WO2013133258A1 - 抗体精製方法および抗体精製用の担体 - Google Patents

抗体精製方法および抗体精製用の担体 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to an antibody purification method and a carrier for antibody purification.
  • an ammonium sulfate precipitation method fractional precipitation method using ammonium sulfate as a precipitant is often used.
  • ammonium sulfate precipitation method the salting out phenomenon of the protein is used, and there is a difference in the concentration of ammonium sulfate (ammonium sulfate) that is salted out between the antibody and other mixed proteins. Collect the supernatant.
  • the ammonium sulfate precipitation method is a method capable of processing a large amount of antibody at a low cost, but requires a complicated study to determine the ammonium sulfate concentration for separating the antibody, and the amount of the obtained antibody is large. Therefore, it is difficult to adapt to a small amount of antibody because it usually requires a desalting treatment such as dialysis and a lot of antibody is lost due to the desalting treatment. Therefore, when purifying an antibody using the ammonium sulfate precipitation method, it is usually necessary to carry out in combination with other purification methods in order to increase the purity of the obtained antibody.
  • affinity chromatography In order to purify IgG type antibodies with high purity, affinity chromatography using a carrier bound with a protein having a binding property to an antibody molecule such as protein A or protein G as a ligand is widely used.
  • affinity chromatography an antibody-containing specimen and a carrier are brought into contact with each other in a neutral liquid state to bind the antibody to the carrier, and then the antibody is eluted using an acidic eluate having a pH of about 2 to 3. The antibody can be recovered.
  • IgM type antibodies have low affinity with protein A and protein G, and cannot be appropriately purified by affinity chromatography (Japanese Patent Application Laid-Open No. 2007-33080).
  • purification methods such as gel filtration chromatography and ion exchange chromatography, and combinations thereof, and a simple and practical purification method has been demanded.
  • the present invention provides an antibody purification method and a carrier for antibody purification that can suppress inactivation due to antibody denaturation during purification.
  • a carrier having a 2,3-dihydroxypropyl group as a ligand adsorbs an antibody in a solution having a pH of 3.0 or more and less than 5.6, and that the antibody can be purified using such a carrier. I found it.
  • the antibody purification method includes a step of contacting a solution containing an antibody having a pH of 3.0 or more and less than pH 5.6 with a carrier having a 2,3-dihydroxypropyl group, and the carrier that has undergone the above steps. Contacting with an eluate having a pH of 5.6 or more and less than pH 10.
  • the antibody may be an immunoglobulin.
  • the carrier according to another embodiment of the present invention is a carrier for antibody purification having a 2,3-dihydroxypropyl group, and has the 2,3-dihydroxypropyl group on the surface.
  • the carrier can be a porous particle.
  • the carrier can be a particle containing a magnetic substance.
  • the antibody is adsorbed to the ligand in a solution having a pH of 3.0 or more and less than pH 5.6 to elute impurities, and then eluted with a relatively neutral aqueous solution having a pH of 5.6 or more and less than pH 10.
  • a relatively neutral aqueous solution having a pH of 5.6 or more and less than pH 10.
  • the above antibody purification method is a novel and useful antibody purification method based on a principle that is completely different from known antibody purification methods such as the ammonium sulfate precipitation method and the affinity chromatography method described in the background art section.
  • FIG. 1 shows the results obtained in Example 1 using a crudely purified IgG solution, a solution obtained in the adsorption step, and a solution recovered in the elution step by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (hereinafter referred to as “SDS-PAGE”). It is a figure which shows an evaluation result.
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of SDS-PAGE evaluation of the dispersion supernatant collected in the adsorption step in Example 2.
  • FIG. 3 is a diagram showing the results of SDS-PAGE evaluation of the dispersion supernatant collected in the adsorption step in Comparative Example 1.
  • FIG. 1 shows the results obtained in Example 1 using a crudely purified IgG solution, a solution obtained in the adsorption step, and a solution recovered in the elution step by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (hereinafter referred to as “SDS-
  • FIG. 4 is a diagram showing the results of evaluation by SDS-PAGE of the solution collected in the elution step in Example 3.
  • FIG. 5 is a diagram showing the results of SDS-PAGE evaluation of the solutions collected in the elution step in Example 4 and Comparative Example 2.
  • the carrier according to one embodiment of the present invention is an antibody purification carrier having a 2,3-dihydroxypropyl group (HO—CH 2 —CH (OH) —CH 2 —) (hereinafter simply referred to as “ It is also referred to as a “carrier”, and a 2,3-dihydroxypropyl group is used as a ligand for antibody adsorption.
  • a 2,3-dihydroxypropyl group HO—CH 2 —CH (OH) —CH 2 —
  • the term “having a 2,3-dihydroxypropyl group” means that a 2,3-dihydroxypropyl group is present at the end of a molecule constituting the carrier.
  • the end of the 2,3-dihydroxypropyl group such as 3,4-dihydroxybutyl group, 4,5-dihydroxypentyl group, 2,3-dihydroxypropyloxy group, 2,3-dihydroxypropylthio group
  • a group having another name having a structure is a group having a 2,3-dihydroxypropyl group, assuming that the carrier has a 2,3-dihydroxypropyl group.
  • Examples of the carrier according to the present embodiment include porous particles, particles containing a magnetic material, filtration filters, fibers for filtration, particles for chromatography columns, particles for batch processing, and the like, porous particles described later, or The particle
  • the carrier according to this embodiment preferably has a 2,3-dihydroxypropyl group on the surface.
  • the carrier according to this embodiment can have at least a surface composed of a polymer portion and have a 2,3-dihydroxypropyl group on at least the surface of the polymer portion.
  • the polymer part may be formed by copolymerizing a monomer part containing a monomer having a 2,3-dihydroxypropyl group, or a monomer that generates a 2,3-dihydroxypropyl group by hydrolysis.
  • 2,3-dihydroxypropyl group may be formed by copolymerization of the monomer part to be contained and then hydrolysis.
  • the carrier according to the present embodiment may be entirely composed of a polymer part, or may have a core / shell structure, and the polymer part may be a shell.
  • the 2,3-dihydroxypropyl group has a function as a ligand when the antibody is adsorbed.
  • the amount of 2,3-dihydroxypropyl group is preferably 10 ⁇ mol / g or more, more preferably 50 ⁇ mol / g or more, based on the solid content of the particles when the whole carrier is a polymer part. Most preferably, it is 100 ⁇ mol / g or more. If the amount of 2,3-dihydroxypropyl group is less than 10 ⁇ mol / g, the function as a ligand for adsorbing an antibody may not be sufficiently exhibited.
  • the amount of 2,3-dihydroxypropyl group can be determined by titration of the amount of hydroxyl group according to JIS K 0070. Usually, the amount of hydroxyl groups is twice the amount of 2,3-dihydroxypropyl groups.
  • the residue derived from the monomer listed in “1.2. Production” can be purified even if it coexists with a 2,3-dihydroxypropyl group in the copolymerization range described later. Will not be damaged.
  • sugar chains such as amino groups, monosaccharides, and heparin can also be introduced into the carrier without degrading the antibody purification characteristics of the carrier.
  • the amount of carboxyl groups introduced is preferably 10 ⁇ mol / g or less, more preferably 1 ⁇ mol / g or less, based on the solid content of the particles. And most preferably 0.1 ⁇ mol / g or less.
  • the number average particle size (hereinafter simply referred to as “particle size”) of the carrier according to the present embodiment is preferably 0.1 to 500 ⁇ m, more preferably 0.3 to 200 ⁇ m, and most preferably 0. .5 to 100 ⁇ m.
  • the particle size can be determined by a laser diffraction / scattering method.
  • the carrier according to this embodiment can be produced by forming a polymer part obtained by copolymerizing a monomer part on at least the surface.
  • a polymer part obtained by copolymerizing a monomer part on at least the surface.
  • Monomer (A) According to the present embodiment, copolymerization is performed using a monomer portion containing a monomer (A) that generates a 2,3-dihydroxypropyl group by hydrolysis (described later. Hereinafter, also simply referred to as “monomer (A)”). When the carrier is produced, hydrolysis before and during the polymerization of the monomer (A) can be prevented.
  • the monomers (A) to (C) are preferably radical polymerizable monomers.
  • the carrier according to the present invention is preferably obtained by subjecting particles having at least a polymer part obtained by copolymerizing a monomer part containing the monomer (A) to a hydrolysis treatment.
  • a hydrolysis treatment by using the monomer (A), it becomes possible to stably introduce more 2,3-dihydroxypropyl groups into the polymer part, and the polymerization stability can be improved.
  • the carrier dispersion after the hydrolysis treatment is preferably washed with water by a centrifugal separation method, a magnetic separation method or the like to remove the remaining hydrolysis catalyst.
  • Examples of the monomer (A) include monomers in which a hydroxyl group is protected with a known protecting group.
  • (A-1) a monomer having a 2,3-epoxypropyl group
  • (A-2) 2,3-dihydroxy
  • examples thereof include a monomer obtained by acetalizing a propyl group and a monomer obtained by silylated a (A-3) 2,3-dihydroxypropyl group.
  • the monomer (A-1) having a 2,3-epoxypropyl group include glycidyl (meth) acrylate and allyl glycidyl ether.
  • A-2) Specific examples of the monomer obtained by acetalizing the 2,3-dihydroxypropyl group include 1,3-dioxolan-2-one-4-ylmethyl (meth) acrylate and 1,3-dioxolane-2. , 2-dimethyl-4-ylmethyl (meth) acrylate and the like.
  • the conditions for hydrolysis of the functional group derived from the monomer (A) depend on the type of the monomer (A), but usually, heating conditions under the condition that particles are dispersed in water and an acid, base, or fluoride salt is used as a catalyst. Under stirring, the mixture is stirred for several hours to several tens of hours for hydrolysis.
  • the hydrolysis of the functional group derived from the monomer (A) does not necessarily require that all the functional groups in the copolymer are hydrolyzed as long as storage stability is not hindered.
  • the hydrolysis of the functional group derived from the monomer (A) is usually carried out after the polymerization of the monomer part, but a part thereof may be hydrolyzed during the polymerization.
  • the ratio of the monomer (A) in the monomer part used is preferably 40 to 95% by weight and more preferably 50 to 90% by weight in 100% by weight of the monomer part. If the ratio of the monomer (A) in the monomer part is less than 40% by weight, nonspecific adsorption may increase. On the other hand, if it exceeds 95% by weight, the carrier becomes water-soluble and the structure as a carrier is increased. You may not be able to keep.
  • the carrier according to the present embodiment preferably has a particle surface obtained by copolymerizing a crosslinkable monomer (B) (hereinafter also simply referred to as “monomer (B)”). That is, in this case, the monomer part further includes a crosslinkable monomer (B). By polymerizing the monomer part containing the monomer (B), a porous carrier can be obtained.
  • the crosslinkable monomer (B) is a monomer that can be copolymerized with the monomer (A) and the like and has two or more radically polymerizable unsaturated bonds in one molecule.
  • Examples of the crosslinkable monomer (B) include ethylene glycol diacrylate, ethylene glycol dimethacrylate, trimethylolpropane triacrylate, trimethylolpropane trimethacrylate, pentaerythritol triacrylate, pentaerythritol trimethacrylate, dipentaerythritol hexaacrylate, dipentaerythritol.
  • Examples include polyfunctional (meth) acrylates such as hexamethacrylate, conjugated diolefins such as butadiene and isoprene, divinylbenzene, diallyl phthalate, allyl acrylate, and allyl methacrylate.
