JP2002145825A - ビスフェノールａ化合物、免疫学的反応体、ハイブリドーマ及びビスフェノールａの測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 本発明は、河川等の環境水中等におけるビス
フェノールＡの濃度の簡便、迅速な測定法に好適に使用
され得る新規ビスフェノールＡ化合物を提供することを
課題とする。 【解決手段】 本発明のビスフェノールＡ化合物は、一
般式 【化１】 ［式中、ｎは３〜９の整数を示す。］で表される。ま
た、本発明によれば、ビスフェノールＡ化合物と担体又
は標識物質との結合体、ビスフェノールＡ等に反応性を
有する免疫学的反応体等が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ビスフェノールＡ
化合物、免疫学的反応体、ハイブリドーマ及びビスフェ
ノールＡの測定方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ビスフェノールＡ、すなわち２，２’−
ビス（４’−オキシフェニル）プロパンは、式（２）

【０００３】

【化２】 で表される化学構造を有する化合物である。

【０００４】ビスフェノールＡは、ポリカーボネート及
びエポキシ樹脂の原料モノマーとして広く用いられてい
る。ビスフェノールＡは、内分泌攪乱作用を有し、いわ
ゆる環境ホルモン物質であると指摘されている。

【０００５】ビスフェノールＡは、工場廃水から、原料
として使用されたプラスチック製品から、又は産業廃棄
物置き場から、水環境中に流出し、環境汚染汚染が予想
されることから、そのモニタリングが重要な課題となっ
ている。

【０００６】従来、ビスフェノールＡを始めとする化学
物質の分析には、機器分析法が用いられ、例えば、水中
濃度のモニタリングの場合には、試料から分析すべき化
学物質を抽出・精製した後に、ガスクロマトグラフィー
を用いた測定が行われてきた。これらの方法は、精度の
点では問題はないものの、操作が煩雑で測定に時間がか
かるため、環境中のビスフェノールＡを、より迅速、簡
便かつ経済的にモニタリングすることのできる、新しい
測定法の開発が求められていた。

【０００７】一方、免疫学的測定法は、抗原抗体反応を
利用して抗原の測定を行うもので、測定精度が優れてい
るばかりでなく、迅速、簡便かつ経済的な測定法であ
る。従来、免疫学的測定法は、臨床診断の分野で患者の
病態の解析法の一つとして、大きな役割を担ってきた
が、環境中に残留する農薬等の物質の測定にも、次第に
適用されるようになってきた。しかし、ビスフェノール
Ａへの適用は、その必要性が高かったのにも拘わらず、
従来は全く行われておらず、適当な抗体はもとより、抗
体を調製するためのハプテンも得られていなかった。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】従来、ビスフェノール
Ａの測定に当たっては、主に、試料からビスフェノール
Ａを抽出し、精製後、ガスクロマトグラフィーや高速液
体クロマトグラフィーを用いて分析している。これらの
方法は、その感度や精度の点で優れているものの、試料
の調製が煩雑で多大の手間と時間を必要とし、分析に熟
練を要すること、並びに、測定装置や設備費等に高額な
費用を必要とする。特に環境中のビスフェノールＡの分
析では短時間の内に結果を出す必要があり、精度面以外
にも簡便性、迅速性、かつ経済性を備えた新しい測定法
が要望されている。

【０００９】そこで、本発明者らは、土壌や、河川等の
環境水中等におけるビスフェノールＡの濃度の簡便、迅
速な測定法として、ビスフェノールＡに対して反応性を
有する抗体を用いる免疫化学的検出法の適用を検討して
きた。その結果、下記一般式（１）で表されるビスフェ
ノールＡ化合物を合成し、これをハプテンとして用いて
得られるビスフェノールＡ化合物と担体との結合体が、
ビスフェノールＡに反応する免疫学的反応体の調製に適
していることを見い出した。また、このようにして調製
された免疫学的反応体、例えばモノクローナル抗体がビ
スフェノールＡと特異的に反応し、これらの免疫学的反
応体を用いる免疫学的測定法により、ビスフェノールＡ
を正確に測定することができることを見い出した。本発
明は、斯かる知見に基づき完成されたものである。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明によれば、一般式
（１）

【００１１】

【化３】 ［式中、ｎは３〜９の整数を示す。］で表されるビスフ
ェノールＡ化合物が提供される。

【００１２】また、本発明によれば、前記一般式（１）
で表されるビスフェノールＡ化合物と担体又は標識物質
との結合体が提供される。

【００１３】また、本発明によれば、ビスフェノールＡ
及び前記一般式（１）で表されるビスフェノールＡ化合
物に反応性を示す免疫学的反応体、例えばモノクローナ
ル抗体が提供される。

【００１４】また、本発明によれば、ビスフェノールＡ
及び前記一般式（１）で表されるビスフェノールＡ化合
物に反応性を示す免疫学的反応体、例えばモノクローナ
ル抗体を産生するハイブリドーマが提供される。

