JPWO2011118599A1 - アフィニティークロマトグラフィー用充填剤およびイムノグロブリンを単離する方法 - Google Patents

アフィニティークロマトグラフィー用充填剤およびイムノグロブリンを単離する方法 Download PDF

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Abstract

アルカリ耐性に優れたアフィニティークロマトグラフィー用充填剤およびイムノグロブリンを単離する方法を提供する。本発明のアフィニティークロマトグラフィー用充填剤は、下記一般式（１）で表されるタンパク質が担体に固定化された充填剤である。Ｒ−Ｒ２・・・・・（１）（式中、Ｒは４〜２０個のヒスチジンが連続した部位を含む４〜３００個のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を示し、Ｒ２はプロテインＡのＺドメイン若しくはそのフラグメント又はこれらの変異体を含む５０〜５００個のアミノ酸残基からなる、イムノグロブリンと結合可能なアミノ酸配列を示す。ここで、ＲはＲ２のＣ末端またはＮ末端に結合する。）

Description

本発明は、アフィニティークロマトグラフィー用充填剤およびイムノグロブリンを単離する方法に関する。特に、イムノグロブリン精製に有用な特定のリガンドを結合したアフィニティークロマトグラフィー用充填剤およびイムノグロブリンを単離する方法に関する。
アフィニティークロマトグラフィーは、不溶性担体に、分離・精製を目的とする物質と特異的に結合する物質（リガンド）を固定化し、得られたリガンド固定化担体を充填したカラムを用いるクロマトグラフィーであり、例えばタンパク質、核酸などの生体関連物質の分離・精製に用いられている（特開平６−２８１６３８号公報）。
アフィニティークロマトグラフィー用充填剤の担体としては、例えば、アガロースゲルに代表される糖鎖の架橋粒子や、合成ポリマーを主成分とする粒子が用いられている。
ところで、バイオセパレーションにおける用途では、通常、充填剤は繰り返し使用される。しかし、精製操作後にも微量な夾雑物が充填剤内に残るため、通常クリーニング・イン・プレイス（ＣＩＰ）として知られる操作が行われる。ＣＩＰには、充填剤から夾雑物を溶出することができる試薬（ＣＩＰ剤）が用いられる。かかる試薬としては例えば、水酸化ナトリウム等のアルカリ性液が挙げられる。水酸化ナトリウムを用いる場合、微生物、タンパク質、脂質および核酸のような夾雑物を効果的に除去することができる。
特開平６−２８１６３８号公報
しかしながら、アルカリ性液を用いて夾雑物を充填剤から除去する場合、充填剤がアルカリ性条件下に曝される。リガンドとしてタンパク質を用いたアフィニティークロマトグラフィー用充填剤にとって、このようなアルカリ性条件は過酷であり、リガンドの不安定化による結合容量低下を生じることがある。
本発明は、アルカリ耐性に優れたアフィニティークロマトグラフィー用充填剤およびイムノグロブリンを単離する方法を提供することを目的とする。
本発明の一態様に係るアフィニティークロマトグラフィー用充填剤は、下記一般式（１）で表されるタンパク質リガンドが担体に固定化されている。
Ｒ−Ｒ２ ・・・・・（１）
（式中、Ｒは４〜２０個のヒスチジンが連続した部位を含む４〜３００個のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列（「ヒスチジンリンカー」ともいう。）を示し、Ｒ２はプロテインＡのＺドメイン（以下、単に「Ｚドメイン」という。）若しくはそのフラグメント（Ｚフラグメント）、又はそれらの変異体を含む５０〜５００個のアミノ酸残基からなる、イムノグロブリンと結合可能なアミノ酸配列を示す（ここで、Ｒ２がＲに結合する末端は、プロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインのＣ末端またはＮ末端である。）。）
ただし、本願明細書においてプロテインＡとは、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）の細胞壁成分であるＰｒｏｔｅｉｎ Ａである。
上記アフィニティークロマトグラフィー用充填剤においては、上記一般式（１）で表されるタンパク質リガンド中のアミノ基が、エポキシ基を有する上記担体とエポキシ基開環反応することにより固定化されていてもよい。
この場合、前記担体は、開環エポキシ基として置換２，３−ジヒドロキシプロピル基を含むことができる。
本発明の別の一態様に係るイムノグロブリンを単離する方法は、
上記アフィニティークロマトグラフィー用充填剤を用いて、前記充填剤にイムノグロブリンを吸着させる工程、
前記イムノグロブリンを溶出させる工程、および
前記充填剤をアルカリ性液で洗浄する工程
を含む。
本発明において、「タンパク質」とは、ペプチド構造単位を有するあらゆる分子をいい、例えば、天然型タンパク質の部分的断片や天然型タンパク質のアミノ酸配列を人為的に改変した変異体を含む概念である。また、「イムノグロブリン結合ドメイン」とは、単独でイムノグロブリン結合活性を有するポリペプチドの機能単位を表し、「イムノグロブリン結合タンパク質」とは、イムノグロブリンに特異的な親和性を有し、かつ、「イムノグロブリン結合ドメイン」を含むタンパク質を表す。「イムノグロブリン結合」とはイムノグロブリン分子の相補性決定領域（ＣＤＲ）以外の領域、特にＦｃフラグメントに結合することを表す。
本発明において、アフィニティークロマトグラフィーに関連して使用される用語「リガンド」とは、アフィニティークロマトグラフィーの標的物質と結合する分子のことを表す。「タンパク質リガンド」とは、上記標的物質と結合する部分がタンパク質で構成されているリガンドを表す。