  • Examples of the crosslinkable monomer further include hydrophilic monomers such as polyethylene glycol diacrylate, polyethylene glycol dimethacrylate, and poly (meth) acrylic ester of polyvinyl alcohol.
  • the ratio of the crosslinkable monomer (B) is preferably 0 to 30% by weight, more preferably 5 to 20% by weight in 100% by weight of the copolymer. When the ratio of the monomer (B) in the copolymer exceeds 30% by weight, nonspecific adsorption may be increased.
  • the carrier according to the present embodiment may have a particle surface obtained by copolymerizing the monomer (C) other than the monomer (A) and the monomer (B) (other monomer (C)).
  • Other monomers (C) include (meth) acrylates having a hydrophilic functional group such as 2-hydroxyethyl acrylate, 2-hydroxyethyl methacrylate, methoxyethyl acrylate, methoxyethyl methacrylate, polyethylene glycol monoacrylate, and polyethylene glycol monomethacrylate.
  • Hydrophilic monomers such as acrylamide, methacrylamide, N-methylol acrylamide, N-methylol methacrylamide, diacetone acrylamide, and aromatic vinyl monomers such as styrene, ⁇ -methylstyrene, halogenated styrene, vinyl acetate, Vinyl esters such as vinyl propionate, unsaturated nitriles such as acrylonitrile, methyl acrylate, methyl methacrylate, ethyl acrylate Ethylenic unsaturation such as ethyl methacrylate, butyl acrylate, butyl methacrylate, 2-ethylhexyl acrylate, 2-ethylhexyl methacrylate, lauryl acrylate, lauryl methacrylate, stearyl acrylate, stearyl methacrylate, cyclohexyl acrylate, cyclohexyl methacrylate, isobornyl acrylate
  • the other monomer (C) a monomer having unprotected 2,3-dihydroxypropyl such as 2,3-dihydroxypropyl (meth) acrylate may be used as long as the effects of the present invention are not hindered.
  • the amount of the other monomer (C) is the remaining amount other than the monomer (A) and the monomer (B) described above.
  • the carrier according to this embodiment can be produced using a conventional method such as emulsion polymerization, soap-free polymerization, suspension polymerization, or the like. More specifically, the carrier according to the present embodiment can be obtained, for example, by suspension polymerization or soap-free polymerization of the vinyl monomer.
  • the carrier according to this embodiment is a two-stage swelling polymerization method using seed particles (mother particles) described in Japanese Patent Publication No. 57-24369, Journal of Polymer Science Polymer Letter Edition, page 937, 21st. Vol., 1963 (J. Polymer. Sci., Polymer Letter Ed.
  • the two-stage swelling polymerization method using seed particles is preferable because the coefficient of variation in particle size can be reduced.
  • seed particles mother particles
  • polystyrene or a styrene copolymer can be used as the seed particles (mother particles).
  • the polymer portion added by the two-stage swelling polymerization method is composed of the above-mentioned monomers (A) to (C).
  • Examples of the emulsifier that can be used in the copolymerization of the monomers (A) to (C) include anionic surfactants such as alkyl sulfate ester salts, alkylaryl sulfate ester salts, alkyl phosphate ester salts, and fatty acid salts; Cationic surfactants such as amine salts and alkyl quaternary amine salts; Nonionic surfactants such as polyoxyethylene alkyl ethers, polyoxyethylene alkyl aryl ethers and block polyethers; Carboxylic acid types (for example, amino acid types, Amphoteric surfactants such as betaine acid type), sulfonic acid type, etc., under the trade names Latemul S-180A, PD-104 (manufactured by Kao), Eleminol JS-2 (manufactured by Sanyo Kasei), Aqualon HS-10, KH-10, RN-10, RN-20, RN-30, RN
  • any of reactive emulsifiers such as Adekari Soap SE-10N, SR-10, NE-20, NE-30, NE-40 [Asahi Denka Kogyo Co., Ltd.], Antox MS-60 [Nihon Emulsifier Co., Ltd.] It can be used.
  • what has a dispersion function among the polymers which have a hydrophilic group can also be used as an emulsifier.
  • polymers examples include styrene / maleic acid copolymer, styrene / acrylic acid copolymer, polyvinyl alcohol, polyalkylene glycol, sulfonated polyisoprene, sulfonated hydrogenated styrene / butadiene copolymer, styrene / Examples thereof include a sulfonated product of a maleic acid copolymer and a sulfonated product of a styrene / acrylic acid copolymer. These emulsifiers can be used alone or in combination of two or more.
  • the amount of the emulsifier used is not particularly limited, but is usually 0.1 to 50 parts by weight, preferably 0.2 to 20 parts per 100 parts by weight of the total amount of the monomers (A) to (C). Parts by weight, more preferably 0.5 to 5 parts by weight. If it is less than 0.1 part by weight, emulsification is not sufficient, and stability during radical polymerization is lowered, which is not preferable. On the other hand, if it exceeds 50 parts by weight, foaming becomes a problem, which is not preferable.
  • radical polymerization initiator used in the copolymerization of the monomers (A) to (C) include persulfates such as potassium persulfate, sodium persulfate, and ammonium persulfate, hydrogen peroxide, and t-butyl hydroperoxide.
  • the carrier according to the present embodiment may be particles containing a magnetic substance.
  • a magnetic substance for example, organic polymer particles containing a magnetic substance (hereinafter referred to as “magnetic substance-containing organic polymer particles”). ”). Since the magnetic substance-containing organic polymer particles can be separated using a magnet without using, for example, a centrifuge, it is useful in that the process of separating particles from a specimen can be simplified or automated. is there.
  • the magnetic substance-containing organic polymer particles are (I) particles in which magnetic fine particles are dispersed in a continuous phase of the polymer part, and (II) particles having a secondary aggregate of magnetic fine particles as a core and a polymer part as a shell.
  • an outer layer of a core particle including a secondary aggregate layer of the magnetic fine particles hereinafter, “core particle including a secondary aggregate layer of magnetic fine particles” is referred to as “mother particle”).
  • particles having a polymer portion are preferable.
  • the polymer portion used for the magnetic substance-containing organic polymer particles having various structures needs to have a 2,3-dihydroxypropyl group.
  • the interface between the core particle and its outer layer (magnetic layer) and the interface between the magnetic layer and its outer layer (organic polymer layer) may be in a state where components of both layers are mixed.
  • the most preferable magnetic substance-containing organic polymer particles have a polymer portion so as to further cover the core particles and the magnetic layer of superparamagnetic fine particles provided on the surface of the core particles. That is, in the magnetic substance-containing organic polymer particles, the core particles are formed of the core particles and the magnetic layer of superparamagnetic fine particles provided on the surface of the core particles, and the polymer portion is set as the shell.
  • the polymer portion is obtained by the above-described production method. That is, the crosslinked polymer is obtained by polymerizing a monomer part composed of 40 to 95 parts by weight of the monomer (A), 0 to 30 parts by weight of the crosslinkable monomer (B), and 0 to 55 parts by weight of the other monomer (C). A polymer is obtained and obtained by hydrolyzing the copolymer.
  • a method for producing a mother particle in which a magnetic layer of superparamagnetic fine particles is formed on the surface of a core particle for example, non-magnetic organic polymer particles and superparamagnetic fine particles are dry blended, and a physically strong force is externally applied.
  • a physically strong force for example, a mortar, an automatic mortar, a ball mill, a blade pressurizing powder compression method, a method using a mechanochemical effect such as a mechanofusion method, a jet mill, a hybridizer, etc. And those using the high-speed air-flow impact method. It is desirable that the physical adsorption force is strong in order to efficiently and strongly perform the composite.
  • the method may be carried out in a vessel equipped with a stirring blade at a peripheral speed of the stirring blade of preferably 15 m / second or more, more preferably 30 m / second or more, and further preferably 40 to 150 m / second.
  • a peripheral speed of the stirring blade preferably 15 m / second or more, more preferably 30 m / second or more, and further preferably 40 to 150 m / second.
  • the peripheral speed of the stirring blade is lower than 15 m / sec, it may not be possible to obtain sufficient energy to adsorb the superparamagnetic fine particles on the surface of the nonmagnetic organic polymer particles.
  • the superparamagnetic fine particles used in the present invention for example, ferrite and / or magnetite fine particles having a particle diameter of about 5 to 20 nm can be preferably used.
  • the polymer part (shell) is composed of 40 to 95 parts by weight of a monomer (A) that generates a 2,3-dihydroxypropyl group by hydrolysis, 0 to 30 parts by weight of a crosslinkable monomer (B), and other monomers (C) 0 It can be formed by copolymerizing a monomer part consisting of ⁇ 55 parts by weight in the presence of the base particle (core).
  • a monomer component is as described above.
  • a more specific polymerization method is as disclosed in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2004-205481.
  • the conditions for the hydrolysis treatment after polymerization are also as described above. When the magnetic substance-containing organic polymer particles are hydrolyzed under particularly strong acidic conditions, the superparamagnetic fine particles may be dissolved. Therefore, the hydrolysis is preferably performed under weak acid to base conditions.
  • the mother particles having the superparamagnetic fine particle magnetic layer formed on the surface of the core particles are mixed with 0 to 30 parts by weight of the crosslinkable monomer (B) and other parts.
  • the crosslinkable monomer (B) After forming a coating layer using another monomer part composed of 70 to 100 parts by weight of monomer (C), 40 to 95 parts by weight of monomer (A) and a crosslinkable monomer ( B)
  • a monomer part consisting of 0 to 30 parts by weight and another monomer (C) 0 to 55 parts by weight particles forming a polymer part (shell) are obtained, and the particles are hydrolyzed.
  • magnetic material-containing organic polymer particles may be formed.
  • hydrolysis conditions having a wide range of strong acidity to strong basicity can be selected in the above-described hydrolysis treatment.
  • the carrier according to this embodiment is used for purifying an antibody by binding an antibody using a 2,3-dihydroxypropyl group as a ligand for antibody adsorption.
  • the solution containing the antibody to be purified in this case include a cell culture solution containing a hybridoma, an antibody solution purified by ammonium sulfate precipitation, and the like.
  • the carrier according to the present embodiment is also used for the purpose of exchange of buffer solution (buffer exchange), desalting, removal of unintended components such as preservatives, stabilizers, and surfactants, etc. with respect to the purified antibody. I can do it.
  • the antibody to be purified is not limited in its class, and may be five types of immunoglobulins, IgG, IgA, IgM, IgD, and IgE. There is no restriction
  • An antibody purification method comprises a step of contacting a solution containing an antibody having a pH of 3.0 or more and less than pH 5.6 with a carrier having a 2,3-dihydroxypropyl group, And the step of contacting the carrier that has undergone the above step with an eluate having a pH of 5.6 or more and less than pH 10. More specifically, the method for purifying an antibody according to one embodiment of the present invention includes a step of contacting a solution containing an antibody having a pH of 3.0 or more and less than pH 5.6 with a carrier having a 2,3-dihydroxypropyl group. The antibody is eluted from the carrier in the step of adsorbing the antibody on a carrier and contacting the carrier that has undergone the above step with an eluate having a pH of 5.6 or more and less than pH 10.
  • the antibody In the step of adsorbing the antibody to the carrier, if the pH of the solution is less than 3.0, the antibody may be irreversibly denatured. On the other hand, when the pH of the solution is 5.6 or more, the antibody tends to be difficult to adsorb on the carrier. In the step of adsorbing the antibody to the carrier, a more preferable pH of the solution is pH 3.5 or more and less than pH 5.6. Examples of the solution used here include a MES buffer solution.