【００１５】また、本発明によれば、前記免疫学的反応
体を用いることを特徴とするビスフェノールＡの免疫学
的測定方法が提供される。

【００１６】本発明方法によれば、ビスフェノールＡ分
析の大幅な簡略化と測定時間の短縮が可能となり、多数
の検体を迅速、簡便かつ経済的に測定できるようになっ
た。

【００１７】

【発明の実施の形態】以下、本発明のビスフェノールＡ
化合物及びその合成方法、ビスフェノールＡ化合物と担
体又は標識物質との結合体及びその調製方法、ポリクロ
ーナル抗体の調製方法、モノクローナル抗体を産生する
ハイブリドーマの分離及びハイブリドーマの産生するモ
ノクローナル抗体の調製方法、これらの抗体フラグメン
トの調製方法、そして免疫学的分析測定の順に説明す
る。

【００１８】本発明の一般式（１）で表されるビスフェ
ノールＡ化合物は、文献未記載の新規化合物である。一
般式（１）において、ｎは３〜９の整数、好ましくは３
〜５の整数である。

【００１９】一般式（１）で表される本発明化合物は、
公知の方法に従って製造することができる。例えば、一
般式（１）で表される本発明化合物は、下記反応式に示
す方法に従い、製造される。

【００２０】

【化４】 ［式中、Ｒはカルボキシル保護基を示す。Ｘはハロゲン
原子を示す。ｎは前記に同じ。］ 即ち、一般式（１）で表される本発明化合物は、式
（２）で表されるビスフェノールＡ（２，２’−ビス
（４’−オキシフェニル）プロパン）と一般式（３）で
表されるハロゲン化物とを反応させて、一般式（４）で
表されるビスフェノールＡ化合物に導き、次いでこの化
合物（４）からカルボキシル保護基を除去することによ
って、一般式（１）で表される本発明化合物が製造され
る。

【００２１】前記一般式（３）において、カルボキシル
保護基としては従来公知のものでよく、特に限定される
ものではないが、例えばメチル基、エチル基、ｔｅｒｔ
−ブチル基、ベンジル基、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシ
リル基、トリメチルシリル基等を例示できる。

【００２２】式（２）で表されるビスフェノールＡと一
般式（３）で表されるハロゲン化物との反応は、当該分
野で利用可能な公知の方法を適宜利用することができ、
斯くして一般式（４）で表されるビスフェノールＡ化合
物に容易に導くことができる。

【００２３】例えば、ジメチルホルムアミド等の不活性
溶媒中で水素化ナトリウム等の塩基の存在下、式（２）
で表されるビスフェノールＡと一般式（３）で表される
ハロゲン化物とを、室温で反応させることにより、一般
式（４）で表されるビスフェノールＡ化合物が容易に製
造できる。

【００２４】カルボキシル保護基Ｒの除去方法として
は、例えばアルカリもしくは酸の存在下で一般式（４）
の化合物を加水分解する方法等が挙げられる。ここで塩
基性触媒としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム
等のアルカリ金属水酸化物、カリウム ｔｅｒｔ−ブト
キシド等の有機金属塩基等を例示できる。また、酸性触
媒としては、塩酸、硫酸等の鉱酸、酢酸、トリフルオロ
酢酸等のカルボン酸、ｐ−トルエンスルホン酸等のスル
ホン酸等を例示できる。この反応において使用される溶
媒としては、例えばメタノール、エタノール等のアルコ
ール類、テトラヒドロフラン、ジオキサン等のエーテル
類、ジメチルスルホキシド等のスルホキシド類、ベンゼ
ン、トルエン等の芳香族炭化水素類、１，２−ジクロロ
エタン等のハロゲン化炭化水素類、水又はこれらの混合
溶媒等が挙げられる。該反応は通常０℃からその使用す
る溶媒の沸点温度までの温度範囲で、好ましくは室温温
度で進行し、一般に０．５〜２４時間程度で完結する。

【００２５】また、カルボキシル保護基Ｒがベンジル基
である場合、その除去は加水素分解によっても行うこと
ができる。

【００２６】斯くして本発明のビスフェノールＡ化合物
が製造される。

【００２７】上記各反応で得られる目的化合物は、各々
通常の分離手段により反応系内より分離され、更に精製
することができる。この分離及び精製手段としては、例
えば蒸留法、再結晶法、カラムクロマトグラフィー、イ
オン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフ
ィー、親和クロマトグラフィー、プレパラティブ薄層ク
ロマトグラフィー、溶媒抽出法等を採用できる。

【００２８】前記反応において中間原料として用いられ
る一般式（３）のハロゲン化物は、商業的に入手可能な
アミノ酸を公知の方法に従って反応することにより容易
に製造することができる。

【００２９】また、式（２）で表されるビスフェノール
Ａは、商業的に容易に入手可能な化合物である。

【００３０】前記一般式（１）で表されるビスフェノー
ルＡ化合物は、ビスフェノールＡと特異的に反応する免
疫学的反応体（例えば、抗体、より具体的にはポリクロ
ーナル抗体もしくはモノクローナル抗体、又はビスフェ
ノールＡと結合可能な部位を含むそれらのフラグメン
ト、あるいは抗血清等）の調製においてハプテンとして
用いることができ、更に各種の免疫学的測定方法の開発
に必要な標識抗原の調製に用いることができる。ここで
「ハプテン」とは、抗体との結合能を有しているもの
の、それ単独では免疫原性を有さず、担体と結合するこ
とによって免疫原性を発現する物質を意味する。従っ
て、一般にハプテンは、担体と結合するための官能基を
有する。

