接著，將反應液加以冷卻後，進行過濾，以純水及乙醇洗淨。使經洗淨之粒子分散於純水中並施行傾析3次，除去小粒子。接著，以粒子的濃度成為10質量%之方式使粒子分散於純水中，獲得多孔質粒子(PB)分散液。
＜實施例1：免疫球蛋白結合蛋白質(PrAt-0~32)的製作＞
取得免疫球蛋白結合蛋白質PrAt-0~32。PrAt-0為包含蛋白A的C結構域(序列編號3)之A1V/G29A變異體(耐鹼性提升變異體；非專利文獻1)藉由胜肽鍵直列地連結而得之同源四聚體之免疫球蛋白結合蛋白質。PrAt-1~32為對PrAt-0的各免疫球蛋白結合結構域導入表1所記載之變異而得之變異體。
PrAt-0~32的表現及精製係各自依以下之方式施行。使用編碼出PrAt-0~32之質體將大腸菌BL21(DE3) (NEW ENGLAND BIOLABS公司製)進行轉形，將所獲得之轉形體在富營養培養基中於37℃進行培養至對數增殖期。然後，藉由在培養基中添加終濃度1mM異丙基-β-硫代半乳哌喃糖苷(和光純藥工業公司製)，並進一步於37℃培養4小時，而使目標蛋白質進行表現。繼而，將培養液進行離心分離並除去上清液，在所獲得之菌體中添加包含源自卵白之溶菌酶(和光純藥工業公司製)及聚氧乙烯(10)辛基苯基醚(和光純藥工業公司製)之pH 9.5的30mM Tris緩衝液並將菌體打碎。自所獲得之細胞打碎液中，藉由陽離子交換層析(SP-Sepharose FF，GE Healthcare Biosciences公司製)及陰離子交換層析(Q-Sepharose FF，GE Healthcare Biosciences公司製)將重組免疫球蛋白結合蛋白質進行精製。將經精製之免疫球蛋白結合蛋白質對10mM檸檬酸緩衝液pH 6.0進行透析。經SDS-PAGE確認之重組型免疫球蛋白結合蛋白質的純度為95%以上。
＜實施例2：免疫球蛋白結合蛋白質(PrAp-0~41)的製作＞
取得免疫球蛋白結合蛋白質PrAp-0~39。PrAp-0為包含蛋白A的C結構域(序列編號3)之A1V/G29A變異體藉由胜肽鍵直列地連結而得之同源五聚體之免疫球蛋白結合蛋白質，PrAp-21為將半胱胺酸(C)連結至蛋白A的C結構域(序列編號3)之A1V/G29A變異體藉由胜肽鍵直列地連結而得之同源五聚體的C末端而得之免疫球蛋白結合蛋白質。PrAp-1~20為對PrAp-0的各免疫球蛋白結合結構域導入表2所記載之變異而得之變異體，PrAp-22~41為對PrAp-21的各免疫球蛋白結合結構域導入表3所記載之變異而得之變異體。
PrAp-0~41的表現及精製係與PrAt-0~32同樣地施行。經SDS-PAGE確認之重組型免疫球蛋白結合蛋白質的純度為95%以上。
＜實施例3：免疫球蛋白結合蛋白質(PrAh-0~41)的製作＞
取得免疫球蛋白結合蛋白質PrAh-0~41。PrAh-0為包含蛋白A的C結構域(序列編號3)之A1V/G29A變異體藉由胜肽鍵直列地連結而得之同源六聚體之免疫球蛋白結合蛋白質，PrAh-21為將半胱胺酸(C)連結至蛋白A的C結構域(序列編號3)之A1V/G29A變異體藉由胜肽鍵直列地連結而得之同源六聚體的C末端而得之免疫球蛋白結合蛋白質。PrAh-1~20為對PrAh-0的各免疫球蛋白結合結構域導入表4所記載之變異而得之變異體，PrAh-22~41為對PrAh-21的各免疫球蛋白結合結構域導入表5所記載之變異而得之變異體。
PrAh-0~41的表現及精製係與PrAt-0~32同樣地施行。經SDS-PAGE確認之重組型免疫球蛋白結合蛋白質的純度為95%以上。
＜實施例4：配位子固定化粒子的調製＞