  • the step of eluting the antibody from the carrier if the pH of the eluate is less than 5.6, the antibody tends to be difficult to elute in the eluate. On the other hand, if the pH of the solution is 10 or more, It may be difficult to use as it is in the reaction. In the step of eluting the antibody from the carrier, a more preferable pH of the solution is pH 6.0 or more and less than pH 10. Examples of the eluent used here include a phosphate buffer solution, a borate buffer solution, a Hepes buffer solution, and a Tris buffer solution.
  • examples of antibodies to be purified in the antibody purification method according to the present embodiment include those exemplified in the above section “1.4. Applications”.
  • Synthesis Example 1 Synthesis of porous particles having 2,3-dihydroxypropyl group as a ligand 110 g of glycidyl methacrylate (Mitsubishi Rayon Co., Ltd., hereinafter referred to as “GMA”) and 73 g of trimethylolpropane trimethacrylate (Sartomer Co., hereinafter referred to as “TMP”), 200 g of diisobutyl ketone (Mitsui Chemicals) and acetophenone It was dissolved in 97 g (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), and 2.4 g of 2,2′-azoisobutyronitrile (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added to prepare an organic monomer solution.
  • GMA glycidyl methacrylate
  • TMP trimethylolpropane trimethacrylate
  • TMP trimethylolpropane trimethacrylate
  • DEP diiso
  • the obtained organic monomer solution and the aqueous solution were put into a 7 L separable flask equipped with a baffle, a thermometer, a stirring blade and a cooling pipe were attached, set in a hot water bath, and stirred at 350 rpm in a nitrogen atmosphere. Started. Subsequently, the separable flask was heated with a hot water bath and stirred at 85 ° C. for 5 hours.
  • the amount of hydroxyl groups in the obtained particles was quantified according to JIS K 0070. Part of the obtained particles was dried under reduced pressure, 0.2 g was separated, and 5 ml of an acetic anhydride / pyridine solution was added as an acetylating agent and reacted at 100 ° C. for 1 hour. After allowing to cool, 1 ml of pure water was added and heated again at 100 ° C. for 10 minutes to decompose acetic anhydride. After allowing to cool, titration with 0.5 M potassium hydroxide ethanol solution using phenolphthalein as an indicator to determine the amount of hydroxyl group was 4.9 mmol / g.
  • Example 1 Purification of antibody from purified ammonium sulfate precipitate IgG
  • Hybridomas producing mouse monoclonal IgG antibodies were cultured in the presence of 20% fetal bovine serum from which bovine IgG was removed.
  • Mouse monoclonal IgG antibody produced in the culture supernatant was precipitated with 50% saturated ammonium sulfate.
  • the obtained precipitate was dissolved in a PBS ( ⁇ ) buffer solution, and excess ammonium sulfate was desalted by dialysis against PBS ( ⁇ ) to obtain a crude purified IgG (immunoglobulin G) solution.
  • the protein concentration when the absorbance at 280 nm is 1.4 is 1.0 mg / ml
  • the protein concentration of the solution obtained from the absorbance measurement was 3.3 mg / ml.
  • the purity of IgG was 40%.
  • This purified IgG solution may contain medium-derived bovine serum albumin or the like as impurities.
  • the antibody purification method of the present invention was applied to this crudely purified IgG solution.
  • the crude purified IgG solution 0.5 ⁇ l, the solution 10 ⁇ l obtained in the adsorption step, and the 10 ⁇ l solution recovered in the elution step were evaluated by SDS-PAGE (FIG. 1).
  • lanes 1 to 6 are, in order, crudely purified IgG, the supernatant of the adsorption step, elution with 100 mM phosphate buffer (pH 7.4), 100 mM phosphate buffer + 0.5M.
  • the patterns of elution with NaCl (pH 7.4), elution with 100 mM borate buffer (pH 8.5), and elution with 100 mM borate buffer + 0.5 M NaCl (pH 8.5) are shown.
  • M represents a molecular weight marker
  • i represents an impurity
  • IgG HC represents an IgG heavy chain
  • IgG LC represents an IgG light chain.
  • impurities in the roughly purified IgG solution did not bind to the particles in the adsorption step and were confirmed in the supernatant (lane 2).
  • IgG adsorbed on the particles was eluted in the elution step and collected in the supernatant of the eluate (lane 3).
  • the purity of the collected IgG was 99% or higher, and the recovery rate was 95% or higher.
  • IgG in the crude purified IgG solution can be recovered as a solution of a buffer solution with high purity and near neutrality.
  • IgG could be recovered in a buffer solution near neutrality, IgG could be recovered immediately in a state where it could be used in other steps (for example, quantification of IgG).
  • Example 2 (Effect of pH in antibody adsorption process) 1 mg of the porous particles having 2,3-dihydroxypropyl group as a ligand, obtained in Synthesis Example 1, is a value having a pH in the range of 5.0 to 7.0 (from pH 5.0 to 7.0, 0. After dispersion in 190 ⁇ l of a 100 mM MES buffer solution adjusted to a value increased by 2 (see FIG. 2), 10 ⁇ l of a crude purified IgG solution was added and shaken at room temperature for 60 minutes. Centrifugation was performed at 10,000 g for 5 minutes, and the supernatant of the dispersion was collected with a pipette (adsorption process).
  • Comparative Example 1 (Acetylation of porous particles having 2,3-dihydroxypropyl group as a ligand) A porous particle dispersion was prepared by dispersing 1.0 g of a dry powder of porous particles having a 2,3-dihydroxypropyl group as a ligand obtained in Synthesis Example 1 in 9.0 g of pyridine.
  • pyridine was added to 2.5 g of acetic anhydride to prepare a 10 ml solution, and 1.0 ml of this solution was added to the dispersion of porous particles and reacted at 100 ° C. for 2 hours. Then, 2.0 ml of pure water was added and reacted at 100 ° C. for an additional hour. The particles were collected using a Kiriyama funnel, washed well with pure water and dried to obtain acetylated particles in which 2,3-dihydroxypropyl groups were acetylated.
  • this acetylated particle is adjusted to a predetermined value in the range of pH 5.0 to 7.0 (value increased by 0.2 from pH 5.0 to 7.0, see FIG. 3).
  • a predetermined value in the range of pH 5.0 to 7.0 (value increased by 0.2 from pH 5.0 to 7.0, see FIG. 3).
  • 10 ⁇ l of a crude purified IgG solution was added and shaken at room temperature for 60 minutes. Centrifugation was performed at 10,000 g for 5 minutes, and the supernatant of the particles was collected with a pipette (adsorption process).
  • IgG during crude purification was not adsorbed to acetylated particles. That is, when acetylated particles were used, impurities and IgG could not be separated. Thus, it was confirmed that the purification of IgG according to Example 1 was due to specific binding between the 2,3-dihydroxypropyl group of the particles and IgG.
  • R represents roughly purified IgG
  • B represents a non-adsorption range.
  • Example 3 Purification of IgM antibody from hybridoma culture supernatant
  • Hybridomas producing mouse monoclonal IgM antibodies were cultured in the presence of 20% fetal calf serum. After culturing, the concentration of IgM contained in the culture supernatant was determined by ELISA. As a result, it was 30 ⁇ g / ml, and the IgM content contained in the total protein was 0.2%. From this hybridoma culture supernatant, purification of IgM was attempted directly using the particles of Synthesis Example 1.
  • lane 1 (L1) and lane 2 (L2) represent the patterns of the culture supernatant 2.5 ⁇ g / lane and the phosphate buffer (pH 7.4) eluate, respectively.
  • IgM HC indicates an IgM heavy chain.
  • Synthesis Example 2 Synthesis of organic polymer particles having 2,3-dihydroxypropyl group as a ligand on the surface and containing a magnetic substance inside
  • 2 parts by weight of a di (3,5,5-trimethylhexanoyl) peroxide solution (“Perloyl 355-75 (S)” manufactured by NOF Corporation) was mixed with 20 parts by weight of a 1% aqueous sodium dodecyl sulfate solution and placed in an ultrasonic disperser. This was put into a reactor containing 13 parts by mass of polystyrene particles having a particle size of 0.77 ⁇ m and 41 parts by mass of water and stirred for 12 hours at 25 ° C.
  • acetone is added to an oil-based magnetic fluid (trade name: “EXP series”, manufactured by Ferrotec Co., Ltd.) to precipitate and precipitate particles, which are then dried to have a surface that has been hydrophobized.
  • Ferrite-based magnetic fine particles (average primary particle size: 0.01 ⁇ m) were obtained.
  • 15 g of the core particles and 15 g of the hydrophobized magnetic fine particles are mixed well with a mixer, and this mixture is mixed with a blade (stirring) using a hybridization system NHS-0 type (manufactured by Nara Machinery Co., Ltd.).
  • the peripheral particles were treated at a peripheral speed of 100 m / sec (16200 rpm) for 5 minutes to obtain mother particles having a magnetic layer composed of magnetic fine particles having an average number particle diameter of 2.0 ⁇ m on the surface.
  • polymerization solvent an aqueous solution
  • a nonionic emulsifier trade name: “Emulgen 150”, manufactured by Kao Corporation
  • MMA methyl methacrylate
  • TMP methyl methacrylate
  • S parroyl 355-75
  • the particles in the separable flask were separated using magnetism, and then washed repeatedly using distilled water.
  • organic polymer particles containing a magnetic substance having 2,3-dihydroxypropyl groups on the surface thereof were obtained.
  • the obtained porous particles were dispersed in pure water so that the particle solid content was 10 wt%.
  • the amount of hydroxyl groups in the obtained particles was quantified in the same manner as in Synthesis Example 1, and was 0.45 mmol / g.
  • Example 4 Antibody purification using organic polymer particles having 2,3-dihydroxypropyl group as a ligand on the surface and containing a magnetic substance inside
  • 10 ⁇ l of the magnetic particles obtained in Synthesis Example 2 1.5 ⁇ l of the roughly purified IgG solution, and 38.5 ⁇ l of 100 mM MES buffer solution (pH 5.0) were placed in a test tube, mixed, and shaken at room temperature for 10 minutes.
  • the purity of IgG in the roughly purified IgG solution used here was 38% as a result of SDS-PAGE assay.
  • the components contained as impurities include bovine serum albumin derived from a medium.
  • the tube was placed on a magnetic stand to separate the particles magnetically, and the particle supernatant was removed with a pipette (adsorption process).
  • lane 1 (L1) and lane 2 (L2) represent the elution patterns of the crude purified IgG and the phosphate buffer (pH 7.4) of Example 4, respectively.
  • M represents a molecular weight marker
  • i represents an impurity
  • IgG HC represents an IgG heavy chain
  • IgG LC represents an IgG light chain.
  • the impurities observed in the roughly purified IgG solution were almost removed from the IgG solution collected in the supernatant of the eluate (lane 2).
  • the purity of the recovered IgG reached 98%, and the recovery rate was 90%.
  • IgG can be efficiently and easily purified from a purified IgG solution by using organic polymer particles having a 2,3-dihydroxypropyl group as a ligand on the surface and containing a magnetic substance inside. It was.
  • Synthesis Example 3 (Synthesis of organic polymer particles having a carboxyl group and a 2,3-dihydroxypropyl group as a ligand on the surface and containing a magnetic substance inside) 375 g of a polymerization solvent was put into a 1 L separable flask, and then 15 g of mother particles having a magnetic layer made of magnetic fine particles with an average number particle diameter of 2.0 ⁇ m synthesized in Synthesis Example 2 were put on the homogenizer. And then heated to 60 ° C.