上記アフィニティークロマトグラフィー用充填剤によれば、アルカリ耐性に優れているため、アルカリ性条件下での洗浄に対して高い耐性を有する。また、上記アフィニティークロマトグラフィー用充填剤を、例えばイムノグロブリンの精製に用いた場合、繰り返し使用してもイムノグロブリンの動的結合容量が低下しにくいため、安価なイムノグロブリン精製が可能となる。
図１は、本発明の合成例２で調製されたイムノグロブリン結合タンパク質（ＳＰ４Ｚ）のアミノ酸配列を示す図である。 図２は、発現ベクター（ｐＥＴＭ−１１）に挿入された、本発明の合成例２に係るイムノグロブリン結合タンパク質をコードするＤＮＡフラグメントの構成を説明する図である。 図３は、本発明の測定例２における耐アルカリ性の評価結果を示すグラフである。
本発明の一実施形態に係るアフィニティークロマトグラフィー用充填剤は、下記一般式（１）で表されるタンパク質リガンドが担体に固定化されている。
Ｒ−Ｒ２ ・・・・・（１）
（式中、Ｒは４〜２０個のヒスチジンが連続した部位を含む４〜３００個のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列（ヒスチジンリンカー）を示し、Ｒ２はプロテインＡのＺドメイン（Ｚドメイン：配列番号１）若しくはそのフラグメント（Ｚフラグメント）又はこれらの変異体を含む５０〜５００個のアミノ酸残基からなる、イムノグロブリンと結合可能なアミノ酸配列を示す。ここで、ＲはＲ２のＣ末端またはＮ末端に結合する。）
１．アフィニティークロマトグラフィー用充填剤
１．１．担体
１．１．１．構成
担体の形状は、特に限定されず、略球状や粉体を含む粒子状、中空繊維を含む繊維状、フィルム状など任意の形状をとることができるが、表面積が大きく製造も容易であることから粒子の形状が好ましい。かかる粒子は多孔性でも非多孔性でもよい。粒子状の担体は充填ベッドとして使用することもできるし、懸濁形態で使用することもできる。懸濁形態には流動層（ｅｘｐａｎｄｅｄ ｂｅｄ）および純然たる懸濁物として知られるものが包含され、粒子が自由に運動できる。モノリス、充填床及び流動層の場合、分離手順は一般に濃度勾配による従来のクロマトグラフィー法に従う。純然たる懸濁物の場合は、回分法が用いられる。あるいは、担体は、チップ、キャピラリーまたはフィルターのような形態であってもよい。
本実施形態に係るアフィニティークロマトグラフィー用充填剤を構成する担体は、好ましくは２０〜８０μｍ、より好ましくは３０〜６０μｍの粒径（体積平均粒子径）を有する。粒径が２０μｍ以上であると、高流速下でカラム圧力が高くなりにくい。粒径が８０μｍ以下であると、タンパク質リガンドや抗体等の生体関連物質の結合容量が低下しにくい。なお、本発明における「粒径」とは、レーザ回折散乱式粒度分布測定装置により得られる担体の体積平均粒径である。
本実施形態に係るアフィニティークロマトグラフィー用充填剤を構成する担体は、好ましくは多孔質であり、５０〜１５０ｍ２／ｇ、より好ましくは８０〜１２０ｍ２／ｇの比表面積を有する。ここで、比表面積が５０ｍ２／ｇ以上であると、タンパク質リガンドや抗体等の生体関連物質の結合容量が低下しにくい。一方、１５０ｍ２／ｇ以下であると、充填剤の強度に優れ、高流速下で充填剤が破壊されにくく、カラム圧力の上昇が抑制される。本発明における「比表面積」とは、水銀ポロシメーターにより得られる細孔径１０〜５０００ｎｍの細孔の有する担体の表面積を担体の乾燥重量で除した値である。
本実施形態に係るアフィニティークロマトグラフィー用充填剤を構成する担体は、好ましくは１００〜４００ｎｍ、より好ましくは２００〜３００ｎｍの体積平均細孔径を有する。ここで、体積平均細孔径が１００ｎｍ以上であると、高流速下の結合容量低下が抑制される。一方、４００ｎｍ以下であると、流速にかかわらず結合容量の低下が抑制される。本発明における「体積平均細孔径」とは、水銀ポロシメーターにより得られる細孔径１０〜５０００ｎｍの細孔の体積平均細孔径である。
上記範囲の粒径、比表面積、および細孔径分布を満たす場合、精製対象溶液の流路となる担体間の隙間および担体内の細孔径と、精製対象分子の結合表面積のバランスが最適化され、高流速下の結合容量が高いレベルに維持される。
担体の材質としては、例えば、親水性表面を有するポリマーであり、例えば、外表面（および存在する場合には内表面にも）ヒドロキシ基（−ＯＨ）、カルボキシ基（−ＣＯＯＨ）、アミノカルボニル基（−ＣＯＮＨ２、或いはＮ置換型）、アミノ基（−ＮＨ２、或いはＮ置換型）、エポキシ基、オリゴ基またはポリエチレンオキシ基を有するポリマーである。ポリマーは、一実施形態では、ポリ（メタ）アクリレート、ポリ（メタ）アクリルアミド、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体のような合成ポリマーである。かかる合成ポリマーは、例えば、Ｊ．ＭＡＴＥＲ．ＣＨＥＭ １９９１，１（３），３７１−３７４に記載の方法等の公知の方法により容易に製造することができる。或いは、トヨパール（東ソー社）のような市販品も使用される。他の実施形態におけるポリマーはデキストラン、デンプン、セルロース、プルラン、アガロース等の多糖類である。かかる多糖類は公知の方法により容易に製造され、例えば特許第４０８１１４３号に記載の方法を参照されたい。或いは、セファロース（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）のような市販品も使用される。その他の実施形態ではシリカ、酸化ジルコニウムなどの無機担体であってもよい。
