KR20180004851A - 친화성 크로마토그래피용 충전제 및 면역글로불린을 단리하는 방법 - Google Patents

친화성 크로마토그래피용 충전제 및 면역글로불린을 단리하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은, 알칼리 내성이 우수한 친화성 크로마토그래피용 충전제 및 면역글로불린을 단리하는 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 친화성 크로마토그래피용 충전제는, 하기 화학식 1로 표시되는 단백질이 담체에 고정화된 충전제이다.
<화학식 1>
Figure pat00005

(화학식 중, R은 4 내지 20개의 히스티딘이 연속된 부위를 포함하는 4 내지 300개의 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열을 나타내고, R2는 단백질 A의 Z 도메인 또는 그의 단편 또는 이들의 변이체를 포함하는 50 내지 500개의 아미노산 잔기를 포함하는, 면역글로불린과 결합 가능한 아미노산 서열을 나타낸다. 여기에서, R은 R2의 C 말단 또는 N 말단에 결합한다)

Description

친화성 크로마토그래피용 충전제 및 면역글로불린을 단리하는 방법{FILLER FOR AFFINITY CHROMATOGRAPHY AND METHOD FOR ISOLATING IMMUNOGLOBULIN}
본 발명은 친화성 크로마토그래피용 충전제 및 면역글로불린을 단리하는 방법에 관한 것이다. 특히, 면역글로불린 정제에 유용한 특정한 리간드를 결합한 친화성 크로마토그래피용 충전제 및 면역글로불린을 단리하는 방법에 관한 것이다.
친화성 크로마토그래피는, 불용성 담체에, 분리·정제를 목적으로 하는 물질과 특이적으로 결합하는 물질(리간드)을 고정화하고, 얻어진 리간드 고정화 담체를 충전한 칼럼을 사용하는 크로마토그래피이며, 예를 들어 단백질, 핵산 등의 생체 관련 물질의 분리·정제에 사용되고 있다(일본 특허 공개 (평)6-281638호 공보).
친화성 크로마토그래피용 충전제의 담체로서는, 예를 들어 아가로오스 겔로 대표되는 당쇄의 가교 입자나, 합성 중합체를 주성분으로 하는 입자가 사용되고 있다.
그런데, 바이오 세퍼레이션(bio separation)에 있어서의 용도에서, 통상 충전제는 반복 사용된다. 그러나, 정제 조작 후에도 미량의 협잡물이 충전제 내에 남기 때문에, 통상 클리닝·인·플레이스(cleaning in place, CIP)로 알려진 조작이 행해진다. CIP에는 충전제로부터 협잡물을 용출시킬 수 있는 시약(CIP제)이 사용된다. 이러한 시약으로서는, 예를 들어 수산화나트륨 등의 알칼리성액을 들 수 있다. 수산화나트륨을 사용하는 경우, 미생물, 단백질, 지질 및 핵산과 같은 협잡물을 효과적으로 제거할 수 있다.
일본 특허 공개 (평) 6-281638호 공보
그러나, 알칼리성액을 사용하여 협잡물을 충전제로부터 제거하는 경우, 충전제가 알칼리성 조건 하에 노출된다. 리간드로서 단백질을 사용한 친화성 크로마토그래피용 충전제에 있어서 이러한 알칼리성 조건은 가혹하여, 리간드의 불안정화에 의한 결합 용량 저하를 발생시키는 경우가 있다.
본 발명은 알칼리 내성이 우수한 친화성 크로마토그래피용 충전제 및 면역글로불린을 단리하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 형태에 관한 친화성 크로마토그래피용 충전제는, 하기 화학식 1로 표시되는 단백질 리간드가 담체에 고정화되어 있다.
Figure pat00001
(화학식 중 R은 4 내지 20개의 히스티딘이 연속된 부위를 포함하는 4 내지 300개의 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열(「히스티딘 링커」라고도 한다)을 나타내고, R2는 단백질 A의 Z 도메인(이하, 간단히 「Z 도메인」이라고 한다) 또는 그의 단편(Z 단편), 또는 이들의 변이체를 포함하는 50 내지 500개의 아미노산 잔기를 포함하는, 면역글로불린과 결합 가능한 아미노산 서열을 나타낸다(여기에서 R2가 R에 결합하는 말단은, 단백질 A의 면역글로불린 결합 도메인의 C 말단 또는 N 말단이다))
단, 본원 명세서에 있어서 단백질 A란, 황색 포도상 구균(Staphylococcus aureus)의 세포벽 성분인 단백질 A이다.
상기 친화성 크로마토그래피용 충전제에 있어서는, 상기 화학식 1로 표시되는 단백질 리간드 중의 아미노기가, 에폭시기를 갖는 상기 담체와 에폭시기 개환 반응함으로써 고정화되어 있을 수도 있다.
이 경우, 상기 담체는 개환 에폭시기로서 치환 2,3-디히드록시프로필기를 포함할 수 있다.
본 발명이 다른 일 형태에 관한 면역글로불린을 단리하는 방법은,
상기 친화성 크로마토그래피용 충전제를 사용하여, 상기 충전제에 면역글로불린을 흡착시키는 공정,
상기 면역글로불린을 용출시키는 공정, 및
상기 충전제를 알칼리성액으로 세정하는 공정
을 포함한다.
본 발명에 있어서 「단백질」이란, 펩티드 구조 단위를 갖는 모든 분자를 말하고, 예를 들어 천연형 단백질의 부분적 단편이나 천연형 단백질의 아미노산 서열을 인위적으로 개변한 변이체를 포함하는 개념이다. 또한, 「면역글로불린 결합 도메인」이란, 단독으로 면역글로불린 결합 활성을 갖는 폴리펩티드의 기능 단위를 나타내고, 「면역글로불린 결합 단백질」이란, 면역글로불린에 특이적인 친화성을 가지며 「면역글로불린 결합 도메인」을 포함하는 단백질을 나타낸다. 「면역글로불린 결합」이란 면역글로불린 분자의 상보성 결정 영역(CDR) 이외의 영역, 특히 Fc 단편에 결합하는 것을 나타낸다.
본 발명에 있어서, 친화성 크로마토그래피에 관련해서 사용되는 용어 「리간드」란, 친화성 크로마토그래피의 표적 물질과 결합하는 분자를 나타낸다. 「단백질 리간드」란, 상기 표적 물질과 결합하는 부분이 단백질로 구성되어 있는 리간드를 나타낸다.
상기 친화성 크로마토그래피용 충전제에 의하면, 알칼리 내성이 우수하기 때문에 알칼리성 조건하에서의 세정에 대하여 높은 내성을 갖는다. 또한, 상기 친화성 크로마토그래피용 충전제를, 예를 들어 면역글로불린의 정제에 사용한 경우, 반복 사용하더라도 면역글로불린의 동적 결합 용량이 저하되기 어렵기 때문에, 저렴한 면역글로불린 정제가 가능하게 된다.