  • the particle diameter of this particle was 2.8 ⁇ m, and the carboxyl group content determined by electric titration was 24 ⁇ mol / g.
  • Reference Example 1 Antibody purification using organic polymer particles having a carboxyl group and 2,3-dihydroxypropyl group on the surface as ligands and a magnetic substance inside
  • lane 3 (L3) and lane 4 (L4) represent the patterns of elution of the roughly purified IgG and the phosphate buffer (pH 7.4) of Reference Example 1, respectively.
  • M represents a molecular weight marker
  • i represents an impurity
  • IgG HC represents an IgG heavy chain
  • IgG LC represents an IgG light chain.
  • the impurities observed in the roughly purified IgG solution were almost removed when the particles of Example 4 were used (lane 2).
  • the particles of Example 1 were used, most of them remained in the solution recovered in the elution step, and sufficient purification could not be achieved (lane 4).
  • the purity of the collected IgG remained at 58%, and the recovery rate was 95%.
  • the present invention is not limited to the embodiment described above, and various modifications are possible.
  • the present invention includes substantially the same configuration (for example, a configuration having the same function, method, and result, or a configuration having the same purpose and effect) as the configuration described in the embodiment.
  • the invention includes a configuration in which a non-essential part of the configuration described in the embodiment is replaced.
  • the present invention includes a configuration that achieves the same effect as the configuration described in the embodiment or a configuration that can achieve the same object.
  • the invention includes a configuration in which a known technique is added to the configuration described in the embodiment.
  • M molecular weight marker, L1 ... lane 1, L2 ... lane 2, L3 ... lane 3, L4 ... lane 4, L5 ... lane 5, L6 ... lane 6, i ... impurity, IgG HC ... IgG heavy chain, IgG LC ... IgG Light chain, R ... Roughly purified IgG, A ... Adsorption range, B ... Non-adsorption range, IgM HC ... IgM heavy chain, BSA ... Bovine serum albumin

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Abstract

　抗体精製方法は、抗体を含有するｐＨ３．０以上ｐＨ５．６未満の溶液を、２，３－ジヒドロキシプロピル基を有する担体と接触させて、前記抗体を前記担体に吸着させる工程と、前記抗体が吸着した前記担体をｐＨ５．６以上ｐＨ１０未満の溶出液に接触させて、前記抗体を前記担体から溶出させる工程と、を含む。

Description

抗体精製方法および抗体精製用の担体
　本発明は、抗体精製方法および抗体精製用の担体に関する。
　抗体を含有する検体から抗体を精製する方法としては、要求される純度や使用目的に応じて種々の方法が使用されている。比較的低い精製度が許容される目的には、硫酸アンモニウムを沈殿剤に用いた硫安沈殿法（分別沈殿法）が多く用いられている。
　硫安沈殿法では、蛋白質の塩析現象を利用し、抗体とその他の混在する蛋白質とで塩析する硫安（硫酸アンモニウム）の濃度に差があることを利用し、抗体を沈殿させるかもしくは抗体を含む上清を回収する。硫安沈殿法は、大量の抗体を安価に処理することができる方法であるが、抗体を分離するための硫安濃度を決定するために煩雑な検討が必要であり、また、得られた抗体は多量の硫安を含むため、使用に際しては通常、透析などの脱塩処理が必要となり、脱塩処理による抗体の損失も多いため、少量の抗体に適応するのは困難である。したがって、硫安沈殿法を用いて抗体を精製する場合、得られた抗体の純度を上げるためには、通常、他の精製方法と組み合わせて実施する必要がある。
　また、ＩｇＧ型の抗体を高純度に精製するために、例えばプロテインＡやプロテインＧ等の抗体分子に対して結合性を有する蛋白質をリガンドとして結合した担体を用いたアフィニティクロマトグラフィーが広く利用されている（特開平７－１４６２８０号公報，米国特許６３９９７５０号公報）。アフィニティクロマトグラフィーでは、抗体を含有する検体と担体とを中性付近の液性で接触させて抗体を担体に結合させた後、ｐＨ２～３程度の酸性溶出液を用いて抗体を溶出することにより、抗体を回収することができる。
　この場合、酸性溶出液による抗体の変性を防ぐためには、回収した抗体を含む酸性溶出液を即座に中和処理して、溶出液の液性を中性付近に調整する必要がある。アフィニティクロマトグラフィーにより精製された抗体は高純度であるものの、酸性溶出液によってしばしば沈殿を形成し、得られた抗体の活性が失われることがある。また、抗体のサブクラスや由来となる動物種によっては、担体との結合性が乏しく精製が困難である場合がある。さらに、プロテインＡやプロテインＧが結合した担体は高価であるため、精製コストが高いという問題がある。
　また、抗体のクラスのうち、ＩｇＭ型の抗体はプロテインＡやプロテインＧとのアフィニティが低く、アフィニティクロマトグラフィーによる精製は適切に行うことが出来ない（特開２００７－３３２０８０号公報）。ＩｇＭ型抗体の精製のためには、ゲルろ過クロマトグラフィーやイオン交換クロマトグラフィーなどの精製方法や、それらの組み合わせで実施する必要があり、簡便で実用的な精製方法が求められていた。
　このように、上述した公知の抗体精製方法では、高い塩濃度の溶液や強酸性溶出液をその精製過程で使用するため、回収した抗体の使用に際して、再度、脱塩や中和といった処理が通常必要である。また、上述した硫安沈殿法では、少量の抗体を簡便に精製することは困難であり、一方、上述したアフィニティクロマトグラフィーでは、大量の抗体を比較的高純度に安価に精製し濃縮することが困難であるうえ、強い酸性溶出液を用いる場合、不可逆的な性能低下が抗体に生じる問題や、抗体のクラス、サブクラスによっては適応性に難がある場合もあった。
　本発明は、精製時における抗体の変性による失活を抑制することができる抗体精製方法および抗体精製用の担体を提供する。
　本発明者は、２，３－ジヒドロキシプロピル基をリガンドとして有する担体が、ｐＨ３．０以上ｐＨ５．６未満の溶液中で抗体を吸着することを発見し、かかる担体を用いて抗体を精製できることを見出した。
　本発明の一態様に係る抗体精製方法は、抗体を含有するｐＨ３．０以上ｐＨ５．６未満の溶液を、２，３－ジヒドロキシプロピル基を有する担体と接触させる工程と、前記工程を経た前記担体をｐＨ５．６以上ｐＨ１０未満の溶出液に接触させる工程と、を含む。
　上記抗体精製方法において、前記抗体がイムノグロブリンであることができる。
　本発明の別の一態様に係る担体は、２，３－ジヒドロキシプロピル基を有する抗体精製用の担体であって、前記２，３－ジヒドロキシプロピル基を表面に有する。
　上記担体は多孔質粒子であることができる。
　上記担体は磁性体を含有する粒子であることができる。
　上記抗体精製方法によれば、ｐＨ３．０以上ｐＨ５．６未満の溶液中で抗体をリガンドに吸着させ、不純物を溶出させた後、ｐＨ５．６以上ｐＨ１０未満という比較的中性付近の水溶液で溶出することが可能である。これにより、従来の抗体精製方法において必要とされていた、脱塩や中和といった処理を行う必要がないため、精製時における抗体の変性による失活を抑えることができる。
　すなわち、上記抗体精製方法は、背景技術の欄で説明した硫安沈殿法やアフィニティクロマトグラフィー法等の公知の抗体精製方法と本質的に全く異なる原理による、新規でかつ有用な抗体精製方法である。
図１は、実施例１において、粗精製ＩｇＧ溶液、吸着工程で得られた溶液、および溶出工程で回収された溶液のドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（以下、「ＳＤＳ－ＰＡＧＥ」という）による評価結果を示す図である。 図２は、実施例２において吸着工程で回収された分散液上清のＳＤＳ－ＰＡＧＥによる評価結果を示す図である。 図３は、比較例１において吸着工程で回収された分散液上清のＳＤＳ－ＰＡＧＥによる評価結果を示す図である。 図４は、実施例３において溶出工程で回収された溶液のＳＤＳ－ＰＡＧＥによる評価結果を示す図である図である。 図５は、実施例４、および比較例２において溶出工程で回収された溶液のＳＤＳ－ＰＡＧＥによる評価結果を示す図である。