對參考例1中所取得之多孔質粒子(PB)8mg，加入已溶解實施例1中所調製出之PrAt-0 1.16mg之包含1.1M硫酸鈉之0.1M碳酸緩衝液(pH 8.8)450μL，將混合液於25℃振盪5小時，而使PrAt-0結合至PB。使用硫代甘油將殘存於粒子中之環氧基進行封閉後，使用0.5M NaOH及0.1M檸檬酸緩衝液(pH 3.2)將粒子洗淨，獲得配位子固定化粒子(PrAt-0/PB)。以同樣的順序，獲得PrAt-1~32中之任一者進行結合而得之配位子固定化粒子(PrAt-1/PB~PrAt-32/PB)。此外，以同樣的順序，獲得PrAp-0~41中之任一者進行結合而得之配位子固定化粒子(PrAp-0/PB~PrAp-41/PB)。再者，以同樣的順序，獲得PrAh-0~41中之任一者進行結合而得之配位子固定化粒子(PrAh-0/PB~PrAh-41/PB)。
＜實施例5：免疫球蛋白結合蛋白質(PrAs-0~22)的製作＞
取得免疫球蛋白結合蛋白質PrAs-0~22。PrAs-0為將6次重複組胺酸標籤(HHHHHH序列)連結至蛋白A的C結構域(序列編號3)之A1V/G29A變異體的N末端而得之免疫球蛋白結合蛋白質。PrAs-1~22為對PrAs-0的各免疫球蛋白結合結構域導入表6所記載之變異而得之變異體。
PrAs-0~22的表現及精製係除了藉由親和層析(HisTrap FF，GE Healthcare Biosciences公司製)將重組免疫球蛋白結合蛋白質進行精製以外，與PrAt-0~32同樣地施行。經SDS-PAGE確認之重組型免疫球蛋白結合蛋白質的純度為95%以上。
＜試驗例1＞
針對實施例4中所製作出之包含變異結構域之配位子固定化粒子PrAt-1/PB~PrAt-29/PB，評估相對於包含親結構域之配位子固定化粒子PrAt-0之相對耐鹼性。
(1)靜態結合容量(SBC)的測定
在2mg的配位子固定化粒子(PrAt-0/PB)中添加包含2.0mg的IgG之20mM磷酸緩衝液(pH 7.5)400μL，保溫培養30分鐘。接著以20mM磷酸緩衝液(pH 7.5)400μL洗淨後，添加50mM檸檬酸鈉緩衝液(pH 2.5)400μL，將包含IgG之溶出液加以回收。藉由吸光度測定算出溶出液中之IgG量，由溶出IgG量及擔體體積求出PrAt-0/PB的靜態結合容量(SBC)。以同樣的順序，求出PrAt-1/PB~PrAt-29/PB的SBC。此外，以同樣的順序，求出PrAh-21/PB~PrAh-41/PB的SBC。
(2)耐鹼性的評估：PrAt-1~29
使2mg的配位子固定化粒子(PrAt-0/PB)以1.0M NaOH進行平衡化後，保溫培養24小時。接著以20mM磷酸緩衝液(pH 7.5)使粒子進行平衡化後，添加包含2.0mg的IgG之20mM磷酸緩衝液(pH 7.5)400μL，保溫培養30分鐘。接著以20mM磷酸緩衝液(pH 7.5)400μL洗淨後，添加50mM檸檬酸鈉緩衝液(pH 2.5)400μL，將包含IgG之溶出液加以回收。藉由吸光度測定算出溶出液中之IgG量，由溶出IgG量及擔體體積求出暴露於鹼之PrAt-0/PB的SBC。以同樣的順序，求出暴露於鹼之PrAt-1~29/PB的SBC。針對各配位子固定化粒子，算出鹼暴露後之SBC相對於(1)中所求出之SBC之相對值(SBC維持率)，接著依照以下式算出各配位子固定化粒子(PrAt-1~29)相對於PrAt-0之相對耐鹼性(%)。
相對耐鹼性(%)＝(PrAt-N(N＝1~29)的SBC維持率)/(PrAt-0的SBC維持率)×100
(3)耐鹼性的評估：PrAh-22~38
以與(2)同樣的順序求出暴露於鹼之PrAh-21~38/PB的SBC，算出PrAh-22~38相對於PrAh-21之相對耐鹼性(%)。
