PT90574B - Processo de preparacao de polipeptidos e de determinacao da presenca de anticorpos de proteina latente anti-virus do papiloma - Google Patents
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Description
MEMÓRIA DESCRITIVA
Referência a patentes relacionadas presente invento é, em parte, a continuação do pedido de patente co-pendente com o Número de Série 194 407 registada em 16 de Maio de 1988 e que é aqui incorporada por referência.
Âmbito técnico presente invento refere-se a composições de anticorpos e de anticorpos monoclonais contendo moléculas de anticorpos que imunorreagem com proteínas latentes do vírus do papiloma (VP). 0 presente invento refere-se também a métodos para a preparação de_s tas moléculas de anticorpos e a métodos de detecção destas prote_í nas latentes do VP e da infecção latente pelo VP.
Antecedentes do Invento
Os vírus do papiloma induzem hiperproliferações benignas, displásticas e malignas da pele ou da mucosa epitelial. Pfister, Rev. Physiol. Biochem. Pharmacol., 99:111-181 (1984). De acordo com Nuovo et al. , 0. Virol, 62:1452-1455 (1988) foram já identif_i cados 51 tipos (estirpes) de vírus do papiloma humano (VPH).
Em humanos, conhecem-se diferentes tipos de vírus do papiloma como causadores de doenças distintas, Pfister, Adv. Câncer ^es., 48:113-147 (1987), Syrjanen, Obstet. Gynecol. Survey, 39: :252-265 (1984). Por exemplo, os virus do papiloma humano (VPH) dos tipos 1 e 2 provocam verrugas vulgares e os do tipo 6 e 11 provocam condilomas e verrugas planas genitais. Em contraste, os VPH do tipo 16, 18 e 33 são encontrados na maioria dos cancros cervicais e não provocam o condiloma usual, mas persistem difusamente no endotélio cervical exibindo apenas um mínimo de variações patológicas. Crê-se que os tipos de VPH associados ao cancro cer vical são mantidos num estado latente nos tecidos do endotélio cervical, durante anos, após a infecção inicial e progridem depois, nalguns casos, provocando o cancro cervical.
□ genoma de muitos dos tipos de VPH presentemente identificados foi clonado e sequenciado. Veja-se por exemplo, Baker,
Sequence Analysis of Papillomavirus Genomes, em The Papovaviridae-
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EPC:11-SCRF 155.1
-Volume 2: The Papillomaviruses, Salzman et al., eds., Plenum Press, Nova Iorque, pgs, 321-386 (1987); e Chou et al., Câncer Cells, 5:55-72 (1987).
Historicamente, as estruturas de leitura aberta (ELA), dos genomas dos vírus do papiloma foram designadas por Ll e L2 e El a E7, onde L e E denotam posterior (late) e anterior (early), respectivamente. Ll, L2 e E4 codificam para proteínas de cápsulas virais e pensa-se que as ELA da região E estão associadas com funções tais como a replicação virai, transformação e manutenção de plasmídeos. Hou/ley et al., Molecular Aspects of Papillomavirus-Host Cell Interactions, in Virai Etioloqy of Cervical Câncer, Peto et al., eds., Banrury Report 21, Cold Spring Harbor Laboratory, pp. 261-272 (1986); e Doorbar et al., Ε MBO 3., 5:355-362 (1986).
Presentemente, não existem antigénios específicos para o vírus do papiloma que tenham sido identificados sem ambiguidades como sendo expressos durante ou indicativos da infecção latente pelo vírus do papiloma humano, VPH.
Este facto contrasta com os tecidos infectados pelo VPH, onde existem vírus em replicação activa. Nesses tecidos, foi já demonstrada a presença de alguns antigénios codificados para o VPH, relacionados com a replicação (por exemplo antigénios de cápsulas virais). Schneider, Methods of Identification of Human Papillomaviruses, in Papillomaviruses and Human Disease, Syrjanen et al., eds., Springer-Verlag, pp. 19-39 (1987).
Diversos estudos referem tentativas de identificar os pro dutos proteicos de linhas de células contendo o VPH. As proteínas de fusão foram expressas em Escherichia coli no qual diversas sequências de nucleótidos da região ELA do VPH foram operativame_n te ligadas a genes heterólogos. A proteína de fusão resultante continha um terminal amino não VPH e parte, ou todos os resíduos de aminoácidos putativos codificados para ELA no terminal carboxj. lo. A proteina de fusão expressa foi utilizada como imunogénico para originar antisoro policlonal e este soro foi utilizado para detectar proteínas putativas codificadas para o VPH in vitro em linhas celulares contendo VPH.
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::
-úPor exemplo, Seedorf et al., EMBO 1. , 6:139-144 (19Θ7) originaram anticorpos para uma proteína de fusão contendo sequências El de ELA e detectaram uma proteína de 70 kilodalton (kd) após tradução in vitro do mARN isolado de células HeLa contendo VPH tipo 18. Usando antisoro originado contra uma proteína de fjj são contendo sequências E4 de ELA, foi detectada uma proteína de 10 kd por tradução in vitro do mARN de células CaSki contendo VPH tipo 16. Seedorf et al., EMBO 0., 6:139-144 (1987).
Da mesma forma o antisoro dirigido contra uma proteína de fusão derivada da sequência E6 de ELA permitiu a detecção de uma proteína de 11 kd por tradução in vitro do nARN de células CaSki contendo VPH tipo 16. Seedorf et al., EMBO 0., 6:139-144 (1987).
antisoro originado para diversas proteínas de fusão que continham sequências E7 de ELA, permitiu detectar diversas pro teínas, dependendo do tipo de VPH estudado. Em células infectadas com VPH 16, foi detectada uma proteína de 15 kd usando o teste Western de imunomanchas e metodologias de radioimuno-precipitação, utilizando células CaSki ou SiHa como fonte de VPH. Seedorf et al., E MB 0 J., 6:139-144 (1987) e Firzlaff et al., Câncer Cells, 5:105-113 (1987) Smotkin et al., /~Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 83:4680-4684 (l987)_7 descreveram o uso de anticorpos originados contra uma proteína de fusão derivada da sequência E7 de ELA para detectar uma proteína de 20 kd por imunoprecipitação de células CaSki ou SiHa contendo VPH tipo 16.
Anticorpos monoclonais foram preparados contra uma proteí. na de fusão contendo ELA E7, que permitem a detecção de uma proteína de 15 kd em células contendo VPH 16, usando metodologias Western e de imunoprecipitação. Oltersdorf et al. , 0. Gen. Virol. 68:2933-2938 (1987).
Recentemente, Li et al., /~J. Gen. Virol♦ , 62:606-609 (1988)_7 descreveram um antisoro originado contra uma proteína de fusão contendo ELA E2 que foi utilizado para detectar proteínas presentes em tecidos primários de biopsia que se sabia conterem sequências genómicas do VPH. Detectou-se uma proteína de 50 kd
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-5por imunomanchas Western de lisados de diversos tecidos dianosticados como condilomas e que se havia demonstrado, por análise de manchas Southern, conterem VPH tipos 6, 11 ou 16.
Também como antecedentes do invento, foram descritos dez as. sete polipéptidos sintéticos cujas sequências de resíduos de aminoácidos correspondem a porçães do VPH do tipo 16 ELA El, E2, E4,
E6 ou E7 ou a uma porção da região ELA E6 do VPH tipo 6. Schoolnick et al., patente europeia EPO nS. 0257754A2, publicada em 2 de Março de 1988, Estes polipéptidos foram utilizados como imunogénicos para preparar antisoro de rato e quatro dos anticorpos anti. -péptido preparados, originados contra uma região E6 do VPH 16, mostraram imunoreagir com tecido de biopsia de pacientes, que se demonstrou conter ADN do VPH-16 e que fora estabelecido como possuindo displasias conhecidas. No entanto, nenhum dos péptidos de Schoolnik et al. , foi demonstrado como possuindo a capacidade de reagir como um antigénios com anticorpos induzidos como resultado de infecção com VPH.
Descrição sumária do invento presente invento refere-se a um polipéptido representado por uma fórmula seleccionada do grupo constituído por:
MADPAGTNGEEGTGC,
HEDEDKENDGDSLPTC,
RPFKSNKSTCC,
CCDWCIAAFGLTPSI,
TYDSEWQRDOFLSQVKIPC ,
HKSAIVTLTYDSEWQRDQC, e CINCQKPLCPEEKQRH.
presente invento refere-se também a um polipéptido compreendendo não mais de cerca de 50 resíduos de aminoácidos e inclui_n do uma sequência de resíduos de aminoácidos possuindo a fórmula:
-TYDSE-.