도 1은, 본 발명의 합성예 2에서 제조된 면역글로불린 결합 단백질(SP4Z)의 아미노산 서열을 나타내는 도면이다.
도 2는, 발현 벡터(pETM-11)에 삽입된, 본 발명의 합성예 2에 관한 면역글로불린 결합 단백질을 코딩하는 DNA 단편의 구성을 설명하는 도면이다.
도 3은, 본 발명의 측정예 2에 있어서의 내알칼리성의 평가 결과를 나타내는 그래프이다.
본 발명의 일 실시 형태에 관한 친화성 크로마토그래피용 충전제는, 하기 화학식 1로 표시되는 단백질 리간드가 담체에 고정화되어 있다.
<화학식 1>
Figure pat00002
(화학식 중, R은 4 내지 20개의 히스티딘이 연속된 부위를 포함하는 4 내지 300개의 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열(히스티딘 링커)을 나타내고, R2는 단백질 A의 Z 도메인(Z 도메인: 서열 번호 1) 또는 그의 단편(Z 단편) 또는 이들의 변이체를 포함하는 50 내지 500개의 아미노산 잔기를 포함하는, 면역글로불린과 결합 가능한 아미노산 서열을 나타낸다. 여기에서, R은 R2의 C 말단 또는 N 말단에 결합한다)
1.친화성 크로마토그래피용 충전제
1.1. 담체
1.1.1. 구성
담체의 형상은 특별히 한정되지 않고, 대략 구 형상이나 분체를 포함하는 입자 형상, 중공 섬유를 포함하는 섬유 형상, 필름 형상 등 임의의 형상을 취할 수 있는데, 표면적이 크고 제조도 용이하기 때문에 입자의 형상이 바람직하다. 이러한 입자는 다공성일 수도 비다공성일 수도 있다. 입자 형상의 담체는 충전상으로서 사용할 수도 있고, 현탁 형태로 사용할 수도 있다. 현탁 형태에는 유동층(expanded bed) 및 순수한 현탁물로서 알려진 것이 포함되고, 입자가 자유롭게 운동할 수 있다. 모노리스, 충전상 및 유동층의 경우, 분리 순서는 일반적으로 농도 구배에 의한 종래의 크로마토그래피법을 따른다. 순수한 현탁물의 경우에는 회분법이 사용된다. 또는, 담체는 칩, 모세관 또는 필터와 같은 형태일 수도 있다.
본 실시 형태에 관한 친화성 크로마토그래피용 충전제를 구성하는 담체는, 바람직하게는 20 내지 80㎛, 보다 바람직하게는 30 내지 60㎛의 입경(부피 평균 입자 직경)을 갖는다. 입경이 20㎛ 이상이면 고유속하에서 칼럼 압력이 높아지기 어렵다. 입경이 80㎛ 이하이면, 단백질 리간드나 항체 등의 생체 관련 물질의 결합 용량이 저하되기 어렵다. 또한, 본 발명에 있어서 「입경」이란, 레이저 회절 산란식 입도 분포 측정 장치에 의해 얻어지는 담체의 부피 평균 입경이다.
본 실시 형태에 관한 친화성 크로마토그래피용 충전제를 구성하는 담체는, 바람직하게는 다공질이며, 50 내지 150m2/g, 보다 바람직하게는 80 내지 120m2/g의 비표면적을 갖는다. 여기에서, 비표면적이 50m2/g 이상이면 단백질 리간드나 항체 등의 생체 관련 물질의 결합 용량이 저하되기 어렵다. 한편 150m2/g 이하이면, 충전제의 강도가 우수하고, 고유속하에서 충전제가 파괴되기 어려워 칼럼 압력의 상승이 억제된다. 본 발명에 있어서 「비표면적」이란, 수은 포로시미터에 의해 얻어지는 세공 직경 10 내지 5000nm의 세공을 갖는 담체의 표면적을 담체의 건조 중량으로 나눈 값이다.
본 실시 형태에 관한 친화성 크로마토그래피용 충전제를 구성하는 담체는, 바람직하게는 100 내지 400nm, 보다 바람직하게는 200 내지 300nm의 부피 평균 세공 직경을 갖는다. 여기에서, 부피 평균 세공 직경이 100nm 이상이면 고유속하의 결합 용량 저하가 억제된다. 한편 400nm 이하이면, 유속에 관계없이 결합 용량의 저하가 억제된다. 본 발명에 있어서 「부피 평균 세공 직경」이란, 수은 포로시미터에 의해 얻어지는 세공 직경 10 내지 5000nm의 세공의 부피 평균 세공 직경이다.
상기 범위의 입경, 비표면적 및 세공 직경 분포를 만족시키는 경우, 정제 대상 용액의 유로(流路)가 되는 담체간의 간극 및 담체 내의 세공 직경과, 정제 대상 분자의 결합 표면적의 균형이 최적화되어, 고유속하의 결합 용량이 높은 수준으로 유지된다.
담체의 재질로서는, 예를 들어 친수성 표면을 갖는 중합체이며, 예를 들어 외표면에(존재하는 경우에는 내표면에도) 히드록시기(-OH), 카르복시기(-COOH), 아미노카르보닐기(-CONH2, 또는 N 치환형), 아미노기(-NH2, 또는 N 치환형), 에폭시기, 올리고기 또는 폴리에틸렌옥시기를 갖는 중합체이다. 중합체는 일 실시 형태에서 폴리(메트)아크릴레이트, 폴리(메트)아크릴아미드, 스티렌-디비닐벤젠 공중합체와 같은 합성 중합체이다. 이러한 합성 중합체는, 예를 들어 문헌 [J. MATER. CHEM 1991, 1(3), 371-374]에 기재된 방법 등의 공지된 방법에 의해 용이하게 제조할 수 있다. 또는, 도요펄(도소사)과 같은 시판품도 사용된다. 다른 실시 형태에 있어서의 중합체는 덱스트란, 전분, 셀룰로오스, 풀루란, 아가로오스 등의 다당류이다. 이러한 다당류는 공지된 방법에 의해 용이하게 제조되며, 예를 들어 일본 특허 제4081143호에 기재된 방법을 참조하기 바란다. 또는, 세파로오스(GE 헬스케어 바이오사이언스사)와 같은 시판품도 사용된다. 그 밖의 실시 형태에서는 실리카, 산화 지르코늄 등의 무기 담체일 수도 있다.
본 실시 형태에 관한 친화성 크로마토그래피용 충전제에 있어서, 담체로서 사용되는 다공성 입자의 일 구체예로서는, 예를 들어 20 내지 50중량％의 가교성 비닐 단량체와 3 내지 80중량％의 에폭시기 함유 비닐 단량체와 20 내지 80중량％의 디올기 함유 비닐 단량체와의 공중합체(단, 각 단량체의 합계량을 100중량％로 함)를 함유하고, 입경이 20 내지 80㎛이며, 비표면적이 50 내지 150m2/g이며, 부피 평균 세공 직경이 100 내지 400nm인 다공성 유기 중합체 입자를 들 수 있다.