【００３１】前記一般式（１）で表される本発明のビス
フェノールＡ化合物と担体又は標識物質との結合体の調
製、抗血清及びポリクローナル抗体の調製、モノクロー
ナル抗体を産生するハイブリドーマの分離及びハイブリ
ドーマが産生するモノクローナル抗体の調製の方法は、
いずれも常法、例えば、続生化学実験講座（日本生化学
会編）又は免疫生化学研究法（日本生化学会編）に記載
の方法で行うことができる。

【００３２】前記一般式（１）で表されるビスフェノー
ルＡ化合物との結合体を調製する際には、従来から、一
般に用いられている公知の担体を用いることができる。
ここで、担体とは、ハプテンと結合（コンジュゲート
化）してハプテンに免疫原性を付与する物質を意味す
る。担体としては、例えば生体高分子化合物、例えば、
分子量が約１万以上、好ましくは約４万〜１００万のタ
ンパク質（例えば、血清アルブミン、免疫グロブリン、
オボアルブミン、ポリリジン、キーホールリンペットヘ
モシアニン等）、又は多糖類（例えばデキストラン、ア
ミロース、アミロペクチン等）、あるいは細胞（例え
ば、哺乳類の赤血球、ＢＣＧ菌等）等を挙げることがで
きる。

【００３３】一方、前記一般式（１）で表されるビスフ
ェノールＡ化合物は、前記担体と結合することのできる
官能基を有している。この官能基は、前記担体と結合す
ることのできるものであればよく、用いる担体に応じて
適宜選択することができる。

【００３４】例えば、担体として高分子化合物であるタ
ンパク質を用いる場合は、そのアミノ基と結合すること
のできる官能基として、例えばカルボキシル基、アルデ
ヒド基、アミノ基、エポキシ基等を、またタンパク質の
チオール基と結合することのできる官能基として、例え
ばチオール基、マレイミド基等を挙げることができる。
また多糖類の場合には、水酸基と結合することのできる
官能基として、例えばカルボキシル基、アルデヒド基、
エポキシ基等を挙げることができる。

【００３５】本発明のビスフェノールＡ化合物と担体と
の結合は、従来公知の方法を用いて行うことができる。
例えば、担体として高分子化合物であるタンパク質を用
いる場合には、混合酸無水物法、活性エステル法、カル
ボジイミド法等の従来公知の結合方法によって本発明ビ
スフェノールＡ化合物とタンパク質との結合体を調製す
ることができる。

【００３６】また、本発明においては、前記一般式
（１）で表されるビスフェノールＡ化合物を標識物質と
結合させることができる。標識物質としては、公知の標
識を用いることができ、例えば、酵素（例えば、ペルオ
キシダーゼ、アルカリホスファターゼ等）、発光物質
（例えば、ルミノール、アクリジニウム誘導体等）、蛍
光物質（例えば、フルオレセイン、ユーロピウムキレー
ト等）を挙げることができる。斯かる標識物質は、上記
と同様の操作によって本発明のビスフェノールＡ化合物
と結合させることができる。得られた結合体は、測定対
象となるビスフェノールＡとの競合反応に用いることが
できる。

【００３７】本発明の免疫学的反応体は、例えば次のよ
うにして調製される。

【００３８】例えば、本発明による抗血清又はポリクロ
ーナル抗体の調製には、前記一般式（１）で表されるビ
スフェノールＡ化合物と担体との結合体を免疫原に用い
ることができる。免疫は、哺乳動物や鳥類（例えば、マ
ウス、ウサギ、又は鶏等）ヘ、通常の方法、例えば、免
疫原溶液を等量のフロイントの完全アジュバント又は不
完全アジュバントと乳化混合したものを接種（初回免
疫）し、以後２〜４週間の間隔で数回免疫することによ
って行うことができる。その後、免疫した動物から血液
を採取し、ポリクローナル抗体を含む抗血清を調製す
る。その後、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィー又
はプロテインＧアフィニティークロマトグラフィー等に
より、抗血清からポリクローナル抗体を精製することが
できる。

【００３９】また、前記一般式（１）で表されるビスフ
ェノールＡ化合物と担体との結合体を免疫原に用い、本
発明によるモノクローナル抗体を産生するハイブリドー
マを分離することができる。

【００４０】例えば、最終免疫して数日後の動物（例え
ば、マウス）から脾臓を無菌的に取り出し、ステンレス
スチールメッシュ等で押しつぶして脾臓細胞を調製し、
細胞融合工程に用いる。細胞融合の他の一方の親細胞で
あるミエローマ細胞（骨髄腫細胞）は、各種の公知の細
胞株、例えば、Ｐ３・ＮＳ−１／１・Ａｇ４．１［Ｅｕ
ｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，５；５１１−５１７（１９
７５）］、ＳＰ２／０−Ａｇ１４［Ｎａｔｕｒｅ，２７
６；２６９−２７０（１９７８）］、Ｐ３−Ｘ６３−Ａ
ｇ８．６５３［Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２３；１５４
８−１５５０（１９７９）］等を使用することができ
る。