Outra concretização do invento refere-se a um polipéptido compreendendo não mais de cerca de 50 resíduos de aminoácidos e incluindo uma sequência de resíduos de aminoácidos representada pela fórmula seleccionada do grupo constituído por:
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— 6-TGILTVTYH5E-,
-HAIVTVTYDSE-,
-NAIUTLTYSSE-,
NGIVTVTFUTE-, e -ILTVT-.
Também contemplada pelo presente invento, encontra-se uma composiç3o compreendendo uma proteína filamentosa substancialmente pura, de 54 kd, do vírus do papiloma humano, contendo a referi, da proteína um primeiro epitopo possuindo a capacidade de imunorreagir com anticorpos anti-polipéptido induzidos por um polipépti. do representado pela fórmula:
MADPAGTNGEEGTGC;
e contendo um segundo epitopo possuindo a capacidade de imunorrea gir com anticorpos anti-polipéptido induzidos por um polipéptido representado pela fórmula:
CINCQKPLCPEEKQRH.
Também contemplada está uma composição compreendendo uma proteína filamentosa, substancialmente pura, de 48 kd do vírus do papiloma humano, contendo a referida proteína um primeiro epitopo possuindo a capacidade de imunorreagir com anticorpos anti-polipéptido induzidos por um polipéptido representado pela fórmula:
MADPAGTNGEEGTGC;
e contendo um segundo epitopo possuindo a capacidade de imunorrea gir com anticorpos anti-polipéptido induzidos por um polipéptido representado pela fórmula:
CINCQKPLCPEEKQRH.
Outro aspecto do invento refere-se a uma composição compreendendo uma proteína difusa substancialmente pura de 112 kd do vírus do papiloma humano, contendo a referida proteína um primeiro epitopo possuindo a capacidade de imunorreagir com anticorpos anti-péptido induzidos por um polipéptido representado pela fórmu la:
HEDEDKENDGDSLPTC;
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-7e contendo um segundo epitopo possuindo a capacidade de imunorre_a gir com anticorpos anti-polipêptido induzidos por um polipéptido representado pela fórmula:
HKSAIVTLTYDSEWQRDQC.
Outro aspecto, refere-se a uma composição compreendendo uma proteína nuclear, substancialmente pura, de 51 kd, do vírus do papiloma humano, contendo a referida proteína um epitopo possuindo a capacidade de imunorreagir com anticorpos anti-péptido induzidos por um polipéptido representado pela fórmula:
HKSAIVTLTYDSEWQRDQC.
Também contemplado pelo invento é um anticorpo anti-polipéptido que imunorreage com apenas um dos polipéptidos seleccionja dos do grupo constituído por:
MADPAGTNGEEGTGC,
HEDEDKENDGDSLPTC,
RPFKSNKSTCC,
CCDWCIAAFGLTPSI,
TYDSEWQRDQFLSQVKIPC,
HKSAIVTLTYDSEWQRDQC, e CINCQKPLCPEEKQRH.
Também contemplado pelo invento é um anticorpo monoclonal contendo moléculas de anticorpos que imunorreagem com uma proteína latente do vírus do papiloma humano, seleccionada do grupo
constituído por: | |||||
i) | a | proteína | difusa de 112 kd; | ||
ii) | a | proteína | filamentosa | de 54 | kd, |
iii) | a | proteína | filamentosa | de 48 | kd, |
iv) | a | proteína | nuclear de | 51 kd ; | e |
v) | a | proteína | nuclear de | 58 kd. |
Sob outro aspecto, o presente invento contempla um anticorpo contendo moléculas de anticorpo substancialmente isoladas ou substancialmente puras, que imunorreagem com uma proteína latente do vírus do papiloma humano seleccionada do grupo constitutuído por:
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i) | a proteína difusa de 112 kd, |
ii) | a proteína filamentosa de 54 kd, |
iii) | a proteína filamentosa de 48 kd, |
iv) | a proteína nuclear de 51 kd; e |
v) | a proteína nuclear de 58 kd. |
Ainda | contemplados pelo invento são as moléculas de anti |
corpos e de anticorpos monoclonais que imunorreagem com os polipéptidos do presente invento, em adição às composiçães contendo os polipéptidos contemplados ou as moléculas de anticorpos contem piadas.
Os sistemas de diagnóstico, na forma de estojo, contendo, numa quantidade suficiente para efectuar pelo menos uma análise, um ou mais dos polipéptidos, composiçães de proteínas e anticorpos acima mencionados, são também contemplados pelo presente invento.
Os métodos para a análise da presença da infecção pelo vi. rus do papiloma e do tipo de virus do papiloma presente, usando os polipéptidos, composiçães de proteínas e anticorpos, acima des. critos, são também contemplados no presente invento.
Descrição sumári,a dos desenhos
A Figura 1 mostra uma representação esquemática das estru turas de leitura aberta (ELA) deduzidas a partir da sequência de nucleótidos do VPH tipo 16. Usando o sistema de numeração da sequência de nucleótidos do VPH tipo 16 descrito por Seedorf et al. Virol, 145:181-185 (1985), cuja descrição é aqui incorporada como referência, as ELA apresentadas na Figura 1 incluem a sequência de nucleótidos contida nessa descrição, para cada uma das ELA, co mo se segue:
303
EPG:11-5CRF 155.1
-9ORF Sequência ds nucleótidos incluída
E6 | 26 - | 556 |
E7 | 544 - | 855 |
Ela | 859 - | 1167 |
Elb | 1104 - | 2810 |
E2 | 2725 - | 3849 |
E4 | 3332 - | 3616 |
E5 | 3862 - | 4096 |
L2 | 4133 - | 5653 |
LI | 5526 - | 7151 |
A fase de tradução da ELA é indicada pela designação R à esquerda, em que Rl indica fase, R2 indica fase 2 e R3 indica fase 3. Uma escala medida em kilobases (kb) de nucleótidos encontra-se localizada por baixo das ELA para indicar as suas posiçães relativas.
A Figura 2 ilustra uma análise de imunomanchas das prote_í nas latentes do vírus do papilDma humano, presentes em culturas de tecidos contendo VPH e em amostras de tecidos de biopsia. Os lisatos celulares foram preparados, submetidos a electroforese em geles com 7,5% de poliacrilamida e analisados por imunomanchas co mo descrito no Exemplo 5, usando antisoro anti-polipéptido 236 de rato.
As lamelas 1 a 4 mostram os resultados obtidos usando lisatos celulares preparados a partir das linhas de células de carcinoma cervical CaSki, HeLa, SiHa e C-33a, respectivamente. ^ste antisoro imunorreage com uma proteína de 112 kilodalton (kd) presente nas células HeLa e SiHa e imunorreage também, não especificamente, com uma proteína possuindo um peso molecular de cerca de 70 000, presente em todos os lisatos celulares analisados (lamelas 1-4, 6, 7). A lamela 5 contém os seguintes padrães de proteí. na sujeitos a electroforese como marcadores, possuindo os seguintes pesos moleculares indicados em kd; lisózima, 14,4 kd; inibi, dor da tripsina, 21,5 kd; anidrase carbónico, 31 kd; ovalbumina, 42,7 kd; albumina de soro bovino, 66,2 kd; fosforilase b, 97,4
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-10kd; beta-galactosidase 116,25 e miosina, 200 kd. As lamelas 6 e 7 mostram os resultados obtidos usando lisatos celulares preparados a partir de duas amostras de tecidos de biopsia de condiloma diferentes. Um dos lisatos de biopsia de condiloma (lamela 6) contém ambas as proteínas filamentosas de 54 kd e 46 kd, enquanto que o outro lisato de biopsia de condiloma contém apenas a espécie de 54 kd.
A Figura 3 ilustra uma análise de imunomanchas especifica para um dado tipo, de proteínas latentes do vírus do papiloma humano presentes em células de carcinoma cervical contendo UPH. Os lisatos celulares foram preparados, sujeitos a electroforese em geles de poliacrilamida a 7,5% e analisados por imunomanchas como descrito no Exemplo 5, usando antisoro anti-polipéptido 236 de ra to. Adicional mente a todas as proteínas não específicas detectáveis usando o antisoro policlonal, foram detectadas as proteínas filamentosas de 58 kd e 54 kd em lisatos celulares preparados a partir de células CaSki (lamela 2), mas não em lisatos preparados a partir de células HeLa (lamela l). Apesar de não apresentado, as proteínas marcadoras com o mesmo peso molecular que as descritas para a Figura 2, foram incluídas na imunomancha, inclusão essa que proporcionou um meio de determinação dos pesos moleculares das proteínas observadas.