또한, 본 실시 형태에 관한 친화성 크로마토그래피용 충전제를 구성하는 담체를 수은 포로시미터로 측정했을 경우, 세공 직경 10 내지 5000nm의 세공의 침입 부피(세공 부피)는 바람직하게 1.3 내지 2.5mL/g이다.
1.1.2.리간드와의 결합
담체와 단백질 리간드의 결합 방법으로서는, 일반적으로 단백질을 담체에 고정화하는 방법을 사용하여 행할 수 있다. 예를 들어, 카르복시기를 갖는 담체를 사용하고, 이 카르복시기를 N-히드록시숙신산이미드에 의해 활성화시켜 단백질 리간드의 아미노기와 반응시키는 방법, 아미노기 또는 카르복시기를 갖는 담체를 사용하고, 수용성 카르보디이미드 등의 탈수 축합제 존재 하에서 단백질 리간드의 카르복시기 또는 아미노기와 반응시켜 아미드 결합을 형성하는 방법, 수산기를 갖는 담체를 사용하고, 브롬화 시안 등의 할로겐화 시안으로 활성화시켜 단백질 리간드의 아미노기와 반응시키는 방법, 또는 담체의 수산기를 토실화 또는 트레실화하고, 단백질 리간드의 아미노기와 반응시키는 방법, 및 비스에폭시드, 에피클로로히드린 등에 의해 에폭시기를 담체에 도입하고, 단백질 리간드의 아미노기 또는 수산기 또는 티올기와 반응시키는 방법, 에폭시기를 갖는 담체를 사용하고, 단백질 리간드의 아미노기 또는 수산기 또는 티올기와 반응시키는 방법 등을 들 수 있다.
본 발명에서 사용하는 단백질 리간드는 후술하는 화학식 1로 표시되는 것이며, 이 단백질 리간드 중의 아미노기가, 담체가 갖는 에폭시기와 결합함으로써, 단백질 리간드를 담체에 결합시키는 방법을 사용하는 것이 바람직하다.
바람직하게는, 리간드가 결합한 담체는 개환 에폭시기로서 치환 2,3-디히드록시프로필기를 포함할 수 있다. 이 개환 에폭시기는 상기 담체를 리간드에 결합시킨 후, 나머지 에폭시기를 개환시킴으로써 얻을 수 있다. 바람직하게는, 상기 담체를 포함하는 본 발명의 충전제를 사용하기 전에, 상기 담체의 에폭시기가 실질적으로 모두 개환되어 있다.
에폭시기가 개환되어 생성되는 개환 에폭시기인 알코올성 수산기는, 담체 표면을 친수화하여 단백질 등의 비특이 흡착을 방지함과 동시에, 수중에서 담체의 인성을 향상시켜 고유속하의 담체의 파괴를 방지하는 역할을 한다. 담체 중의 에폭시기의 개환 방법으로서는, 예를 들어 수용매 중에서, 산 또는 알칼리에 의해, 가열 또는 실온에서 교반하는 방법을 들 수 있다. 또한, 머캅토에탄올, 티오글리세롤 등의 머캅토기를 갖는 블로킹제나 모노에탄올아민 등의 아미노기를 갖는 블로킹제로 에폭시기를 개환시킬 수도 있다. 가장 바람직한 개환 에폭시기는, 다공질 담체에 포함되는 에폭시기를 티오글리세롤에 의해 개환시켜 얻어지는 개환 에폭시기이다. 티오글리세롤은 원료로서 머캅토에탄올 등보다 독성이 낮고, 티오글리세롤이 부가된 에폭시 개환기는 아미노기를 갖는 블로킹제에 의한 개환기보다 비특이 흡착이 낮은데다가 동적 결합량이 높아진다는 이점을 갖는다.
필요에 따라, 담체와 리간드 사이에 임의 길이의 분자(스페이서)를 도입할 수도 있다. 스페이서의 예로서는, 폴리메틸렌쇄, 폴리에틸렌글리콜쇄, 당류 등을 들 수 있다.
1.2.리간드
1.2.1.면역글로불린 결합 단백질
본 발명의 친화성 크로마토그래피용 충전제에 사용되는 단백질 리간드는, 상기 화학식 1로 표시되는 면역글로불린 결합 단백질일 수 있다. 이 면역글로불린 결합 단백질(이하, 「단백질 1」이라고도 한다)을, 예를 들어 담체의 에폭시기와 반응시킴으로써 담체에 결합시킬 수 있다.
상기 화학식 1에 있어서, R로 표시되는 아미노산 서열은 4 내지 20개의 히스티딘이 연속된 부위를 포함하는 4 내지 300개의 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열이다. R에 포함되는 아미노산 잔기의 수는 8 내지 100개인 것이 바람직하고, R에 포함되는 히스티딘이 연속된 부위의 히스티딘의 수는 4 내지 8개인 것이 바람직하다. 또한, 상기 화학식 1에 있어서, R2는 단백질 A의 Z 도메인(서열 번호 1) 또는 그의 단편 또는 이들의 변이체를 포함하는 50 내지 500개의 아미노산 잔기를 포함하는, 면역글로불린과 결합 가능한 아미노산 서열이다. R2로 표시되는 아미노산 서열에 포함되는 아미노산 잔기의 수는 120 내지 480개인 것이 바람직하다.
상기 화학식 1에 있어서, R로 표시되는 아미노산 서열 및 R2로 표시되는 아미노산 서열 중 적어도 한쪽이, 리신, 아르기닌 및 시스테인으로부터 선택되는 1종의 아미노산을 포함하는 1 내지 50개의 아미노산을 포함하는 도메인 t를 포함하고 있을 수도 있다. 이 경우, 상기 아미노산 서열 중에 동일 또는 상이한 도메인 t가 복수개 포함되어 있을 수도 있다.
또한, 상기 화학식 1에 있어서, R-은 하기 화학식 2로 표시되는 기인 것이 바람직하다.
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(화학식 중, R1은 4 내지 20개의 히스티딘이 연속된 부위를 포함하는 4 내지 100개의 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열을 나타내고(여기에서, R1에 있어서, 상기 히스티딘이 연속된 부위의 말단이 r과 결합한다), r은 7 내지 200개의 아미노산 잔기를 포함하는 임의의 아미노산 서열을 나타낸다)
상기 화학식 2에 있어서, R1로 표시되는 아미노산 서열에 포함되는 아미노산 잔기의 수는 4 내지 25개인 것이 바람직하고, R1에 포함되는 히스티딘이 연속된 부위의 히스티딘의 수는 4 내지 8개인 것이 바람직하고, r로 표시되는 아미노산 서열에 포함되는 아미노산 잔기의 수는 10 내지 50개인 것이 바람직하다.
