JP2001172200A - ヒトナプシンaに対する抗体およびこれを用いる医薬 - Google Patents
ヒトナプシンaに対する抗体およびこれを用いる医薬Info
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Abstract
る物質を探索し、当該物質に対する抗原を取得し、これ
を有効成分とする診断薬等の医薬を提供すること。 【解決手段】 ヒトナプシンAに対する抗体およびヒト
ナプシンAと、KLH、BSA、OVAまたはチオグロ
ブリンから選ばれる高分子蛋白とを結合させ、この結合
物で動物を免疫し、当該動物から脾細胞を取り出し、こ
れをミエローマ細胞と融合させ、得られたハイブリド−
マを培養し、抗体を採取することを特徴とする上記抗体
の採取法並びに上記抗体を有効成分とする医薬。
Description
対する抗体に関し、更に詳細には、ヒト原発性ガンの確
定判断に有用なヒトナプシンAに対する抗体およびこれ
を用いる医薬に関する。
するが、このうち、原発性ガンの発生を早期に発見し、
これを治療することは極めて重要である。肺癌について
も、原発性ガンの存在が知られており、原発性ガンの存
在を正確に見出すための手段が求められている。
肺組織を可溶化した後、2次元電気泳動を行うと、一定
の蛋白質が高頻度に出現することを知り、この蛋白をT
A01およびTA02と命名し、報告した( Hirano T
et. al.,1997, " Britsh J.Cancer ",75, 978-985 )。
のスポットとして得られたのみであり、その構造や、こ
れがヒト原発性肺癌のマーカーとなりうるかどうかにつ
いては、全く不明であった。
の蛋白、TA01およびTA02の構造を解析し、これ
をヒト原発性肺癌腫瘍マーカーとして使用できるかどう
かを探索し、更に使用可能な場合は当該蛋白に対する抗
原を取得し、これを有効成分とする医薬を提供すること
を課題とするものである。
のうち、TA02と命名されたものについて、そのアミ
ノ酸配列の分析を行っていたところ、そのN端のペプチ
ド配列が次の式、 Lys-Pro-Ile-Phe-Val-Pro-Leu-Ser-Asn-Tyr-Arg-Asp-Va
l-Gln-Tyr-Phe-Gly-Glu-Ile で表されるものであり、既に報告されていたヒトナプシ
ンAと呼ばれる蛋白と同一物であることを見出した。そ
して、常法によりこのヒトナプシンAと特定の高分子化
合物の結合物で動物を免疫して得た抗体は、ヒト原発性
肺癌組織に結合することを見出した。
抗体を提供するものである。
蛋白とを結合させ、この結合物で動物を免役し、当該動
物から脾細胞を取り出し、これをミエローマ細胞と融合
させ、得られたハイブリド−マを培養し、抗体を採取す
るヒト原発性肺癌に対する抗体の採取法を提供するもの
である。
る抗体を有効成分とする医薬を提供するものである。
プシンAは、肺や腎臓に存在するアスパラギン酸プロテ
ィナーゼとして既に報告されているものである(FFB
S レターズ、第441号、第43頁から第48頁(1
998))。しかし、上記報告中では、このものと癌、
特に原発性肺癌との関係については全く示唆されていな
い。
上記文献中に記載されているので、これに基づいて合成
しても良いが、例えばそのN端の配列、 Lys-Pro-Ile-Phe-Val-Pro-Leu-Ser-Asn-Tyr-Arg-Asp-Va
l-Gln-Tyr-Phe-Gly-Glu-Ile をコードする塩基配列を用意し、これをプライマーとし
て、例えば原発性肺腺癌を含む肺組織の切除材料からナ
プシンAのcDNAを取得し、これをPCR法等により
増幅した後、適当なベクターと宿主細胞を用いて発現さ
せることにより得ることもできる。
上記ヒトナプシンAを抗原として動物に投与し、当該動
物の抗血清として取得することもできるが、選択性の高
いモノクローナル抗体として得る場合は、例えば次のよ
うにすることが好ましい。
l-Gln-Tyr-Phe-Gly-Glu-Ile を有するポリペプチドを合成し、これを高分子蛋白と結
合させて、抗体を得るための抗原とする。この抗原で適
当な動物を免疫し、当該動物から脾細胞を取り出し、こ
れをミエローマ細胞と融合させ、得られたハイブリド−
マを培養することにより、ヒトナプシンAに対する抗体
を採取することができる。
の例としては、キーホール リンペット ヘモシアニン
(Keyhole limpet heamocyanin;KLH)、ボビン シ
ーラムアルブミン(Bvine serum albumin;BSA)、
オブアルブミン(Ovalbumin;OVA)、チオグロブリ
ン(thiogloburin)等を使用することができ、ポリペプチ
ドと高分子蛋白の結合は、マレイミド法、カルボジイミ
ド法、グルタールアルデヒド法等の公知の方法を利用す
ることができる。
細胞の採取、ミエローマ細胞との融合、更に抗体の採取