本実施形態に係るアフィニティークロマトグラフィー用充填剤において、担体として使用される多孔性粒子の一具体例としては、例えば、２０〜５０重量％の架橋性ビニル単量体と３〜８０重量％のエポキシ基含有ビニル単量体と２０〜８０重量％のジオール基含有ビニル単量体との共重合体（ただし、各単量体の合計量を１００重量％とする）を含有し、粒径が２０〜８０μｍであり、比表面積が５０〜１５０ｍ２／ｇであり、体積平均細孔径が１００〜４００ｎｍである多孔性有機重合体粒子が挙げられる。
なお、本実施形態に係るアフィニティークロマトグラフィー用充填剤を構成する担体を水銀ポロシメーターで測定した場合の細孔径１０〜５０００ｎｍの細孔の浸入体積（細孔体積）は、好ましくは１．３〜２．５ｍＬ／ｇである。
１．１．２．リガンドとの結合
担体とタンパク質リガンドとの結合方法としては、一般にタンパク質を担体に固定化する方法を用いて行うことができる。例えば、カルボキシ基を有する担体を用い、このカルボキシ基をＮ−ヒドロキシコハク酸イミドにより活性化させタンパク質リガンドのアミノ基と反応させる方法、アミノ基またはカルボキシ基を有する担体を用い、水溶性カルボジイミドなどの脱水縮合剤存在下でタンパク質リガンドのカルボキシ基またはアミノ基と反応させアミド結合を形成する方法、水酸基を有する担体を用い、臭化シアンなどのハロゲン化シアンで活性化させてタンパク質リガンドのアミノ基と反応させる方法、または担体の水酸基をトシル化もしくはトレシル化し、タンパク質リガンドのアミノ基と反応させる方法、およびビスエポキシド、エピクロロヒドリンなどによりエポキシ基を担体に導入し、タンパク質リガンドのアミノ基または水酸基またはチオール基と反応させる方法、エポキシ基を有する担体を用い、タンパク質リガンドのアミノ基または水酸基またはチオール基と反応させる方法などが挙げられる。
本発明で用いるタンパク質リガンドは、後述の一般式（１）で表されるものであり、このタンパク質リガンド中のアミノ基が、担体が有するエポキシ基と結合することによって、タンパク質リガンドを担体に結合する方法を用いるのが好ましい。
好ましくは、リガンドが結合した担体は、開環エポキシ基として置換２，３−ジヒドロキシプロピル基を含み得る。この開環エポキシ基は、上記担体をリガンドに結合させた後、残余のエポキシ基を開環させることによって得ることができる。好ましくは、上記担体を含む本発明の充填剤を使用する前において、該担体のエポキシ基は実質的に全て開環されている。
エポキシ基が開環して生成する開環エポキシ基であるアルコール性水酸基は、担体表面を親水化し、タンパク質などの非特異吸着を防止すると共に、水中で担体の靱性を向上させ、高流速下の担体の破壊を防止する役割を果たす。担体中のエポキシ基の開環方法としては、例えば、水溶媒中で、酸またはアルカリにより、加熱または室温で攪拌する方法を挙げることができる。また、メルカプトエタノール、チオグリセロールなどのメルカプト基を有するブロッキング剤やモノエタノールアミンなどのアミノ基を有するブロッキング剤で、エポキシ基を開環させても良い。最も好ましい開環エポキシ基は、多孔質担体に含まれるエポキシ基をチオグリセロールにより開環させて得られる開環エポキシ基である。チオグリセロールは、原料としてメルカプトエタノールなどよりも毒性が低く、チオグリセロールが付加したエポキシ開環基は、アミノ基を有するブロッキング剤による開環基よりも非特異吸着が低い上に、動的結合量が高くなるといった利点を有する。
必要に応じて、担体とリガンドとの間に任意の長さの分子（スペーサー）を導入してもよい。スペーサーの例としては、ポリメチレン鎖、ポリエチレングリコール鎖、糖類などが挙げられる。
１．２．リガンド
１．２．１．イムノグロブリン結合タンパク質
本発明のアフィニティークロマトグラフィー用充填剤に使用されるタンパク質リガンドは、上記一般式（１）で表されるイムノグロブリン結合タンパク質であり得る。このイムノグロブリン結合タンパク質（以下、「タンパク質１」ともいう。）を、例えば担体のエポキシ基と反応させることにより、担体に結合させることができる。
上記一般式（１）において、Ｒで表されるアミノ酸配列は、４〜２０個のヒスチジンが連続した部位を含む４〜３００個のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列である。Ｒに含まれるアミノ酸残基の数は８〜１００個であることが好ましく、Ｒに含まれるヒスチジンが連続した部位のヒスチジンの数は４〜８個であることが好ましい。また、上記一般式（１）において、Ｒ２はプロテインＡのＺドメイン（配列番号１）若しくはそのフラグメント又はこれらの変異体を含む５０〜５００個のアミノ酸残基からなる、イムノグロブリンと結合可能なアミノ酸配列である。Ｒ２で表されるアミノ酸配列に含まれるアミノ酸残基の数は１２０〜４８０個であることが好ましい。
上記一般式（１）において、Ｒで表されるアミノ酸配列およびＲ２で表されるアミノ酸配列のうち少なくとも一方が、リジン、アルギニン、およびシステインから選ばれる１種のアミノ酸を含む１〜５０個のアミノ酸からなるドメインｔを含んでいてもよい。この場合、上記アミノ酸配列中に同一または異なるドメインｔが複数含まれていてもよい。
また、上記一般式（１）において、Ｒ−は下記一般式（２）で表される基であることが好ましい。
Ｒ１−ｒ− ・・・・・（２）
（式中、Ｒ１は４〜２０個のヒスチジンが連続した部位を含む４〜１００個のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を示し（ここで、Ｒ１において、前記ヒスチジンが連続した部位の末端がｒと結合する。）、ｒは７〜２００個のアミノ酸残基からなる任意のアミノ酸配列を示す。）
