JPH0296593A - ヒトパピローマウイルス潜伏性タンパク質に対する抗体、その診断システム及びその使用法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （関連出題のクロスレファレンス） 本出願は、その記載事項を参考文献として引用している
、１９８８年５月１６日に登録された出願番号１９４，
４０７の出願の一部継続出願である。

（技術分野） 本発明は潜伏性パピローマウィルス（ＰＶ）タンパク質
と免疫反応する抗体分子を含む抗体及びモノクローナル
抗体組成物に関するものである。

また本発明は、これらの抗体の合成法及びこれら潜伏性
ｐｖタンパク質及び潜在的ＰＶ惑感染検出法に関するも
のである。

（背　景） パピローマウィルスは、皮ｔＳ又は粘膜上皮の良性及び
悪性の高増殖を誘導する。ブフィスター（Ｐｆｉｓｔｅ
ｒ）　、レヴユー・オブ・フィジオロジー・バイオケミ
ストリー・アンド・ファーマコロジー（Ｅｅｖ、　Ｐｈ
ｙｓｉｏｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ
、）、９９１１１−１８１　（１９８４）、ヌーボ（Ｎ
ｕｏｖｏ）等（ジャーナル・オプ・ピロロジー（Ｊ、Ｖ
ｉｒｏｌ、）６２゜１４５２−１４５５　　（１９８８
））の方法に従がい、５１タイプ（株）のヒトパピロー
マウィルス（ＨＰＶ）が同定されている。

ヒトにおいて、別のタイプのパピローマウィルスは、別
の病気を起こすことが知られている（シラネン（Ｓｙｒ
ｊａｎｅｎ）　　オブステト・シネコル・サーベイ（Ｏ
ｂｓｔｅｔ、　Ｇｙｎｅｃｏｌ、　５ｅｒｖｅｙ）、　
　３９　＋　２５２２６５　（１９８４）　）。例えば
、ヒトのパピローマウィルス（ＨＰ　Ｖ）のタイプ１及
びタイプ２は一般的イボを作るし、また、タイプ６及び
タイプ１１はコンジローム及び生殖器の偏平イボを作る
。逆に、ＨＰＶタイプ１６．１８及び３３は、大多数の
頚管がん中に保持されており、また、通常のコンジロー
マは引き起こさないが、少ない病理的変化を示す頚管内
皮巾に分散して存在する。

ＩＭ管がんに関連するＨＰＶは最初の感染の後、何年間
も頚管内皮８Ｐｉ織中に潜伏状態で維持され、それから
ある場合に進行して、頚管がんを引き起こす。

現在同定されている多くのＨＰＶのゲノムがクローン化
され、配列決定がなされてきている。例えば、ベーカー
（Ｂａｋｅｒ）、′パピローマウィルスゲノムの配列分
析”　（パボバビリダエ（Ｐａｖｏｖａｖｉｒｉｄｉａ
ｅ）　、　２　ｔ’　；パピローマウィルス、ザルラマ
ン（Ｓａｌｚｍａｎ）等線、プレナムプレス版、ニュー
ヨーク、３２ｍ−３８６頁（１９Ｂ？））；及びチョウ
（Ｃｈａｉｎ）等、“がん細胞”５．５５−７２頁（１
９８７）参照。

歴史的にパピローマウィルスゲノムの読み枠（ＯＲＦ）
は、Ｌｌ及びＬ２及びＥ１〜Ｅ７と命名されてきており
、“Ｌ”及び“Ｅ”は各々後期及び初期を意味している
。Ｌｌ、Ｌ２及びＥ４はウィルスキャプシドタンパク質
をコードしており、またＥ領域ＯＲＦはウィルスの複製
、形質転換及びプラスミド維持のような機能に関連して
いると考えられている。ホーリー（）Ｉｏｗｌｅｙ）等
、“パピローマウィルス−宿主細胞相互作用の分子的特
徴”（“頚管がんのウィルス病因学”ベト（Ｐｅｔｏ）
等線、パンラリ−レポート２１、コールドスプリングハ
ーバ−ラボラトリ−２６１−２７２頁（１９８６））及
びドーム−（Ｄｏｏｂａｒ）等、ＥＮＢＯＪ、　　５　
　；　３５５−３６２　　（１９８６）　　。

現在、潜伏性ＨＰ　Ｖ感染の間に発現されるか、もしく
は、それを示すと明確に確認されているパピローマウィ
ルス特異的抗原はない。

このことは、活発な複製ウィルスが存在する、ＨＰ　Ｖ
感染組織とは対照的である。これらの組織において、い
くつかのＨＰＶにコートされている複製関連抗原（例え
ばウィルスキャプシド抗原）の存在が示されている。シ
ュナイダ−（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ）“ヒトパピローマウ
ィルスの同定法″（″パピローマウィルス及びヒトの病
気”シラネン（Ｓｙｒｊａｎｅｎ）等線、スプリンガー
ーバーラグ、１９−３９頁（１９８７））。

ＨＰ　Ｖ含有細胞系列のタンパク質産物の同定を目的と
した、いくつかの研究が報告されている。

種々のＨＰＶＯＲＦ領域ヌクレオチド配列が異種遺伝子
と機能的に結合した、融合タンパク質が大腸菌において
発現された。生成した融合タンパク質産物は、非ＨＰＶ
アミノ末端及びカルボキシ末端にｔ［Ｕ定上のＯＲＦコ
ート化アミノ酸残基の一部又は全てを含んでいた。この
発現された融合タンパク質は、ポリクローナル抗血清を
生成させるための免疫原として用いられ、また、その血
清はインビトロで、ＨＰＶ含有細胞系列における推定上
のＨＰ　Ｖコード化タンパク質を検出するのに用いられ
た。

例えば、シードルア　（Ｓｅｅｄｏｒｆ）等（ＥＭＢＯ
Ｊ、６；１３９−１４４　　（１９８７））は、ＥＩＯ
ＲＦ配列を含む融合タンパク質を生成し、またＨＰＶタ
イプ１８を含有する１ＩｅＬａ細胞から単離したｍＲＮ
Ａの、インビトロ翻訳後、７０キロダルトン（ｋｄ）の
タンパク質を検出した。Ｆ　４　ｏ＋＋＋；配列を含む
融合タンパク質に対して生じた抗血清を用い、ＨＰ　Ｖ
タイプ１６含有Ｃａ５Ｋｉ細胞由来のｍＲＮＡの、イン
ビトロ翻訳により、１０ｋｄのタンパク質を検出した。

シードルア（Ｓｅｅｄｏｒｆ）等、ＥＭＢＯＪ、６．ｔ
３９−１４４　　（１９８７）。

同様に、Ｅ６０ＲＦ配列由来の融合タンパク質に対する
抗血清は、ＨＰ　Ｖタイプ１６含有Ｃａ５Ｋｉ細胞由来
のｍ　ＲＮ　、Ａのインビトロ劃１訳にヨリ、１１ｋｄ
のタンパク質を検出した。シードルア（Ｓｅｅｄｏｒｆ
）等、ＥＭＢＯＪ、　　６．１３９−１４４　　（１９
８７）。

Ｅ７０ＲＦ配列を含む種々の融合タンパク質に対して生
じた抗血清は、実験したＨＰＶのタイツに依存する、い
くつかのタンパク質を検出した。

ＨＰＶ　１６感染細胞において、１５ｋｄのタンパク質
は、ＨＰＶ源として、Ｃａ５Ｋｉ又は５ｉＨａ細胞を用
い、ウェスタン・イムノブロッティング及びラジオイム
ノ沈殿法を用いて検出されている。シードルア　（Ｓｅ
ｅｄｏｒｆ）等、ＥｌｖｌＢＯＪ、６．　１３９１／１
４　　（１９８７）；及びファーズラフ（Ｆｉｒｚｌａ
ｆｆ）等、がん細胞（Ｃａｎｃｅｒ　Ｃｅ１ｌｓ）、　
５．１０５１１３　（１９８７）。スモトキン（Ｓｍｏ
ｔｋｉｎ）等〔プロシープインク・イン・ナショナル・
アカデミ−・オブ・サイエンス（Ｐｒｏ、　　Ｎａｔｌ
、　、へｃａｄ、　　Ｓｃｉ、）ＵＳＡ、　　　　８３
．　　４６８０−４６８４　　　（１９８７）　　〕は
Ｅ７７０ＲＦ配列由来融合タンパク質に対して生じる抗
体を用いた、ＨＰＶクイプ１６含有（：ａＳｋ　ｉ又は
５ｉＨａ細胞の免疫沈殿法により、２０ｋｄのタンパク
質の検出について報告した。

ウェスタン法及び免疫沈殿法の両方を用いることにより
、ＨＰＶ　１６含有細胞中の１５ｋｄタンパク貿を検出
する、Ｅ７０ＲＦ含有融合タンパク質に対するモノクロ
ーナル抗体が調製された。オルクーストルア　（［１ｌ
ｔｅｒｓｄｏｒｆ）等、ジャーナル・オブ・ゼネラル・
ピロロジー（Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、）　６８　
。

２９３：３−２９３８　　（１９８７）。

最近、！Ｊ−（Ｌｉ）等（ジャーナル・オブ・ゼネラル
−ビｏｏジー（Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、）　６２
　、　６０６６０９　　（１９８８））は、Ｅ２０ＲＦ
含有融合タンパク質に対して生じる抗血清を、ＨＰＶゲ
ノム配列を含むことが知られている一次生検組織中に存
在するタンパク質の検出に用いたことを報告した。サウ
ザンプロテイングにより、ＨＰＶタイプ６．１１又は１
６を含むことが示され、コンジローマと診断された、い
くつかの組織由来の溶解物のウェスタンイムノブロッテ
ィングにより、５Ｑｋｄのタンパク質が検出された。

別の背景として、ＨＰＶタイプ１６Ｅ１．Ｅ２゜Ｅ４．
Ｅ６又はＥ７０ＲＦの一部又は、ＨＰＶタイプ６のＥ６
０ＲＦ領域の一部に対応するアミノ酸残基配列をもつ、
１７個の合成ポリペプチドが報告されている。スクール
ニック　（Ｓｃｈｏｏ、Ｉｎ１ｃｋ）等、ＥＰＯ持許出
願第０２５７７５４Δ２号（１９８８，３月２日公開）
。これらのポリペフ。

チドは、ウサギの抗血清を調製するための免疫原として
用いられ、また、ＨＰＶ−１６のＥ６領域に対して生じ
る抗ペプチド抗体４種が、ＨＰＶ１６ＤＮΔを含むこと
が示され、かつ、既知のジスプラシアスをもつと評価さ
れた患者の生検ｐＪＩ　Ｓ４ｍと免疫反応することが示
された。しかしながら、スクールニク　（Ｓｃｈｏｏｌ
ｎｉｃｋ）等のペプチドのいずれも、ＨＰ感染の結果と
して誘導される抗体と、抗原として反応する能力を有す
ることを示さなかった。

（発明の＋概要） 本発明は式 ％式％ ＲＰＦＫＳＮＫＳＴＣＣ ＣＣＤｌ’ｌＣ１八ＡＦＧＬＴＰＳＩ。

ＴＹＤＳＥＩ／ＩＱＲＤＱＦＬＳＱＶＫＩＰＣ。

ＨＫＳＡＩＶＴＬＴＹＤＳＥＩ；ＩＱＲＤＱＣＣＩＮ［
：ＱＫＰＬＣＰＥＥＫＱＲＨ からなる群から選ばれる式で表わされるポリペプチドを
考案している。

さらに、せいぜい約５０個のアミノ酸残基からなり、か
つ、式−ＴＹＤＳＥ−で表わされるアミノ酸残基配列を
含むポリペプチドを考案している。

別、暫嘩は、せいぜい約５０個のアミノ酸残基からなり
、かつ、式 ％式％ からなる群から選ばれる式で表わされるアミノ酸残基配
列を含むポリペプチドを考案している。

また、式ＩＪ　Ａ　Ｄ　ＰへＧＴＮＧＥεＧＴＧＣで表
わされるポリペプチドによりＢＲ’２７１される抗ポリ
ペプチド抗体と免疫反応する能力を有する第１エピトー
プ、及び式ＣＩＮＣＱＫＰＬＣＰＥＥＫＱＩ？ｌ＋で表
わされるポリペプチドにより誘導される抗ポリペプチド
抗体と免疫反応する能力を有する第２エピト−プを含む
、実質的に純粋なヒトパピローマウィルスの５４ｋｄ繊
維状タンパク質を含む組成物が考案されている。

さらに、式ＭＡＤＰＡＧＴＮＧＥＥＧＴＧＣで表わされ
るポリペプチドにより誘導される抗ペプチド抗体と免疫
反応する能力を有する第１エピトープ、及び弐（ＪＮＩ
ＫＰｌ、ＣＰＥＥＫＱＲｌｌ　テ表わされるボ１７　／
＜ブチトニより誘導される抗ポリペプチド抗体と免疫反
応する能力を有する第２エピトープを含む、実質的に純
粋なヒトパピローマウィルスの４８ｋｄ１６１ｉ維状タ
ンパク質が考案されている。

もう１つの特徴は、式１１ＥＤ［ｌ’０ＫＩＥＮＤＧＤ
ＳＬＰＴＣで表わされるポリペプチドによりＶ’ｒ４さ
れる抗ペプチド抗体と免疫反応する能力を有する第１エ
ピトープ、及び式１１ＫｓＡ　ＩＶＴＬＴＹＤＳＥＷＱ
Ｉ（ＤＱＣテ表わされるポリペプチドにより誘導される
抗ポリペプチド抗体と免疫反応する能力を有する第２エ
ピトープを含む、実質的に純粋なヒトパピローマウィル
スの１１２ｋｄ分散タンパク質を含む組成物である。

さらに別の特徴は、式１１にＳＡ　ＩＶＴＬＴＹＤＳＥ
ＷＱＲＤＱＣで表わされるポリペプチドによりａＲ４さ
れる抗ポリペプチド抗体と免疫反応する能力を有するエ
ピトープを含む、実質的に純粋なヒトパピローマウィル
スの５１７核タンパク質を含む組成物である。

また、式 ％式％ ［ からなる群から選ばれるポリペプチドの１つのみと免疫
反応する抗ポリペプチド抗体も考案されている。

さらに、１）１１２ｋｄ分散タンパク質、１ｉ）５４ｋ
ｄ繊維状タンパク質、 １ｉｉ）４８ｋｄ繊維状タンパク質、 １ｖ）５１ｋｄ核タンパク質、及び ｖ）５８ｋｄ核タンパク質 からなる群から選ばれる、ヒトパピローマウィルス潜伏
性タンパク質と免疫反応する抗体分子を含むモノクロー
ナル抗体が考案されている。

別の特徴において、本発明は １）１１２ｋｄ分散タンパク質、 １ｉ）５４ｋｄ繊維状タンパク質、 １ｉｉ）４８ｋｄ繊維状タンパク質、 １ｖ）５１ｋｄ核タンパク質、及び ｖ）５８ｋｄ核タンパク質 からなる群から選ばれる、ヒトパピローマウィルス潜伏
性タンパク質と免疫反応する、実質的に単離された、も
しくは実質的に純粋な抗体分子を含む抗体を考案してい
る。

さらに、考案されたポリペプチド又は考案された抗体分
子を含む組成物に加えて、本発明のポリペプチドと免疫
反応する抗体及びモノクローナル抗体が考案されている
。

また、少なくとも１回の検定を行なうのに十分な量の、
１つ以上の、上記ポリペプチド、タンパク質組成物及び
抗体のを含む、キットの形をした診断システムも考案さ
れている。

さらに、上述のポリペプチド、タンパク質組成物及び抗
体を用いた、パピローマウィルス感染の存在及び存在す
るパピローマウィルスのタイプを検定する方法が考案さ
れている。

（発明の詳細な説明） Ａ、定義 （アミノ酸）　　ここで示される全てのアミノ酸は、天
然のＬ型のものである。標阜的ポリペプチド命名法に従
かい（ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ
ー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、）　　２４３　。

３５５７−５９　　（１９６９））、アミノ酸残基に対
する略号は、以下の対応表に示した。

記 対応 号 １ス多 ｙｒ １ｙ ｈｅ ｅｔ ｌａ ｅｒ １ｅ ｅｕ ｈｒ ａｌ Ｐｒ。

ｙｓ １−１’ｒｓ ｌｎ ｌｕ ｒｙ ｒｇ 表 アミノ酸 チロシン グリシン フェニルアラニン メチオニン アラニン セリン イソ【コイシン ロイシン スレオニン ハ゛リン プロリン リジン ヒスチジン グルタミン グルタミン酸 トリプトファン アルギニン Ｄ　　　　　　Ａｓｐ　　　　　　アスパラギン酸Ｎ　
　　　　　Ａｓｎ　　　　　　アスパラギンＣＣｙｓ　
　　　　　システィン ここては、全てのアミノ酸残基配列は、左から右へ、従
来のアミン末端からカルボキシ末端の方向で表わされて
いることに注意せよ。また、アミノ酸残基配列の最初又
は最後にあるダッシュは、ポリペプチド鎖中、総計約５
０個の残基までに及ぶ、１個以上のアミノ酸残基への、
１個の結合を示していることにも注意せよ。

（ポリペプチド及びペプチド）　ポリペプチド及びペプ
チドは、隣同志の残基のα−アミノ基及びカルボキシ基
間のペプチド結合により互いに連結した、線状のせいぜ
い約５０個のアミノ酸残基を意味して、同義的に用いら
れている。

（タンパク質）　タンパク質とは、ポリペプチドと同様
に互いに連結した、線状の５０個以上のアミノ酸を意味
して用いられている謬である。

Ｂ、パピローマウィルス潜在的タンパク質ハヒローマウ
イルス感染は、潜伏状態で感染された組織中に維持され
るウィルスを生じうる。現在、ヒトパピローマウィルス
（１−ＩＰＶ）について理解されているように、ウィル
ス潜伏は、生殖器のパピローマウィルス感染に関連する
タイプのＨＰ　Ｖ、特に頚骨がんのような種々のジスプ
ラシアスを引き起こすものに起こる。ジスブラシアス関
連ＨＩ’）　Ｖ　ニは、タイプ１６、Ｉ８．３Ｉ及び３
３．３５．５２及びそれに類するものが含まれる。

本発明を発明する前、パピローマウィルスゲノムＥ領域
ＯＲＦコード化タンパクｎの存在は、潜伏状態でウィル
スを維持する、パピローマウィルス感染組織中では検出
されていない。現在、パピローマウィルス特異的タンパ
ク質は、潜伏性の非増殖状態でウィルスを宿している感
染組織中に発現されていることが示されている。

それゆえ、広い意味で、本発明の１つの態様は、実質的
に純粋なパピローマウィルス潜伏性タンパク質を考案し
ている。ここで用いられているように、′パピローマウ
ィルス潜伏性タンパク質”“潜伏性パピローマウィルス
タンパク質”及びこれに類する語句は、ＨＰＶにより潜
伏的な感染を受けた組織中で発現される、ＨＰＶ　　Ｅ
　　ＯＲＦによりコートされるタンパク質を意味する。

ＨＰＶで潜伏的な感染を受けた組織は、ＨＰ　Ｖゲノム
物質を含んでいるが、免疫的方法で検出可能なレベルま
でには、ＨＰ　Ｖウィルスキャプシド抗原を含んでいな
い。

１、パピローマウィルス繊維状潜伏性タンパク質性免疫
原でウィルスを維持している、ＨＰＶ感染細胞は、現在
、例５で説明しているように、ラウリル硫酸ナトリウム
（ＳＤＳ）存在下でのポリアクリルアミドゲル電気泳動
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で測定したとき、約５４キロダル
トン（ｋｄ’）のパピローマウィルス特異的繊維状タン
パク質（すなわち、細胞の繊維状成分に関連して発見さ
れたタンパク質）を生産することが知られている。例え
ば、例５で説明しているように、５４ｋｄの繊維状タン
パク質はＣａ５ｋｉ及び５ｉＨａ細胞中に検出するごと
ができる。Ｃａ５ｋｉ及び５ｉＨａ細胞は、ＩＩＰＶタ
イプ１６を含み、また、各々、ＣＲＬ１５５０及びＨＴ
Ｂ３５として、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレ
クション（八ＴＣＣ，ＭＤ州ロックビル）から入手でき
る、頚管がん肺由来の細胞系列である。

さらに、５４ｋｄ繊維状タンパク質は、第１表で示され
ているＨＰＶポリペプチド２３５及び２４７と、免疫学
的に交叉反応するエピトープを所有することで特徴づけ
られる。すなわち、５４ｋｄ繊維状タンパク質は、ポリ
ペプチド２３５及び２４７の配列と相同的なアミノ酸残
基配列を含む。

また、ＨＰ　Ｖの潜伏的感染を受けた組織は、５ＤＳ−
ＰＡＧＥで測定されるように、４８ｋｄの繊維状タンパ
ク質を生産する。この４８ｋｄ繊維状タンパク質は、例
５で説明されている、イムノブロッティング法を用いて
、Ｃａ５ｋｉ細胞中に検出することができる。

さらに、この４８ｋｄ繊維状タンパク質は、ポリペプチ
ド２３５．２４７及び２４５と免疫学的に交叉反応する
エピトープを所有することで特徴づけられ、従って、こ
れらのポリペプチドと相同的なアミノ酸残基配列を含ん
でいる。

２、パピローマウィルス潜伏性核タンパク質ＨＰ　Ｖで
潜伏的感染を受けた細胞は、Ｃａ５ｋ　ｉ細胞の核中に
検出される５ＤＳ−ＰＡＧＥでの測定で約５１ｋｄのＨ
ＰＶ特異的タンパク質を発現する。

さらに、この５１ｋｄ核タンパク質は、Ｅ２０ＲＦ内部
領域のアミノ酸残基配列由来のポリペプチド２４５と、
免疫学的に交叉反応するエピトープを所有することで特
徴づけられる。

ＨＰＶによる潜伏的感染を受けた細胞は、さらに、５Ｄ
Ｓ−ＰＡＧＥでの測定による２６ｋｄ。

４８ｋｄ及び５８ｋｄの核タンパク質を発現する。

この２６ｋｄ、　４８ｋｄ及び５８ｋｄのタンパク質は
、例２６ａで説明する、イムノブロッティング法を用い
、ＨＰ　Ｖ感染細胞で検出することができ、またポリペ
プチド２４５と免疫学的に交叉反応するエピトープを所
有することで特徴づけられる。

３、パピローマウィルス潜伏性分散タンパク質この分散
タンパク質は、例５で説明する５ＤＳＰ八ＧＥでの測定
によると約１１２ｋｄの見かけ分子量をもつ、パピロー
マウィルス潜伏性タンパク質である。この１１２ｋｄ分
散タンパク質は、例５で説明するイムノブロッティング
法を用い、１ＩｅＬａ及び５ｉｌｌａ細胞中に検出する
ことができる。

１１ｅＬａ細胞は、ＨＰＶタイプ１８を含む頚管がん腫
細胞培養細胞であり、また、ＣＣｌ２としてＡＴＣＣか
ら入手できる。

さらに、この１１２ｋｄ分散タンパク質は、各々、ＥＩ
ＯＲＦ内部領域、Ｅ２０ＲＦ内部領域、ＥｌａＯＲＦア
ミノ末端領域、ＥＩＯＲＦ内部領域及びＥ６０ＲＦ内部
領域のアミノ酸残基配列由来のポリペプチド２３６．２
４５．２３５．２３８及び２４７と免疫学的に交叉反応
するエピトープを所有することで特徴づけられる。

上述の種々の潜伏性パピローマウィルスタンパク質は、
本発明の接種物中のタンパク質性免疫原として、又は、
本発明の診断システムにおける抗原として、実質的に純
粋な形で有用である。

従って、本発明は、実質的に純粋な上述の各繊維状、核
及び分散パピローマウィルス潜伏性タンパク質を考案し
ている。”実質的に純粋”ということは、特定のＨＰＶ
潜伏性タンパク質が実質的に、他のパピローマウィルス
関連タンパク質を含まない組成物中に存在することを意
味する。

実質的に純粋な特定のタンパク質を生産する方法は当分
野ではよく知られている。−船釣に、こらの方法には、
よく知られている生化学的技術を用いて、そのタンパク
質を含む細胞からそのタンパク質を単離することが含ま
れる。例えば、タンパク質分画法として知られているゲ
ル濾過、ゲルクロマトグラフィー、超遠心、電気泳動、
イオン交換、アフィニティークロマトグラフィー及びこ
れに類する方法を、潜伏的感染したＨＰＶ含有培養物中
のパピローマウィルス潜伏性タンパク質の単離に使用す
ることができる。ここに述べられている各潜伏性タンパ
ク質は、限定されたポリペプチドに対する免疫学的交叉
反応により、部分的に特徴づけられるので、実質的に純
粋な、潜伏性タンパク質を生産するのに、免疫アフィニ
ティ免疫吸着及びそれに類するもののような免疫化学的
精製法は、特にうまく応用することができる。

またこの組成物は、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム（
ＳＤＳ）、ポリアクアリルアミド、及び５ＤＳ−ＰＡＧ
Ｅによる見かけの分子量約４０ｋｄ以下の、組織又は細
胞培養由来のタンパク質などの、イオン性界面活性剤の
ような物質を実質的に含まないことが好ましい。

Ｃ，ポリペプチド 本発明のポリペプチドは、少な（とも約５個の残基を含
み、かつ、わずか約５０個、通常約３５個以下、好まし
くは約２５個以下のアミノ酸残基を含んでいる。さらに
、本発明のポリペプチドはそのアミノ酸残基配列及び新
しい機能性により特徴づけられる。

特別に公表される配列に加えて、総計せいぜい約５０個
のアミノ酸残基までの、本発明のポリペプチド中に存在
するアミノ酸残基には、ここで議論されているポリペプ
チドの基本的かつ新規の特徴に重大な影響を与えないも
のがなりえる。

このような付加的残基は、通常、公表されたポリペプチ
ドの片方の又は両方の末端に付加され、また、公表され
たポリペプチド配列の反復又は部分反復を含むこともで
きる。