　以下、本発明の一実施形態に係る抗体精製方法および抗体精製用の担体について、具体的に説明する。
　１．抗体精製用の担体
　本発明の一実施形態に係る担体は、２，３－ジヒドロキシプロピル基（ＨＯ－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２－）を有する抗体精製用の担体（以下、単に「担体」ともいう。）であって、２，３－ジヒドロキシプロピル基を抗体吸着用リガンドとして用いる。
　なお、担体が「２，３－ジヒドロキシプロピル基を有する」とは、担体を構成する分子の末端に２，３－ジヒドロキシプロピル基が存在することを指す。したがって、例えば、３，４－ジヒドロキシブチル基、４，５－ジヒドロキシペンチル基、２，３－ジヒドロキシプロピルオキシ基、２，３－ジヒドロキシプロピルチオ基のように、２，３－ジヒドロキシプロピル基の末端構造を有する他の名称の基でも、担体に２，３－ジヒドロキシプロピル基が存在するものとして、２，３－ジヒドロキシプロピル基を有する基であると解することとする。
　本実施形態に係る担体は例えば、多孔質粒子、磁性体を含有する粒子、ろ過フィルター、ろ過用繊維、クロマトグラフィーカラム用粒子、バッチ処理用粒子等が挙げられ、後述する多孔質粒子、あるいは、後述する磁性体を含有する粒子が好ましい。
　１．１．構造
　本実施形態に係る担体は、表面に２，３－ジヒドロキシプロピル基を有するものであるのが好ましい。例えば、本実施形態に係る担体は、少なくとも表面がポリマー部からなり、このポリマー部の少なくとも表面に２，３－ジヒドロキシプロピル基を有することができる。この場合、ポリマー部は、２，３－ジヒドロキシプロピル基を有するモノマーを含むモノマー部を共重合して形成してもよいし、または、加水分解により２，３－ジヒドロキシプロピル基を生成するモノマーを含むモノマー部を共重合した後、加水分解することにより２，３－ジヒドロキシプロピル基を形成してもよい。
　本実施形態に係る担体は、全体がポリマー部から構成されていてもよいし、あるいは、コア・シェル構造を有していて、ポリマー部がシェルであってもよい。
　本実施形態に係る担体において、２，３－ジヒドロキシプロピル基は、抗体を吸着させる際にリガンドとしての機能を有する。２，３－ジヒドロキシプロピル基の量は、担体全体がポリマー部からなる粒子の場合、該粒子の固形分に対して、好ましくは１０μｍｏｌ／ｇ以上であり、さらに好ましくは５０μｍｏｌ／ｇ以上であり、最も好ましくは１００μｍｏｌ／ｇ以上である。２，３－ジヒドロキシプロピル基の量が１０μｍｏｌ／ｇ未満では、抗体を吸着させるリガンドとしての機能を十分発揮できない場合がある。
　２，３－ジヒドロキシプロピル基の量は、ＪＩＳ　Ｋ　００７０に従った水酸基量の滴定により求めることが出来る。通常、水酸基の量は２，３－ジヒドロキシプロピル基の量の２倍である。
　本実施形態に係る担体において、「１．２．製造」の項に挙げるモノマー由来の残基は、後述するその共重合範囲において、２，３－ジヒドロキシプロピル基と共存しても、その精製特性を損なうことはない。また、アミノ基や、単糖、およびヘパリンのような糖鎖ポリマーも担体の抗体精製特性を低下することなく担体に導入することが可能である。しかし、カルボキシル基の導入は、担体の抗体精製特性を低下させるため、カルボキシル基の導入量は、該粒子の固形分に対して、好ましくは１０μｍｏｌ／ｇ以下であり、さらに好ましくは１μｍｏｌ／ｇ以下であり、最も好ましくは０．１μｍｏｌ／ｇ以下である。
　本実施形態に係る担体の数平均粒径（以下、単に「粒径」という。）は、好ましくは、０．１～５００μｍであり、さら好ましくは０．３～２００μｍであり、最も好ましくは０．５～１００μｍである。粒径は、レーザ回折・散乱法により求めることができる。
　１．２．製造
　本実施形態に係る担体は、モノマー部を共重合して得られるポリマー部を少なくとも表面に形成することにより製造することができる。以下、モノマー部を構成する各モノマーについて説明する。
　１．２．１．モノマー（Ａ）
　加水分解により２，３－ジヒドロキシプロピル基を生成するモノマー（Ａ）（後述する。以下、単に「モノマー（Ａ）」ともいう。）を含むモノマー部を用いて共重合して本実施形態に係る担体を製造する場合、モノマー（Ａ）の重合前および重合中の加水分解を防止することができる。なお、以下、モノマー（Ａ）～（Ｃ）は、好ましくはラジカル重合性モノマーである。
　本発明に係る担体は、好ましくは、モノマー（Ａ）を含むモノマー部を共重合することにより得られるポリマー部を少なくとも表面に有する粒子を加水分解処理して得られる。前記共重合において、モノマー（Ａ）を使用することにより、ポリマー部中により多くの２，３－ジヒドロキシプロピル基を安定的に導入することが可能になり、重合安定性を改善することができる。なお、加水分解処理後の担体の分散液は、遠心分離法、磁気分離法等により水洗を繰り返して、残余の加水分解触媒を除いておくことが好ましい。
　モノマー（Ａ）としては、水酸基を公知の保護基で保護したモノマーが挙げられるが、例えば、（Ａ－１）２，３－エポキシプロピル基を有するモノマー、（Ａ－２）２，３－ジヒドロキシプロピル基をアセタール化したモノマー、（Ａ－３）２，３－ジヒドロキシプロピル基をシリル化したモノマーなどを挙げることができる。
　（Ａ－１）２，３－エポキシプロピル基を有するモノマーとしては、具体的には、グリシジル（メタ）アクリレート、アリルグリシジルエーテル等を例示できる。（Ａ－２）２，３－ジヒドロキシプロピル基をアセタール化したモノマーとしては、具体的には、１，３－ジオキソラン－２－オン－４－イルメチル（メタ）アクリレート、１，３－ジオキソラン－２，２－ジメチル－４－イルメチル（メタ）アクリレート等を例示できる。（Ａ－３）２，３－ジヒドロキシプロピル基をシリル化したモノマーとしては、具体的には、２，３－ジヒドロキシプロピル（メタ）アクリレートのジ（ｔ－ブチル）シリル化物、２，３－ジヒドロキシプロピル（メタ）アクリレートのジ（トリメチルシリル）化物などを挙げることができる。
　モノマー（Ａ）由来の官能基の加水分解の条件は、モノマー（Ａ）の種類によるが、通常、粒子を水に分散した状態で、酸、塩基、またはフッ化物塩を触媒として、加温条件下で数時間～数十時間攪拌して加水分解する。モノマー（Ａ）由来の官能基の加水分解は、貯蔵安定性などに支障のない限り、必ずしも共重合体中の全ての官能基が加水分解されている必要はない。モノマー（Ａ）由来の官能基の加水分解は、通常、モノマー部の重合後に実施するが、重合中にその一部が加水分解されてもよい。
　使用するモノマー部中におけるモノマー（Ａ）の比率は、モノマー部１００重量％中に好ましくは４０～９５重量％であり、さらに好ましくは５０～９０重量％である。モノマー部中のモノマー（Ａ）の比率が４０重量％未満であると、非特異吸着が増加する場合があり、一方、９５重量％を超えると、担体が水溶性となって担体としての構造を保てなくなってしまう場合がある。
　１．２．２．モノマー（Ｂ）
　本実施形態に係る担体は、好ましくは、架橋性モノマー（Ｂ）（以下、単に「モノマー（Ｂ）」ともいう。）を共重合することにより得られる粒子表面を有する。すなわち、この場合、モノマー部は、架橋性モノマー（Ｂ）をさらに含む。モノマー（Ｂ）を含むモノマー部を重合することにより、多孔質の担体を得ることができる。
　架橋性モノマー（Ｂ）は、モノマー（Ａ）などと共重合可能で、１分子中に２個以上のラジカル重合性不飽和結合を有するモノマーである。架橋性モノマー（Ｂ）としては、エチレングリコールジアクリレート、エチレングリコールジメタクリレート、トリメチロールプロパントリアクリレート、トリメチロールプロパントリメタクリレート、ペンタエリスリトールトリアクリレート、ペンタエリスリトールトリメタクリレート、ジペンタエリスリトールヘキサアクリレート、ジペンタエリスリトールヘキサメタクリレートなどの多官能性（メタ）アクリレート、ブタジエン、イソプレンなどの共役ジオレフィン、ジビニルベンゼン、ジアリルフタレート、アリルアクリレート、アリルメタクリレートなどを例示することができる。架橋性のモノマーとしては、さらに、ポリエチレングリコールジアクリレート、ポリエチレングリコールジメタクリレート、ポリビニルアルコールのポリ（メタ）アクリルエステルなどの親水性のモノマーを例示することができる。架橋性モノマー（Ｂ）の比率は、共重合体１００重量％中に好ましくは０～３０重量％であり、さらに好ましくは５～２０重量％である。共重合体中のモノマー（Ｂ）の比率が３０重量％を超えると、非特異吸着を増加させることがある。
　１．２．３．その他のモノマー（Ｃ）
　本実施形態に係る担体は、上記モノマー（Ａ）およびモノマー（Ｂ）以外のモノマー（Ｃ）（その他のモノマー（Ｃ））を共重合することにより得られる粒子表面を有していてもよい。その他のモノマー（Ｃ）としては、２－ヒドロキシエチルアクリレート、２－ヒドロキシエチルメタクリレート、メトキシエチルアクリレート、メトキシエチルメタクリレート、ポリエチレングリコールモノアクリレート、ポリエチレングリコールモノメタクリレートなどの親水性官能基を有する（メタ）アクリレート、アクリルアミド、メタクリルアミド、Ｎ－メチロールアクリルアミド、Ｎ－メチロールメタクリルアミド、ダイアセトンアクリルアミドなどの親水性モノマー、および、スチレン、α－メチルスチレン、ハロゲン化スチレンなどの芳香族ビニル単量体、酢酸ビニル、プロピオン酸ビニルなどのビニルエステル類、アクリロニトリルなどの不飽和ニトリル、メチルアクリレート、メチルメタクリレート、エチルアクリレート、エチルメタクリレート、ブチルアクリレート、ブチルメタクリレート、２－エチルヘキシルアクリレート、２－エチルヘキシルメタクリレート、ラウリルアクリレート、ラウリルメタクリレート、ステアリルアクリレート、ステアリルメタクリレート、シクロヘキシルアクリレート、シクロヘキシルメタクリレート、イソボニルアクリレート、イソボニルメタクリレートなどのエチレン性不飽和カルボン酸アルキルエステルを例示することができる。その他のモノマー（Ｃ）として、本発明の効果の発現を妨げない範囲で、２，３－ジヒドロキシプロピル（メタ）アクリレートなど非保護の２，３－ジヒドロキシプロピルを有するモノマーを使用しても良い。その他のモノマー（Ｃ）の量は、上述のモノマー（Ａ）およびモノマー（Ｂ）以外の残余の量である。
　１．２．４．重合方法
　本実施形態に係る担体は、例えば、乳化重合、ソープフリー重合、懸濁重合等の定法を用いて製造が可能である。より具体的には、本実施形態に係る担体は、例えば、上記ビニル系モノマーの懸濁重合、あるいはソープフリー重合によって得ることができる。例えば、本実施形態に係る担体は、特公昭５７－２４３６９号公報記載のシード粒子（母粒子）を用いる二段膨潤重合法、ジャーナル・オブ・ポリマーサイエンス・ポリマーレター・エディション，９３７頁，第２１巻，１９６３年（Ｊ．　Ｐｏｌｙｍ．　Ｓｃｉ．，　Ｐｏｌｙｍｅｒ　Ｌｅｔｔｅｒ　Ｅｄ．　２１，９３７（１９６３））記載の重合方法、特開昭６１－２１５６０２号公報、特開昭６１－２１５６０３号公報、および特開昭６１－２１５６０４号公報記載の方法によって作製することができる。これらの方法の中では、シード粒子（母粒子）を用いる二段膨潤重合法が、粒径の変動係数を小さくすることができるため好ましい。シード粒子（母粒子）は、ポリスチレンまたはスチレン系共重合体等を用いることができる。そして、二段膨潤重合法により追加されるポリマー部は、上述のモノマー（Ａ）～（Ｃ）の共重合体からなる。
