JPH11181000A - ピラジン誘導体認識抗体及びそれを用いた１，２−ジカルボニル誘導体の測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 簡便で多検体測定が可能な１，２−ジカルボ
ニル誘導体の測定方法を提供すること。 【解決手段】 １，２−ジカルボニル誘導体をジアミノ
誘導体と反応させて一般式（Ｉ） 【化１】 （ただし、式中、Ｒ¹ 、Ｒ² は、互いに独立に、水素、
メチル基、ヒドロキシメチル基、ヒドロキシエチル基、
ジヒドロキシエチル基、ジヒドロキシプロピル基、トリ
ヒドロキシプロピル基又はトリヒドロキシブチル基であ
り、Ａはピラジン環と結合して５員又は６員の芳香族炭
化水素基、芳香族複素環基又は脂環式炭化水素基を形成
する基であり、Ｒ³ は架橋性残基であり、Ａにより形成
される環は、上記Ｒ³ の他に、５員環の場合には１又は
２個、６員環の場合には１〜３個のさらなる置換基によ
って置換されていてもよい）で示されるピラジン誘導体
とし、該ピラジン誘導体を認識する抗体を用いた免疫測
定方法により該ピラジン誘導体を測定し、それによって
１，２−ジカルボニル誘導体を測定する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、生体内におけるタ
ンパク質の糖化反応の中間体である１，２−ジカルボニ
ル誘導体の反応物であるピラジン誘導体を認識する抗
体、該抗体を誘起するための免疫原及び該抗体を用いた
１，２−ジカルボニル誘導体の免疫測定方法に関する。

【０００２】糖尿病はインスリンに起因する代謝異常の
疾患であり、慢性化しやすいため、種々の合併症を引き
起こす。この合併症は、例えば、眼疾患、腎疾患、神経
症、心血管系合併症、壊疽等があげられ、合併症の有無
や程度によって患者の予後は大きく左右される。

【０００３】一方、糖尿病における蛋白質の糖化反応の
有力な原因とされる中間体に、デオキシグルコゾンがあ
る。デオキシグルコゾンは、蛋白質間のクロスリンカー
として作用し、糖化反応の最終反応物の形成を促進する
機能を持つ物質である。このデオキシグルコゾンが、高
血糖状態の持続しやすい糖尿病患者、特に腎症を合併し
ている患者の血中において増加していること（Biochem.
Biophys. Res. Commun., Vol196, p837-843, 1993）
や、糖尿病性動脈硬化を引き起こしている患者の血中に
おいて増加していること（DIABETES, Vol.45, SP3, S81
-83, 1996 ）が示されてから、糖尿病合併症の病状を把
握する指標として注目された。また、メチルグルオキザ
ールも糖尿病性動脈硬化を引き起こしている患者の血中
において増加していること（DIABETES, Vol.45, SP3, S
81-83, 1996 ）が示唆され、糖尿病における１，２−ジ
カルボニル誘導体の動向が注目されている。

【０００４】しかしながら、デオキシキグルコゾンを初
めとする１，２−ジカルボニル誘導体は、非常に不安定
な物質であるため、これまでは１，２−ジカルボニル誘
導体を誘導体、あるいは、安定な代謝物に変換した後抽
出し、ＧＳ／ＭＳやＨＰＬＣ等を用いたクロマトグラフ
ィー分析にて測定していた。これらの方法は、１，２−
ジカルボニル誘導体の抽出操作及びクロマトグラフィー
分析操作が煩雑で時間を要するため、更に簡便で多検体
測定が可能な測定手法が待ち望まれていた。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、簡便で多検体測定が可能な１，２−ジカルボニル誘
導体の測定方法を提供することである。さらに、本発明
の目的は、該測定方法に用いられる抗体、及び該抗体の
産生を誘起するための免疫原を提供することである。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本願発明者らは、鋭意研
究の結果、１，２−ジカルボニル誘導体をジアミノ誘導
体と反応させて安定なピラジン誘導体に変え、このピラ
ジン誘導体を認識する抗体を用いた免疫測定で該ピラジ
ン誘導体を測定することにより、検体中の１，２−ジカ
ルボニル誘導体を測定することができることを見出し、
かつ、上記の抗体を現実に提供し、本発明を完成した。

【０００７】すなわち、本発明は、下記一般式（Ｉ）で
示されるピラジン誘導体の少なくともＲ¹ 又はＲ² を包
含する領域を認識する抗体を提供する。

【０００８】

【化１】

【０００９】（ただし、式中、Ｒ¹ 、Ｒ² は、互いに独
立に、水素、メチル基、ヒドロキシメチル基、ヒドロキ
シエチル基、ジヒドロキシエチル基、ジヒドロキシプロ
ピル基、トリヒドロキシプロピル基又はトリヒドロキシ
ブチル基であり、Ａはピラジン環と結合して５員又は６
員の芳香族炭化水素基、芳香族複素環基又は脂環式炭化
水素基を形成する基であり、Ｒ³ は架橋性残基であり、
Ａにより形成される環は、上記Ｒ³ の他に、５員環の場
合には１又は２個、６員環の場合には１〜３個のさらな
る置換基によって置換されていてもよい）。

【００１０】また、本発明は、上記一般式（Ｉ）で示さ
れるピラジン誘導体又は該ピラジン誘導体のＲ³ に免疫
原性担体が結合したものから成る免疫原を提供する。

【００１１】さらに、本発明は、生体内におけるタンパ
ク質の糖化反応の中間体である１，２−ジカルボニル誘
導体を免疫測定する方法であって、検体中の１，２−ジ
カルボニル誘導体を、一般式（II）

【化２】 （Ｒ³ 及びＡは、上記一般式（Ｉ）の場合と同義）で示
されるジアミノ誘導体と反応させて上記一般式（Ｉ）で
示されるピラジン誘導体を生成させ、該ピラジン誘導体
と上記本発明の抗体との抗原抗体反応を利用した免疫測
定により該ピラジン誘導体を測定し、それによって検体
中の１，２−ジカルボニル誘導体を測定することから成
る、１，２−ジカルボニル誘導体の免疫測定方法を提供
する。

【００１２】

【発明の実施の形態】上述のように、本発明の抗体は、
上記一般式（Ｉ）で示されるピラジン誘導体を認識する
ものである。

【００１３】一般式（Ｉ）中のＲ¹ 、Ｒ² の定義は上記
の通りであり、Ｒ¹ が水素でＲ² がトリヒドロキシブチ
ル基、Ｒ¹ がメチル基でＲ² がトリヒドロキシプロピル
基、又はＲ¹ がヒドロキシメチル基でＲ² がジヒドロキ
シプロピル基であることが好ましい。

【００１４】一般式（Ｉ）中、Ａの定義は上記の通りで
あり、Ａにより形成される環がピリジン、ベンゼン、フ
ラン又はチオフェンであることが好ましい。また、Ａに
より形成される環は、Ｒ³ の他に、５員環の場合には１
又は２個、６員環の場合には１〜３個のさらなる任意の
置換基によって置換されていてもよい。該置換基として
は、カルボキシ基、スルホニル基、アルコキシカルボニ
ル基、カルバモイル基、シアノ基、ホルミル基、ヒドロ
キシ基、メルカプト基、ニトロ基、ハロゲン原子；、カ
ルボキシ基、スルホニル基、アルコキシカルボニル基、
カルバモイル基、シアノ基、ホルミル基、ヒドロキシ
基、メルカプト基、ニトロ基、ハロゲン原子で置換され
ていてもよい芳香族炭化水素基、芳香族複素環基、また
は脂肪族炭化水素基（該脂肪族炭化水素基は炭素鎖が酸
素またはイオウ原子によって置換されていてもよい）等
を挙げることができる。

