JPH11343300A - 新規ハプテン、それを認識する抗体およびそれらを用いた免疫学的測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【解決手段】 新規２−アミノ−２−（アリールアルキ
ル）−１，３−ジオール基含有化合物、それをハプテン
基として含む免疫原性を有する複合体、２−アミノ−２
−（アリールアルキル）−１，３−ジオール基に親和性
を示す抗体、該抗体を用いる２−アミノ−２−（アリー
ルアルキル）−１，３−ジオール基含有化合物、特にＦ
ＴＹ７２０物質の測定方法およびそのためのキット。 【効果】 本発明によれば、検体中のＦＴＹ７２０物質
を簡便且つ高感度に検出定量することができ、移植にお
ける拒絶反応の持続的抑制および自己免疫疾患の治療に
おいて有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、免疫抑制活性を有
する新規低分子化合物、該低分子化合物の活性基に対し
て特異的な親和性を有する抗体、該抗体を用いた生体試
料中の該低分子化合物の測定方法、並びにそのためのキ
ットに関する。

【０００２】

【従来の技術】２−アミノ−２−［２−（４−オクチル
フェニル）エチル］プロパン−１，３−ジオール塩酸塩
（以下、ＦＴＹ７２０と称する場合もある）、その医薬
上許容される塩、塩基またはそれらの水和物は、安全性
の高い優れた免疫抑制作用を示し、臓器または骨髄の移
植時に生じる拒絶反応を抑制するとともに、関節リウマ
チ等の自己免疫疾患、アトピー性皮膚炎、喘息などの予
防および治療に有効であることが知られている（特許第
２５７９６０２号公報）。ＦＴＹ７２０は微量で非常に
強力な免疫抑制作用を有するため、例えば、臓器移植等
の移植における拒絶反応を有効且つ持続的に抑制するに
は、生体投与後の該化合物の血中濃度を簡便且つ高感度
にモニタリングする技術が必要である。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】生体試料中に微量含ま
れる低分子物質の測定法としては、ガスクロマトグラフ
ィー、高速液体クロマトグラフィーなどが従来より用い
られているが、これらの分析法には、（１）微量濃度の
薬理活性物質を測定するには感度が不充分である、
（２）操作が煩雑である、（３）大型装置を必要とする
等の問題点があった。そのため、微量濃度のＦＴＹ７２
０を簡便且つ高感度に定量する測定方法は未だに確立さ
れていない。

【０００４】

【課題を解決するための手段】したがって、本発明の目
的は、生体試料等に含まれる微量濃度のＦＴＹ７２０を
迅速、簡便且つ高感度に測定することができるＦＴＹ７
２０の新規測定方法、並びに該測定方法に用いるための
キットを提供することである。

【０００５】本発明者らは、抗原抗体反応を利用した高
感度免疫測定法に着目し、ＦＴＹ７２０の免疫抑制活性
部位である２−アミノ−２−（２−フェニルエチル）プ
ロパン−１，３−ジオール基を含む化合物として、２−
アミノ−２−［２−（４−（４−メルカプトブチル）フ
ェニル）エチル］プロパン−１，３−ジオール塩酸塩
（ＡＭＰＤ）等の２−アミノ−２−（アリールアルキ
ル）プロパン−１，３−ジオール基含有化合物を新規に
合成し、該新規化合物をアルブミン等の適当な担体に結
合して免疫原性を有する複合体（immunogenic conjugat
e ）を作製した。次いで、該複合体を感作抗原として、
２−アミノ−２−（アリールアルキル）プロパン−１，
３−ジオール基のある部位をハプテン基として認識する
ポリクローナルおよびモノクローナル抗体をそれぞれ取
得することに成功した。さらに、本発明者らは、該抗体
を用いて生体試料、特に血液等の体液中の２−アミノ−
２−（アリールアルキル）プロパン−１，３−ジオール
基含有化合物を高感度に検出できることを確認して、本
発明を完成するに至った。

【０００６】すなわち、本発明は以下の通りである。 （１）一般式

【０００７】

【化２】

【０００８】（式中、ｋは１〜２０、好ましくは１〜３
の整数、就中１であり、ｍおよびｎはそれぞれ独立して
１〜２０の整数、好ましくは１〜８の整数、さらに好ま
しくは１〜４の整数であり、Ｘは直接結合、−ＣＯＮＨ
−，−Ｏ−または−ＮＨ−、好ましくは直接結合を表
す）により表されるチオール化合物またはその保護体あ
るいはそれらの塩。 （２）２−アミノ−２−（アリールアルキル）プロパン
−１，３ージオール基、好ましくはアルキル基が２〜４
個の炭素原子を有し、および／またはアリール基がフェ
ニルおよび炭素数２〜８個の直鎖状または分枝鎖状のア
ルキルによって置換されたフェニルからなる群より選択
される２−アミノ−２−（アリールアルキル）プロパン
−１，３ージオール基、就中２−アミノ−２−（２−フ
ェニルエチル）プロパン−１，３−ジオール基または２
−アミノ−２−（２−（炭素数２〜８個の直鎖状または
分枝鎖状のアルキル置換フェニル）エチル）プロパン−
１，３−ジオール基、並びに免疫学上許容される担体を
含む、免疫原性を有する複合体。 （３）２−アミノ−２−（アリールアルキル）プロパン
−１，３−ジオール基、好ましくはアルキル基が２〜４
個の炭素原子を有し、および／またはアリール基がフェ
ニルおよび炭素数２〜８個の直鎖状または分枝鎖状のア
ルキルによって置換されたフェニルからなる群より選択
される２−アミノ−２−（アリールアルキル）プロパン
−１，３−ジオール基、就中２−アミノ−２−（２−フ
ェニルエチル）プロパン−１，３−ジオール基または２
−アミノ−２−（２−（炭素数２〜８個の直鎖状または
分枝鎖状のアルキル置換フェニル）エチル）プロパン−
１，３−ジオール基に対して親和性を有する抗体、好ま
しくはモノクローナル抗体。 （４）下記の(a) 〜(f) の工程により取得することがで
きる、２−アミノ−２−（アリールアルキル）プロパン
−１，３−ジオール基に対して親和性を有するモノクロ
ーナル抗体： (a) ２−アミノ−２−（アリールアルキル）プロパン−
１，３−ジオール基含有化合物と免疫学上許容される担
体を反応させて免疫原性を有する複合体を生成させ、
(b) 該免疫原性を有する複合体で哺乳動物を１回または
数回免疫して２−アミノ−２−（アリールアルキル）プ
ロパン−１，３−ジオール基に対して親和性を有する抗
体を産生させ、(c) 該哺乳動物から抗体産生細胞を採取
し、(d) 該抗体産生細胞を株化させ、(e) 該株化細胞か
ら２−アミノ−２−（アリールアルキル）プロパン−
１，３−ジオール基に対して親和性を有するモノクロー
ナル抗体を産生する細胞をクローン化し、(f) 該クロー
ン化された細胞株から該モノクローナル抗体を採取す
る、好ましくは２−アミノ−２−（アリールアルキル）
プロパン−１，３−ジオール基が、２−アミノ−２−
（２−フェニルエチル）プロパン−１，３−ジオール基
または２−アミノ−２−（２−（炭素数２〜８個の直鎖
状または分枝鎖状のアルキル置換フェニル）エチル）プ
ロパン−１，３−ジオール基である該モノクローナル抗
体。 （５）上記（３）または（４）のモノクローナル抗体を
産生し得るハイブリドーマ。 （６）生体試料中の２−アミノ−２−（アリールアルキ
ル）プロパン−１，３−ジオール基含有化合物を、上記
（３）または（４）の抗体を用いて検出することを特徴
とする、生体試料中の２−アミノ−２−（アリールアル
キル）プロパン−１，３−ジオール基含有化合物の測定
方法。 （７）下記(a) 〜(c) の工程を含む生体試料中の２−ア
ミノ−２−（アリールアルキル）プロパン−１，３−ジ
オール基含有化合物の測定方法： (a) 固相化された上記（３）または（４）の抗体に、生
体試料と、標識された２−アミノ−２−（アリールアル
キル）プロパン−１，３−ジオール基含有化合物とを競
合的に反応させた後、(b) 固相と液相とを分離し、(c)
その一方に存在する標識量を測定する。 （８）下記(a) 〜(d) の工程を含む生体試料中の２−ア
ミノ−２−（アリールアルキル）プロパン−１，３−ジ
オール基含有化合物の測定方法： (a) 上記（３）または（４）の抗体に、生体試料と、標
識された２−アミノ−２−（アリールアルキル）プロパ
ン−１，３−ジオール基含有化合物とを競合的に反応さ
せ、(b) 該反応液を該抗体に対して親和性を有する固相
化された二次抗体とさらに反応させた後、(c) 固相と液
相とを分離し、(d) その一方に存在する標識量を測定す
る。 （９）下記(a) 〜(d) の工程を含む生体試料中の２−ア
ミノ−２−（アリールアルキル）プロパン−１，３−ジ
オール基含有化合物の測定方法： (a) 生体試料と標識された上記（３）または（４）の抗
体とを反応させ、(b) 該反応液を、固相化された２−ア
ミノ−２−（アリールアルキル）プロパン−１，３−ジ
オール基含有化合物とさらに反応させた後、(c) 固相と
液相とを分離し、(d) その一方に存在する標識量を測定
する。 （１０）下記(a) 〜(f) の工程を含む生体試料中の２−
アミノ−２−（アリールアルキル）プロパン−１，３−
ジオール基含有化合物の測定方法： (a) 生体試料と、上記（３）または（４）の抗体とを反
応させ、(b) 該反応液を、固相化された２−アミノ−２
−（アリールアルキル）プロパン−１，３−ジオール基
含有化合物とさらに反応させた後、(c) 固相と液相とを
分離し、(d) 固相に結合した抗体と、該抗体に対して親
和性を有する標識された二次抗体とを反応させ、(e) 液
相を除去した後、(f) 該固相上の標識量を測定する。 （１１）２−アミノ−２−（アリールアルキル）プロパ
ン−１，３−ジオール基含有化合物の体液中レベルの測
定方法である上記（６）〜（１０）のいずれかの方法。 （１２）２−アミノ−２−（アリールアルキル）プロパ
ン−１，３−ジオール基が、２−アミノ−２−（２−フ
ェニルエチル）プロパン−１，３−ジオール基または２
−アミノ−２−（２−（炭素数２〜８個の直鎖状または
分枝鎖状のアルキル置換フェニル）エチル）プロパン−
１，３−ジオール基である上記（６）〜（１１）のいず
れかの方法。 （１３）標識が酵素、蛍光物質または放射性同位元素で
ある上記（７）〜（１２）のいずれかの方法。 （１４）下記(a) および(b) を含む生体試料中の２−ア
ミノ−２−（アリールアルキル）プロパン−１，３−ジ
オール基含有化合物測定用キット。 (a) 上記（３）または（４）の抗体 (b) 標識された２−アミノ−２−（アリールアルキル）
プロパン−１，３−ジオール基含有化合物 （１５）さらに上記（３）または（４）の抗体に対して
親和性を有する二次抗体を含む上記（１４）のキット。 （１６）下記(a) および(b) を含む生体試料中の２−ア
ミノ−２−（アリールアルキル）プロパン−１，３−ジ
オール基含有化合物測定用キット。 (a) 標識された上記（３）または（４）の抗体 (b) 固相化可能な２−アミノ−２−（アリールアルキ
ル）プロパン−１，３−ジオール基含有化合物 （１７）下記(a) 〜(c) を含む生体試料中の２−アミノ
−２−（アリールアルキル）プロパン−１，３−ジオー
ル基含有化合物測定用キット。 (a) 固相化可能な２−アミノ−２−（アリールアルキ
ル）プロパン−１，３−ジオール基含有化合物 (b) 上記（３）または（４）の抗体 (c) 該抗体に対して親和性を有する標識された二次抗体 （１８）２−アミノ−２−（アリールアルキル）プロパ
ン−１，３−ジオール基含有化合物の体液中レベルの測
定用キットである上記（１４）〜（１７）のいずれかの
キット。 （１９）２−アミノ−２−（アリールアルキル）プロパ
ン−１，３−ジオール基が、２−アミノ−２−（２−フ
ェニルエチル）プロパン−１，３−ジオール基または２
−アミノ−２−（２−（炭素数２〜８個の直鎖状または
分枝鎖状のアルキル置換フェニル）エチル）プロパン−
１，３−ジオール基である上記（１４）〜（１８）のい
ずれかのキット。 （２０）標識が酵素、蛍光物質または放射性同位元素で
ある上記（１４）〜（１９）のいずれかのキット。