(4)耐鹼性的評估：PrAh-39~41
使配位子固定化粒子(PrAh-21/PB及PrAh-39~41/PB)以與(2)同樣的順序，惟以0.5M NaOH代替1.0M NaOH進行平衡化後，保溫培養24小時。然後，以與(2)同樣的方法，求出暴露於鹼之PrAh-21及39~41/PB的SBC，算出PrAh-39~41相對於PrAh-21之相對耐鹼性(%)。
將(1)中所測定出之SBC及(2)~(4)中所測定出之相對耐鹼性之測定結果示於表7~9。PrAt-1~29/PB的SBC相較於PrAt-0/PB而言並未見到較大差異。另一方面，PrAt-1~29/PB的相對耐鹼性相較於PrAt-0/PB而言提升14~64%。此外，PrAh-22~38/PB係SBC相較於PrAh-21/PB而言並未見到較大差異，另一方面，相對耐鹼性相較於PrAh-21/PB而言提升28~69%。再者，PrAh-39~41/PB係SBC相較於PrAh-21/PB而言並未見到較大差異，另一方面，相對耐鹼性相較於PrAh-21/PB而言提升22~26%。由此等結果，顯示出包含變異結構域之實施例1~3之免疫球蛋白結合蛋白質與變異導入前相比，耐鹼性較高，即便置於暴露於1.0M或0.5M氫氧化鈉24小時之比較嚴酷的條件後亦可維持抗體結合活性。
＜試驗例2＞
針對實施例5中所製作出之包含變異結構域之免疫球蛋白結合蛋白質PrAs-1~PrAs-19，評估相對於包含親結構域之免疫球蛋白結合蛋白質PrAs-0之相對耐鹼性。
(1)試料溶液的調製
將0.13mg的免疫球蛋白結合蛋白質(PrAs-0及PrAs-1~19)在1.0M氫氧化鈉水溶液中進行保溫培養。在緊接於保溫培養開始後或保溫培養開始24小時後，將該液藉由1.0M檸檬酸進行中和。接著將中和溶液使用包含0.1%源自牛血清之白蛋白(和光純藥工業公司製)及0.02%Triton X-100(和光純藥工業公司製)之D-PBS緩衝液稀釋成蛋白質濃度10μg/mL，調製試料溶液。針對此等試料溶液，將PrAs-N(N＝0~19)在氫氧化鈉中在緊接於保溫培養開始後進行中和而得之試料溶液定為PrAs-Na，在保溫培養開始24小時後進行中和而得之試料溶液則定為PrAs-Nb。
(2)IgG結合生物感測器的調製
使1.0mg的IgG與3.9μg的EZ-Link NHS-PEG4-Biotin (Thermo Fisher Scientific公司製)進行反應，將IgG進行生物素化。使用Octet RED 96e系統(Pall ForteBio公司製)使其接觸至鏈黴親和素生物感測器(Pall ForteBio公司製)，將IgG固定化至感測器上。
(3)耐鹼性的評估
使用Octet RED 96e系統使IgG結合生物感測器接觸至試料溶液，而使免疫球蛋白結合蛋白質結合至感測器上之IgG。由感測圖譜決定結合速度，算出PrAs-Nb的結合速度相對於PrAs-Na的結合速度之相對值(結合速度維持率)。接著，依照以下式算出各免疫球蛋白結合蛋白質(PrAs-0~19)相對於PrAs-0之相對耐鹼性(%)。
相對耐鹼性(%)＝｛(PrAs-N(N＝1~19)的結合速度維持率)/(PrAs-0的結合速度維持率)｝×100
PrAs-N(N＝0~19)的結合速度維持率＝(PrAs-N(N＝0~19)b的結合速度)/(PrAs-N(N＝0~19)a的結合速度)
將相對耐鹼性之測定結果示於表10。PrAs-17~19的相對耐鹼性相較於PrAs-0而言係降低，另一方面，PrAs-1~16的相對耐鹼性相較於PrAs-0而言提升60~338%。由此等結果，顯示出包含變異結構域之免疫球蛋白結合蛋白質PrAs-1~16與變異導入前相比，耐鹼性較高，即便置於暴露於1.0M氫氧化鈉24小時之比較嚴酷的條件後亦可維持抗體結合活性。