【００１５】一般式（Ｉ）中、Ｒ³ は架橋性残基であ
る。本明細書において架橋性残基とは、ピラジン誘導体
と他の物質とを結合することのできる化学構造を意味す
る。Ｒ³ は、ピラジン部分を免疫原性担体や標識のよう
な他の化合物と結合することを目的とするのであるか
ら、この目的が達成されるならばその具体的な構造は如
何なるものでもよい。従って、架橋性残基による結合手
段としては、共有結合及び非共有結合のどちらをも包含
する。非共有結合としては、疎水結合、水素結合、イオ
ン結合、配位結合等を挙げることができ、具体的には、
長鎖の脂肪族炭化水素（炭素数は好ましくは８〜１
８）、カルボキシレートイオン、アンモニウムイオン等
を挙げることがきる。共有結合の場合は、Ｒ³ はスペー
サー部分と反応部分とから成ることが好ましい。反応部
分とは他の化合物と反応して共有結合を形成することの
できる官能基を意味し、例えば、カルボキシル基、水酸
基、スルフヒドリル基、アミノ基、マレイミド基、アル
デヒド基、ハロゲン原子等、及び他の化合物と結合する
ために活性化されたこれら官能基の誘導体を挙げること
ができる。スペーサー部分とは、ピラジン部分と反応部
分とを適当な距離に置くことのできる化学構造を意味
し、例えば、脂肪族炭化水素（炭素数は好ましくは２〜
６）、芳香族炭化水素、またはこれらが互いにエステル
結合、アミド結合、エーテル結合、チオエーテル結合、
ジスルフィド結合、シッフ塩基結合等により連結された
構造等を挙げることができるが、Ｒ³ は反応部分だけで
スペーサー部分を含まない構造も取り得る。

【００１６】Ｒ³ で示される架橋性残基は、ピラジン誘
導体と他の物質とを直接結合させることも、２価性の反
応性架橋剤を介して間接的に結合させることもできる。
ここで、２価性の反応性架橋剤の具体例として、スクシ
ンイミジル３−（２−ピリジルチオ）プロピオネ−ト
（ＳＰＤＰ）、Ｎ−スクシンイミジル４−マレイミド酪
酸（ＧＭＢＳ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミ
ノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、Ｎ，
Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、３
−（２−ピリジルジチオ）プロピオニルヒドラジド（Ｐ
ＤＰＨ）、４−（４−マレイミドメチル）ブタン酸ヒド
ラジド塩酸塩（ＭＰＢＨ）等を挙げることができる。

【００１７】一般式（Ｉ）で示される化合物としての好
ましい構造は、Ｒ¹ 及びＲ² のどちらか一方が水素、他
方が２，３，４−トリヒドロキシブチル基、Ａがベンゼ
ン、Ｒ³ が４−カルボキサミドブタノイル−（２−メル
カプト）エチルアミド基である化合物Ｎ−（４−（３−
（２，３，４−トリヒドロキシブチル）キノキサリン−
６−カルボキサミド）ブタノイル）−２−メルカプトエ
チルアミンまたはＮ−（４−（２−（２，３，４−トリ
ヒドロキシブチル）キノキサリン−６−カルボキサミ
ド）ブタノイル）−２−メルカプトエチルアミンが好ま
しい。Ｎ−（４−（３−（２，３，４−トリヒドロキシ
ブチル）キノキサリン−６−カルボキサミド）ブタノイ
ル）−２−メルカプトエチルアミン及びＮ−（４−（２
−（２，３，４−トリヒドロキシブチル）キノキサリン
−６−カルボキサミド）ブタノイル）−２−メルカプト
エチルアミンの化学式を以下に示す。

【００１８】

【化３】

【００１９】

【化４】

【００２０】本発明の抗体は、上記したピラジン誘導体
を認識するものであるが、特に、該ピラジン誘導体の少
なくともＲ¹ 又はＲ² を包含する領域を認識するもので
ある。すなわち、より詳細に後述するように、本発明の
抗体は検体中の１，２−ジカルボニル誘導体を測定する
ために用いられるものである。この１，２−ジカルボニ
ル誘導体が後述するジアミノ誘導体と反応して上記一般
式（Ｉ）で示されるピラジン誘導体を形成し、形成され
たピラジン誘導体を本発明の抗体を用いて測定するので
ある。そして、１，２−ジカルボニル誘導体は、ピラジ
ン誘導体中のＲ¹ 及びＲ² 並びにこれらの置換基が結合
しているピラジン環の部分を構成する。従って、本発明
の抗体は、ピラジン誘導体の少なくともＲ¹ 又はＲ² を
包含する領域を認識するものである必要があり、例え
ば、Ｒ³ のみを認識するような抗体は本発明の抗体では
ない。もっとも、Ｒ³ を含む、ピラジン誘導体全体を認
識するような抗体は、当然、本発明の抗体である。

【００２１】本発明の抗体は、ポリクローナル抗体でも
モノクローナル抗体でもよいが、均一な反応特異性を有
する抗体を再現性良く得るという観点からモノクローナ
ル抗体が好ましい。なお、ポリクローナル抗体の場合に
は、ピラジン誘導体の少なくともＲ¹ 又はＲ² を包含す
る領域以外の領域を認識する抗体が含まれていても構わ
ない。

【００２２】本発明の抗体は、一般式（Ｉ）で示される
ピラジン誘導体又は該ピラジン誘導体のＲ³ に免疫原性
担体が結合したものから成る免疫原を用いて常法により
調製することができ、後者の免疫原を用いることがより
好ましい。免疫原性担体としては、ＢＳＡやＫＬＨのよ
うなタンパク質が好ましい。

【００２３】ポリクローナル抗体の場合には、上記の免
疫原を動物に免疫し、抗血清から常法により抗体を生成
することにより本発明の抗体を得ることができる。ま
た、モノクローナル抗体の場合には、上記免疫原を免疫
した動物の脾臓細胞等のような抗体産生細胞と、ミエロ
ーマ細胞のような腫瘍細胞とを、ポリエチレングリコー
ル等のような融合剤で融合してハイブリドーマを作製す
る。次いでハイブリドーマをＨＡＴ培地のような選択培
地を用いて選択し、限界希釈法等の適当な方法でモノク
ロン化して培養する。この培養上清を酵素免疫測定法の
ような適当な免疫測定法で分析し、目的とする抗ピラジ
ン誘導体抗体を産生しているクローンを選択する。これ
らのモノクローナル抗体作製の手法は、公知の方法、例
えば、ケーラーとミルシュタイン（Nature 256 495 197
5 ）、シェーラー（Nature 285 4461980 ）等の方法に
より行うことができる。また上述の手法により作製した
モノクローナル抗体は、培養上清から、塩折、イオン交
換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー等
の分析・精製手段により回収することができる。さら
に、ピラジン誘導体の少なくともＲ¹ 又はＲ² を包含す
る領域以外の領域を認識する抗体は、下記実施例に詳述
するように、１，２−ジカルボニル誘導体の濃度を変え
て後述する本発明の方法により１，２−ジカルボニル誘
導体の測定を行って検量線を書き、該検量線が１，２−
ジカルボニル誘導体の濃度に依存して変化するものを選
択することにより得ることができる。

【００２４】次に、本発明の抗体を用いた１，２−ジカ
ルボニル誘導体の測定方法について説明する。

【００２５】本発明の免疫測定方法の測定対象である
１，２−ジカルボニル誘導体は、デオキシグルコゾン、
グリオキサール等の、生体内におけるタンパク質の糖化
反応の中間体である１，２−ジカルボニル誘導体であ
り、例えば、２−デオキシグルコゾン、３−デオキシグ
ルコゾン、４−デオキシグルコゾン、メチルグリオキサ
ール等を挙げることができる。

【００２６】また、１，２−ジカルボニル誘導体を含む
検体としては、特に限定されないが、通常、血清、血
漿、血液、尿等の体液や生体組織である。

【００２７】本発明の免疫測定方法では、先ず、検体中
の１，２−ジカルボニル誘導体を、上記一般式（II）で
示されるジアミノ誘導体と反応させて上記一般式（Ｉ）
で示されるピラジン誘導体を生成させる。この反応は、
好ましくは、４℃〜３７℃、さらに好ましくは室温で、
好ましくは１２〜２０時間程度、単に混合するだけで行
うことができる。また、反応させるジアミノ誘導体の濃
度は、通常、１〜５０μｇ／ｍｌ程度、好ましくは５〜
２０μｇ／ｍｌ程度である。なお、１，２−ジカルボニ
ル誘導体とジアミノ誘導体との反応は、免疫反応の前に
行うことも、同時に行うこともできる。以下に、例とし
て、１，２−ジカルボニル誘導体の一種である３−デオ
キシグルコゾンとジアミノ誘導体の一種であるジアミノ
ベンゼン誘導体との反応式を示す。