【０００９】

【発明の実施の形態】本発明の新規化合物のうち、特に
好ましい化合物は、一般に下式で表される化合物または
その塩である（以下、総称してＡＭＰＤ物質という場合
もある）。

【００１０】

【化３】

【００１１】（式中、ｐは１〜２０、好ましくは４〜８
の整数である）

【００１２】塩としては、塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩等
の無機酸との塩、マレイン酸塩、フマール酸塩、クエン
酸塩、酢酸塩、リンゴ酸塩、酒石酸塩、ベンゼンスルホ
ン酸塩、シュウ酸塩等が挙げられる。本化合物はＯ位お
よび／またはＮ位がアシル基（アセチル、クロロアセチ
ル、トリフルオロアセチル等）、アルコキシカルボニル
（第３級ブトキシカルボニル等）、アルキリデン（イソ
プロピリデン等）、トリアルキルシリル（トリブチルシ
リル等）により保護されていてもよい。これら保護体は
合成原料として用いられる。本化合物はＦＴＹ７２０同
様、２−アミノ−２−（２−フェニルエチル）プロパン
−１，３−ジオール基を有する。また、チオール基を有
するため、免疫原性を有する複合体の作製の際に、担体
となる物質と容易に架橋形成させることができる。

【００１３】ＡＭＰＤ物質は、例えば、下式で示される
化合物（１）を出発物質として、以下に示す一連の工程
により調製することができるが、それに限定されない。

【００１４】

【化４】

【００１５】（式中、ｐは１〜２０の整数を示す）

【００１６】工程１ 化合物（１）をパラトルエンスルホン酸、硫酸、ジエチ
ルエーテル三フッ化ホウ素付加物等の存在下、第１級ア
ルコール（メタノール、無水エタノール、プロパノール
等）と６０〜８０℃、１〜２時間反応させてエステル化
し、化合物（２）を得る。

【００１７】

【化５】

【００１８】（式中、Ｒはメチル、エチル、プロピル等
の低級アルキルを、ｐは１〜２０の整数を示す）

【００１９】工程２ 化合物（２）を塩化アルミニウム、塩化亜鉛、ジエチル
エーテル三フッ化ホウ素付加物等の存在下、ブロモアセ
チルクロリド等のアシル化剤を用いて−２０〜４０℃で
１〜２時間反応させてアシル化し、化合物（３）を得
る。溶媒としては、ジクロロメタン、ジクロロエタン、
クロロホルム、ニトロベンゼン、二硫化炭素等が使用で
きる。

【００２０】

【化６】

【００２１】（式中、Ｘは臭素、塩素またはフッ素、Ｒ
はメチル、エチル、プロピル等の低級アルキルを、ｐは
１〜２０の整数を示す）

【００２２】工程３ 化合物（３）をトリエチルシランおよびトリフルオロ酢
酸（ＴＦＡ）の存在下、−１０〜４０℃で２〜４時間反
応させて還元し、化合物（４）を得る。

【００２３】

【化７】

【００２４】（式中、Ｘは臭素、塩素またはフッ素、Ｒ
はメチル、エチル、プロピル等の低級アルキルを、ｐは
１〜２０の整数を示す）

【００２５】工程４ 化合物（４）をヨウ化ナトリウムで処理し、５０〜９０
℃で２〜６時間反応させてヨウ化し、化合物（５）を得
る。溶媒としては、２−ブタノン、メチルエチルケト
ン、アセトン等が使用できる。

【００２６】

【化８】

【００２７】（式中、Ｒはメチル、エチル、プロピル等
の低級アルキルを、ｐは１〜２０の整数を示す）

【００２８】工程５ 化合物（５）を水素化ナトリウム、ナトリウムエトキシ
ド等の存在下、２−（Ｎ−置換）−アミノマロン酸エス
テルと４０〜１００℃で１〜８時間反応させて縮合し、
化合物（６）を得る。溶媒としては、ジメチルホルムア
ミド、テトラヒドロフラン、エタノール、トルエン等が
使用できる。

【００２９】

【化９】

【００３０】（式中、Ｙはアセチル、第３級ブトキシカ
ルボニル、ベンジルオキシカルボニル等を、Ｒ，Ｒ² ，
Ｒ³ はそれぞれ同一または異なって、メチル、エチル、
プロピル等の低級アルキルを、ｐは１〜２０の整数を示
す）

【００３１】工程６ 化合物（６）を水素化ホウ素ナトリウム、水素化ホウ素
リチウム、水素化ホウ素カルシウム等と０〜６０℃、２
〜８時間反応させて還元し、さらにその反応混合物をｐ
−トルエンスルホン酸、硫酸、ジエチルエーテル三フッ
化ホウ素付加物等の存在下、２−ジメトキシプロパンま
たはアセトンと０〜８０℃で１〜２４時間反応させてア
セタール化し、化合物（７）および（８）を得る。還元
反応の溶媒としては、エタノール、メタノール、テトラ
ヒドロフラン等が使用できる。

【００３２】

【化１０】

【００３３】（式中、Ｙはアセチル、第３級ブトキシカ
ルボニル、ベンジルオキシカルボニル等を、Ｒはメチ
ル、エチル、プロピル等の低級アルキルを、ｐは１〜２
０の整数を示す）

【００３４】

【化１１】

【００３５】（式中、Ｙはアセチル、第３級ブトキシカ
ルボニル、ベンジルオキシカルボニル等を、ｐは１〜２
０の整数を示す）

【００３６】工程７ 化合物（７）を水素化ホウ素リチウム、水素化リチウム
アルミニウム、水素化ホウ素ナトリウム等と−２０〜６
０℃で０．５〜４時間反応させて還元し、化合物（８）
を得る。溶媒としては、ジエチルエーテル、テトラヒド
ロフラン、メタノール、エタノール等が使用できる。

【００３７】工程８ 化合物（８）をピリジン、トリエチルアミン、ヘキサメ
チルホスホルアミド等の存在下、ｐ−トルエンスルホニ
ルクロリド、メタンスルホニルクロリド等と−２０〜６
０℃で１〜２４時間反応させて化合物（９）を得る。溶
媒としては、ジクロロメタン、ジクロロエタン、トルエ
ン等が使用できる。

【００３８】

【化１２】

【００３９】（式中、Ｙはアセチル、第３級ブトキシカ
ルボニル、ベンジルオキシカルボニル等を、Ｚはトルエ
ンスルホニル、メタンスルホニル等を、ｐは１〜２０の
整数を示す）

【００４０】工程９ 化合物（９）をチオ酢酸カリウム、チオプロピオン酸カ
リウム、チオブタン酸カリウム等と６０〜１００℃で
０．５〜４時間反応させてチオアシル化し、化合物（１
０）を得る。

【００４１】

【化１３】

【００４２】（式中、Ｙはアセチル、第３級ブトキシカ
ルボニル、ベンジルオキシカルボニル等を、Ｒ⁵ はメチ
ル、エチル、プロピル等の低級アルキルを、ｐは１〜２
０の整数を示す）

【００４３】工程１０ 化合物（１０）を塩酸、硫酸等の存在下、２０〜１００
℃で１〜１０時間反応させて加水分解し、化合物（Ａ）
の塩として化合物（１２）である塩酸塩やその他硫酸塩
等を得る。溶媒としては、メタノール、エタノール、水
等が使用できる。

【００４４】工程１１ 化合物（１０）を水酸化ナトリウム、水酸化リチウム等
の存在下、０〜６０℃で０．１〜５時間反応させて加水
分解し、化合物（１１）を得る。溶媒としては、メタノ
ール、エタノール等が使用できる。

【００４５】

【化１４】

【００４６】（式中、Ｙはアセチル、第３級ブトキシカ
ルボニル、ベンジルオキシカルボニル等を、ｐは１〜２
０の整数を示す）

【００４７】工程１２ 化合物（１１）を塩酸、硫酸等の存在下、２０〜１００
℃で１〜１０時間反応させて加水分解し、化合物（Ａ）
の塩として化合物（１２）である塩酸塩やその他硫酸塩
等を得る。溶媒としては、メタノール、エタノール、水
等が使用できる。

【００４８】

【化１５】

【００４９】（式中、ｐは１〜２０の整数を示す）

【００５０】ＦＴＹ７２０や本発明のＡＭＰＤ物質は低
分子化合物であるため、免疫原性、すなわち抗体産生誘
導能がないか、または非常に低い。したがって、本発明
の抗体を調製するためには、２−アミノ−２−（アリー
ルアルキル）プロパン−１，３−ジオール基、好ましく
は２−アミノ−２−（２−フェニルエチル）プロパン−
１，３−ジオール基または２−アミノ−２−（２−（炭
素数２〜８個の直鎖状または分枝鎖状のアルキル置換フ
ェニル）エチル）プロパン−１，３−ジオール基を含む
化合物、就中ＦＴＹ７２０やＡＭＰＤ物質を、例えばマ
レイミド法などの常法を用いて免疫学上許容される担体
に結合して免疫原性を有する複合体もしくは免疫原性が
より高められた複合体、すなわち人工抗原を作製する必
要がある。

【００５１】本発明はまた、上記方法により製造され
る、２−アミノ−２−（アリールアルキル）プロパン−
１，３−ジオール基に対して親和性を有する抗体の産生
誘導能を有する複合体を提供する。該複合体は、ハプテ
ン基含有領域としての２−アミノ−２−（アリールアル
キル）プロパン−１，３−ジオール基含有化合物、およ
び免疫学上許容される担体からなる。２−アミノ−２−
（アリールアルキル）プロパン−１，３−ジオール基含
有化合物として、好ましくは、アルキル基が２〜４個の
炭素原子を有し、および／またはアリール基がフェニル
および炭素数２〜８個の直鎖状または分枝鎖状のアルキ
ルによって置換されたフェニルからなる群より選択され
る２−アミノ−２−（アリールアルキル）プロパン−
１，３−ジオール基を含む化合物、就中２−アミノ−２
−（２−フェニルエチル）プロパン−１，３−ジオール
基または２−アミノ−２−（２−（炭素数２〜８個の直
鎖状または分枝鎖状のアルキル置換フェニル）エチル）
プロパン−１，３−ジオール基を含む化合物が挙げられ
る。また、免疫学上許容される担体としては、例えばウ
シ血清アルブミン（ＢＳＡ）、卵白アルブミン、ゼラチ
ン、ヘモシアニン等の高分子量タンパク質の他、赤血
球、多糖体等が挙げられるが特に制限はない。