広く言うと、本発明はパピローマウィルス潜在性タンパ
ク質と免疫反応する抗体分子を生産（誘導）することが
できるアミノ酸残基配列を含むポリペプチドを考案して
いる。本発明のポリペプチドは、潜伏性パピローマウィ
ルス感染により誘導される抗体、すなわち、抗潜伏性パ
ピローマウィルスタンパク質抗体と免疫反応することが
望ましい。さらに、このポリペプチドは潜伏性パピロー
マウィルスタンパク質をコードすることが知られている
パピローマウィルスゲノムの、これらの読み枠（ＯＲＦ
）領域の核酸配列から誘導されるアミノ酸残基配列の一
部に対応するアミノ酸残基配列を含むことが望ましい。

本発明のポリペプチドは、免疫化に当り、潜伏性パピロ
ーマウィルスタンパク質と免疫反応する抗体分子を含む
抗血清を生産することができる限り、潜伏性パピローマ
ウィルスタンパク質のアミノ酸残基配列と同一である必
要はないことを理解しなければならない。そのポリペプ
チドは、潜伏性パピローマウィルス感染により誘導され
る抗体と免疫反応することが好ましい。それゆえ、本発
明のポリペプチドは、その使用に対し、ある利点を提供
するときは、保存的な場合も、非保存的場合も挿入、欠
失及び置換などの種々の変化を与えることができる。

保存的置換とは、１つのアミノ酸残基が別の、生物学的
に同様の残基と置き換える場合である。

保存的置換の代表例にはイソロイシン、バリン、ロイシ
ン又はメチオニンなどの１つの疎水性残基の別の疎水性
残基への置換、もしくは、アルギニンとリジン間、グル
タミン酸とアスパラギン酸間、又はグルタミンとアスパ
ラギン間のような極性残基間の置換及びそれに類するも
のが含まれる。また“保存的置換”という語句には、ポ
リペプチドが必要とされる抗体ｖＭ　ｉ活性を示すなら
、本来の未置換アミノ酸の代りの、置換アミノ酸の使用
も含まれる。

本発明のポリペプチドが筒便に、ラベル又は固体マトリ
クス又は抗原性キャリヤーに固定することを可能にする
“リンカ−”を提供する目的で、いずれかの末端に付加
的残基を付加する場合以外、１つ以上の保存的又は非保
存的置換が行なわれたため、潜伏性パピローマウィルス
タンパク質の配列と同一ではない配列を、本発明のポリ
ペプチドが有している場合、通常わずか約２０％、そし
てより一般的にはわずか約１０％のアミノ酸残基が置換
している。本発明のポリペプチドに使用できるラベル、
固体７トリクス及びキャリヤーは後に議論される。

通常、アミノ酸残基リンカ−は、少なくとも１個の残基
であり、また４０個以上の残基でもよいし、通常は１か
ら１０個の残基である。結合のために使用される典型的
アミノ酸残基には、チロシン、システィン、リジン、グ
ルタミン酸及びアスパラギン酸などがある。さらに、本
発明のポリペプチド配列は、その配列が例えばアセチル
化などの末端−ＮＨ２アシル化又は末端−Ｎ＋（２チオ
グリコール酸アミド化、末端カルボキシアミド化（例え
ばアンモニア、メチルアミンなど）により修正されるこ
とにより天然の配列とは異なることもありうる。

本発明のペプチドは、少なくとも１個のシスティン残基
を含むことができ、また、ある場合にはその残基を２個
含むことができる。従って、このペプチドは、種々の酸
化状態で存在しうる。そのシスティン残基のスルフィド
リル基が還元されている単量体型に加えて、２つ以上の
ペプチド分子上のスルフィドリル基が酸化し、かつ、ペ
プチド間及びペプチド内のジスルフィド結合の形成した
二量体又は多量体として存在することもできる。

唯１つのシスティン残基を有する本ペプチドは線状ダイ
マーを形成するのみだが、２個のシスティン残基を有す
ることは種々の長さの線状又は環状ダイマー及び線状ポ
リマーを形成することができる。これら種々の酸化型は
、本発明の一部と考えられ、かつ、“ポリペプチド”及
び“ペプチドの範囲にはいる。

リンカ−を介してキャリヤーに結合し、当分野でキャリ
ヤーハプテン結合体として知れられているものを形成す
るとき、本発明のポリペプチドは、上記タンパク質が潜
伏性パピローマウィルス感染を含むチンプル中に存在す
る場合、潜伏性パピローマタンパク質と免疫反応する抗
体を誘導することができる。本発明のポリペプチドを用
いて誘導される、抗体及び潜伏性パピローマウィルスタ
ンパク質との代表的免疫反応を例５で説明する。

免疫学的交叉反応の確立された原則からみて、本発明は
、抗原的に関連する、本発明のポリペプチドの多種の変
異体を考案している。“抗原的に関連する変異体”とは
潜伏性パピローマウィルスタンパク質の少なくとも６個
のアミノ酸残基配列部分を含み、かつ上記タンパク質は
潜伏性パピローマウィルス感染を含むサンプル中に存在
する場合、潜伏性パピローマウィルスタンパク質と免疫
反応する抗体分子を誘導することができるポリペプチド
である。

本発明のポリペプチドは、組換えＤＮＡ技術を含む、ポ
リペプチドの分野でよく知られている技術により合成す
ることができる。

メリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）型の固相合成
などの合成化学的技術は、純度、抗原特異性、望ましく
ない副産物の欠除、生産の容易性などの理由で好ましい
。使用しうる多数の技術の優れたまとめは、Ｊ、　Ｍ、
スチワード（Ｓｔｅｗａｒｄ）及び、Ｊ、　Ｄ。

ヤング（Ｙｏｕｎｇ）　、“同相ペプチド合成”、Ｗ、
ｌＩ。

フリーマン（Ｆｒｅｅｍａｎ）社、サンフランシスコ、
１９６９；Ｍ、ロダンス二Ｆ　−（Ｉｌｏｄａｎｓｚｋ
ｙ）等、“ペプチド合成”、ジョンウィリー・アンド・
サンズ（Ｊｏｈｎ−Ｗｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ）社、第
２編、１９７６及びＪ、メイエンホーフｙ　−（Ｍｅｉ
ｅｎｈｏｆｅｒ）　、”ホルモン性タンパク質及びペプ
チド”２巻、４６頁、アカデミツクブレス版にューヨー
ク）、１９８３（以上固相合成）及びＥ、シュローダ−
（Ｓｃｈｒｏｄｅｒ）及びに、クフ゛ケ（Ｋｕｂｋｅ）
、“ペプチド分子上、アカデミツクブレス版にューヨー
ク）、１９６５（古典的溶液合成）に見ることができ、
これら各々は、参考文献として、ここで引用されている
。

このような合成に使用できる適当な保護基は、上述のテ
キスト内及び参考文献として、ここで弓用している、Ｊ
、　Ｆ、　Ｗ、マコーミ−（ＭｃＯｍｉｅ）、“有機化
学における保護基”プレナムプレス版、ニューヨーク、
１９７３に報告されている。

本発明のポリペプチドは、パピローマウィルス、好まし
くはＨＰＶのＥｌ、Ｅ２又はＥ６０ＲＦのヌクレオチド
配列から誘導されることが好ましい。

さらに、本発明のポリペプチドは、ＨＰ　Ｖタイプ６．
１１．１６，１８，３３，３５．５２及びこれに類する
ものを含む、生殖器のパピローマウィルス感染を起こす
ことが知られている特定のＨＰ　Ｖのヌクレオチド配列
から３Ａ　’４されることがより好ましい。

１、　ＨＰ　Ｖタイプ１６関連ポリペプチド本発明のＨ
Ｐ　Ｖタイプ１６関連ポリペプチドは、少なくとも５個
、好ましくは少なくとも１２個のアミノ酸残基を含み、
かつ第１図に示したようなＨＰ　Ｖタイプ１６のＥｌ、
ＩＥ２又はＥ６０ＲＦから３Ａ　導されるアミノ酸残基
配列の一部に対応する配列を含む。

本発明のＩＩ　ｌ）　Ｖタイプ−１６関連ポリペプチド
は、アミノ酸残基配列ＷＲＯＲＤ叶ＬＳＱＶを含まない
ことが望ましい。

本発明の好ましいポリペプチドには、第１表に示すアミ
ノ酸残基配列のものが含まれる。

第　　１　　表 ヒトバピローマウイルスボリベプチト 爪捷町□配ｌｌＪ　　　；　１べｊチト名−アミノ酸配
列Ｅ　　Ｉ　　ａ　　　　　　　　　２　３　５　　　
　　　　　ＭＡＤＰＡＧＴＮＧＥＥＧＴＧＣＥ　　１　
　　　　　　２　３　６　　　　　　＋１ＥＤＥＤＫＩ
ミＮＤＧＤＳＩ、ＩＩＴｃｆＥ　　１　　　　　　　２
　３　８　　　　　１’１ＰＦＫＳＮＫＳＴＣＣＥ　　
ｌ　　　　　　　　２　４　６　　　　　　ＣＣＤＷＣ
ＩＡＡＦＧＬＴＰＳＩＥ　２　　　　　　　２　３　７
　　　　　　ＴＹＤＳＥＷＱＲＤＧＦＬＳＱＶＫＩＰＣ
Ｅ　２　　　　　　　２　４　５　　　　　１１ＫＳＡ
ＩＶＴＬＴＶＤＳＥＷ［］１ｉＤＱＣＩＥ　６　　　　
　　　２　４　７　　　　　　ＣＩＮＣＱＫＩ）ＬＣＰ
［ＥＫＱＲＩ＋■　読み枠（○ＲＦ）の名称は、ポリペ
プチドのアミノ酸残基配列が誘導される、第１図中に示
した○ＲＦに対応している。

好ましいＨＰＶタイプ１６関連ポリペプチドには、ＨＰ
Ｖクイプ１６のＥ２０ＲＦから誘導されるアミノ酸配列
の一部に対応し、かつ、式−ＴＹＤＳＥで表わされるア
ミノ酸残基配列を含むアミノ酸残基配列を含む。この含
有される配列は、式−ＬＴＹＤＳＥで表わすことが望ま
しい。

本発明のＨＰｖタイプ１６関連ポリペプチドは式 ％式％ （式中、Ｂは、次に示すアミノ酸残基配列の少なくとも
１つてあり、 一３ＡＩＶＴＬＴ。

ＳＡＩＶＴＬＴ。

ＡＩＶＴＬＴ。

ＩＶＴＬＴ。

ＶＴＬＴ。

ＬＴ １、Ｔ Ｔ　・ Ｂ′は、次に示すアミノ酸残基配列の少なくとも１つで
ある。

Ｅ、　　　） で表わされるアミノ酸残基配列により定義されるもので
あることがより好ましい。

本発明のより好ましいｌ−（Ｐ　Ｖタイプ１６関連ポリ
ペプチドには、式−５Ａ　ＩＶＴＬＴＤＹＳＥ−又は１
１にＳへ１νＴＬＴＤＹＳＥ−で表わされるアミノ酸残
Ｊｔ　ｐｉ己列が含まれる。

さらに、式−［ＩＫＳＡＩＶＴｌ、ＴＹＤＳＩｌ　’（
式中、Ｂは次に示すアミノ酸残基配列の少なくとも１つ
であり、 ５ＳＴＷＩＩＷＴＧＩＩＮＶＫＩＩ ＳＴＷＩＩＷＴＧＩＩＮＶＫＩ＋ ＴＷＩＩＷＴＧＩＩＮＶＫＩ＋ 匈１１ＷＴＧＩＩＮＶＫ１１ ＩＩ匈Ｔ　Ｇ　ＩＩ　Ｎ　Ｖ　Ｋ　ＩＩＷＴＧＩＩＮＶ
ＫＨ。

ＴＧＩＩＮＶＫＨ。

Ｇ　ＩＩ　Ｎ　Ｖ　Ｋ　Ｈ ＩＩ　Ｎ　Ｖ　Ｋ　ＩＩ Ｎ　Ｖ　Ｋ　ＩＩ νＫｌ＋。

■　； Ｂ′は、次に示すアミノ酸残基配列の少なくとも１つで
ある。

ＥＷ［］ｌ？１）Ｑ Ｅ讐ＱＲＤ ＷＱＲ ＷＱ Ｅ凱 Ｅ、　　　） で表わされるアミノ酸残基配列で定義されるＩＩＰシタ
イブ１６関連ポリペプチドであることがより好ましい。

関連する態様において、ＨＰ　Ｖタイプ１６関連ポリペ
プチドは、ＨＰＶクイプ１６のＥ２０ＲＦから誘導され
るアミノ酸配列の一部に対応し、かつ、次に示すアミノ
酸残基配列、 −ＨＫＳへＩＶ− 一３ＡＩＶＴＬ− −ＩＶＴＬＴＤ− の少フエくとも１つを含むアミノ酸残基配列を含む。

好ましいＨＰＶクイプ１６関連ポリペプチドはわずか約
３０個のアミノ酸残基を含み、かつそのアミノ酸残基配
列の一部として、次に示す配列、ＶＴＬＴＤ　− 一３ＡＩＶＴＬ− −ＨＫＳＡ［Ｖ− −ＨＫＳＡＩＶＴＬＴＤＹＳε− 一３ＡＩＶＴＬＴ［１ＹＳＥ ＴＤＹＳＥ ＴＤＹＳε−； の少なくとも１つを有し、もしくは、式％式％ て表わされるＨＰＶタイプ１６配列の一部に、好ましく
は挿入または欠失のない状態で粗間的であり、より好ま
しくはこれと同一のものである。

好ましい特定のＨＰＶタイプ１６関連ポリペプチドには
、第２表に示すアミノ酸残基配列を有するものが含まれ
る。

ポリペプチド名 第　　２　　表 ■」■翻 ５ＳＴＷＩＩＷＴＧＩＩＮＶＫＨＫＳＡ　ＩＶＴＬＴＹ
Ｄ＋１ＫｓＡ　ＶＴＬＴＹＤＳＥＷＱＩ？ＤＣ１１ＫＳ
ＡＩＶＴＬＴＹＤＳＥＷＱＩ？ＣＨＫＳＡ　　ＶＴＬＴ
ＹＤＳＥＷＱＣ ｌｌＫｓＡ　ＩＶＴＬＴＹＤＳＥＷＣ ｌｌＫＳＡ　　ＶＴＬＴＹＤＳＥＣ ＨＫＳＡ　　ＶＴＬＴＹＤＳＣ １１ＫＳＡ　　ＶＴＬＴＹＤＣ ＨＫＳＡ　　ＶＴＬＴＹＣ に５Ａ１νＴＬＴＹＤＳＥＷＱＲＤＧＣ５Ａ　　ＶＴＬ
ＴＹＤＳＥＷＱＲＤＱＣ八ＩＶＴＬＴＹＤＳＥＷΩＲへ
口Ｃ ＩＶＴＬＴＹＤｓＥＷＱＲＤＱｃ ＶＴＬＴＹＤＳＥＷＱＲＤＱＣ ＴＬＴＹＤＳＥＷＱＩ？ＤＯＣ ＬＴＹＤＳＥＷＱＲＤ［ＩＣ 本発明のもう１つの好ましいＨＰＶタイプ１６関連ポリ
ペプチドは、わずか約５０個のアミノ酸からなり、かつ
、−最大 （式中、Ｚは、式１１ＫｓＡ　ＩＶＴＬＴＹＤＳＥで表
わされる配列の一部に対応する配列を有する、少なくと
も５個のアミノ酸残基であり、 Ｘは水素又は、少なくとも１個のアミノ酸残基であり、 Ｘ′は水酸基又は少なくとも１個のアミノ酸残基である
） で表わされるアミノ酸残基配列を含み、かつ、抗ＨＰＶ
潜在性タンパク質抗体と免疫反応すること゛ができるポ
リペプチドである。

また別の好ましいＨＰＶタイプ１６関連ポリベプチドは
、わずか約５０個のアミノ酸残基からなり、かつ、−最
大 ％式％ （式中、Ｘは水素又は、少なくとも１個のアミノ酸残基
であり、Ｘ′は水酸基又はＸ′がアミノ酸残基配列ＷＱ
ＲＤＱＦＬＳＱＶを含まない条件で、少なくとも１個の
アミノ酸残基である） で表わされるアミノ酸残基配列を含むポリペプチドであ
る。

ある態様における、Ｘ′は、式 からなる群から選ばれる式で表わされるアミノ酸残基配
列である。

好ましい態様におけるＸ′は、式 ％式％ からなる群から選ばれる式で表わされるアミノ酸残基配
列である。

また別の好ましい態様におけるＸ′は、式％式％ からなる群から選ばれる式で表わされるアミノ酸残基配
列である。

さらに好ましＨＰＶタイプ１６関連ポリペプチドの別の
定義は、わずか約５０個のアミノ酸残基を含み、かつ、
次に示すアミノ酸残基配列−ＴＤＹＳＥ−。

しＴＤＹＳＥ ＳＡ　Ｉ　ＶＴＬＴＤＹＳＥ −）ＩＫＳＡＩＶＴＬＴＤＹＳＥ−。

ＨＫＳ八ｌへＶ−。

Ｓへｉ　ＶＴＬ−。

ＴＬＴＤ のうちの少なくとも１つを含み、かつ、アミノ酸残基配
列ＷＲＱＲＤＯＦＬＳＱＶを含まないポリペプチドであ
る。

２、　ＨＰ　Ｖタイプ６関連ポリペプチド本発明のＨＰ
　Ｖタイプ６関連ポリペプチドは、ＨＰ　Ｖタイプ６の
Ｅ２０ＲＦから誘導されるアミノ酸残基配列の一部に対
応し、かつ、式＋１Ａ　ＩＶＴＶＴＹＤＳＥ−で表わさ
れるアミノ酸残基配列を含むアミノ酸残基配列を含んで
いる。

好ましいＨＰ　Ｖタイプ６関連ポリペプチドは、弐ＩＩ
　Ｋ　ＩＩΔＩシＴシ’ｒＶＤｓＥＥＱＲＧＱｃで表わ
されるアミノ酸残基配列を有している。

３、　ＨＰ　Ｖタイプ１１関連ポリペプチド本発明のＨ
Ｐ　Ｖタイプ１１関連ポリペプチドは、ＨＰ　Ｖタイプ
１１のＥ２０ＲＦから誘導されるアミノ酸残基配列の一
部に対応し、かつ式−ＮＡＩＶＴＬＴＹＳＳＥ−で表わ
されるアミノ酸残基配列を含むアミノ酸残基配列を含ん
でいる。

好ましいＨＰ　Ｖタイプ１１関連ポリペプチドは弐ＨＫ
ＮＡ　ＩνＴＬＴＹＳＳＥＥＱＲＱ［］Ｃで表わされる
アミノ酸残基配列を有している。

４、　ＨＰ　Ｖタイプ１８関連ポリペプチド本発明のＨ
Ｐ　Ｖタイプ１８関連ポリペプチドは、ＨＰＶクイブ１
８のＥ２０ＲＦから誘導されるアミノ酸残基配列の一部
に対応し、かつ、式−ＩＬＴＶＴより好ましくは式−Ｔ
ＧＴＬＴＶＴＹＨ３Ｅ−で表わされるアミノ酸残基配列
を含むアミノ酸残基配列を含んでいる。

好ましいＨＰ　Ｖタイプ１８関連ポリペプチドは、式 ％式％ からなる群から選ばれる式で表わされるアミノ酸残基配
列を有している。

５、　ＨＰ　Ｖタイプ３３関連ポリペプチド本発明のＨ
ＰＶタイプ３３関連ポリペプチドは、ＨＰＶタイプ３３
のＥ２０ＲＦから具秀導されるアミノ酸残基配列の一部
に対応し、かつ、式ＮＧＩＶＴＶＴＦＶＴＥ−で表わさ
れるアミノ酸残基配列を含むアミノ酸残基配列を含んで
いる。

好ましいＨＰＶクイプ３３関連ポリペプチドは、式５Ｋ
ＮＧ　ＩＶＴＶＴＦＶＴＥＱＱＯＱＭＣテ表ワサレルア
ミノ酸残基配列を有している。

■（Ｐ　Ｖタイプ６．１＋、、１８及び３３のＥ２０Ｒ
Ｆから誘導された好ましいＨＰ　Ｖ関連ポリペプチドを
第３表に示す。

第　　３ ｆリベブチト名　　　　１１ＰＶタイ　フニに７０　　
　　　　　　６ に７１　　　　　　　　　　１１ に６９　　　　　　　　１８ に６８　　　　　　　　　　１８ に１２　　　　　　　　３３ 表 アミノ酸残基βＡ １１ｋｌｌＡＩＶＴＶＴＹＯ５ＥＥＱＲＱＱＣ１１ＫＮ
ＡＩＶＴＬＴＹＳＳＥＥＱＲＯＱＣＥＫＴＧＩＬＴＶＴ
ＹＩＩＳ［ＴＯＩンＴＩ？ＣＮＩＥＫＴＧＩＬＴＶＴＹ
Ｈ５ＩｉＴＱＲＴＲＣ５ＫＮＧＩシＴＶＴＩ？ＶＴＥ（
ＩＱＱＱＭＣまた本発明は、生理的に許容される希釈剤
中に混合した、本発明のポリペプチドを含む組成物を考
写している。−射的に、この組成物は、マイクロモル濃
度からモル濃度の範囲で、好ましくはミリモル濃度の７
震度でポリペプチドを含んでいる。

さらに本発明は、パピローマウィルス潜伏性タンパクｇ
ｏＲＦから誘導される配列と異なる、少なくとも１個の
アミノ酸残基配列に機能的に結合（融合）した本発明の
ポリペプチドを含む融合タンパク質及びその組成物を考
案している。

Ｄ、接種物 別の態様において、本発明のポリペプチド、その抗原的
に関連する変異体又は、本発明の実質的に純粋なパピロ
ーマウィルス潜伏性タンパク質は、医薬的に許容される
水性希釈剤組成物中、その効果量を投与したとき、パピ
ローマウィルス潜伏性タンパク質と免疫反応する抗体を
誘導することができる接種物を作るのに用いられる。

種々の文法型の゛接種物″′という冶は、パピローマウ
ィルス潜伏性タンパク質に対する抗体の調製に用いられ
る活性成分として、本発明のポリペプチド又は実質的に
純粋なパピローマウィルス潜伏性タンパク質を含む組成
物を示すの用いられている。

ポリペプチドを抗体の誘導に用いるとき、ポリペプチド
は、単独で、又は結合体としてキャリヤーに結合して、
又はポリペプチドポリマーとして用いることができるが
、それらは本発明のポリペプチドの種々の態様を平易に
表現するため、種々の文法型の“ポリペプチドという語
が集約的に使用される。

約３５個以下のアミノ酸残基を含むポリペプチドに対し
ては、すでに述べてきたように、抗体産生の誘導のため
には、キャリヤーに結合したペプチドを使用することが
望ましい。

先に示したように、１個以上の付加的アミノ酸残基がポ
リペプチドのキャリヤーへの結合を助ける目的で、ポリ
ペプチドのアミノ−又はカルボキノ末端に付加するごと
ができる。ポリペプチドのアミノ−又はカルボキン末端
に付加したシスティン残基は、ジスルフィド結合を介し
て結合体を形成するのに特に有用であることが分ってい
る。しかし、結合体を形成するための、当分野でよく知
られている他の方法も用いることができる。

代表的付加結合操作には、ミカエル付加反応産物、グル
タルアルデヒドのようなジアルデヒドの使用、クリプス
タイン（Ｋｌｉｐｓｔｅｉｎ）等、ジャーナル・オフ・
インフェクシャス・ディンーズ（Ｊ。

Ｉｎｆｅｃ、Ｄｉｓ、）ｌ　　４７．３１８−３２６　
　（１９８３）及びこれに類するもの、又は、キャリヤ
ーへのアミド結合を形成する、水溶性カルボジイミドの
使用におけるような、カルボジイミド技術の使用などが
含まれる。

タンパク質結合体又は活性化官能基を介しての結合に関
するレヴユーは、オーラメアス（Ａｕｒａｍｅａｓ）等
、スカンジナビアン・ジャーナル・オフ・イムノロジー
（Ｓｃａｎｄ、　Ｊ、　Ｉｍｍｎｏｌ、）　８巻、ン甫
−１，７７−２３（１９７８）参照。

有用なキャリヤーは当分野ではよく知られており、また
、−ｒＣに、それらはタンパク質自体である。このよう
なキャリヤーの代表例には、キーホールリンペットヘモ
シアニン（ＫＬＨ）、エデスチン、チログロブリン、ウ
シ血清アルブミン（ＢＳＡ）又はヒト血清アルブミン（
ＩＳＡ）などのアルブミン、羊赤血球（Ｓ　ＲＢ　Ｃ）
のような赤血球、テタヌストキソイド、コレラトキソイ
ド及びポリ　（Ｄ−リジン、Ｄグルタミン酸）などのポ
リアミノ酸及びこれに類するものがある。

キャリヤーの選択はその接種物の最終的使用法に依存し
ており、本発明に特に関係しない規準に基づいて行なわ
れる。例えば、接種を受けた特定の動物中で都合の悪い
反応が起こらないキャリヤーを選択するべきである。

本接種物には、効果的免疫原量の、本発明のポリペプチ
ド又は潜伏性パピローマウィルスタンパク質を含み、ま
た−船釣に、ポリペプチドの場合は、キャリヤーに結合
した結合体として用いられる。単位投与量当りの、ポリ
ペプチド又はタンパク質の効果的量は、とりわけ、接種
される動物種、その動物の体重、及び選択される接種処
方に依存する。このことは、当分野ではよく知られてい
ることである。−船釣に接種物は、接種（投与）当り、
約１０マイクログラムから約５００ミリグラムの濃度、
好ましくは、投与当り、約５０マイクログラムから約５
０ミリグラムの濃度のポリペプチド及びタンパク質を含
んでいる。