等はこの分野で公知の方法により実施することができ
る。
に対する抗体の代表例としては、後記実施例で得られる
モノクローナル抗体4B2が挙げられる。この抗体は、
例えば次のような性質を有するものである。
を有する。 下記のヒトガンの培養細胞株を始め、知られている
ガン培養細胞に対して陽性反応を示さない。 KATO−III、MKN−1、MKN−28、MKN−
45、PC−1、PC−3、PC−6、PC−7、PC
−9、P3HR−1、Raji イムノグロブリンのクラスは、IgG1である。
用して調製することができる医薬の一例としては、原発
性肺癌の診断薬が挙げられる。この診断薬は、本発明抗
体とヒト原発性肺癌との抗原抗体反応を利用し、肺生検
材料、喀痰、気管支洗浄液等を試料とし、通常の免疫学
的測定法により原発性肺癌の存在を見出すものである。
性肺癌に対する治療薬が挙げられる。この治療薬は、本
発明抗体と抗癌成分とを種々の手法で結合させた後、こ
れを患部に投与し、抗癌成分を原発性肺癌に集中的に作
用させ、癌を治療するというものである。
するに当たっても、公知の医薬担体や、抗癌成分を使用
することができ、その製造も常法に従えばよい。
ヒト原発性肺癌に特異的なペプチドであることが解明さ
れた。従って、このペプチドを抗原として作成された抗
体は、後記実施例で示すように、実質的に原発性肺癌と
のみ反応し、他の癌とは反応しない。従って、当該抗体
は、原発性肺癌を確定的に診断するための診断薬や、原
発性肺癌の治療剤の有効成分として利用可能となるので
ある。
するが、本発明はこれら実施例等により何ら制約される
ものではない。
ル調製および二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動に
よるTA02の採取:TA02を発現する高分化腺癌を
有する生物材料を外科的に切除し、これを非酵素的サン
プル調製手法を用いて処理した。具体的には、「エレク
トロフォレシス(Electrophoresis)」、第14巻、第
1045頁〜第1053頁(1993)および同、第1
5巻、第382頁〜第390頁(1994)の記述に従
って、二次元電気泳動(2−DE)と組み合わせた非酵
素的サンプル調製手法を実施した。100μgの蛋白質
に相当する試料を等電点電気泳動(IEF)にかけ、プ
ロテインII(Protein II)セル(バイオ−ラッド社
製)および1000/500型電源(バイオ−ラッド社
製)を用いて800Vで14.5時間、1000Vで1
時間かけて分離・濃縮させた。IEFののち、IEFゲ
ルを直線勾配の10−13%SDSポリアクリルアミド
ゲルに載せ、10℃で10mA/ゲルを用いて一夜電気
泳動した。
析:二次元電気泳動を行ったのち、「ネイチャー(Natu
re)」、第227号、第680頁〜第685頁(197
0)に記述されたウェスタンブロット法を用いて、TA
02ポリペプチドをイモビロン(Immobilon)ポリ弗化
ビニリデン(PVDF)膜(ミリポア社製)へ移した。
PVDF膜上のTA02スポットを、クマジ−ブリリア
ントブル−染色法を用いて可視化した。つぎに、膜を乾
燥後、TA02スポットを取り出し、TA02ポリペプ
チドを採取した。TA02ポリペプチドをシ−クエンサ
−にかけて、N末端のアミノ酸配列を分析した。
番目のアミノ酸を除く30個のアミノ酸の配列を決定す
ることができた。それは次の通りであった。KPIPV
PLSNYRDVQYFGEIGLGTPPQ( )F
YV
生および精製:免疫感作には、TA02のN端(K)よ
り18番目(I)の内部アミノ酸配列に対応する合成ペ
プチド(KPIFVPLSNYRDVQYFGEIC)
を用いた。このペプチドをウシチログロブリンに結合さ
せ、不完全アジュバントと混合し、マウス(BALB/
c)に皮下注射した。
X63−Ag8−653細胞との間のポリエチレングリ
コ−ル介在細胞融合を誘発させ(「ジャパン・ジャーナ
ル・オブ・キャンサー・リサーチ(Jpn. J. Cancer Re
s)」、第85号、第918頁〜第926頁)、抗原被
覆イライザ(ELISA)プレ−トを用いてハイブリド
−マ細胞のスクリ−ニングを行った。10%FCS添加
RPMI1640中で陽性クロ−ンを培養して、抗体を
産生させた。この培地から、抗原ペプチド結合アフィニ
ティ−カラムを用いてモノクロ−ナル抗体(mAb)を
抽出し、精製した。
り、それぞれmAb−4B2、34D1、22Aおよび
6A1と名付けた。ウェスタンブロット分析での反応性
に基づいて、mAb−4B2を選択し、その後の実験に
はこのクロ−ンを用いた。高分化肺腺癌の原発巣を2D
E処理後、電気泳動でPVDF膜(ミリポア社製)へ移
動させ、mAb−4B2でウェスタンブロットを行っ
た。その結果、TA02と同一スポットがmAb−4B
2と反応することが確認された。
2DE後、PVDF膜へ移動させたものを同一サンプル
で2種類用意した。片方については銀染色によって蛋白