【００５２】本発明の抗体は、２−アミノ−２−（アリ
ールアルキル）プロパン−１，３−ジオール基に対して
親和性を有するものであれば特に制限はない。好ましく
は、２−アミノ−２−（２−フェニルエチル）プロパン
−１，３−ジオール基または２−アミノ−２−（２−
（炭素数２〜８個の直鎖状または分枝鎖状のアルキル置
換フェニル）エチル）プロパン−１，３−ジオール基に
対して親和性を有する抗体である。

【００５３】当該抗体としては、ポリクローナル抗体お
よびモノクローナル抗体をともに包含する。また、当該
抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤまたはＩｇＥ
のいずれの免疫グロブリンクラスに属するものであって
もよいが、好ましくはＩｇＧまたはＩｇＭである。

【００５４】本発明のポリクローナル抗体は、例えば以
下の方法により作製することができる。上記の複合体と
完全または不完全フロイントアジュバント（ＦＣＡまた
はＦＩＡ）との混和物を感作抗原として、ウサギ、マウ
ス、ラット、ヤギ、モルモットまたはハムスター等の哺
乳動物に免疫（初回免疫から約１〜４週間毎に１〜数回
追加免疫する）し、各追加免疫の約３〜１０日後に部分
採血した血清の抗体価を従来公知の抗原抗体反応を利用
して測定、その上昇を確認しておく。さらに、最終免疫
から約３〜１０日後全血を採取して抗血清を精製する。
ポリクローナル抗体は、硫安分画等の塩析、遠心分離、
透析、カラムクロマトグラフィー等の慣用の分離技術を
用いて単独の免疫グロブリンクラスとして精製すること
もできる。

【００５５】また、本発明のモノクローナル抗体は、通
常細胞融合によって製造されるハイブリドーマ（融合細
胞）から取得することができる。すなわち、上記ポリク
ローナル抗体の場合と同様、２−アミノ−２−（アリー
ルアルキル）プロパン−１，３−ジオール基含有化合物
を担体に結合した複合体を免疫感作した哺乳動物から抗
体産生細胞を単離し、これと骨髄腫細胞とを融合させて
ハイブリドーマを形成させ、当該ハイブリドーマをクロ
ーン化し、上記抗原あるいは２−アミノ−２−（アリー
ルアルキル）プロパン−１，３−ジオール基含有化合物
をマーカー抗原（あるいはマーカーハプテン）として、
それに対して特異的な親和性を示す抗体を生産するクロ
ーンを選択することによって製造される。また、あらか
じめ単離された脾細胞あるいはリンパ球等に培養液中で
上記の複合体を作用させて生じる抗体産生細胞も使用す
ることができる。この場合にはヒト由来の抗体産生細胞
も調製可能である。

【００５６】モノクローナル抗体を分泌するハイブリド
ーマの調製はケーラーおよびミルシュタインの方法（Na
ture, Vol. 256, pp. 495-497, 1975 ）およびその変法
に従って行うことができる。すなわち、本発明のモノク
ローナル抗体は、前述のごとく免疫感作された動物から
取得される脾細胞、リンパ節細胞、末梢リンパ球、骨髄
腫細胞あるいは扁桃細胞等、好ましくは脾細胞に含まれ
る抗体産生細胞と、好ましくは同種のマウス、ラット、
モルモット、ハムスター、ウサギまたはヒト等の哺乳動
物、より好ましくはマウス、ラットまたはヒトの骨髄腫
細胞（ミエローマ）との融合により得られるハイブリド
ーマを培養することにより調製される。培養は、インビ
トロまたはマウス、ラット、モルモット、ハムスター、
ウサギ等の哺乳動物、好ましくはマウスまたはラット、
より好ましくはマウスの腹腔内等でのインビボで行うこ
とができ、抗体はそれぞれ培養上清あるいは哺乳動物の
腹水から取得することができる。

【００５７】細胞融合に用いられる骨髄腫細胞として
は、例えばマウス由来ミエローマＰ３／Ｘ６３−ＡＧ
８，Ｐ３／ＮＳＩ／１−Ａｇ４−１，Ｐ３／Ｘ６３−Ａ
ｇ８．Ｕ１，ＳＰ２／０−Ａｇ１４、Ｆ０あるいはＢＷ
５１４７、ラット由来ミエローマ２１０ＲＣＹ３−Ａｇ
１．２．３．，ヒト由来ミエローマＵ−２６６ＡＲ１，
ＧＭＬ５００−６ＴＧ−Ａ１−２，ＵＣ７２９−６，Ｃ
ＥＭ−ＡＧＲ，Ｄ１Ｒ１１あるいはＣＥＭ−Ｔ１５等が
挙げられる。

【００５８】本発明のモノクローナル抗体を産生するハ
イブリドーマクローンのスクリーニングは、ハイブリド
ーマを例えばマイクロタイタープレート中で培養し、増
殖のみられたウェル中の培養上清の、マーカー抗原（ま
たはハプテン）に対する反応性を、ラジオイムノアッセ
イ、エンザイムイムノアッセイ、蛍光イムノアッセイ等
によって測定することにより行うことができる。

【００５９】モノクローナル抗体の単離精製は、上述の
ような方法によって製造される該抗体含有培養上清ある
いは腹水を、イオン交換クロマトグラフィー、抗イムノ
グロブリンカラムまたはプロテインＡカラム等のアフィ
ニティーカラムクロマトグラフィーに付すことにより行
うことができる。

【００６０】本発明のモノクローナル抗体は、上述の製
造方法に限定されることなく、いかなる方法で得られた
ものであってもよい。また、通常モノクローナル抗体は
免疫感作を施す哺乳動物の種類によりそれぞれ異なる構
造の糖鎖を有するが、本発明におけるモノクローナル抗
体は、該糖鎖の構造差異により限定されるものではな
く、あらゆる哺乳動物由来のモノクローナル抗体をも包
含するものである。さらに、例えばヒト免疫グロブリン
遺伝子を組み込まれたトランスジェニック動物から得ら
れる組換えヒト型モノクローナル抗体、あるいはある哺
乳動物由来のモノクローナル抗体の定常領域（Ｆｃ）を
ヒト由来モノクローナル抗体のＦｃ領域と組換えたキメ
ラモノクローナル抗体、さらには抗原と相補的に直接結
合し得る相補性決定部位（ＣＤＲ）以外の全領域をヒト
由来モノクローナル抗体の対応領域と組換えたキメラモ
ノクローナル抗体も本発明のモノクローナル抗体に包含
される。

【００６１】本発明はまた、上記のようにして取得され
るような、２−アミノ−２−（アリールアルキル）プロ
パン−１，３−ジオール基に対して親和性を有する抗
体、好ましくは２−アミノ−２−（２−フェニルエチ
ル）プロパン−１，３−ジオール基または２−アミノ−
２−（２−（炭素数２〜８個の直鎖状または分枝鎖状の
アルキル置換フェニル）エチル）プロパン−１，３−ジ
オール基に対して親和性を有する抗体を用いて、２−ア
ミノ−２−（アリールアルキル）プロパン−１，３−ジ
オール基含有化合物、好ましくは２−アミノ−２−（２
−フェニルエチル）プロパン−１，３−ジオール基また
は２−アミノ−２−（２−（炭素数２〜８個の直鎖状ま
たは分枝鎖状のアルキル置換フェニル）エチル）プロパ
ン−１，３−ジオール基含有化合物を測定することを特
徴とする、生体試料中の２−アミノ−２−（アリールア
ルキル）プロパン−１，３−ジオール基含有化合物、好
ましくは２−アミノ−２−（２−フェニルエチル）プロ
パン−１，３−ジオール基または２−アミノ−２−（２
−（炭素数２〜８個の直鎖状または分枝鎖状のアルキル
置換フェニル）エチル）プロパン−１，３−ジオール基
含有化合物の測定方法を提供する。

【００６２】測定対象の生体試料としては、例えば、ヒ
ト、ラット、ヤギ、サル、イヌ、ブタなどの哺乳動物由
来の血液、あるいはその血清、血漿等の体液または体液
由来の試料が挙げられる。血清または血漿マトリックス
効果により２−アミノ−２−（アリールアルキル）プロ
パン−１，３−ジオール基含有化合物の回収率が低く良
好な測定結果が得られない場合には、生体試料を水酸化
ナトリウム水溶液等のアルカリ存在下にクロロホルム抽
出することにより、目的物質を抽出・濃縮することがで
きる。

【００６３】用いられる抗体はポリクローナル抗体およ
びモノクローナル抗体のいずれであってもよいが、より
選択性が高く、各製造ロット間でその特性に差がない等
の理由からモノクローナル抗体がより好ましい。また、
完全な抗体分子だけでなく、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）
₂ 、Ｈ鎖、Ｌ鎖、可変領域、超可変領域、ＣＤＲ等の、
抗原またはハプテンとの結合能を有する断片もまた、好
ましく使用することができる。

【００６４】本発明の測定方法は、高感度を実現するた
めに、酵素、蛍光物質（例えば、フルオレセインイソチ
オシアネート、アクリジン、ローダミン等）または放射
性同位元素（ＲＩ）を標識として利用する。特別な実験
施設や装置を必要としない等の点で、酵素標識が特に好
ましく使用できる。用いられる酵素としては、例えばペ
ルオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、アルカリ
ホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、アセチルコ
リンエステラーゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵
素、リンゴ酸脱水素酵素もしくはウレアーゼ等が挙げら
れるが、好ましくはペルオキシダーゼ、特に西洋ワサビ
由来ペルオキシダーゼ（以下、ＨＲＰと称する場合もあ
る）である。標識される物質は、測定に用いる抗原抗体
反応の様式に応じて２−アミノ−２−（アリールアルキ
ル）プロパン−１，３−ジオール基含有化合物、抗２−
アミノ−２−（アリールアルキル）プロパン−１，３−
ジオール基抗体あるいは該抗体に対して特異的な親和性
を有する二次抗体のうちから選択されるが、いずれの場
合でも、常法に従って直接または架橋剤を介して間接的
に標識することができる。

【００６５】本発明の測定方法の好ましい一態様におい
ては、固相化された上記抗２−アミノ−２−（アリール
アルキル）プロパン−１，３−ジオール基抗体、好まし
くはモノクローナル抗体に、生体試料と、標識、好まし
くは酵素標識された２−アミノ−２−（アリールアルキ
ル）プロパン−１，３−ジオール基含有化合物とを競合
的に反応させた後、固相と液相とを分離し、その一方に
存在する標識量を測定することにより、生体試料中の２
−アミノ−２−（アリールアルキル）プロパン−１，３
−ジオール基含有化合物を測定する（本法を以下、直接
法１という）。用いられる固相としては、例えばプレー
ト（イムノプレート等）、粒子（イムノビーズ等）、ポ
リスチレンボールや試験管等が使用されるが、簡便な操
作性の点でイムノプレートが好ましい。固相に結合した
酵素標識物質または液相中の酵素標識物質の検出は、標
識に使用される酵素の活性を、常法により測定すること
により行われる。例えば、標識に用いられた酵素がＨＲ
Ｐの場合には、ｏ−フェニレンジアミンと過酸化水素水
とを含む酵素基質溶液を使用し、酸化された基質の発色
の程度を吸光度測定することにより２−アミノ−２−
（アリールアルキル）プロパン−１，３−ジオール基含
有化合物の定量が行われる。本法により、２−アミノ−
２−（２−フェニルエチル）プロパン−１，３−ジオー
ル基含有化合物の微量濃度（１０^-1〜１０² ｎｇ／ｍ
ｌ）を高感度かつ簡便に定量的および定性的に測定する
ことができる。なお、本発明においては、検出限界を、
ラットブランク血清８例についての測定値の標準偏差の
２倍以上の特異シグナルを与える標準血清中のＦＴＹ７
２０濃度として定義する。また、検量線が直線性を示す
上限を定量可能上限とする。