本発明の接種物に使用される“単位投与”という語は、
必要とされる希釈剤、すなわち、キャリヤー又はビヒク
ルとともに、望ましい免疫原的効果を生ずると計算され
た、所定計の活性物質を含む、動物に対する１回の投与
に適した物理的に分離した単位を意味している。本発明
の接種物の単位投与量の処方は、（ａｌ活性物質独自の
特性及び達成すべき特定の免疫学的効果、及び（１））
動物への免疫学的使用のための、このような活性物質を
調合する分野に内在する制限により記述され、かつこれ
らに直接依存しており、これらの要素は、ここで詳細に
公開されており、本発明の特徴ともなっている。

一般的に、接種物は、水、食塩水、又はリン酸緩？Ｊｉ
液などの生理的に許容される希釈剤又はビヒクル中に、
ポリペプチド結合体を分散して水性Ｎ、■成物を作るこ
とにより、乾燥した固体ポリペプチド結合体から調装す
ることができる。同様Ｃ二潜伏性パピローマウィルスタ
ンパク質を含む接種物は、−船釣に、同様の生理的に許
容されるん択剤ｒｆ＋　ｌこ分散することにより、実質
的に純粋な潜伏性バビローマウ・イルスタンバク質から
Ｊ周製する。このような希釈剤は当分野ではよく知られ
ており、また、例えば、“レミントン・ファーマンユー
ティカ）ｌ／−サイエンス”　　（Ｒｅｍ＋ｎｇｔｏｎ
’　ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ＋ｃａｌ　Ｓｃ＋ｅｎｃ
ｅ）　７８１６　ｒｆＡ、マソク出版、イーストン、Ｐ
Ａ川、（１９８０）、１４６５−１４６７頁で議論され
ている。

また、接種物は、希釈剤の一部としてアジュバントを含
むこともてきる。完全フロインドアジュバント　（ＣＦ
Δ）、不完全フロインドアジュバント　（ＩＦＡ）及び
ミョウバンのようなアジュバントは、当分野でよく知ら
れている１勿質であり、また、いくつかの販売元から市
販されている。

Ｅ、抗体及び抗ポリペプチド抗体 種々の文法型の″抗体”という語は、−群の免疫グロブ
リン分子そして、または免疫グロブリン分子の免疫学的
活性領域、すなわち、抗体結合部位又はバラトープを含
む分子、を含む組成物を差して用いられる。

“抗体結合部位゛′とは、特異的に抗原を結合（と免疫
反応）する重鎖及び軽鎖可Ｗ及び超可変領域を含む抗体
分子のｋｌ、Ｌ　菌子！戎である。

種々の文法型○゛抗体分子″′という語句は、ワ；来の
免疫クロプリン分子及び免疫クロプリン分÷−の免疫学
的活性領域を意味して用いられている。

代表的抗体分子には、本来の免疫クロプリンで）・子、
実質的な免疫グロブリン分子及び当分野てＦａｂ、Ｆａ
ｂ’　、Ｆ（ａｂ’　）２及びＦ　（ｖ）として知られ
ている領域を含む、パラトープを含む免疫クロッリン分
子のこれらの領域がある。

抗体のＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２領域：ま、各々、パパ
イン及びベプンンによるタンパク質分解反応によりｇｍ
ｌされる。例えばチオフィロポラス（Ｔｔ＋ｅ。

ｆ　ｉ　１ｏｐｏｌａｕｓ）及びデクソン（Ｄｉｘｏｎ
）に対する米国特許第４．３１１２．５６６号参照。

また、Ｆ’　ａ　ｂ　’抗体領域もよく知られており、
ノルカプトエタノールなと゛て、２つの重鎮領土或を結
合するジスルフィド結合の還元と、つづく、ヨードアセ
トアミドのような成葉による、生成したタンパク質メル
カプタンのアルキル化により、Ｆ（ａｂ’）２領域から
生成する。本来の抗体分子を含む抗体が好ましく、ここ
では例として使用している。

種々の文法型の“免疫反応”という語は、抗原決定基含
有分子及び全抗体分子又はその一部のような、抗体結合
部位を含む分子間の結合を意味している。

免疫反応は、抗体結合部位及び結合した抗原決定基を含
む免疫反応産物を生成する。結合が、ここで説明されて
いるＥＬＩＳＡ法、イムノブロッティング法、免疫染色
法又はそれに類するものにより測定しうる星の免疫反応
物を生じるなら、この免疫反応は実質的なものと言える
。

“抗原決定基”は抗体結合部位により免疫学的に結合さ
れる、抗原の実際の構造領域を意味している。この語は
“エピトープ”と同義的に使用される。

本発明の抗体は、以下に示すパピローマウィルス潜伏性
タンパク質、 ａＨ１２ｋｄ分散タンパク質、 ｂ）５４ｋｄ繊維状タンパク質、 Ｃ）４８ｋｄ繊維状タンパク質、 ｄ）５１ｋｄ核タンパク質、 ｅ）５８ｋｄ核タンパク質、 ｆ）２６ｋｄ核タンパク質、 ｇ）４８ｋｄ核タンパク質、 の１つと免疫反応する実質的に単離した、または実質的
に純粋な抗体分子を含むことで特徴づけられる。

“実質的に単離した”という語句は、抗体中に存在する
少なくとも約１０％、好ましくは少なくとも約２５％、
より好ましくは、少なくとも約５０％がパピローマウィ
ルス潜伏性タンパク質又はパピローマウィルス関連ポリ
ペプチドを指向するものであることを意味する。

“実質的に純粋”という語句は、抗体中に存在するタン
パク質の少なくとも約１％、好ましくは少なくとも１０
％、より好ましくは、少なくとも５０％が抗体結合部位
を形成するタンパク質分子であることを意味している。

好ましい態様において、考案された抗体は、ａ　）　Ｉ
Ｉ　ｅ　Ｌ　ａ細胞中に存在する７０ｋｄタンパク質、
ｂ）　Ｃａ５ｋｉＶｌｌＩ胞中に存在する２０ｋｄタン
パク質、ｃ）　Ｃａ５ｋ＋細胞中に存在する１５ｋｄタ
ンパク質、ｄ）　Ｃａ５ｋｉ細胞中に存在するｌ１ｋｄ
タンパク質、又は、 ｅ）　Ｃａ５ｋｉ細胞中に存在する１Ｏｋｄタンパク質
、と免疫反応しない。

別の態様において、本発明は、（１１ポリペプチド、好
ましくは、唯１つのポリペプチド、及び（２）ａＮ１２
ｋｄ分散タンパク質、 ｂ）５４ｋｄ繊維状タンパク質、 Ｃ）４８ｋｄ繊維状タンパク質、 ｄ）５１ｋｄ核タンパク質、及び ｅ）５８ｋｄ核タンパク質 からなる群から選ばれるパピローマウィルス潜在性タン
パク質の少なくとも１つ、と免疫反応する抗体分子を含
む抗ポリペプチド抗体を考案している。

好ましい態様において、考案された抗ポリペプチド抗体
は実質的に、 ａ　）　Ｉｔ　ｅ　Ｌ　ａ細胞中に存在する７０ｋｄタ
ンパク質、ｂ）　Ｃａ５ｋｉ細胞中に存在する２０ｋｄ
タンパク７１、ｃ）　Ｃａ５ｋｉ細胞中に存在する１５
ｋｄクンバク質、ｄ）　Ｃａ５ｋｉ細胞中に存在する１
ｌｋｄタンパク質、又は ｅ）　Ｃａ５ｋｉ細胞中に存在する１０ｋｄタンパク質
、とは免疫反応しなし・。

弐 ４八ＤＰＡＧＴＮＧ［ＥＧＴＧＣ ＩＩ　Ｅ　Ｄ　Ｅ　Ｄ　Ｋ　Ｅ　Ｎ　Ｄ　Ｇ　Ｄ　Ｓ　
Ｌ　Ｐ　Ｔ　ＣＲｌ）　ｒｉ　Ｋ　Ｓ　Ｎ　Ｋ　Ｓ　Ｔ
　ＣＣＣＣＤ響ＣＩ八八ＦへへＴＰＳ　ｌ　。

ＴＹＤＳＥＷＱＲＤＱＦＬＳ［］νＫＩＰＣ。

＋１ＫＳＡＩνＴＬＴＹＤＳＥＷＱＲＤ［］Ｃ。

ＣＩＮＣ［］ＫＰＬＣＰＥＥＫＱＲＩ＋からなる群から
選ばれるポリペプチド、好ましくは、唯一のポリペプチ
ドと免疫反応する、ポリクローナル抗ポリペプチド抗体
がより好ましい。

さらに、ヤギ、ウマ、ウサギ及びそれに類するもののよ
うな、ヒト以外のボ乳動物を免疫することにより作られ
る、抗ポリペプチド抗体も好ましい。代表的抗ポリペプ
チド抗体とは、抗２３５、抗２３６、抗２３７、抗２３
８、抗２４５、抗２４６及び抗２４７と命名した、ウサ
ギ中で作られるものである。

本発明の抗体は一般的に、本発明の接種物でホ乳類動物
を免疫化し、それにより、そのホ乳動物中、適当なポリ
ペプチド免疫特異性を有する抗体分子を誘導することに
より生産される。それからこの抗体を、このホ乳動物か
ら回収し、ついで例えば免疫アフィニティークロマトグ
ラフィーのような、従来技術により望まれる程度に単離
、精製する。それから、単離した抗体分子含有組成物に
ついて、先に述べた免疫特異性に従がい、免疫反応する
能力の評価を行ない、また、このように調製した、適当
な免疫特異性を有する、これらの組成物を、本発明の抗
体組成物として保存する。このようにして生成した抗体
は、なかでも、体液サンプル中の潜伏性パピローマウィ
ルスタンパク質の存在を検定する、本発明の診断法及び
診断システムにおいて用いろことができる。

本発明のポリペプチドにより誘導される、本発明の抗体
は、それらが本来のウィルス潜伏性関連のバビＬ１−マ
ウイルスコーＦ化タンパク質に似ている、そのエピトー
プと比較して、比較的に少ないエピト−プを有する免疫
原（比較的小さいポリペプチド）に対して生じるもので
あるので、天然のボリク［１−ナル抗体と比べ、オリゴ
クローナル抗体と呼ぶことができる。結果的に、本発明
の抗体分子は、そのポリペプチドのエピト−プと結合す
るが、一方全潜伏性バビローマウイルスタンパク質に対
して生じる天然の抗体は、このタンパク質分子全体を通
してのエピトープと結合し、従ってポリクローナル抗体
と呼ばれる。

別の態様において、本発明の抗体は潜伏性パピローマウ
ィルスタンパク質関連ポリペプナド、すなわら、潜伏性
タンパク質ＯＲＦ、好ましくは、Ｅ　１、＋５２又はＥ
６から誘λ９されるポリペブチ１と免疫反応する、実質
的に単離された抗体分子を含むことで特徴づけられる。

式、 ５ＳＴＷＩＩＷＴＧＩＩＮＶＫＨＫＳＡＩＶＴＬＴＹＤ
ＳＩＥＷ旧？ＤＣ。

［ＥＫＴＧＩＬＴＶＴＹＩＩＳＥＴＱＲＴｌ？Ｃ１１Ｋ
ＩＩＡＩＶＴＶＴＹＯ３ＥＥＱＲＱＱＣ１１ＫＮＡＴシ
ＴＬＴＹＳＳＥＩミ旧ン０（１Ｃ５ＫＮＧ　ＩＶＴＶＴ
ｌ？ＶＴＥ口ＱＱＱＭＣで表わされるポリペプチドと免
疫反応する、実質的に単離された抗体分子が好ましい。

−静的に、これらの抗体は潜伏性パピローマウィルス感
染した。患打にみられる、抗潜伏性パピローマウィルス
タンパク″ｎ抗体含有血清から、固定化した潜伏性パピ
ローマウィルスタンパク質関連ポリペプチドを用いた、
イムノアフィニティークロマトグラフィーにより得られ
る。本態様の好ましい抗体は、潜伏性パピローマウィル
ス感染、好ましくは、タイプ１６．１８．６．１１又は
３３のヒトパピローマウィルス又はそれに類するものに
引き起こされる感染を受けた患者の血清からｔ）ｙ離さ
れるヒトの抗体である。特に、例１５で調製される、ヒ
トの抗体が好ましい。

■パ、七ツクｍｌ−ナル抗体（■酸物 パピローマウィルス潜伏性タンパク質と免疫反応する抗
体分子を含むモノクローナル抗体も吟享されている。種
々の文法型の“モノクローナル抗体゛という語句は特定
の抗原と免疫反胞、することかできる、唯一の抗体結合
部位を有する一群の抗体分子を意味する。したがって、
−静的にモノクし１−ナル抗体は免疫反応する抗原に対
し、歌−の結合親和性を示す。それゆえ、モノクし１−
ナル抗体には各々が異なる抗原に免疫特異性を有する、
複数の抗体結合部位を有する抗体分子、例えば特異的モ
ノクローナル抗体が含まれる。

−・般に、モノクローナル抗体組成物は唯一種の抗体分
子を分泌（生産）するハイブリドーマと呼ばれるｊｊｌ
−細胞クローンにより生産される抗体を含んでいる。こ
のハイプリドーマ細胞は、抗体産生細胞と、ミエローマ
又は他の自己増殖細胞系列と融合することにより生成さ
れる。ごのような抗体はここで、その説明を参考として
引用した、コラ−（Ｋｏｈｌｅｒ）及びミルスタイン（
Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）　（ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、
　　２５６．　４９５−４９７（１９７５））により初
めて報告された。

ある態様において、本発明のモノクローナル抗体組成物
は、次に示すパピローマウィルス潜伏性タンパク質、 ａ）ｌ１２ｋｄ分散タンパク質、 ｂ）５４ｋｄ繊維状タンパク質、 Ｃ）４８ｋｄ繊維状タンパク質、 ｄ）５１ｋｔｌ核クンバク質、 （り５８ｋｄ核タンパク質、 ｆ）２６ｋｄ核タンパク質、又は ＋；）４８ｋｄ核タンパク質 のうらの１つと免疫反応する抗体分子を含むごとにより
特徴づけろれる。

本発明のモノクローナル抗体は、 ａ　）　１ｌｅＬａ４ａ胞１１弓こ存在する７０ｋｄタ
ンパク質、ｂ）ＣａＳｋｉ細胞中に存在する２０ｋｄタ
ンパク質、ｃ　）　Ｃａ５ｋｉ細胞中に存在する１５ｋ
ｄタンパク質、ｄ　）　Ｃａ５ｋｉ細胞中に存在する１
ｌｋｄタンパク質、又は ｅ）ＣａＳｋｉ　細胞中に存在する１Ｑｋｔｊタンパク
質、と、実質的に免疫反応しないことが好ましい。

別のｇ　ＦｊＱにおいて、本発明は、本発明のポリペプ
チド及びパピローマウィルス潜伏性タン、ＸＩり質と免
疫反応する抗体分子を含む抗ポリペプチドモノクローナ
ル抗体を考案している。

抗体ポリペプチドモノクローナル抗体は、ａ　）　ｆｌ
ｅＬａ細胞中に存在する７０ｋｄタンパク質、ｂ）Ｃａ
Ｓｋｉ細胞中に存在する２０ｋｄタンパク質、Ｃ）　Ｃ
ａ５ｋｔ　１ｆｌ胞中に存在する１５ｋｄタンパク質、
ｄ　）　Ｃａ５ｋｉ　細胞中に存在する１ｌｋｄタンパ
ク質、又は、 ｅ　）　Ｃａ５ｋｉ細胞中に存在する１Ｑｋｄタンパク
質、と、実質的に免疫反応しないことが望ましい。

好ましい態様においては、モノクローナル抗体が、アミ
ノ酸残基配列が第１、第２又は第３表に示したポリペプ
チドに対応するポリペプチドと免疫反応する。特に好ま
しいモノクローナル抗体は第４表に示したハイブリドー
マにより産生されるる抗体分子を含んで５）る。

第４に 七ツク１コーナル（）を体産牛ハイブリ１−マ０１セド
１　　ポリペプチド名２　ハ・イブリトーマ名１ミＩ　
　　　　　　２３５　　　　　　　２３５：Ｂ９ＩＥＩ
２３８２３８：８１ミ９ ＋Ｅ２　　　　　２４５　　　　　　　２４５　：　１
ＩＥ３１ｉ６２４７　　　　　　　２４７：４Ｄ１１＋
４６　　　　　２４７　　　　　　　２４７　：　１０
Ｆ７ＩミＧ　　　　　　２４７　　　　　　　２４７＋
ｌＩＤ１１１、読み枠（ＯＲＦ）名は、そのポリペプチ
ドアミノ酸配列が由来する、第１図に示したＯＲＦに対
応している。

２、　ポリペプチドは第１表に示したアミノ酸配列を有
している。

２３５：Ｂ９．２４５：１ＩＥ３及び２４７：ｌＩ　Ｄ
　１１と命名された、好ましいモノクローナル抗体産生
ハイブリドーマは、１９８８年５月１２目、ＭＤ月４、
ロノクヒ゛ル、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレ
クション（Ａ　Ｔ　ＣＣ）に、ハイブリ１−−マ培孜物
として保管され、各々受理番号Ｉ！　１３９７２０、ｌ
−１ｆ３９７１８及び１ＩＢ９７１９が古り）１１てら
れた。

別の態様において、本発明は式、 ５ＳＴＷＩＩＷＴＧＩＩＮＶＫＩＩＫＳＡ　ＩＶ’ｎＴ
ＹＤＳＥＷ［１Ｒｔ）ＣＥＫ’ｒＧ　ＩＬＴＶＴＹＩＩ
ＳＥＴＱｌ？ＴＲＣ１１に１１ＡＩＶＴＶＴＹＯ５ＥＥ
ＯＲ［１（Ｉｃ。

＋１ＫＮＡ　ＩＶＴＬＴＹＳＳＥＥＯＲＱＱＣ５ＫＮＧ
ＩＶＴＶＴＦＶＴＥ［ｌ（ＩＱＱＭｃで友ねされるポリ
ペプチドと免疫反応する抗体分子を含む抗ポリペプチド
モノクローナル抗体を考案している。

本発明のモノクローナル抗体は、適当な免疫特異性を有
する抗体分子を分泌する、本発明のハ・イブリドーマを
含む栄養培地からなるモノクローナルハイブリドーマ培
養を開始することによっ゛Ｃ生産することができる。こ
の培養を、ハイブリドーマが培地中に抗体分子を分泌す
る条件及び時間、￥１１：持する。その後、この抗体含
有培地を回収する。

さらにこの抗体分子を従来法によりｉ↑’−１ｔｔｔす
る。

高濃度の重積製モノクローナル抗体を作るため、目的の
ハイブリドーマをマウス、好ましくは同系又は単回系マ
ウスに注入する。このハイブリドーマは、適当なインキ
ュヘーション時間の後、抗体産生腫瘍を形成させ、その
結果、その宿主マウスの血液及び１１Ｍ腔滲出物（ＩＩ
！水）中に、高濃度の目的とする抗体（約５〜２０ｍｇ
／ｍ＃）が生ずる。

これらの組成物調製のために有用な培地はこの分野では
よく知られ、また市販されており、これには、合成培養
培地、近交系マウス及びこれに類するものが含まれる。

代表的合成培地は、４．５ｇ／ｌのグルコース、２０關
グルタミン及び２０％ウシ胎児血清を補ったダルベコ最
小基礎培地（ＤＭＥＭ　；ダルベコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ
）等、ピロロジー（Ｖｉｒｏｌ、）８．　３９６　　（
１９５９）　）である。代表的近交系マウス株はＢａ１
ｂ／ｃである。

上記の方法で産生されるモノクローナル抗体組成物は、
例えばパピローマウィルス潜伏性タンパク質含有免疫産
物の生成が望まれる、診断法及び免疫精製法で使用する
ことができる。

Ｇ　ハイブリドーマ及びその他のモノクローナル抗体産
生細胞及びその調製法 本発明のハイブリドーマは、本発明のモノクローナル抗
体を産生ずる能力を有することを特徴とするものである
。望ましい免疫特異性の、すなわち、特定のタンパク質
、特定のタンパク買上の同定可能なエピトープそしてま
たは、ポリペプチドと免疫反応する能力を有する抗体分
子を産生（分泌）するハイブリドーマを生産方法は当分
野ではよく知られているものである。ここで参考のため
引用している、ナイマン（Ｎｉｍａｎ）等（プロンーデ
インク・イン・ナショナル・アカデミ−・オフ・サイｘ
ｙス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　５ｃ３）　
　ＵＳΔ８０．４９４！Ｊ−４９５３（１９８３））及
びガルフレ（Ｇａｌｆｒｅ）等（メソッズ・イン・エン
ザイモロジー（Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍｏｌ、）　７３　
、　３−４６　（１９８１））の方法は特に応用性が高
い。

一般的に、本発明のハイブリドーマは上述の技術におい
て本発明の、実質的に純粋な潜伏性パピローマウィルス
クンバク質又はポリペプチドを免疫原として用いること
により、生産することができる。

Ｈ３診断システム 本発明のキット型の診断システムには、少なくとも１回
の検定を行うのに十分な量の、各々別々にパッケージさ
れた試薬として本発明の実質的に純粋なパピローマウィ
ルス潜伏性タンパク質、ポリペプチド、抗体、抗ポリペ
プチド抗体、モノクローナル抗体、又は抗ポリペプチド
モノクローナル抗体が含まれる。このパッケージされた
試薬の使用説明書を含めるのが一般的である。

ここで使用されているように、゛′パッケージ″′とい
う語は、本発明のポリペプチド、抗体組成物又はモノク
ローナル抗体組成物の所定量を含めることができる。ガ
ラス、プラスチック、紙、ホイル及びこれに類するもの
等の、固体マトリフクス又は物質を意味する。従って、
例えば、パッケージは、ミリグラム量の考案ポリペプチ
ドを含めるのに用いられるガラスのバイアルであること
も可能であり、また、マイクログラム量の考案のポリペ
プチドを機能的に固定した、すなわち、抗（２幻＝よる
免疫学的に結合が可能なように結合した、マイクロプレ
ートのウェルであることも可能である。

−静的に、゛使用説明書″には、試薬の濃度又は、試薬
と投与を受（するサンプルのｌｌ目対量、試＝■／サン
プル混合物の維持時間、温度、バッファ条件及びこれに
頚するもの等の、少なくとも１回Ｃ）検定方法のパラメ
ータを記述し、た実際的表現が含まれている。

１つの態様において、身体サンプル中の潜伏Ｉ生の（ｌ
ａｔｅｎｔ）乳頭腫ウィルス感染の存在をアン七・１′
する診断系は潜伏性の乳頭腫ウィルスタンパク質と免疫
反応する本発明の抗体を含有するパッケージよりなる。

好ましくは抗体は本発明のモノクローナル抗体である。

より好ましくは抗体分子は本発明のハイブリドーマによ
って生産される抗体の分子である。抗体分子が酵累ラベ
ルに結合しているキットがさらに好ましい。

このように好ましい態様において本発明の診断系はさら
に本発明の抗体分子またはポリペプチドを含有する複合
体の生成を信号で知らせることができるラベルもしくは
指示手段を含有する。

ここで用いる用語「複合体」は抗体−抗原反応のような
特異的結合反応の生産物を指称する。例示的複合体は免
疫反応生成物である。

ここで用いる用語「ラベル」及び「指示手段」はそれら
の種々の文法的形態において複合体の存在を示す検出可
能なシグナルの生産に直接にもしくは間接に関与する単
一の原子及び分子を指称する。いずれのラベルもしくは
指示手段も実質上純粋な潜伏性乳頭腫ウィルスタンパク
質、ポリペプチドまたは本発明の抗体もしくはモノクロ
ーナル抗体＆Ｊｌ成物の部分である抗体分子に結合する
かこれに含有されることができるか、または別々に用い
られ、それらの原子または分子は単独にまたは伺加の試
薬と共に用いることができる。このようなラベルは臨床
診断化学において周知であり、それらが新規なタンパク
質方法及び／または系について用いられる限りにおいて
本発明の一部を構成する。

ラベル手段は抗体もしくは抗原にそれらを変性させるこ
となく化学的に結合して有用な免疫螢光トレーサーであ
るフルオロクロム（ｆ　ｌｕｏｒｏｃｈｒｏｍｅ）（染
料）を生成する螢光ラベル剤であることができる。適当
な螢光ラベル剤はフルオレセインイソシアネート　（Ｆ
ＩＬ）、フルオレセインイソチオシアネート　（ＦＩＴ
Ｃ）、５−ジメチルアミン１−ナフタレンスルホニルり
ロライト′（〇へＮ５Ｃ）、テトラメチルローダミンイ
ソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、リサミン（ｌ　ｉｓ
ｓａｍｉｎｅ）　　、ｏ−ダミン８２００スルホニルク
ロライド（ＲＢ２００ＳＣ）等のフルオロクロム等であ
る。免疫フルオレセイン分析技術の記述はＤｅＬｕｃａ
、“ｌｍｍ１ｎ。

ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　　八ｎａｌｙｓｉｓ　　　
　、ｉｎ　　八ｎｔｉｂｏｄｙ　　ＡＳ　　ａＴｏｏｌ
、　Ｍａｒｃｈａｌｏｎｉｓ、　　ｅｔ　ａｌｌｅｄｓ
、、Ｊｏｈｎ　！’１ｉｌｅｙ　＆５ｏｎｓ、　Ｌｔｄ
、、　ｐｐ、　ｌ　８９−２３１　（］−９８２）に見
い出される。この文献を参考としてここに加入する。

好ましい態様において、指示基はホースラディシュ（ｈ
ｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ）ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、
アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ等の
酵素等である。主たる指示基（ｉ　ｎｄ　ｉｃａ　ｔ　
ｉ　ｎｇｔ：　ｒ　ｏ　ｕ　ｐ　）がＨＲＰ、グルコー
スオキシダーゼ等の酵素である場合には受容器−リガン
ト複合体（イムツリアククンＩｎ　（ｉｍｍｕｎｏｒｅ
ａｃｔａｎｔ）が生成した事実を視覚化するために付加
的な試薬が必要とされる。かかる付加的な試薬は）Ｉ　
ＲＰについては過酸化水素、及びジアミノヘンジン、オ
ルトフェニレンジアミン等の酸化染料プレカーサーを包
含する。

グルコースオキシダーゼについて有用な付加的試薬は２
，２′−アジノージ−（３−エチルーヘンズヂアゾリン
ーＧ−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）である。