또한, 상기 화학식 2에 나타내는 r로 표시되는 아미노산 서열 중에는, TEV 절단 부위가 포함되어 있을 수도 있다. 본 발명에 있어서 「TEV 절단 부위」란, TEV(Tobacco Etch Virus) 프로테아제에 의해 특이적 절단 부위로서 인식될 수 있는 아미노산 서열을 말하는데, 실제로 TEV 프로테아제에 의해 절단될 수 있는 것은 필요로 하지 않는다. 또한, r로 표시되는 아미노산 서열 중에, TEV 도메인의 변이체(상기 TEV 프로테아제로 절단할 수 있는지의 여부와 관계없이, TEV 절단 부위의 아미노 서열과 70％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상의 상동성을 갖는다)가 포함되어 있을 수도 있다.
단백질 1을 구성하는 아미노산 잔기의 총 개수는 54 내지 800이며, 담체에 결합시킬 경우 80 내지 600인 것이 바람직하다.
1.2.1.1.면역글로불린 결합 도메인
상기 화학식 1에 있어서, R2는 면역글로불린 결합 도메인을 포함하는 아미노산 서열을 나타낸다. 상기 아미노산 서열은 단백질 A의 Z 도메인(Z 도메인), 그의 단편(Z 단편), 및 이들의 변이체로부터 선택되는 적어도 1개의 아미노산 서열을 포함한다. Z 도메인에 대해서는, 닐슨 비(Nilsson B.) 외의 문헌[프로틴 엔지니어링(Protein engineering), 1987년, 제1권, 2호, 107-113 페이지]에 기재되어 있다. Z 도메인은 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.
Z 단편이란, Z 도메인의 아미노산 서열의 일부를 갖는 것이며, 예를 들어 Z 도메인의 아미노산 서열의 90％ 이상을 갖는 것이 바람직하고, 95％ 이상을 갖는 것이 보다 바람직하다. 또한, Z 도메인의 변이체란, 예를 들어 Z 도메인의 아미노산 서열과 90％ 이상의 상동성을 갖는 것이며, 95％ 이상의 상동성을 갖는 것이 바람직하다. Z 도메인의 변이체는, Z 도메인과 비교하여 알칼리 내성이 개량된 것이 바람직하다. 이 경우, Z 도메인의 변이체가 Z 도메인과 비교하여 알칼리 내성이 개량되어 있는지의 여부는, 후술하는 실시예에 기재된 방법으로 확인할 수 있다.
Z 도메인의 변이체로서는, 예를 들어 일본 특허 제4391830호에 기재된 서열을 갖는 단백질을 들 수 있다. 예를 들어, 일본 특허 제4391830호의 청구항 1에는 서열 번호 1로 규정되는 2 이상의 반복 단위(Z 도메인)를 포함하고, 23 위치의 아미노산 잔기가 트레오닌인 단백질이 예시되어 있다.
또한, 본 발명에 있어서 상기 R2는 Z 도메인 또는 그의 단편(Z 단편), 또는 이들의 변이체를 단독으로 또는 조합하여 2개 이상(바람직하게는 4 내지 10개) 포함할 수 있다.
바람직하게는, 상기 R2는 Z 도메인, Z 단편, 및 이들의 변이체로부터 선택되는 적어도 1개, 또는 이들의 2개 이상 또는 4 내지 10개의 조합을 포함한다.
1.2.1.2.단백질 1의 제조
단백질 1을 제조하기 위한 표준 기술로서는, 예를 들어 프레데릭 엠.오스벨(Frederick M.Ausbel) 외에 의한 문헌[Current Protocols In Molecular Biology]나 샘브룩(Sambrook) 외가 편집한 문헌[Molecular Cloning(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3rd edition,2001)] 등에 기재되어 있는 공지된 유전자 재조합 기술을 이용할 수 있다. 즉, 목적으로 하는 개변 단백질(단백질 1)을 코딩하는 핵산 서열을 함유시킨 발현 벡터를 대장균 등의 숙주 세포로 형질 전환하고, 상기 숙주 세포를 적절한 액체 배지에서 배양함으로써, 배양 후의 숙주 세포로부터 단백질 1을 대량이며 경제적으로 취득할 수 있다. 바람직한 발현 벡터로서는 세균 내에서 복제 가능한 기지의 벡터 중 어느 것이든 사용할 수 있는데, 예를 들어 미국 특허 제5,151,350호 명세서에 기재되어 있는 플라스미드나, 샘브룩 외가 편집한 문헌[Molecular Cloning(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3rd edition, 2001)] 등에 기재되어 있는 플라스미드를 들 수 있다. 또한, 숙주 중에 핵산을 도입함으로써 숙주를 형질 전환시키기 위해서, 상기 기술분야에서 알려져 있는 어떠한 방법을 사용해도 좋고, 예를 들어 샘브룩 외가 편집한 문헌[Molecular Cloning(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3rd edition, 2001)] 등에 기재되어 있는 공지된 방법을 이용할 수 있다. 형질 전환시킨 세균을 배양하고, 발현된 단백질을 회수하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있고, 본 발명의 실시예에도 예시되어 있다.
즉, 본 발명의 다른 일 실시 형태에 관한 핵산은, 면역글로불린 결합 단백질 또는 그의 등기능 변이체를 코딩한다. 본 발명에 있어서, 면역글로불린 결합 단백질의 「등기능 변이체(functional variant)」란, 부분적인 아미노산의 부가, 삭제, 치환, 아미노산 잔기의 화학적 수식 등에 의해 개변된 면역글로불린 결합 단백질이며, 개변 전의 면역글로불린 결합 단백질의 아미노산 서열과 70％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상의 상동성을 유지하며, 면역글로불린 결합 활성에 있어서, 개변 전의 면역글로불린 결합 단백질과 동등한 것으로서 취급할 수 있는 것을 의미한다. 즉, 상기 핵산으로서는, 본 명세서에 있어서의 단백질 1을 코딩하는 핵산이 포함된다.
또한, 상술한 바와 같이 단백질 1은 면역글로불린 결합 도메인을 1개 이상(바람직하게는 2 내지 12개, 보다 바람직하게는 4 내지 10개) 포함하는 단백질일 수도 있다. 이러한 단백질을 코딩하는 적절한 발현 플라스미드를, 본 발명의 실시예에서 나타내는 바와 같은 방법으로 제작할 수 있고, 면역글로불린 결합 도메인을 1개 이상 포함하는 단백질을 용이하게 제조할 수 있다.
예를 들어, 후술하는 실시예에서 나타내는 서열 번호 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질(SP4Z)이나, 서열 번호 2에 있어서 1개 또는 수개의 아미노산 잔기가 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하며 면역글로불린 결합 활성을 갖는 단백질은, 본 발명에서 사용하는 면역글로불린 결합 단백질로서 적합하다.