【００６６】本発明の測定方法の別の好ましい一態様に
おいては、上記抗２−アミノ−２−（アリールアルキ
ル）プロパン−１，３−ジオール基抗体、好ましくはモ
ノクローナル抗体に、生体試料と、標識、好ましくは酵
素標識された２−アミノ−２−（アリールアルキル）プ
ロパン−１，３−ジオール基含有化合物とを競合的に反
応させ、該反応液を、該抗体に対して親和性を有する固
相化された二次抗体とさらに反応させた後、固相と液相
とを分離し、その一方に存在する標識量を測定すること
により、生体試料中の２−アミノ−２−（アリールアル
キル）プロパン−１，３−ジオール基含有化合物を測定
する（本法を以下、間接法１という）。二次抗体として
は、抗２−アミノ−２−（アリールアルキル）プロパン
−１，３−ジオール基抗体もしくは該抗体と同一の抗原
決定基を有する抗体を抗原として用いて常法により調製
される抗体でも、あるいは市販されている抗体でもよい
が、一次抗体と検出すべき物質との抗原抗体反応を妨げ
ず、且つ一次抗体を特異的に認識するものであればポリ
クローナル抗体、モノクローナル抗体にかかわらず使用
できる。例えば、ウサギ由来ＩｇＧクラス抗体を一次抗
体として使用する場合は、二次抗体としてヤギ抗ウサギ
ＩｇＧが、また、マウス由来ＩｇＧクラス抗体を一次抗
体として使用する場合は、二次抗体としてウサギ抗マウ
スＩｇＧが好ましく使用できる。用いられる固相や標識
酵素および該酵素の検出方法は、上記の測定法の場合と
同様である。本法により、２−アミノ−２−（アリール
アルキル）プロパン−１，３−ジオール基含有化合物の
微量濃度（１０¹ 〜１０³ ｎｇ／ｍｌ）を高感度且つ簡
便に定量的および定性的に測定することができる。

【００６７】本発明の別の態様においては、生体試料
と、標識、好ましくは酵素標識された上記抗２−アミノ
−２−（アリールアルキル）プロパン−１，３−ジオー
ル基抗体、好ましくはモノクローナル抗体とを反応さ
せ、該反応液を、固相化された２−アミノ−２−（アリ
ールアルキル）プロパン−１，３−ジオール基含有化合
物とさらに反応させた後、固相と液相とを分離し、その
一方に存在する標識量を測定することにより、生体試料
中の２−アミノ−２−（アリールアルキル）プロパン−
１，３−ジオール基含有化合物を測定する（本法を以
下、直接法２という）。ＦＴＹ７２０やＡＭＰＤ物質の
ような低分子化合物は、単独で固相に吸着させることが
困難であるが、適当なキャリアー（例えばアルブミン等
のタンパク質や多糖体など）と結合させることにより、
常法を用いて固相に吸着させることが可能となる。な
お、用いられる固相や標識酵素および該酵素の検出方法
は、上記の測定法の場合と同様である。本法により、２
−アミノ−２−（アリールアルキル）プロパン−１，３
−ジオール基含有化合物の微量濃度（１０¹ 〜１０⁴ ｐ
ｇ／ｍｌ）を高感度且つ簡便に定量的および定性的に測
定することができる。

【００６８】本発明のさらに別の態様においては、生体
試料と、抗２−アミノ−２−（アリールアルキル）プロ
パン−１，３−ジオール基抗体、好ましくはモノクロー
ナル抗体とを反応させ、該反応液を、固相化された２−
アミノ−２−（アリールアルキル）プロパン−１，３−
ジオール基含有化合物とさらに反応させた後、固相と液
相とを分離し、該固相に該抗体に対して親和性を有する
標識（好ましくは酵素標識）された二次抗体を反応さ
せ、液相を除去した後、該固相中の標識量を測定するこ
とにより、生体試料中の２−アミノ−２−（アリールア
ルキル）プロパン−１，３−ジオール基含有化合物を測
定する（本法を以下、間接法２という）。２−アミノ−
２−（アリールアルキル）プロパン−１，３−ジオール
基含有化合物の固相化方法、用いられる固相、二次抗
体、並びに標識酵素および該酵素の検出方法は、上記の
測定法の場合と同様である。

【００６９】本発明はまた、上記の各測定方法を簡便に
行うための２−アミノ−２−（アリールアルキル）プロ
パン−１，３−ジオール基含有化合物測定用キットを提
供する。例えば、上記直接法１を実施する場合には、該
キットは、少なくとも、抗２−アミノ−２−（アリール
アルキル）プロパン−１，３−ジオール基抗体、好まし
くはモノクローナル抗体、および標識、好ましくは酵素
標識された２−アミノ−２−（アリールアルキル）プロ
パン−１，３−ジオール基含有化合物を含む。また、間
接法１にて測定する場合には、該キットはさらに上記抗
体に対して親和性を有する二次抗体を含む。

【００７０】また、上記直接法２の場合、本発明のキッ
トは、標識、好ましくは酵素標識された抗２−アミノ−
２−（アリールアルキル）プロパン−１，３−ジオール
基抗体、好ましくはモノクローナル抗体、および固相化
可能な２−アミノ−２−（アリールアルキル）プロパン
−１，３−ジオール基含有化合物を含む。固相化可能な
２−アミノ−２−（アリールアルキル）プロパン−１，
３−ジオール基含有化合物としては、例えば、アルブミ
ン等の適当なキャリアーに結合されたＦＴＹ７２０また
はＡＭＰＤ物質などが挙げられる。

【００７１】さらにまた、上記間接法２の場合、本発明
のキットは、抗２−アミノ−２−（アリールアルキル）
プロパン−１，３−ジオール基抗体、好ましくはモノク
ローナル抗体、該抗体に対して親和性を有する標識（好
ましくは酵素標識）された二次抗体、および固相化可能
な２−アミノ−２−（アリールアルキル）プロパン−
１，３−ジオール基含有化合物を含む。

【００７２】また、本発明のキットは、２−アミノ−２
−（アリールアルキル）プロパン−１，３−ジオール基
含有化合物を定量的に測定する場合に必要な既知量の同
化合物を標準試料として含むことが望ましい。さらに、
該キットは、本発明の高感度免疫測定法を実施する際に
使用される周知の試薬類（例えば、反応緩衝液、ブロッ
キング液、洗浄液、標識検出試薬等）および器具類（例
えば、反応容器等）を含んでいてもよい。