【００４１】細胞融合は、通常の方法、例えば、公知の
融合促進剤を含む培地［例えば、市販の細胞融合用ポリ
エチレングリコール（分子量１５００；ベーリンガーマ
ンハイム社製）］中で、脾臓細胞とミエローマ細胞とを
よく混合することによって行うことができ、細胞の混合
比率も常法に従って、例えば、マウスの脾臓細胞に対し
てミエローマ細胞を約１／５〜１／１０程度の割合で行
うことができる。融合後、選択用培地（例えば、ＨＡＴ
培地）を用いて、ハイブリドーマのみを増殖させる。そ
れらの内、培養上清中に目的のモノクローナル抗体を分
泌しているハイブリドーマは、例えば、培養上清のビス
フェノールＡとの反応性を酵素結合免疫測定法（ＥＬＩ
ＳＡ）でスクリーニングすることによって確認し、選択
することができる。また、これらのハイブリドーマは、
通常、細胞クローニング法、例えば、限界希釈法を用い
て分離でき、公知の培地で継代培養し、液体窒素中で容
易に長期間保存することができる。

【００４２】また、ハイブリドーマ（モノクローナル抗
体産生細胞）の産生するモノクローナル抗体は、これを
培養することにより、容易に調製することができる。特
に、イン・ビトロの培養では、例えば、５％二酸化炭素
及び３７℃条件下で培養に適した任意の培地を用いて培
養することができ、好適にはダルベコ培地に１０％ウシ
胎児血清（以下「ＦＢＳ」と略す）を含む培地（以下、
「ダルベコ／１０％ＦＢＳ培地」と略す）を用いること
ができる。またイン・ビボの培養では、用いたミエロー
マと同種の動物、例えば、マウスの腹腔中で培養するの
が好ましい。これらの培養上清又は腹水を各々モノクロ
ーナル抗体溶液として用いることができる。

【００４３】また、抗血清や培養上清、あるいは腹水を
出発材料として、抗体を精製することもできる。抗体の
精製には、タンパク質の精製に一般的な方法、例えば硫
安塩析、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロ
マトグラフィー、プロテインＡもしくはプロテインＧ結
合ポリマー等を用いるアフィニティークロマトグラフィ
ー、又は透析等の方法を適宜組み合わせて用いることが
できる。

【００４４】本発明のビスフェノールＡの免疫学的測定
方法によれば、前記の免疫学的反応体（ポリクローナル
抗体又はモノクローナル抗体、あるいは抗血清）を用い
て実施するので、ビスフェノールＡを正確に分析するこ
とができる。すなわち、本発明の免疫学的測定方法によ
って、ビスフェノールＡの存在の検出、半定量的測定又
は定量的測定を行うことができる。本発明による免疫学
的測定方法は、ビスフェノールＡに特異的に反応する免
疫学的反応体を用いることを除けば、それ以外の点では
従来公知の免疫学的測定方法、例えば、酵素免疫測定方
法、蛍光免疫測定方法又は放射性免疫測定方法等を適用
することができる。

【００４５】本発明方法に従えば、環境水中等に存在し
ている可能性のあるビスフェノールＡを測定することが
できる。被検試料は、ビスフェノールＡを含有する試料
である限り特に限定されるものではない。

【００４６】本発明による免疫学的測定方法を、例え
ば、通常抗原標識法と呼ばれる方法、すなわち、上記抗
体もしくは抗体フラグメントを固相化した後、ビスフェ
ノールＡ化合物と標識物質との結合体である標識化ビス
フェノールＡ化合物（標準品）と、試料中の検査対象化
合物ビスフェノールＡとを競合阻害反応させる方法等に
適用することができる。ここでは、本発明による免疫学
的測定方法の内、抗原標識法について以下に説明する。

【００４７】本発明方法は、例えば、 （１）ビスフェノールＡと特異的に反応する免疫学的反
応体、特に抗体もしくは抗体フラグメントを固相化する
（以下、「固相化抗体」と略す）工程； （２）被検試料が水性試料の場合には、その被検試料を
濾紙等で濾過し、また被検試料が土壌等の場合には、被
検試料中に含まれていることのあるビスフェノールＡを
抽出することのできる有機溶媒で被検試料を抽出処理
し、検体を調製する工程； （３）前記固相化抗体と検体と標識化ビスフェノールＡ
化合物とを接触させ、反応させる工程； （４）固相化抗体に結合した標識化ビスフェノールＡ化
合物と、結合していない標識化ビスフェノールＡ化合物
とを分離する工程； （５）前記工程（４）で分離した、いずれか一方、好ま
しくは固相化抗体と結合した標識化ビスフェノールＡ化
合物に由来する信号を測定する工程からなる。

【００４８】本発明方法を実施する場合には、前記のよ
うに、標識化ビスフェノールＡ化合物を用いてビスフェ
ノールＡの確認又は定量を行うことができる。ビスフェ
ノールＡ化合物の標識には、公知の標識物、例えば、放
射性同位体（例えば、：³²Ｐ、³⁵Ｓ、³Ｈ等）、酵素
（例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファター
ゼ等）、ビタミン（例えば、ビオチン等）、蛍光物質
（例えば、ＦＩＴＣ等）、又は化学発光物質（例えば、
アクリジニウム等）等を用いることができる。