上記一般式（２）において、Ｒ１で表されるアミノ酸配列に含まれるアミノ酸残基の数は４〜２５個であることが好ましく、Ｒ１に含まれるヒスチジンが連続した部位のヒスチジンの数は４〜８個であることが好ましく、ｒで表されるアミノ酸配列に含まれるアミノ酸残基の数は１０〜５０個であることが好ましい。
また、上記一般式（２）に示されるｒで表されるアミノ酸配列中には、ＴＥＶ切断部位が含まれていてもよい。本発明において、「ＴＥＶ切断部位」とは、ＴＥＶ（Ｔｏｂａｃｃｏ Ｅｔｃｈ Ｖｉｒｕｓ）プロテアーゼによって特異的切断部位として認識され得るアミノ酸配列をいうが、実際にＴＥＶプロテアーゼによって切断され得ることは要しない。また、ｒで表されるアミノ酸配列中に、ＴＥＶドメインの変異体（該ＴＥＶプロテアーゼで切断できるか否かと関係なく、ＴＥＶ切断部位のアミノ配列と７０％以上、好ましくは９０％以上の相同性を有する。）が含まれていてもよい。
タンパク質１を構成するアミノ酸残基の総個数は５４〜８００であり、担体に結合させる場合、８０〜６００であるのが好ましい。
１．２．１．１．イムノグロブリン結合ドメイン
上記一般式（１）において、Ｒ２は、イムノグロブリン結合ドメインを含むアミノ酸配列を表す。当該アミノ酸配列は、プロテインＡのＺドメイン（Ｚドメイン）、そのフラグメント（Ｚフラグメント）、及びそれらの変異体から選ばれる少なくとも１個のアミノ酸配列を含む。Ｚドメインについては、ニルソン・ビー（Ｎｉｌｓｓｏｎ Ｂ．）他、プロテイン・エンジニアリング（Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）、１９８７年、第１巻、２号、１０７−１１３頁）に記載されている。Ｚドメインは配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる。
Ｚフラグメントとは、Ｚドメインのアミノ酸配列の一部を有するものであり、例えば、Ｚドメインのアミノ酸配列の９０％以上を有するものであることが好ましく、９５％以上を有するものであることがより好ましい。また、Ｚドメインの変異体とは、例えば、Ｚドメインのアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するものであり、９５％以上の相同性を有するものであるのが好ましい。Ｚドメインの変異体は、Ｚドメインと比較してアルカリ耐性が改良されたものであることが好ましい。この場合、Ｚドメインの変異体がＺドメインと比較してアルカリ耐性が改良されているかどうかは、後述する実施例記載の方法にて確認することができる。
Ｚドメインの変異体としては、例えば、特許第４３９１８３０号に記載された配列を有するタンパク質が挙げられる。例えば、特許第４３９１８３０号の請求項１には、配列番号１で規定される２以上の反復単位（Ｚドメイン）を含み、２３位のアミノ酸残基がスレオニンであるタンパク質が挙げられる。
また、本発明において、上記Ｒ２は、Ｚドメイン若しくはそのフラグメント（Ｚフラグメント）、又はそれらの変異体を単独でまたは組み合わせて２個以上（好ましくは４〜１０個）含むことができる。
好ましくは、上記Ｒ２は、Ｚドメイン、Ｚフラグメント、及びそれらの変異体から選ばれる少なくとも１個、またはそれらの２個以上若しくは４〜１０個の組み合わせからなる。
１．２．１．２．タンパク質１の製造
タンパク質１を製造するための標準技術としては、例えば、Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｍ．ＡｕｓｂｅｌらによるＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＢｉｏｌｏｇｙやＳａｍｂｒｏｏｋら編集のＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１）などに記載されている公知の遺伝子組換え技術を利用することができる。すなわち、目的の改変タンパク質（タンパク質１）をコードする核酸配列を含有させた発現ベクターを大腸菌などの宿主細胞に形質転換し、当該宿主細胞を適切な液体培地で培養することにより、培養後の宿主細胞から、タンパク質１を大量かつ経済的に取得することができる。好ましい発現ベクターとしては、細菌内で複製可能な既知のベクターのいずれをも用いることができ、例えば、米国特許第５，１５１，３５０号明細書に記載されているプラスミドや、Ｓａｍｂｒｏｏｋら編集のＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１）などに記載されているプラスミドが挙げられる。また、宿主中に核酸を導入することにより宿主を形質転換させるためには、当該技術分野において知られるいずれの方法を用いてもよく、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら編集のＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１）などに記載されている公知の方法を利用することができる。形質転換した細菌を培養して、発現されたタンパク質を回収する方法は、当業者によく知られており、本発明の実施例にも例示されている。
すなわち、本発明の他の一実施形態にかかる核酸は、イムノグロブリン結合タンパク質あるいはその等機能変異体をコードする。本発明において、イムノグロブリン結合タンパク質の「等機能変異体（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｖａｒｉａｎｔ）」とは、部分的なアミノ酸の付加、削除、置換、アミノ酸残基の化学的修飾等により改変されたイムノグロブリン結合タンパク質であって、改変前のイムノグロブリン結合タンパク質のアミノ酸配列と７０％以上、好ましくは９０％以上の相同性を保持し、かつ、イムノグロブリン結合活性において、改変前のイムノグロブリン結合タンパク質と同等のものとして扱うことができるものを意味する。すなわち、上記核酸としては、本明細書におけるタンパク質１をコードする核酸が含まれる。