【００７３】

【実施例】以下に実施例を挙げて本発明をより詳細に説
明するが、これらは単なる例示であって本発明を何ら限
定するものではない。

【００７４】実施例１ ＡＭＰＤの合成（全工程を図１
に示す） (1) ４−フェニル酪酸 [1]（１９．０ｇ，１．１６×１
０^-1ｍｏｌ）の無水エタノール（３００ｍｌ）溶液にｐ
−トルエンスルホン酸（１．１０ｇ，５．７９×１０^-3
ｍｏｌ）を加えて２時間還流した。反応液を減圧乾固
し、氷水（５０ｍｌ）を加えて酢酸エチル（２００ｍ
ｌ）で抽出した。該抽出液を飽和炭酸水素ナトリウム水
（２０ｍｌ）、飽和食塩水（５ｍｌ×２回）で順次洗浄
し乾燥した後、溶媒を留去して淡黄色油状物質 [2]（２
１．６ｇ，９７％）を得た。 (2) 油状物質 [2]（２０．０ｇ，１．０４×１０^-1ｍｏ
ｌ）の無水クロロホルム（２５０ｍｌ）溶液にブロモア
セチルクロリド（１０．４ｍｌ，１．２６×１０ ^-1ｍｏ
ｌ）を加え、−１０℃で塩化アルミニウム（３０．６
ｇ，２．２９×１０ ^-1ｍｏｌ）を少量ずつ添加し、１５
分間攪拌後、室温でさらに１．５時間攪拌した。該反応
液を氷中（２００ｍｌ）にゆっくりと注加し、クロロホ
ルム（１００ｍｌ）を加えて室温で１５分間攪拌した。
クロロホルム層を分取し、飽和炭酸水素ナトリウム水
（２００ｍｌ）、飽和食塩水（５０ｍｌ）で順次洗浄
し、乾燥した。溶媒を留去して得られた残渣をシリカゲ
ルカラムクロマトグラフィーに付し、ヘキサン−酢酸エ
チル（９：１）溶出部より無色油状物質 [3]（２８．８
ｇ，８８％）を得た。 (3) 氷冷下、油状物質 [3]（７．９ｇ，２．５×１０^-2
ｍｏｌ）のトリフルオロ酢酸（２５ｍｌ）溶液に、トリ
エチルシラン（８．９ｍｌ，５．６×１０^-2ｍｏｌ）を
加えて１５分間攪拌後、室温でさらに４時間攪拌した。
該反応液を氷水中（１５０ｍｌ）に注加し、酢酸エチル
（２００ｍｌ）および炭酸水素ナトリウム粉末（２７
ｇ）を加えた。酢酸エチル層を分取し、飽和炭酸水素ナ
トリウム水（２０ｍｌ）、飽和食塩水（１５ｍｌ×２
回）で順次洗浄し、乾燥した。溶媒を留去して得られた
残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し、ヘ
キサン−酢酸エチル（４０：１）溶出部より無色油状物
質 [4]（５．１ｇ，６８％）を得た。 (4) 油状物質 [4]（４．８ｇ，１．６×１０^-2ｍｏｌ）
の２−ブタノン（１００ｍｌ）溶液にヨウ化ナトリウム
（７．９ｇ，５．３×１０^-2ｍｏｌ）を加えて４時間還
流した。反応液を減圧乾固し、氷水（２０ｍｌ）を加え
て酢酸エチル（５０ｍｌ）で抽出した。該抽出液を飽和
亜硫酸ナトリウム水（８０ｍｌおよび２０ｍｌ）、飽和
食塩水（２０ｍｌ×２回）で順次洗浄し乾燥した後、溶
媒を留去して淡黄色油状物質 [5]（５．４ｇ，９７％）
を得た。 (5) アルゴン気流下、ジエチルアセトアミドマロネート
（１５ｇ，６．９×１０ ^-2ｍｏｌ）の無水ＤＭＦ（４６
ｍｌ）溶液に、６０％水素化ナトリウム（２．０ｇ，
５．０×１０^-2ｍｏｌ）を加えて９０℃で油浴加熱し
た。該溶液に無水テトラヒドロフラン（６０ｍｌ）を加
え、次いで、油状物質 [5]（８．０ｇ，２．３×１０^-2
ｍｏｌ）の無水テトラヒドロフラン（６ｍｌ）溶液を加
えて２時間還流した。該反応液を減圧乾固し、氷水（５
０ｍｌ）を加えてジエチルエーテル（１５０ｍｌ）で抽
出した。該抽出液を飽和食塩水（２０ｍｌ×２回）で洗
浄し、乾燥した。溶媒を留去して得られた残渣をシリカ
ゲルカラムクロマトグラフィーに付し、ヘキサン−酢酸
エチル（３：１）溶出部より無色油状物質 [6]（８．６
ｇ，８５％）を得た。 (6) 氷冷下、 [6]（１．９ｇ，４．４×１０^-3ｍｏｌ）
のエタノール（７ｍｌ）溶液に水素化ホウ素ナトリウム
（０．８０ｇ，２．１×１０^-2ｍｏｌ）を加え、室温で
７時間攪拌した。該反応液に氷水（１０ｍｌ）および酢
酸エチル（５０ｍｌ）を加え、１Ｎ塩酸でｐＨ３とした
後、酢酸エチル層を分取し、飽和食塩水（１０ｍｌ）で
洗浄し、乾燥した。溶媒を留去して得られた残渣に、
２，２−ジメトキシプロパン（９．０ｍｌ，７．３×１
０^-2ｍｏｌ）およびｐ−トルエンスルホン酸（８２ｍ
ｇ，４．３×１０^-4ｍｏｌ）を加え、室温で１８時間攪
拌した。反応液を減圧乾固し、氷水（１０ｍｌ）を加え
て酢酸エチル（３０ｍｌ）で抽出した。該抽出液を飽和
食塩水（５ｍｌ）で洗浄し、乾燥した。溶媒を留去して
得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに
付し、ヘキサン−酢酸エチル（２：１→１：１）溶出部
より無色結晶 [7]（０．８４ｇ，４９％）を得、ヘキサ
ン−酢酸エチル（１：２）溶出部より無色結晶 [8]
（０．２３ｇ，１５％）を得た。 (7) 氷冷下、 [7]（１．３ｇ，３．３×１０^-3ｍｏｌ）
の無水ジエチルエーテル（８０ｍｌ）溶液に水素化リチ
ウムアルミニウム（０．３８ｇ，１．０×１０^-2ｍｏ
ｌ）を加え、室温で２時間攪拌した。氷冷下、反応液に
飽和酒石酸ナトリウムカリウム水（ロッセル塩）を加
え、上澄液を分取した。溶媒を留去して、得られた残渣
をベンゼンにより再結晶化させ、無色針状結晶 [8]
（０．７８ｇ，６７％）を得た。 (8) 氷冷下、 [8]（０．４５ｇ，１．３×１０^-3ｍｏ
ｌ）の無水ジクロロメタン（５．０ｍｌ）−トリエチル
アミン（０．３６ｍｌ，２．６×１０^-3ｍｏｌ）溶液に
ｐ−トルエンスルホニルクロリド（０．３０ｇ，１．６
×１０^-3ｍｏｌ）を加え、室温で１３時間攪拌した。反
応液を減圧乾固し、氷水（５ｍｌ）を加えて、酢酸エチ
ル（２０ｍｌ）で抽出した。該抽出液を飽和食塩水（１
ｍｌ）で洗浄し、乾燥した後、溶媒を留去して得られた
残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し、ヘ
キサン−酢酸エチル（１：３）溶出部より無色結晶 [9]
（０．４９ｇ，７５％）を得た。 (9) アルゴン気流下、 [9]（０．４５ｇ，８．９×１０
^-4ｍｏｌ）の無水エタノール（１０ｍｌ）溶液に９０％
チオ酢酸カリウム（０．１３ｇ，１．０×１０^-3ｍｏ
ｌ）を加え、１時間還流した。反応液を減圧濃縮後、氷
水（５ｍｌ）を加えて酢酸エチル（２０ｍｌ）で抽出し
た。該抽出液を飽和食塩水（１ｍｌ）で洗浄し、乾燥し
た後、溶媒を留去して得られた残渣をシリカゲルカラム
クロマトグラフィーに付し、ヘキサン−酢酸エチル
（１：１）溶出部より無色結晶[10]（０．２９ｇ，８０
％）を得た。 (10)アルゴン気流下、[10]（０．０７７ｇ，１．９×１
０^-4ｍｏｌ）のエタノール（２．０ｍｌ）溶液に１０％
塩酸（１．５ｍｌ）を加えて８時間還流した。反応液を
減圧留去して白色粉末（０．０６０ｇ，１００％）を得
た。ジエチルエーテル−メタノールより再結晶し、無色
板状結晶[12]を得た。 無色板状結晶[12]： 融点：１０５〜１１３℃（分解）； ＩＲ ν_max （ＣＨＣｌ₃ ）ｃｍ^-1：3550-3150, 3150-
2400；¹ Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆ ）δ：1.5
3 (2H, m), 1.62 (2H, m), 1.76 (2H, m), 2.23. (1H,
t, J=8.0Hz),2.46-2.55 (4H, m), 2.59 (2H, m), 3.52
(each 2H, d, J=5.0Hz),5.36 (2H, t, J=5.0Hz), 7.11
(4H, br s), 7.82 (3H, br s); ＦＡＢ−ＭＳ（−）ｍ／ｚ：３１８，３２０（Ｍ−１）
⁺ ； 元素分析（計算値）Ｃ₁₅Ｈ₂₆ＮＯ₂ ＳＣｌ；Ｃ：56.32,Ｈ：8.19, Ｎ：4.38 （実験値）Ｃ：56.37,Ｈ：8.09, Ｎ：4.49 (11)アルゴン気流下、[10]（０．０４７ｇ，１．２×１
０^-4ｍｏｌ）のメタノール（１．０ｍｌ）溶液に５Ｎ水
酸化ナトリウム（０．０２５ｍｌ）を加えて室温で０．
５時間攪拌した。氷冷下、該反応液に１Ｎ塩酸を加えて
ｐＨ３とした後、析出した沈殿を濾取し、無色板状結晶
[11]（０．０２３ｇ，５５％）を得た。 (12)アルゴン気流下、[11]（５．７ｍｇ，１．６×１０
^-5ｍｏｌ）のエタノール（１．０ｍｌ）溶液に１０％塩
酸（０．６０ｍｌ）を加えて０．５時間還流した。反応
液を減圧留去して白色粉末（４．９ｍｇ，９８％）を得
た。該物質の ¹Ｈ−ＮＭＲデータは上記の工程(10)で得
られた無色板状結晶[12]のそれと完全に一致した。

【００７５】実施例２ 化合物［６］は、次のようにして化合物［４］から直接
合成することができる。アルゴン気流下、ジエチルアセ
トアミドマロネート（４．８ｇ，２．２×１０ ^-2ｍｏ
ｌ）の無水ＤＭＦ（１０ｍｌ）溶液に、６０％水素化ナ
トリウム（０．７４ｇ，１．９×１０^-2ｍｏｌ）を加え
て９０℃で油浴加熱した。該溶液に無水テトラヒドロフ
ラン（１０ｍｌ）を加え、次いで、油状物質［４］
（２．２ｇ，７．４×１０^-3ｍｏｌ）の無水テトラヒド
ロフラン（５ｍｌ）溶液を加えて４．５時間還流した。
該反応液を減圧乾固し、氷水（２０ｍｌ）を加えてジエ
チルエーテル（８０ｍｌ）で抽出した。該抽出液は飽和
食塩水（５ｍｌ×２回）で洗浄し、乾燥した。溶媒を留
去して得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフ
ィーに付し、ヘキサン−酢酸エチル（２：１）溶出部よ
り無色油状物質［６］（２．６ｇ，８１％）を得た。

【００７６】実施例３ ＡＭＰＤ−卵白アルブミン（Ｏ
ＶＡ）複合体の調製 （１）マレイミド化卵白アルブミンの調製 １０ｍｇ／ｍｌ卵白アルブミン（ＯＶＡ）を含む０．１
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）０．６ｍｌに８０ｍＭ
Ｎ−（６−マレイミドカプロイルオキシ）サクシンイミ
ド／Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド０．０６ｍｌを加
え、３０℃で３０分間保温した後、緩衝液Ｄ（５ｍＭ
ＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液，ｐＨ
６．０）で平衡化したセファデックスＧ−５０（商品
名）カラム（１×５ｃｍ）を用いて、遠心（１００×
ｇ，２分間）によりゲル濾過を行い、マレイミド化ＯＶ
Ａを得た。ＯＶＡの２８０ｎｍにおける吸光係数Ｅ２８
０＝０．７４ｇ^-1Ｌｃｍ^-1から算出したマレイミド化Ｏ
ＶＡ濃度は１．３８×１０^-4Ｍであった。導入されたマ
レイミド基数はＯＶＡ１分子あたり平均８．４分子であ
った。 （２）ＡＭＰＤ−ＯＶＡ複合体の調製 実施例１で得られたＡＭＰＤ１．２ｍｇを緩衝液Ｄ３ｍ
ｌに溶解後、ミリポアフィルターで濾過した。４，４−
ジチオジピリジンの還元を指標としてチオール基を定量
し、該チオール基濃度（０．４５ｍＭ）をＡＭＰＤ濃度
とした。このＡＭＰＤ溶液１．４８ｍｌ（６６７ｎｍｏ
ｌ）を、上記（１）で得られたマレイミド化ＯＶＡ溶液
０．４８４ｍｌ（６６．７ｎｍｏｌ）に加え、４℃で２
０時間保温した後、緩衝液Ｄに溶解した０．１Ｍ ２−
メルカプトエチルアミン塩酸塩１８．６４μｌを加え、
３０℃で１５分間保温した。次いで、緩衝液Ａ（０．１
ｍＭ ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝
液，ｐＨ７．０）で平衡化したセファデックスＧ−２５
カラム（１×３０ｃｍ）を用いて、ゲル濾過を行い、Ａ
ＭＰＤ−ＯＶＡ複合体を得た。マレイミド基の減少から
算出された結合ＡＭＰＤ分子数は、ＯＶＡ１分子あたり
平均６．８分子であった。卵白アルブミンの２８０ｎｍ
における吸光度から算出されたＡＭＰＤ−ＯＶＡ複合体
濃度は０．４１４ｍｇ／ｍｌであった。

【００７７】実施例４ 抗ＡＭＰＤポリクローナル抗体
の調製 （１）抗血清の取得 完全フロイントアジュバント（ＦＣＡ）１．２ｍｌを５
ｍｌのガラス注射筒に注入した後、実施例３で得られた
ＡＭＰＤ−ＯＶＡ複合体１．２ｍｌを該注射筒に注入し
て乳化させた。これをテルモシリンジ注射針付ツベルク
リン用注射筒（ＳＳ−０１Ｔ２６１３Ｓ）に０．５ｍｌ
ずつ分注した。雌性ウサギ（日本白色種、体重２．７〜
２．８ｋｇ）３羽に、上記のように調製した乳化したＡ
ＭＰＤ−ＯＶＡ複合体をそれぞれ１００μｇ皮内投与し
た。３週間間隔で、乳化したＡＭＰＤ−ＯＶＡ複合体１
００μｇを２回皮内投与して追加免疫を行った。最終免
疫の１週間後にネンブタール麻酔下、頚動脈より全血を
採取した。得られた血液を室温で２．５時間保温後、２
０００×ｇ（４０００ｒｐｍ）で１０分間遠心して抗血
清を得た。 （２）ＩｇＧ画分、Ｆ（ａｂ’）₂ およびＦａｂ’の調
製 室温で攪拌しながら、上記（１）で得られた各血清１０
ｍｌにそれぞれ硫酸ナトリウム（１．８ｇ）を少量ずつ
添加し、溶解後さらに３０分間攪拌した後、室温、５５
００×ｇ（７０００ｒｐｍ）で１５分間遠心分離した。
沈殿を１７．５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．３）５ｍｌ
に溶解させ、同緩衝液１Ｌに対して４℃で５時間透析し
た後、透析外液を交換してさらに一夜透析した。上清を
１７．５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．３）で平衡化した
ＤＥ５２−セルロースカラム（１．５×７ｃｍ）のクロ
マトグラフィーに付し、ＩｇＧ画分（ウサギ１ＩｇＧ，
ウサギ２ＩｇＧおよびウサギ３ＩｇＧ）を得た。各ウサ
ギの最終体重、血清量、ＩｇＧ濃度を表１に示す。得ら
れた３種の抗ＡＭＰＤウサギＩｇＧ５ｍｇを０．１Ｍ
塩化ナトリウムを含む０．１Ｍ 酢酸ナトリウム（ｐＨ
４．５）３００ｍｌで一夜透析した後、２８０ｎｍにお
ける吸光度を測定してＩｇＧ濃度を算出した。透析内液
にＩｇＧの１／５０量の１ｍｇ／ｍｌペプシン溶液を加
え、３７℃で１５時間保温した後、緩衝液Ｄで平衡化し
たUltrogel AcA44（商品名）カラム（１．５×４５ｃ
ｍ）によるゲル濾過を行い、Ｆ（ａｂ’）₂ を得た。各
ウサギ由来のＦ（ａｂ’）₂ 濃度を表１に示す。各Ｆ
（ａｂ’）₂ 溶液をCentricon-30（商品名）を用いて４
℃、４０００×（６０００ｒｐｍ）で１０分間遠心し、
濃縮した。該濃縮液０．６０ｍｌに緩衝液Ｄに溶解した
２−メルカプトエチルアミン塩酸塩６６．７μｌを加
え、３７℃で１．５時間保温した後、緩衝液Ｄで平衡化
したセファデックスＧ−５０カラム（１×５ｃｍ）を用
いて遠心（１００×ｇ，２分間）によるゲル濾過を行
い、Ｆａｂ’を得た。各ウサギ由来のＦａｂ’濃度、Ｆ
ａｂ’のチオール基濃度およびＦａｂ’１分子あたりの
チオール基数を表１に示す。