放射性元素もまた有用なラベル剤である。例示的放射性
ラベル剤はγ−線を発する放射性元素である。それ自身
γ−線を発する元素、例えば１２４Ｉ、＋２５１．１２
１１１．１：１２１、及び５ＩＣｒは１クラスのγ−線
発生放躬性元素指示グループを表す。特に好ましいのは
１２５１である。別の有用なラベル手段の群はそれ自身
ポジトロン（Ｐｏｓ　ｉ　ｔｒｏｎ）を発するＣ１＋８
ｐ、１５０及び１ｆｆＮ等の元素である。発したポジト
ロンは動物の体内に存在する電子と出会うとＴ−線を生
成する。■１インジウム、３Ｈ等のβ−発生体も有用で
ある。

ラベルの結合、すなわちポリペプチド及びタンパク質の
ラヘリングはこの技術分野で周知である。

例えばハイブリドーマによって生産される抗体分子は培
地成分として供給された放射性同位元素含有アミノ酸の
代謝移入によってラベルすることができる。例えばＧａ
１ｆｒｅ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｅｔｔ＋、　Ｅｎｚｙｍ
ｏｌ、。

７３．３−４６　　（１９８１）参照。活性化官能基を
通してのタンパク質複合化またはカップリングの技術は
特に適用可能である。例えばＡｕｒａｍｅａｓ。

ｅｔ　ａｌ、、　５ｃａｎｄ、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ
、、　Ｖｏｌ、ａ　５ｕｐｐ１．７　ニア　　２３　　
（１９７８）　、　Ｒｏｄｗｅｌｌ　ｅｔ　ａｌ、、Ｂ
ｉｏＬｅｃｂ。

３　：　８８９−８９４　（１９８４）　、　ａｎｄ　
Ｕ、Ｓ、　Ｐａｔ。

Ｎｏ、４．４９３．７９５参照。

診断系は好ましくはまた別パッケージとして特異的結合
剤を包含することができる。［特異的結合剤Ｊは本発明
の試薬種（ｓｐｅｃｉｅｓ）を選択的に結合することが
できるが、それ自身実質上純粋なタンパク質、ポリペプ
チドまたは本発明の抗体分子でない分子体（ｅｎｔｉｔ
ｙ）である。例示的な特異的結合剤は二次（ｓｅｃｏｎ
ｄ）抗体分子、補体タンパク質もしくはその断片（ｆｒ
ａｇｍｅｎｔｓ）　、　Ｓ、ａｕｒｅｕｓプロティンΔ
等である。好ましくは特異的結合剤はそれが複合体の一
部として存在する場合の本発明の抗体分子もしくはポリ
ペプチドを結合できる。

好ましい態様において特異的結合剤はラベルされている
。しかしながら診断系がラベルされていない特異的結合
剤を含有する場合、剤は典型的には増幅手段もしくは試
薬として用いられる。これらの態様においてラベル化さ
れた特異的結合剤は増幅手段が試薬種含有複合体に結合
している場合増幅手段を特異的に結合することができる
。

本発明の診断キットは血清、血漿、尿等の体内流体サン
プル中に存在する潜伏性乳頭腫ウィルス（ｌｅｔｅｎｔ
　ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ）　　タンパク質と免
疫反応する抗体分子の存在または量を検出する「エライ
ザＪ　　（ＥＬＩＳハ）法（ｆｏｒｍａｔ）において用
い得る。

「エライザ」はサンプル中に存在する抗原もしくは抗体
の堡を検出し定量するために、固相に結合した抗体もし
くは抗原、及び酵素−抗原もしくは醇素−抗体複合体を
用いる酵素−結合免疫吸着アッセイを指称する。エライ
サ技術の記述はＣｈａｐｔｅｒ２２　ｏｆ　ｔｈｅ　　
４ｔｈεｄｉｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｂａ５ｉｃ　ａｎｄ　Ｃ
１ｉｎｉｃａｌＣ１１ｎｉｃａｌ１　　ｂｙ　Ｄ、　Ｐ
、　５ｉｔｅｓ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｕｂｌ＋５ｈｅｄ
ｂｙ　Ｌａｎｇｅ　！、Ｉｅｄｉｃａｌ　Ｐｕｂｌｉｃ
ａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　　Ｌｏｓ　Ａｌｔｏｓ。

ＣＡ　　ｉｎ　　１９８２　　ａｎｄ　　ｉｎ　　Ｕ、
Ｓ、　Ｐａｔｅｎｔｓ　　Ｎｏ、３，６５４，０９ＯＮ
Ｏ１３，８５０，７５２；　ａｎｄ　Ｎｏ、４，０１６
，０４３に見い出される。これらはすべてここに参考に
加入する。

かくのごとく好ましい態様において本発明の実質上純粋
なタンパク質、ポリペプチドまたは抗体分子は固体マト
リックスに付着させ（ｂｅ　Ｉａｆｆｉｘｅｄ）て固体
支持体とし、これを別個に本診断系にパンケージする。

試薬は、他の当業者に公知の付着手段も用い得るが、典
型的には水性媒体からの吸着によって固体マトリックス
に付着させる。

有用な固体マトリックスは当業界で周知である。

かかる材料はＰｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍ
ｉｃａｌｓ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ。

ＮＪ）からの商標５ＥＰＨＡＤＥＸなる名称の架橋デキ
ストラン、アカ゛ロース、ラテックス、八ｂｂｏｔｔ　
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｎｏｒｔｈ　Ｃｈｉｃａｇ
ｏ、　ＩＬ）から入手し得る直径１μ〜約５１のポリエ
チレンビーズ、塩化ポリビニル、ボスチレン、架橋ポリ
アクリルアミド、シーＩ・、条片（ｓｔｒｉｐｓ）、パ
トラ−（ｐａｄｄ　Ｉｅｒ）等のニトロセルロースもし
くはナイロン基調の織布、またはポリスチレンもしくは
ポリビニルクロライドからつくられた管、プレートもし
くは微量力価プレート穴（ｉｖｅｌｌ）を包含する。

試薬種、ラベル化結合剤またはここに記述するいずれか
の診断系の増幅試薬は溶液、分散液または実質上乾燥粉
末（例えば凍結乾燥形態）で提供され得る。指示手段が
酵素である場合、酵素の基質も系の別個のパッケージと
して提供される。前述のＦａｆｆｉ滴定プレート等の固
体支持体及び１以上のバッファーも本診断アッセイ系の
別個のパンゲージ要素として包含できる。

診断系に関してここで論議されるパッケージ［７ｊ料は
診断系で慣用的に用いられるものである。かかる材料（
まガラス及びプラスチック　（例えばポリエチレン、ポ
リフロピレン、ポリカーボネート）のボトル、バイアル
、プラスチック及びプラスチックホイルラミ２・−ト包
み（ｅｎｖｅｌｏｐｅ）等である。

別の態様において本発明の診断系は潜伏性乳頭腫ウィル
ス感染によって誘導される抗体、すなわち抗潜伏性乳頭
腫ウィルス抗体の存在をアッセイするのに有用である。

かかる系はキント形熊において、本発明の潜伏性乳頭腫
ウィルスタンパク質もしくはポリペプチドを含有するパ
ンケージよりなる。好ましくは含有されるポリペプチド
は配列した乳頭腫ウィルスゲノムのＥ領域読取り、枠（
ＯＲＦｓ）から導かれる推測アミノ酸残基配列の部分に
相同の配列を含有する。より好ましくは含有されるペプ
チドはＨＰＶのＥｌ、Ｅ２またはＥ６０ＲＦから推測さ
れる配列を含有する。

１つの態様において、考慮された診断系に、りｆプロ、
１１．１６．１８．３３及び３５についてここで開示し
たような特定のＨＰ　Ｖタイプに関するポリペプチドを
包含させるのが好ましい。本発明のＨＰ　Ｖタイプ６．
１１．１６．１８もしくは１；）関与ポリペプチド、好
ましくは配列が表１．２もしくは３に示されるそれらの
１つを包含するのか特に好ましい。

実施例で論じた結果から、ＨＰ　Ｖタイプ１６′／ｖＩ
仏性タンパク誘導抗体と反応する、ヒト乳頭腫ウィルス
の重要な抗原決定基は前述した５つのアミノ酸残基配列
−ＴＹＤＳＩＥ−（その中に含有された）によって定義
されることが明らかである。さらに、本発明のＩＩ　Ｐ
　Ｖタイプ１６関連ポリペブチ１の各々は大抵の抗１−
Ｉ　Ｐ　Ｖタイプ１６潜伏性タンパク質抗体含有血清と
反応するが、個々の患者血清はＩＩ　Ｐ　Ｖタイプ１６
関連ポリペプチドの１つと特異的に反応し、他とは反応
しないことが認められた。この観察は付加的な抗原決定
基が前述の弐ＬＴＹＤＳＩＥ−−−５ＡＩＶＴＬＴＤＹ
ＳＩＥ−−１１ＫｓＡＩＶＴＬＹＤＹｓＥ１ｉＫＳＡＩ
Ｖ−−−５ＡＩＶＴＬ−または−Ｉシ且ＴＤ−を含有す
る配列を含有する他のペプチド中に存在することを示し
ている。

従って、本発明はさらに」二記）ｊ　Ｐ　Ｖタイプ１６
関連ポリペプチドがＨＰＶタイプ１６関連ポリペプヂド
の異なる種と組合せて用いる場合にはＩＩＰＶタイプ１
６潜伏性潜伏性タンパ抗質の認識を顕著に高めるという
発見を考慮している。例示的で好ましい態様は組合せに
おけるポリペプチド６６及び２４５、または７８及び８
５、または６６．７８及び８５、及び同様な組合せを包
含する。

かくして１つの態様において診断系は本発明の１より多
くのＨＰ　Ｖタイプ１６関連ポリペブチ１種を含有する
。ポリペプチド種は個々的に別々のパッケージに存在さ
せまたは系中の別々の場所に隔βｉｆｆすることができ
るが、好ましくはそれらの種は混合して系中に存在させ
る。この組合せ方式は単一−−−１＝ソ］・中でまたは
好ましくは混合される場合ｊ１１−の固体支持体上で、
異なる免疫特異性を有する抗ＨＰ　Ｖ潜伏タンパク質抗
体を検出し、それによってかかる系のスクリーニング可
能性（ｃａｐａｂｉｌｉｔｙ）を改善する能力を提供す
る（ｐｒｏｖｉｄｅ）。

異なる乳頭腫ウィルスタイプにさらされることの間で検
出し区別するために用いられる診断系を提供することが
望まれる場合、キットは付加的ポリペプチドが、第１の
ポリペプチドが導かれたウィルスタイプとは異なる第２
のウィルスタイプの潜伏性乳頭腫ウィルスタンパク質と
免疫反応する抗体分子を免疫化によって生成する能力を
もとに選択される１つより多くのポリペプチドを含有す
る。

さらに付加的ポリペプチドは最初のウィルスタイプによ
って発現された潜伏性乳頭腫ウィルスタンパク質と免疫
反応しない抗体分子を誘導する。このように、ここで用
いる「異なる」は２つのポリペプチド誘導抗体分子組成
物が単一の乳頭腫ウィルスタイプによる潜伏性感染にお
いて生成した潜伏性乳頭腫ウィルスタンパク質と免疫反
応する能力に実質的な測定し得る差があることを意味す
る。

かくのごとく、単一ウィルスタイプの潜伏性乳頭腫ウィ
ルスタンパク質と、共には免疫反応しない抗体組成物を
誘導する能力において該ポリペプチドはタイプ特異的で
あるといわれる。

換言すれば、１つのタイプの乳頭腫ウィルス７に仏性タ
ンパク質によって誘導される抗体と免疫反応する能力を
他のタイプのタンパク質と免疫反５する能力と比較した
場合それらの能力に実質的な測定し得る差がある場合の
ポリペプチドは「異なって」おり従ってタイプ特異的で
ある。エライザによって測定される場合の免疫反応にお
ける差は実施例１４に示されるように光学密度において
０．０５、好ましくは０．１、さらに好ましくは０４よ
り大なる差があれば実質的である。

本診断系のこの態様に含めるのに好ましいクイズ特異的
ポリペプチドは前述のＨＰＶタイプ１６関連、タイプ１
８関連、タイプ６関連、タイプ■関連及びタイプ３３関
連ポリペプチドを包含する。

診断系における本発明のタイプ特異的ポリペプチドの例
示的使用は実施例１４に示す。

タイプ特異的ポリペプチドを利用する６３　ＩＪＮ用キ
ットのこの態様においては、ポリペプチドをキント内で
物理的に分は隔てて提供し、それによって含まれたポリ
ペプチドの一方もしくは他方と免疫反応する抗体の存在
の間で区別することを可能にすることができることが含
まれている。このタイプの例示的キットは第１のポリペ
プチドを機能し得るように付着させた第１の固体サポー
ト及び第２のポリペプチドを機能し得るように付着させ
ただ第２の固体サポートを包含し、そこでは２つの分り
隔てられたポリペプチドは異なる乳頭腫ウィルスタイプ
に対してタイプ特異的である。もちろん、２つの固体支
持体は固体支持体が、微量滴定穴（ｗｅｌｌ）であって
、２の穴が同じか異なるｉ数量力価プレート上にある場
合のように、同しか異なるかさばった（ｂｕｌｋ）媒体
上にあることができる。加えて、この態様はその特異性
が第１とものとも第２のものとも異なる第８のタイプ特
異的ポリペプチドを付着させた第３の固体支持体を包含
することができる。

別の態様においては、異なる夕・イブ特異的ポリペプチ
ドを含ませるすべてのベブチ）・の混合物として診断用
キット中に含有させ、もって１つの固体担体を用いて１
つより多くの乳頭腫ウィルスタイプによって引き起こさ
れた潜伏性乳頭腫ウィルス感染によって誘導された抗体
の存在をスクリーンする能力を創造する。このタイプの
キットは代表的には個々の穴に１より多くの（ｍｏｒｅ
　ｔｈａｎ　ｏｎｅ）乳頭腫ウィルスタイプに対しタイ
プ特異的であるポリペプチドの混合物を機能し得るよう
に付着させた微量力価プレート等の固体支持体を包含す
る。

■、アッセイ法 本発明は潜伏性乳頭腫ウィルスタンパク質、特にバイオ
プシン、尿道スミアまたはパップ（ｐａｐ）スミア等の
組織サンプル中に見い出されるこれらのタンパク質を、
実質上線枠な乳頭腫ウィルスタンパク質、ポリペプチド
、または本発明の抗体またはモノクローナル抗体組成物
に含有される抗体分子を含有する免疫複合体を生成させ
ることによって検出するいかなる方法をも包含する。

加えて、本発明は、乳頭腫ウィルスゲノムのヌクレオチ
ド配列から推測される潜伏性乳頭腫ウィルスタンパク質
と免疫反応する抗体分子、特に脈管系体液中のそれらの
抗体分子、例えば潜伏性乳頭腫ウィルス感染を有する患
者もしくは他の動物種の血清もしくは膣分泌物（ｓｅｃ
ｒｅ　ｔ　１ｏｎｓ）中に見い出されるそれらの抗体分
子を、実質上線枠なｔ替仏性乳頭腫つィルスタンパク質
、ポリペプチド、または本発明の抗体もしくはモノクロ
ーナル抗体中に含有される抗体分子を含有する免疫複合
体を生成させることによって検出するいかなる方法をも
包含する。

当業者はこれらの複合体を生成させるのに用いることが
できる多くの周知の臨床診断化学的手法があることを理
解するであろう。このように、例示的アッセイ法がここ
に述べられるけれども、本発明はそれに限定されるもの
ではない。

■、　　　サンプルの　　　　　　　ラベリング組織サ
ンプル中の潜伏性乳頭腫ウィルス感染の存在の検出方法
が考慮される。この態様においては本発明の抗体分子は
、乳頭腫ウィルスに感染した、頚部上皮ハイオプシイ、
コンジロームハイオプシイ、尿道スミア及びパップスミ
ア等の組織サンプル中に存在する潜伏性乳頭腫ウィルス
タンパク質と免疫反応する能力によって潜伏性乳頭腫ウ
ィルス感染を検出するのに用いる。好ましい態様におい
て、抗体分子はモノクローナル抗体組成物として存在し
、より好ましくは表４にリストしたハイブリドーマによ
って生産される。

例えば、バイオプシイサンプルは周知技術による免疫ｆ
ＪＨａ化学的分析のための固定化（ｆｉｘａｔｉｏｎ）
によって得られかつ調製される。例えばＴ　ｕ　ｂ　ｂ
　ｓ　＋へｔｌａｓ　　ｏｆ　　Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔ
ｏｌｏｇ　　、　　Ａｍｅｒｉｃａｎ　　５ｏｃｉｅｔ
ｙｏｆ　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ　Ｐｒ
ｅｓｓ、　Ｃｈｉｃａｇｏ参照。調製したバイオブシイ
サンプルを本発明の抗体分子含有組成物と混合して免疫
反応混合物を生成させる。かくして生成した混合物をサ
ンプル中に存在する潜伏性乳頭腫ウィルスタンパク質に
十分な時間生物アッセイ条件下に保って加えた抗体分子
と免疫反応させて免疫反応生成物を生成させる。免疫反
応生成物の存在をついでアッセイする。

この態様において、組織サンプル中の潜伏性乳頭腫ウィ
ルス感染の検出に用いられる抗体分子は潜伏性乳頭腫タ
ンパク質関連ポリペプチド、好ましくはＥ２　０ＲＦか
ら推測されるポリペプチドと免疫反応する実質的に単離
された抗体分子を包含することができる。この場合の例
示的抗体分子は乳頭腫ウィルス関連配列を有する固定化
ポリペプチドを用いるアフィニティークロマトグラフィ
ーによって単離される抗体分子、及び潜伏性乳頭腫ウィ
ルス感染を有する患者に見い出されるような抗層仏性乳
頭腫つィルスタンパク質抗体含有血清から単離される抗
体分子である。例示的な検出方法はＨＰ　Ｖ感染患者抗
血清から単離された抗体分子アフィニティーを用いる実
施例１６の方法である。

脈管系体液中の潜伏性乳頭腫ウィルスタンパク質と免疫
反応する抗体、すなわち抗乳頭腫つィルスタンパク質抗
体の存在及び好ましくは量を検出するために、種々の不
均一系及び均−系の、及び競合的もしくは非競合的アッ
セイのプロトコルを用いることができる。

特に、本発明は血清、血漿、膣分泌物、尿等の体液サン
プル中の、潜伏性乳頭腫ウィルスタンパク質と免疫反応
する抗体分子の存在及び量を検出するための、ここに述
べるエライサ方弐を意図する。この方法においては、サ
ンプル中に存在する抗体の量を検出、定量するために本
方法は固体用（固体支持体）に結合した抗原もしくは抗
体、及び酵素−抗原もしくは酵素−抗体複合体を用いる
。

好ましい態様において固体用に結合する抗原は本発明の
ポリペプチドである。

例えば、ヒト血液サンプル、及び本発明のポリペプチド
を付着させた固体支持体を混合する。混合物を生物アッ
セイ条件下に抗体が同相ポリペプチドと免疫反応して免
疫反応産物を生成するのに十分な時間保持する。ホース
ラディシュ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ）ペルオキシダー
ゼでラベルした抗ヒトＩｇＡ抗体等の第２ラベル化抗体
をついで第１の免疫反応生成物含有固体支持体と混合し
、生物アッセイ条件下に最初の免疫反応産物がラヘル化
抗体と免疫反応し、ラベルされた第２の免疫反応産物を
生成するに十分な時間保持する。ついでラベルされた第
２免疫反応産物を未反応ラヘル化抗体から代表的には未
結合ラベルを除去するに十分なほど該固体支持体を洗浄
することによって分離する。ついでラベルされた免疫反
応産物の量をアッセイする。

生物アッセイ条件は本発明の抗体分子及びポリペプチド
分子及びアッセイしようとする抗体分子の生物活性を維
持する条件である。これらの条件は約り℃〜約４５゛Ｃ
の温度、好ましくは約３７゛Ｃ１約５〜約９、好ましく
は約７のｐＨ値、及び蒸留水のイオン強度〜約ＬＭの塩
化ナトリウムのイオン強度、好ましくは生理的食塩水の
イオン強度を包含する。かかる条件を最適化する方法は
当分野で周知である。

好ましい態様において、本エライサ方式アッセイ法はＨ
ＰＶタイプ１６のＥｌ、Ｅ２またはＥ６０ＲＦ、から推
測されるポリペプチド、特にそのアミノ酸残基配列が表
１にリストした配列であるポリペプチドを用いる。さら
に−層好ましくはＨＰ　Ｖタイプ１６ボリベブチド２３
７．２４５及び２４６である。抗潜伏性乳頭腫ウィルス
タンパク質を検出するのに使用するために好ましい付加
的ＩＩ　Ｐ　Ｖタイプ１６関連ポリペプチドは表２にリ
ストしたものである。

別の態様において、本発明のアッセイはタイプ１６以外
のタイプのヒト乳頭腫ウィルスの抗＋１ＰＶ潜伏性タン
パク質抗体の、他の生殖器乳頭腫ウィルスのＥ２０ＲＦ
領域から推測されるＨＰＶ関連ポリペプチドの使用によ
る検出を包含する。

ＨＰ　Ｖ関連ポリペプチドは好ましくはタイプ６．１１
．１８及び３３から推測されたもの、特に表３に示すも
のである。

種々のポリペプチドを利用する例示的エライサ法を実施
例に示す。

本発明は２つの異なる競合方式において基本的エライザ
を用いる、抗層仏性乳頭腫つィルスタンパク質抗体の存
在好ましくは星を検出するための競合アッセイ方法を包
含する。

１つの方式においては、以下の工程よりなる抗層仏性乳
頭腫つィルスタンパク質抗体の存在について体液サンプ
ルをアッセイするための方法を包含する： （ａｌ　　体液サンプルを（１）固体支持体に付着した
本発明のポリペプチド及び（２）付着させたポリペプチ
ドと免疫反応する本発明の液相ラベル化抗ポリペプチド
抗体の予め定めた一定量と同時に混合して固体及び液体
相を有する競合免疫反応混合物を生成させる。好ましく
は体液サンプルは既知量の血液、血清、血脩、尿、唾液
、精液または膣分泌物である。

（ｂ）　　混合物を生物アッセイ条件下に、サンプル中
に存在するいずれかの抗層仏性乳頭腫つィルスタンパク
質抗体がポリペプチドと免疫反応するのに十分であり、
及びまたラベルされた抗ポリペプチド抗体が同じポリペ
プチドとの免疫反応について競合するのに十分である約
り℃〜約４５℃の温度で予め定められた時間例えば約１
０分〜約１６〜２０時間保持して、固相ラベル化抗ポリ
ペプチド含有免疫反応産物を生成させる。

（Ｃ１固体相中のいずれかのラベル化抗ポリペプチド含
有免疫反応産物の存在をアッセイし、それによって免疫
反応混合物中のいずれかの抗層仏性乳頭腫つィルスタン
パク質抗体の存在も求める。好ましくは生成したいずれ
のラベル化抗ポリペプチド含有免疫反応産物の量を求め
、それによってサンプル中に存在する抗層仏性乳頭腫つ
ィルスタンパク質抗体の量を求める。

別の方式においては、本発明の競合エライザは次の工程
よりなる。

（８１前記方式と同様、体液サンプルを（１）固体支持
体に付着させた本発明のポリペプチド、及び（２）液相
中の予め定めた量の同一ポリペプチドまたは免疫交差反
応性ポリペプチドと実質上同時に混合して固相及び液相
を有する競合免疫反応混合物を生成させる。

（ｂ）　　混合物を、生物アッセイ条件下サンプル中に
存在するいずれかの抗層仏性乳頭腫つィルスタンパク質
抗体が同相もしくは液相ポリペプチドと免疫反応するに
十分な時間維持して同相及び液相ポリペプチド含有免疫
反応産物を生成させ、及び ＦＣ＋　　生成した固体用ポリペプチド含有免疫反応生
成物の存在をアッセイし、それによって免疫反応混合物
中の抗層仏性乳頭腫つィルスタンパク質抗体の存在をア
ッセイする。

第２の方式の異なる態様においては、液相中のポリペプ
チドは固相中のポリペプチドと同じでなくまたそれと実
質上免疫的に交差反応しない。かくして、アッセイに含
まれる２つのポリペプチドはここで定義された「異なる
」の意味での異なる乳頭腫ウィルスタイプ特異的ポリペ
プチドである。

例えば、ＨＰＶタイプ１６関連ポリペプチドが固体用に
存在し、ＨＰＶ６関連ポリペプチドが液相に存在するが
具体的には例えばそれぞれポリペプチド２４５及びに−
７０である。かかる競合アッセイ方式は検出された抗Ｈ
Ｐ　Ｖ　潜伏性タンパク質抗体を誘導した、存在するＨ
ＰＶタイプを識別する方法を提供する。

実施例 以下の実施例は本発明を例示するものであり限定するる
ものではない。

１、泄丈ぺ１九を介戚 アミノ酸残基配列において、種々のＨＰＶタイプ１６Ｅ
　ＯＲＦによってコード化された潜伏性タンパク質の部
分（ｐｏｒｔｉｏｎｓ）に対応するポリペプチドをＬＩ
Ｓ特許４６３１２１１　　（この開示をここに参考とし
て加入する）に開示された固相法に従って化学合成した
。

合成されたポリペプチドのアミノ酸残基配列及びＨＰＶ
　　Ｅ領域ＯＲＦ、の推測されたアミノ酸配列を表１に
リストする。

付加的１−Ｉ　Ｐ　Ｖ　Ｍ連ポリペプチドは上記固相法
によって化学合成したが、各々のポリペプチドはアミノ
酸残基配列として表２及び３にリストした配列の１つを
存していた。