A Figura 4 ilustra uma análise de imunomanchas de proteínas latentes do vírus do papiloma humano, presentes em células de carcinoma cervical contendo UPH. Os lisatos celulares foram preparados, sujeitos a electroforese em geles de poliacrilamida a 7,5% e analisados por imunomanchas como descrito no Exemplo 7, usando o anticorpo monoclonal 247:4D11. A lamela 1 contém as pro teínas marcadoras com o mesmo peso molecular que as descritas na Figura 2. As lamelas 2 a 5 mostram os resultados Dbtidos usando lisatos celulares preparados a partir das linhas de células de carcinoma cervical SiHa, HeLa, CaSki; e HT-3, respectivamente.
As proteínas latentes de UPH detectadas em células CaSki incluem as proteínas filamentosas de 58 kd, 54 kd e 48 kd (lamela 4), enquanto que apenas a proteína de 54 kd foi detectada em células
HeLa. Todas as outras proteínas detetadas são produtos de imunor
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EPG:11-SCRF 155.1 tf tf*
-11reacção não específicos, observados quando se utiliza o anticorpo monoclonal 247:4D11.
A Figura 5 ilustra uma análise de imunomanchas de proteínas latentes do vírus do papiloma humano, presentes em células de carcinoma cervical contendo l/PH. Os lisatos celulares foram preparados, sujeitos a electroforese em geles de poliacrilamida a 7% e analisados por imunomanchas como descrito no Exemplo 16a usando a afinidade de moléculas de anticorpo pela proteína latente anti-VPH isolada no polipéptido 245 (Painel A), sobrenadante da cultçj ra de hibridoma 245:11E3 (Painel B) ou moléculas de afinidade is_o ladas de anticorpos anti-polipéptido 245 de rato (Painel C). Cada lisato celular analisado é listado no topo da lamela de gel respectiva. Os números nas margens direita e esquerda da figura denotam o peso molecular em kilodaltons (kd) das principais espécies imunorreactivas, 5B kd e 4Θ kd. As setas indicam as posiçães das proteínas marcadoras possuindo um peso molecular de 200, 116, 92, 66, 44 e 31 kd, respectivamente. A parte esquerda do Painel A e a totalidade do Painel B foram desenvolvidas durante 12 horas, enquanto que a parte direita do Painel A e a totalidade do Painel C foram desenvolvidas durante 30 minutos.
Descrição detalhada do invento
A. DefiniçSes
Aminoácido: todos os resíduos de aminoácidos identificados no presente invento se encontram na configuração natural, L. Mantendo a nomenclatura padrão de polipéptidos, 3. Biol. Chem., 243:3557-59 (1969), as abreviaturas utilizadas para os resíduos de aminoácidos são as que se apresentam na seguinte Tabela de Co_r respondSncia:
303
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-12TABELA DE CORRESPONDÊNCIA SÍMBOLO_ AMINOÁCIDO
1-Letra | 3-Letras | |
Y | Tyr | L-tirosina |
G | Gly | glicina |
F | Phe | L-fenilalanina |
M | Met | L-metionina |
A | Ala | L-alanina |
S | Ser | L-serina |
I | Ile | L-isoleucina |
L | Leu | L-leucina |
T | Thr | L-treonina |
\J | Uai | L-valina |
P | Pro | L-prolina |
K | Lys | L-lisina |
H | His | L-histidina |
Q | Gin | L-glutamina |
E | Glu | ácido L-glutâmico |
W | Try | L-triptofano |
R | Arg | L-arginina |
D | Asp | ácido L-aspártico |
N | As n | L-asparagina |
C | Cys | L-cisteina |
Deverá notar-se que todos os resíduos de aminoácidos sáo aqui representados por fórmulas cuja orientaçáo, da esquerda para a direita, está de acordo com a direcçáo convencional de terminal amino para terminal carboxilo. Além disso, deverá notar-se que a existência de um traço no inicio ou no fim de uma sequência de re síduos de aminoácidos indica uma ligaçáo a outra sequência de um ou mais resíduos de aminoácidos, até um total de cerca de cinque_n ta resíduos na cadeia polipeptidica.
Polipéptido e Péptido: polipéptido e péptido são termos aqui utilizados para designar entre si, séries lineares de n3o
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-13mais de cerca de 50 resíduos de aminoácidos ligados uns aos outros por ligações peptídicas entre os grupos alfa-amino e carboxilo de resíduos adjacentes.
Proteína: proteína é um termo utilizado na presente de.s crição para designar séries lineares de mais de 50 resíduos de aminoácidos ligados uns aos outros como num polipéptido.
B. Proteínas latentes do vírus do papiloma
As infecções pelo vírus do papiloma podem resultar da manutenção do vírus no tecido infectado num estado latente. Tal c_o mo é presentemente entendida, para os vírus do papiloma humano (VPH), a manutenção dos vírus em estado latente ocorre para os ti^ pos de VPH associados com a infecção genital pelo vírus do papil_o ma, particularmente com aqueles que provocam diversas displasias, como o cancro cervical. Os tipos de VPH associados a displasias incluem os tipos 16, IB, 31 e 33, 35, 52 e semelhantes.
Antes da descoberta do presente invento, a presença de pr_o teínas codificadas por ELA da região E do genoma do vírus do papi. loma não tinham ainda sido detectadas em tecidos infectados com o vírus do papiloma que mantivessem o vírus num estado latente. E agora demonstrado pelo presente invento que as proteínas especlfj. cas do vírus do papiloma são expressas em tecidos infectados que abrigam o vírus num estado latente, não-replicativo.
Genericamente, portanto, uma concretização do invento cori templa uma proteína latente do vírus do papiloma, numa forma subs. tancialmente pura. Tal como utilizadas no presente invento, as frases proteína latente do vírus da papiloma, proteína do vírus latente do papiloma e semelhantes referem-se a uma proteína codificada por ELA E do VPH que é expressa em tecidos infectados em estado latente, com VPH. Os tecidos infectados em estado latente com VPH contêm material genémico de VPH mas não contêm antigénios de cápsula virai de VPH em níveis detectáveis por métodos imunológicos.
1. Proteínas latentes filamentosas do vírus do papiloma
Sabe-se agora que as células infectadas com VPH que mantêm
303
EPG:11-SCRE 155.1 /c:;
,/.
-14o virus num estado latente, produzem uma proteína filamentosa específica do vírus do papiloma (isto é, uma proteína que se encontra associada com componentes filamentados da célula) com um peso molecular de cerca de 54 kilodaltons (kd), quando medido por elejr troforese em gel de poliacrilamida na presença de dodecilsulfato de sódio (DSS-PAGE), como descrito no Exemplo 5. Por exemplo, a proteína filamentosa de 54 kd é detectável em células CaSki e SiHa como descrito no Exemplo 5. As células CaSki e SiHa são linhas de células derivadas do carcinoma cervical que contêm VPH ti po 16 e que podem ser adquiridas no Americaç Type Culture Colle£ tion (ATCC; Rockville, MD)” como CRL 1550 e HTB 35, respectivamente.
A proteína filamentosa de 54 kd é ainda caracterizada como possuindo epitopos que são imunologicamente reactivos em cruza do com os polipéptidos 235 e 247 do VPH, como apresentado na Tabe la 1. Isto significa que a proteína filamentosa de 54 kd contém sequências de resíduos de aminoácidos homólogas às sequências dos polipéptidos 235 e 247.
Os tecidos infectados em estado latente com VPH produzem também uma proteína filamentosa de 4Θ kd, como determinado por DSS-PAGE. A proteína filamentosa de 48 kd é detectável em células CaSki usando o método de análise por imunomanchas descrito no Exemplo 5.
A proteína filamentosa de 48 kd é ainda caracterizada como possuindo epitopos que são imunologicamente reactivos em cruza do com os polipéptidos 235, 247 e 245 e contêm assim sequências de resíduos de aminoácidos homólogas a esses polipéptidos.
2. Proteína nuclear latente do virus do papiloma
As células infectadas em estado latente com VPH expressam uma proteína especifica do VPH de cerca de 51 kd, como determinado por DSS-PAGE, que é detectável no núcleo de células CaSki. A proteína nuclear de 51 kd é ainda caracterizada como possuindo um epitopo que é imunologicamente reactivo em cruzado com o polipépti do 245 derivado da sequência de resíduos de aminoácidos da região interna E2 de ELA.
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EPG:11-SCRF-155.1
-15«R
As células infectadas em estado latente com VPH expressam proteínas nucleares adicionais de 26 kd, 48 kd e 58 kd, como determinado por DSS-PAGE.
As proteínas de 26 kd, 48 kd e 58 kd são detectáveis em células infectadas com VPH, usando o método de imunomanchas descrito no Exemplo 16a e são ainda caracterizadas por possuírem ep_i topos que são imunologicamente reactivos em cruzado com o polipéptido 245.