【００７８】

【表１】

【００７９】実施例５ ハプテン基の解析 実施例４で得られたウサギ２由来抗ＡＭＰＤＩｇＧが認
識するハプテン基の解析を、競合法によるＥＩＡを用い
て行った。すなわち、該ＩｇＧを固相化した後、ＦＴＹ
７２０またはその類似体とＨＲＰ標識ＡＭＰＤとを競合
的に反応させ、ｏ−フェニレンジアミンを水素供与体と
して固相に結合したＨＲＰ活性を測定し、各化合物につ
いて比較した。その結果を表２に示す（各化合物に対す
る交叉反応性は、ＦＴＹ７２０の固相への結合度を１０
０としたときの各化合物の相対結合度として示してい
る）。なお、ＥＩＡの詳細については後記実施例７にて
説明する）。

【００８０】

【表２】

【００８１】ＦＴＹ７２０のジオール部をモノオールに
変換した化合物[13]、ジオール部をすべてアセチル化し
た化合物[14]およびアミノ基をアセチル化およびジメチ
ル化した化合物[15]および[16]に対しては、該抗体（Ｆ
ａｂ’）はほとんどあるいは全く交叉反応性を示さなか
った（表２．Ａ）。また、ベンゼン環を有しない化合物
[17]〜[19]に対しても該抗体はほとんどあるいは全く交
叉反応性を示さなかった（表２．Ｂ）。さらに、該抗体
は２−アミノ−プロパン−１，３−ジオール部とベンゼ
ン環の間の炭素数も認識し、２−アミノ−２−（２−フ
ェニルエチル）プロパン１，３−ジオール基に対して特
に高い親和性を示すことが明らかとなった（表２．
Ｃ）。

【００８２】実施例６ 抗ＡＭＰＤモノクローナル抗体
の調製 （１）脾細胞およびミエローマ細胞の調製 実施例４で調製した乳化ＡＭＰＤ−ＯＶＡ複合体１００
μｇを雌性ＢＡＬＢ／ｃマウス（８週齢）に腹腔内注射
する。初回免疫から２週間毎に、等量の不完全フロイン
トアジュバント（ＦＩＡ）で乳化したＡＭＰＤ−ＯＶＡ
１００μｇを２回腹腔内注射して追加免疫を行う。２週
間後、１０倍量のＦＩＡ乳化ＡＭＰＤ−ＯＶＡ複合体
（１ｍｇ）を皮内投与し、さらに最終免疫としてＦＩＡ
乳化ＡＭＰＤ−ＯＶＡ複合体２００μｇを尾静脈より静
注し、その３日後にマウスを安楽死させて開腹し、脾臓
を摘出する。脾臓をピンセットでほぐして脾細胞を無血
清のダルベッコ氏改変イーグルズ最少必須培地（Ｄ−Ｍ
ＥＭ：ＧＩＢＣＯ社製）に懸濁する。脾細胞浮遊液中の
赤血球を、０．８３％塩化アンモニウム溶液（９容量）
と０．１７Ｍ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．６５，１容
量）との混液で５分間処理して破壊し、遠心分離により
除去する。ミエローマ細胞として市販のマウスミエロー
マ細胞Ｐ３×６３ＡｇＢＵ・１（大日本製薬）を一旦増
殖させた後液体窒素中で凍結保存し、これを融解後さら
に増殖させて細胞融合に供する。該細胞の培養には１０
％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）含有Ｄ−ＭＥＭを用いる。上
記のように調製した脾細胞およびミエローマ細胞浮遊液
は、Ｄ−ＭＥＭで数回洗浄した後細胞融合に供する。 （２）細胞融合およびハイブリドーマの選択 ミエローマ細胞（４×１０⁷ 個）浮遊液に脾細胞（２×
１０⁸ 個）浮遊液を加え、該混液を５０ｍｌプラスチッ
ク管（コーニング・グラス・ワークス社製５０ｍｌコー
ニング遠心管）中でよく混合する。培地を遠心分離によ
り除去し、細胞を水浴中で３７℃に加温する。この細胞
に、４５％ポリエチレングリコール（平均分子量４，０
００；メルク社製）溶液１ｍｌを振り混ぜながら１分間
かけて徐々に加え、混合物を室温で５分間放置する。反
応混合物に５分間かけてＤ−ＭＥＭ１５ｍｌを滴加して
細胞融合反応を停止させ、大量のＤ−ＭＥＭを加えた後
混合物を遠心分離して上清を除去する。残渣に１５％Ｆ
ＢＳ（センタウラス社製、Ｌｏｔ７５７）、２ｍＭグル
タミン、２×１０^-5Ｍ ２−メルカプトエタノール、１
００μｇ／ｍｌ硫酸ストレプトマイシン、１００Ｕ／ｍ
ｌペニシリンＧ、８０μｇ／ｍｌ硫酸ゲンタマイシンお
よびファンギゾン（アンホテリシンＢ；ＧＩＢＣＯ社
製）を補ったＤ−ＭＥＭよりなる完全培地（以下、ＣＭ
という）を加える。混合物を少し混ぜた後、生じた融合
細胞浮遊液を、２４ウェルのプレート（ヌンク社製）１
０枚に、脾細胞が１ウェルあたり１×ｌ０⁶ 個となるよ
うに１ウェルに１ｍｌずつ分注し、５％炭酸ガス気中、
３７℃で１日培養した後、アミノプテリン（４×１０^-7
Ｍ）、チミジン（１．６×１０^-5Ｍ）およびヒポキサン
チン（１×１０^-4Ｍ）を含有するＣＭ（ＨＡＴ培地）１
ｍｌを各ウェルに添加する。１日後、各ウェルから半量
の培地を吸引除去し、新鮮なＨＡＴ培地を添加する。そ
の後２日または３日毎に同様の培地交換を続ける。 （３）抗ＡＭＰＤ抗体産生ハイブリドーマのスクリーニ
ングおよびクローニング 上記選択培地での培養により生育したハイブリドーマコ
ロニーについてＥＬＩＳＡ法にて所望の抗体産生の有無
を調べる。すなわち、実施例３において、ＯＶＡの代わ
りにウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）をキャリアータンパ
ク質として用い、同様にして調製されたＡＭＰＤ−ＢＳ
Ａ複合体（２０μｇ／ｍｌ緩衝液Ａ）を９６ウェルのプ
レートに１０μｌずつ添加して３７℃で２時間静置し、
固相に吸着させる。該プレートの各ウェルに各ハイブリ
ドーマコロニーの培養上清を３０μｌずつ添加して３７
℃で２時間静置する。反応液を吸引除去し、１％ＢＳＡ
含有ＰＢＳで洗浄後、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＡ＋Ｉｇ
Ｇ＋ＩｇＭ（Ｈ＋Ｌ鎖）抗体（カッペル社製）の２００
０倍希釈液を加え、３７℃で１時間放置する。反応液を
吸引除去し、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで洗浄後、常法の発
色反応によりＨＲＰ活性を測定して陽性細胞群を得る。
ＡＭＰＤ物質およびＦＴＹ７２０に対して特異的である
かどうかは、上記のＡＭＰＤ−ＢＳＡをコーティングし
たプレートにＡＭＰＤまたはＦＴＹ７２０溶液（１％Ｂ
ＳＡ含有ＰＢＳ１ｍｌ中１００μｇ）を各ウェル１０μ
ｌずつ添加し、さらに上記陽性細胞の培養上清３０μｌ
を加えて上記と同様の反応を行い、固相に結合したＨＲ
Ｐ活性の減少を指標にして判定する。ＡＭＰＤおよびＦ
ＴＹ７２０の両方と反応する抗体は、両化合物に共通す
る２−アミノ−２−（２−フェニルエチル）プロパン−
１，３−ジオール基のある部位をハプテン基として認識
することが示唆される。該抗体を産生するハイブリドー
マのうち特に抗体価の高いウェルの細胞について、ＢＡ
ＬＢ／ｃマウスの胸膜細胞をフィーダー層（５×１０⁶
細胞／ｍｌ）として用いた９６ウェル平底マイクロプレ
ート（ヌンク社製）を用いて限界希釈法によりクローニ
ング操作を行い、ＡＭＰＤおよびＦＴＹ７２０と特異的
に反応するモノクローナル抗体を産生するハイブリドー
マクローンを得る。 （４）抗体クラスの特定 上記（３）で得られるハイブリドーマクローンが産生す
る抗体クラスを、Mouse monoAb ID/SP Kit（Ｚｙｍｅｄ
社製）を用いて以下のように調べる。各クローンをそれ
ぞれ１０％ＦＢＳ含有ＣＭ中で、５％炭酸ガス気中、３
７℃の条件で培養する。得られた培養上清を６群に分
け、それぞれにＩｇＧ₁ ，ＩｇＧ_2a，ＩｇＧ_2b，ＩｇＧ
₃ ，ＩｇＡまたはＩｇＭに対する抗体のいずれか１つを
添加して４９２ｎｍでの吸光度を測定し、標準ウサギ血
清の吸光度に対する各群の吸光度の比が５以上のものを
陽性と判定する（ネガティブコントロールとして、マウ
スミエローマＰ３×６３ＡｇＢＵ・１を用いる）。 （５）抗体の単離精製 ２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカンを投与
して免疫抑制状態にした雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔
内にハイブリドーマを１マウスあたり１×１０ ⁷ 個移植
し、１０〜１４日後に腹水を採取する。該腹水を５０％
飽和硫安で分画した後、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
８．０）に対して透析し、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
８．０）で平衡化したＤＥＡＥセルロースカラムクロマ
トグラフィーに付し、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．
０）中、ＮａＣｌの連続濃度勾配法で溶出させ、モノク
ローナル抗体のイムノグロブリンクラス画分を回収す
る。