２、　ポリクローナル　ポリペプチド　血？１の貝製 ａ、　　”’　　（ｒｅｄｕｃｅｄ）ポリペプチドの調
実施例１に記述した方法で調製したポリペプチドを分析
してシスティン含量を求めた。１２５μｇのポリペプチ
ドを含有するＰＥバッファー〔０，１Ｍリン酸ナトリウ
ムバッファー、ｐｌ＋７．２．５ｍＭエチレンジアミン
テトラ酢酸（ＥＤＴＡ））の１ｍ７！容量溶液を、ＤＴ
ＮＢ溶液（メタノール中の１ｍＭジチオニトロ安息香酸
）１００μｌと混合し、室温で３０分保持した。混合物
の光学密度（０，０，）をＰＥハソファー単独のコント
ロール溶液に対し４１２ｎｍで測定した。グルタチオン
を用いる％　ｉ％凸曲線そこではＰＥバッファー中の２
８μｇ／ｍｆｆ溶液が４１２ｒ＋＋ｎで約１．１４０゜
Ｄ、単位を示す）と比較して、測定される各ポリペプチ
ドについてＴＩ’Ｒｄシスティンの量を求めた。７５％
より少ない酸化された利用し得るシスティン残基を有す
るポリペプチドは還元されたポリペプチドとみなした。

７５％より多くの酸化された利用し得るシスティン残基
を有するポリペプチドは上記したようにして還元に付し
た。

ポリペプチドは１０ｍｇのポリペプチドと５０ｍ！４リ
ン酸ハンフｙ　　　（ｐＨ８，０）　　１ｍｌ中の１０
ｍｇジチオスレイトール（ＤＴＴ、　Ｓｉｇｍａ　Ｃｈ
ｅｍｉｃａｌ　Ｃ。

ｓｔ　　Ｌｏｕｉｓ、　！、１０）とを混合し、混合物
を室温て連続的に撹拌しながら保持することによって還
元した。

撹拌６０分後、５０μβの濃酢酸をさらに混合し、つい
て混合物を、水中の５％酢酸で予め洗浄した１５ｍ１床
容量のセフ７デツクスＧ−Ｉ　Ｑ　（Ｐｈａｒｍｃｉａ
。

Ｐｉｓｃａｊａν＋ａｙ、　ＮＪ）　　カラムに適用し
た。カラムを５％酢酸ですすぎ、生じるカラム溶出液を
画分て集めた。各両分の２０６ｎｍでの光学密度（０，
Ｄ、　）を測定し、最初のタンパク質ピークの０．Ｄ、
２０６と定められた画分をプールし、プール画分を凍結
乾燥して乾燥還元ポリペプチドを得た。乾燥ポリペプチ
ドを５ｍｇ／ｍで酢酸バッフｙ　　（ｐＨ４，０＞に溶
解して還元ポリペプチドを得た。

ｂ　ポリペプチド−Ｋ　Ｌ　ｌ−１１合免疫原の調製実
施例１で調製した還元ポリペプチドをカンプリング試薬
ｍ−マレイミドベンゾイルＮ−ヒドロキシザクシンイミ
ドエステル（Ｍ　Ｂ　Ｓ　、、Ｓｉｇｍａ）を用いてキ
ーホールリンペット（ｋｅｙｂｏｌｅ　ｌｉｍｐｈｅｔ
）ヘモシアニンタンパク質（Ｋ　Ｌ　Ｈ；　Ｐａｃｉｆ
ｉｃ　Ｂｉ。

Ｍａｒｉｎｅ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｓ、　Ｖｅｎｉｃ
ｅ、　ＣＡ）に複合化させた。２０ｍｇＫ　Ｌ　Ｈ７ｍ
ｌ！　Ｐ　ＢでＰＢ（ｌｏｍＭリン酸ハソファ−１ｐＨ
７，２）に対して透析した２００μｐのＫ　Ｌ　Ｈ溶液
をＰＢ５５μｌと混合し、ついで混合物を室温で攪拌し
つつＭＢＳ？容液（ジメチルホルムアミド中６ｍｇ／ｍ
１　８５μｌを徐々に滴下混合した。混合物を室温で攪
拌しながら３０分保持し、ついでＰＢ５０（５０ｍＭリ
ン酸バ・ノファー、ｐｌ＋６．０）で予めリンスした１
５ｍ１床容量のセファデックスＧ−２５カラム（Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ）に付した。カラムでＰＢ５０でリンスし
、生じるカラム溶出液を滴下的に両分（１両分につき３
５滴）に集めた。各両分につき０．０．２６０を求め、
ピーク画分をプールした。プールを還元ポリペプチド〔
酢酸バッフｙ　−（ｐＨ４，０）中５ｍｇ／ｎｊ２）　
　ｌ＋ｎｊ！と混合し、得られる混合物のｐ＋＋を監視
し、混合物をｐＨ７，０〜７．５に維持するよう水酸化
ナトリウムもしく（ま塩酸で必要に応じニア」整し、一
方室温で３時間撹拌した。維持され撹拌された混合物を
ついて２．０　ｄの最終容量とするのに十分なＰＢＳ（
１，１ン酸ハンフア一化食塩水）と混合してＫ　Ｌ、　
Ｈ複合化ポリペプチド溶液を生成させた。

Ｓ　　ＣＲＦ　　Ｖｉｖａｒｉｕｍ　　（Ｒａｓｅａｒ
ｃｈ　　１ｎｓｔｉｔｕｔ、ｅ　　ｏｆＳｃｒｉｐｐｓ
　Ｃ１１ｎｉｃ、　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、　ＣＡ）から得
られたニューシーラント白ウサギを実施例２ｂによって
調製したＫ　Ｌ　Ｈ複合化ポリペプチド溶液を用い、以
下の植菌スケジュールによって免疫化した。最初の植菌
は背中に沿っての位置で投与した４回の皮下注射よりな
り、各注射はミコ）＜クテリウム（Ｄ　　Ｉ　　Ｆ　Ｃ
ｏ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　　Ｄｅｔｒｏｉｔ
、　　！４１）　　　３ｍｇ。

不完全フロインドアジュバント　（Ｉ　Ｆ　Ａ、　Ｓｉ
ｇｍａ）１．５ｍｆｆ及びＫＬＨｍ合化ポリペプチド含
有ＰＢＳ溶液１．５　ｍｅを混合することによって調装
された溶液約３７５μβでなされ、該混合物は植菌前に
５分間乳化させた。第２回目の植菌は最初の植菌後１４
日にミコバクテリウムを除く以外同じ混合物を用いて同
様に投与した。第３回目の植菌はＫ　Ｌ　Ｈ複合化ポリ
ペプチド溶液２５０μＩＰＢｓ９５０ｍｊ！及び水酸化
アルミニウム溶液（１０ｍｇ／　ｍ　Ｉ！無菌水）８０
０μβのよ（振盪した混合物１ｍｊ２よりなり１回目の
植菌から２１日後に腹腔内注射により投与した。

１回目の注射後２８及び３５日にウサギ抗ポリペプチド
抗血清を生産するために耳静脈から出血させて、上記免
疫化ウサギから抗血清を得た。

そのアミノ酸残基配列が表１の如くであるポリペプチド
に対し高められたウサギ抗ポリペプチド抗血清をついで
実施例３に示したエライサアッセイによってスクリーン
した。そのように８同調したエライサアソセイによって
スクリーンしたすべてのウサギ抗血清は免疫化するポリ
ペプチドと１＝２５６０の過剰の力価で免疫反応した。

３　エライサアソセイ 抗体組成物及びモノクローナル抗体組成物中に含まれる
抗体分子の種々のポリペプチドと免疫反応する能力を酵
素結合免疫アッセイ　（エライザ）法によって３周べた
。

実施例１ａに記載したようにして調製したポリペプチド
を塗布（Ｃｏａｔｉｎｇ）溶液ｌ１１７！あたり１０μ
ｇの濃度で含有する塗布溶液（０，１Ｍ炭酸ナトリウム
バッファー、ｐＨ９，２）１００μＪを平底（ｆｌａｔ
−ｂｏｔＬｏｍ）　　９６穴微量力価（ｍｉｃｒｏｔｉ
　ｔｅｒ）プレートの各人に加えた。プレートを室温で
一夜維持してポリペプチドを穴の壁に吸着させた。つい
で塗布溶液を転置及び振盪によって除去し、穴を蒸留水
で２回リンスし、１５０μｌのブロッキング？容液（１
）ＢＳ中３％ウシ血清アルブミン（Ｂ　Ｓ　Ａｗ／ｖ）
）を各人（固体支持体）に混合し、過剰のタンパク質部
位をブロックした。

穴を室温で２０分維持し、ついでブロッキング溶液をｇ
ＱｆＪ除去した。各人に実施例２ｃに述べたようにして
３周製し、フ゛ロッキングハ゛ソファ−で連、涜的に希
釈したウザギ抗ペプチド抗血清を含有する溶液１００μ
ｌを混合した。得られた固／；夜相免疫反応混合物を室
温で６０分維持して固相結合ポリペプチドと混合した抗
体との１次固相結合免疫反応産物を生成させた。ついで
同相と液相を分離し、穴を蒸留水で５回リンスし、過剰
の液を振盪除去した。

ブロッキング溶液で１＝１０００に希釈したグルコース
オキシダーゼラヘル化ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｃｏｏｐｅ
ｒ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ、　Ｍａｌｕｅｒｎ、　ＰＡ
）含有溶液１００μβを各人に混合して２次回／液相免
疫反応混合物（ラベル免疫反応混合物）を生成させた。

穴を３７℃で１時間維持してラベル化抗体と１次免疫反
応産物のいずれかの同相結合抗体との間の２次免疫反応
産物を生成させ、蒸留水で５回リンスして固相結合ラベ
ル含有免疫反応産物を単離した。

過剰の液を穴から除去した。

（ＩＩＰ　Ｂ　　（０，Ｉ　Ｍリン酸バッファー　（ｐ
ｌ＋　６．０　）　）中に２．１％グルコース（Ｗ／Ｖ
）を含有する調製グルコース溶液（該グルコース溶液は
一夜維持してグルコースを変旋光させた）２８ｍｌ！、
（２１Ｐ　Ｂ中にホースラデイツシュパーオキシダーゼ
０．１％（Ｗ／Ｖ）を含有する溶液２００　ｐ　１　、
、及び（３）Ｐ　Ｂに幻し４５ｍｇの濃度で新たに調製
したＡＢＴＳ染料（２，２’−アジノージ〔３−エチル
ヘンスチアヅリンスルホ２−１（６１）ジアンモニウム
塩、１１ｏｅｈｒｉｎＢｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ、　Ｉ
ｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、　ＩＮ）を含有するＡＢＴＳ
？容７夜２００μｌをＹ昆合することにより、使用前に
新たに色素形成基質溶液を調製した。

ついで色素形成基質溶液１００μｌを各人に混合してカ
ラー形成反応混合物を生成させた。形成反応混合物を室
温で１時間暗さに維持した後、溶液混合物の０．Ｄ、を
４１５ｎｍフィルター使用のマルチスカン（ｍｕｌｔｉ
ｓｋａｎ）　ａ量力価プレートリーダー（ｌｌｉｏ−Ｔ
ｅｎ　Ｉｎ５ｔｒ、、　Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、　ＶＴ）を
用い穴中で直接測定した。

上記エライサ法の結果を非希釈、積極的に（ｐｏｓｉ　
ｔｉｖｅｌｙ）に反応する抗原を用いた場合に色素形成
基質溶液が生成した最大００口、の約５０％を生成した
抗体組成物の希釈度として表した。これらの組成物に含
有される抗体分子は５０％の最大０、Ｄ、を達成する希
釈度が１：４より大なるとき固相ポリペプチドと免疫反
応する能力（ｃａｐａｂ　ｉ　Ｉ　ｉ　ｔｙ）を有する
とみなした。

ウサギ抗ポリペプチド抗血清の特異性を高めるため、こ
れらの抗血清をここに述べる固相ポリペプチドリガンド
を用いて親和性単離した。

実施例１の如く調製したポリペプチド５ｍｇを水に溶解
し、ついでＡＨ−セファロース４Ｂ（Ｐｂａｒｍａｃｉ
ａ）に製造者の指示に従ってカップリングしてポリペプ
チド−アガロース固体支持体を形成させた。３ｍｆｆの
床容量を有するカラムをポリペプチド−アガロース固体
支持体を用いて調製し、ＮＥＴバッフｙ　　　（１５０
ｍＭ　ＮａＣＥ、１ｍＭＥＤＴＡ、２０ｍＭ１−リス−
ＨＣＮミｐＨ７，５）を用いてリンスすることにより平
衡化した。実施例２ｃの如く調整したウサギ抗ポリペプ
チド抗血清約１０ｍｎを平衡化したカラムに適用し、つ
いでカラムをＮＥＴバッファーの３０カラム容量で洗浄
した。ついで１００ｍＭクエン酸バッファー（ｐＨ３，
０）をカラムに適用し、溶出液を両分に集めた。両分の
０．Ｄ、を２８０ｎｍで測定し、ピーク含有画分を決定
し、プールして抗体含有プールを得た。プールのｐＨを
測定し、トリス塩基で７．０に調整し、ついでＰＢＳに
対して透析して親和性精製ウサギ抗体分子含有？容ン夜
を得た。

得られた親和性精製ウサギ抗体分子含有溶液は、そこに
含まれる抗体分子の５０％より大がＨＰＶ潜伏潜伏性タ
ンパ色質疫反応する能力（ｃａｐａｃｉｔｙ）を有して
いるので実質上単離された抗体を表す。

上記方法によって１１相性単離された各ウサギ抗ポリペ
プチド抗血清はその特定の抗血清を高めた免疫原の調製
において使用したと同しポリペプチドを同いて争乱した
。この方法によって親和性単離（Ａ■）されたウサギ抗
ポリペプチド抗血清はウサギ抗ポリペプチド２３５　（
ウサギ抗−２３５）（以下ウサギＡｌ抗〜２３５と称す
る）、ウサギＡＩ抗−２３６、ウサギＡＩ抗−２４５及
びウサギＡＩ抗−２４７を包含する。

５、　ポリクローナル　ポリペプチド を　いる゛　　性　　腫ウィルスタン パク質のウェスタン免疫プロット ウェスタン免疫プロットアッセイを用いて、ＨＰ　Ｖ含
有組織培養細胞分解物及び種々のバイオプレイサンプル
を調製し、潜伏性乳頭腫ウィルスタンパク質の存在を調
べた。

アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａ　ＴＣＣ
、ＲｏｃｋｖｒＩＩｅ　、　Ｍ　Ｄ　）から得られ、そ
れらの名称の後の括弧に示すＡＴＣＣ番号を有するヒト
頚部癌セルラインＣ−３３Ａ　（ＨＴＢ−３１）、ＨＴ
　　３（ＨＴＢ　　３２）、）ｌｅｌａ（ＣＣｌ２）　
、Ｃａ５ｋｉ　　（ＣＲＬ１５５０）　、ＭＳ７５１　
　（ＨＴＢ３４）及び５ｉＨａ　（ＨＴＢ　３５）をＡ
ＴＣＣの推奨する培地及び方法を用いて培養した。

単層培養で増殖させた細胞を回収し、ＤＢＳＥＤ’ｒＡ
（０，０２％ＥＤＴＡ含有ＰＢＳ）　で２回洗浄し、ペ
レット化して水洗細胞を回収し、ＰＢＳ−ＥＤＴＡを除
去して詰まった細胞ベレットを得た。詰まった細胞ベレ
ットを秤量し、０．５ｍｊ２ＰＢＳに対し０．１　ｇの
詰まった細胞ベレットの濃度でＰＢＳ中に４°Ｃで攪拌
下に再懸濁し、０．５　ｍ　ｌの２ＸＳＢ　（すなわち
サンプルバッファーの２倍濃度を有する調製バッファー
）を加えて溶細胞して（ｂｅ　１ｙｓｅｄ）　、溶細胞
物（ｃｅｌｌ　１ｙｓａＬｅｓ）を得た。サンプルバッ
ファ−（ＳＢ）は２％ＳＤＳ、５０ｍＭジチオスレイト
ール、１０％グリセロール、１２５ｍＬｔ−リス−１ｉ
ＣＺ　ｐＨ６，８及び１ｍＭフ、ｚ−ルメチルスルホニ
ルフルオライｌ”（ＰＭＳＦ）を含有する。

Ｄｒ、　Ｚ、　Ｂｅｋａｓｓｙ　（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎ
ｔ　ｏｆ　Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｙ。

Ｌｕｎｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｈｏ５ｐｉｔａｌＸ
Ｌｕｎｄ、、Ｓｗｅｄｅｎ）から得たコンジロームの組
織バイオプシイを秤量し、細かく切り刻み、０．１　ｍ
ｇ／　ｍ　Ｉ！の濃度でＳＢに懸濁した。切り刻みｉＱ
、？ＥＪ液をドウンス（ｄｏｕｎｃｅ）ホモゲナイザー
中ゆるい適合の乳棒（ａ　ｌｏｏｓｅｆｉｔｔｉｎｇ　
ｐｅｓｔｌｅ）を用い、３ストロークで破砕し、ついで
水浴ソニケータ−（ｓｏｎｉｃａｔｏｒ　）中１．５時
間音波処理した。音波処理（ｓｏｎｉｃａｔｅｄ　）懸
濁液を一７０゛Ｃに凍結し、４サイクルの解凍（ｆｒｅ
ｅｚｅｔｈａｗ）により解凍しくｂｅ　ｔｈａｗｅｄ　
）　、得られた懸濁液を微量遠心分離機（ｍｉｃｒｏｃ
ｅｎＬｒｉｆｕｇｅ　）巾約２０００Ｘｇで遠心分離し
て組織破片（ｔｉｓｓｕｅｄｅｂｒｉｓ）を除去した。

得られた上清を保有してコンジロームｍ織溶解物得た。

細胞溶解物をＬａｅｍｍ　Ｏｉ、　Ｎａｔｕｒｅ＋　　
２２６　＋　６８０６８５　（１９７０）に記述され、
旧ａｋｅ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｔｍｍｕｎ、、　　３３．２１２　２
７２　　（１９８１）によって修飾された不連続（ｄｉ
ｓｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ　）、バッファー系（この方法
をここに参考に加入する）を用い、染色された（Ｐｒｅ
ｓｔａｉｎｅｄ）分子量マーカータンパク質（Ｂｉｏ−
Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｒｉｃｈｍｏｎ
ｄ、ＣＡ）を含有するレーンによっていずれかの側（ｅ
ｉｔｈｅｒ　５ｉｄｅ　）と側面を接した（ｆｌａｎｋ
ｅｄ　ｏｎ）ゲルレーン（ｌａｎｅ）あたり細胞熔解物
１００μ！を用いる、７．５％粘着性（ｓｌａｂ）ゲル
上のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−
ＰＡＧＥ）に付した。マーカー調製物中に存在するタン
パク質はすべて１０００ダルトンの単位でリゾチーム１
４．４ｋｄ、）リプシン阻害剤２１．５ｋｄ。

カーボンアンヒドラーゼ（ｃａｒｂｏｎｉｃ　ａｎｈｙ
ｄｒａｓｅ）３１ｋｄ、オプアルブミン（ｏｖａｌｂｕ
ｍｉｎ　）　４２．７ｋｃＬウシ血清アルブミン６６．
２ｋｄ、ホスホリラーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ
　）　Ｄ　９７．４ｋｃＬ　β−ガラクトシダーゼ１１
６．２５ｋｄ及びミオシン（ｍｙｏｓｉｎ）　２００ｋ
ｄを包含する。

電気泳動、及びＴｏｗｂｉｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ
、　Ｎａｔｌ。

八ｃａｄ、　　Ｓｃｉ、Ｕ　　Ｓ　　Ａ、　　７　６　
　、　４３５０−４３５４（１９７９）（この方法をこ
こに参考に加入する）によって記述されたニトロセルロ
ース上へのＢｉ。

Ｒａｄ　　Ｉ・ランスファーユニットを用いるエレクト
ロプロッティング後、プロット　（ｂｌｏｔ）を旧、Ｏ
ＴＴＯ（ＡｎＬｉｆｏａｍΔ（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉ
ｃａｌ　Ｃｏｒｐ、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ。

ＭＯ）０．０２５％を含有するＰＢＳ中の５％粉末脱脂
ミルク〕中に攪拌下１時間浸漬することによってブロッ
クした。ブロックしたプロットを示されたウサギ抗ポリ
ペプチド抗血清もしくはＡＩウサギ抗ポリペプチド抗血
清を１：１００の希釈度で含有するＢＬＯＴＴＯ中室温
で２中間温持して、混合した抗体組成物とプロット上に
固相として存在する潜伏性乳頭腫ウィルスタンパク質と
の間の免疫反応産物を生成させた。ついでプロットをＢ
ＬＯＴＴＯで３回それぞれ約１分、２０分及び２０分洗
浄して非結合抗ペプチド抗血清を除去した。ついで洗浄
したプロットを１７１０００に希釈したアルカリホスフ
ァターゼ複合化ヤギ抗ウサギＩｇＧ　　（Ｓｉｇｍａ　
）を含有するＢＬＯＴＴＯ中で３０分維持して、第２の
混合した抗体とプロットの固相上に存在する最初に生成
した免疫反応産物との間で第２の免疫反応産物を生成さ
せた。ついでプロットをＰＢＳ−Ｔ（０，５％ツイーン
２０含有ＰＢＳ）中で１回５分、４同各３０分洗浄して
非結合第２混合抗体を除去した。ついで洗浄プロットを
顕色剤を含有する色素形成基質溶液に室温で約４時間維
持してプロット上に存在する免疫反応産物を視覚化した
。

顕色剤溶液は１．５　Ｍ　ｌ−リス（ｐＨ８，８）　５
ｍ＃。

水４５ｍ！！、ニトロブルーテトラゾリウム５■、ｌ　
Ｍ　ＭｇＣ１ｚ　０．２ｍｌ！及び５−ブロモ−４−ク
ロロインドリルホスフェート２．５■を混合して調製し
た。

潜伏性乳頭腫ウィルスタンパク質を検出するためにウェ
スタン免疫ブロントアンセイを用いる結果は図２及び３
に示す。

例えば図２のレーン１−４は約１１２ｋｄの分子量を有
する拡散タンパク質が、ポリクローナルウサギ抗２３６
抗血清を用いて、５ｉ）１ａ及びＨｅＬａ細胞溶解物中
に検出されたが、Ｃａ５ｋｉ　またはＣ−３３Ａ細胞溶
解物中には検出されなかった。同じ１１２ｋｄ拡散タン
パク質がウサギ抗２４５抗血清を用いる免疫プロット上
の免疫反応産物の生成によっても検出された。

図２のレーン６及び７はＨＰＶ５４ｋｄ線維状（ｆｉｌ
ａｍｅｎｔｏｕｓ　）クンバク質がコンジロームバイオ
プシイ組織の免疫プロッティング細胞溶解物によって、
ウサギ抗−２３６抗血清を用いて検出された。ＨＰＶ４
ｇｋｄ線維状タンパ線維状タンパク−ムバイオプンイ細
胞溶解物の１つにおいてもウサギ抗−２３６抗血清を用
いて検出された（図２、レーン６）が、他のコンジロー
ム溶解物中には検出されなかった（レーン７）。４８ｋ
ｄ線維状タンパク質はウサギ抗−２３５、ウサギ抗−２
４５及びウサギ抗−２４７を用いるプロット上での免疫
反応によっても検出された。

図３はポリペプチド２３６に対して高められたポリクロ
ーナル抗血清をＨＰ　Ｖタイプ１６感染とＨＰＶタイプ
１８感染とを識別するだめのタイプ特異的試薬として用
い得ることを実証している９図３に示ずごとく、５４ｋ
ｄ及び５８ｋｄ綿維状タンパク質が共にウサギ抗−２３
６抗血清を用いて、Ｃａ５ｋｉ細胞溶解物（レーン２）
を免疫プロットすることによって検出されたが、１Ｉｅ
Ｌａ細胞溶解物（レーンｌ）中には検出されなかった。

５１ｋｄ核タンパク質が親和性華離つサギ抗２４５を用
いるＣａ５ｋｉ細胞溶解物の免疫プロッティングによっ
て検出された。

上記結果は乳頭腫ウィルスのＥ領域ＯＲＦ、から推測さ
れたポリペプチドに対し高められた抗ペプチド抗血清が
乳頭腫ウィルス潜伏性タンパク質と免疫反応する能力を
有していることを実証している。ある場合には抗ポリベ
プナド抗血清は１つのしかし他のでないＨＰ　Ｖタイプ
によって生産された潜伏性タンパク質と免疫反応する能
力を有する（ずなわら、タイプ特異的抗血清）。

すべてのハイブリドーマは免疫化の初めに約３週分であ
った、Ｓ　ＣＲＦ　Ｖｉｖａｒｉｕｍ（Ｌａ　Ｊｏｌｌ
ａ、、ＣＡ）から得られた、免疫化１２９Ｇ、、″マウ
スからの肺臓細胞を用いて生産した。

表１にリストとしたポリペプチドの各々をＫ　１．＋１
複合化し、ここに記述するハイブリトーマを生産するだ
めの免疫原として用いた。

特定のポリペプチドで免疫化する各マウスに、実施例２
ｂにおける如く調製したＫＬＨ複合化ボリペフ゛チドン
容液約６２．５μｌ、ＰＢＳｏ、４３　ｍｌ。

及びフロイントの完全アジュバント（ＣＦ　Ａ）０．５
ｍｆｆの乳化混合物を含有する懸濁液をまず腹腔内（Ｉ
Ｐ）注射した。約２週間後、各マウスに前と同じＫＬｓ
ｇ合化ポリペプチド溶液約３２μ！、ＰＢ３０．４７ｍ
及びアラム（ａｌｕｍ）　４ｙＢ液（ＰＢＳ中１０ｍｇ
／ｍｆの水酸化フルミニラム）０．５ｍｆを含有する懸
濁液をＩＰ注射した。第２の注射の約７〜１０日後、目
からの出血によりマウス抗血清を集め、抗血清の力価を
以下に述べる修飾をする以外実施例３に記述したエライ
ヤ法を用いて求めた。