3. Proteína difusa latente do vírus do papiloma
A proteína difusa é uma proteína latente do vírus do pap_i loma possuindo um peso molecular de cerca de 112 kd, quando medido por DSS-PAGE, como descrito no Exemplo 5. A proteína difusa de 112 kd é detectável em células HeLa e SiHa usando o método de imunomanchas descrito também no Exemplo 5.
As células HeLa são células de cultura de tecido de carc_i noma cervical que contêm VPH tipo 18 e que podem ser obtidas do ATCC como CCL2.
A proteína difusa de 112 kd é ainda caracterizada por pos_ suir epitopos que são imunologicamente reactivos em cruzado com os polipéptidos 236, 245, 235, 238 e 247, derivados da sequência de resíduos de aminoácidos da região interna de ELA, Ei, da região interna de ELA E2, da região amino terminal de ELA Ela, da região interna de ELA Ei e da região interna de ELA E6, respectivamente.
As diversas espécies de proteínas latentes de vírus do p_a piloma descritas acima, são úteis, numa forma substancialmente p_u ra, como imunogênico proteinaceos num inóculo do presente invento ou como antigénios num sistema de diagnóstico do presente invento.
Assim, o presente invento contempla cada uma das proteínas filamentosas, nucleares e difusas, latentes do vírus do papiloma, acima descritas, numa forma substancialmente pura. Por forma substancialmente pura entende-se que a proteína latente de VPH particular, se encontra presente numa composição que é substancial, mente isenta de outras proteínas relacionadas com o vírus do pap_i loma.
303
EPG:11-SCRF 155.1 χί'——ff»· e-
Z
-16Os processos de produção de uma dada proteína em forma substancialmente pura, são bem conhecidos na especialidade. Tipi camente, esses processos incluem o isolamento da proteína de células que a contêm utilizando técnicas bioquímicas bem conhecidas Por exemplo, os processos de filtração em gel, cromatografia em gel, ultrafiltração, electroforese, permuta iónica, cromatografia de afinidade e semelhantes, tal como são conhecidos para o fraccionamento de proteínas, podem ser utilizados para isolar as proteínas latentes do vírus do papiloma encontradas em culturas infectadas em estado latente, contendo UPH. Dado que cada uma das proteínas latentes aqui descritas se caracteriza, em parte, pela sua reactividade imunológica em cruzado com polipéptidos definidos, os processos de purificação imunoquímicos, como a imunoafini dade, imunoadsorção e semelhantes, são particularmente apropriados para a produção das proteínas latentes em forma substancialmente pura. Preferivelmente, a composição encontra-se também substancialmente livre de entidades tais como detergentes aniónicos, por exemplo dodecilsulfato de sódio (DSS), poliacrilamida e de proteínas derivadas de culturas de células ou de tecidos, possuindo um peso molecular aparente inferior a cerca de 40 kd, como determinado por DSS-PAGE.
C. Polipéptidos
Um polipéptido do presente invento não contém mais de cer ca de 50, mais usualmente menos de cerca de 35 e preferivelmente menos de cerca de 25 resíduos de aminoácidos e contém pelo menos cerca de 5 resíduos. Adicionalmente, um polipéptido do presente invento é caracterizado pela sua sequência de resíduos de aminoácidos e pelas suas novas propriedades funcionais.
Os resíduos de aminoácidos presentes num polipéptido do invento, em adição a uma sequência específicamente enumerada até um total de não mais de cerca de 50 resíduos de aminoácidos, podem ser quaisquer resíduos que não afectem material mente as novas e básicas características de um polipéptido, tal como se discute seguidamente. Esses resíduos adicionais são usualmente adicionados a um ou a ambos os terminais de um polipéptido enumerado e p_o
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17dem incluir repetições e repetições parciais de uma sequência polipeptídica enumerada.
Genericamente, o presente invento contempla um polipéptido que inclui uma sequência de resíduos de aminoácidos capaz de produzir (induzir) moléculas de anticorpos que imunorreagem com uma proteína latente do vírus do papiloma. Preferivelmente, um polipéptido do presente invento imunorreage com anticorpos induzi, dos por uma infecção latente provocada pelo vírus do papiloma, is. to é, anticorpos anti-proteína latente do vírus, do papiloma.
Além disso, o polipéptido contém uma sequência de resíduos de ami noácidos que corresponde a uma porção da sequência de resíduos de aminoácidos deduzida a partir da sequência de ácidos nucleicos das regiões das estruturas de leitura aberta (ELA) do genoma do vírus do papiloma que se sabem encodar as proteínas latentes do vírus do papiloma.
Deverá entender-se que um polipéptido do presente invento não necessita ser igual à sequência de resíduos de aminoácidos de uma proteína latente do vírus do papiloma, desde que esteja apto a produzir, aquando da imunização, um antisoro que contenha moléculas de anticorpos que imunoreajam com uma proteína latente do vírus do papiloma. Preferivelmente, o referido polipéptido apresenta a capacidade de imunoreagir com anticorpos induzidos por uma infecção latente provocada pelo vírus do papiloma. Assim, um polipéptido do presente invento pode ser submetido a diversas modificações tais como inserções, eliminações e substituições, quer conservativas quer não conservativas, modificações essas que proporcionam algumas vantagens.
As substituições conservativas são aquelas em que um res_í duo aminoácido é substituído por outro resíduo biologicamente semelhante. Exemplos de substituições conservativas incluem a subs tituição de um resíduo hidrofóbico como a isoleucina, valina, lejj cina ou metionina por outro, ou a substituição de um resíduo polar por outro, tal como a substituição entre arginina e lisina, ácidos glutêmico e aspártico ou entre glutamina e asparagina e se melhantes. 0 termo substituição conservativa inclui também a utilização de um aminoácido substituído em lugar de um aminoácido
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-18parente não substituido, desde que esse polipéptido apresente também a actividade requerida de indução de anticorpos.
Quando um polipéptido do presente invento possui uma sequência que não é idêntica à sequência de uma proteína latente do vírus do papiloma, por se terem efectuado uma ou mais substituições conservativas ou não conservativas, usualmente não mais de cerca de 20% e mais usualmente não mais de 10% dos resíduos de aminoácidos são substituídos, excepto quando se tenham adicionado resíduos adicionais a qualquer uma das porções terminais com o objectivo de proporcionar um ligante por meio do qual os polipéptidos do presente invento possam ser convenientemente fixados a uma matriz lábil ou sólida ou a um veiculo antigénico. As matrizes lábeis ou sólidas e os veículos que podem ser utilizados com os polipéptidos do presente invento são descritos posteriormente.
Os ligantes de resíduos de aminoácidos são usualmente, p_e lo menos um resíduo e podem ser 40 ou mais resíduos, mais frequeri temente 1 a 10 resíduos. Os resíduos típicos de aminoácidos usados para ligação são tirosina, cisteína, lisina, ácidos glutâmico e aspártico ou semelhantes. Adicionalmente, uma sequência polipeptldica do presente invento pode diferir da sequência natural por esta ter sido modificada por acilação do terminal , por exemplo, acetilação ou amidação com ácido tioglicólico, carboxil amidação terminal, por exemplo, amónia, metilamina, etc..
0s péptidos do presente invento podem conter pelo menos um resíduo de cisteína e, em certos casos, dois desses resíduos. Assim, os referidos péptidos podem existir em diversas formas oxidativas. Fm adição à forma monomérica à qual o grupo sulfidrilo do(s) resíduo(s) de cisteína, é reduzido, podem também exis tir formas diméricas ou poliméricas nas quais os grupos sulfidrilo em duas ou mais moléculas de péptido se tornam oxidados e formam ligações dissulfureto inter e intra-péptido. Enquanto os péptidos que possuem apenas um resíduo de cisteína podem formar apenas dímeros lineares, aqueles que possuem dois resíduos de cisteína podem formar monómeros cíclicos ou dímeros lineares ou cíclicos e polímeros lineares de diversos comprimentos. Estas várias formas
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c.
oxidativas são consideradas como partes do presente invento e incluem-se nos termos polipéptidos e péptidos.
Quando acoplado a um veículo por meio de um ligante, para formar aquilo que é conhecido na especialidade por conjugado veículo- hapten , um polipéptido do presente invento é capaz de ind_u zir anticorpos que imunorreagem com uma proteína latente do vírus do papiloma quando essa proteína está presente numa amostra que contém uma infecção latente provocada pelo vírus do papiloma. As imunoreacções representativas entre uma proteína latente do vírus do papiloma e anticorpos que foram induzidos utilizando polipépt_i dos do presente invento, são descritas no Exemplo 5.