【００８３】実施例７ ＦＴＹ７２０のエンザイムイム
ノアッセイ（直接法１） （１）ＨＲＰ標識ＡＭＰＤの調製 １０ｍｇ／ｍｌ ＨＲＰを含む０．１Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ７．０）１．７８ｍｌに３０ｍＭ Ｎ−（６−マ
レイミドカプロイルオキシ）サクシンイミド／Ｎ，Ｎ−
ジメチルホルムアミド０．１７８ｍｌを加え、３０℃で
１時間保温した後、緩衝液Ｄで平衡化したセファデック
スＧ−２５カラム（１×３０ｃｍ）によるゲル濾過を行
い、マレイミド化ＨＲＰを得た。ＨＲＰの４０３ｎｍに
おける吸光係数Ｅ４０３＝２．２７５ｇ^-1Ｌｃｍ^-1から
算出されたマレイミド化ＨＲＰ濃度は１３４μＭであっ
た。導入されたマレイミド基数は、ＨＲＰ１分子あたり
平均０．９３分子であった。このマレイミド化ＨＲＰ
０．５６６ｍｌ（２００ｎｍｏｌ）に、３．５１ｍＭ
ＡＭＰＤ水溶液０．１４７ｍｌ（５１６ｎｍｏｌ）を加
え、室温で１時間保温した後、反応液０．５５３ｍｌに
緩衝液Ｄ０．３９４ｍｌを混和し、該混液０．６ｍｌを
緩衝液Ｄで平衡化したセファデックスＧ−５０カラム
（１×５ｃｍ）を用いた遠心（１００×ｇ，２分間）に
よるゲル濾過に付して過剰量のＡＭＰＤを除去した。次
いで、濾液０．７８４ｍｌに緩衝液Ｄに溶解した０．１
Ｍ ２−メルカプトエチルアミン塩酸塩７．８４μｌを
加え、室温で１５分間保温した後、緩衝液Ａ５００ｍｌ
に対して２日間透析し、ＨＲＰ標識ＡＭＰＤを得た
（１．６１ｍｇ／ｍｌ）。マレイミド基の減少から算出
した結合ＡＭＰＤ分子数はＨＲＰ１分子あたり平均１．
０分子であった。 （２）固相化ウサギ抗ＡＭＰＤＩｇＧポリクローナル抗
体の調製 実施例４の（２）で調製したウサギ２由来抗ＡＭＰＤＩ
ｇＧのＰＢＳ溶液をＥＬＩＳＡ用プレートＳ（ＭＳ−３
４９６Ｆ；住友ベークライト社製）に分注し、４℃で一
夜静置して固相化した。溶液を吸引除去した後プレート
をＰＢＳで３回洗浄した。 （３）抗原抗体反応 上記のプレートに１％ＢＳＡ含有ＰＢＳを満たして３７
℃で３０分間放置してブロッキングを行った後、該溶液
を除去した。該プレートの各ウェルに、１％ＢＳＡ含有
ＰＢＳで系列希釈した標準ＦＴＹ７２０溶液および上記
（１）で調製したＨＲＰ標識ＡＭＰＤを１％ＢＳＡ含有
ＰＢＳで２×１０⁵ 倍希釈した液を各１００μｌずつ添
加して、プレートミキサーで１０秒間攪拌した後４℃で
一夜放置した。 （４）ＨＲＰ活性測定 反応液を吸引除去し、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０（商
品名）含有ＰＢＳで各ウェルを２回洗浄した後、酵素基
質溶液［ｏ−フェニレンジアミンと３０％過酸化水素水
をMcllvaine 緩衝液（０．１Ｍリン酸水素二ナトリウ
ム，０．１Ｍクエン酸，ｐＨ５．４）に溶解したもの］
を分注し、３０分間室温で反応させた（酵素基質溶液は
使用直前に調製した）。４Ｎ硫酸５０μｌを添加して反
応を停止させ、酵素基質溶液を対照として、マルチスキ
ャン（商品名：タイターテック社製）により４９２ｎｍ
における反応液の吸光度を測定した。得られた吸光度の
数値をＦＴＹ７２０濃度に対してプロットした結果、検
量線が直線性を示した上限（定量可能上限）は４５ｎｇ
／ｍｌであった。また、ラットブランク血清８例を本測
定法で測定した時の標準偏差の２倍以上の特異シグナル
を与える標準血清中のＦＴＹ７２０濃度（検出限界）は
０．４５ｎｇ／ｍｌであった。

【００８４】実施例８ ＦＴＹ７２０物質のエンザイム
イムノアッセイ（間接法１） １７．２ｍｇ／ｍｌヤギ（抗ウサギＩｇＧ）ＩｇＧ抗体
（２９．０７μｌ）に０．１％アジ化ナトリウムを含む
０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）５ｍｌを加え、
０．１ｍｇ／ｍｌとした。該溶液にポリスチレンビーズ
（約３００個）を入れ、４℃で一夜保温した。保温後、
ＩｇＧ溶液を吸引により除去し、緩衝液Ｃ（０．１％Ｂ
ＳＡ，１ｍＭ塩化マグネシウム，０．１％アジ化ナトリ
ウムを含む緩衝液Ａ）にて１０回洗浄後、緩衝液Ｃ中で
４℃にて一夜保温した。０．２％ウサギ２由来抗ＡＭＰ
ＤＩｇＧのＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液と標準ＦＴＹ７２０溶
液（０，１，１０ｎｇ／ｍｌ）を、試験管に５０μｌず
つ加え、４℃で４時間保温した後、実施例７の（１）で
調製したＨＲＰ標識ＡＭＰＤ５０μｌを加えて４℃で一
夜保温した。この溶液に、上記のように調製したヤギ
（抗ウサギＩｇＧ）ＩｇＧ不溶化ポリスチレンビーズ
（３個）を加え、２０℃で３時間保温した後、溶液を除
去し、ビーズを緩衝液Ａで洗浄した。該ビーズ（３個）
に結合したＨＲＰ活性を実施例７の（４）と同様に測定
した。その結果、本アッセイ系の定量可能範囲は１０〜
１０００ｎｇ／ｍｌであった。

【００８５】実施例９ ＦＴＹ７２０物質のエンザイム
イムノアッセイ（直接法２） （１）ＨＲＰ標識抗ＡＭＰＤＩｇＧポリクローナル抗体
Ｆａｂ’の調製 実施例７の（１）と同様にしてマレイミド化ＨＲＰを調
製した。ＨＲＰの４０３ｎｍにおける吸光係数Ｅ４０３
＝２．２７５ｇ^-1Ｌｃｍ^-1から算出されたマレイミド化
ＨＲＰ濃度は８２．５μＭであった。導入されたマレイ
ミド基数は、ＨＲＰ１分子あたり平均１．８５分子であ
った。実施例４の（２）で調製した各ウサギ抗ＡＭＰＤ
ＩｇＧポリクローナル抗体のＦａｂ’（ウサギ１＝０．
５５ｍｌ，ウサギ２＝０．５４ｍｌ，ウサギ３＝０．５
６ｍｌ）に、上記のマレイミド化ＨＲＰ（ウサギ１＝
０．４１７ｍｌ，ウサギ２＝０．３９８ｍｌ，ウサギ３
＝０．４７２ｍｌ）を加えて攪拌した後、Centricon-30
（商品名）を用いて４℃、４０００×ｇ（６０００ｒｐ
ｍ）で１０分間遠心して濃縮した。濃縮液を４℃で一夜
保温した後、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平
衡化したUltrogel AcA44（商品名）カラム（１．５×４
５ｃｍ）によるゲル濾過を行い、ＨＲＰ標識Ｆａｂ’画
分を得た。 （２）ＡＭＰＤ−ＢＳＡ複合体の調製 １０ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡを含む０．１Ｍリン酸ナトリウ
ム緩衝液（ｐＨ７．０）０．６ｍｌに３０ｍＭ Ｎ−
（６−マレイミドカプロイルオキシ）サクシンイミド／
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド０．０６ｍｌを加え、３
０℃で３０分間保温した後、緩衝液Ｄで平衡化したセフ
ァデックスＧ−５０カラム（１×５ｃｍ）を用いて、遠
心（１００×ｇ，２分間）によりゲル濾過を行い、マレ
イミド化ＢＳＡを得た。ＢＳＡの２８０ｎｍにおける吸
光係数Ｅ２８０＝０．６３ｇ^-1Ｌｃｍ^-1から算出したマ
レイミド化ＢＳＡ濃度は１．０１×１０^-4Ｍであった。
導入されたマレイミド基数はＢＳＡ１分子あたり平均１
０．１分子であった。一方、実施例１で得られたＡＭＰ
Ｄ１．２ｍｇを緩衝液Ｄ３ｍｌに溶解後、ミリポアフィ
ルターで濾過して０．４５ｍＭ ＡＭＰＤ溶液を調製し
た。このＡＭＰＤ溶液１．０１ｍｌ（４５５ｎｍｏｌ）
を、マレイミド化ＢＳＡ溶液０．４５０ｍｌ（４５．３
ｎｍｏｌ）に加え、４℃で２０時間保温した後、緩衝液
Ｄに溶解した０．１Ｍ ２−メルカプトエチルアミン塩
酸塩１４．６０μｌを加え、３０℃で１５分間保温し
た。次いで、緩衝液Ａで平衡化したセファデックスＧ−
２５カラム（１×３０ｃｍ）を用いてゲル濾過を行い、
ＡＭＰＤ−ＢＳＡ複合体を得た。マレイミド基の減少か
ら算出された結合ＡＭＰＤ分子数は、ＢＳＡ１分子あた
り平均９．６分子であった。ＡＭＰＤ−ＢＳＡ複合体濃
度は０．５７９ｍｇ／ｍｌであった。 （３）抗原抗体反応およびＨＲＰ活性測定 上記（２）で得られたＡＭＰＤ−ＢＳＡ複合体［１０μ
ｇ／ｍｌ緩衝液Ｅ（０．１％アジ化ナトリウムを含む
０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液，ｐＨ７．５）］を１
０μｇ／ｍｌＢＳＡ含有緩衝液Ｅで３００倍希釈した液
０．１５ｍｌをＥＬＩＳＡ用プレートの各ウェルに加え
て４℃で一夜保温した。該溶液を除き緩衝液Ａ０．２ｍ
ｌで４回洗浄した後、緩衝液Ｂ（０．１％ＢＳＡ含有緩
衝液Ａ）０．２ｍｌを加えて室温で２時間保温した。こ
れとは別に、緩衝液Ｂで系列希釈した標準ＦＴＹ７２０
溶液７５μｌと上記（１）で得られたＨＲＰ標識Ｆａ
ｂ’（５μｇ／ｍｌ緩衝液Ｅを緩衝液Ｂで１ｎＭに希
釈）７５μｌを試験管に加えて４℃で一夜保温した後、
該反応混液を上記のプレートに加え、４℃で６時間保温
した。反応混液を除去し、緩衝液Ａ０．２５ｍｌで４回
洗浄した後、固相中のＨＲＰ活性を実施例７の（４）と
同様にして測定した。その結果、本アッセイ系の定量可
能範囲は６０〜１００００ｐｇ／ｍｌであった。

【００８６】

【発明の効果】本発明の抗体および免疫測定法を用いれ
ば、簡便且つ高感度に生体試料中のＦＴＹ７２０物質を
検出することができるので、ＦＴＹ７２０物質を投与さ
れた臓器移植患者や自己免疫疾患患者における同物質の
体内動態を容易にモニタリングでき、移植における拒絶
反応の持続的抑制および自己免疫疾患の治療にきわめて
有用である。