　モノマー（Ａ）～（Ｃ）の共重合の際に使用可能な乳化剤としては、例えばアルキル硫酸エステル塩、アルキルアリール硫酸エステル塩、アルキルリン酸エステル塩、脂肪酸塩などのアニオン系界面活性剤；アルキルアミン塩、アルキル四級アミン塩などのカチオン系界面活性剤；ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルアリールエーテル、ブロック型ポリエーテルなどのノニオン系界面活性剤；カルボン酸型（例えば、アミノ酸型、ベタイン酸型など）、スルホン酸型などの両性界面活性剤、商品名で、ラテムルＳ－１８０Ａ、ＰＤ－１０４〔花王社製〕、エレミノールＪＳ－２〔三洋化成社製〕、アクアロンＨＳ－１０、ＫＨ－１０、ＲＮ－１０、ＲＮ－２０、ＲＮ－３０、ＲＮ－５０〔第一工業製薬社製〕、アデカリアソープＳＥ－１０Ｎ、ＳＲ－１０、ＮＥ－２０、ＮＥ－３０、ＮＥ－４０〔旭電化工業社製〕、Ａｎｔｏｘ　ＭＳ－６０〔日本乳化剤社製〕などの反応性乳化剤などのいずれでも使用可能である。特に、反応性乳化剤を用いると、粒子の分散性に優れるため好ましい。また、親水性基を有するポリマーのうち分散機能を有するものも乳化剤として使用することができる。このようなポリマーとしては、スチレン・マレイン酸共重合体、スチレン・アクリル酸共重合体、ポリビニルアルコール、ポリアルキレングリコール、ポリイソプレンのスルホン化物、水添スチレン・ブタジエン共重合体のスルホン化物、スチレン・マレイン酸共重合体のスルホン化物、スチレン・アクリル酸共重合体のスルホン化物などを挙げることができる。これらの乳化剤は、１種単独であるいは２種以上を併用することができる。乳化剤の使用量は特に限定されるものではないが、モノマー（Ａ）～（Ｃ）の合計量１００重量部に対し、通常、０．１～５０重量部であり、好ましくは０．２～２０重量部であり、さらに好ましくは０．５～５重量部である。０．１重量部未満では、乳化が充分でなく、ラジカル重合時の安定性が低下し好ましくない。一方、５０重量部を超えると、泡立ちが問題となり好ましくない。
　モノマー（Ａ）～（Ｃ）の共重合の際に使用されるラジカル重合開始剤としては、過硫酸カリウム、過硫酸ナトリウム、過硫酸アンモニウムなどの過硫酸塩、過酸化水素、ｔ－ブチルハイドロパーオキサイド、ｔ－ブチルパーオキシマレイン酸、コハク酸パーオキサイド、２，２’－アゾビス〔２－Ｎ－ベンジルアミジノ〕プロパン塩酸塩などの水溶性開始剤；ベンゾイルパーオキサイド、クメンハイドロパーオキサイド、ジイソプロピルパーオキシジカーボネート、クミルパーオキシネオデカノエート、クミルパーオキシオクトエート、アゾビスイソブチロニトリルなどの油溶性開始剤；酸性亜硫酸ナトリウム、ロンガリット、アスコルビン酸などの還元剤を併用したレドックス系開始剤などが使用できる。ラジカル重合開始剤としては、水中で酸または塩基性を示さない油溶性開始剤が好ましい。
　１．３．磁性体を含有する担体およびその製造方法
　本実施形態に係る担体は、磁性体を含有する粒子であってもよく、例えば、磁性体を含有する有機ポリマー粒子（以下、「磁性体含有有機ポリマー粒子」という。）であることができる。磁性体含有有機ポリマー粒子は、例えば遠心分離器等を用いずに、磁石を用いて分離することができるため、被検体からの粒子の分離工程を簡素化または自動化することができる点で有用である。
　磁性体含有有機ポリマー粒子は、（Ｉ）ポリマー部の連続相中に磁性体微粒子が分散している粒子、（ＩＩ）磁性体微粒子の２次凝集体をコアとし、ポリマー部をシェルとする粒子、（ＩＩＩ）有機ポリマー等の非磁性体からなる核粒子と、該核粒子の表面に設けられた超常磁性微粒子の２次凝集体層（磁性体層）と、さらに該磁性体層の外層にポリマー部とを有する粒子等が挙げられる。これらの中では、（ＩＩＩ）前記磁性体微粒子の２次凝集体層を含む核粒子（以下、「磁性体微粒子の２次凝集体層を含む核粒子」を「母粒子」と表す）の外層に、ポリマー部を有する粒子が好ましい。なお、各種構造の磁性体含有有機ポリマー粒子に用いるポリマー部は、前述のとおり、２，３－ジヒドロキシプロピル基を有することが必要である。また、核粒子とその外層（磁性体層）との界面、ならびに磁性体層とその外層（有機ポリマー層）との界面は、両層の成分が混在した状態であっても構わない。
　最も好ましい磁性体含有有機ポリマー粒子は、核粒子と、この核粒子の表面に設けられた超常磁性微粒子の磁性体層とをさらに覆うように、ポリマー部が設けられている。すなわち、この磁性体含有有機ポリマー粒子では、前記核粒子と核粒子の表面に設けられた超常磁性微粒子の磁性体層からなる粒子をコアとし、ポリマー部をシェルとする。ここで、ポリマー部は上述の製造方法により得られる。すなわち、架橋重合体は、モノマー（Ａ）４０～９５重量部、架橋性モノマー（Ｂ）０～３０重量部、およびその他のモノマー（Ｃ）０～５５重量部からなるモノマー部を重合して共重合体を得、この共重合体を加水分解して得られる。
　核粒子の表面に超常磁性微粒子の磁性体層が形成された母粒子の製造方法としては、例えば、非磁性の有機ポリマー粒子と超常磁性微粒子とをドライブレンドして、物理的に強い力を外部から加えることにより双方の粒子を複合化させる方法により作製することができる。物理的に強い力を負荷する方法としては、例えば、乳鉢、自動乳鉢、ボールミル、ブレード加圧式粉体圧縮法、メカノフュージョン法のようなメカノケミカル効果を利用するもの、あるいはジェットミル、ハイブリダイザー等の高速気流中衝撃法を利用するものが挙げられる。効率よくかつ強固に複合化を実施するには、物理的吸着力が強いことが望ましい。その方法としては、攪拌翼付き容器中で攪拌翼の周速度が好ましくは１５ｍ／秒以上、より好ましくは３０ｍ／秒以上、さらに好ましくは４０～１５０ｍ／秒で実施することが挙げられる。撹拌翼の周速度が１５ｍ／秒より低いと、非磁性の有機ポリマー粒子の表面に超常磁性微粒子を吸着させるのに十分なエネルギーを得ることができないことがある。なお、撹拌翼の周速度の上限については、特に制限はないが、使用する装置、エネルギー効率等の点から自ずと決定される。本発明で使用する超常磁性微粒子は、例えば、粒子径５～２０ｎｍ程度のフェライトおよび／またはマグネタイトの微粒子が好適に使用できる。
　ポリマー部（シェル）は、加水分解により２，３－ジヒドロキシプロピル基を生成するモノマー（Ａ）４０～９５重量部、架橋性モノマー（Ｂ）０～３０重量部、およびその他のモノマー（Ｃ）０～５５重量部からなるモノマー部を前記母粒子（コア）の存在下で共重合することにより形成することができる。各モノマー成分については上述の通りである。より具体的な重合方法については、特開２００４－２０５４８１号公報等に開示されている通りである。また、重合後の加水分解処理の条件も上述の通りである。磁性体含有有機ポリマー粒子を特に強い酸性条件下で加水分解を実施すると、超常磁性微粒子が溶解する場合があるため、加水分解は弱酸～塩基条件で行なうことが望ましい。
　なお、母粒子上の超常磁性微粒子の溶解を防止するため、核粒子の表面に超常磁性微粒子の磁性体層が形成された母粒子を、架橋性モノマー（Ｂ）０～３０重量部およびその他のモノマー（Ｃ）７０～１００重量部からなる別のモノマー部を用いてコーティング層を形成した後、このコーティング層を含む母粒子をコアとして、モノマー（Ａ）４０～９５重量部、架橋性モノマー（Ｂ）０～３０重量部、およびその他のモノマー（Ｃ）０～５５重量部からなるモノマー部を共重合することにより、ポリマー部（シェル）を形成する粒子を得、この粒子を加水分解することにより、磁性体含有有機ポリマー粒子を形成してもよい。このような超常磁性微粒子がコーティング層によってコーティングされた磁性体含有有機ポリマー粒子の場合、上述の加水分解処理において強酸性～強塩基性の広い加水分解条件を選択することができる。
　１．４．用途
　上述したように、本実施形態に係る担体は、２，３－ジヒドロキシプロピル基を抗体吸着用リガンドとして用いて抗体を結合させて抗体を精製するために使用されるものである。この場合の精製対象となる抗体を含む溶液としては、ハイブリドーマを含む細胞の培養液、硫安沈殿により租精製された抗体溶液などが挙げられる。また、本実施形態に係る担体は、精製済み抗体に対して、緩衝溶液の交換（バッファー交換）、脱塩、防腐剤・安定剤・界面活性剤等の意図しない成分の除去等の目的でも使用することが出来る。
　本実施形態に係る担体において、精製対象となる抗体としては、そのクラスに制限はなく、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥの５種類のクラスの免疫グロブリンを対象とすることができる。ＩｇＧのサブクラスにも制限はなく、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のどちらも対象とすることができる。
　２．抗体精製方法
　本発明の一実施形態に係る抗体精製方法は、抗体を含有するｐＨ３．０以上ｐＨ５．６未満の溶液を、２，３－ジヒドロキシプロピル基を有する担体と接触させる工程と、前記工程を経た前記担体をｐＨ５．６以上ｐＨ１０未満の溶出液に接触させる工程と、を含む。より詳細には、本発明の一実施形態に係る抗体精製方法は、抗体を含有するｐＨ３．０以上ｐＨ５．６未満の溶液を、２，３－ジヒドロキシプロピル基を有する担体と接触させる工程において、抗体を担体に吸着させ、前記工程を経た前記担体をｐＨ５．６以上ｐＨ１０未満の溶出液に接触させる工程において、抗体を担体から溶出させる。
　抗体を担体に吸着させる工程において、溶液のｐＨが３．０未満であると、抗体が不可逆的に変性する可能性がある。一方、溶液のｐＨが５．６以上であると、担体に抗体が吸着しにくくなる傾向がある。なお、抗体を担体に吸着させる工程において、より好ましい溶液のｐＨはｐＨ３．５以上ｐＨ５．６未満である。ここで用いる溶液としては、例えば、ＭＥＳ緩衝溶液が挙げられる。
　抗体を担体から溶出させる工程において、溶出液のｐＨが５．６未満であると、溶出液に抗体が溶出しにくくなる傾向があり、一方、溶液のｐＨが１０以上であると、次工程以降の反応にそのまま用いることが困難になる可能性がある。なお、抗体を担体から溶出させる工程において、より好ましい溶液のｐＨはｐＨ６．０以上ｐＨ１０未満である。ここで用いる溶出液としては、例えば、リン酸緩衝溶液、ホウ酸緩衝溶液、ヘペス緩衝溶液、トリス緩衝溶液が挙げられる。
　また、本実施形態に係る抗体精製方法において精製対象となる抗体としては、上記「１．４．用途」の欄で例示したものが挙げられる。
　３．実施例