【００４９】また、本発明方法では、固相化抗体と標識
化ビスフェノールＡ化合物との反応が終了した後で、固
相化抗体に結合しなかった標識化ビスフェノールＡ化合
物を分離する。分離は、例えば、濾過、遠心処理又は緩
衝液による洗浄によって行うことができる。

【００５０】分離後、例えば固相化抗体と結合した標識
化ビスフェノールＡ化合物からの信号を測定することが
できる。信号を測定する際には、反応系を信号測定に適
した条件に変えるのが好ましい。例えば、標識物とし
て、蛍光又は化学発光物質を用いた場合には、消光が起
こらない条件で信号を検出する。前記の免疫学的測定法
においては、適当な対照液（例えば、固相化抗体とビス
フェノールＡ化合物との結合体）をコントロールとして
使用することができる。

【００５１】

【実施例】以下、実施例を掲げて本発明を具体的に説明
するが、これらは本発明の範囲を限定するものではな
い。

【００５２】実施例１ ４−｛４−［１−（４−ヒドロキシフェニル）−１−メ
チルエチル］フェノキシ｝酪酸の合成 ビスフェノールＡ（２）（４．６ｇ、２０ミリモル）を
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）５０ｍｌに溶
解して、０．８ｇ（２０ミリモル）の水素化ナトリウム
（油性、６０％）を加えた。室温で３０分撹拌後、２．
７２ｇ（２０ミリモル）の４−クロロ酪酸メチル（３）
のジメチルホルムアミド溶液２０ｍｌを滴下した。室温
で５時間撹拌後、反応液をジエチルエーテル／水で分配
抽出し、ジエチルエーテル層を無水硫酸マグネシウムで
脱水、濾過、濃縮して得られた残渣をシリカゲルカラム
クロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝４：
１〜１：１）粗精製した。

【００５３】上記で得られた４−｛４−［１−（４−ヒ
ドロキシフェニル）−１−メチルエチル］フェノキシ｝
酪酸メチル（４）の粗精製物をエタノール／水（１０／
１）の混合溶液１００ｍｌに溶解して、１０ｇの水酸化
ナトリウムを添加後、５時間撹拌した。氷冷しながら塩
酸でｐＨを２に調整し、濃縮後に酢酸エチル／水で分配
抽出した。酢酸エチル層を無水硫酸マグネシウムで脱
水、濾過、濃縮して得られた残渣をシリカゲルカラムク
ロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝４：１
〜２：１）で精製することにより、白色結晶として０．
７４ｇ（通算収率１２％）の標題の目的物４−｛４−
［１−（４−ヒドロキシフェニル）−１−メチルエチ
ル］フェノキシ｝酪酸を得た。

【００５４】実施例２ビスフェノールＡ化合物と担体タンパク質との結合体の
調製 免疫原としてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と本発明の
ビスフェノールＡ化合物（ハプテン）の結合体を混合酸
無水物法を用いて作製した。

【００５５】上記実施例１で製造した４−｛４−［１−
（４−ヒドロキシフェニル）−１−メチルエチル］フェ
ノキシ｝酪酸の７．８５ｍｇを１ｍｌの無水ジオキサン
に溶解し、０．０２５μｌのＮ−メチルモルホリンを加
えて１０℃で２０分間撹拌し、更に０．０１μｌのクロ
ロ蟻酸イソブチルを少しづつ添加し２０分間撹拌して、
４−｛４−［１−（４−ヒドロキシフェニル）−１−メ
チルエチル］フェノキシ｝酪酸の混合酸無水物を調製し
た。一方、１６．８ｍｇのＢＳＡを１ｍｌの蒸留水に溶
解したのち、１ＮのＮａＯＨでＰＨ９．５に調整し、さ
らに１０℃でジオキサン１．３ｍｌを滴下した。このＢ
ＳＡ溶液に、１ＮのＮａＯＨ溶液でｐＨ９に保ちながら
先に調製した４−｛４−［１−（４−ヒドロキシフェニ
ル）−１−メチルエチル］フェノキシ｝酪酸の混合酸無
水物溶液を徐々に滴下し、４℃で４時間撹拌した。反応
終了後、４℃で一晩蒸留水に対して透析した後、凍結乾
燥してフリーザー内に貯蔵した。こうして得られたビス
フェノールＡ化合物とＢＳＡとの結合体を免疫原として
使用した。

【００５６】また、コーティング抗原として用いるため
に、４−｛４−［１−（４−ヒドロキシフェニル）−１
−メチルエチル］フェノキシ｝酪酸とウサギ血清アルブ
ミン（ＲＳＡ）との結合体も同様の方法で調製した。