Em face do princípio bem estabelecido da reactividade imu nolégica em cruzado, o presente invento contempla portanto variari tes, antigenicamente relacionadas, dos polipéptidos do presente invento. Uma variante antigénicamente relacionada é um polipéptido que inclui uma porção de uma sequência com, pelo menos, seis resíduos de aminoácidos de uma proteína latente do vírus do papiloma e que é capaz de induzir moléculas de anticorpos que imunorreagem com uma proteína latente do vírus do papiloma quando essa proteína se encontra presente numa amostra que contém uma i_n fecção latente provocada pelo vírus do papiloma.
Um polipéptido do presente invento pode ser sintetizado por qualquer uma das técnicas conhecidas dos entendidos na especialidade dos polipéptidos, incluindo técnicas de ADN recombinante. As técnicas de síntese química, como a síntese em fase sólida do tipo Merrifield, são preferidas por razões de pureza, especif_i cidade antigénica, isenção de produtos secundários não desejados, facilidade de produção e semelhantes. Um excelente resumo das d_i versas técnicas disponíveis, pode ser encontrado em 3. M. Steuard e 3. D. Yound, Solid Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, 1969; M. Bodanszky, e al., Peptide Synthesis, Qohn Wiley ά Sons, Second Edition, 1979 and 3. Meienhofer, Hormo nal Proteins and Peptides, Vol. 2, p. 46, Academic Press (Neiu York), 1983 para síntese de péptidos em fase sólida e E. Schroder e K. Kubke, The Peptides, Vol. 1, Academic Press (Neuj York),
1965 para síntese clássica em solução, textos estes que são aqui
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-20incorpora dos como referência. Os grupos protectores adequados utilizáveis nestas sínteses são descritos nos textos acima e em O.F.W. McOmie, Protective Groups in Organic Chemistry, Plenum Press, Netu York, 1973, que é aqui incorporado como referência.
Os polipéptidos preferidos do presente invento são deduzj. dos a partir da sequência de nucleótidos das ELAs El, E2 ou E6 dos vírus do papiloma, preferivelmente VPH.
Mais preferivelmente, os polipéptidos do presente invento são deduzidos a partir da sequência de nucleótidos de VPH específicos conhecidos por causarem infecçães genitais provocadas pelo vírus do papiloma, incluindo os VPH tipos 6, 11, 16, 18, 33, 35, e semelhantes.
1. Polipéptidos relacionados com o VPH tipo 16
Um polipéptido relacionado com o VPH tipo 16 de acordo com o presente invento, contém pelo menos 5, preferivelmente pelo menos 12, resíduos de aminoácidos e inclui uma sequência que corresponde a porçães da sequência de resíduos de aminoácidos, deduzida a partir das ELAs El, E2 ou E6 do VPH tipo 16, como apresentado na Figura 1.
Preferivelmente, os polipéptidos relacionados com o VPH tipo 16 do presente invento, não contêm a sequência de resíduos de aminoácidos WRQRDQFLSQV.
Os polipéptidos preferidos do presente invento incluem aqueles cujas sequências de resíduos de aminoácidos são apresenta das na Tabela 1.
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-21Tabela 1
Polipéptidos do vírus do papiloma humano | ||
Sequência ELA1 | Designação do polipéptido | Resíduo de aminoácido |
Ela | 235 | MADPAGTNGEEGTGC |
EI | 2 36 | HEDEDKENDGDSLPTC |
EI | 238 | RPFKSNKSTCC |
EI | 246 | CCDWCIAAFGLTPSI |
E2 | 2 37 | TYDSEWQRDQFLSQVKIPC |
E2 | 245 | ΗΚΞA IVTLTYDSEWQRDQC |
E6 | 247 | CINCQKPLCPEEKQRH |
4 A nomenclatura das estruturas de leitura aberta (ELA) corresponde às ELAs apresentadas na Figura 1, a partir das quais foi derivada a sequência de aminoácidos do polipéptido.
Um polipéptido preferido, relacionado com o VPH tipo 16, contém uma sequência de resíduos de aminoácidos que corresponde a uma porção da sequência de aminoácidos deduzida a partir da ELA E2 de VPH tipo 16 e inclui uma sequência de resíduos de aminoácidos representada pela fórmula -TYDSE-. Preferivelmente, a sequêri cia incluída é representada pela fórmula -LTYDSE-.
Mais preferivelmente, um polipéptido relacionado com VPH tipo 16 de acordo com o presente invento, é definido pela sequência de resíduos de aminoácidos representada pela fórmula:
-BYDSB;
em que B é pelo menos uma das seguintes sequências de resíduos de aminoácidos:
-SAIVTLP, SAIVTLT, AIVTLT, IVTLT,
VTLT,
TLT,
LT, ou T; e
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-22erc que B' é pelo menos uma das seguintes sequências de resíduos de aminoácidos:
E-, ou
E.
Um polipéptido mais preferido, relacionado com VPH tipo 16, de acordo com o presente invento inclui uma sequência de res^ duos de aminoácidos representada pela fórmula
-SAIVTLTDYSE- ou -HK5AIVTLTDYSE-.
Ainda mais preferido á um polipáptido relacionado com VPH tipo 16 definido pela sequência de resíduos de aminoácidos representada pela fórmula:
-BKSAIVTLTYDSB;
em que B ê pelo menos uma das seguintes sequências de resíduos de aminoácidos:
SSTWHWTGHNVKH,
STWHWTGHNVKH,
TWHWTGHNVKH,
WHWTGHNVKH,
HWTGHNVKH,
WTGHNVKH,
TGHNVKH,
GHNVKH,
HNVKH,
NVKH,
VKH,
KH, ou
H ; e em que B' é pelo menos uma das seguintes sequências de resíduos de aminoácidos:
EWORDQ,
EWQRD,
EWQR ,
EWQ,
EW, e E.
-2369 303
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Numa concretização relacionada, um polipéptido relacionado com VPH tipo 16 contêm uma sequência de resíduos de aminoácidos que corresponde a uma porção da sequência de aminoácidos ded_u zida a partir da ELA E2 de VPH tipo 16 e inclui pelo menos uma das seguintes sequências de resíduos de aminoácidos:
-HKSAIV-,
-SAIVTL-, e
-IVTLTD-.
Os polipéptidos relacionados com VPH tipo 16 preferidos não contêm mais de cerca de 30 resíduos de aminoácidos, possuem como parte da sua sequência de resíduos de aminoácidos pelo menos uma das seguintes sequências:
-IVTLTD-,
-SAIVTL-,
-HKSAIV-,
-HKSAIVTLTDYSE-,
-SAIVTLTDYSE-,
-LTDYSE-, e
-TDYSE-; e são homólogos, preferivelmente sem inserção ou eliminação e mais preferivelmente são idênticos a uma porção da sequência do VPH ti po 16 representada pela fórmula:
-SSTWHWTGHNVKHKSAIVTLTYDSEWQRDQ.
Os polipéptidos específicos relacionados com o VPH tipo 16 preferidos incluem aqueles cujas sequências de resíduos de ami ácidos são apresentadas na Tabela 2:
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-24Tabela 2
Designação do polipéptido | Sequência de resíduos de aminoá |
66 | SSTWHWTGHNVKHKSAIVTLTYD |
71 | HKSAIVTLTYDSEWQRDC |
72 | HKSAIVTLTYDSEWQRC |
73 | HKSAIVTLTYDSEWQC |
74 | HKSAIVTLTYDSEWC |
75 | HKSAIVTLTYDSEC |
76 | HKSAIVTLTYDSC |
77 | HKSAIVTLTYDC |
78 | HKSAIVTLTYC |
79 | KSAIVTLTYDSEWQRDQC |
80 | SAIVTLTYDSEWQRDQC |
81 | A IVTLTYDSEWQRDQC |
82 | IVTLTYDSEWQRDQC |
83 | VTLTYDSEWQRDQC |
84 | TLTYDSEWQRDQC |
85 | LTYDSEWQRDQC |
Outro polipéptido preferido relacionado com o VPH tipo 16, de acordo com o presente invento, é um polipéptido compreendendo não mais de 50 resíduos de aminoácidos e incluindo uma sequência de resíduos de aminoácidos representada pela fórmula:
XZX ’ , em que Z é uma sequência de resíduos de aminoácidos contendo pelo menos 5 resíduos de aminoácidos possuindo uma sequência correspon dente a uma porção da sequência representada pela fórmula:
HKSAIVTLTYDSE, em que X é hidrogénio ou pelo menos um resíduo de aminoácido e em que X' é hidroxilo ou pelo menos um resíduo de aminoácido, sendo o referido polipéptido capaz de imunorreagir com anticorpos anti-proteína latente do vírus do papiloma.