の存在を確認した(図1中、左側)。また他方は、mA
b−4B2によるウエスタンブロッティングによって抗
体の認識部位を調べた(図1中、右側)。そしてこれら
の結果を重ね合わせると、TA02およびTA01はm
Ab−4B2で認識される分子と同一であることが明ら
かとなった(図1中、下)。
(RT−PCR)による分析ならびにAおよびB転写産
物の識別:TA02のアミノ酸配列の結果によれば、T
A02は、ヒトアスパラギン酸プロテイナ−ゼの一つの
タイプであるナプシンと相同であると考えられた。外科
的に切除した原発性肺腺癌材料およびラジ(Raji)細胞
(バ−キットリンパ腫細胞株)から全RNAを調製し、
第一鎖cDNAを、第一鎖cDNA合成キット(アマシ
ャム・ファルマシア・バイオテック社製)を用いて生成
させた。
cDNA配列(FEBSレターズ、第441号、第43
頁〜第48頁、(1998))に基づいて合成したフォ
ワ−ドプライマ−(5'−GACTATTGGTGGA
ATCAAGGGTG−3':NAP−3)およびリバ
−スプライマ−(5'−GTCAGGCTTATCCA
ATAG−3':NAP−4)を用いてのポリメラ−ゼ
連鎖反応(PCR)により、プロナプシンA/B cD
NAの465−648領域を増幅させた。
めに、ナプシンB cDNAのみに特異的制限部位を有
する(FEBSレターズ、第441号、第43頁〜第4
8頁、(1998))MspA1を用いてPCR産物を
消化した。消化後、2%アガロ−スゲル電気泳動により
断片を分析した。
(TA02分子の高度発現が確認される)およびラジ細
胞において、ナプシンA/B転写産物の発現を検出し
た。TA02発現肺腺癌の塩基対465−648の領域
からのRT−PCR産物はMspA1によっては消化さ
れなかったが、ラジ細胞からのRT−PCR産物は代謝
された。この消化分析は、蛋白質レベルでTA02を発
現する原発性肺腺癌はナプシンA mRNAをも発現
し、ラジ細胞はナプシンB mRNAを発現したことを
明らかにしている。なぜなら、MspA1はナプシンB
cDNAのみに特異的制限部位を有しているからであ
る。
での発現:発表されているヒトプロナプシンA cDN
A配列(FEBSレターズ、第441号、第43頁〜第
48頁、(1998))に基づいて合成したフォワ−ド
プライマ−(5'−GCGAATTCATGTCTCC
ACCACCGCTG−3':NAP−1)およびリバ
−スプライマ−(5'−CGCTCGAGGCGTCA
CCCGGGGAACTG−3':NAP−6)を用い
て、ヒト原発性肺腺癌の第一鎖cDNAからナプシンA
の全長cDNAを増幅させた。増幅産物をEcoRIお
よびXhoIで消化し、pGEX−4T−1ベクタ−
(アマシャム・ファルマシア・バイオテック社製)に挿
入し、E.coli JM109細胞の形質転換に用い
た。PCRによってクロ−ン化したナプシンA cDN
Aは完全に配列決定された。また、形質転換大腸菌JM
109から、これが発現したGST−ナプシン融合蛋白
質を得た。
体を用いての免疫検出:外科的に切除したヒト原発性肺
腺癌材料およびグルタチオンS−トランスフェラ−ゼ
(GST)−プロナプシンA融合蛋白質発現性大腸菌を
12.5%ポリアクリルアミドゲルにかけ、次に「ネイ
チャー(Nature)」、第227号、第680頁〜第68
5頁(1970)に記載されているSDS−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動法により分画し、電気泳動により
イモビロン(Immobilon)ポリ弗化ビニリデン(PVD
F)膜(ミリポア社製)へ移行させた。抗TA02mA
bで膜を免疫ブロットし、ECLウェスタン検出試薬キ
ット(アマシャム社製)を用いての強化化学発光検出法
により検出した。
すでに確認されている高分化腺癌を用いて、ウェスタン
ブロットおよび抗TA02モノクローナル抗体(mAb
−4B2)を用いての免疫検出を実施した。ウェスタン
ブロット分析では、mAb−4B2がGST−ナプシン
融合蛋白質を分子量約67kDaの分子として認識する
ことを確認した。
ルマリン固定・パラフィン包埋標本を用意し、これから
厚み4μmの組織切片を調製し、スライドガラス上に載
せた。脱パラフィン後、各標本を、抗TA02モノクロ
−ナル抗体(mAb−4B2)を用い、ABC法により
免疫組織化学的に染色した。この結果を表1および表2
に示す。
腺癌のうち47例(81.0%)が、顆粒性パタ−ンの
陽性染色を示した。とくに、高分化例では、低分化例と
比較して強い免疫活性を見ることができた。これに対
し、他の組織タイプの癌は、弱い発現を示した少数例の
大細胞癌を除いて、完全に陰性の染色を示した。
の細胞質および肺胞マクロファ−ジは、強度の顆粒性発
現パタ−ンを示した。また、腎尿細管ならびに膵外分泌
腺および膵管は、陽性の細胞質染色を示した。これらの