1.2.1.3. 작용 효과
본 실시 형태에 관한 충전제에 의하면, 알칼리성 조건 하에서의 세정(예를 들어 0.01 내지 0.2M의 수산화나트륨 등의 알칼리성액을 사용한 세정)에 대하여 높은 내성을 갖는다. 그 이유로서는, 반드시 명백하진 않으나 히스티딘이 연속된 부위를 Z 도메인에 부가함으로써, 담체와 Z 도메인의 결합 위치가 히스티딘 연속 부위가 없는 경우와는 상이한 것, 및 고정화 후의 Z 도메인에 어떠한 구조 변화가 일어나 알칼리 내성이 높아진 것 등을 생각할 수 있다.
1.3. 면역글로불린을 단리하는 방법
본 발명의 일 실시 형태에 관한 면역글로불린을 단리하는 방법을 설명한다. 본 실시 형태에 관한 면역글로불린을 단리하는 방법은, 상기 본 발명의 친화성 크로마토그래피용 충전제를 사용하고, 상기 충전제에 면역글로불린을 흡착시키는 공정(제1 공정), 상기 면역글로불린을 용출시키는 공정(제2 공정) 및 상기 충전제를 알칼리성액으로 세정하는 공정(제3 공정)을 포함한다.
제1 공정에서는, 상기 친화성 크로마토그래피용 충전제를 충전한 칼럼 등에, 면역글로불린을 함유하는 용액을 상기 충전제의 단백질 리간드에 면역글로불린이 흡착하는 조건으로 흘려 보낸다. 여기에서, 상기 면역글로불린을 함유하는 용액이란 면역글로불린을 함유하는 임의의 용액이면 되고, 예를 들어 혈청 등의 생체 유래의 검체, 하이브리도마 배지의 상청 등을 들 수 있다. 상기 면역글로불린이 흡착하는 조건으로서는, 예를 들어 면역글로불린 농도 0.1 내지 10g/L, 용액의 pH 5 내지 9, 칼럼 중의 체류시간 0.5 내지 50분, 온도 0 내지 40℃를 들 수 있다.
이 제1 공정에서는, 용액 중의 면역글로불린 이외의 물질의 대부분은 흡착되지 않고 칼럼을 통과한다. 통상, 일부가 약하게 유지된 물질을 제거하기 위하여, 충전제를 NaCl 등의 염을 포함하는 중성의 완충액, 예를 들어 인산2수소나트륨/인산수소2나트륨 용액, 시트르산/인산수소2나트륨 용액, 염산/트리스(히드록시메틸)아미노메탄 용액, HEPES/수산화나트륨 용액 등으로 세정한다. 제2 공정에서는, pH 2 내지 5의 적절한 완충액, 예를 들어 시트르산/시트르산나트륨 용액, 아세트산/아세트산나트륨 용액, 염산/글리신 용액 등을 흘려 면역글로불린을 용출시킨다. 제3 공정에서는 알칼리성액으로 충전제를 세정(CIP 세정)한다.
본 실시 형태에 관한 면역글로불린을 단리하는 방법에서 사용되는 알칼리성액으로서는, 예를 들어 수산화나트륨 수용액, 수산화칼륨 수용액, 트리에틸아민, 수산화테트라부틸암모늄 등을 들 수 있다.
[실시예]
2. 실시예
이하, 본 실시 형태에 관한 친화성 크로마토그래피용 충전제를, 실시예를 들어 더욱 구체적으로 설명한다. 또한, 이하의 기재는 본 발명의 형태를 개괄적으로 나타내는 것으로, 특별한 이유는 없으며, 이러한 기재에 의해 본 발명은 한정되지 않는다.
2.1. 합성예 1(다공질 입자의 합성)
글리시딜메타크릴레이트(미쯔비시 레이온사제) 8.2g, 트리메틸올프로판트리메타크릴레이트(사토머사제) 65.9g 및 글리세린모노메타크릴레이트(니찌유사제) 90.6g을 2-옥타논(도요 고세 고교사제) 245.8g 및 아세토페논(와코 쥰야꾸 고교사제) 62g에 용해시키고, 2,2'-아조이소부티로니트릴(와코 쥰야꾸 고교사제) 2g을 첨가하여, 유기 단량체 용액을 제조하였다.
이어서, 4240g의 순수(純水)에 폴리비닐알코올(구라레사제 PVA-217) 8.5g, 도데실황산나트륨(가오사제 에말 10G) 0.43g 및 황산나트륨(와코 쥰야꾸 고교사제) 21.3g을 첨가하고, 밤새 교반하여 수용액을 제조하였다.
계속해서, 얻어진 수용액을 7L 분리형 플라스크 내에 투입하고, 온도계, 교반 날개 및 냉각관을 장착하여 온수욕에 세팅하고, 질소 분위기 하에서, 600rpm으로 교반을 개시하였다. 계속해서, 분리형 플라스크를 온수욕에 의해 가온하고, 수용액의 온도가 85℃가 되었을 때, 이 수용액에 적하 깔때기를 사용하여 상기 유기 단량체 용액을 첨가하고, 5시간 교반을 행하였다.
계속해서, 반응액을 냉각시킨 후, 이러한 반응액을 5L의 폴리프로필렌제 병에 옮겨 입자가 부유할때까지 정치하고, 하방으로부터 여분의 물을 뽑아내어 폐기하였다. 또한, 이 반응액에 아세톤을 첨가하여 입자를 침강시켰다. 이어서, 반응액을 3분간 정치하고 경사법에 의해 아세톤을 제거하였다. 이 조작을 2회 반복한 후 물을 첨가하여 입자를 침강시켰다. 또한, 3분간 정치하고 경사법을 행하였다. 이 조작을 2회 반복하여 입자를 세정하였다. 또한, 입자의 분산액을 아세톤으로 다시 치환하고, 밤새 풍건시킨 뒤, 진공 건조기로 건조를 행하여 다공질 입자(이하, PB라 기재한다) 90g을 얻었다. PB의 평균 입경은 43㎛, 비표면적은 83m2/g이었다.
2.2. 합성예 2(단백질 리간드의 제작)
2.2.1. 면역글로불린 결합 단백질의 제작
2.2.1.1. 면역글로불린 결합 단백질 발현 벡터의 구축
면역글로불린 결합 단백질(SP4Z) 발현 벡터를 하기의 스텝 (i) 내지 (iv)로 구축하였다. 도 2는 SP4Z 벡터(SP4Z-pETM11)의 구축 방법을 설명하는 도면이다.
(i) 스텝 1
단량체 Z 도메인을 코딩하는 DNA를 출발 물질로 하여, NcoI 절단 부위 및 EcoRI 절단 부위를 갖는 단량체 Z 도메인 벡터(A-pETM11)를 구축하였다.
2.2.1.2. SP1Z-pETM11 벡터(종지 코돈이 있는 단량체 Z 도메인 벡터)의 구축
SPZK DNA(서열 번호 3)를 템플릿으로 하고, 정방향 프라이머(forward primer)로서 프라이머 153(서열 번호 5) 및 역방향 프라이머(reverse primer)로서 프라이머 156(서열 번호 8)을 사용하여 PCR를 실시하였다. 프라이머 153 및 프라이머 156에는, 각각 NcoI 절단 부위 및 SacI의 제한 효소 절단 부위가 포함된다. PCR의 조건은 이하와 같다.