【００２８】

【化５】

【００２９】次に、本発明の抗体を用いた免疫測定方法
により、上記の反応により形成された、一般式（Ｉ）で
示されるピラジン誘導体を測定する。免疫測定方法自体
は、この分野において周知であり、免疫組織染色法、免
疫比濁法、ラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノア
ッセイ等の該抗体とピラジン誘導体との免疫反応を応用
するいずれの測定方法をも採用することができる。

【００３０】好ましい免疫測定方法の一例として、上記
ジアミノ誘導体のＲ³ が検出可能な標識により標識され
ており、免疫測定は、本発明の抗体を固相に結合させ、
該固相結合抗体と前記ピラジン誘導体とを反応させ、洗
浄後、固相に結合された標識量を測定することにより前
記ピラジン誘導体を測定することから成る方法を挙げる
ことができる。この場合の標識としては、ビオチン、酵
素、放射性同位体等のこの分野において常用されるいず
れの標識をも用いることができる。

【００３１】

【実施例】以下、本発明を実施例に基づきさらに具体的
に説明する。もっとも、本発明は、下記実施例に限定さ
れるものではない。

【００３２】参考例１ Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニル−
４−アミノ酪酸（化合物(1) ）の合成

【００３３】４−アミノ酪酸５．１６ｇを水２０ｍｌに
溶解し、Ｎ−メチルモルホリン８．４ｍｌと、アセトン
５０ｍｌに溶解した２−ｔ−ブトキシカルボニルオキシ
イミノ−２−フェニルアセトニトリル１１．０８ｇを加
え、室温で一夜撹拌した。溶媒を約半分溜去し、水及び
酢酸エチルを加えてよく振り混ぜ、分液した。水層を酢
酸エチルで洗い、有機相を合わせて、５％炭酸水素ナト
リウム水溶液で抽出した。水層を合わせて酢酸エチルを
加え、６Ｎ塩酸でｐＨを約３とし、分液した。水層を更
に２回酢酸エチルで抽出し、抽出液を合わせて水洗いし
た。これを無水硫酸マグネシウムで乾燥した。乾燥剤を
濾去した後、Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシルアミンを加え結
晶化した。結晶を濾取し、エーテルで洗って乾燥した。
Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシルアミン塩の収量は１５．０７
ｇで、収率は７９％であった。

【００３４】Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシルアミン塩全量を
酢酸エチルと５％クエン酸水溶液に溶解し、分液した。
水層を酢酸エチルで抽出し、有機相を合わせて、５％ク
エン酸水溶液及び水で洗って、無水硫酸マグネシウムで
乾燥した。溶媒を溜去し、Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニル
−４−アミノ酪酸（以下、本明細書中では化合物(1)と
記載する）として７．５７ｇの油状物を得た。化合物
(1) の化学式を以下に示す。式中Ｂｏｃはｔ−ブトキシ
カルボニル基を示す。

【００３５】

【化６】

【００３６】化合物〔１〕のＮＭＲ測定結果は以下の通
りであった。 １Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃ ，ｐｐｍ）δ
１．４４（９Ｈ，ｓ），１．８２（２Ｈ，ｍ，Ｊ＝７．
０，７．０Ｈｚ），２．４０（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．０Ｈ
ｚ），３．１８（２Ｈ，ｍ），４．７２（１Ｈ，ｓ）．

【００３７】参考例２ Ｓ−（２−ピリジルチオ）−２
−メルカプトエチルアミン塩酸塩（化合物(2) ）の合成 ２，２’−ジピリジルジスルフィド１３．２ｇをメタノ
ール１００ｍｌに溶解し、激しく撹拌しながら、メタノ
ール３０ｍｌに溶解した２−メルカプトエチルアミン塩
酸塩３．４ｇを滴下した。反応液を１時間４０分撹拌し
た後、溶媒を溜去した。残渣に酢酸エチルを加えて結晶
化し、濾取した。得られた粗結晶をメタノール−エーテ
ルから再結晶した。母液を濃縮し、エーテルを加えてさ
らに結晶化し、Ｓ−（２−ピリジルチオ）−２−メルカ
プトエチルアミン塩酸塩（以下、本明細書中では化合物
(2) と記載する）を得た。化合物(2) の収量は５．６２
ｇで、収率は８４％であった。化合物(2) の化学式を以
下に示す。

【００３８】

【化７】

【００３９】化合物(2) のＮＭＲ測定結果は以下の通り
であった。 １Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−Ｄ₆ ，ｐｐ
ｍ）δ３．０９（４Ｈ，ｍ），７．３０（１Ｈ，ｍ，Ｊ
＝１．１，４．８，７．４Ｈｚ），７．７５（１Ｈ，
ｍ，Ｊ＝０．９，１．１，８．０Ｈｚ），７．８４（１
Ｈ，ｍ，Ｊ＝１．８，７．４，８．０Ｈｚ），８．１０
（３Ｈ，ｓ），８．５２（１Ｈ，ｍ，Ｊ＝０．９，１．
８，４．８Ｈｚ）．

【００４０】参考例３ Ｎ−（４−ｔ−ブトキシカルボ
キサミドブタノイル）−Ｓ−（２−ピリジルチオ）−２
−メルカプトエチルアミン（化合物(3) ）の合成 参考例１で合成した化合物(1) を０. ９８ｇ、参考例２
で合成した化合物(2)を１. ０７ｇ及び１−ヒドロキシ
ベンゾトリアゾール０. ６５ｇをＤＭＦ２０ｍｌに懸濁
し、氷／食塩浴で冷却下、水溶性カルボジイミド０. ８
８ｍｌを加え、室温で６時間撹拌した。次いで、水溶性
カルボジイミド塩酸塩０. ２８ｇを追加し、一夜撹拌し
た。溶媒を溜去し、残渣を水と酢酸エチルに溶解し分液
した。酢酸エチル相を水、５％炭酸水素ナトリウム水溶
液、水で洗って、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶
媒を溜去し、油状の残渣をシリカゲルカラムクロマトグ
ラフィー（１００ｍｌ、酢酸エチル）で精製した。Ｎ−
（４−ｔ−ブトキシカルボキサミドブタノイル）−Ｓ−
（２−ピリジルチオ）−２−メルカプトエチルアミン
（以下、本明細書中では化合物(3) と記載する）の収量
は１. １０ｇで、収率は５６％であった。化合物(3) の
化学式を以下に示す。

【００４１】

【化８】

【００４２】化合物(3) のＮＭＲ測定結果は以下の通り
であった。 １Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃ ，ｐｐｍ）δ
１．４４（９Ｈ，ｓ），１．８２（２Ｈ，ｍ，Ｊ＝７．
０Ｈｚ），２．２７（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），
２．９４（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ），３．１８（２
Ｈ，ｍ），３．５７（２Ｈ，ｍ，Ｊ＝６．０，６．０Ｈ
ｚ），４．８６（１Ｈ，ｓ），７．１５（１Ｈ，ｍ，Ｊ
＝１．８，４．９，６．７Ｈｚ），７．３９（１Ｈ，
ｓ），７．５４（１Ｈ，ｍ，Ｊ＝０．５，０．９，８．
１Ｈｚ），７．６３（１Ｈ，ｍ，Ｊ＝１．８，４．９，
６．７Ｈｚ），８．５０（１Ｈ，ｍ，Ｊ＝０．９，１．
８，４．９Ｈｚ）．