組織のいくつかでは、免疫活性は弱かったが、顆粒性発
現パタ−ンを観察することができた。他の器官では、顆
粒性発現パタ−ンを観察できなかった。
ヒト原発性肺癌に特異的なものであり、この癌の確定診
断のために有用であることが明らかとなった。
は、上記実施例で示すように、ほぼ原発性肺癌とのみ反
応し、他の癌とは反応しない。本発明抗体は、このよう
な特異性があるため、原発性肺癌を確定的に診断するた
めの診断薬や、原発性肺癌の治療剤としての利用が期待
される。
に出現するTA01およびTA02と呼ばれる蛋白を認
識することを電気泳動により確認した結果を示す写真。 以 上
Claims (5)
- 【請求項1】 ヒトナプシンAに対する抗体。
- 【請求項2】 N端に次の式、 Lys-Pro-Ile-Phe-Val-Pro-Leu-Ser-Asn-Tyr-Arg-Asp-Va
l-Gln-Tyr-Phe-Gly-Glu-Ile で表されるペプチド配列を有するポリペプチドを認識す
る、請求項第1項記載の抗体。 - 【請求項3】 ヒト原発性肺癌組織と特異的に結合する
ものである請求項第1項または第2項記載の抗体。 - 【請求項4】 ヒトナプシンAと、キーホール リンペ
ット ヘモシアニン、ボビン シーラム アルブミン、オ
ブアルブミンまたはチオグロブリンから選ばれる高分子
蛋白とを結合させ、この結合物で動物を免疫し、当該動
物から脾細胞を取り出し、これをミエローマ細胞と融合
させ、得られたハイブリド−マを培養し、抗体を採取す
ることを特徴とするヒトナプシンAに対する抗体の採取
法。 - 【請求項5】 請求項第1項ないし第2項の何れかの項
に記載の抗体を有効成分とする医薬。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP35889199A JP2001172200A (ja) | 1999-12-17 | 1999-12-17 | ヒトナプシンaに対する抗体およびこれを用いる医薬 |
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JP35889199A JP2001172200A (ja) | 1999-12-17 | 1999-12-17 | ヒトナプシンaに対する抗体およびこれを用いる医薬 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2001172200A true JP2001172200A (ja) | 2001-06-26 |
JP2001172200A5 JP2001172200A5 (ja) | 2006-07-27 |
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JP35889199A Pending JP2001172200A (ja) | 1999-12-17 | 1999-12-17 | ヒトナプシンaに対する抗体およびこれを用いる医薬 |
Country Status (1)
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---|---|
JP (1) | JP2001172200A (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2006013012A2 (en) * | 2004-08-04 | 2006-02-09 | Bayer Healthcare Ag | Diagnostics and therapeutics for diseases associated with napsin 1 (nap1) |
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JPH0296593A (ja) * | 1988-05-16 | 1990-04-09 | Scripps Clinic Res Found | ヒトパピローマウイルス潜伏性タンパク質に対する抗体、その診断システム及びその使用法 |
WO1998022597A2 (en) * | 1996-11-20 | 1998-05-28 | Oklahoma Medical Research Foundation | Cloning and characterization of napsin, an aspartic protease |
JPH11343300A (ja) * | 1998-03-13 | 1999-12-14 | Tetsuro Fujita | 新規ハプテン、それを認識する抗体およびそれらを用いた免疫学的測定法 |
-
1999
- 1999-12-17 JP JP35889199A patent/JP2001172200A/ja active Pending
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