また、上述したように、タンパク質１は、イムノグロブリン結合ドメインを１個以上（好ましくは２〜１２個、より好ましくは４〜１０個）を含むタンパク質であってもよい。この様なタンパク質をコードする適切な発現プラスミドを本発明の実施例で示す様な方法で作製でき、イムノグロブリン結合ドメインを１個以上含むタンパク質を容易に製造することができる。
例えば、後述する実施例において示される配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質（ＳＰ４Ｚ）や、配列番号２において１個または数個のアミノ酸残基が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、イムノグロブリン結合活性を有するタンパク質は、本発明で用いるイムノグロブリン結合タンパク質として好適である。
１．２．１．３．作用効果
本実施形態に係る充填剤によれば、アルカリ性条件下での洗浄（例えば０．０１〜０．２Ｍの水酸化ナトリウム等のアルカリ性液を用いた洗浄）に対して高い耐性を有する。その理由としては、必ずしも明らかではないが、ヒスチジンが連続した部位をＺドメインに付加したことにより、担体とＺドメインの結合位置がヒスチジン連続部位のない場合とは異なること、および固定化後のＺドメインに何らかの構造変化が起こり、アルカリ耐性が高くなったことなどが考えられる。
１．３．イムノグロブリンを単離する方法
本発明の一実施形態に係るイムノグロブリンを単離する方法を説明する。本実施形態に係るイムノグロブリンを単離する方法は、上記本発明のアフィニティークロマトグラフィー用充填剤を用いて、当該充填剤にイムノグロブリンを吸着させる工程（第一の工程）、当該イムノグロブリンを溶出させる工程（第二の工程）、および当該充填剤をアルカリ性液で洗浄する工程（第三の工程）を含む。
第一の工程では、上記アフィニティークロマトグラフィー用充填剤を充填したカラム等にイムノグロブリンを含有する溶液を、該充填剤のタンパク質リガンドにイムノグロブリンが吸着する条件にて流す。ここで、上記イムノグロブリンを含有する溶液とは、イムノグロブリンを含有する任意の溶液であればよく、例えば、血清等の生体由来の検体、ハイブリドーマ培地の上清等が挙げられる。上記イムノグロブリンが吸着する条件としては、例えば、イムノグロブリン濃度０．１〜１０ｇ／Ｌ、溶液のｐＨ５〜９、カラム中の滞留時間０．５〜５０分、温度０〜４０℃が挙げられる。
この第一の工程では、溶液中のイムノグロブリン以外の物質のほとんどは吸着されずカラムを通過する。通常、一部の弱く保持された物質を除去するため、充填剤をＮａＣｌなどの塩を含む中性の緩衝液、例えば、リン酸二水素ナトリウム／リン酸水素二ナトリウム溶液、クエン酸／リン酸水素二ナトリウム溶液、塩酸／トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン溶液、ＨＥＰＥＳ／水酸化ナトリウム溶液等、で洗浄する。第二の工程では、ｐＨ２〜５の適切な緩衝液、例えば、クエン酸／クエン酸ナトリウム溶液、酢酸／酢酸ナトリウム溶液、塩酸／グリシン溶液等、を流しイムノグロブリンを溶出させる。第三の工程では、アルカリ性液で充填剤を洗浄（ＣＩＰ洗浄）する。
本実施形態に係るイムノグロブリンを単離する方法において使用されるアルカリ性液としては、例えば、水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カリウム水溶液、トリエチルアミン、水酸化テトラブチルアンモニウム等が挙げられる。
２．実施例
以下、本実施形態にかかるアフィニティークロマトグラフィー用充填剤を、実施例を挙げてさらに具体的に説明する。また、以下の記載は本発明の態様を概括的に示すものであり、特に理由なく、かかる記載により本発明は限定されるものではない。
２．１．合成例１（多孔質粒子の合成）
グリシジルメタクリレート（三菱レーヨン社製）８．２ｇ、トリメチロールプロパントリメタクリレート（サートマー社製）６５．９ｇおよびグリセリンモノメタクリレート（日油社製）９０．６ｇを２−オクタノン（東洋合成工業社製）２４５．８ｇおよびアセトフェノン（和光純薬工業社製）６２ｇに溶解させ、２，２’−アゾイソブチロニトリル（和光純薬工業社製）２ｇを添加し、有機モノマー溶液を調製した。
次に、４２４０ｇの純水にポリビニルアルコール（クラレ社製 ＰＶＡ−２１７）８．５ｇ、ドデシル硫酸ナトリウム（花王社製 エマール１０Ｇ）０．４３ｇおよび硫酸ナトリウム（和光純薬工業社製）２１．３ｇを添加し、一晩撹拌して水溶液を調製した。
次いで、得られた水溶液を７Ｌセパラブルフラスコ内に投入し、温度計、攪拌翼、および冷却管を装着して、温水バスにセットし、窒素雰囲気下、６００ｒｐｍで撹拌を開始した。続いて、セパラブルフラスコを温水バスにより加温し、水溶液の温度が８５℃になったところで、この水溶液に滴下ロートを用いて上記有機モノマー溶液を添加し、５時間攪拌を行った。
次いで、反応液を冷却したのち、かかる反応液を５Ｌのポリプロピレン製ビンに移し、粒子が浮遊するまで静置し、下方から余分な水を吸い出して廃棄した。さらに、この反応液にアセトンを加えて粒子を沈降させた。次に、反応液を３分間静置して、デカンテーションによりアセトンを除去した。この操作を２回繰り返したのち水を加えて、粒子を沈降させた。さらに、３分間静置してデカンテーションを行った。この操作を２回繰り返して粒子を洗浄した。さらに、粒子の分散液をアセトンで再び置換して、一晩風乾したのち、真空乾燥機にて乾燥を行い、多孔質粒子（以下、ＰＢと記す。）９０ｇを得た。ＰＢの平均粒径は４３μｍ、比表面積は８３ｍ２／ｇであった。