【００４３】参考例４ ３，４−ジ−ｔ−ブトキシカル
ボキサミド安息香酸（化合物(4) ）の合成 ３，４−ジアミノ安息香酸３．０４ｇを１Ｎ水酸化ナト
リウム水溶液２５ｍｌに溶解し、ジ−ｔ−ブチルジカー
ボネート９．６ｇをアセトン３０ｍｌに溶解して加え、
一夜撹拌した。次いで、ジ−ｔ−ブチルジカーボネート
２．０ｇと１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液５ｍｌを追加
し、さらに３日間撹拌を続けた。アセトンを溜去し、残
渣に水と酢酸エチルを加えてよく振り混ぜた後、分液し
た。水層を酢酸エチルで抽出し、酢酸エチル相を合わせ
て、５％炭酸水素ナトリウム水溶液で２回抽出した。水
層をすべて合わせて、酢酸エチルを加え、６Ｎ塩酸でｐ
Ｈを約３とした後、分液した。水層を酢酸エチルで２回
抽出し、酢酸エチル相を合わせて水洗した。抽出液を濃
縮し、析出した結晶を濾取した。酢酸エチルで結晶を洗
い、五酸化二燐上で乾燥した。３，４−ジ−ｔ−ブトキ
シカルボキサミド安息香酸（以下、本明細書中では化合
物(4) と記載する）の収量は５. ５５ｇで、収率は７９
％であった。化合物(4) の化学式を以下に示す。

【００４４】

【化９】

【００４５】化合物(4) のＮＭＲ測定結果は以下の通り
であった。 １Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−Ｄ₆ ，ｐｐ
ｍ）δ１．４８（９Ｈ，ｓ），１．４９（９Ｈ，ｓ），
７．６３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ），７．７１（１
Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ），８．０９（１Ｈ，ｓ），
８．６８（１Ｈ，ｓ），８．７３（１Ｈ，ｓ），１２．
６−１３．０（１Ｈ，ｂｒｏａｄ ｓ）．

【００４６】参考例５ ３，４−ジ−ｔ−ブトキシカル
ボキサミド安息香酸Ｎ−コハク酸イミドエステル（化合
物(5) ）の合成 参考例４で合成した化合物(4) ５. ５０ｇとＮ−ヒドロ
キシコハク酸イミド２. ７０ｇをＤＭＦ５０ｍｌに溶解
し、氷冷下、水溶性カルボジイミド塩酸塩４.５０ｇを
加え、撹拌した。２時間後、室温に戻し一夜撹拌した。
溶媒を溜去し、残渣を水と酢酸エチルを加えて溶解し、
分液した。酢酸エチル相を水、５％炭酸水素ナトリウム
水溶液、５％クエン酸水溶液、水で洗って、無水硫酸マ
グネシウムで乾燥した。溶媒を溜去し、ヘキサンを加え
て結晶化し、濾取した。３，４−ジ−ｔ−ブトキシカル
ボキサミド安息香酸Ｎ−コハク酸イミドエステル（以
下、本明細書中では化合物(5) と記載する）の収量は
６. ６３ｇで、収率は９５％であった。化合物(5) の化
学式を以下に示す。化合物(5) の化学式中、ＮＳｕはコ
ハク酸イミド基を示す。

【００４７】

【化１０】

【００４８】化合物(5) のＮＭＲ測定結果は以下の通り
であった。 １Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−Ｄ₆ ，ｐｐ
ｍ）δ１．４９（９Ｈ，ｓ），１．５０（９Ｈ，ｓ），
２．８８（４Ｈ，ｓ），７．７８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．
６Ｈｚ），７．９５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ），
８．２８（１Ｈ，ｓ），８．８９（１Ｈ，ｓ），８．９
９（１Ｈ，ｓ）．

【００４９】参考例６ Ｎ−（４−（３，４−ジアミノ
ベンズアミド）ブタノイル）−Ｓ−（２−ピリジルチ
オ）−２−メルカプトエチルアミン（化合物(7) ）の合
成 参考例３に記載の方法で合成した化合物(3) １. ５４ｇ
をクロロホルム５ｍｌに溶解し、トリフルオロ酢酸５ｍ
ｌを加え、室温で３０分撹拌後、溶媒を溜去した。残渣
にクロロホルムを加えて溜去を３回繰り返した後、ＤＭ
Ｆ２０ｍｌに溶解した。これを氷冷しトリエチルアミン
で中和し、化合物(5) １. ８６ｇを加え、トリエチルア
ミンでｐＨを７〜８位に調節しながら一夜反応させた。
溶媒を溜去し、残渣を水と酢酸エチルに溶解し、分液し
た。酢酸エチル相を５％クエン酸水溶液、５％炭酸水素
ナトリウム水溶液、水で洗って、無水硫酸マグネシウム
で乾燥した。溶媒を溜去し、Ｎ−（４−（３，４−ジ−
ｔ−ブトキシカルボキサミドベンズアミド）ブタノイ
ル）−Ｓ−（２−ピリジルチオ）−２−メルカプトエチ
ルアミン（以下、本明細書中では化合物(6) と記載す
る）を油状物として得た。化合物(6) の化学式を以下に
示す。

【００５０】

【化１１】

【００５１】化合物(6) のＮＭＲ測定結果は以下の通り
であった。 １Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃ ，ｐｐｍ）δ
１．５１（９Ｈ，ｓ），１．５２（９Ｈ，ｓ），１．９
７（２Ｈ，ｍ），２．３４（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．９Ｈ
ｚ），２．９０（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ），３．４
６−３．５７（４Ｈ，ｍ），６．７−６．９（１Ｈ，ｂ
ｒｏａｄ ｓ），７．１０−７．１７（２Ｈ，ｍ），
７．５２−７．７０（４Ｈ，ｍ），７．８２（１Ｈ，
ｓ），８．４７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．９Ｈｚ）．

【００５２】化合物(6) 全量をトリフルオロ酢酸１０ｍ
ｌに溶解し、室温で１時間撹拌した。トリフルオロ酢酸
を溜去し、水を加えてもう一度溜去した。残渣を水に溶
解し、ダイアイオン ＨＰ−２０カラム４５ｍｌに吸着
させ、水２５０ｍｌで洗った後、４０％アセトニトリル
水溶液３００ｍｌで溶出した。溶出液を集めて濃縮し、
分離してきた油状物を少量のアセトニトリルを加えて溶
解し、凍結乾燥して、Ｎ−（４−（３，４−ジアミノベ
ンズアミド）ブタノイル）−Ｓ−（２−ピリジルチオ）
−２−メルカプトエチルアミン（以下、本明細書中では
化合物(7) と記載する）を得た。化合物(7) の収量は
１. ３０ｇであった。化合物(7) の化学式を以下に示
す。

【００５３】

【化１２】

【００５４】化合物(7) のＮＭＲ測定結果は以下の通り
であった。 １Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−Ｄ₆ ，ｐｐ
ｍ）δ１．７０（２Ｈ，ｍ），２．１０（２Ｈ，ｔ，Ｊ
＝７．３Ｈｚ），２．８９（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．８Ｈ
ｚ），３．１８（２Ｈ，ｍ），３．３３（２Ｈ，ｍ），
５．４２（４Ｈ，ｂｒｏａｄ ｓ），６．５３（１Ｈ，
ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ）７．０５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１．
９，８．１Ｈｚ），７．１５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．９Ｈ
ｚ），７．２３（１Ｈ，ｍ，Ｊ＝１．１，４．８，７．
３Ｈｚ），７．７６（１Ｈ，ｍ，Ｊ＝０．９，１．１，
８．４Ｈｚ），７．８２（１Ｈ，ｍ，Ｊ＝１．８，７．
３，８．４Ｈｚ），７．９４（１Ｈ，ｂｒｏａｄ
ｔ），８．０６（１Ｈ，ｂｒｏａｄｔ），８．４５（１
Ｈ，ｍ，Ｊ＝０．９，１．８，４．８Ｈｚ）．