Outro polipéptido preferido relacionado com VPH tipo 16 é
303
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-25um polipéptido contendo não mais de 50 resíduos de aminoácidos e incluindo uma sequência de residuos de aminoácidos com a fórmula:
XTYDSEX ' , em que X é hidrogénio ou pelo menos um ou mais resíduos de aminoácidos e em que X' é hidroxilo ou pelo menos um residuo de aminoácido, desde que X' não inclua a sequência de resíduos de aminoácidos WQRDQFLSQV. Numa concretização, X' é uma sequência de resíduos de aminoácidos representada por uma fórmula seleccionada entre o grupo constituído por:
W,
WQ,
WQR ,
WQRD, e WQRDQ.
Numa concretização preferida, X’ é uma sequência de resíduos de aminoácidos representada por uma fórmula seleccionada entre o gru po constituído por:
WQRDQE, e WQRDQFL.
Noutra concretização preferida, X' é uma sequência de residuos de aminoácidos representada por uma fórmula seleccionada entre o gru po constituído por:
WQRDQFLS, e WQRDQFLSQ.
Ainda outra forma de definir um polipéptido preferido relacionado com VPH tipo 16 é como um polipéptido compreendendo não mais de cerca de 50 resíduos de aminoácidos e incluindo pelo menos uma das seguintes sequências de residuos de aminoácidos:
-TDYSE-,
-LTDYSE-,
-SAIVTLTDTSE-,
-HK5AIVTLTDYSE-,
-HKSAIV-,
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-26-SAIUTL-, e -IUTLTD-; e em que o referido polipéptido não contém a sequência de resíduos de aminoácidos WRQRDQFLSQU.
2. Polipéptidos relacionados com UPH tipo 6
Um polipéptido relacionado com UPH tipo 6, de acordo com o presente invento, contém uma sequência de resíduos de aminoácidos que corresponde a uma porção da sequência de resíduos de aminoácidos deduzida a partir da FLA F2 de UPH tipo 6 e inclui uma sequência de resíduos de aminoácidos representada pela fórmula -HAIUTUTYDSF-.
Um polipéptido preferido, relacionado com UPH tipo 6, po.s sui uma sequência de resíduos de aminoácidos representada pela fórmula HKHAIUTUTYDSFFQRQOC.
3. Polipéptidos relacionados com UPH tipo 11
Um polipéptido relacionado com UPH tipo 11, de acordo com o presente invento, contém uma sequência de resíduos de aminoácidos que corresponde a uma porção da sequência de aminoácidos ded_u zida a partir da ELA E2 de UPH tipo 11 e inclui uma sequência de resíduos de aminoácidos representada pela fórmula -NAIUTLTYSSF-.
Um polipéptido preferido, relacionado com UPH tipo 11, possui uma sequência de resíduos de aminoácidos representada pela fórmula HKNAIUTLTYSSFEQRQQC.
4. Polipéptidos relacionados com UPH tipo 18
Um polipéptido relacionado com UPH tipo 18, de acordo com o presente invento, contém uma sequência de resíduos de aminoácidos que corresponde a uma porção da sequência de resíduos de aminoácidos deduzida a partir de FLA F2 de UPH tipo 18 e inclui uma sequência de resíduos de aminoácidos representada pela fórmula -ILTUT- e, mais preferivelmente, inclui uma sequência representada pela fórmula -TGTLTUTYHSF-.
Um polipéptido preferido, relacionado com UPH tipo 18, possui uma sequência de resíduos de aminoácidos representada por
303
EPG:11-SCRE 155.1
-27uma fórmula seleccionada do gruoo constituído por:
EKTGILTUTYHSETORTKC, e IMEKTGILTVTYHSETQRTKC.
5. Polipóptidos relacionados com VPH tipo 33
Um polipéptido relacionado com VPH tipo 33, de acordo com o presente invento, contém uma sequência de resíduos de aminoácidos que corresponde a uma porção da sequência de resíduos de aminoácidos deduzida a partir da ELA E2 de VPH tipo 33 e inclui uma sequência de resíduos de aminoácidos representada pela fórmula -NGIVTVTFVTE-.
Um polipéptido preferido, relacionado com VPH tipo 33, possui uma sequência de aminoácidos representada pela fórmula SKNGIVTVTFVTEQQQQMC.
□s polipéptidos preferidos relacionados com VPH, deduzidos a partir das ELA E2 de VPH tipos 6, 11, 18 e 33 são apresenk dos na Tabela 3.
Tabela 3
Designação do polipéptido
VPH
Tipo Sequência de resíduos de aminoácidos
K70 | 6 | HKHAIVTVTYOSEEQRQQC |
K71 | 11 | ΗΚΝΑIVTLTYSSEEQRQQC |
K69 | 18 | EKTGILTVTYHSETQRTRC |
«68 | 18 | NEKTGILTVTYHSETQRTRC |
K72 | 33 | SKNGIVTVTFVTEQQQQMC |
presente invento contempla também uma composição contendo um polipéptido do presente invento misturado num diluente fisiologicamente tolerável. Essas composições contêm tipicamente o polipéptido numa concentração compreendida no intervalo entre micromolar e molar, preferivelmente milimolar.
Adicionalmente, o presente invento contempla proteínas de fusão e composições derivadas, compreendendo um polipéptido do presente invento operativamante ligado (fundido) a pelo menos uma
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-28sequência de resíduos de aminoácidos, sendo a referida sequência heteróloga a uma sequência deduzida a partir de uma ELA da prote_í na latente do vírus do papiloma.
D. Inóculos
Noutra concretização, um polipéptido do presente invento, uma sua variante antigenicamente relacionada ou uma proteína latente do vírus do papiloma substancialmente pura, de acordo com o presente invento, é utilizado numa composição diluente aquosa, farmaceuticamente aceitável, para formar um inóculo que, quando administrado numa quantidade eficaz, é capaz de induzir anticorpos que imunoreagem com a proteína latente do vírus do papiloma.
A palavra inóculo nas suas diversas formas gramaticais é aqui utilizada para descrever uma composição contendo um polipéptido ou uma proteína latente do vírus do papiloma substancialmente pura, de acordo com o inventa, como ingrediente activo utilizado para a preparação de anticorpos contra uma proteína latente do vírus do papiloma.
Quando se utiliza um polipéptido para induzir anticorpos deverá entender-se que esse polipéptido pode ser utilizado sozinho ou ligado a um veículo na forma de um conjugado ou ainda como um polímero de polipéptido, mas, para facilidade de expressão, as várias concretizaçães dos polipéptidos do presente invento serão colectivamente referidas pelo termo polipéptido e suas diversas formas gramaticais.
Para um polipéptido que contenha menos de cerca de 35 resíduos de aminoácidos é preferível utilizar o péptido ligado a um veículo para induzir a produção de anticorpos, como anteriormente mencionado.
Como mencionado anteriormente, um ou mais resíduos de ami. noácidos adicionais podem ser adicionados ao ter minal amino ou carboxilo do polipéptido para auxiliar a ligação do polipéptido a um veiculo. Os resíduos de cisteína adicionados ao terminal amino ou carboxilo do polipéptido demonstraram ser particularmente úteis para formar conjugados por meio de ligaçães dissulfureto.
No entanto, outros métodos, bem conhecidos na especialidade para
303
EPG:11-SCRF 155.1 a preparação de conjugados, poderão também ser utilizados. Os processos adicionais de ligação incluem, por exemplo, a utilização dos produtos da reacção de adição de Michael, di-aldeídos como o glutaraldeído, Klipstein et al., 0. Infect. Dis., 147, 318-316 (1983) e semelhantes, ou a utilização da tecnologia de carbodiind das, como a utilização de uma carbodiimida solúvel em água para formar ligações amida ao veículo. Para uma revisão da conjugação ou acoplamento de proteínas por meio de grupos funcionais activados, veja-se Aurameas et al., Scand. 0. Immunol., l/ol. 8, Sup. 1 7, 7-23 (1978).
Os veículos úteis são bem conhecidos na especialidade e são, geralmente, proteínas. Exemplos desses veículos são a hemocianina de lapa do género Fissurella (HL), edestina, tiroglobulina, albuminas como a albumina de soro bovino (ASB) ou a albumina de soro humano (ASH), eritrécitos tais como eritrócitos de ovelha (EO), toxina do tétano, toxina da cólera, bem como ácidos poliami. nados tais como poli (ácido 0-lisina: D-glutSmico) e semelhantes.