２．２．合成例２（タンパク質リガンドの作製）
２．２．１．イムノグロブリン結合タンパク質の作製
２．２．１．１．イムノグロブリン結合タンパク質発現ベクターの構築
イムノグロブリン結合タンパク質（ＳＰ４Ｚ）発現ベクターを下記のステップ（ｉ）〜（ｉｖ）で構築した。図２は、ＳＰ４Ｚベクター（ＳＰ４Ｚ−ｐＥＴＭ１１）の構築方法を説明する図である。
（ｉ）ステップ１
単量体ＺドメインをコードするＤＮＡを出発物質として、ＮｃｏＩ切断部位およびＥｃｏＲＩ切断部位を有する単量体Ｚドメインベクター（Ａ−ｐＥＴＭ１１）を構築した。
２．２．１．２．ＳＰ１Ｚ−ｐＥＴＭ１１ベクター（終止コドン有りの単量体Ｚドメインベクター）の構築
ＳＰＺＫ ＤＮＡ（配列番号３）をテンプレートとし、フォワードプライマーとしてプライマー１５３（配列番号５）およびリバースプライマーとしてプライマー１５６（配列番号８）を用いてＰＣＲを実施した。プライマー１５３およびプライマー１５６にはそれぞれ、ＮｃｏＩ切断部位およびＳａｃＩの制限酵素切断部位が含まれる。ＰＣＲの条件は以下の通りである。
段階１：９４℃１分間１サイクル、段階２：９４℃３０秒間、５５℃３０秒間、７２℃２．５分間（２５サイクル）、段階３：７２℃１０分間１サイクル、その後４℃で保持した。
ＰＣＲ生成物はＰＣＲ精製キット（ｉｌｌｕｓｔｒａ ＧＦＸ−９６ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ；ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）で精製し、１％アガロースＴＡＥゲルで１００Ｖ４５分間電気泳動を行った。得られたバンドをゲル抽出キット（ｉｌｌｕｓｔｒａ ＧＦＸ ＰＣＲ ＤＮＡ Ｂａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ；ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）で精製した。次に、ＮｃｏＩ制限酵素およびＳａｃＩ制限酵素を用いて切断されたｐＥＴＭ１１ベクター（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）とＰＣＲ生成物とのライゲーションを行った。制限酵素による消化反応は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ製ＮｃｏＩ制限酵素およびＳａｃＩ制限酵素を用いて３７℃１時間行い、電気泳動で精製した後、ゲル抽出キットで精製した。
ライゲーション反応は、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）で室温にて終夜行った。
ライゲーションで得られたベクターをＤＨ５ａ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌ（Ｂｉｏｍｅｄａｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）で形質転換させ、得られた形質転換体を、カナマイシンを含むＬＢ培地で３７℃終夜培養し、一部培地からプラスミドを抽出し、挿入されたＤＮＡフラグメントの配列が正しいことをＤＮＡシーケンサー（３７３０ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）で確認した。
２．２．１．３．Ａ−ｐＥＴＭ１１ベクター（終止コドン無しの単量体Ｚドメインベクター）の構築
プライマー１５３，１５６の代わりに、フォワードプライマーとしてプライマー１５３およびリバースプライマーとしてプライマー１５４（配列番号６）を用いて、実験２．２．１．２．と同様にＡ−ｐＥＴＭ１１ベクターを構築した。なお、ＤＮＡフラグメントの挿入は、ｐＥＴＭ１１のＮｃｏＩ切断部位およびＥｃｏＲＩ切断部位を利用している。
（ｉｉ）ステップ２
次に、Ａ−ｐＥＴＭ１１ベクターにもう一個Ｚドメインを付加して、ＥｃｏＲＩ切断部位およびＳａｃＩ切断部位を有する２量体Ｚドメインベクター（ＡＢ−ｐＥＴＭ１１）を構築した。
２．２．１．４．ＳＰ２Ｚ−ｐＥＴＭ１１ベクター（終止コドン有りの２量体Ｚドメインベクター）の構築
ＳＰＺＫ ＤＮＡ（配列番号３）をテンプレートとし、フォワードプライマーとしてプライマー１５５（配列番号７）およびリバースプライマーとしてプライマー１５６を用いて、ＰＣＲでＥｃｏＲＩ切断部位およびＳａｃＩ切断部位を有する単量体ＺドメインのＤＮＡを調製し、Ａ−ｐＥＴＭ１１のＥｃｏＲＩ切断部位およびＳａｃＩ切断部位に挿入した。実験は実験２．２．１．２．と同様の条件で行った。
２．２．１．５．ＡＢ−ｐＥＴＭ１１ベクター（終止コドンなしの２量体Ｚドメインベクター）の構築
ＳＰＺＫ ＤＮＡ（配列番号３）をテンプレートとし、フォワードプライマーとしてプライマー１５５およびリバースプライマーとしてプライマー１５７（配列番号９）を用いて、ＰＣＲでＥｃｏＲＩ切断部位およびＳａｃＩ切断部位を有する終止コドンなしの単量体ＺドメインのＤＮＡを調製し、Ａ−ｐＥＴＭ１１のＥｃｏＲＩ切断部位およびＳａｃＩ切断部位に挿入して、ＡＢ−ｐＥＴＭ１１ベクターを構築した。実験は実験２．２．１．２．と同様の条件で行った。
（ｉｉｉ）ステップ３
次いで、ＡＢ−ｐＥＴＭ１１ベクターに更にもう一個Ｚドメインを付加して、ＳａｃＩ切断部位およびＨｉｎｄ ＩＩＩ切断部位を有する３量体Ｚドメインベクター（ＡＢＣ−ｐＥＴＭ１１）を構築した。
２．２．１．６．ＳＰ３Ｚ−ｐＥＴＭ１１ベクター（終止コドン有りの３量体Ｚドメインベクター）の構築