【００５５】実施例１ Ｎ−（４−（３−（２，３，４
−トリヒドロキシブチル）キノキサリン−６−カルボキ
サミド）ブタノイル）−Ｓ−（２−ピリジルチオ）−２
−メルカプトエチルアミン（化合物（８−１））及びＮ
−（４−（２−（２，３，４−トリヒドロキシブチル）
キノキサリン−６−カルボキサミド）ブタノイル）−Ｓ
−（２−ピリジルチオ）−２−メルカプトエチルアミン
（化合物（８−２））の合成 参考例６で合成した化合物(7) ２８. ９５ｍｇをメタノ
ール１ｍｌに溶解し、文献（Carbohyd. Res., 17, p183
-192, 1971）に記載の方法に従って合成した３−デオキ
シ−Ｄ−エリスロヘキソース−２−ウロース（３−デオ
キシグルコゾン）（以下、本明細書中では３−ＤＧと記
載する）３６. ９２ｍｇを１ｍｌのＰＢＳに溶解して混
合した。アルゴン雰囲気下、室温で一夜撹拌した。反応
液を水で希釈しダイアイオンＨＰ−２０カラム５ｍｌに
吸着させ、水洗し、４０％アセトニトリル水溶液で溶出
した。溶出液を濃縮し、別のダイアイオンＨＰ−２０カ
ラム７ｍｌに吸着させ、５％、１０％、２０％アセトニ
トリル水溶液で順に溶出し、２０％アセトニトリル水溶
液で溶出された画分を集めて濃縮し、これを凍結乾燥し
て化合物(8) を得た。化合物(8) は、Ｎ−（４−（３−
（２，３，４−トリヒドロキシブチル）キノキサリン−
６−カルボキサミド）ブタノイル）−Ｓ−（２−ピリジ
ルチオ）−２−メルカプトエチルアミン（以下、本明細
書中では化合物（８−１）と記載する）とＮ−（４−
（２−（２，３，４−トリヒドロキシブチル）キノキサ
リン−６−カルボキサミド）ブタノイル）−Ｓ−（２−
ピリジルチオ）−２−メルカプトエチルアミン（以下、
本明細書中では化合物（８−２）と記載する）との混合
物である。化合物(8) の収量は、異性体の混合物として
２６. ７０ｍｇであった。化合物（８−１）及び（８−
２）の化学式を以下に示す。

【００５６】

【化１３】

【００５７】

【化１４】

【００５８】化合物(8) のＮＭＲ測定結果は以下の通り
であった。 １Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−Ｄ₆ ，ｐｐ
ｍ）δ１．８１（２Ｈ，ｍ），２．１８（２Ｈ，ｔ，Ｊ
＝７．３Ｈｚ），２．９０（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．８Ｈ
ｚ），３．０２（２Ｈ，ｍ），３．３４（４Ｈ，ｍ），
３．４５（２Ｈ，ｍ），３．６１（１Ｈ，ｍ），３．９
３（１Ｈ，ｍ），４．４５（１Ｈ，ｂｒｏａｄｓ），
４．７８（２Ｈ，ｍ），７．２２（１Ｈ，ｍ），７．７
６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ），７．８１（１Ｈ，ｄ
ｄ，Ｊ＝７．２，８．１Ｈｚ），８．０８（２Ｈ，
ｍ），８．１７（０．４Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），
８．２１（０．６Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），８．４５
（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．６Ｈｚ），８．５４（０．４Ｈ，
ｓ），８．５６（０．６Ｈ，ｓ），８．８２（１Ｈ，ｂ
ｒｏａｄｄ，Ｊ＝５．１Ｈｚ），８．９０（０．４Ｈ，
ｓ），８．９１（０．６Ｈ，ｓ）．

【００５９】実施例２ ＫＬＨ結合ピラジン誘導体の合
成 免疫原として、化合物(8) と貝ヘモシアニン（以下、本
明細書ではＫＬＨと記載する）（カルビオケム社製）と
の結合物を合成した。すなわち、ＫＬＨ１１.１６ｍｇ
を０. １Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）８９３μｌに溶
解し、ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）２２３μｌに溶
解したＧＭＢＳ（４−マレイミド酢酸Ｎ−コハク酸イミ
ドエステル、同人化学研究所製）２. ２３ｍｇを加え、
室温で１時間撹拌した。１ｍＭのＥＤＴＡを含む０. １
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７. ０）で平衡化したＰＤ−１０
カラム（ファルマシア社製）二本に、反応液を５００μ
ｌずつ分注し、同緩衝液で溶出した。それぞれ、最初の
２. ５ｍｌを棄て、続く２. ０ｍｌを集めた。

【００６０】一方、実施例１で合成した化合物〔８〕
３. ４６ｍｇを２０％アセトニトリル水溶液３００μｌ
に溶解し、ジチオスレイトール１１. ５６ｍｇを加えて
室温で３０分放置した。この還元溶液１５０μｌを、逆
相ＨＰＬＣ（ＹＭＣ−ＰａｃｋＡＰ−３２２、内径１０
ｍｍｘ長さ１５０ｍｍ）を用いて、１ｍＭのＥＤＴＡを
含む０. １Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７. ０）とアセトニト
リル１０−２０％の濃度勾配で溶出分離し、保持時間１
０分のピーク分画（Ａ）および１０. ８分のピーク分画
（Ｂ）を分取した。分画（Ａ）及び（Ｂ）を、上記のマ
レイミド化ＫＬＨ溶液にそれぞれ加え、室温で撹拌し
た。４０分後に残りの還元溶液１５０μｌを分取しそれ
ぞれの反応液に追加した。通算で３時間反応させ、透析
チューブに移し、ＰＢＳに対し一夜透析し、ＫＬＨ結合
ピラジン誘導体を得た。収量は、分画（Ａ）由来のＫＬ
Ｈ結合ピラジン誘導体が約７ｍｌ（３４６ｍｇ／ｍ
ｌ）、分画（Ｂ）由来のＫＬＨ結合ピラジン誘導体が約
６ｍｌ（３７５ｍｇ／ｍｌ）であった。

【００６１】実施例３ ＢＳＡ結合ピラジン誘導体の合
成 実施例２と同様の方法で、牛血清アルブミン（以下、本
明細書ではＢＳＡと記載する）１２. ８８ｍｇと実施例
１で合成した化合物(8) ３. ３ｍｇとを用い、免疫測定
用の抗原として化合物(8) とＢＳＡとの結合物を合成し
た。収量は、逆相ＨＰＬＣで分取した分画（Ａ）由来の
ＢＳＡ結合ピラジン誘導体が約８ｍｌ（５９０ｍｇ／ｍ
ｌ）、分画（Ｂ）由来のＢＳＡ結合ピラジン誘導体が約
７ｍｌ（６６５ｍｇ／ｍｌ）であった。

【００６２】実施例４ ビオチン結合ピラジン誘導体
（化合物(9) ）の合成 免疫測定用の抗原として、化合物(8) とビオチンとの結
合物（以下、本明細書では化合物(9) と記載する）を合
成した。すなわち、実施例１に記載の方法で合成した化
合物(8) ２１. ３５ｍｇを１ｍＭのＥＤＴＡを含む０.
１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７. ０）２ｍｌとメタノール
０. ２ｍｌに溶解し、ジチオスレイトール４０. ５３ｍ
ｇを加えて、アルゴン雰囲気下室温で撹拌した。この溶
液を逆相ＨＰＬＣ（アサヒパックＯＤＰ−９０、２０ｍ
ｍＩ．Ｄ．ｘ３００ｍｍＬ．昭和電工社製）を用い、１
ｍＭのＥＤＴＡを含む０. １Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７.
０）とアセトニトリル１０−２０％の濃度勾配で溶出分
離し、保持時間約２６分のピーク分画（Ａ）と２７分の
ピーク分画（Ｂ）を分取した。ビオチン−ＰＥ−マレイ
ミド（同人化学研究所製）を、分画（Ａ）には１４. ０
ｍｇ、分画（Ｂ）には１１. ３ｍｇ加え、アルゴン雰囲
気下、室温で撹拌した。分画（Ａ）の反応液をダイアイ
オンＨＰ−２０カラム７ｍｌに、分画（Ｂ）の反応液を
ダイアイオンＨＰ−２０カラム５ｍｌに吸着させ、それ
ぞれ１０％アセトニトリル水溶液で洗った後、４０％ア
セトニトリル水溶液で溶出し、凍結乾燥した。収量は、
分画（Ａ）由来のビオチン結合ピラジン誘導体が１１．
３５ｍｇ、分画（Ｂ）由来のビオチン結合ピラジン誘導
体が４．１５ｍｇであった。化合物（９−１）及び（９
−２）の化学式を以下に示す。