微屯力価プレートをマウス免疫化に用いたのと同じポリ
ペプチドで被覆した後、すでに述べたようにして穴をブ
ロックし、ついでプロンキングバッファーで希釈した連
続希釈のマウス目出血抗血清を混合し、混合物をすでに
述べたようにして維持した。グルコースオキシダーゼ複
合化抗体がエライヤ法で必要とされる場合、抗ウサギＩ
ｇＧ（（：ｏｏｐｅｒ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）の代り
にヤギ抗マウスＩｇＧ複合体が用いられたっ４１５ｎｍ
で５０％最大ＯＤを達成するための目出血力価がＩ：３
２００より小さかった場合には２回目と同じ接種物を含
有する付加的注射を第２回目の注射２週間後にマウスに
投与した。

目出器物の力価が１：３２００より大に達してから約１
カ月後に、１１１■記と同じＫ　Ｌ　Ｈ複合化ポリペプ
チド溶液約３２μ／及びＰＢＳＣｌ、４７ｍｆｆを含有
する懸濁液の最後の注射を尾静脈に静脈内（ＩＵ）投与
した。

ｂ　ハイブリドーマ融合 実施例６ａで免疫化したマウスからマウス牌細胞（ｓｐ
ｌｅｅｎｏｃｙｔｃｓ）を最終注射約３日後に回収し、
ミエローマ細胞との融合をここに記述するように行った
。各マウスからの約１×１０Ｌ′牌細胞（ＡＴ”ＣＣＣ
ＲＦｌ　５８１）を４０％ＰＥＧ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅ
ｒ−Ｍａｎｎｈｅ：ｍ、　　Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ
、　　ＪＮ）　　よりなる融解培地中で約２　Ｘ　１０
’　Ｓ　Ｐ”１０〜Ａｇ１４ミエローマ細胞と混合した
。細胞融合後、得られるハイブリドーマ細胞を９６穴微
星力価プレート中に入れ（ｂｅ　５ｅｅｄｅｄ　）　、
周知のＨＡ　Ｔ培地（ヒボキサンチン、アミノプテリン
及びチミジン）中で培養し、そこから得られた生残ハイ
ブリドーマ培養物を免疫化するポリペプチドと免疫反応
する抗体分子を産生ずる能力について、マウス目出血抗
血清の代りにハイブリドーマ培養上清を用いた以外実施
例６ａの修飾エライザ法を用いてスクリーンした。

エライザアッセイにおける抗ポリペプチド抗体分子の存
在についてスクリーンされたハイブリドーマ培養上清は
、１：２希釈培養上清の４１４ｎｍでの光学密度（０，
Ｄ、）がコントロールの培養培地について得られた０、
１）、の４倍より大きかった場合陽性（ｐｏｓｉｔｉｖ
ｅ）であるとみなした。代表的融合は３０の９６穴微量
力価プレートに置き（ｂｅ　ｐｌａｔｅｄ　）　、エラ
イザアッセイにおける免疫化ポリペプチドと免疫反応し
た融合あたり１０６０のハイブリドーマ培養物から産出
された。

前記スクリーニング法によって選択された特定のハイブ
リドーマによって生産された抗体分子は１）特定の融合
に対する肺細胞を提供したマウスを免疫化するのに使用
したポリペプチド、及び２）それから特定のＨＡＴ培地
抵抗性ハイブリドーマ細胞が単離された９６穴培養プレ
ート、列及び大番号を示す特性（ｃｈａｒａｃｔｅｒｓ
）によってここでは指称する。具体的に関与する特性は
ここでは１語としてリストし、そこではコロンに先行す
る数字はポリペプチド命名、それに続く記号は微量力価
穴を指称する（例えば２４７　：　１１Ｄ１２）。

？■離されたハイブリドーマを表５に示す。

表　　　５ ハイブリドーマ ２３８　　　　２Ｄ４，４Ｄ４，５八１０，８１Ｅ９．
８Ｇ１０１０Ｃ１０，１０Ｃ１１，１０Ｅ１０　　　　
　　　８２４６　　１Ｄ１０．２１１４．３Ｆ２．４Ｇ
Ｉ＋、７０８．９Ｅｌ　　６ハイブリドーマ培養物をＩ
Ｐ注射し、周知の方法によって維持したマウスの腹水（
ａｓｃｉｔｅｓ　ｆｌｕｉｄ）を回収することによって
モノクローナル抗体組成物を調製した。得られた腹水２
ｍ７！を１２０００×ｇで１５分遠心分離し、上清を集
め、０．２μのＡｃｒｏｄ　ｉｓｃフィルター（Ｇｅｌ
ｍａｎ）を通して濾過して濾過腹水を得た。

５ｕｐｅｒｏｓｅ　６及び５ｕｐｅｒｏｓｅ　１２カラ
ム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）をＦＰＬＣ装置上で直列に連
結し、０．５　ｍ　ｌ　／ｍｉｎの流速で６０分ＰＢＳ
により平衡化した。５００μｌの濾過腹水を平衡化カラ
ムに付し、ＰＢＳを用い０．４　ｍ　ｊ！　／ｍｉｎの
流速でクロマトグラフした。

得られた溶出液を２８０ｎｍの光学密度（０，Ｄ、）に
ついて監視し、溶出液の１１２画分を集めた。

両分を実施例６ｂに記述の免疫化するポリペプチドを用
いる抗ポリペプチド抗体の存在についてのエライザ法に
よってアッセイした。代表的に２つの画分が大多数の抗
ポリペプチド抗体を含有するものとして求められ、２つ
のｌ　ｍ１画分をプールして実施例６ｂに記述したエラ
イザによって求められる１　：　２５６０より大なる抗
ポリペプチド力価を存するＦＰＬＣ精製モノクローナル
抗体を生産させた。

この方法により、モノクローナル抗体２４７：４Ｄｌｌ
、２３５　：Ｂ９及び２４５　：　１１１Ｅ３をＦ　Ｐ
　Ｌ　Ｃ精製したが、これらはＯ，Ｄ、２８０測定に裁
く公知のタンパク質濃度を有していた。

得られたＦＰＬＣ精製モノクローナル抗体分子含有？８
　？Ｐｉの各々は、その中に含まれる５０％より大なる
タンパク質が抗体結合部位を形成するタンパク質より構
成されているので実質上純粋な抗体を表す。

バク　のウェスタン　　プロノト 実施例６に記述したごと（調製したモノクローナル抗体
を用いて、ＨＰＶ含有組織中に存在するヒト乳頭腫ウィ
ルス潜伏性タンパク質をここに述べる例外を適用する実
施例５のウェスタン免疫プロット法によって検出した。

実施例５におけるようにして調製した電気プロット（ｅ
ｌｅｃｔｒｏｂｌｏｔｔｅｄ）　Ｌブロー！りしたニト
ロセルロースプロットを、実施例６Ｃに記述のごとくし
て調製し、２４７：４Ｄ１１についてのＢＬＯＴＴＯの
−あたり３２μｇの濃度または２３５：８９についての
希釈ＢＬＯＴＴＯ（２％ミルクに）のｍβあたり２５μ
ｇの濃度に希釈したＦＰＬＣ精製抗体溶液を含有する溶
液と混合し、前記と同様にしてその溶液中で維持して免
疫反応産物を生成させた。

前述のようにしてプロットを洗浄し、ついで約１：５０
０の濃度に希釈したウサギ抗マウス抗体（Ｃｏｏｐｅｒ
　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）を含有するＢＬＯＴＴＯの溶
液中で４５分間維持して免疫反応産物の生成させた。

ついでプロットをＢＬＯＴＴＯ中で３回ｌ、２０及び２
０分洗浄し、ついてアルメリホスファクーゼ複合化ヤギ
抗つサギＩｇＧ含有ＢＬ［ＩＴＴＯ溶液中で前述と同様
にして維持した。引き続いての洗浄及び展開（ｄｅｖｅ
ｌｏｐｍｅｎｔ）も前記と同様に行った。

図４に示す結果としての免疫プロットは、モノクローナ
ル抗体２４７：４Ｄ１１を用いる場合のＣａ５ｋｉ細胞
溶解物（レーン４）中の５４ｋｄ及び４８ｋｄの線維状
タンパク貿の検出を実証している。

Ｃａ５ｋｉ細胞溶解物中にはまた約５３ｋｄの分子屋を
有する付加的なＨＰＶ特異性タンパク質も観察された。

この５３ｋｄタンパク質は５４ｋｄ線維状タンパク質の
細胞加工（グリコジル化）産物であると考えられる。モ
ノクローナル抗体２４７　：　４　ＤｌｌはまたＨｅＬ
ａ細胞溶解物中に存在する５４ｋｄ線維状タンパク質と
免疫反応するが、５ｉＨａもしくＨＴ３細胞溶解物（各
レーン２及び５）の示された調製物とは顕著には免疫反
応しない。

上記免疫プロッティング法により、モノクローナル抗体
がすべての乳頭腫ウィルス潜伏性タンパク質と免疫反応
することが実証された。例えば、５４ｋｄ線維状タンパ
ク質はＩＩｅＬａ、　Ｃａ５ｋｉ及び５ｉｌｌａ細胞溶
解物をモノクローナル抗体２３５　：Ｂ９または２４７
　：　４Ｄｌ　ｌを用いて免疫プロットすることによっ
て検出された。４８ｋｄ線維状タンパク質はこれらの同
じモノクローナル抗体を用いてＣａ５ｋｉ　ｍ胞溶解物
中に同様に検出された。核タンパク質はモノクローナル
抗体２４５：１１Ｅ３を用いるＣａ５ｋｉ　Ｉｉ胞溶解
物免疫プロッティングによって検出された。拡散タンパ
ク質はモノクローナル抗体２３５：Ｂ９．２３８：８Ｅ
９．２４７：１０Ｆ？及び２４７　：　１　ｌＤＩ　１
を用いるＨｅＬａ及び５ｉｔｌａｉＨ胞溶解物の免疫プ
ロッティングによって尋禽出された。

良 頚部癌セルラインＨＴ−３、ＭＳ７５１、Ｃ−３３Ａ、
　５ｉＨｘ、ＨｅＬａ及びＣａ５ｋ　ｉを実施例５にお
けると同様に培養した。半融合性の（ｓ６ｍｉ−ｃｏｎ
ｆＩｕｃｎｔ）単層培養物を選び、ＰＢＳでリンスして
過剰の培地を除き、１０分風乾した。ついで風乾培養物
を冷（−２０℃）のアセトンに５分浸すこと（ｆｌｏｏ
ｄｉｎｇ）によって固定化した（ｂｅ　ｆｉｘｅｄ）。

固定化培養物を３％過酸化水素中で１５分維持し、つい
で室温でＰＢＳ中に５０回急速に浸したり出したりした
。ついで培養物をまずＰＢＳ中で２分維持し、ついで８
％正常ウマ血清及び０．０１％チメローザル（ｔｈｉｍ
ｅｒｏｓａｌ）を含有する連続的に揺り動かしたＰＢＳ
溶液中に室温で１時間維持して非特異的タンパク質結果
部位ブロック化サンプルを生成させた。

ブロック化サンプルを抗ペプチド抗体組成物を含有する
溶液を用いて室温で６０分維持して、混合した抗体及び
ブロック化サンプルを含有する免疫反応産物を生成させ
た。前記したごとく、数種の異なる抗体がこれらのアッ
セイにおいて異なる希釈度で用いられた。ついで免疫反
応サンプルをＰＢＳ中に２０回浸け、ＰＢＳ中で２分維
持し（すなわち２０浸清＋２分）、ついでこの操作を２
回くり返した（すなわち２０浸清＋２分を３回）。

ついでサンプルを、バイオタイニレート化した（ｂｉｏ
ｔｉｎｙｌａｔｅｄ）ウマ抗マウスＩｇＧ　　（Ｖｅｃ
ｔｏｒＬａｂｓ、　Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｃ、　ＣＡ）を
７．ＩＪｇ／ｍｊ！の濃度で含有する０、　５％ＢＬＯ
ＴＴＯ（ＰＢＳ中０．５％脱脂粉末ミルク、０．Ｏ１％
チメロサール、０．０２５％消泡剤Ａ）の溶液中に室温
で４５分維持して、混合したバイオタイニレート化した
ＩｇＧとサンプル上に存在する結合マウス抗体との間の
第２免疫反応産物を生成させた。ついでサンプルをＰＢ
Ｓ中で３回すすぎ（各２０浸漬＋２分）、ついでアビジ
ン（ａｖｉｄｉｎ）　Ｄ−ペルオキシダーゼ（Ｖｅｃｔ
ｏｒｊａｂｓ）を１２μｇ／ｌｌ１ｌ含有するＮＨＴバ
ッファー　（０，３Ｍ　ＮａＣ１，２０ｍＭ　Ｈｅｐｅ
ｓｓ　ｐ）Ｉ　６．５．０．０１％チメローサル）中室
塩で３０分維持してアビジン試薬が第２免疫反応産物中
に存在するビオチンと複合化するにまかせた。ついでサ
ンプルをＰＢＳ中で３回リンスしく各２０浸漬＋２分）
、ついで（１１７ミノエチルカルバゾール（Ｓｉｇｍａ
　）　　５０　ｍｇを含有する４　ｍｌのジメチルホル
ムアミド、（２１８０μｌの過酸化水素、及び（３１１
００ｍＭ酢酸ナトリウムバッファーｐｌ！５．５　２０
０　ｍｌを混合して調製したＡＢＣバッファー中室温で
１０分維持してサンプル上でのカラー顕色反応を起こさ
せた。顕色化後、サンプルを振盪して過剰の液を除き、
水中でリンスし、ついでＭａｙｅｒのへマドキシリンス
ティン（ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ　５ｔａｉｎ　）　　
（Ｓｉｇｍａ　）中で３分維持し、ついで水でリンスし
た。染色したサンプルを水中の５０％グリセロール中に
盛り上げ（ｂｅｍｏｕｎｔｅｄ　）　、光顕微鏡検査に
よって観察した（ｂｅνｉｅ賀ｅｄ）。

ＨＰ　Ｖ含有セルラインの免疫組織化学的染色（免疫染
色）の結果を表６に示す。

表　　　６ ＨＰ　Ｖ含有組織培養セルラインの免疫染色１１ｅＬａ ａＳｋｉ ｉＨａ １Ｔ−３ ３３−Ａ ＋＋＋＋＋＋＋ ＋＋＋　　　　　　　　　＋＋＋　　　　　　　　　　
＋＋＋＋＋＋　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　＋＋＋＋＋＋　　　　　　　　　Ｈ＋　　　　　
　　　　　＋＋＋■　顕著な（ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ
　）及び陽性の免疫反応は、抗体依存パーオキシダーゼ
染色の不存在下で優勢となるヘマトキシリンカウンター
スティン（ｃｏｕｎＬｅｒｓｔａｉｎ）の青灰色（−）
と比較して、特徴的なさび色の染色パターン（十＋　＋
）の存在によって決定した。ある場合には弱い免疫反応
が観察された（＋）。

２　モノクローナル抗体２３５：Ｂ９は実施例６Ｃに記
述したようにして調製したＦＰＬＣ精製抗体を、０．２
％ＢＬＯＴＴＯ（ＰＢＳ中０．２％脱脂粉末ミルク、０
．０１％チメロサール、０、０２５％消泡剤Ａ）の＋ｔ
ｌあたり２５μｇの濃度で含有する溶液を用いて、ブロ
ックしたサンプルと免疫反応させた。モノクローナル抗
体２４５：１ＩＥ３は実施例６Ｃと同様にして調製し、
１０％正常ウマ血清（ＰＢＳ中１中篇０％／Ｖ））　中
でｌ：４０に希釈した腹水の溶液を用いて、ブロック化
サンプルと免疫反応させた。モノクローナル抗体２４７
　：　４Ｄ１１はＦＰＬＣ精製抗体を１０％正常ウマ血
清ｍ１あたり１００μｇの濃度で含有する溶液を用いて
、ブロック化サンプルと免疫反応させた。

表６の結果は本発明のモノクローナル抗体の、ＨＰＶ感
染セルラインを用いる免疫染色方式において潜伏性ＨＰ
Ｖタンパク質と免疫反応する能力を実証している。乳頭
腫ウィルス潜伏性タンパク質に対する特異性はこれらの
抗体の、ＨＰＶ、を含有することが知られている細胞（
ＨｅＬａ、　Ｃａ５ｋｉ、５ｉｌｌａ及びＭＳ７５１）
と免疫反応するがＨＰＶを含有しない細胞（ＨＴ−３及
びＣ５３−Ａ）とは免疫反応しない能力によって実証さ
れる。

ヒト頚部癌及びヒトコンジロームのホルマリン固定化（
ｆｏｒｍａｌｉｎ４ｉｘｅｄ）　、パラフィン付着化（
ｐａｒａｆｆｉｎ−ｅｍｂｅｄｄｅｄ　）　ＦＪＩ織パ
イオブシイをＤｒ。

Ｃｏｎｐｅｎｔｅｒ　　（Ｕ　ＣＳ　Ｄ　Ｍｅｄｉｃａ
ｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　、　ＳａｎＤｉｅｇ、　ＣＡ）　、
Ｄｒ、　　Ｊ、　Ｒｏｂｂ　（Ｄｅｐｔ、　ｏｆＰａｔ
ｈｏｌｏｇｙ　％　Ｇｒｅｅｎ　ｌ１ｏｓｐｉｔａｌ、
Ｌａ　ＪｏｌｌａＸＣＡ）及びＤｒ、　Ｗ、　Ｌａｎｃ
ａｓｔｅｒ　　（Ｇｅｏｒｇｅｔｏｗｎ　Ｕｎｉｖｅｒ
ｉｔｙ。

Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、、Ｄ　Ｃ）から得た。Ｐａｐａ
ｎｉｃｏｌａｏｎ（“Ｐａｐ”）スミアはＯｒ、　　Ｊ
、　Ｗｉｌｌｅｍｓ　　（ＯＢ／ＧＹＮ、　Ｓｃｒ：ｐ
ｐｓ　Ｃ１１ｎｉｃ、　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、　ＣＡ）か
ら得た。これらの組織サンプルをここに述べる例外を適
用する実施例８ａ記述の免疫組織化学的染色法に服せし
めた。

ホルマリン固定化付着組織はまずキシレン中５０回浸漬
で脱パラフィンし、ついでキシレン中に２分浸漬した。

ついで固定化組織を９５％エタノール中へ５０回浸漬し
、ついで２分間浸漬し、ついで８０％エタノール中への
５０回浸漬及び２分浸漬に付し、ついで５０％エタノー
ル中への５０回浸漬及び２分浸漬に付し、最後にＰＢＳ
中への５０回浸漬及び２分浸漬に付して再水和（ｒｅｈ
ｙｄｒａｔｅｄ）サンプルを形成させた。再水和サンプ
ルを３％過酸化水素溶液にサンプルを維持する工程から
始まる実施例８ａ記載の手順で処理した。

Ｐａｐミルスミアスライドを１０分風乾し、６７％アセ
トン／３３％メタノール中−２０℃で１０分の維持によ
って固定した。固定パップ（ｐａｐ）スミアを３％過酸
化物溶液中でのサンプルの維持の工程から始まる実施例
８ａ記述の操作に付した。

本発明のモノクローナル抗体を用いる種々の組織バイオ
プシイサンプルの免疫染色の結果を表７に示す。

表　　　７ ＨＰ　Ｖ含有キ■織ハイオプシイの免疫染色コントロー
マトス 非！８染 ハイオプンイ４ 頚部形成異常 旧＋ｖ　タイプ１６ １１ＰＶ　　タイプ３１ ＲＰＶ　　タイプ１１ 非タイプ化 頚部癌 ［正常Ｊ上皮 ■ ３／３ ０／１ １４／１４ ３／３ ２／２ ２／２ ５／８ １／　２ Ｎ、Ｔ。

Ｎ、Ｔ。

１４／１４ ２／２ Ｎ、Ｔ。

０／１ Ｎ、Ｔ。

Ｎ、Ｔ。

１１／１１ ２／２ ０／２ １／１ ２／２ ０／２ １　免疫染色の結果はテストしたサンプルの総数に対す
るテスト陽性の組織の数として表す。陽性反応は染色が
表６の注１に記述するように顕著であった場合に数えた
。

２　モノクローナル抗体２３５：Ｅ９．２４５：１１Ｅ
３及び２４７：４Ｄ１１を表６の注２に記述の条件下に
免疫反応させた。

３　コルボスコピー的に証明された頚部コントロールを
有する患者から得られたパップ（ナンプルをコントロー
マトス（ｃｏｎｄｙｌｏｍａｔｏｕｓ　）と名づけた。

「非感染」と名づけだバンプスミアは性２３ＨＰＶ感染
にさらされた危険をもたなかったと信しられる証明され
た処女から導かれた。ハイオプシイサンプルは核酸ハイ
ブリダイゼーション（Ｄｅｖｉｌｌｉｅｒｓ　ｅｔ　ａ
ｌ、、Ｌａｎｃｅｔ、　　ｉｉ、７０３（１９８７））
によって特定のＨＰ　Ｖタイプの存在についてスクリー
ンし、示された場合の頚部形成異常のバイオプシイを包
含した。頚部癌バイオブシイは未知ＨＰ　Ｖステータス
（ｓｔａｔｕｓ）を有してスクリーンされた。手４Ｊか
らの２つの見たとこでは正常な上皮バイオプレイは未知
のＨＰ　Ｖステータスを有してスクリーンされた。

コントロールの非感染上皮ハイオプシイは性器ＨＰ　Ｖ
感染にさらされた危険を有さないと信じられる６オの女
性（ｆｅｍａｌｅ）から得られた。

表７の結果はモノクローナル抗体分子の、バイオプレイ
組織サンプル中に存在するＨ　Ｐ　Ｖ潜伏性タンパク質
と免疫反応する能力を実証している。

これらのサンプルは、独立の手段によって潜伏性ＨＰＶ
感染が知られているサンプルに対する２３５：Ｂ９を用
いる場合、誤った陰性なしで１００％陽性の反応性を示
した。

表７の結果はあるモノクローナル抗体が１つのしかし別
のでないＲＰＶタイプによって産生された潜伏性タンパ
ク質と免疫反応する能力を有する（すなわち、タイプ特
異的抗体分子）ことも実証している。例えば、モノクロ
ーナル抗体２３５：Ｂ９が１１．１６もしくは３１タイ
プ名称を有するＨ　Ｐ　Ｖ−タイプ形成異常′ｆＪｉｍ
と免疫染色によって免疫反応したのに対し、モノクロー
ナル抗体２４５　：　１１Ｅ７及び２４７　：　４Ｄ１
１は形成異常を含むＨＰＶタイプ１５及びタイイブ３１
とは免疫反応したが形成異常を含むタイプ１１とは免疫
反応しなかった。

加えるに、免疫染色によるＨＰＶ潜伏性仏性パク質の検
出は潜伏性クンバク質の細胞局在化（１ｏｃａｌｉｚａ
ｔｉｏｎ　）を示し、従ってこれらのタンパク質の付加
的特徴化を与える。例えば、モノクローナル抗体２４７
　：　４Ｄ１１は細胞の細胞質繊維関連成分上に分布す
る、Ｃａ５ｋｉ細胞上のまたは種々のＨＰ　Ｖ含有バイ
オプシイ組織上に免疫染色パターンを生成した。従って
、実施例７に示されるモノクローナル抗体２４７　：　
４Ｄ１１を用いる免疫プロッティングによって検出され
た４６ｋｄ、５４ｋｄ及び５８ｋｄタンパク質は免疫染
色細胞中でのそれらの分布に基き繊維状じｆ　ｉ　ｌａ
ｍｅｎ　ｔｏｕｓ’）タイプ潜伏性タンパク質であると
してさらに特徴づけられた。同様の繊維状染色パターン
はＨＰＶ含有バンプスミア、ハイオプシイサンプル及び
組織培養細胞を免疫染色するためにモノクローナル抗体
２３５：Ｂ９を用いて観察された。

モノクローナル抗体２４５　：　１１Ｅ３は核に位置し
たＣａ５ｋｉ細胞中の特徴ある免疫染色パターンを生じ
た。かくして、実施例７に記述のこのモノクローナル抗
体を用いる免疫プロッティングによって検出された５１
ｋｄタンパク質は「核」タイプ潜伏性タンパク質である
としてさらに特徴づけられた。

モノクローナル抗体２３８：８Ｅ９．２４７：１０Ｆ７
及び２４７　：　１１ＤＩ　１は、染色された細胞の核
及び細胞質の両方に拡散して存在する（　ｂｅ　１ｏｃ
ａｌｉｚｅｄ　）　ＨｅＬａ細胞及び５ｉＨａ細胞中に
おける特徴的な免疫染色ハターンをそれぞれ生じた。こ
れらのモノクローナル抗体は実施例７に記述した免疫プ
ロノティングアソセイにおいて１１２ｋｄのタンパク質
を検出したので、この１１２ｋｄタンパク質は「拡散」
タイプ潜伏性タンパク質であるとしてさらに特徴づけら
れた。

潜伏性ＨＰ　Ｖ感染症を有するとして診断された患者か
らの抗血清を組織学的に確認されたコンジローム病変の
形態においてＤｒｓ、　Ｒ，Ｒｏｂｂ　ａｎｄ　Ｊ。

Ｗｉｌｌａｍｓ　　（５ｃｒｉｐｐｓ　　Ｃ１１ｎｉｃ
、　　Ｌａ　　Ｊｏｌｌａ、　　ＣＡ　　）　　から得
た。

実施例３に記述したと同様のエライザ操作によって、こ
れらの抗血清のポリペプチド２３７．２４５及び２４６
に結合する能力を以下に示す例外を伴って評価した。

ポリペプチド２３７．２４５または２４６の１μｇを含
有する被覆液（ｃｏａｔｉＢ　５ｏｌｕｔｉｏｎ　）　
５０μｌを微量力価プレートの穴に加え、４℃で一夜維
持してポリペプチドを穴の壁に吸着させた。ついで穴を
前述のごとくリンスし、ＮＧＳバッファー（ＰＢＳ中１
中筋０％正常ヤギ血清加え３７°Ｃで９０分維持してブ
ロックした。ついで穴を逆さにして空にし振盪して過剰
の液を除去し、穴を３７℃で１時間維持して乾燥して乾
燥プレートを形成させた。