ＳＰＺＫ ＤＮＡ（配列番号３）をテンプレートとし、フォワードプライマーとしてプライマー１５８（配列番号１０）およびリバースプライマーとしてプライマー１６１（配列番号１３）を用いて、ＰＣＲでＳａｃＩ切断部位およびＸｈｏＩ切断部位を有する単量体ＺドメインのＤＮＡを調製し、ＡＢ−ｐＥＴＭ１１のＥｃｏＲＩ切断部位およびＳａｃＩ切断部位に挿入した。実験は実験２．２．１．２．と同様の条件で行った。
２．２．１．７．ＡＢＣ−ｐＥＴＭ１１ベクター（終止コドン無しの３量体Ｚドメインベクター）の構築
ＳＰＺＫ ＤＮＡ（配列番号３）をテンプレートとし、フォワードプライマーとしてプライマー１５８およびリバースプライマーとしてプライマー１５９（配列番号１１）を用いて、ＰＣＲでＳａｃＩ切断部位およびＨｉｎｄＩＩＩ切断部位を有する終止コドン無しの単量体ＺドメインのＤＮＡを調製し、ＡＢ−ｐＥＴＭ１１のＳａｃＩ切断部位およびＨｉｎｄＩＩＩ切断部位に挿入して、ＡＢＣ−ｐＥＴＭ１１ベクターを構築した。実験は実験２．２．１．２．と同様の条件で行った。
（ｉｖ）ステップ４
最後に、ＡＢＣ−ｐＥＴＭ１１ベクターに４個目のＺドメインを付加して、ＨｉｎｄＩＩＩ切断部位およびＸｈｏＩ切断部位を有するＳＰ４Ｚ−ｐＥＴＭ１１ベクターを構築した。
２．２．１．８．ＳＰ４Ｚ−ｐＥＴＭ１１ベクター（終止コドン有りの４量体Ｚドメインベクター）の構築
ＳＰＺＫ ＤＮＡ（配列番号３）をテンプレートとし、プライマー１６０（配列番号１２）およびプライマー１６１を用いて、ＰＣＲでＨｉｎｄＩＩＩ切断部位およびＸｈｏＩ切断部位を有する単量体ＺドメインのＤＮＡを調製し、ＡＢＣ−ｐＥＴＭ１１のＨｉｎｄＩＩＩ切断部位およびＸｈｏＩ切断部位に挿入して、ＳＰ４Ｚ−ｐＥＴＭ１１ベクターを構築した。実験は実験２．２．１．２．と同様の条件で行った。
２．２．１．９．ＳＰ４Ｚの発現および精製
得られたＳＰ４Ｚ−ｐＥＴＭ１１ベクターをＥ．ｃｏｌｉ（ＢＬ２１株）細胞（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ製）に導入し、１８℃で１ｍＭのＩＰＴＧ（イソプロピル-β-チオガラクトピラノシド；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製）を添加し、１５時間インキュベートして、組み換え型イムノグロブリン結合タンパク質（タンパク質１）を発現させた。誘導に先立って、吸光度（ＯＤ６００）が約０．６に到達するまで上記細胞を３７℃でインキュベートした。タンパク質発現後、細胞を回収し、ｐＨ８．０のトリス緩衝液中で破砕した。
得られた組み換え型イムノグロブリン結合タンパク質（ＳＰ４Ｚ）は、Ｎｉアフィニティークロマトグラフィー（Ｎｉ−ＮＴＡ（ニトリロトリ酢酸）粒子、キアゲン社製）によって精製された。精製されたイムノグロブリン結合タンパク質は陰イオン交換クロマトグラフィー（Ｑ−セファロースＦＦ、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）によって、さらに精製された。ＳＤＳゲル電気泳動によって確認されたイムノグロブリン結合タンパク質の純度は９６質量％であった。
また、得られた組み換え型イムノグロブリン結合タンパク質（ＳＰ４Ｚ）は、飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ）スペクトル分析により分子量を確認した。
上記で調製されたイムノグロブリン結合タンパク質ＳＰ４Ｚのアミノ酸配列を図１に示す。なお、図１において、ＲおよびＲ２は上記一般式（１）におけるＲおよびＲ２に対応し、Ｒ１およびｒは上記一般式（２）におけるＲ１およびｒに対応する。ｒ中の下線部はＴＥＶ切断部位を示す。また、図１におけるＺフラグメントは、配列番号１で表されるＺドメインのＣ末端のアミノ酸残基ＡＰＫを除去したアミノ酸配列を有する。
２．２．２．ＳＰ４ＺｗｏＨｉｓの作製
５０ｍＭ トリス塩酸、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ（エチレンジアミン４酢酸）、および１ｍＭ ＤＴＴ（ジチオスレイトール）のバッファー（ｐＨ８．０）１５ｍＬにＳＰ４Ｚ １５０ｍｇ、ＭｏｂｉＴＥＶプロテアーゼ（ＭｏＢｉＴｅｃ社）９００Ｕを加え３０℃で１２時間攪拌しＳＰ４ＺのＴＥＶ切断部位を切断した。ＴＥＶプロテアーゼで切断されたＳＰ４ＺをＮｉ−ＮＴＡカラム（容量：４ｍＬ）に通過させて、ＳＰ４Ｚのヒスチジンリンカーが切断された粗ＳＰ４ＺｗｏＨｉｓを回収した。得られた粗ＳＰ４ＺｗｏＨｉｓは陰イオン交換クロマトグラフィー（Ｑ−セファロースＦＦ、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）によって、ｐＨ７．５のＨＥＰＥＳ緩衝液中でさらに精製された。このタンパク質１ｗｏＨｉｓを遠心濃縮器（ビバスピン２０、ザルトリウス社製）にて濃縮した後、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳバーファー（ｐＨ７．５）中で１２時間透析して、ＳＰ４ＺｗｏＨｉｓ（配列番号４）を調製した。
２．３．合成例３（イムノグロブリン結合タンパク質の粒子への固定化）
２．３．１．固定化例１
１．１ｍＬのＰＢ、２０ｍｇのＳＰ４Ｚが１０ｍＬの０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ６．８）に分散した混合液を調製した後２．１ｇの硫酸ナトリウムを加え、２５℃で２４時間転倒混和し、ＳＰ４ＺをＰＢ（グリシジルメタクリレート・トリメチロールプロパントリメタクリレート・グリセリンモノメタクリレート共重合多孔質粒子）に結合させた。生成した粒子を濾過した後、５Ｍチオグリセロール１０ｍＬと混合し３０℃で４時間反応させ、残余のエポキシ基をブロッキングし、ＰＢＳ／０．０５％Ｔｅｅｅｎ２０で洗浄後、ＰＢＳで洗浄し、１．１ｍＬのＳＰ４Ｚ結合多孔質粒子（ＳＰ４Ｚ−ＰＢ）を得た。