A escolha do veículo depende principalmente da utilização final do inóculo e baseia-se em critérios que não estão particularmente envolvidos no âmbito do presente invento. Por exemplo, deverá seleccionar-se um veículo que não dê origem a uma reacção indesejada no animal particular a ser inoculado.
inóculo do presente invento contém uma quantidade eficaz e imunogénica de um polipéptido ou proteína latente do vírus do papiloma de acordo com o presente invento e para um polipéptido, o referido inóculo encontra-se geralmente na forma de um conjugado ligado a um veículo. A quantidade eficaz do polipéptido ou proteína, por unidade de dosagem, depende, entre outros factores, da espécie do animal inoculado, do peso do corpo do animal e do regime de inoculação escolhido, como é bem conhecido na espec.i alidade. Os inóculos contêm tipicamente concentrações de polipépti do ou proteína entre cerca de 10 micrograma e cerca de 500 miligrama por inoculação (dose) e preferivelmente cerca de 50 microgra ma a cerca de 50 miligrama por dose.
termo unidade de dosagem refere-se, no que se relacijq na com os inóculos do presente invento, a unidades fisicamente
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EPG:11-SCRE 155.1 /s
-30discretas, adequadas cama dosagens unitárias para animais, conten do cada unidade uma quantidade predeterminada de ingrediente act_i vo, calculada para produzir o efeito imunogénico desejado, em associação com o diluente requerido; isto é, veículo. As especifi cações para a nova unidade de dosagem de um inóculo do presente invento, são ditadas e dependem directamente (a) das caracteristicas únicas do ingrediente activo e do efeito imunológico particular a alcançar e (b) das limitações inerentes à especialidade de formulação desses ingredientes activos para uso imunológico em animais, como descrito aqui em detalhe, sendo estas especificações uma característica do presente invento.
Os inóculos são tipicamente preparados a partir do conjugado do polipéptido sólido e seco por dispersão do conjugado do polipéptido num diluente ou veículo fisiologicamente tolerável (aceitável), como água, solução salina ou solução salina tamponada com fosfato, para formar uma composição aquosa. Da mesma forma, os inóculos contendo proteína latente do virus do papiloma são tipicamente preparados a partir de uma proteína latente do v_í rus do papiloma substancialmente pura, por dispersão nos mesmos diluentes fisiologicamente toleráveis. Esses diluentes são bem conhecidos na especialidade e são discutidos, por exemplo, em Reminqton^ Pharmaceutical Sciences, 16§ Edição, Mack Publishing Company, Easton, PA (l9S0) nas páginas 1465-1467.
Os inóculos podem também incluir um adjuvante como parte do diluente. Os adjuvantes como o adjuvante completo de Ereund (ACE), o adjuvante incompleto de Ereund (ΑΙΓ) e sulfato de alumínio são materiais bem conhecidos na especialidade e encontram-se comercialmente disponíveis em diversas fontes.
E. Anticorpos e anticorpos anti-polipéptidos termo anticorpo nas suas diversas formas gramaticais é utilizado no presente invento para se referir a uma composição contendo uma população de moléculas de imunoglobulina e/ou porções imunologicamente activas de moléculas de imunoglobulina, isto é, a moléculas que contêm um local de combinação de anticorpos ou paratopo.
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EPG:11-SCRF 155.1
-31Um local de combinação de anticorpos é a porção estrutu ral de uma molécula de anticorpo constituída por regiões de cadei_ as pesadas e leves variadas e hipervariadas, que se liga especifj. camente à (imunorreage com) antigénios.
A frase molécula de anticorpo nas suas várias formas gramaticais, tal como aqui utilizada, contempla tanto uma molécula de imunoglobulina intacta como uma porção imunologicamente activa de uma molécula de imunoglobulina.
As moléculas de anticorpo exemplares são as moléculas intactas de imunoglobulina, as moléculas de imunoglobulina substancialmente intactas e as porções de uma molécula de imunoglobulina que contêm o paratopo, incluindo as porções conhecidas na especia^ lidade como Fab, Fab', Ffab'^ B F(v).
As porções Fab e FÍab'^ dos anticorpos são preparadas p_e la reacção proteolítica de papaína e pepsina, respectivamente, em anticorpos substancialmente intactos, por métodos bem conhecidos. Veja-se por exemplo a Patente U.S. N9. 4 342 566 de Theofilopolous e Dixon. As porções de anticorpo Fab' são também bem conhecidas e são produzidas a partir das porções FÍab')^ seguida da redução das ligações dissulfureto que ligam as duas porções de cadeia pesada, como com mercaptoetanol e seguida da alquilação da proteína resultante, mercaptano, com um reagente como a iodoacetamida. Os anticorpos que contêm moléculas de anticorpo intactas são preferi^ dos e são utilizados como ilustrativos no presente invento.
termo imunorreage nas suas várias formas significa a ligação entre uma molécula contendo um determinante antigénico e uma molécula contendo um local de combinação de anticorpos, tal como uma molécula intacta de anticorpo ou uma sua porção.
Uma imunorreacção forma um produto de imunorreacção que contém um local de combinação de anticorpos e o determinante anti génico ligado. Uma imunorreacção é substancial se a ligação resultar na produção de uma quantidade de produto de imunorreacção que seja mensurável por métodos como ELISA, imunomanchas, imunocoloração ou semelhantes, como descrito no presente invento.
Determinante antigénico refere-se a uma porção estrutural
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EPG:11-SCRE 155.1
-32do antigénio que está imunologicamente ligada por um local de com binação de anticorpos. Este termo é também utilizado com epitopo.
Um anticorpo de acordo com o presente invento é caracter^i zado por conter moléculas de anticorpos, substancialmente puras ou substancialmente isoladas, que imunorreagem com uma das seguin tes proteínas latentes do vírus do papiloma:
a) | proteína difusa | de 112 kd; |
b) | proteína filamentosa de 54 kd; | |
c) | proteína filamentosa de 48 kd; | |
d) | proteína nuclear | de 51 kd; |
e) | proteína nuclear | de 58 kd; |
f) | proteína nuclear | de 26 kd; ou |
g) | proteína nuclear | de 48 kd. |
Por substancialmente isolada significa-se que pelo menos 10%, preferivelmente pelo menos 25% e mais preferivelmente pelo me nos cerca de 50% das moléculas de anticorpo presentes no anticorpo são dirigidas contra uma proteína latente do vírus do papiloma ou contra um polipéptido relacionada com o vírus do papiloma.
Por substancialmente pura significa-se que pelo menos 1% preferivelmente pelo menos 10% e mais preferivelmente pelo menos 50% da proteína presente no anticorpo são moléculas de proteína que formam locais de combinação de anticorpos.
Em concretizações preferidas, um anticorpo contemplado não imunorreage com:
a) | uma | p roteína | de | 70 | kd | presente | em | células | HeL a, |
b) | uma | proteína | de | 20 | kd | presente | em | célula | CaSki, |
c) | uma | proteína | de | 15 | kd | presente | em | células | CaS ki, |
d) | uma | proteína | de | 11 | kd | presente | e m | células | CaSki, |
e) | uma | proteína | de | 10 | kd | presente | em | células | CaSki. |
Noutra concretização, o presente invento contempla um anticorpo anti-polipéptido contendo moléculas de anticorpos que imu norreagem com (l) um polipéptido e preferivelmente com apenas um polipéptido, do presente invento e (2) com pelo menos uma das pro
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EPG:11-SCRF 155.1
-33telnas latentes da vírus da papiloma, seleccionada do grupo cons-
tituído por: | |||
a) | proteína | difusa de 112 kd; | |
b) | proteína | filamentosa de 54 | kd; |
c) | proteína | filamentosa de 48 | kd; |
d) | proteína | nuclear de 51 kd; | e |
e) | proteína | nuclear de 58 kd. | |
Nas | concretizações preferidas, | um anticorpo anti-polipépt_i |
do contemplado não imunoreage substancialmente com:
a) | uma | proteína | de | 70 | kd | presente | em | células | HeLa, |
b) | uma | proteína | de | 20 | kd | presente | e m | células | CaSki, |
c) | uma | proteína | de | 15 | kd | presente | em | células | CaSki, |
d) | uma | proteína | de | 11 | kd | presente | em | células | CaSki, |
e) | uma | proteína | de | 10 | kd | presente | em | células | CaSki. |
□ | tipo | de anticorpo | mais | preferido | é i | jm anticorpo policljo | |||
nal anti-polipéptido em i | gue | as | moléculas de | anticorpo | imunoreagem |
com um polipáptido, preferivelmente com apenas um dos polipéptidos, seleccionado do grupo constituído por:
MADPAGTNGEEGTGC,
HEDEDKENDGDSLPTC,
RPFKSNKSTCC,
CCDWCIAAFGLTPSI,
TYDSEWQRDQFLSQVKIPC,
HKSA IVTLTYDSEWQRDQC, e CINCQKPLCPEEKQRH.
Ainda mais preferidos são os anticorpos anti-polipéptido preparados por imunização de um mamífero não humano, como uma cabra, um cavalo, um coelho ou semelhantes. Ds anticorpos anti-polipéptido exemplares são os preparados em coelhos, designados aqui como anti-235, anti-236, anti-237, anti-238, anti-245, anti-246 e anti-247.