【００５７】実施例３モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの作成と抗体の
作製 実施例２で調製した免疫原を２ｍｇ／ｍｌになるように
生理的リン酸緩衝液に溶解し、アジュバントと等量混合
した後、Ｂａｌｂ／ｃマウスに１００μｌをマウス腹腔
内に投与した。その後、２週間毎に追加免疫した。尾血
管から採取した血液の血清中の抗体力価が高くなったマ
ウスの脾臓を摘出し、ＤＭＥＭ培地（ダルベコ改変イー
グル培地）を入れたシャーレ内で摘出した脾臓をハサミ
で傷をつけ、注射筒で培地を脾臓内に注入して細胞を追
い出した。培地を遠沈管に移し、大きな組織片を沈降さ
せるために５分間静置した。脾臓細胞が浮遊している上
清を静かに取り、単細胞の懸濁液を３００×ｇ、５分間
遠心して細胞を集め、脾臓細胞を調製した。マウスのミ
エローマ細胞（Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３）を細胞数の
比で５：１（ミエローマ細胞：脾臓細胞）になるように
混合し、３００×ｇ、５分間遠心して細胞を集めた。上
清を除去し、遠心管をはじいて沈殿細胞をほぐした後、
３７℃に暖めておいた５０％ポリエチレングリコール
（分子量１，５００）溶液１ｍｌを６０秒かけてゆっく
り加え細胞融合を行った。ＤＭＥＭ培地９ｍｌを加えた
後、含牛胎児血清ＤＭＥＭ培地４０ｍｌを添加した。遠
心によって集められた細胞を細胞数が５×１０⁵個／ｍ
ｌになるようにＨＡＴ培地を加えた。細胞懸濁液を９６
穴プラスチックプレートに２５０μｌ／ウェルの量を分
注して、３７℃にて５％二酸化炭素の気相中でインキュ
べーションした。１週間後、ウェル中の培地の半量をＨ
ＡＴ培地で置換して、１０日から１４日間培養した。培
養液中の抗体の活性をＥＬＩＳＡ法で調べ、目的とする
抗体を産生しているウェルの細胞について、９６穴のプ
ラスチックプレートで、ＨＡＴ培地を用い、限界希釈法
によりハイブリドーマのクローニングを行った。クロー
ニングした結果、最終的に抗ビスフェノールＡ抗体を産
生している安定なハイブリドーマ５株を得た。これらの
株をそれぞれＢＢＡ−２１８７、ＢＢＡ−２６１７、Ｂ
ＢＥ−４２８０、ＢＫＥ−３４３０及びＢＫＥ−４２６
５と名付け、このハイブリドーマ株をＤＭＥＭに１０％
牛胎児血清を含む培地で培養した。培養液の遠心上清を
モノクローナル抗体溶液とし、それぞれ「モノクローナ
ル抗体ＢＢＡ−２１８７」（以下単に「抗体ＢＢＡ−２
１８７」という）、「モノクローナル抗体ＢＢＡ−２６
１７」（以下単に「抗体ＢＢＡ−２６１７」という）、
「モノクローナル抗体ＢＢＥ−４２８０」（以下単に
「抗体ＢＢＥ−４２８０」という）、「モノクローナル
抗体ＢＫＥ−３４３０」（以下単に「抗体ＢＫＥ−３４
３０」という）及び「モノクローナル抗体ＢＫＥ−４２
６５」（以下単に「抗体ＫＥ−４２６５」という）とし
た。調製したモノクローナル抗体溶液はＰＢＳで希釈し
て抗原固相化し、競合間接ＥＬＩＳＡ法によりビスフェ
ノールＡの反応性を調べた。

【００５８】以下にモノクローナル抗体とビスフェノー
ルＡとの反応性の測定例を示す。

【００５９】実施例４ｏ−フェニレンジアミン発色溶液を用いたＥＬＩＳＡ
（標準ＥＬＩＳＡ）によるビスフェノールＡの測定 １）９６穴マイクロプレートにビスフェノールＡとＲＳ
Ａとの結合体（１００ｎｇ／ｍｌ）を１００μｌ／ウェ
ルの量を加えて４℃で一晩インキュベーションしてプレ
ートに吸着させた。洗浄緩衝液で５回洗浄後、３％スキ
ムミルク溶液又は４倍希釈のブロックエース（Ｂｌｏｃ
ｋ−Ａｃｅ、大日本製薬（株）製）溶液の２５０μｌ／
ウェル量を加え、２５℃で１時間インキュベーションし
た後、プレートを洗浄した。２）モノクローナル抗体を
ＰＢＳで１，５００倍に希釈した溶液とビスフェノール
Ａ溶液の各々５０μｌをウェルに加え、１時間インキュ
ベーションした後、プレートを洗浄した。３）西洋ワサ
ビペルオキシダーゼを結合した抗マウスＩｇＧヤギ抗体
（第二抗体）をＰＢＳで３，０００倍に希釈し、１００
μｌ／ウェルを加え、２５℃で１時間インキュベーショ
ンした後、プレートを洗浄した。４）０．２％のｏ−フ
ェニレンジアミン発色溶液（１００ｍＭリン酸クエン酸
緩衝液（ＰＨ５．０）、０．００３％過酸化水素水）の
２００μｌ／ウェルを加え、２５℃で１０分間インキュ
ベーションした後、４Ｎ硫酸５０μｌ／ウェルを加えて
酵素反応を止め、４９２ｎｍ及び６３０ｎｍの吸光度を
マイクロプレートリーダーで測定した。