ＮＧＳハソファーで希釈した患者抗血清を含有する）容
液１００μｌをそれぞれに混合して免疫反応混合物を生
成させ、混合物を３７℃で１時間維持して抗血清中の抗
体が穴壁に吸着したポリベプチドと免疫反応してポリペ
プチド含有免疫反応産物を生成するにまかせた。ついで
穴をＰＢＳ−Ｔ（ＰＢＳ中０．５％ツイーン２０）で５
回洗浄して未結合抗血清を除去し、過剰の液を振盪除去
した。

ＮＧＳバッファーで１：５０００に希釈したホースラデ
イツシュペルオキシダーゼラベル化モノクローナル抗ヒ
ト免疫グロブリンＩｇＡ複合体（Ｊａｎｓｓｅｎ、　Ｐ
ｉｓｃａｔａｗａｙ、　ＮＪ　）含有溶液１００μｌを
各穴中に混合し、３７℃で１時間維持して結合ヒト抗体
と加えたラベル化複合体との間で第２の免疫反応産物を
生成させた。ついで加えた溶液を除去し、穴を前述の如
くリンスし、過剰の液を振盪除去した。

（１）顕色（ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ　）バッフｙ−（０
，１２Ｍクエン酸、０．２６Ｍ二塩基性リン酸ナトリウ
ム（ｐＨ５，０））５０　ｍ１１（２）ＯＰＤ　（水ｍ
ｅあたりオルトフェニレンジアミン１ｍｇ）１ｍｌ、及
び（３）３０％過酸化水素２５μｌを混合することによ
りパーオキシダーゼ基質溶液を新たに調製した。ついで
パーオキシダーゼ基ＩＨｇ液１００μｌを各人に混合し
てカラー顕色反応混合物を生成させた。顕色反応混合物
を暗やみ中室温で２０分維持後、溶液混合物の０．Ｄ、
を４９２ｎｍフィルターを備えたマルチスカン（ｍｕｌ
ｔｉｓｋａｎ）　　プレートリーダーを用いて測定した
。

上記エライサ操作でテストしたとき６人の異なるコント
ローム患者からの抗血清はポリペプチド２３７．２４５
及び２４６と免疫反応する免疫グロブリンＩｇＡ抗体分
子の高められたレベルを実証した。対照的に３人の健康
なコントロール患者からの抗血清はポリペプチド２３７
．２４５または２４６と免疫反応しなかった。さらに、
ＨＰＶクイプ１１コンジロームを有する患者からの抗血
清はいずれのポリペプチドとも免疫反応しなかった。

ＨＰＶ保有患者からの抗血清も免疫プロッティング方式
を用いてＨＰ　Ｖ　？Ｊ伏仏性ンパク質と免疫反応する
ことが示された。

ポリペプチド２４５を用いる上記エライサ方式において
免疫反応した抗血清を実施例４に記述したようにして親
和性単離した。親和性単離した抗ポリペプチド２４５抗
血清（ＡＩ抗−２４５）をついでＣａ５ｋｉ、　５ｉＨ
ａ、　１ｌｅｌ、ａ、Ｃ−３３Ａ及びＨＴ３を細胞から
調製された細胞溶解物を含有するプロット上での実施例
５に記述の免疫プロットアッセイに使用した。この免疫
プロットアッセイを実施例５における免疫プロッティン
グについて記述したヤギ抗つサギＩｇＧ抗体の代りにア
ルカリホスファターゼラベル化モノクローナル抗ヒト免
疫グロブリンＩｇＡ抗体を用いて行った場合、５８ｋｄ
ＨＰＶ潜伏性タンパク質はＣａ５ｋｉ細胞溶解物中にの
み検出された。これらの結果は、ヒト抗ＨＰＶＷＩ仏性
タンパク質抗体の存在を免疫プロッティング方式を用い
て実証できることを示している。

１０、　　　　腫ウィルス　　　タンパク　の単離 Ｍａｃｒｏｓｐｈｅｒｅ　Ａ＋ｗｉｎｏ　３００人ビー
ズ（八Ｉ　Ｉ　ｔｅｃｈＡｓｓｏｃｉａｔｅｓ、　Ｄｅ
ａｒｆｉｅｌｄ、　ＩＬ　）　　１００　ｍｇを５０ｍ
Ｍリン酸バッフｙ　　（ｐＨ７，０）１５　ｍｌに分散
し、分散液を脱気したつビーズを脱気分散液から遠心分
離によって回収し、得られたペレットを回収し５０ｍＭ
リン酸バッフｙ　　　（ｐＨ７，５）１３．５ｍｆに再
懸濁して脱ガスビーズ懸濁液を生成させた。脱ガスビー
ズ懸濁液を撹拌しつつ、２５％グルクルアルデヒド水（
Ｆ！Ｊ　５ｃｉｅｎｅｃｅ、　Ｃｈｅｒｒｙ　Ｈｉｌｌ
、　　ＮＪ　）１．５ｄを混合し撹拌を３分続けてグル
タルアルデヒドカップル化ビーズを形成させた。ついで
水をカップル化ビーズに撹拌下加えて最終容量を５０ｍ
ｅとし、ビーズを遠心分離によって集め水５０　ｍｌで
３回洗浄して活性化ビーズを形成させた。

実施例２Ｃに記述されたようにして調製し合計タンパク
値約５００ｍｇを含有するある量のウサギ抗ポリペプチ
ド２３６抗血清を等量のＰＢＳで希釈し、ＪＡ−２００
０−ター（８ｅｃｋｍａｎ　）　　中１２００Ｏｒｐｍ
、４℃で１５分遠心分離した。得られた上清を等量のク
ロロホルムで抽出し、水相をバッファーＡ（１００ｍＭ
　　）リス−ＨＣｊ’、ｐＨ＆Ｏ）に対して一夜透析し
て透析ウサギ抗血清を生成させた。

透析ウサギ抗血清約９ｍｌをＰＤ−１０カラム（Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、　Ｐｆ
ｓｃａｔａｗａｙ、　Ｎ、Ｊ、）に付し、バッファーＡ
２５ｍ１で予め平衡化した。

カラムを出た溶出液中最初の２．５ｍＡを捨て、残余の
溶出液を保持した。ついでバッファーＡ４ｍ１をカラム
に加え、得られる溶出液を再び保有し、前記保有溶出液
と混合した。混合物を０．２μニトロセルロースアクロ
デイス／　（ａｃｒｏｄｉｓｃ　）フィルター　（Ｇｅ
ｌｍａｎ　５ｃｉｅｎｃｅｓ、　Ａｎｎ　Ａｒｂｏｒ、
旧）に通して濾過ウサギ抗血清を生成させた。

濾過ウサギ抗血清を、自動化ＦＰＬＣ装置（Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａ　）上に平衡化バッファーとしてバッファーＡ
を用いて備えたＭｏｎｏ　Ｑアニオン交換体カラムに付
した。ついでカラムをバッファー八で洗浄し、バッファ
−Ｂ（バッファーＡ中０．５ＭＮａＣＡ）の０−３０％
勾配よりなる溶出勾配を適用した。得られる勾配溶出画
分をエライザ及び実施例３に記述したアッセイにより測
定した抗ポリペプチド抗体免疫反応性について監視し、
抗体台を両分をプールしてＦＰＬＣ精製抗ポリペプチド
２３６抗体溶液（ＦＰＬＣ抗−２５６）を生成させた。

０、Ｄ、２８０によって６ｍｇ／ｍｌの濃度を有するこ
とが決定されたＦＰＬＣ抗−２３６１ｍｊ！を１０１■
の活性化ビーズと混合し、混合物を連続攪拌下４℃で６
０分維持した。ついで攪拌ビーズを遠心分離によって非
結合抗体分子から単離し、ＩＭグリシンバッフｙ　　　
（ｐＦ４７．０）　　１　　ｍｌ中に再懸濁し、室温で
３０分維持してビーズ上に存在する過剰の活性化部位を
ブロックした。ついでブロック化ビーズを遠心分離によ
ってグリシンバッファーから単離して抗−２３６複合化
ビーズを形成させた。

抗−２５６１ｚ合化ビーズを最初に５　ｍＭクエン酸ハ
ソファ−（ｐＨ３，０）１　ｒｅβで洗浄して過剰のグ
リシンを溶出し、ついでＰＢＳｌｍｆｆで２回洗浄し、
さらにＲＩＰＡバッファー〔ノニデソト（ｎｏｎｉｄｅ
ｔ）　　Ｐ−４０（ＮＰ４０）　　２　ｍ１１デオキシ
コール酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ　ｄｅｏｘｙｃｈｏ
ｌａｔｅ　）２ｇ、　ＳＤＳ　００２ｇ、０．５Ｍ　Ｅ
ＤＴＡ２　ｍｌ及び十分なＰＢＳを混合して最終容量２
００ｍｊ！にすることによって調製した〕で２回洗浄し
て、平衡化抗−２３６複合化ビーズを形成させた。

Ｉｔ　ｅ　Ｌ　ａ細胞の０．１２ｇ′Ｒ，填細胞ペレッ
トを実施例５と同様にして調製し、−７０℃に凍結し、
解凍し、ついでＲＩＰＡバッファー１　　ｍｊ２に）懸
濁した。ついでＨｅＬａ細胞懸濁液をドゥンス（ｄｏｕ
ｎｃｅ　）ホモゲナイザー中ゆるい適合の乳棒を用いる
ストロークで攪拌し、攪拌懸濁液を微量遠心分離機中１
２０００ｘｇで１５分遠心分離した。得られる上清を集
め、平衡化した抗−２３６複合化ビーズと混合し、混合
物を連続攪拌下４℃で２時間維持して複合化抗体と潜伏
性乳頭腫ウィルス拡散タンパク質との間の免疫反応産物
を生成させた。ついで混合物をカラムに入れ、混合物中
に含まれるビーズを、カラムをＲＩＰＡバッファー１　
ｍｌ、ＬＢバッフｙ−（０，２％ＮＰ４０．２０　ｍＭ
　トリス−ＨＣｌ、ｐ　Ｈ７，５，１５０ｍＭ　　Ｎａ
Ｃ１）　　Ｉｎｊ！、ＩＭＫＣＡｌｍｆｆ及び５％ＰＢ
Ｓ中の２．５ｍＭＣａＣβ２　１　ｍｌでリンスして洗
浄した。リンスしたカラムに５０ｍＭクエン酸ナトリウ
ム（ｐＨ３，０）２００μｌを加え、溶出液を集めた。

十分な１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７，５）を溶出液に
加えてクエン酸バッファーを約ｐＨ７，０に中和し、中
和した溶出液を、溶出液中に存在するタンパク質を沈殿
させるため、十分な１００％トリクロロ酢酸と混合して
１５％ＴＣＡを達成した。タンパク質沈殿を回収し、ア
セトンで洗浄し、アセトン洗浄タンパク質をＳＢに再懸
濁し、実施例５に記述した５ＤＳ−ＰＡＧＥで分析した
。

Ｉｆ　ｅ　Ｌ　ａ細胞から単離したアセトン洗浄タンパ
ク質の５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析は見掛けの分子量約１’１
２　ｋａを有し、免疫プロットアッセイにおいて実施例
２ｃで調製されたウサギ抗−２４５抗血清と免疫反応し
たタンパク質を実証した。

表２に示すポリペプチド、ポリペプチド２４５及びコン
トロールポリペプチド６５を実施例９に示したと以下の
例外を行う以外同様なエライサアソセイに用いて抗ＨＰ
Ｖ潜仏性タンパク質抗体分子を検出した。

ポリペプチドを含有する被覆溶液５０μｌを９６穴平底
微量力価プレート（ｒｍｍｕｎｏｌｏｎ　　Ｕ、Ｄｙｎ
ａｔｅｃｈ、　Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ、　ＶＡ　）の穴に
、甚大が表８に示すポリペプチドのうち唯１つの１μｇ
を含有するように加えた。穴を前記と同様に維持し、リ
ンスし、ブロックした。ついでプレートを前記と同様に
乾燥し、ついでＮＧＳパンファーで１／１０希釈した患
者血清１００μｌを甚大に加えて免疫反応混合物を形成
させ、これを前記と同様にして維持し、洗浄した。

免疫反応産物をＮＧＳで１　：　３０００に希釈したホ
ースラディソシュベルオキシダーゼラヘル化モノクロー
ナル抗ヒトＩｇ−Ａ複合体（Ｊａｎｓｓｅｎ　）を用い
て前記と同様にして検出した。第２のセントの穴を、ラ
ベル化複合体がＩｇＡの代りに抗Ｔ　ｇ　Ｇ　（０ｒｔ
ｔ＋ｏ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、　０ｎｔａｒｉｏ＋
　Ｃａｎａｄａ　）であったことを除き同様にして調製
した。得られた着色反応混合物約４９０ｎｍでの光学密
度（ＯＤ４９゜）を測定した。測定値を表８に示す。

゛） 表８の結果は配列−ＬＴＹＤＳＦ−またはポリペプチド
６６では配列−１ｌＫｓＡ　ＩＶＴＬＴＹＤ−を含有す
るすべてのポリペプチドがコントロールペプチド６５よ
り強力に患者抗血清中に存在するｇａまたはＩｇＡと免
疫反応したことを示す。患者１はタイプ１８潜伏性ＨＰ
　Ｖ感染を有するとして診断され、患者２は頚の鱗屑状
細胞癌を有することが″６ｉ１織学的に確認された。

これらの結果はＩＩ　Ｐ　Ｖ感染患者からの抗血清がＨ
Ｉ）　Ｖタイプ１６関連ポリペプチドと免疫反応するこ
とを示している。結果は免疫反応が−ＬＴＹＤＳＥまた
はポリペプチド６６ではより小さなよく特徴づけられた
エピトープの存在によることを実証している。

表９に示すポリペプチドを９６穴ｍｌ力価プレートの各
人の壁に吸着させ（穴あたり１つのポリペプチド種）、
ついで穴をブロッキング溶液よりもＮＨＳバッファー（
ＰＩ３Ｓ中１０中正０％正常ウマ血清ロックした。つい
でＮ　ＨＳバッファーを用いて連続的に２倍希釈に希釈
したモノクローナル抗体２４５　：　ｌ　ｌＥ３の５０
μｌを各ブロック化壁に混合した。混合物を前記のごと
く維持し、免疫反応産物を形成させた。固相結合免疫反
応産物を実施例６ａに記述したようにしてＡ・ギ抗マウ
スＩｇＧ複合体を用いて検出し、表９に示す結果を４１
５ｎｍで５０％最大ＯＤを得るのに必要な力価として表
した。

モノクローナル抗体２４５：１１Ｅ３のＨＰ　Ｖタイプ
１６関連ポリペプチドと免疫反応する能力を以下に述べ
る例外をもって実施例３に述べたと同様な固相エライサ
操作によって評価した。

表９ Ｍａｂ２４５：１１Ｅ３のエビ ペプチド配列 門ＡＤＰＡＧＴＮＧＥＥＧＴＧＣ ’Ｉ’　Ｙ　Ｄ　Ｓ　ｌミＷ＋［ＤＱＦｌ、ＳＱシＫＩ
ｒ’Ｃ１１ＫＳＡＩＶＴＬＴＹＤＳＥＷＯＲＤロＣ１１
ＫｓＡＩシＴＬＴＹＤＳＥＷＣ １１ＫｓＡＩシＴＬＴＹＤＳＩＥＣ １１ＫｓＡ　ＩＶＴＬＴＹＤＳＣ ＋１ＫｓＡ　［ＶＴＬＴＹＤＣ １１ＫｓＡ　ＩＶＴＬＴＹｃ Ｉ・−プ地図化 ガー賃− く１：８ １　：　５１２ １　：　５１２ １　：　５１２ １：５１２ １　：　２５６ １　：　１２８ ＜１：８ 表９の結果はモノクローナル抗体２４５：１１Ｅ３に結
合するＨ　Ｐ　Ｖタイプ１６関連ポリペプチドについて
のエピトープはアミノ酸残基配列ＴＹＤＳＥ−を含有す
ることを示している。

患者血液中の抗ＨＰ　Ｖ潜伏性タンパク質抗体分子を検
出するため、ＨＰＶタイプ１６関連ポリペプチド２３７
．２４５及び２４６を以下の例外以外実施例６と同様な
エライサアソセイに服せしめた。

抗血清は、表ＩＯに示す種々のＭｉ織学的に確認された
コントローム病変または種々の等級（ｇｒａｄｅｓｏｆ
　）頚部形成異常の形態で潜伏性１１　Ｐ　Ｖ感染症と
して診断された４６人の患者から得られた。これらの抗
血清の各々をポリペプチド２３７．２４５また２４６を
吸着させた個々の穴中で混合し、吸着したＨ　Ｐ　Ｖタ
イプ１６関連ポリペプチドと免疫反応できる抗ＨＰＶ潜
仏性タンパク質抗体分子（免疫グロブリンＩｇＡ）の存
在について実施例９に示すようにしてアッセイした。結
果を表１０に示す。

（支問 シｊ　　　　」 ’−６’−６’−６ １、結果はポリペプチド２３７．２４５または２４６を
吸着させた壁についての０ＤＡ９２及びポリペプチドを
吸着させない壁についでの０Ｄ４９□　（ブランク）と
して表した。

２、組織学を各抗血清提供者について報告する。

ＣＩＮは頚部上皮内断形成を示す。ボーダーラインＣＩ
Ｎ　（＋／−ＣＩＮ）はあるタイプのＨＰ　Ｖを通例有
しており、ＣＩＮＩは温和な形成異常、ＣｌＮ２は中位
の形成異常、ＣｌＮ３は高度の（５ｅｖｅｒｅ　）形成
異常もしくは基本的ＩＩＩ　Ｉ泡層貫入（ｂａｓａｌ　
ｃｅｌｌ　１ａｙｅｒ　ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ前のそ
の場での癌である。他の組織学的特徴も示される。

表１０の結果は、潜伏性ＨＰ　Ｖ感染を有し、異なる段
階の頚部形成異常もしくはコントロールを示す患者が１
のみならず数種の異なるＨ　Ｐ　Ｖタイプ１６関連ポリ
ペプチドと免疫反応するＩｇＡ抗体分子を血液中に含ん
でいることを示す。

このように本発明はその配列がすべて１つのＨＰＶタイ
プから推測される異なる種類のポリペプチドの互いの組
合せにおける使用を包含する。

これらの異なるポリペプチドは実行されたエライサアソ
セイの別個の穴または診断用キ・ノドに上記したごとく
含有させることができ、また組み合わせて単一の固体支
持体上に例えば単一の穴中に吸着させることができる。

好ましい組合せは単一の＆ＩＦＪ力価プレートの別個の
穴中へのポリペプチド２３７．２４５及び２４６を包含
する。

組織学的に診断された種々の段階の形成異常において潜
伏性ＨＰＶ惑染感染する患者から得た抗血清の一群を、
以下の例外を除き実施例９に記載したと同様なエライサ
アソセイで分析した。

ポリペプチドに６９、Ｋ２Ｏ、Ｋ７２または２４５を１
μｇ含有する被覆溶液、またはコントロールとしてＰＶ
〔標準的ウィルス学的操作により、保存されたピリオン
乳頭腫ウィルスタンパク質を含有するムース（ｍｏｏｓ
ｅ　）いぼから単離された乳頭腫ウィルスピリオン）ｌ
ｐｇを含有する被覆溶液５０μｌを９６穴半面積平底（
ｈａｌｆ　ａｒｅａｆｌａｔ　ｂｏｔｔｏｍ　）　重量
力価プレート（ｃｏｓｔａｒＣａｍｂｒｉｄｇｅ、　Ｍ
Ａ　）の穴に加え、前記と同様に維持して加えた物質を
穴の壁に吸着させた。ＮＧＳバッファーの代りにＮ　Ｈ
Ｓバッファーを用いて穴をフロックした。ついでＮＨＳ
バッファーで１：２０に希釈した患者血清５０μｌを各
人に混合して免疫反応混合物を形成させ、混合物を３７
℃で２時間維持してポリペプチド含有免疫反応産物を形
成させた。

Ｎ　１１　Ｓバッファーで１：ａｏｏに希釈したアルカ
リホスファターゼラベル化ポリクローナル親和性精製抗
ヒト免疫グロブリンＩｇＡ複合体（ＤａｋｏｐｏｔＬｓ
、　Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、、Ｄｅｎｍａｒｋ　）を含
有する溶液５０μｐを各人に混合し、３７°Ｃで２時間
維持して結合ヒト抗体と加えたラベル化複合体との間の
第２免疫反応産物を生成させた。ついで加えた溶液を除
去し、前記のごと＜ＮＨＳバッファーでリンスし、過剰
の液を振盪除去した。

ＰＮＰＰ　基Ｘ溶液Ｃｐ−ニトロフェニルホスフェート
、ＳＩＧ！、ｌＡ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　　Ｃｏｒｐ、　
　Ｓｔ、　　Ｌｏｕｉｓ、　　）、１０　：０．０１％
ＭｇＣβ２を含有するジェタノールアミンバッファー、
９．８％（ｖ／ｖ　）　、ｐＨ９，５の艷あたり１ｍｇ
の濃度〕５０μｐを各人に混合してカラー顕色反応溶液
を形成させた。混合物を室温で４５分維持した後、溶液
の０．Ｄ、を４０５ｎｍフィルターを備えたマルチスカ
ンプレートリーダーを用いて測定した。

免疫グロブリンＩｇＡ抗体分子を測定する結果を表１１
に示す。

　ｚ 一へへへへＣ’Ｊへへのの０円内のりω円マ寸ママト １　表１０の１２におけるように各抗血清提供者につい
ての３、■識字を報告する。

２ｆ）Ｖはムースいぼから単離されたコントロール乳ロ
頁ｌＩ市ヒ゛リオンである。

「１６」はＨＰ　Ｖタイプ１６から准７１１すされた配
列を有するポリペプチド２４５が穴に含有されていたこ
とを示す。

［６」ばＩ−Ｉ　Ｐ　Ｖタイプ６から推測された配列を
有するポリペプチドに７０が穴に含有されていたごとを
示す。

「１８」はＩ−ｆ　Ｐ　Ｖタイプ１８から推測された配
列を有するポリペプチドに６９が穴に含有されていたこ
とを示す。

６　　ｒ３３ＪはＩ−Ｉ　Ｐ　Ｖタイプ３３から推測さ
れた配列を有するポリペブチ）”Ｋ７２が穴に含有され
ていたことを示す。

表１１の結果は種々の潜伏性ＨＰ　Ｖ感染を有する患者
が血液内に別のに対してより１つのＨＰ　Ｖタイプ関連
ポリペプチドと優先的に免疫反応するＩｇＡ抗体分子を
含んでいることを示している。

例えば、患者１はＶｉｒａ　Ｔｙｐｅ　ＤＮ八へｙｐｉ
ｎｇ　Ｋｉｔ（）、１ｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｉａｇｎｏ
ｓｔｉｃｓ、　Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、　）、ＩＤ
　）を用いて決定された確認されたＨＰＶタイプ１６感
染者てあり、彼の血液はＨＰＶタイプ１６関連ポリペプ
チド２４５と実質的に免疫反応するＩｇＡ抗体分子を含
んでいたが、タイプ３３関連ポリペプチドに７２とは少
しの程度しか免疫反応しなかった。患者３６はＨＰＶタ
イプ１８関連ポリペプチドに６９と優先的に免疫反応す
るＩｇＡｖＬ体分子を血液中に含んでいた。患者７５及
び９２はＨＰＶタイプ６関連ポリペプチドに７０と優先
的に免疫反応するＩｇＡ抗体分子を血液中に含んでいた
。

表１１の結果は、そのアミノ酸残基配列が異なるＨＰＶ
タイプから推測されるＨＰＶ関連ポリペプチドを１つの
であって他のでないＨＰＶクイブによって誘導される抗
体分子をタイプ特異的に検出し識別するのに用いること
ができる本発明の１態様を実証している。ＨＰＶ関連タ
イプ特異的ボリペプチドは上記のごと〈実施されたエラ
イサアッセイまたは診断用キットの別々の穴に含有させ
ることもできるし、組み合わせて単一の固体支持体上に
例えば単一の大中に吸着させることもできる。

ラベルされた抗体複合体を用いて同様のアッセイを行い
一群の提供者抗血清中のＩｇＡ及びＩｇＧ免疫グロブリ
ンを検出した。このアッセイにおいて、結果はまず上記
と同様表１２に示すＨＰＶタイプ特異的ポリペプチドと
免疫反応する免疫グロブリンＩｇＡ抗体分子を含有する
抗血清について求められた。

ついで、ＩｇＡ１合体の代りに、ＮＨＳバッファーで［
８００に希釈したホースラデイツシュペルオキシダーゼ
ラベル化ポリクローナル抗ヒト免疫グロブリンＩｇＧ１
合体（Ｄａｋｏｐａｔｔｓ　）含有溶液５０μｐを用い
る以外同様のエライサアッセイを同じ群の抗血清につい
て行った。第２の免疫反応産物の生成及び前記と同様の
リンス後、ＡＢＴＳ基質溶液（０，００２Ｍクエン酸塩
ｐＨ５，０のｍｌあたり０．２　ｍｇの濃度のＡＢＴＳ
、０．００９％過酸化水素）５０μｌを各式に混合して
カラー形成反応混合物を生成させた。顕色反応混合物を
暗やみ中室温で２０分維持した後、溶液混合物の０．Ｄ
。

を、４１５ｎｍフィルターを備えたマルチスカンプレー
トリーダーを用いて測定した。

ＨＰＶ関連ポリペプチドと免疫反応する、ヒト提供者血
液中のＩｇＡ及びｒｇｃ抗体分子の検出結果を表ＩＩと
同し取扱い方式で表１２に示す。

６ｖ！＄ １５、ヒト血゛から抗ＨＰＶ　　連タンパク実施例１と
同様にして調製したポリペプチド２４５の１０ｎｗを水
に溶解し、次に充填Ｃｌ−１−セファロースビーズ（Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ　）４　ｍａｌに製造者の指示に従っ
てカップリングさせてポリペプチド２４５−アガロース
固体支持体を形成させた。調製された支持体をまず４Ｍ
　ＫＳＣＮ　１０　ｍｌで洗浄し、ついでＰＢ３４００
ｍｌで洗浄して平衡化２４５支持体を形成させた。第２
の支持体をＩＩＰＶＥ領域０ＲＦｓと配列相同性を有さ
ないコントロールポリペプチドを用いて同様に製造して
平衡化コントロール支持体を生成させた。