＜試驗例3＞
針對實施例5中所製作出之免疫球蛋白結合蛋白質(PrAs-0及PrAs-20~22)，除了在0.5M氫氧化鈉水溶液中進行保溫培養以外，以與試驗例2同樣的順序，算出耐鹼性。將相對耐鹼性之測定結果示於表11。由於PrAs-20~22係相對耐鹼性相較於PrAs-0而言提升21~31%，故顯示出與變異導入前相比，耐鹼性較高。
Claims (18)
- 一種免疫球蛋白結合蛋白質，其包含多肽鏈，該多肽鏈係由屬於與序列編號1~6及57~62中之任一者的胺基酸序列具有至少85%的同一性之胺基酸序列，且具有選自由以下(a)~(f)所組成之群組之至少1種變異之胺基酸序列所組成： (a)在選自由相當於序列編號3的胺基酸序列的3位、6位、11位之位置所組成之群組之至少一個位置之胺基酸殘基的成為其他胺基酸殘基的取代或缺失，或其他胺基酸殘基向該位置之前或後之位置的插入； (b)在選自由相當於序列編號3的胺基酸序列的24位及25位之位置所組成之群組之至少一個位置之胺基酸殘基的成為其他胺基酸殘基的取代或缺失，或其他胺基酸殘基向該位置之前或後之位置的插入； (c)在相當於序列編號3的胺基酸序列的39位之位置之胺基酸殘基的成為其他胺基酸殘基的取代或缺失，或其他胺基酸殘基向該位置之前或後之位置的插入； (d)在相當於序列編號3的胺基酸序列的46位之位置之胺基酸殘基的成為其他胺基酸殘基的取代或缺失，或其他胺基酸殘基向該位置之前或後之位置的插入； (e)在選自由相當於序列編號3的胺基酸序列的4位、49位及58位之位置所組成之群組之至少一個位置之胺基酸殘基的成為其他胺基酸殘基的取代或缺失，或其他胺基酸殘基向該位置之前或後之位置的插入；以及 (f)在相當於序列編號3的胺基酸序列的23位之位置之胺基酸殘基的成為其他胺基酸殘基的取代或缺失，或其他胺基酸殘基向該位置之前或後之位置的插入。
- 如申請專利範圍第1項之免疫球蛋白結合蛋白質，其中，前述多肽鏈為由與序列編號3的胺基酸序列具有至少85%的同一性且具有選自由前述(a)~(f)所組成之群組之至少1種變異之胺基酸序列所組成之多肽鏈。
- 如申請專利範圍第1項之免疫球蛋白結合蛋白質，其中，選自由前述(a)~(f)所組成之群組之至少1種變異為選自由下列者所組成之群組之至少1種變異： (a1 )在相當於序列編號3的胺基酸序列的3位之位置之由Asn成為Gln的取代； (a2 )在相當於序列編號3的胺基酸序列的3位之位置之由Asn成為Ala的取代； (a3 )在相當於序列編號3的胺基酸序列的3位之位置之由Asn成為Asp的取代； (a4 )在相當於序列編號3的胺基酸序列的6位之位置之由Asn成為Gln的取代； (a5 )在相當於序列編號3的胺基酸序列的6位之位置之由Asn成為Ala的取代； (a6 )在相當於序列編號3的胺基酸序列的6位之位置之由Asn成為Asp的取代； (a7 )在相當於序列編號3的胺基酸序列的11位之位置之由Asn成為Gln的取代； (a8 )在相當於序列編號3的胺基酸序列的11位之位置之由Asn成為Ala的取代； (a9 )在相當於序列編號3的胺基酸序列的11位之位置之由Asn成為Arg的取代； (a10 )在相當於序列編號3的胺基酸序列的11位之位置之由Asn成為Asp的取代； (a11 )在相當於序列編號3的胺基酸序列的11位之位置之由Asn成為Cys的取代； (a12 )在相當於序列編號3的胺基酸序列的11位之位置之由Asn成為Glu的取代； (a13 )在相當於序列編號3的胺基酸序列的11位之位置之由Asn成為His的取代； (a14 )在相當於序列編號3的胺基酸序列的11位之位置之由Asn成為Ile的取代； (a15 )在相當於序列編號3的胺基酸序列的11位之位置之由Asn成為Leu的取代； (a16 )在相當於序列編號3的胺基酸序列的11位之位置之由Asn成為Lys的取代； (a17 )在相當於序列編號3的胺基酸序列的11位之位置之由Asn成為Met的取代； (a18 )在相當於序列編號3的胺基酸序列的11位之位置之由Asn成為Phe的取代； (a19 )在相當於序列編號3的胺基酸序列的11位之位置之由Asn成為Thr的取代； (a20 )在相當於序列編號3的胺基酸序列的11位之位置之由Asn成為Trp的取代； (a21 )在相當於序列編號3的胺基酸序列的11位之位置之由Asn成為Tyr的取代； (a22 )在相當於序列編號3的胺基酸序列的11位之位置之由Asn成為Val的取代； (b1 )在相當於序列編號3的胺基酸序列的24位之位置之由Glu成為Asp的取代； (b2 )在相當於序列編號3的胺基酸序列的25位之位置之由Glu成為Asp的取代； (c1 )在相當於序列編號3的胺基酸序列的39位之位置之由Ser成為Lys的取代； (c2 )在相當於序列編號3的胺基酸序列的39位之位置之由Ser成為Arg的取代； (d1 )在相當於序列編號3的胺基酸序列的46位之位置之由Ala成為Asp的取代； (d2 )在相當於序列編號3的胺基酸序列的46位之位置之由Ala成為Glu的取代； (d3 )在相當於序列編號3的胺基酸序列的46位之位置之由Ala成為Lys的取代； (d4 )在相當於序列編號3的胺基酸序列的46位之位置之由Ala成為Arg的取代； (e1 )在相當於序列編號3的胺基酸序列的4位之位置之Lys的缺失； (e2 )在相當於序列編號3的胺基酸序列的49位之位置之由Lys成為Arg的取代； (e3 )在相當於序列編號3的胺基酸序列的58位之位置之Lys的缺失； (e4 )在相當於序列編號3的胺基酸序列的58位之位置之由Lys成為Arg的取代； (f1 )在相當於序列編號3的胺基酸序列的23位之位置之由Thr成為Arg的取代； (f2 )在相當於序列編號3的胺基酸序列的23位之位置之由Thr成為Leu的取代；以及 (f3 )在相當於序列編號3的胺基酸序列的23位之位置之由Thr成為Ser的取代。
- 如申請專利範圍第3項之免疫球蛋白結合蛋白質，其中，選自由前述(a)~(f)所組成之群組之至少1種變異為下列者中之任1種： (a1 )在相當於序列編號3的胺基酸序列的3位之位置之由Asn成為Gln的取代； (a2 )在相當於序列編號3的胺基酸序列的3位之位置之由Asn成為Ala的取代； (a3 )在相當於序列編號3的胺基酸序列的3位之位置之由Asn成為Asp的取代； (a4 )在相當於序列編號3的胺基酸序列的6位之位置之由Asn成為Gln的取代； (a5 )在相當於序列編號3的胺基酸序列的6位之位置之由Asn成為Ala的取代； (a6 )在相當於序列編號3的胺基酸序列的6位之位置之由Asn成為Asp的取代； (a7 )在相當於序列編號3的胺基酸序列的11位之位置之由Asn成為Gln的取代； (a8 )在相當於序列編號3的胺基酸序列的11位之位置之由Asn成為Ala的取代； (a9 )在相當於序列編號3的胺基酸序列的11位之位置之由Asn成為Arg的取代； (a10 )在相當於序列編號3的胺基酸序列的11位之位置之由Asn成為Asp的取代； (a11 )在相當於序列編號3的胺基酸序列的11位之位置之由Asn成為Cys的取代； (a12 )在相當於序列編號3的胺基酸序列的11位之位置之由Asn成為Glu的取代； (a13 )在相當於序列編號3的胺基酸序列的11位之位置之由Asn成為His的取代； (a14 )在相當於序列編號3的胺基酸序列的11位之位置之由Asn成為Ile的取代； (a15 )在相當於序列編號3的胺基酸序列的11位之位置之由Asn成為Leu的取代； (a16 )在相當於序列編號3的胺基酸序列的11位之位置之由Asn成為Lys的取代； (a17 )在相當於序列編號3的胺基酸序列的11位之位置之由Asn成為Met的取代； (a18 )在相當於序列編號3的胺基酸序列的11位之位置之由Asn成為Phe的取代； (a19 )在相當於序列編號3的胺基酸序列的11位之位置之由Asn成為Thr的取代； (a20 )在相當於序列編號3的胺基酸序列的11位之位置之由Asn成為Trp的取代； (a21 )在相當於序列編號3的胺基酸序列的11位之位置之由Asn成為Tyr的取代； (a22 )在相當於序列編號3的胺基酸序列的11位之位置之由Asn成為Val的取代； (a23 )在相當於序列編號3的胺基酸序列的3位、6位及11位之位置之由Asn成為Gln的取代； (a24 )在相當於序列編號3的胺基酸序列的3位之位置之由Asn成為Ala的取代，及在相當於11位之位置之由Asn成為Gln的取代； (a25 )在相當於序列編號3的胺基酸序列的3位之位置之由Asn成為Asp的取代，及在相當於11位之位置之由Asn成為Gln的取代； (a26 )在相當於序列編號3的胺基酸序列的6位之位置之由Asn成為Asp的取代，及在相當於11位之位置之由Asn成為Gln的取代； (a27 )在相當於序列編號3的胺基酸序列的3位之位置之由Asn成為Asp的取代，在相當於6位之位置之由Asn成為Asp的取代，及在相當於11位之位置之由Asn成為Gln的取代； (a28 )在相當於序列編號3的胺基酸序列的3位之位置之由Asn成為Ala的取代，在相當於6位之位置之由Asn成為Asp的取代，及在相當於11位之位置之由Asn成為Gln的取代； (b1 )在相當於序列編號3的胺基酸序列的24位之位置之由Glu成為Asp的取代； (b2 )在相當於序列編號3的胺基酸序列的25位之位置之由Glu成為Asp的取代； (c1 )在相當於序列編號3的胺基酸序列的39位之位置之由Ser成為Lys的取代； (c2 )在相當於序列編號3的胺基酸序列的39位之位置之由Ser成為Arg的取代； (d1 )在相當於序列編號3的胺基酸序列的46位之位置之由Ala成為Asp的取代； (d2 )在相當於序列編號3的胺基酸序列的46位之位置之由Ala成為Glu的取代； (d3 )在相當於序列編號3的胺基酸序列的46位之位置之由Ala成為Lys的取代； (d4 )在相當於序列編號3的胺基酸序列的46位之位置之由Ala成為Arg的取代； (e1 )在相當於序列編號3的胺基酸序列的4位之位置之Lys的缺失； (e2 )在相當於序列編號3的胺基酸序列的49位之位置之由Lys成為Arg的取代； (e3 )在相當於序列編號3的胺基酸序列的58位之位置之Lys的缺失； (e4 )在相當於序列編號3的胺基酸序列的58位之位置之由Lys成為Arg的取代； (f1 )在相當於序列編號3的胺基酸序列的23位之位置之由Thr成為Arg的取代； (f2 )在相當於序列編號3的胺基酸序列的23位之位置之由Thr成為Leu的取代； (f3 )在相當於序列編號3的胺基酸序列的23位之位置之由Thr成為Ser的取代； (g1 )(a7 )與(f1 )之組合； (g2 )(a7 )與(f2 )之組合； (g3 )(a7 )與(f3 )之組合； (g4 )(a7 )與(e2 )之組合； (g5 )(a7 )與(e4 )之組合； (g6 )(a7 )與(f1 )與(e2 )之組合； (g7 )(a7 )與(f2 )與(e2 )之組合；以及 (g8 )(a7 )與(f3 )與(e2 )之組合。