【００６０】抗ビスフェノールＡ抗体を用いた場合のＥ
ＬＩＳＡ法によるビスフェノールＡとＲＳＡとの結合体
の濃度は１００μｇ／ｍｌを用い、抗体の２，０００倍
希釈溶液とメタノールに溶解したビスフェノールＡ標準
ストック溶液を０．１ｎｇ／ｍｌから５００ｎｇ／ｍｌ
の濃度になるようにＰＢＳで段階的に希釈した溶液をウ
ェルに加え、第二抗体を３，０００倍に希釈したものを
用いることにより作成したビスフェノールＡの標準阻害
曲線を図１に示す。阻害率は次式より算出して示した。

【００６１】阻害率（％）＝（標準試料の吸光度／コン
トロールの吸光度）×１００ 測定の結果、抗体ＢＢＡ−２１８７を用いたＥＬＩＳＡ
によるビスフェノールＡの測定可能範囲は０．１〜１ｎ
ｇ／ｍｌであり、５０％阻害を示す値（ＩＣ₅₀値）は
０．２４ｎｇ／ｍｌであった。

【００６２】実施例５ルミノール発色溶液を用いたＬＣ−ＥＬＩＳＡによるビ
スフェノールＡの測定 １）９６穴マイクロプレート（黒色プレート）にビスフ
ェノールＡとＲＳＡとの結合体（１００ｎｇ／ｍｌ）を
１００μｌ／ウェルの量を加えて４℃で一晩インキュベ
ーションしてプレートに吸着させた。洗浄緩衝液で５回
洗浄後、４倍希釈のブロックエース（Ｂｌｏｃｋ−Ａｃ
ｅ、大日本製薬（株）製）溶液の２５０μｌ／ウェル量
を加え、２５℃で１時間インキュベーションした後、プ
レートを洗浄した。 ２）モノクローナル抗体をＰＢＳで３，０００倍に希釈
した溶液とビスフェノールＡ溶液の各々５０μｌをウェ
ルに加え、１時間インキュベーションした後、プレート
を洗浄した。 ３）西洋ワサビペルオキシダーゼを結合した抗マウスＩ
ｇＧヤギ抗体（第二抗体）をＰＢＳで４，０００倍に希
釈し、１００μｌ／ウェルを加え、２５℃で１時間イン
キュベーションした後、プレートを洗浄した。 ４）ルミノール発色溶液ＥＬＩＳＡ基質ＰＯＤ（ベーリ
ンガマンハイム社製）の１００μｌ／ウェルを加え、２
５℃で１０分間インキュベーションした後、化学蛍光リ
ーダー（アトー社：ルミネッセンサーＪＮＲ，ＡＢ−２
１００）で測定した。

【００６３】抗ビスフェノールＡ抗体を用いた場合のＬ
Ｃ−ＥＬＩＳＡ法によるコーティング抗原の濃度は１０
０μｇ／ｍｌを用い、抗体の３，０００倍希釈溶液とメ
タノールに溶解したビスフェノールＡ標準ストック溶液
を０．１ｎｇ／ｍｌから３，０００ｎｇ／ｍｌの濃度に
なるようにＰＢＳで段階的に希釈した溶液をウェルに加
え、第二抗体を４，０００倍に希釈したものを用いるこ
とにより作成したビスフェノールＡの標準阻害曲線を図
２に示す。

【００６４】抗体ＢＢＡ−２１８７を用いたＬＣ−ＥＬ
ＩＳＡによるビスフェノールＡの測定可能範囲は０．０
５３〜１ｎｇ／ｍｌ（６４〜１０００ｐｐｔ）であり、
５０％阻害を示す値（ＩＣ₅₀値）は０．２３ｎｇ／ｍｌ
であった。ＬＣ−ＥＬＩＳＡによる測定法の感度及び測
定可能範囲は、実施例４の標準ＥＬＩＳＡによる測定法
の感度及び測定可能範囲と同程度であった。

【００６５】実施例６アビジン−ビオチン複合体を用いたＡＢＣ−ＥＬＩＳＡ
によるビスフェノールＡの測定 １）９６穴マイクロプレート（白色プレート）にビスフ
ェノールＡとＲＳＡとの結合体（１００ｎｇ／ｍｌ）を
１００μｌ／ウェルの量を加えて４℃で一晩インキュベ
ーションしてプレートに吸着させた。洗浄緩衝液で５回
洗浄後、４倍希釈のブロックエース（Ｂｌｏｃｋ−Ａｃ
ｅ、大日本製薬（株）製）溶液の２５０μｌ／ウェル量
を加え、２５℃で１時間インキュベーションした後、プ
レートを洗浄した。 ２）モノクローナル抗体をＰＢＳで３，０００倍に希釈
した溶液とビスフェノールＡ溶液の各々５０μｌをウェ
ルに加え、１時間インキュベーションした後、プレート
を洗浄した。 ３）ビオチン化抗マウスＩｇＧヤギ抗体（第二抗体）を
１００μｌ／ウェルを加え、２５℃で１時間インキュベ
ーションした後、プレートを洗浄した。 ４）イムノ ピュア ウルトラ−センシティブ ＡＢＣ
ペルオキシダーゼ ステイニング キット（Immuno P
ure Ultra-Sensitive ABC Peroxidase StainingKit）
（ピアス社製）を２，０００倍希釈したビオチン結合ペ
ルオキシダーゼ溶液の１００μｌ／ウェルを加え、２５
℃で１時間インキュベーションした後、プレートを洗浄
した。 ５）実施例４で使用した０．２％のｏ−フェニレンジア
ミン発色溶液（１００ｍＭリン酸クエン酸緩衝液（ＰＨ
５．０）、０．００３％過酸化水素水）の２００μｌ／
ウェルを加え、２５℃で１０分間インキュベーションし
た後、４Ｎ硫酸５０μｌ／ウェルを加えて酵素反応を止
め、４９２ｎｍ及び６３０ｎｍの吸光度をマイクロプレ
ートリーダーで測定した。