단계 1: 94℃ 1분간 1 사이클, 단계 2: 94℃ 30초간, 55℃ 30초간, 72℃ 2.5분간(25 사이클), 단계 3: 72℃ 10분간 1 사이클, 그 후 4℃로 유지하였다.
PCR 생성물은 PCR 정제 키트(illustra GFX-96 PCR Purification Kit; GE 헬스케어 바이오사이언스사제)로 정제하고, 1％ 아가로오스 TAE 겔에서 100V 45분간 전기 영동을 행하였다. 얻어진 밴드를 겔 추출 키트(illustra GFX PCR DNA Band Purification Kit; GE 헬스케어 바이오사이언스사제)로 정제하였다. 이어서, NcoI 제한 효소 및 SacI 제한 효소를 사용하여, 절단된 pETM11 벡터(European Molecular Biology Laboratory)와 PCR 생성물의 라이게이션(ligation)을 행하였다. 제한 효소에 의한 소화 반응은 뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs)제 NcoI 제한 효소 및 SacI 제한 효소를 사용하여 37℃에서 1시간 행하고, 전기 영동으로 정제한 후, 겔 추출 키트로 정제하였다.
라이게이션 반응은 T4 DNA리가아제(인비트로젠(Invitrogen)제)로 실온에서 밤새 행하였다.
라이게이션으로 얻어진 벡터를 DH5a 컴피턴트 세포(competent cell)(바이오메달 라이프 사이언스(Biomedal Life Science)사제)로 형질 전환시키고, 얻어진 형질 전환체를, 카나마이신을 포함하는 LB 배지에서 37℃로 밤새 배양하고, 일부 배지로부터 플라스미드를 추출하고, 삽입된 DNA 단편의 서열이 올바르다는 것을 DNA 시퀀서(3730 DNA Sequencer; 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems)제)로 확인하였다.
2.2.1.3. A-pETM11 벡터(종지 코돈이 없는 단량체 Z 도메인 벡터)의 구축
프라이머 153, 156 대신에 정방향 프라이머로서 프라이머 153 및 역방향 프라이머로서 프라이머 154(서열 번호 6)를 사용하여, 실험 2.2.1.2.와 동일하게 A-pETM11 벡터를 구축하였다. 또한, DNA 단편의 삽입은 pETM11의 NcoI 절단 부위 및 EcoRI 절단 부위를 이용하였다.
(ii) 스텝 2
이어서, A-pETM11 벡터에 추가로 1개의 Z 도메인을 부가하여, EcoRI 절단 부위 및 SacI 절단 부위를 갖는 이량체 Z 도메인 벡터(AB-pETM11)를 구축하였다.
2.2.1.4. SP2Z-pETM11 벡터(종지 코돈이 있는 이량체 Z 도메인 벡터)의 구축
SPZK DNA(서열 번호 3)를 템플릿으로 하고, 정방향 프라이머로서 프라이머 155(서열 번호 7) 및 역방향 프라이머로서 프라이머 156을 사용하고, PCR로 EcoRI 절단 부위 및 SacI 절단 부위를 갖는 단량체 Z 도메인의 DNA를 제조하여, A-pETM11의 EcoRI 절단 부위 및 SacI 절단 부위에 삽입하였다. 실험은 실험 2.2.1.2.와 동일한 조건에서 행하였다.
2.2.1.5. AB-pETM11 벡터(종지 코돈이 없는 이량체 Z 도메인 벡터)의 구축
SPZK DNA(서열 번호 3)를 템플릿으로 하고, 정방향 프라이머로서 프라이머 155 및 역방향 프라이머로서 프라이머 157(서열 번호 9)을 사용하여, PCR로 EcoRI 절단 부위 및 SacI 절단 부위를 갖는 종지 코돈이 없는 단량체 Z 도메인의 DNA를 제조하고, A-pETM11의 EcoRI 절단 부위 및 SacI 절단 부위에 삽입하여, AB-pETM11 벡터를 구축하였다. 실험은 실험 2.2.1.2.와 동일한 조건에서 행하였다.
(iii) 스텝 3
계속해서, AB-pETM11 벡터에 추가로 또 1개의 Z 도메인을 부가하여, SacI 절단 부위 및 Hind III 절단 부위를 갖는 삼량체 Z 도메인 벡터(ABC-pETM11)를 구축하였다.
2.2.1.6. SP3Z-pETM11 벡터(종지 코돈이 있는 삼량체 Z 도메인 벡터)의 구축
SPZK DNA(서열 번호 3)를 템플릿으로 하고, 정방향 프라이머로서 프라이머 158(서열 번호 10) 및 역방향 프라이머로서 프라이머 161(서열 번호 13)을 사용하고, PCR로 SacI 절단 부위 및 XhoI 절단 부위를 갖는 단량체 Z 도메인의 DNA를 제조하고, AB-pETM11의 EcoRI 절단 부위 및 SacI 절단 부위에 삽입하였다. 실험은 실험 2.2.1.2.와 동일한 조건에서 행하였다.
2.2.1.7. ABC-pETM11 벡터(종지 코돈이 없는 삼량체 Z 도메인 벡터)의 구축
SPZK DNA(서열 번호 3)를 템플릿으로 하고, 정방향 프라이머로서 프라이머 158 및 역방향 프라이머로서 프라이머 159(서열 번호 11)를 사용하고, PCR로 SacI 절단 부위 및 HindIII 절단 부위를 갖는 종지 코돈이 없는 단량체 Z 도메인의 DNA를 제조하고, AB-pETM11의 SacI 절단 부위 및 HindIII 절단 부위에 삽입하여, ABC-pETM11 벡터를 구축하였다. 실험은 실험 2.2.1.2.와 동일한 조건에서 행하였다.
(iv) 스텝 4
마지막으로, ABC-pETM11 벡터에 4개째의 Z 도메인을 부가하여, HindIII 절단 부위 및 XhoI 절단 부위를 갖는 SP4Z-pETM11 벡터를 구축하였다.
2.2.1.8. SP4Z-pETM11 벡터(종지 코돈이 있는 사량체 Z 도메인 벡터)의 구축
SPZK DNA(서열 번호 3)를 템플릿으로 하고, 프라이머 160(서열 번호 12) 및 프라이머 161을 사용하고, PCR로 HindIII 절단 부위 및 XhoI 절단 부위를 갖는 단량체 Z 도메인의 DNA를 제조하고, ABC-pETM11의 HindIII 절단 부위 및 XhoI 절단 부위에 삽입하여, SP4Z-pETM11 벡터를 구축하였다. 실험은 실험 2.2.1.2.와 동일한 조건에서 행하였다.