【００６３】

【化１５】

【００６４】

【化１６】

【００６５】実施例５ ビオチン結合ジアミノベンゼン
誘導体（化合物(10)）の合成 参考例６に記載の方法で合成した化合物(7) １００ｍｇ
を１ｍＭのＥＤＴＡを含む０. １Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
７. ０）４ｍｌとアセトニトリル１ｍｌに溶解し、ジチ
オスレイトール１１５ｍｇを加えて１時間撹拌した。ダ
イヤイオンＨＰ−２０カラム１０ｍｌに吸着させ、水５
０ｍｌで洗った後、２０％アセトニトリル水溶液５０ｍ
ｌで溶出した。溶出液にビオチン−ＰＥ−マレイミド４
２．６ｍｇを加え５時間攪拌した。ダイヤイオンＨＰ−
２０カラム２０ｍｌに吸着させ、水５０ｍｌで洗った
後、４０％アセトニトリル水溶液５０ｍｌで溶出した。
溶出液を凍結乾燥し、粗生成物５３．８ｍｇを得た。逆
相ＨＰＬＣを用いて精製し、化合物(10)８．０５ｍｇを
得た。化合物(10)の化学式を以下に示す。

【００６６】

【化１７】

【００６７】参考例７ Ｎα−（９−フルオレニルメト
キシカルボニル）−Ｎε−（３，４−ジ−ｔ−ブトキシ
カルボキサミドベンゾイル）−Ｌ−リジン（化合物(1
1)）の合成 Ｎα−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）−Ｎε
−ｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−リジン０．５４ｇをク
ロロフォルム５ｍｌに溶解し、トリフルオロ酢酸５ｍｌ
を加えて、室温で１時間撹拌した。溶媒を溜去し、エー
テルを加えて沈殿させ、上澄みを除いて、ＤＭＦ５ｍｌ
に溶解した。氷冷下、トリエチルアミン３２２μｌと
３，４−ジ−ｔ−ブトキシカルボキサミド安息香酸Ｎ−
コハク酸イミドエステル０．６７ｇを加え、室温で一夜
撹拌した。溶媒を溜去し、残渣を酢酸エチル、希塩酸に
溶解し、分液した。酢酸エチル相を水洗し、無水硫酸マ
グネシウムで乾燥した。溶媒を溜去し、残渣にｎ−ヘキ
サンを加え、結晶を濾取した。化合物(11)の収量は０．
６０ｇであった。化合物(11)の化学式を以下に示す。化
合物(11)の化学式中、Ｆｍｏｃは９−フルオレニルメト
キシカルボニル基を示す。

【００６８】

【化１８】

【００６９】参考例８ Ｎε−（３，４−ジ−ｔ−ブト
キシカルボキサミドベンゾイル）−Ｌ−リジン（化合物
(12)）の合成 参考例７で合成した化合物(11)０．６０ｇをＤＭＦ７ｍ
ｌに溶解し、ピぺリジン３ｍｌを加え、室温で１０分間
撹拌した。反応液を１．５％トリフルオロ酢酸水溶液１
５０ｍｌ中に注ぎ、不溶物を濾去した。水相をダイアイ
オンＨＰ−２０カラム１０ｍｌに通して目的物を吸着さ
せ、水５０ｍｌで洗った後、４０％アセトニトリル水溶
液１００ｍｌで溶出した。溶出液を濃縮し、凍結乾燥し
た。化合物(12)の収量は１０１ｍｇであった。化合物(1
2)の化学式を以下に示す。

【００７０】

【化１９】

【００７１】実施例６ Ｎα−（５−（ビオチニルアミ
ノ）−ペンタノイル）−Ｎε−（３，４−ジアミノベン
ゾイル）−Ｌ−リジン（化合物(13)）の合成 参考例８で合成した化合物〔１２〕３０．２９ｍｇを
０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）３ｍｌに懸濁し、
激しく撹拌しながらビオチン−ＡＣ５−ＯＳｕ（同人化
学社製）のＤＭＦ溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）４ｍｌを４回
に分けて加え、室温で一夜撹拌した。溶媒を溜去し、残
渣を酢酸エチルと水に溶解し、６Ｎ塩酸で酸性にした。
析出した沈殿を濾取し、水洗し、五酸化二燐上で乾燥し
た。得られた固体を、トリフルオロ酢酸１ｍｌに溶解し
室温で１時間撹拌した。溶媒を溜去し、残渣を水に溶解
し凍結乾燥した。化合物(13)の収量は２１．１４ｍｇで
あった。化合物(13)の化学式を以下に示す。

【００７２】

【化２０】

【００７３】化合物〔１３〕のＮＭＲ測定結果は以下の
通りであった。 １Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−Ｄ₆ ，ｐｐ
ｍ）δ１．２−１．８（１６Ｈ，ｍ），２．０５（２
Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），２．１０（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝
７．３Ｈｚ），２．５８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１２．４Ｈ
ｚ），２．８２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．１，１２．４Ｈ
ｚ），３．００（２Ｈ，ｍ），３．０９（１Ｈ，ｍ），
３．１９（２Ｈ，ｍ），３．２−４．０（４Ｈ，ｂｒｏ
ａｄ ｓ），４．１４（２Ｈ，ｍ），４．３１（１Ｈ，
ｍ），６．３６（１Ｈ，ｂｒｏａｄ ｓ），６．４２
（１Ｈ，ｂｒｏａｄ ｓ），６．７１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝
８．４Ｈｚ），７．３４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝０．７，
８．４Ｈｚ），７．４４（１Ｈ，ｓ），７．７２（１
Ｈ，ｍ），８．００（１Ｈ，ｍ），８．１０（１Ｈ，
ｍ）．

【００７４】参考例９ Ｎα−ビオチニル−Ｎε−
（３，４−ジアミノベンゾイル）−Ｌ−リジン（化合物
(14)）の合成 参考例８で合成した化合物(12)４１．０７ｍｇを０．１
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）４ｍｌに懸濁し、激しく
撹拌しながらビオチン−ＯＳｕ（同人化学社製）のＤＭ
Ｆ溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）３ｍｌを加え、室温で一夜撹
拌した。溶媒を溜去し、残渣を酢酸エチルと水に溶解
し、６Ｎ塩酸で酸性にした。分液し、酢酸エチル相を水
洗した。溶媒を溜去し、残渣をトリフルオロ酢酸１ｍｌ
に溶解して室温で１時間撹拌した。溶媒を溜去し、残渣
を水、アセトニトリルに溶解し凍結乾燥した。化合物(1
4)の収量は４７ｍｇであった。化合物(14)の化学式を以
下に示す。

【００７５】

【化２１】

【００７６】実施例７ 抗ピラジン誘導体モノクローナ
ル抗体の作製 抗ピラジン誘導体モノクローナル抗体は、実施例２で合
成した分画（Ａ）由来のＫＬＨ結合ピラジン誘導体をＢ
ＡＬＢ／Ｃマウスに免疫し、その脾臓リンパ球とミエロ
ーマ細胞を融合することにより作製した。すなわち、Ｂ
ＡＬＢ／Ｃマウスにフロイント完全アジュバントでエマ
ルジョン化したＫＬＨ結合ピラジン誘導体の２５〜１０
０μｇを用いて初回免疫を行い、２〜３週間後、フロイ
ント不完全アジュバントでエマルジョン化した同抗原２
５〜１００μｇで追加免疫を行った。抗体価の上昇は、
後述のスクリーニング法と同様の手法で、実施例３で合
成した分画（Ａ）由来のＢＳＡ結合ピラジン誘導体を固
相抗原としたＥＬＩＳＡで確認した。抗体価の上昇を確
認後、ＫＬＨ結合ピラジン誘導体２５〜１００μｇを静
脈内に投与し、その３〜４日後、マウスから脾臓を取り
出し脾細胞を調製した。前もってＲＰＭＩ−１６４０培
地で培養していたマウスミエローマ細胞（Ｐ３Ｕ１）と
脾細胞を１：２〜１：５の比率で混合し、ポリエチレン
グリコール（ベーリンガー社製）を用い細胞融合を行っ
た。融合した細胞はＨＡＴ培地に浮遊した後、９６ウエ
ル培養プレートに分注し３７℃二酸化炭素インキュベー
ターで培養した。