２．３．２．固定化例２
固定化例１で、ＳＰ４Ｚの代わりにＳＰ４ＺｗｏＨｉｓを用いた以外は固定化例１と同様にして、１．１ｍｌのＳＰ４ＺｗｏＨｉｓ結合多孔質粒子（ＳＰ４ＺｗｏＨｉｓ−ＰＢ）を得た。
２．３．３．固定化例３
固定化例１でＰＢの代わりにＥｐｏｘｙ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ６Ｂ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いた以外は固定化例１と同様にして、１．１ｍｌのＳＰ４Ｚ結合アガロース粒子（タンパク質１−ＡＧ）を得た。
２．３．４．固定化例４
固定化例１でＰＢの代わりにＥｐｏｘｙ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ６Ｂ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）、ＳＰ４Ｚの代わりにＳＰ４ＺｗｏＨｉｓを用いた以外は固定化例１と同様にして、１．１ｍｌのＳＰ４ＺｗｏＨｉｓ結合アガロース粒子（ＳＰ４ＺｗｏＨｉｓ−ＡＧ）を得た。
２．４．試験例
２．４．１．測定例１（イムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）動的結合容量の測定）
ＳＰ４Ｚ−ＰＢ、ＳＰ４ＺｗｏＨｉｓ−ＰＢ、ＳＰ４Ｚ−ＡＧ、ＳＰ４ＺｗｏＨｉｓ−ＡＧをそれぞれ内径０．５ｃｍのカラムにベッド高５ｃｍまで詰めた。各カラムを２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４）で平衡化した後、ヒトポリクローナルＩｇＧ（５ｍｇ／ｍＬ）を含む２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４）を、線流速６０ｃｍ／時間で流し、吸光度モニターで溶出液中のヒトポリクローナルＩｇＧが１０％ブレークスルー（破過）したときのヒトポリクローナルＩｇＧ吸着量を充填剤体積で割り算して充填剤の単位体積当たりの動的結合容量を求めた。結果を表１に示す。
Figure 2011118599
２．４．２．測定例２（耐アルカリ性の測定）
測定例１で用いた各充填剤を詰めたカラムを低圧クロマトグラフィーシステム（ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ ｐｌｕｓ；ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）にセットし、０．１Ｍ水酸化ナトリウム１０ｍｌをカラム内に流した。カラムを装置から外し、密閉した後室温で一定時間放置した後、測定例１と同様に、線流速６０ｃｍ／時間におけるヒトポリクローナルＩｇＧの結合容量を測定した。０．１Ｍ水酸化ナトリウムで処理する前のヒトポリクローナルＩｇＧ結合量を１００％とした時の結合容量維持率を求めた。その結果を図３に示す。
図３によれば、ヒスチジンリンカーを有するイムノグロブリンタンパク質（ＳＰ４Ｚ）が結合した充填剤（ＳＰ４Ｚ−ＰＢ、ＳＰ４Ｚ−ＡＧ）は、ヒスチジンリンカーを有さないイムノグロブリンタンパク質が結合した充填剤（ＳＰ４ＺｗｏＨｉｓ−ＰＢ、ＳＰ４ＺｗｏＨｉｓ−ＡＧ）と比較して、アルカリ接触時間が長くなっても、結合容量の維持率の低下が小さかった。このことから、上記一般式（１）で表されるタンパク質リガンドが固定化された充填剤は、耐アルカリ性に優れていることが確認された。
本発明は、上述した実施形態に限定されるものではなく、さらなる種々の変形が可能である。また本発明は、実施形態で説明した構成と実質的に同一の構成（例えば、機能、方法および結果が同一の構成、あるいは目的および結果が同一の構成）を含む。また、本発明は、実施形態で説明した構成の本質的でない部分を置き換えた構成を含む。また、本発明は、実施形態で説明した構成と同一の作用効果を奏する構成または同一の目的を達成することができる構成を含む。また、本発明は、実施形態で説明した構成に公知技術を付加した構成を含む。

Claims (4)

  1. 下記一般式（１）で表されるタンパク質リガンドが担体に固定化された、アフィニティークロマトグラフィー用充填剤。
    Ｒ−Ｒ２ ・・・・・（１）
    （式中、Ｒは４〜２０個のヒスチジンが連続した部位を含む４〜３００個のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を示し、Ｒ２はプロテインＡのＺドメイン若しくはそのフラグメント又はこれらの変異体を含む５０〜５００個のアミノ酸残基からなる、イムノグロブリンと結合可能なアミノ酸配列を示す。ここで、ＲはＲ２のＣ末端またはＮ末端に結合する。）
  2. 前記一般式（１）で表されるタンパク質リガンド中のアミノ基が、エポキシ基を有する前記担体に固定化されている、請求項１に記載のアフィニティークロマトグラフィー用充填剤。
  3. 前記担体が開環エポキシ基として置換２，３−ジヒドロキシプロピル基を含む、請求項２に記載のアフィニティークロマトグラフィー用充填剤。
  4. 請求項１〜３のいずれか１項に記載のアフィニティークロマトグラフィー用充填剤にイムノグロブリンを吸着させる工程、
    該イムノグロブリンを溶出させる工程、および
    該充填剤をアルカリ性液で洗浄する工程
    を含む、イムノグロブリンを単離する方法。
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