【図面の簡単な説明】

【図１】ＡＭＰＤ合成の全工程を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｃ 323/41 Ｃ０７Ｃ 323/41 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/08 15/02 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ Ｃ１２Ｐ 21/08 33/531 Ａ Ｇ０１Ｎ 33/53 33/577 Ｂ 33/531 Ａ６１Ｋ 39/00 Ｈ 33/577 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ // Ａ６１Ｋ 39/00 15/00 Ｃ (72)発明者 内田 秀治 大阪府豊中市曽根西町４丁目13番２号 (72)発明者 河野 武幸 京都府京都市左京区下鴨宮崎町128−138 (72)発明者 広瀬 良治 兵庫県神戸市長田区東尻池新町１番26号 台糖株式会社研究所内

Claims (30)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 一般式 【化１】 （式中、ｋ，ｍおよびｎはそれぞれ独立して１〜２０の
   整数であり、Ｘは直接結合，−ＣＯＮＨ−，−Ｏ−また
   は−ＮＨ−を表す）により表されるチオール化合物また
   はその保護体あるいはそれらの塩。
2. 【請求項２】 式中、ｋが１〜３の整数、ｍおよびｎが
   それぞれ独立して１〜８の整数であり、Ｘが直接結合を
   表す請求項１記載の化合物またはその塩。
3. 【請求項３】 式中、ｋが１〜３の整数、ｍおよびｎが
   それぞれ独立して１〜４の整数であり、Ｘが直接結合を
   表す請求項１記載の化合物またはその塩。
4. 【請求項４】 式中、ｋが１、ｍおよびｎがそれぞれ独
   立して１〜４の整数であり、Ｘが直接結合を表す請求項
   １記載の化合物またはその塩。
5. 【請求項５】 ２−アミノ−２−（アリールアルキル）
   プロパン−１，３−ジオール基含有化合物および免疫学
   上許容される担体を含む免疫原性を有する複合体。
6. 【請求項６】 ２−アミノ−２−（アリールアルキル）
   プロパン−１，３−ジオール基のアルキル基が２〜４個
   の炭素原子を有し、および／またはアリール基がフェニ
   ルおよび炭素数２〜８個の直鎖状または分枝鎖状のアル
   キルによって置換されたフェニルからなる群より選択さ
   れるものである請求項５記載の免疫原性を有する複合
   体。
7. 【請求項７】 ２−アミノ−２−（アリールアルキル）
   プロパン−１，３−ジオール基が２−アミノ−２−（２
   −フェニルエチル）プロパン−１，３−ジオール基また
   は２−アミノ−２−（２−（炭素数２〜８個の直鎖状ま
   たは分枝鎖状のアルキル置換フェニル）エチル）プロパ
   ン−１，３−ジオール基である請求項５記載の免疫原性
   を有する複合体。
8. 【請求項８】 ２−アミノ−２−（アリールアルキル）
   プロパン−１，３−ジオール基に対して親和性を有する
   抗体。
9. 【請求項９】 ２−アミノ−２−（アリールアルキル）
   プロパン−１，３−ジオール基のアルキル基が２〜４個
   の炭素原子を有し、および／またはアリール基がフェニ
   ルおよび炭素数２〜８個の直鎖状または分枝鎖状のアル
   キルによって置換されたフェニルからなる群より選択さ
   れるものである請求項８記載の抗体。
10. 【請求項１０】 ２−アミノ−２−（アリールアルキ
    ル）プロパン−１，３−ジオール基が２−アミノ−２−
    （２−フェニルエチル）プロパン−１，３−ジオール基
    または２−アミノ−２−（２−（炭素数２〜８個の直鎖
    状または分枝鎖状のアルキル置換フェニル）エチル）プ
    ロパン−１，３−ジオール基である請求項８記載の抗
    体。
11. 【請求項１１】 モノクローナル抗体である請求項８〜
    １０のいずれかに記載の抗体。
12. 【請求項１２】 下記(a) 〜(f) の工程により取得する
    ことができるモノクローナル抗体： (a) ２−アミノ−２−（アリールアルキル）プロパン−
    １，３−ジオール基含有化合物と免疫学上許容される担
    体を反応させて免疫原性を有する複合体を生成させ、 (b) 該免疫原性を有する複合体で哺乳動物を１回または
    数回免疫して２−アミノ−２−（アリールアルキル）プ
    ロパン−１，３−ジオール基に対して親和性を有する抗
    体を産生させ、 (c) 該哺乳動物から抗体産生細胞を採取し、 (d) 該抗体産生細胞を株化させ、 (e) 該株化細胞から２−アミノ−２−（アリールアルキ
    ル）プロパン−１，３−ジオール基に対して親和性を有
    するモノクローナル抗体を産生する細胞をクローン化
    し、 (f) 該クローン化された細胞株から該モノクローナル抗
    体を採取する。
13. 【請求項１３】 ２−アミノ−２−（アリールアルキ
    ル）プロパン−１，３−ジオール基のアルキル基が２〜
    ４個の炭素原子を有し、および／またはアリール基がフ
    ェニルおよび炭素数２〜８個の直鎖状または分枝鎖状の
    アルキルによって置換されたフェニルからなる群より選
    択されるものである請求項１２記載のモノクローナル抗
    体。
14. 【請求項１４】 ２−アミノ−２−（アリールアルキ
    ル）プロパン−１，３−ジオール基が２−アミノ−２−
    （２−フェニルエチル）プロパン−１，３−ジオール基
    または２−アミノ−２−（２−（炭素数２〜８個の直鎖
    状または分枝鎖状のアルキル置換フェニル）エチル）プ
    ロパン−１，３−ジオール基である請求項１２記載のモ
    ノクローナル抗体。
15. 【請求項１５】 請求項１２〜１４のいずれかに記載の
    モノクローナル抗体を産生し得るハイブリドーマ。
16. 【請求項１６】 ２−アミノ−２−（アリールアルキ
    ル）プロパン−１，３−ジオール基含有化合物を、請求
    項８〜１４のいずれかに記載の抗体を用いて検出するこ
    とを特徴とする、生体試料中の２−アミノ−２−（アリ
    ールアルキル）プロパン−１，３−ジオール基含有化合
    物の測定方法。
17. 【請求項１７】 下記(a) 〜(c) の工程を含む生体試料
    中の２−アミノ−２−（アリールアルキル）プロパン−
    １，３−ジオール基含有化合物の測定方法： (a) 固相化された請求項８〜１４のいずれかに記載の抗
    体に、生体試料と、標識された２−アミノ−２−（アリ
    ールアルキル）プロパン−１，３−ジオール基含有化合
    物とを競合的に反応させた後、 (b) 固相と液相とを分離し、 (c) その一方に存在する標識量を測定する。
18. 【請求項１８】 下記(a) 〜(d) の工程を含む生体試料
    中の２−アミノ−２−（アリールアルキル）プロパン−
    １，３−ジオール基含有化合物の測定方法： (a) 請求項８〜１４記載のいずれかに記載の抗体に、生
    体試料と、標識された２−アミノ−２−（アリールアル
    キル）プロパン−１，３−ジオール基含有化合物とを競
    合的に反応させ、 (b) 該反応液を該抗体に対して親和性を有する固相化さ
    れた二次抗体とさらに反応させた後、 (c) 固相と液相とを分離し、 (d) その一方に存在する標識量を測定する。
19. 【請求項１９】 下記(a) 〜(d) の工程を含む生体試料
    中の２−アミノ−２−（アリールアルキル）プロパン−
    １，３−ジオール基含有化合物の測定方法： (a) 生体試料と、２−アミノ−２−（アリールアルキ
    ル）プロパン−１，３−ジオール基に対して親和性を有
    する標識された抗体とを反応させ、 (b) 該反応液を、固相化された２−アミノ−２−（アリ
    ールアルキル）プロパン−１，３−ジオール基含有化合
    物とさらに反応させた後、 (c) 固相と液相とを分離し、 (d) その一方に存在する標識量を測定する。
20. 【請求項２０】 下記(a) 〜(f) の工程を含む生体試料
    中の２−アミノ−２−（アリールアルキル）プロパン−
    １，３−ジオール基含有化合物の測定方法： (a) 生体試料と、請求項８〜１４のいずれかに記載の抗
    体とを反応させ、 (b) 該反応液を、固相化された２−アミノ−２−（アリ
    ールアルキル）プロパン−１，３−ジオール基含有化合
    物とさらに反応させた後、 (c) 固相と液相とを分離し、 (d) 固相に結合した抗体と、該抗体に対して親和性を有
    する標識された二次抗体とを反応させ、 (e) 液相を除去した後、 (f) 該固相上の標識量を測定する。
21. 【請求項２１】 ２−アミノ−２−（アリールアルキ
    ル）プロパン−１，３−ジオール基含有化合物の体液中
    レベルの測定方法である請求項１６〜２０のいずれかに
    記載の方法。
22. 【請求項２２】 ２−アミノ−２−（アリールアルキ
    ル）プロパン−１，３−ジオール基が２−アミノ−２−
    （２−フェニルエチル）プロパン−１，３−ジオール基
    または２−アミノ−２−（２−（炭素数２〜８個の直鎖
    状または分枝鎖状のアルキル置換フェニル）エチル）プ
    ロパン−１，３−ジオール基である請求項１６〜２１の
    いずれかに記載の方法。
23. 【請求項２３】 標識が酵素、蛍光物質および放射性同
    位元素からなる群より選択される請求項１７〜２２のい
    ずれかに記載の方法。
24. 【請求項２４】 下記(a) および(b) を含む生体試料中
    の２−アミノ−２−（アリールアルキル）プロパン−
    １，３−ジオール基含有化合物測定用キット。 (a) 請求項８〜１４のいずれかに記載の抗体 (b) 標識された２−アミノ−２−（アリールアルキル）
    プロパン−１，３−ジオール基含有化合物
25. 【請求項２５】 さらに請求項８〜１４のいずれかに記
    載の抗体に対して親和性を有する二次抗体を含む請求項
    ２４記載のキット。
26. 【請求項２６】 下記(a) および(b) を含む生体試料中
    の２−アミノ−２−（アリールアルキル）プロパン−
    １，３−ジオール基含有化合物測定用キット。 (a) 標識された請求項８〜１４のいずれかに記載の抗体 (b) 固相化可能な２−アミノ−２−（アリールアルキ
    ル）プロパン−１，３−ジオール基含有化合物
27. 【請求項２７】 下記(a) 〜(c) を含む生体試料中の２
    −アミノ−２−（アリールアルキル）プロパン−１，３
    −ジオール基含有化合物測定用キット。 (a) 固相化可能な２−アミノ−２−（アリールアルキ
    ル）プロパン−１，３−ジオール基含有化合物 (b) 請求項８〜１４のいずれかに記載の抗体 (c) 該抗体に対して親和性を有する標識された二次抗体
28. 【請求項２８】 ２−アミノ−２−（アリールアルキ
    ル）プロパン−１，３−ジオール基含有化合物の体液中
    レベルの測定用キットである請求項２４〜２７のいずれ
    かに記載のキット。
29. 【請求項２９】 ２−アミノ−２−（アリールアルキ
    ル）プロパン−１，３−ジオール基が２−アミノ−２−
    （２−フェニルエチル）プロパン−１，３−ジオール基
    または２−アミノ−２−（２−（炭素数２〜８個の直鎖
    状または分枝鎖状のアルキル置換フェニル）エチル）プ
    ロパン−１，３−ジオール基である請求項２４〜２８の
    いずれかに記載のキット。
30. 【請求項３０】 標識が酵素、蛍光物質および放射性同
    位元素からなる群より選択される請求項２４〜２９のい
    ずれかに記載のキット。