【００７７】スクリーニングは抗原固相ＥＬＩＳＡで行
った。すなわち、実施例３で合成した分画（Ａ）由来の
ＢＳＡ結合ピラジン誘導体を９６ウエルＥＬＩＳＡプレ
ート（ファルマシア社製）に１μｇ／ｍｌの濃度で５０
μｌ／ウエルづつ注し、４℃一晩放置することにより吸
着させた。プレートを１％スキムミルクでブロッキング
した後、０．０５％ツィーン２０を含むリン酸緩衝液
（以下本明細書中では、洗浄緩衝液と記載する）で３回
洗浄し、細胞融合を行ったプレートの培養上清５０μｌ
を加え、３７℃１時間反応させた。同様に洗浄緩衝液で
３回洗後、パーオキシダーゼ（以下本明細書中では、Ｐ
ＯＤと記載する）標識抗マウスイムノグロブリン抗体
（ダコ社製）を加え、さらに３７℃１時間反応させた。
洗浄緩衝液で４回洗浄後、基質ＡＢＴＳを加え発色の見
られるウエルを選択した。ＢＳＡ結合ピラジン誘導体に
反応性を示したウエルは、さらにフリーのピラジン誘導
体による抑制試験を行い特異性を確認した。すなわち、
固相抗原と培養上清との反応時に、一定濃度（約１０μ
Ｍ）のピラジン誘導体を共存させ、抑制の有無で特異性
を確認した。この場合、抑制を示すウエルが特異的なウ
エルである。特異性を確認したウエルの細胞は限界希釈
法によりクローニングを行いモノクローン化した。抗ピ
ラジン誘導体モノクローナル抗体を産生する細胞は、大
量に培養後、マウス腹腔に投与し、抗ピラジン誘導体モ
ノクローナル抗体を含む腹水を回収した。さらにプロテ
インＡ−セファロースを用い、腹水から抗体を精製しモ
ノクローナル抗体を得た。この抗ピラジン誘導体モノク
ローナル抗体を３ＤＧ−４５１抗体と命名し、３ＤＧ−
４５１抗体を産生するハイブリドーマは工業技術院生命
工学工業技術研究所微生物寄託センターに寄託され、そ
の受託番号はＦＥＲＭ Ｐ−１６１７９である。

【００７８】実施例８ 抗ピラジン誘導体モノクローナ
ル抗体の特異性の確認 抗ピラジン誘導体モノクローナル抗体の特異性は、ＢＳ
Ａ結合ピラジン誘導体を固相抗原としたＥＬＩＳＡの抑
制試験で確認した。すなわち、ヌンク社製ＥＬＩＳＡプ
レート（マキシソーブ）に実施例３で合成した分画
（Ａ）由来または分画（Ｂ）由来のＢＳＡ結合ピラジン
誘導体をそれぞれ１μｇ／ｍｌの濃度で７５μｌ／ウエ
ル分注し、４℃一夜放置し吸着させ、分画（Ａ）由来Ｂ
ＳＡ結合ピラジン誘導体吸着プレートをプレート
（Ａ）、分画（Ｂ）由来ＢＳＡ結合ピラジン誘導体吸着
プレートをプレート（Ｂ）とした。プレート（Ａ）及び
プレート（Ｂ）を１％スキムミルクで３７℃、３時間放
置してブロッキングした後、インヒビターとして、１ｍ
Ｍから５ｎ希釈した実施例１で合成したピラジン誘導体
（化合物(8) ）、１０ｍＭから５ｎ希釈した参考例６で
合成したジアミノベンゼン誘導体（化合物(7) ）、１０
ｍＭから５ｎ希釈したキノキサリン（東京化成工業社
製）の溶液をそれぞれ４０μｌづつ各ウエルに入れた。
次に、１μｇ／ｍｌの３ＤＧ−４５１抗体を４０μｌ加
え、３７℃で１時間反応させた。洗浄緩衝液で充分洗浄
した後、ＰＯＤ標識抗マウスイムノグロブリン抗体（ダ
コ社製）を加え、３７℃で１時間反応させた。同様に洗
浄緩衝液で充分洗浄した後、基質ＡＢＴＳを加え、室温
で２０〜３０分放置した後、分光光度計にて４０５ｎｍ
の吸収を測定した。図１及び図２に示すように、ＢＳＡ
結合ピラジン誘導体と３ＤＧ−４５１抗体との反応は、
ピラジン誘導体（化合物(8) ）では抑制されたが、ジア
ミノベンゼン誘導体（化合物(7) ）及びキノキサリンで
は全く抑制されなかった。３ＤＧ−４５１抗体のジアミ
ノベンゼン誘導体（化合物(7) ）及びキノキサリンに対
する交差反応性は０．１％以下であり、ピラジン誘導体
（化合物(8) ）特異的であることが確認できた。

【００７９】実施例９ ビオチン結合ピラジン誘導体
（化合物(9) ）の測定 実施例４で合成した化合物(9) をサンドイッチＥＬＩＳ
Ａ法にて測定した。ヌンク社製ＥＬＩＳＡプレート（マ
キシソーブ）に３ＤＧ−４５１抗体を１０μｇ／ｍｌの
濃度で７５μｌ／ウェルづつ分注し、４℃一晩放置して
吸着させた。プレートを１％スキムミルクで３７℃、３
時間放置してブロッキングした後、実施例４で合成した
ビオチン結合ピラジン誘導体（化合物(9) ）を１％ＢＳ
Ａ含有トリス緩衝液で４０ｎｇ／ｍｌから５ｎ希釈し、
各希釈液を抗体吸着プレートに７５μｌ／ウェルづつ入
れ、３７℃、１時間反応させた。同様に、１０００ｎｇ
／ｍｌより５ｎ希釈した実施例５で合成したビオチン結
合ジアミノベンゼン誘導体（化合物(10)）も測定した。
反応後、洗浄緩衝液で充分洗浄し、アルカリフォスファ
ターゼ（以下本明細書中では、ＡＬＰと記載する）標識
アビジン（ダコ社製）を各ウェルに７５μｌ入れ、さら
に３７℃、１時間反応させた。洗浄緩衝液で充分洗浄
し、基質ｐＮＰＰを７５μｌ／ウェル入れ室温で３０分
放置後、４０５ｎｍの波長を測定した。結果を図３に示
す。図３に示すように固相として用いた抗体３ＤＧ−４
５１はジアミノベンゼン誘導体（化合物(10)）には全く
反応しないが、ピラジン誘導体（化合物(9) ）はおよそ
１０ｐｇ／ｍｌまで測定可能であった。

【００８０】実施例１０ ３−デオキシグルコゾン（３
−ＤＧ）の測定−１ ３−ＤＧと実施例５で合成したビオチン結合ジアミノベ
ンゼン誘導体（化合物(10)）とをＰＢＳ中室温で一晩反
応させ、その反応物を３ＤＧ−４５１固相ＥＬＩＳＡで
測定した。すなわち、５μｇ／ｍｌから５ｎ希釈した３
−ＤＧにビオチン結合ジアミノベンゼン誘導体溶液（化
合物(10)）を終濃度１０μｇ／ｍｌになるように加え、
室温、一晩反応させた。ヌンク社製ＥＬＩＳＡプレート
（マキシソーブ）に３ＤＧ−４５１抗体を１０μｇ／ｍ
ｌの濃度で７５μｌ／ウェル入れ、４℃一晩放置して吸
着させた後、１％スキムミルクでブロッキングし、ＥＬ
ＩＳＡプレートを作製した。対照として、ピラジン誘導
体には特異性を持たないモノクローナル抗体ＰＣＸ２２
Ａ４を吸着させたＥＬＩＳＡプレートも作製した。ＥＬ
ＩＳＡの測定手法は実施例９で示した方法に従い、作製
した２種類のプレートを用いて、３−ＤＧとビオチン結
合ジアミノベンゼン誘導体（化合物(10)）との反応物で
あるビオチン結合ピラジン誘導体を測定した。結果を図
４に示す。図４に示すように、本測定法で３−ＤＧが測
定できることを確認した。

【００８１】実施例１１ ３−ＤＧの測定−２ ３−ＤＧと実施例６で合成したビオチン化ジアミノベン
ゼン誘導体（化合物(13)）または参考例９で合成したビ
オチン化ジアミノベンゼン誘導体（化合物(14)）とをそ
れぞれＰＢＳ中室温で一晩反応させ、その反応物を３Ｄ
Ｇ−４５１固相ＥＬＩＳＡで測定した。すなわち実施例
１０と同様に、２００ｎｇ／ｍｌから３ｎ希釈した３−
ＤＧに化合物(13)または化合物(14)を終濃度１０μｇ／
ｍｌになるように加え、室温で一晩反応させた。ＥＬＩ
ＳＡ測定方法は実施例１０と同様に行った。結果を図５
に示す。図５に示すように、化合物(14)のビオチン化ジ
アミノベンゼン誘導体は反応を示さなかったが、化合物
(13)のビオチン化ジアミノベンゼン誘導体を用いた場
合、３−ＤＧが１００ｐｇ／ｍｌ程度より測定可能であ
った。