2.2.1.9. SP4Z의 발현 및 정제
얻어진 SP4Z-pETM11 벡터를 E.coli(BL21주) 세포(스트라타진(STRATAGENE)제)에 도입하고, 18℃에서 1mM의 IPTG(이소프로필-β-티오갈락토피라노시드; 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)제)를 첨가하고, 15시간 인큐베이션하여, 재조합형 면역글로불린 결합 단백질(단백질 1)을 발현시켰다. 유도에 앞서, 흡광도(OD600)가 약 0.6에 도달할 때까지 상기 세포를 37℃에서 인큐베이션하였다. 단백질 발현 후, 세포를 회수하고, pH 8.0의 트리스 완충액 중에서 파쇄하였다.
얻어진 재조합형 면역글로불린 결합 단백질(SP4Z)은 Ni 친화성 크로마토그래피(Ni-NTA(니트릴로트리아세트산) 입자, 퀴아젠사제)에 의해 정제되었다. 정제된 면역글로불린 결합 단백질은 음이온 교환 크로마토그래피(Q-세파로오스 FF, GE 헬스케어 바이오사이언스사제)에 의해 더 정제되었다. SDS겔 전기 영동에 의해 확인된 면역글로불린 결합 단백질의 순도는 96질량％였다.
또한, 얻어진 재조합형 면역글로불린 결합 단백질(SP4Z)은 비행 시간형 질량 분석(MALDI-TOF/MS) 스펙트럼 분석에 의해 분자량을 확인하였다.
상기에서 제조된 면역글로불린 결합 단백질 SP4Z의 아미노산 서열을 도 1에 도시한다. 또한, 도 1에 있어서 R 및 R2는 상기 화학식 1에 있어서의 R 및 R2에 대응하고, R1 및 r은 상기 화학식 2에 있어서의 R1 및 r에 대응한다. r 중의 밑줄친 부분은 TEV 절단 부위를 나타낸다. 또한, 도 1에 있어서의 Z 단편은 서열 번호 1로 표시되는 Z 도메인의 C 말단의 아미노산 잔기 APK를 제거한 아미노산 서열을 갖는다.
2.2.2. SP4ZwoHis의 제작
50mM 트리스염산, 0.5mM EDTA(에틸렌디아민4아세트산) 및 1mM DTT(디티오 트레이톨)의 버퍼(pH 8.0) 15mL에, SP4Z 150mg, MobiTEV 프로테아제(모비텍(MoBiTec)사) 900U를 첨가하고 30℃에서 12시간 교반하여 SP4Z의 TEV 절단 부위를 절단하였다. TEV 프로테아제로 절단된 SP4Z를 Ni-NTA 칼럼(용량: 4mL)에 통과시켜, SP4Z의 히스티딘 링커가 절단된 조(粗)SP4ZwoHis를 회수하였다. 얻어진 조SP4ZwoHis는 음이온 교환 크로마토그래피(Q-세파로오스 FF, GE 헬스케어 바이오사이언스사제)에 의해, pH 7.5의 HEPES 완충액 중에서 더 정제되었다. 이 단백질 1woHis를 원심 농축기(비바 스핀 20, 사르토리우스사제)로 농축한 후, 10mM HEPES 버퍼(pH 7.5) 중에서 12시간 투석하여, SP4ZwoHis(서열 번호 4)를 제조하였다.
2.3. 합성예 3(면역글로불린 결합 단백질의 입자로의 고정화)
2.3.1. 고정화예 1
1.1mL의 PB, 20mg의 SP4Z가 10mL의 0.1M 인산 버퍼(pH 6.8)에 분산된 혼합액을 제조한 후, 2.1g의 황산나트륨을 첨가하고, 25℃에서 24시간 전도 혼화하고, SP4Z를 PB(글리시딜메타크릴레이트·트리메틸올프로판트리메타크릴레이트·글리세린모노메타크릴레이트 공중합 다공질 입자)에 결합시켰다. 생성된 입자를 여과한 후, 5M 티오글리세롤 10mL와 혼합하고, 30℃에서 4시간 반응시켜 나머지 에폭시기를 블로킹하고, PBS/0.05％ Teeen20으로 세정한 후, PBS로 세정하여 1.1mL의 SP4Z 결합 다공질 입자(SP4Z-PB)를 얻었다.
2.3.2. 고정화예 2
고정화예 1에서 SP4Z 대신 SP4ZwoHis를 사용한 것 이외에는 고정화예 1과 동일하게 하여, 1.1ml의 SP4ZwoHis 결합 다공질 입자(SP4ZwoHis-PB)를 얻었다.
2.3.3. 고정화예 3
고정화예 1에서 PB 대신 에폭시-활성화 세파로오스(Epoxy-activated Sepharose) 6B(GE 헬스케어 바이오사이언스사제)를 사용한 것 이외에는 고정화예 1과 동일하게 하여, 1.1ml의 SP4Z 결합 아가로오스 입자(단백질 1-AG)를 얻었다.
2.3.4. 고정화예 4
고정화예 1에서 PB 대신 에폭시-활성화 세파로오스 6B(GE 헬스케어 바이오사이언스사제)를, SP4Z 대신 SP4ZwoHis를 사용한 것 이외에는 고정화예 1과 동일하게 하여, 1.1ml의 SP4ZwoHis 결합 아가로오스 입자(SP4ZwoHis-AG)를 얻었다.
2.4. 시험예
2.4.1. 측정예 1(면역글로불린 G(IgG) 동적 결합 용량의 측정)
SP4Z-PB, SP4ZwoHis-PB, SP4Z-AG, SP4ZwoHis-AG를 각각 내경 0.5cm의 칼럼에 베드 높이 5cm까지 채웠다. 각 칼럼을 20mM 인산 버퍼(pH 7.4)로 평형화한 후, 인간 폴리클로날 IgG(5mg/mL)를 포함하는 20mM 인산 버퍼(pH 7.4)를 선 유속 60cm/시간으로 흘리고, 흡광도 모니터로 용출액 중의 인간 폴리클로날 IgG가 10％ 브레이크 스루(break through; 파과)했을 때의 인간 폴리클로날 IgG 흡착량을 충전제 부피로 나누어, 충전제의 단위 부피당의 동적 결합 용량을 구하였다. 결과를 표 1에 나타냈다.
Figure pat00004
2.4.2. 측정예 2(내알칼리성의 측정)
측정예 1에서 사용한 각 충전제를 채운 칼럼을 저압 크로마토그래피 시스템(AKTAprime plus; GE 헬스케어 바이오사이언스사)에 세팅하고, 0.1M 수산화나트륨 10ml를 칼럼 내로 흐르게 하였다. 칼럼을 장치로부터 떼어 내고, 밀폐한 후 실온에서 일정 시간 방치한 후, 측정예 1과 동일하게 선 유속 60cm/시간에 있어서의 인간 폴리클로날 IgG의 결합 용량을 측정하였다. 0.1M 수산화나트륨으로 처리하기 전의 인간 폴리클로날 IgG 결합량을 100％로 했을 때의 결합 용량 유지율을 구하였다. 그 결과를 도 3에 도시한다.