　以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって制限されるものではない。
　３．１．合成例１（２，３－ジヒドロキシプロピル基をリガンドとして有する多孔性粒子の合成）
　グリシジルメタクリレート（三菱レーヨン社製。以下、「ＧＭＡ」という。）１１０ｇおよびトリメチロールプロパントリメタクリレート（サートマー社製。（以下、「ＴＭＰ」という。）７３ｇをジイソブチルケトン（三井化学社製）２００ｇおよびアセトフェノン（和光純薬工業社製）９７ｇに溶解させ、２，２’－アゾイソブチロニトリル（和光純薬工業社製）２．４ｇを添加し、有機モノマー溶液を調製した。
　次に、４，２５０ｇの純水にポリビニルアルコール（クラレ社製　ＰＶＡ－２１７）１７ｇ、ドデシル硫酸ナトリウム（花王社製　エマール１０Ｇ）１．７ｇおよび塩化ナトリウム８５ｇを添加し、一晩撹拌して水溶液を調製した。
　次いで、得られた前記有機モノマー溶液および前記水溶液をバッフル付き７Ｌセパラブルフラスコ内に投入し、温度計、攪拌翼、冷却管を装着して、温水バスにセットし、窒素雰囲気下、３５０ｒｐｍで撹拌を開始した。続いて、セパラブルフラスコを温水バスにより加温し、８５℃で５時間攪拌を行った。
　次いで、反応液を冷却したのち、イソプロピルアルコールおよび水で粒子を洗浄し、さらに粒子の水分散体を超音波洗浄機で分散した後、上清の微小粒子をデカンテーションで除く操作を３回繰り返した後、真空乾燥機にて乾燥を行い、エポキシ基を有する粒子（１０３ｇ）を得た。水銀ポロシメーター（島津製作所社製　オートポアＩＶ９５０）を用いて、この粒子を測定したところ、細孔径測定レンジ０．５～５０００ｎｍにおいて、細孔径最頻値は２２７ｎｍ、比表面積は１６６ｍ２／ｇであった。レーザ回折散乱式粒度分布測定装置（ベックマン・コールター社製　ＬＳ１３３２０）により求めた、粒子の体積平均粒径は３０μｍであった。
　次に、得られた前記粒子１０ｇを２５０ｍＬポリ瓶にいれて、純水８０ｇに分散させ、０．１Ｍ硫酸を１０ｇ添加した。この液を６０℃で５時間転倒混和することにより、エポキシ基を開環させて、２，３－ジヒドロキシプロピル基をリガンドとして有する多孔性粒子を得た。得られた多孔性粒子は純水で繰り返し洗浄した後、粒子固形分が２ｗｔ％となるように純水に分散させた。
　得られた粒子の水酸基量を、ＪＩＳ　Ｋ　００７０に従い定量した。得られた粒子の一部を減圧乾燥し、０．２ｇを取り分け、アセチル化剤として無水酢酸／ピリジン溶液５ｍｌを加えて１００℃で１時間反応した。放冷後、純水１ｍｌを加えて再度、１００℃で１０分間加熱し、無水酢酸を分解した。放冷後、フェノールフタレインを指示薬に、０．５Ｍ水酸化カリウムエタノール溶液で滴定し、水酸基量を求めたところ、４．９ｍｍｏｌ／ｇであった。
　３．２．実施例１（硫安沈殿租精製ＩｇＧからの抗体の精製）
　マウスモノクローナルＩｇＧ抗体を産生するハイブリドーマを、ウシＩｇＧを除去した２０％ウシ胎児血清存在下で培養した。培養上清に産生されたマウスモノクローナルＩｇＧ抗体を、５０％飽和硫安で硫安沈殿させた。得られた沈殿をＰＢＳ（－）緩衝溶液に溶解させ、ＰＢＳ（－）に対して透析することによって余分な硫安を脱塩し、粗精製ＩｇＧ（イムノグロブリンＧ）溶液を得た。２８０ｎｍにおける吸光度が１．４の時の蛋白質濃度を１．０ｍｇ／ｍｌと仮定したとき、吸光度測定から求められた溶液の蛋白質濃度は３．３ｍｇ／ｍｌであった。また、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる純度検定の結果、ＩｇＧの純度は４０％であった。なお、この租精製ＩｇＧ溶液には、不純物として、培地由来のウシ血清アルブミンなどが含まれている可能性がある。この粗精製ＩｇＧ溶液に対して本発明の抗体精製方法を適用した。
　合成例１で得られた多孔性粒子５０μｌに、粗精製ＩｇＧ溶液１０μｌおよび１００ｍＭ　ＭＥＳ緩衝溶液（ｐＨ５．０）１４０μｌを加え、室温で６０分間振盪した。次に、この液を１０，０００ｇで５分間遠心し、粒子の上清をピペットで回収した（吸着工程）。
　次に、吸着工程後の粒子に１ｍｌの１００ｍＭ　ＭＥＳ緩衝溶液（ｐＨ５．０）を加えて分散させて洗浄し、遠心した後、上清をピペットで除去した（洗浄工程）。この洗浄工程を２回繰り返した。
　次いで、洗浄工程後の粒子に２００μｌの１００ｍＭ　リン酸緩衝溶液（ｐＨ７．４）を加え、室温で１０分間振盪し、粒子に吸着したＩｇＧを溶出させた（溶出工程）。
　粗精製ＩｇＧ溶液０．５μｌ、吸着工程で得られた溶液１０μｌ、および溶出工程で回収された溶液１０μｌをＳＤＳ－ＰＡＧＥで評価した（図１）。
　ここで図１において、レーン１ないしレーン６（Ｌ１～Ｌ６）は、順に、粗精製ＩｇＧ、吸着工程の上清、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）溶出、１００ｍＭリン酸緩衝液＋０．５Ｍ　ＮａＣｌ（ｐＨ７．４）溶出、１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）溶出、および１００ｍＭホウ酸緩衝液＋０．５Ｍ　ＮａＣｌ（ｐＨ８．５）溶出、のパターンを表している。また、図１において、Ｍは分子量マーカー、ｉは不純物、ＩｇＧ　ＨＣはＩｇＧ重鎖、ＩｇＧ　ＬＣはＩｇＧ軽鎖をそれぞれ示している。
　図１に示されるように、粗精製ＩｇＧ溶液（レーン１）中の不純物は、吸着工程で粒子に結合せず、上清中に確認された（レーン２）。また、粒子に吸着したＩｇＧは、溶出工程で溶出され、溶出液の上清中に回収された（レーン３）。なお、回収されたＩｇＧの純度は９９％以上であり、回収率は９５％以上であった。
　また、溶出液のｐＨおよび塩濃度の影響を確認するために、溶出液として、１００ｍＭ　リン酸緩衝溶液の代わりに、０．５Ｍ　塩化ナトリウム含有１００ｍＭ　リン酸緩衝溶液（ｐＨ７．４）（レーン４）、１００ｍＭ　ホウ酸緩衝溶液（ｐＨ８．５）（レーン５）および０．５Ｍ　塩化ナトリウム含有１００ｍＭ　ホウ酸緩衝溶液（ｐＨ８．５）（レーン６）を用いて溶出効果を確認したところ、高い塩濃度（０．５Ｍ）の溶液（レーン４～６）を溶出液として用いた場合ならびにｐＨ８．５の弱アルカリ性溶液（レーン５および６）を溶出液として用いた場合のいずれにおいても、高効率でＩｇＧを溶出できることが確認できた。
　以上により、本発明の抗体精製方法によれば、粗精製ＩｇＧ溶液中のＩｇＧを高純度で、かつ、中性付近の緩衝液の溶液として回収できることが明らかになった。また、中性付近の緩衝液溶液中にＩｇＧを回収できたことから、ＩｇＧをすぐに他の工程（例えばＩｇＧの定量）に使用できる状態で回収することができた。
　３．３．実施例２（抗体吸着工程におけるｐＨの影響）
　合成例１で得られた、２，３－ジヒドロキシプロピル基をリガンドとして有する多孔性粒子１ｍｇを、ｐＨが５．０～７．０の範囲にある値（ｐＨ５．０から７．０まで０．２ずつ増加させた値、図２参照）にそれぞれ調整された１００ｍＭ　ＭＥＳ緩衝溶液１９０μｌに分散させた後、粗精製ＩｇＧ溶液１０μｌを加え、６０分間室温で振盪した。１０，０００ｇで５分間遠心し、分散液の上清をピペットで回収した（吸着工程）。
　次に、吸着工程で回収された上清１０μｌをＳＤＳ－ＰＡＧＥで評価した（図２）。
　図２に示されるように、ｐＨ５．０～５．６の緩衝液を用いて合成例１で得られた多孔質粒子を処理した場合、上清中に存在するＩｇＧが減少したことが分かる。この結果から、粗精製溶液中のＩｇＧは、ｐＨ５．０～５．６の範囲で、合成例１に係る２，３－ジヒドロキシプロピル基を有する粒子と優先的に結合することが確認された。なお、図２において、Ｒは粗精製ＩｇＧ、Ａは吸着範囲、およびＢは非吸着範囲をそれぞれ示している。
　３．４．比較例１（２，３－ジヒドロキシプロピル基をリガンドとして有する多孔性粒子のアセチル化）
　合成例１で得られた、２，３－ジヒドロキシプロピル基をリガンドとして有する多孔性粒子の乾燥粉末１．０ｇをピリジン９．０ｇに分散させて、多孔質粒子の分散液を調製した。
　次に、無水酢酸２．５ｇにピリジンを加え、１０ｍｌの溶液を調製し、この１．０ｍｌを多孔性粒子の分散液に加えて１００℃で２時間反応した。その後、純水を２．０ｍｌ加え、１００℃でさらに１時間反応した。桐山ロートを用いて粒子を回収し、純水でよく洗浄して乾燥し、２，３－ジヒドロキシプロピル基がアセチル化されたアセチル化粒子を得た。
　次いで、このアセチル化粒子１ｍｇを、ｐＨが５．０～７．０の範囲にある所定の値（ｐＨ５．０から７．０まで０．２ずつ増加させた値、図３参照）に調整された１００ｍＭ　ＭＥＳ緩衝溶液１９０μｌに分散させた後、粗精製ＩｇＧ溶液１０μｌを加え、６０分間室温で振盪した。１０，０００ｇで５分間遠心し、粒子の上清をピペットで回収した（吸着工程）。
　次に、吸着工程で回収された溶液１０μｌをＳＤＳ－ＰＡＧＥで評価した（図３）。
　図３に示されるように、粗精製中のＩｇＧはアセチル化粒子に吸着することはなかった。すなわち、アセチル化粒子を用いた場合、不純物とＩｇＧを分離することが出来なかった。これにより、実施例１によるＩｇＧの精製は、粒子の２，３－ジヒドロキシプロピル基とＩｇＧとの特異的結合によるものであることが確認できた。なお、図３において、Ｒは粗精製ＩｇＧ、およびＢは非吸着範囲をそれぞれ示している。
　３．５．実施例３（ハイブリドーマ培養上清からのＩｇＭ抗体の精製）
　マウスモノクローナルＩｇＭ抗体を産生するハイブリドーマを、２０％ウシ胎児血清存在下で培養した。培養後、培養液上清に含まれるＩｇＭ濃度をＥＬＩＳＡ法により求めた結果、３０μｇ／ｍｌであり、総タンパク質に含まれるＩｇＭ含量は０．２％であった。このハイブリドーマ培養上清から、合成例１の粒子を用いて直接にＩｇＭの精製を試みた。
　合成例１で得られた多孔性粒子５０μｌに、培養液上清１００μｌおよび１００ｍＭ　ＭＥＳ緩衝溶液（ｐＨ５．０）５００μｌを加え、室温で６０分間振盪した。次に、この液を１０，０００ｇで５分間遠心し、粒子の上清をピペットで回収した（吸着工程）。
　次に、吸着工程後の粒子に１ｍｌの１００ｍＭ　ＭＥＳ緩衝溶液（ｐＨ５．０）を加えて分散させて洗浄し、遠心した後、上清をピペットで除去した（洗浄工程）。この洗浄工程を２回繰り返した。
　次いで、洗浄工程後の粒子に６０μｌの１００ｍＭ　リン酸緩衝溶液（ｐＨ７．４）を加え、室温で１０分間振盪し、粒子に吸着したＩｇＭを溶出させた（溶出工程）。
　溶出工程で回収された溶液４．５μｌ（培養液７．５μｌ相当）を還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥで評価した（図４）。
　ここで図４において、レーン１（Ｌ１）およびレーン２（Ｌ２）は、それぞれ培養上清２．５μｇ／レーン、およびリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）溶出液のパターンを表している。また、図４において、ＩｇＭ　ＨＣはＩｇＭ重鎖を示している。