【００８２】

【発明の効果】本発明により、合併症を伴う糖尿病の指
標となり得る１，２−ジカルボニル誘導体を測定し得る
抗体を提供し、該抗体を用いた測定法によって１，２−
ジカルボニル誘導体を簡便に測定できるようになった。

【図面の簡単な説明】

【図１】分画（Ａ）由来ＢＳＡ結合ピラジン誘導体を用
いた抗ピラジン誘導体モノクローナル抗体の特異性を示
す図である。

【図２】分画（Ｂ）由来ＢＳＡ結合ピラジン誘導体を用
いた抗ピラジン誘導体モノクローナル抗体の特異性を示
す図である。

【図３】抗ピラジン誘導体モノクローナル抗体によるビ
オチン結合ピラジン誘導体の測定結果を示す図である。

【図４】化合物(10)を用いた抗ピラジン誘導体モノクロ
ーナル抗体による３−デオキシグルコゾンの測定結果を
示す図である。

【図５】化合物(13)及び化合物(14)を用いた抗ピラジン
誘導体モノクローナル抗体による３−デオキシグルコゾ
ンの測定結果を示す図である。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【書類名】 受託番号変更届

【提出日】 平成１０年９月１４日

【あて先】 特許庁長官殿

【事件の表示】

【出願番号】 特願平１０−２４９１２２号

【手続をした者】

【事件との関係】 特許出願人

【識別番号】 ０００２３７２０４

【氏名又は名称】 富士レビオ株式会社

【代理人】

【識別番号】 １０００８８５４６

【弁理士】

【氏名又は名称】 谷川 英次郎

【旧寄託機関の名称】 通商産業省工業技術院生命工
学工業技術研究所

【旧受託番号】 ＦＥＲＭ Ｐ−１６１７９

【新寄託機関の名称】 通商産業省工業技術院生命工
学工業技術研究所

【新受託番号】 ＦＥＲＭ ＢＰ−６３４６

【提出物件の目録】

【物件名】 新受託番号を証明する書面
１

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 15/02 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記一般式（Ｉ）で示されるピラジン誘
   導体の少なくともＲ¹ 又はＲ² を包含する領域を認識す
   る抗体。 【化１】 （ただし、式中、Ｒ¹ 、Ｒ² は、互いに独立に、水素、
   メチル基、ヒドロキシメチル基、ヒドロキシエチル基、
   ジヒドロキシエチル基、ジヒドロキシプロピル基、トリ
   ヒドロキシプロピル基又はトリヒドロキシブチル基であ
   り、Ａはピラジン環と結合して５員又は６員の芳香族炭
   化水素基、芳香族複素環基又は脂環式炭化水素基を形成
   する基であり、Ｒ³ は架橋性残基であり、Ａにより形成
   される環は、上記Ｒ³ の他に、５員環の場合には１又は
   ２個、６員環の場合には１〜３個のさらなる置換基によ
   って置換されていてもよい）。
2. 【請求項２】 Ｒ¹ が水素でＲ² がトリヒドロキシブチ
   ル基、Ｒ¹ がメチル基でＲ² がトリヒドロキシプロピル
   基、又はＲ¹ がヒドロキシメチル基でＲ² がジヒドロキ
   シプロピル基である請求項１記載の抗体。
3. 【請求項３】 Ｒ¹ が水素、Ｒ² がメチル基である請求
   項１記載の抗体。
4. 【請求項４】 Ａにより形成される環はピリジン、ベン
   ゼン、フラン又はチオフェンである請求項１ないし３の
   いずれか１項に記載の抗体。
5. 【請求項５】 Ｒ³ は反応部分とスペーサー部分を有す
   る請求項１ないし４のいずれか１項に記載の抗体。
6. 【請求項６】 前記反応部分はカルボキシル基、水酸
   基、スルフヒドリル基、アミノ基、マレイミド基、アル
   デヒド基若しくはハロゲン原子又はこれらの誘導体であ
   って他の化合物と反応して共有結合を形成できるもので
   ある請求項５記載の抗体。
7. 【請求項７】 前記スペーサー部分は、脂肪族炭化水素
   基若しくは芳香族炭化水素基又はこれらが互いにエステ
   ル結合、アミド結合、エーテル結合、チオエーテル結
   合、ジスルフィド結合若しくはシッフ塩基結合により結
   合されたものである請求項５又は６記載の抗体。
8. 【請求項８】 Ｒ¹ 及びＲ² のいずれか一方が水素、他
   方が２，３，４−トリヒドロキシブチル基、Ａが形成す
   る環がベンゼンであり、Ｒ³ が４−カルボキサミドブタ
   ノイル−（２−メルカプト）エチルアミド基である請求
   項１記載の抗体。
9. 【請求項９】 モノクローナル抗体である請求項１ない
   し８のいずれか１項に記載の抗体。
10. 【請求項１０】 ＦＥＲＭ Ｐ−１６１７９の受託番号
    で寄託されたハイブリドーマが産生するモノクローナル
    抗体３ＤＧ−４５１である請求項８記載の抗体。
11. 【請求項１１】 下記一般式（Ｉ）で示されるピラジン
    誘導体又は該ピラジン誘導体のＲ³ に免疫原性担体が結
    合したものから成る免疫原。 【化１】 （ただし、式中、Ｒ¹ 、Ｒ² は、互いに独立に、水素、
    メチル基、ヒドロキシメチル基、ヒドロキシエチル基、
    ジヒドロキシエチル基、ジヒドロキシプロピル基、トリ
    ヒドロキシプロピル基又はトリヒドロキシブチル基であ
    り、Ａはピラジン環と結合して５員又は６員の芳香族炭
    化水素基、芳香族複素環基又は脂環式炭化水素基を形成
    する基であり、Ｒ³ は架橋性残基であり、Ａにより形成
    される環は、上記Ｒ³ の他に、５員環の場合には１又は
    ２個、６員環の場合には１〜３個のさらなる置換基によ
    って置換されていてもよい）。
12. 【請求項１２】 前記免疫原性担体がタンパク質である
    請求項１１記載の免疫原。
13. 【請求項１３】 生体内におけるタンパク質の糖化反応
    の中間体である１，２−ジカルボニル誘導体を免疫測定
    する方法であって、検体中の１，２−ジカルボニル誘導
    体を、一般式（II） 【化２】 （Ｒ³ 及びＡは、請求項１に記載される一般式（Ｉ）の
    場合と同義）で示されるジアミノ誘導体と反応させて請
    求項１に記載される一般式（Ｉ）で示されるピラジン誘
    導体を生成させ、該ピラジン誘導体と請求項１ないし１
    ０のいずれか１項に記載の抗体との抗原抗体反応を利用
    した免疫測定により該ピラジン誘導体を測定し、それに
    よって検体中の１，２−ジカルボニル誘導体を測定する
    ことから成る、１，２−ジカルボニル誘導体の免疫測定
    方法。
14. 【請求項１４】 上記ジアミノ誘導体のＲ³ が検出可能
    な標識により標識されており、前記免疫測定は、前記抗
    体を固相に結合させ、該固相結合抗体と前記ピラジン誘
    導体とを反応させ、洗浄後、固相に結合された標識量を
    測定することにより前記ピラジン誘導体を測定すること
    から成る、請求項１３記載の方法。
15. 【請求項１５】 前記標識はビオチンである請求項１４
    記載の方法。
16. 【請求項１６】 前記１，２−ジカルボニル誘導体は、
    デオキシグルコゾンである、請求項１３ないし１５のい
    ずれか１項に記載の方法。
17. 【請求項１７】 前記１，２−ジカルボニル誘導体は、
    メチルグリオキサールである、請求項１３ないし１５の
    いずれか１項に記載の方法。