実施例９に記載の手法を用いて求めたポリペブチ］・と
免疫反応性の抗体分子を有するＣＩＮ患者からの抗血清
を集めた。集めた抗血清２　ｍｌを５ｍ（１／ｈｒの流
速でコントロール支持体に適用し、支持体からの溶出液
を回収した。ついで回収した溶出液を平衡化した２４５
支持体に適用し、ついで支持体を０．５　Ｍ　ＮａＣＩ
ｔを含有するＰＢＳ約８０ｒｒｅで洗浄して２４５支持
体に含まれていたポリペプチドと特異的免疫反応をしな
かったすべての物質をすすぎ流した。

ついで４ＭＫＳＣＮを支持体に５ｍｆｆ／ｈｒの流速で
加えて免疫反応した抗体分子を２４５支持体から溶出し
、溶出液を両分に回収した。両分の０．Ｄ。

を２８０ｎｍで測定し、ピーク含有画分を決定し、プー
ルして抗体含有プールを得た。ついでこのプールをＰＢ
Ｓに対して透析してポリペプチド２４５単離精製ヒト抗
ＨＰＶ潜伏性タンパク質抗体分子を含有する溶液を得た
。このようにして調製された溶液中に含有される抗体分
子を親和性精製もしくは親和性単離ヒト抗ＨＰＶ潜仏性
タンパク質抗体分子と称する。

得られた親和性単雛された抗体分子は、溶液中に含まれ
る抗体分子の５０％より多い部分がＩＩＰＶタイプ１６
関連ポリペプチドと免疫反応する能力を有するので実質
上単離された抗体を表す。ここで実証されるごとく、こ
れらの抗体分子はまたＨ　Ｐ　Ｖ潜伏性タンパク質と免
疫反応する能力も有する。

セルラインＮ　ｌ　ｔｌ　３　Ｔ　３　／　ＨＰ　Ｖ　
１６はｔＩ　Ｐ　Ｖタイプ１６で安定にトランセクトさ
れた（　ｂｅｔｒａｎｓｅｃｔｅｄ　）マウス繊維芽細
胞Ｎ　Ｉ　１−１３　Ｔ　３セルラインであり　（Ｙａ
ｓｕｍｏｔｏ　ｅＬ　ａｔ、、　Ｊ、ν１ｒｏ１．５７
．５７２−５７７．１９８６）、　ｆＪｒ、ｊ、　Ｄｉ
Ｐａｏｌ。

から得た。Ｃ４，ＩＩはＨＰＶタイプ１８保有頚部癌セ
ルライン（Ｙｅｅ　ｅｔ　ａｌ、、八ｍ、　Ｊ、　Ｐａ
ｔｈｏｌ、　１１９−１３６１−３６６．１９８５）で
あり、ＡＴＣＣから得、ＡＴＣＣ仕様書に従って培養し
た。

実施例５に記述したセルラインＨＴ　−３、Ｃａ５ｋｉ
及び５ｉｌｌａ　、Ｎｌｌｌ３Ｔ３／ＨＰＶ１６及びＣ
４■、及び正常セルラインＮｌＮ５Ｔ３　　（ＡＴＣＣ
）を以下に述べる例外を除き実施例５に記述したウェス
タン免疫プロットアッセイに服せしめた。

細胞溶解物を前記したようにしてただし７％ポリアクリ
ルアミドゲル及び図５の凡例に示した分子量マーカータ
ンパク質を用いる５Ｏ５−ＰＡＧＥに服せしめた。電気
泳動細胞熔解物をニトロセルロースに移行させ、ブロッ
クした後、ブロックしたプロットを、（ａｌ実施例１５
で調製し、ＢＬＯＴＴＯで１＝１０に希釈したポリペプ
チド２４５親和性単離ヒト抗＋ｒｐｖ？１伏性タンパク
質抗体分子の溶液、（ｂｌ実施例６ｂで調製したハイブ
リドーマ２４５：１１Ｅ３からの未希釈培養上清、また
は（Ｃ１実施例４で調製しＢＬＯＴＴＯでｌ：３２に希
釈したウサギ親和性単離抗ポリペプチド２４５抗体分子
含有溶液中に１２時間維持して混合した抗体組成物とプ
ロット上の固相としての潜伏性乳頭腫ウィルスタンパク
質との間の免疫反応産物を生成させた。

ついで洗浄したプロットをｆａｌ抗ヒトＩｇＡ、（ｂｌ
ｌ抗マウス１ｇ士たは（Ｃ）抗ウサギＩｇＧにそれぞれ
複合化させたアルカリホスファターゼをそれぞれ１：１
０００に希釈して含有するＢＬＯＴＴＯ中で維持して、
第２の混合抗体とプロットの固相上に存在する最初に生
成した免疫反応産物との間で第２の免疫反応産物を生成
させた。ついでプロットを洗浄し、同相免疫反応産物を
色素生産性物質展開剤（ｄｏｖｅｌｏｐｅｒ　）溶液を
図５の凡例に示した展開時間用いて視覚化した。

ヒト抗体分子を用いて潜伏性乳頭腫ウィルスタンパク質
を検出するためにウェスタン免疫プロットアッセイを用
いる結果を図５に示す。

例えば、ヒト抗体分子はＣ４■細胞中の４８ｋｄタンパ
ク質、Ｎ　ＴＨ３Ｔ３／ＨＰＶ　１６細胞中の４８ｋｄ
及び２６ｋｄタンパク質、及び長いさらしでＣａ５ｋｉ
細胞中の５８ｋｄタンパク質（図５Ａの左部）と免疫反
応したが、コント【コール細胞ＨＴ　−３またはＮ　Ｉ
　Ｈ３Ｔ　３との免疫反応はみられなかった。

さらなる特徴化として、モノクローナル抗体２４５　：
　１１Ｅ３はＣａ５ｋｉ細胞中の５８ｋｄタンパク質と
免疫反応したが、ＨＴ　−３または５ｉｌｌａ細胞中の
タンパク質とは免疫反応しなかった（図５ｂ）。親和性
単離ウサギ抗体はＣａ５ｋ　ｉ細胞中の４８ｋｄタンパ
ク質と優先的に免疫反応し、５１ｋｄ及び５８ｋｄタン
パク質とは最小的に免疫反応した（図５ｃ）。

固定細胞を８％Ｎ　ＨＳ中で３０分ブロックした以外実
施例８ａと同様にして免疫組織化学検出用ｍ織培養細胞
を調製し、（ａｌ実施例１５で調製され、ＢＬＯＴＴＯ
で１：５に希釈したポリペプチド２４５親和性単離ヒト
抗ＨＰＶ潜伏性タンパク質抗体分子、または（ｂｌハイ
ブリドーマ２／１５　：　ｌ　ＩＡＥ３培養物からの上
清に存在し、実施例６ｂで調製され、ＢＬＯＴＴＯで１
＝１８に希釈された抗体分子を含有する溶液を用いて９
０分免疫反応させた。結果は両方の抗体分子ともＨＰＶ
タイプ１６感染Ｃａ５ｋｉ細胞と免疫反応するが、テス
トした他のセルラインとは免疫反応しないことを示した
。Ｃａ５ｋｉ細胞中の視覚化された免疫反応産物は細胞
核における強い染色を示した。Ｃａ５ｋｉ　ｉ［ｌ胞を
細胞より小さい（５ｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ　）分別に付
して核を華離し、単離核を実施例１６ａに示すウェスタ
ン免疫プロッティングによって分析して５８ｋｄタンパ
ク質を同定することによって核局在を確認した。

これらの分析はヒト及びマウスポリペプチド２４５￥’
Ｊｌ和性単離抗体分子の両者とも核ＨＰ　Ｖ潜伏性５８
ｋｄタンパク質及び２６ｋｄ及び４８ｋｄＨＰ　Ｖ潜伏
性タンパク質と免疫反応したことを示す。

表１３ ＣＩＮＩ　　　　　　　３２　　　　　　０．１３７　
　　０．１９８ＣＩＮ２　　　　　　２０　　　　　　
０．１６２　　　　０．１２６ＣＩＮ３　　　　　　１
４　　　　　　０．３２０　　　　０．１７４１．４９
２ｎｍでの０．Ｄ、はエライサアノセイにおける患者１
ｇＡ抗体分子とポリペプチド２４５との免疫反応によっ
て測定した。

Ｍｉ織学的にＣＩＮＩ、ＣｌＮ２またはＣｌＮ５（定義
は表ＩＯの注２に示す）として確認された形成異常（ｄ
ｙｓｐｌａｓｉａ　）を有する患者から得た抗血清サン
プルを用いる実施例９のエライサアッセイによって得ら
れたエライサ免疫反応結果に基いてヒト血液中分子の統
計的分析を行った。この結果を表１３に示す。

結果は形成異常の苛烈さと抗ＨＰＶｉ仏性タンパク質抗
体のポリペプチド２４５との免疫反応性の相関関係を示
す。従って、抗乳頭腫つィルス潜仏性タンパク質抗体分
子を検出するための本方法及び診断系は患者１ｇＡ免疫
反応性及び力価と乳頭腫ウィルス誘導性器病変及び形成
異常の苛烈さとを相関させるために用いることができる
。

具体的態様及び実施例を含む上記明細書は本発明を例示
するものであり、限定的に解すべきでない。本発明の真
の精神及び範囲を離れることなく多くの他の変化及び修
飾を行うことができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ＨＰ　Ｖタイプ１６のヌクレオチド配列から
誘導される読み取り枠（ＯＲＦ）を図的に示したもので
ある。ここで参考として引用している、シードルフ（５
ｅｅｄｏｒｆ　）等（ピロロジー（ν１ｒｏ１．　）、
＋４５．１８１−１８５　　（１９８５））の報告に示
されている、ＨＰ　Ｖタイプ１６のヌクレオチド配列の
番号システムを用いているので、第１図に示したＯＲＦ
は、以下に示す核ＯＲＦに対して、上記報告中に含まれ
ているヌクレオチド配列を含んでいる。 ｉ化ま」」ジ檗写顕ｔチ１ノむ阻 このＯＲＦの翻訳フェーズは、“Ｒ１″がフェーズ１、
“Ｒ２”がフェーズ２及び“Ｒ３”がフェーズ３を示し
ている、左に記した“Ｒ”によって示している。ヌクレ
オチドのキロヘース（ｋｂ　）で測定する尺度が０ＲＦ
Ｏ下に位置しており、その相対的位置を示している。 第２図は、ｌ−（Ｐ　Ｖ含有組織培養物及び生検組織サ
ンプル中に存在する、ヒトパピローマウィルス潜在性タ
ンパク質のイムノプロット分析を示している。細胞溶解
物を調製し、７．５％ポリアクリルアミドゲルによる電
気泳動を行ない、そしてウサギ抗ポリペプチド２３６抗
血清を用いた、例５で説明されているようなイムノブロ
ッティングを行った。 レーンｌからレーン４は、各々頚管がん腫細胞系列Ｃａ
５ｋｉ、、ＨｅＬａ、　　５ｉＨａ及びＣ−３３ａから
調製した細胞溶解物を用いて得られた結果を示した。 この抗血清は、）ＩｅＬａ及び５ｉＨａ細胞中に存在す
る１１２キロダル１−ン（ｋｄ　）のタンパク質と免疫
反応し、また、分析した全ての細胞溶解物中に存在する
約７０，０００の分子量を有するタンパク質とも非特異
的に免疫反応を起こす（レーン１４．６．７）。レーン
５は、ｋｄで示した分子量を有する、マーカーとして電
気泳動した以下に示すタンパク質標７に物質を含んでい
る；リゾチーム、１４、４ｋｄ　；　ｌ−リブシンイン
ヒビター　２１．５ｋｄ；カーボニックアンヒドラーゼ
、３１ｋｄ；オバルフ′ミン、４２．７ｋｄｉウシ血清
アルブミン、６６．２ｋｄ；ホスホリラーゼｂ、　９７
．４　ｋｄ　　；β−ガラクトシダーゼ、１１６．２５
ｉ及びミオシン、２００ｋｄ　０　レーン６及び７は、
２種のコンジローマ生検ザンプルから調製した細胞溶解
物を用いて得られた結果を示している。１つのコンジロ
ーマ生検溶解物（レーン６）は、５４ｋｄ及び４６ｋｄ
両方の虱維状タンパク質を含んでおり、一方他のコンジ
ローマ生検溶解物は、５４ｋｄタンパク質のみを含んで
いる。 第３図は、ＨＰ　Ｖ含有頚管がん腫細胞中に存在する、
ヒトパピローマウィルス潜伏性タンパク質のタイプ特異
的イムノプロット分析を示している。 細胞溶解物を調製して、７．５％ポリアクリルアミドゲ
ルで電気泳動し、これを、ウサギ抗ポリペプチド２３６
抗血清を用い、例５で説明されているようにイムノプロ
ット分析した。ポリクローナル抗血清を用いて検出する
ことができる、全ての非特異的クンバク質に加え、５８
ｋｄ及び５４ｋｄの繊維状タンパク質がＣａ５ｋｉ細胞
から調製した細胞溶解物中に検出されたが（レーン２）
、ＩＩｅＬａ細胞から調製した細胞溶解物中には検出さ
れなかった（レーン１）。示されてはいないが、第２図
で説明したものと同じ分子量のマーカータンパク質がイ
ムノプロット上に含まれており、このことが、観察され
たタンパク質の分子量を測定する手段を提供している。 第４図は、ＨＰ　Ｖ含有頚管がん腫細胞中に存在する、
ヒ１−パピローマウィルス潜仏性タンパク質のイムノプ
ロット分析を示している。細胞溶解物を調製して、７．
５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動し、これを、モノ
クローナル抗体２４７　：　４１）　１１を用いて、例
７で説明されているようにイムノプロット分析した。レ
ーン１は、第２図で説明したのと同じ分子量マーカータ
ンパク質を含んでいる。レーン２〜５は、各々頚管がん
腫細胞系列５ｉｌｌａ　、　ＩＩｅＬａＸＣａＳｋｉ及
びＨＴ−３から調製した細胞熔解物を用いて得られた結
果を示している。 Ｃａ５ｋ＋細胞中に検出されるｆ（Ｐ　Ｖ潜伏性クンバ
ク質は、５８ｋｄ、５４ｋｄ、及び４８ｋｄの繊維状タ
ンパク質を含み（レーン４）、一方、１ＩｅＬａの細胞
中には、５４ｋｄのタンパク質のみが検出された。検出
された全てのその他のタンパク質は、モノクローナル抗
体２４７：４Ｄ１１を用いたとき観察される非特異的免
疫反応産物である。 第５図は、ＨＩ）　Ｖ含有頚管がん肺細胞中に存在する
、ヒＩ・パピローマウィルス潜伏性タンパク質のイムノ
プロット分析を示している。細胞溶解物を調製して、７
％ポリアクリルアミドゲル電気泳動し、これを、ポリペ
プチド２４５　（パネルＡ）、ハイブリドーマ２４５：
１ＩＥ３培養物上清（パネルＢ）、又は、ウサギのアフ
ィニティ単離化抗ポリペプチド２４５抗体分子（パネル
Ｃ）Ｊ二でアフィニティー単離した、ヒト抗ＨＰ　Ｖ潜
伏性タンパク質抗体分子を用いて、例１６ａで説明され
ているようにイムノプロット分析した。分析した各細胞
溶解物を、各ゲルのレーン上に列挙した。図の右及び左
欄の数字は、主要免疫反応種の十ロダル１−ンで示した
分子量、５８ｋｄ及び４８ｋｄを示している。矢じりは
、各々、２００．１１６．９２．６６．４４及び３１ｋ
ｄの分子量を有するマーカークンバク質の位置を示して
いる。パネルへの左側部分及びパネルＢ全体は、１２時
間現像したもので、一方、パネルへの右側部分及びパネ
ルＣ全体は、３０分間現像したものである。 図面の’！”Ｆ’　７？；・′内容に変更なし）ＦＩＧ
、　２ ＦＩＧ、　３ ＦＩＧ、５Ａ ＦＩＧ、　４ 日Ｇ、５Ｂ ＦＩＧ、５Ｃ ｆｆ！　■

Claims (23)

【特許請求の範囲】
1. （１）式 【遺伝子配列があります】 からなる群から選ばれる式で表わされるポリペプチド。
2. （２）わずか約５０個のアミノ酸残基からなり、かつ、
   式 【遺伝子配列があります】 からなる群から選ばれる式で表わされるアミノ酸残基配
   列を含むポリペプチド。
3. （３）わずか約５０個のアミノ酸残基からなり、かつ、
   式 【遺伝子配列があります】 からなる群から選ばれる式で表わされるアミノ酸残基配
   列を含むポリペプチド。
4. （４）わずか約５０個のアミノ酸残基からなり、かつ、
   一般式 ＸＺＸ′ （式中、Ｚは、式ＨＫＳＡＩＶＴＬＴＹＤＳＥで表わさ
   れる配列の一部に対応する配列を有する、少なくとも５
   個のアミノ酸残基を含むアミノ酸残基配列であり、 Ｘは水素もしくは、少なくとも１個のアミノ酸残基であ
   り、 Ｘ′は水酸基もしくは、少なくとも１個のアミノ酸残基
   である） で表わされるアミノ酸残基配列を含み、かつ抗ヒトパピ
   ロ−マウイルス潜伏性タンパク質抗体と免疫反応する能
   力を有するポリペプチド。
5. （５）Ｚが、式 【遺伝子配列があります】 からなる群から選ばれる式で表わされるアミノ酸残基配
   列を含むアミノ酸残基配列である、請求項（４）記載の
   ポリペプチド。
6. （６）上記ポリペプチドが、式 【遺伝子配列があります】 からなる群から選ばれる式で表わされるアミノ酸残基配
   列を有する、請求項（４）記載のポリペプチド。
7. （７）わずか約５０個のアミノ酸残基からなり、かつ、
   一般式 ＸＴＹＤＳＥＸ′ （式中、Ｘは水素もしくは少なくとも１個のアミノ酸残
   基であり、Ｘ′は水酸基もしくは、Ｘ′がアミノ酸残基
   配列ＷＱＲＤＱＦＬＳＱＶを含まない条件付で、少なく
   とも１個以上のアミノ酸残基である） で表わされるアミノ酸残基配列を含むポリペプチド。
8. （８）Ｘ′が、式 【遺伝子配列があります】 からなる群から選ばれる式で表わされるアミノ酸残基配
   列である、請求項（７）記載のポリペプチド。
9. （９）わずか約５０個のアミノ酸残基からなり、かつ、
   式 【遺伝子配列があります】 から成る群から選ばれる式で表わされるアミノ酸残基配
   列を含み、かつ、アミノ酸残基配列−ＷＲＱＲＤＱＦＬ
   ＳＱＶ−を含まないポリペプチド。
10. （１０）式 【遺伝子配列があります】 から成る群から選ばれる式で表わされるアミノ酸残基配
    列を有するポリペプチド。
11. （１１）式 【遺伝子配列があります】 で表わされるポリペプチドと免疫反応する抗体分子を含
    む実質的に単離された抗体分子もしくはモノクローナル
    抗体を含む抗体。
12. （１２）式 【遺伝子配列があります】 からなる群から選ばれるポリペプチドの唯１つと免疫反
    応する抗体分子を含む抗ポリペプチド抗体もしくはモノ
    クローナル抗体。
13. （１３）２３５：Ｂ９、２４５：１１Ｅ３及び２４７：
    ４Ｄ１１からなるハイブリドーマの群から選ばれるハイ
    ブリドーマにより産生する抗体分子を含み、かつ、潜伏
    性ヒトパピローマウイルスタンパク質と免疫反応するこ
    ができるモノクローナル抗体。
14. （１４）潜伏性ヒトパピローマウイルスタンパク質と免
    疫反応する抗体分子を産生し、かつ、２３５：Ｂ９、２
    ４５：１１Ｅ３及び２４７：４Ｄ１１からなるハイブリ
    ドーマの群から選ばれるハイブリドーマ。
15. （１５）ａ）被検者の体液サンプルを、式、【遺伝子配
    列があります】 から成る群から選ばれる式で表わされるポリペプチドを
    混合することにより免疫反応混合物を作成する工程、 ｂ）サンプル中に存在する抗パピローマウイルス潜伏性
    タンパク質抗体が上記ポリペプチドと免疫反応し、ポリ
    ペプチド含有免疫反応産物を形成するのに十分な時間、
    上記免疫反応混合物を、生物学的検定条件に維持する工
    程、 ｃ）生成したポリペプチド含有免疫反応産物の存在を検
    定することにより、上記被検者におけるパピローマウイ
    ルス感染の有無を検定する工程、 以上、ａ）〜ｃ）の工程を含む、被検者におけるパピロ
    ーマウイルス感染の検定法。
16. （１６）ａ）被検者の体液サンプルを、わずか約５０個
    のアミノ酸残基からなり、かつ、一般式、ＸＺＸ′ （式中、Ｚは、式ＨＫＳＡＩＶＴＬＴＹＤＳＥで表わさ
    れる配列の一部に対応する配列を有する、 少なくとも５個のアミノ酸残基配列であり、Ｘは、水素
    もしくは、少なくとも１個のアミノ酸残基であり、かつ Ｘ′は、水酸基もしくは少なくとも１個のアミノ酸残基
    である） で表わされるアミノ酸残基配列を含み、かつ、抗ヒトパ
    ピローマウイルス潜伏性タンパク質抗体と免疫反応する
    ことができるポリペプチドと混合することにより、免疫
    反応混合物を作る工程、 ｂ）サンプル中に存在する抗パピローマウイルス潜伏性
    タンパク質抗体が、上記ポリペプチドと免疫反応し、ポ
    リペプチド含有免疫反応産物を形成するのに十分な時間
    、上記免疫反応混合物を、生物学的検定条件に維持する
    工程、 ｃ）生成したポリペプチド含有免疫反応産物の存在を検
    定することにより、上記被検者における抗ヒトパピロー
    マウイルス潜伏性タンパク質の有無を検定する工程、 以上、ａ）〜ｃ）の工程を含む、被検者における抗ヒト
    パピローマウイルス潜伏性タンパク質抗体の存在の検定
    法。
17. （１７）上記ポリペプチドが、式、 【遺伝子配列があります】 からなる群から選ばれる式で表わされるアミノ酸残基配
    列を有する、請求項（１６）記載の方法。
18. （１８）ａ）被検者の体液サンプルを、わずか約５０個
    のアミノ酸残基からなり、かつ、式、 【遺伝子配列があります】 からなる群から選ばれる式で表わされるアミノ酸残基配
    列を含むポリペプチドと混合することにより、免疫反応
    混合物を作る工程、 ｂ）サンプル中に存在する抗パピローマウイルス潜伏性
    タンパク質抗体が上記ポリペプチドと免疫反応し、ポリ
    ペプチド含有免疫反応産物を形成するのに十分な時間、
    上記免疫反応混合物を生物学的検定条件に維持する工程
    、 ｃ）生成したポリペプチド含有免疫反応産物の存在を検
    定することにより、上記被検者における抗ヒトパピロー
    マウイルス潜伏性タンパク質の存在を検定する工程、 以上、ａ）〜ｃ）の工程を含む、被検者における、パピ
    ローマウイルス感染と抗ヒトパピローマウイルス潜伏性
    タンパク質抗体の存在を検定する方法。
19. （１９）少なくとも１回の検定を行なうのに十分な量の
    、式 【遺伝子配列があります】 からなる群から選ばれる式で表わされ、かつ潜伏性パピ
    ローマウイルス感染により誘導される抗体と免疫反応す
    ることができるポリペプチドを含有するパッケージを含
    む、体液サンプル中の抗パピローマウイルス潜伏性タン
    パク質抗体の存在を検定するための、キットの形をした
    診断システム。
20. （２０）少なくとも一回の検定を行なうのに十分な量の
    、わずか約５０個のアミノ酸残基からなる、かつ、一般
    式、 ＸＺＸ′ （式中、Ｚは式ＨＫＳＡＩＶＴＬＴＹＤＳＥに対応する
    配列を有する、少なくとも５個のアミノ酸残基を含むア
    ミノ酸残基配列であり、 Ｘは、水素もしくは、少なくとも１個のアミノ酸残基で
    あり、 Ｘ′は、水酸基もしくは、少なくとも１個のアミノ酸残
    基である） で表わされるアミノ酸残基配列を含み、かつ、抗ヒトパ
    ピローマウイルス潜伏性タンパク質抗体と免疫反応する
    ポリペプチドの少なくとも１種を含有するパッケージを
    含む、体液サンプル中における抗パピローマウイルス潜
    伏性タンパク質抗体の存在を検定するための、キットの
    形をした診断システム。
21. （２１）上記ポリペプチドが、式 【遺伝子配列があります】 からなる群から選ばれる式で表わされるアミノ酸残基配
    列を含むか、もしくは、式 【遺伝子配列があります】 からなる群から選ばれる式で表わされるアミノ酸残基配
    列を有する、請求項（２０）記載の診断システム。
22. （２２）わずか約５０個のアミノ酸残基からなり、かつ
    、式、 【遺伝子配列があります】 からなる群から選ばれる式で表わされるアミノ酸残基配
    列を含むポリペプチドの少なくとも１種を付加的に含む
    か、もしくは、上記付加的ポリペプチドが、式 【遺伝子配列があります】 からなる群から選ばれる式で表わされるアミノ酸残基配
    列を有する、請求項１記載の診断システム。
23. （２３）少なくとも一回の検定を行なうのに十分な量の
    、わずか約５０個のアミノ酸残基からなり、かつ、式 【遺伝子配列があります】 からなる群から選ばれる式で表わされるアミノ酸残基配
    列を含むか、もしくは、式 【遺伝子配列があります】 からなる群から選ばれる式で表わされるアミノ酸残基配
    列を有するポリペプチドの少なくとも１種を含有するパ
    ッケージを含む、体液サンプルにおける抗パピローマウ
    イルス潜伏性タンパク質抗体の存在を検定するための、
    キットの形をした診断システム。