도 3에 의하면, 히스티딘 링커를 갖는 면역글로불린 결합 단백질(SP4Z)이 결합한 충전제(SP4Z-PB, SP4Z-AG)는, 히스티딘 링커를 갖지 않는 면역글로불린 결합 단백질이 결합한 충전제(SP4ZwoHis-PB, SP4ZwoHis-AG)와 비교하여, 알칼리 접촉 시간이 길어지더라도 결합 용량의 유지율의 저하가 작았다. 이것으로부터, 상기 화학식 1로 표시되는 단백질 리간드가 고정화된 충전제는 내알칼리성이 우수하다는 것이 확인되었다.
본 발명은 상술한 실시 형태로 한정되는 것이 아니며, 더욱 다양한 변형이 가능하다. 또한, 본 발명은 실시 형태에서 설명한 구성과 실질적으로 동일한 구성 (예를 들어, 기능, 방법 및 결과가 동일한 구성, 또는 목적 및 결과가 동일한 구성)을 포함한다. 또한, 본 발명은 실시 형태에서 설명한 구성의 본질적이지 않은 부분을 변경한 구성을 포함한다. 또한, 본 발명은 실시 형태에서 설명한 구성과 동일한 작용 효과를 발휘하는 구성 또는 동일한 목적을 달성할 수 있는 구성을 포함한다. 또한, 본 발명은 실시 형태에서 설명한 구성에 공지 기술을 부가한 구성을 포함한다.
SEQUENCE LISTING <110> JSR CORPORATION <120> FILLER FOR AFFINITY CHROMATOGRAPHY AND METHOD OF ISOLATING IMMUNOGLOBLIN <130> JSR0026 <150> JP2010-068794 <151> 2010-03-24 <160> 13 <210> 1 <211> 58 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <220> <223> Z domain <400> 1 Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 2 <211> 258 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <220> <223> SP4Z <400> 2 Met Lys His His His His His His Pro Met Ser Asp Tyr Asp Ile Pro 1 5 10 15 Thr Thr Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ala Met Val Val Asp Asn Lys 20 25 30 Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro 35 40 45 Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp 50 55 60 Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn 65 70 75 80 Asp Ala Gln Lys Glu Phe Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln 85 90 95 Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln 100 105 110 Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala 115 120 125 Asn Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Lys Glu Leu 130 135 140 Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile 145 150 155 160 Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln 165 170 175 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala 180 185 190 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Lys Lys Leu Val Asp Asn Lys Phe Asn 195 200 205 Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu 210 215 220 Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro 225 230 235 240 Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala 245 250 255 Gln Lys <210> 3 <211> 213 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <220> <223> SPZK DNA <400> 3 atgcatcatc atcatcatca cgtgaattcg ctcgaggtgg ataacaaatt caacaaagaa 60 caacaaaatg ctttctatga aatcttacat ttacctaact taaacgaaga acaacgcaat 120 gctttcatcc aaagcctaaa agatgaccca agccaaagcg ctaacctttt agcagaagct 180 aaaaagctaa atgatgcaca aggatctaaa taa 213 <210> 4 <211> 291 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <220> <223> SPATK <400> 4 Met Lys His His His His His His Pro Met Ser Asp Tyr Asp Ile Pro 1 5 10 15 Thr Thr Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ala Met Ala Lys Ala Asp Ala 20 25 30 Gln Gln Asn Asn Phe Asn Lys Asp Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile 35 40 45 Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Ala Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln 50 55 60 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Thr Asn Val Leu Gly Glu Ala 65 70 75 80 Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn Asn Phe Asn 85 90 95 Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro Asn Leu 100 105 110 Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro 115 120 125 Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ser Glu Ala Lys Lys Leu Asn Glu Ser 130 135 140 Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gly Ser Ser Gly 145 150 155 160 Lys Ala Asp Ala Gln Gln Asn Asn Phe Asn Lys Asp Gln Gln Ser Ala 165 170 175 Phe Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Ala Gln Arg Asn 180 185 190 Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Thr Asn Val 195 200 205 Leu Gly Glu Ala Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys Ala Asp 210 215 220 Asn Asn Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu Asn 225 230 235 240 Met Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu 245 250 255 Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ser Glu Ala Lys Lys 260 265 270 Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu 275 280 285 Gly Ser Lys 290 <210> 5 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer containing NcoI cutting site <400> 5 ggaggaccat ggttgtggat aacaaattca acaaagaa 38 <210> 6 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer containing EcoRI cutting site <400> 6 ggtggtgaat tctttttgtg catcatttag ctttttagc 39 <210> 7 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer containing EcoRI cutting site <400> 7 ggaggagaat tcgtggataa caaattcaac aaagaac 37 <210> 8 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer containing SacI cutting site <400> 8 ggtggtgagc tcctattttt gtgcatcatt tagctt 36 <210> 9 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer containing SacI cutting site <400> 9 ggtggtgagc tctttttgtg catcatttag ctt 33 <210> 10 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer containing SacI cutting site <400> 10 ggaggagagc tcgtggataa caaattcaac aaagaa 36 <210> 11 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer containing HindIII cutting site <400> 11 ggtggtaagc tttttttgtg catcatttag ctttttagc 39 <210> 12 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer containing HindIII cutting site <400> 12 ggaggaaagc ttgtggataa caaattcaac aaagaa 36 <210> 13 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer containing XhoI cutting site <400> 13 ggtggtctcg agctattttt gtgcatcatt tagctt 36

Claims (4)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 단백질 리간드가 담체에 고정화된, 친화성 크로마토그래피용 충전제.
    <화학식 1>
    R-R2
    (화학식 중, R은 4 내지 20개의 히스티딘이 연속된 부위를 포함하는 4 내지 300개의 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열을 나타내고, R2는 단백질 A의 Z 도메인 또는 그의 단편 또는 이들의 변이체를 포함하는 50 내지 500개의 아미노산 잔기를 포함하는, 면역글로불린과 결합 가능한 아미노산 서열을 나타내고, 여기에서 R은 R2의 C 말단 또는 N 말단에 결합한다)
  2. 제1항에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 단백질 리간드 중의 아미노기가, 에폭시기를 갖는 상기 담체에 고정화되어 있는 것인 친화성 크로마토그래피용 충전제.
  3. 제2항에 있어서, 상기 담체가 개환 에폭시기로서 치환 2,3-디히드록시프로필기를 포함하는 것인 친화성 크로마토그래피용 충전제.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 기재된 친화성 크로마토그래피용 충전제에 면역글로불린을 흡착시키는 공정,
    상기 면역글로불린을 용출시키는 공정, 및
    상기 충전제를 알칼리성액으로 세정하는 공정
    을 포함하는, 면역글로불린을 단리하는 방법.
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