　図４に示されるように、培養液上清（レーン１）中にはウシ血清に由来する多量のＢＳＡが認められたが、精製後の溶出液の上清（レーン２）中ではウシ血清に由来するタンパク質のほとんどが除かれており、ＩｇＭ由来のバンドがはっきりと確認できた。回収されたＩｇＭの純度は、ＩｇＭ濃度が低い培養上清を出発材料としたにも関わらず、２０％以上であり、回収率は９０％以上であった。
　３．６．合成例２（表面に２，３－ジヒドロキシプロピル基をリガンドとして有し、内部に磁性体を含有する有機ポリマー粒子の合成）
　ジ（３，５，５－トリメチルヘキサノイル）パーオキサイド溶液（日本油脂製「パーロイル３５５－７５（Ｓ）」２質量部を１％ドデシル硫酸ナトリウム水溶液２０質量部に混合し、超音波分散機にて微細乳化した。これを粒径０．７７μｍのポリスチレン粒子１３質量部および水４１質量部の入ったリアクターに入れ、２５℃で１２時間攪拌した。別の容器にて、スチレン９６質量部およびジビニルベンゼン４質量部を０．１％ドデシル硫酸ナトリウム水溶液４００質量部で乳化させた液を前記リアクターに入れ、４０℃で２時間攪拌した後、７５℃に昇温して８時間重合した。室温まで冷却した後、遠心分離により粒子のみ取り出したものをさらに水洗し、乾燥および粉砕した。これを核粒子とする（核粒子の作製）。数平均粒径は１．５μｍであった。
　次に、油性磁性流体（商品名：「ＥＸＰシリーズ」，（株）フェローテック製）にアセトンを加えて粒子を析出沈殿させた後、これを乾燥することにより、疎水化処理された表面を有するフェライト系の磁性体微粒子（平均一次粒子径：０．０１μｍ）を得た。
　次いで、上記核粒子１５ｇおよび上記疎水化された磁性体微粒子１５ｇをミキサーでよく混合し、この混合物をハイブリダイゼーションシステムＮＨＳ－０型（奈良機械製作所（株）製）を使用して、羽根（撹拌翼）の周速度１００ｍ／秒（１６２００ｒｐｍ）で５分間処理し、平均数粒子径が２．０μｍの磁性体微粒子からなる磁性体層を表面に有する母粒子を得た。
　次に、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム０．２５重量％およびノニオン性乳化剤（商品名：「エマルゲン１５０」，花王（株）製）０．２５重量％を含む水溶液（以下「重合溶媒」という。）３７５ｇを１Ｌセパラブルフラスコに投入し、次いで、前記磁性体層を有する母粒子１５ｇを投入し、ホモジナイザーで分散した後、６０℃に加熱した。重合溶媒１５０ｇに、メチルメタクリレート（以下、「ＭＭＡ」という。）２７ｇ、ＴＭＰ３ｇ、およびパーロイル３５５－７５（Ｓ）０．６ｇ入れて分散させたプレエマルジョンを、６０℃にコントロールした前記１Ｌセパラブルフラスコに１時間３０分かけて滴下した。滴下終了後、６０℃に保持し１時間攪拌した後、重合溶媒７５ｇに、ＧＭＡ１３．５ｇ、ＴＭＰ１．５ｇ、およびパーロイル３５５－７５（Ｓ）０．３ｇを入れて分散させたプレエマルジョンを、６０℃にコントロールした上記１Ｌセパラブルフラスコに１時間３０分かけて滴下した。その後７５℃に昇温した後さらに２時間重合を続けて、反応を完了させた。続けて、この１Ｌセパラブルフラスコに１ｍｏｌ／Ｌ　硫酸６０ｍｌを入れ、６０℃で６時間撹拌した。次いで、前記セパラブルフラスコ中の粒子を、磁気を用いて分離した後、蒸留水を用いて繰り返し洗浄した。以上により、２，３－ジヒドロキシプロピル基をその表面に有する、磁性体を含有する有機ポリマー粒子を得た。得られた多孔性粒子は粒子固形分が１０ｗｔ％となるように純水に分散させた。
　得られた粒子の水酸基量を、合成例１と同様に定量したところ、０．４５ｍｍｏｌ／ｇであった。
　３．７．実施例４（表面に２，３－ジヒドロキシプロピル基をリガンドとして有し、内部に磁性体を含有する有機ポリマー粒子による抗体精製）
　合成例２で得られた磁性粒子１０μｌ、粗精製ＩｇＧ溶液１．５μｌおよび１００ｍＭ　ＭＥＳ緩衝溶液（ｐＨ５．０）３８．５μｌをテストチューブに取って混合し、室温で１０分間振盪した。なお、ここで使用した粗精製ＩｇＧ溶液中のＩｇＧの純度はＳＤＳ－ＰＡＧＥによる検定の結果、３８％であった。不純物として含まれる成分としては、培地由来のウシ血清アルブミンなどである。次に、このチューブを磁気スタンドに立てて粒子を磁気で分離し、粒子の上清をピペットで取り除いた（吸着工程）。
　次に、吸着工程後の粒子に５０μｌの１００ｍＭ　ＭＥＳ緩衝溶液（ｐＨ５．０）を加えて分散させて洗浄し、チューブを磁気スタンドに立てて粒子を磁気で分離した後、上清をピペットで除去した（洗浄工程）。この洗浄工程を２回繰り返した。
　次いで、洗浄工程後の粒子に５０μｌの１００ｍＭ　リン酸緩衝溶液（ｐＨ７．４）を加え、室温で１０分間振盪し、粒子に吸着したＩｇＧを溶出させた（溶出工程）。
　粗精製ＩｇＧ溶液０．１８μｌ、および溶出工程で回収された溶液６μｌを還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥで評価した（図５）。
　ここで図５において、レーン１（Ｌ１）およびレーン２（Ｌ２）は、それぞれ粗精製ＩｇＧ、および実施例４のリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）溶出のパターンを表している。また、図５において、Ｍは分子量マーカー、ｉは不純物、ＩｇＧ　ＨＣはＩｇＧ重鎖、ＩｇＧ　ＬＣはＩｇＧ軽鎖をそれぞれ示している。
　図５に示されるように、粗精製ＩｇＧ溶液（レーン１）中に認められた不純物が、溶出液の上清中に回収されたＩｇＧ溶液ではほとんど除かれていた（レーン２）。なお、回収されたＩｇＧの純度は９８％に達し、回収率は９０％であった。
　このように、表面に２，３－ジヒドロキシプロピル基をリガンドとして有し、内部に磁性体を含有する有機ポリマー粒子を用いることで、租精製ＩｇＧ溶液からＩｇＧを効率よく簡便に精製できることが確認できた。
　３．８．合成例３（表面にカルボキシル基と２，３－ジヒドロキシプロピル基をリガンドとして有し、内部に磁性体を含有する有機ポリマー粒子の合成）
　重合溶媒３７５ｇを１Ｌセパラブルフラスコに投入し、次いで、合成例２で合成した、平均数粒子径が２．０μｍの磁性体微粒子からなる磁性体層を表面に有する母粒子１５ｇを投入し、ホモジナイザーで分散した後、６０℃に加熱した。重合溶媒１５０ｇに、ＭＭＡ２７ｇ、ＴＭＰ３ｇ、およびパーロイル３５５－７５（Ｓ）０．６ｇを入れて分散させたプレエマルジョンを、６０℃にコントロールした前記５００ｍＬセパラブルフラスコに１時間３０分かけて滴下した。滴下終了後、６０℃に保持して１時間攪拌した後、重合溶媒７５ｇに、ｔ-ブチルメタクリレート３ｇ、ＧＭＡ１０．５ｇ、ＴＭＰ１．５ｇ、およびパーロイル３５５－７５（Ｓ）０．３ｇを入れて分散させたプレエマルジョンを、６０℃にコントロールした上記１Ｌセパラブルフラスコに１時間３０分かけて滴下した。その後７５℃に昇温した後さらに２時間重合を続けて、反応を完了させた。以上の工程により、コアである母粒子を覆う共重合体を形成した。続けて、この１Ｌセパラブルフラスコに１ｍｏｌ／Ｌ　硫酸６０ｍｌを入れ、６０℃で６時間撹拌することにより、加水分解反応を実施して、母粒子をコアとし、ポリマー部をシェルとする有機ポリマー粒子（低非特異吸着性の有機ポリマー粒子）を得た。磁気を用いて前記セパラブルフラスコ中の粒子を分離し、蒸留水を用いて繰り返し洗浄した。得られた多孔性粒子は粒子固形分が１０ｗｔ％となるように純水に分散させた。以上により、磁性体を含有する有機ポリマー粒子の分散液を得た。
　この粒子の粒径は２．８μｍであり、電動度滴定で求めたカルボキシル基含有量は２４μｍｏｌ／ｇであった。
　３．９．参考例１（表面にカルボキシル基と２，３－ジヒドロキシプロピル基をリガンドとして有し、内部に磁性体を含有する有機ポリマー粒子による抗体精製）
合成例３で得られた磁性粒子１０μｌ、実施例４で用いた粗精製ＩｇＧ溶液１．５μｌおよび１００ｍＭ　ＭＥＳ緩衝溶液（ｐＨ５．０）３８．５μｌをテストチューブに取って混合し、室温で１０分間振盪した。次に、このチューブを磁気スタンドに立てて粒子を磁気で分離し、粒子の上清をピペットで取り除いた（吸着工程）。
　次に、吸着工程後の粒子に５０μｌの１００ｍＭ　ＭＥＳ緩衝溶液（ｐＨ５．０）を加えて分散させて洗浄し、チューブを磁気スタンドに立てて粒子を磁気で分離した後、上清をピペットで除去した（洗浄工程）。この洗浄工程を２回繰り返した。
　次いで、洗浄工程後の粒子に５０μｌの１００ｍＭ　リン酸緩衝溶液（ｐＨ７．４）を加え、室温で１０分間振盪し、粒子に吸着したＩｇＧを溶出させた（溶出工程）。
　粗精製ＩｇＧ溶液０．１８μｌ、および溶出工程で回収された溶液６μｌを還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥで評価した（図５）。
　ここで図５において、レーン３（Ｌ３）およびレーン４（Ｌ４）は、それぞれ粗精製ＩｇＧ、および参考例１のリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）溶出のパターンを表している。また、図５において、Ｍは分子量マーカー、ｉは不純物、ＩｇＧ　ＨＣはＩｇＧ重鎖、ＩｇＧ　ＬＣはＩｇＧ軽鎖をそれぞれ示している。
　図５に示されるように、粗精製ＩｇＧ溶液（レーン１および３）中に認められた不純物が、実施例４の粒子を用いた場合はほとんど除かれていた（レーン２）のに対し、参考例１の粒子を用いた場合は、溶出工程で回収された溶液中にその大部分が残されたままであり、十分な精製が達成できなかった（レーン４）。なお、回収されたＩｇＧの純度は５８％に留まり、回収率は９５％であった。
　本発明は、以上説明した実施形態に限定されるものではなく、種々の変形が可能である。例えば、本発明は、実施形態で説明した構成と実質的に同一の構成（例えば、機能、方法および結果が同一の構成、あるいは目的および効果が同一の構成）を含む。また、本発明は、実施形態で説明した構成の本質的でない部分を置き換えた構成を含む。また、本発明は、実施形態で説明した構成と同一の作用効果を奏する構成または同一の目的を達成することができる構成を含む。また、本発明は、実施形態で説明した構成に公知技術を付加した構成を含む。
Ｍ…分子量マーカー、Ｌ１…レーン１、Ｌ２…レーン２、Ｌ３…レーン３、Ｌ４…レーン４、Ｌ５…レーン５、Ｌ６…レーン６、ｉ…不純物、ＩｇＧ　ＨＣ…ＩｇＧ重鎖、ＩｇＧ　ＬＣ…ＩｇＧ軽鎖、Ｒ…粗精製ＩｇＧ、Ａ…吸着範囲、Ｂ…非吸着範囲、ＩｇＭ　ＨＣ…ＩｇＭ重鎖、ＢＳＡ…ウシ血清アルブミン

Claims (4)

  1. 　抗体を含有するｐＨ３．０以上ｐＨ５．６未満の溶液を、２，３－ジヒドロキシプロピル基を有する担体と接触させる工程と、
    　前記工程を経た前記担体をｐＨ５．６以上ｐＨ１０未満の溶出液に接触させる工程と、を含む、抗体精製方法。
  2. 　２，３－ジヒドロキシプロピル基を有する抗体精製用の担体であって、
    　前記２，３－ジヒドロキシプロピル基を表面に有する、担体。
  3. 　多孔質粒子である、請求項２に記載の担体。
  4. 　磁性体を含有する粒子である、請求項２または３に記載の担体。
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