【００６６】抗ビスフェノールＡ抗体を用いた場合のＡ
ＢＣ−ＥＬＩＳＡ法によるコーティング抗原の濃度は１
００μｇ／ｍｌを用い、抗体の３，０００倍希釈溶液と
メタノールに溶解したビスフェノールＡ標準ストック溶
液を０．１ｎｇ／ｍｌから３，０００ｎｇ／ｍｌの濃度
になるようにＰＢＳで段階的に希釈した溶液をウェルに
加え、第二抗体を２，０００倍に希釈したものを用いる
ことにより作成したビスフェノールＡの標準阻害曲線を
図３に示す。

【００６７】抗体ＢＢＡ−２１８７を用いたＡＢＣ−Ｅ
ＬＩＳＡによるビスフェノールＡの測定可能範囲は０．
０５７〜１ｎｇ／ｍｌ（６４〜１０００ｐｐｔ）であ
り、５０％阻害を示す値（ＩＣ₅₀値）は０．２４ｎｇ／
ｍｌであった。ＡＢＣ−ＥＬＩＳＡによる測定法の感度
及び測定可能範囲は、実施例４の標準ＥＬＩＳＡによる
測定法の感度及び測定可能範囲並びに実施例５のＬＣ−
ＥＬＩＳＡによる測定法の感度及び測定可能範囲と同程
度であった。

【００６８】実施例７抗体のビスフェノールＡ構造類似化合物に対する交差反
応性 ビスフェノールＡと化学構造が類似している化合物につ
いて抗体ＢＢＡ−２１８７の交差反応性を調べた。交差
反応性は試験化合物のＩＣ₅₀値を求め、次式より計算し
た。

【００６９】交差反応率(%)＝(ビスフェノールＡのＩＣ
₅₀値／試験化合物のＩＣ₅₀値)×100 上記式を用いて交差反応率を算出した結果を表１に示
す。

【００７０】

【表１】 表１から次のことが判る。すなわち、抗体ＢＢＡ−２１
８７は、試験した化合物のビスフェノールＥ及びビスフ
ェノールＦと僅かに反応したが、他の化合物とは殆ど反
応しなかった。この結果より、本抗体は、ビスフェノー
ルＡに対して特異性の高い結合様式を示した。

【００７１】以上の結果から、次のことが明らかになっ
た。ビスフェノールＡと担体蛋白質との結合体をマウス
に免疫して得られた脾臓細胞とミエローマ細胞を融合す
ることにより、ビスフェノールＡと結合する抗体を産生
する融合細胞を選抜した。この細胞を培養した培養上清
を抗体として用い、ビスフェノールＡを測定するための
ＥＬＩＳＡ法の最適条件を決定した。このＥＬＩＳＡ法
によって河川水中の低濃度のビスフェノールＡをモニタ
リングするに当たっては、本ＥＬＩＳＡ法による簡便、
迅速な方法が適していることが判明した。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、標準ＥＬＩＳＡ法によるビスフェノー
ルＡの標準曲線である。

【図２】図２は、ＬＣ−ＥＬＩＳＡ法によるビスフェノ
ールＡの標準曲線である。

【図３】図２は、ＡＢＣ−ＥＬＩＳＡ法によるビスフェ
ノールＡの標準曲線である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/00 Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｂ 33/53 Ｃ１２Ｒ 1:91） 33/577 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 5/10 15/00 Ｃ Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 森宗 孝介 徳島県鳴門市里浦町里浦字花面615番地 大塚化学株式会社鳴門研究所内 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA53 GA03 GA18 HA15 4B064 AG27 CA10 CA20 CC01 CC24 DA13 4B065 AA91X AB05 AC14 AC15 BA08 BA24 BB01 BC03 BC07 BD15 BD50 CA25 CA46 4H006 AA01 AA03 AB80 AB99 BJ50 BN30 BP30 BS10 4H045 AA11 AA20 AA30 DA76 EA50 FA72 GA15

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 一般式（１） 【化１】 ［式中、ｎは３〜９の整数を示す。］で表されるビスフ
   ェノールＡ化合物。
2. 【請求項２】 請求項１に記載のビスフェノールＡ化合
   物と担体又は標識物質との結合体。
3. 【請求項３】 ビスフェノールＡ及び請求項１に記載の
   ビスフェノールＡ化合物に反応性を示す免疫学的反応
   体。
4. 【請求項４】 免疫学的反応体がモノクローナル抗体で
   ある請求項３に記載の免疫学的反応体。
5. 【請求項５】 請求項３に記載の免疫学的反応体を産生
   するハイブリドーマ。
6. 【請求項６】 請求項３又は請求項４に記載の免疫学的
   反応体を用いることを特徴とするビスフェノールＡの免
   疫学的測定方法。