- 如申請專利範圍第1項之免疫球蛋白結合蛋白質，其中，選自由前述(a)~(f)所組成之群組之至少1種變異包含在相當於序列編號3的胺基酸序列的3位、6位、11位、24位、25位、39位、46位、4位、49位、58位及23位中之至少二個位置之位置之胺基酸殘基的成為其他胺基酸殘基的取代或缺失，或其他胺基酸殘基向該位置之前或後之位置的插入。
- 如申請專利範圍第5項之免疫球蛋白結合蛋白質，其中，前述至少1種變異為申請專利範圍第4項之(a23 )~(a28 )中之任一者，或申請專利範圍第4項之(a1 )~(a28 )中之任1者與(b1 )~(f3 )中之任1者以上之組合。
- 如申請專利範圍第1項之免疫球蛋白結合蛋白質，其中，前述胺基酸序列的同一性至少為90%。
- 如申請專利範圍第1項之免疫球蛋白結合蛋白質，其中，前述多肽鏈進一步包含在相當於序列編號3的胺基酸序列的1位之位置之胺基酸殘基的成為Val的取代，及/或在相當於序列編號3的胺基酸序列的29位之位置之胺基酸殘基的成為Ala的取代。
- 如申請專利範圍第1項之免疫球蛋白結合蛋白質，其中，包含2個以上前述多肽鏈。
- 一種多核苷酸，其編碼出申請專利範圍第1至9項中任一項之免疫球蛋白結合蛋白質。
- 一種載體，其包含申請專利範圍第10項之多核苷酸。
- 一種轉形體，其包含申請專利範圍第11項之載體。
- 一種親和擔體，其包含固相擔體，及結合至該固相擔體之申請專利範圍第1至9項中任一項之免疫球蛋白結合蛋白質。
- 一種層析管柱，其包含申請專利範圍第13項之親和擔體。
- 一種抗體或其片段之單離方法，其使用申請專利範圍第13項之親和擔體或申請專利範圍第14項之層析管柱。
- 一種免疫球蛋白結合蛋白質之製造方法，其包含在申請專利範圍第12項之轉形體，或無細胞蛋白質合成系統中使申請專利範圍第1至9項中任一項之免疫球蛋白結合蛋白質進行表現，或者將該免疫球蛋白結合蛋白質進行化學合成。
- 一種變異多肽鏈之製造方法，該方法包含對由序列編號1~6及57~62中之任一者的胺基酸序列或與此等具有至少85%的同一性之胺基酸序列所組成，且具有免疫球蛋白結合活性之多肽鏈，導入選自由以下(a)~(f)所組成之群組之至少1種變異： (a)在選自由相當於序列編號3的胺基酸序列的3位、6位、11位之位置所組成之群組之至少一個位置之胺基酸殘基的成為其他胺基酸殘基的取代或缺失，或其他胺基酸殘基向該位置之前或後之位置的插入； (b)在選自由相當於序列編號3的胺基酸序列的24位及25位之位置所組成之群組之至少一個位置之胺基酸殘基的成為其他胺基酸殘基的取代或缺失，或其他胺基酸殘基向該位置之前或後之位置的插入； (c)在相當於序列編號3的胺基酸序列的39位之位置之胺基酸殘基的成為其他胺基酸殘基的取代或缺失，或其他胺基酸殘基向該位置之前或後之位置的插入； (d)在相當於序列編號3的胺基酸序列的46位之位置之胺基酸殘基的成為其他胺基酸殘基的取代或缺失，或其他胺基酸殘基向該位置之前或後之位置的插入； (e)在選自由相當於序列編號3的胺基酸序列的4位、49位及58位之位置所組成之群組之至少一個位置之胺基酸殘基的成為其他胺基酸殘基的取代或缺失，或其他胺基酸殘基向該位置之前或後之位置的插入；以及 (f)在相當於序列編號3的胺基酸序列的23位之位置之胺基酸殘基的成為其他胺基酸殘基的取代或缺失，或其他胺基酸殘基向該位置之前或後之位置的插入。
- 一種親和擔體之製造方法，其包含將申請專利範圍第1至9項中任一項之免疫球蛋白結合蛋白質固定化至固相擔體。
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