Um anticorpo do presente invento é tipicamente produzido imunizando um mamífero com um inóculo do presente invento, induzindo assim no mamífero moléculas de anticorpos possuindo a imuno especificidade para polipéptidos apropriada. As moléculas de an69 303
EPG:11-SCRF 155.1
-34ticorpos são então recolhidas do mamífero e isoladas ou purificadas na extensão desejada por técnicas bem conhecidas como, por exemplo, cromatografia de imunoafinidade. As composiçães isoladas contendo moléculas de anticorpos são então avaliadas reiativja mente à sua capacidade de imunoreagir de acordo com a .imunoespeci. ficidade descrita e as composiçães assim preparadas, possuindo a imunoespecificidade apropriada, são retidas como composiçães de anticorpos de acordo com o presente invento. 0 anticorpo assim produzido pode ser usado, inter alia, nos métodos e sistemas de diagnóstico do presente invento para testar a presença de proteínas latentes do vírus do papiloma numa amostra de sangue.
□s anticorpos do presente invento, induzidos por um polipéptido do presente invento, podem ser descritos como sendo oligo. clonais em comparação com os anticorpos policlonais de ocorrência natural, uma vez que são originados para um imunogene (o polipépti. do relativamente pequeno) possuindo relativamente poucos epitopos em comparação com os epitopos mimetizados por uma proteína intacta codificada para o vírus do papiloma, associada à latência virai. Consequentemente, as moléculas de anticorpos de acordo com o presente invento, ligam-se a anticorpos do polipéptido enquanto que os anticorpos de ocorrência natural, originados para proteínas la^ tentes do vírus do papiloma, se ligam a epitopos através dessas moléculas de proteínas e são aqui referidos como sendo policlonais.
Noutra concretização, um anticorpo de acordo com o preserj te invento, é caracterizado como contendo moléculas de anticorpos substancialmente isoladas que imunoreagem com um polipéptido rela, cionado com a proteína latente do vírus do papiloma, isto é, com um polipéptido deduzido a partir de uma ELA de uma proteína lateja te, preferivelmente Ei, E2 ou E6. Mais preferidas são as moléculas de anticorpos substancialmente isoladas, que imunoreagem com um polipéptido possuindo a fórmula:
SSTWHWTGHNVKHKSA IVTLTYD5EWQRDC,
EKTGILTVTYHSETORTRC,
HKHAIVTVTYOSEEQRQQC,
HKNAIVTLTYSSEEQRQQC, ou 5KNGIVTVTFVTEQQQQMC.
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EPG:11-SCRF 155.1
-35Estes anticorpos são tipicamente produzidos por cromatografia de imunoaf inidade, usando polipéptidos imobilizados, rela, cionados com a proteína latente do vírus do papiloma, a partir de soro contendo anticorpos anti-proteína latente do vírus do papil_o ma, tal como é encontrado num paciente possuindo uma infecção latente provocada pelo vírus do papiloma. Os anticorpos preferidos nesta concretização são anticorpos humanos, isolados do soro de pacientes possuindo uma infecção latente provocada pelo vírus do papiloma, preferivelmente uma infecção provocada por um vírus do papiloma humano do tipo 16, 18, 6, 11 ou 33, ou semelhantes. Pa_r ticularmente preferidos são os anticorpos preparados no Exemplo 15.
F. ComposiçSes de anticorpos monoclonais
Um anticorpo monoclonal que contém moléculas de anticorpos que imunoreagem com a proteína latente do vírus do papiloma é tajm bém contemplado no presente invento, A frase anticorpo monoclonal nas suas várias formas gramaticais, refere-se a uma população de moléculas de anticorpos que contém apenas uma espécie de locais de combinação de anticorpos capaz de imunoreagir com um a_n tigénio particular. Uma composição de anticorpos monoclonais apre senta assim uma afinidade de ligação única para qualquer antigénio com o qual imunoreaja. Um anticorpo monoclonal contém portanto uma molécula de anticorpo possuindo uma pluralidade de locais de combinação de anticorpos, cada um deles específico para um antig_é nio diferente, por exemplo, um anticorpo monoclonal bi-específico.
Uma composição de anticorpos monoclonais é tipicamente composta por anticorpos produzidos por clones de uma única célula denominada hibridoma, que segrega (produz) apenas um tipo de molé cuia de anticorpo. A célula de hibridoma é formada fundindo uma célula produtora de anticorpos e um mieioma ou outra linha celular auto-replicativa. Esses anticorpos foram primeiro descritos por Kohler and Milstein, Nature, 256:495-497 (1975), cuja descrição é aqui incorporada como referência.
Numa concretização, a composição de anticorpos monoclonais de acordo com o invento é caracterizada por conter moléculas de anticorpo que imunoreagem com uma das seguintes proteínas laten
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EPG:11-SCRF 155.1
-36tes do virus do papiloma:
a) | proteína difusa de 112 kd, |
b) | proteína filamentosa de 54 kd |
c) | proteína filamentosa de 48 kd |
d) | proteína nuclear de 51 kd, |
e) | proteína nuclear de 58 kd, |
f) | proteína nuclear de 26 kd, ou |
g) | proteína nuclear de 48 kd. |
Preferivelmente, um anticorpo monoclonal de acordo com o presente invento não imunoreage substancialmente com:
a) | uma | proteína | de | 70 | kd | presente | em | células | HeLa, |
b) | uma | proteína | de | 20 | kd | presente | em | células | CaS ki, |
c) | uma | proteína | de | 15 | kd | presente | e m | células | CaS ki, |
d) | uma | proteína | de | 11 | kd | presente | e m | células | CaS ki, |
e) | uma | proteína | de | 10 | kd | presente | em | células | CaS ki. |
Noutra concretização, o presente invento contempla um anticorpo monoclonal anti-polipéptido contendo moléculas de antico_r po que imunoreagem com um polipéptido do presente invento e com uma proteína latente do vírus do papiloma. Preferivelmente, um anticorpo monoclonal anti-polipéptido não imunoreage substancialmente com:
a) | uma | proteína | de | 7Q | kd | presente | em | células | HeLa, |
b) | uma | proteína | de | 20 | kd | presente | em | células | CaS ki, |
c) | uma | proteína | de | 15 | kd | presente | e m | células | CaS ki, |
d) | uma | proteína | de | 11 | kd | presente | em | células | C aS k i , |
e) | uma | p roteína | de | 10 | kd | presente | em | células | CaS ki. |
Nas concretizações preferidas, um anticorpo monoclonal imunoreage com um polipéptido cuja sequência de resíduos de amino ácidos corresponde a um polipéptido apresentado na Tabela 1, 2 ou 3. Um anticorpo monoclonal particularmente preferido contém molé cuias de anticorpo capazes de ser produzidas por um hibridoma apresentado na Tabela 4.
303
EPG:11-5CRF 155.1 ν''.·/ '
-37- Tabela 4 Hibridomas que produzem anticorpos monoclonais | ||
Designação do | Designação | |
ELA1 2 | 2 □olipéptido | hibridoma |
EI | 235 | 235: B9 |
EI | 238 | 238:BE9 |
E2 | 245 | 245:11E3 |
E6 | 247 | 247:4D11 |
E6 | 247 | 247:10F7 |
E6 | 247 | 247:11011 |
1 A nomenclatura das estruturas de leitura aberta (ELA) correspon de às ELA apresentadas na Figura 1, a partir das quais foi deri vada a sequência de aminoácidos.
Os polipéptidos possuem sequências de aminoácidos como apresentado na Tabela 1.
Os anticorpos monoclonais preferidos, produtores de hibri domas designados por 235:B9, 245:11E3 e 247:4D11 foram registados como culturas de hibridomas na American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD, em 12 de Maio de 19B8 tendo-lhes sido atr_i buídos os números de acesso HB 9720, HB 9718 e HB 9719, respectivamente.
Noutra concretização, o presente invento contempla um anticorpo monoclonal anti-polipéptido contendo moléculas de anticor po que imunoreagem com um polipéptido possuindo a fórmula:
SSTWHWTGHNVKHKSAIVTLTYDSEWORDC,
EKTG1LTVTYHSETQRTRC,
HKHAIVTVTYOSEEQRQQC,
HKNAIVTLTYSSEEQRQQC, ou
SKNGIVTVTFVTEQQQQMC.
Um anticorpo monoclonal de acordo com o presente invento pode ser produzido iniciando uma cultura de hibridomas monoclonais
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EPG:11-SCRF 155.1
-38compresndendo um meio nutriente contendo um hibridoma do presente invento que segrega moléculas ds anticorpos com a imunoespecific_i dade adequada. A cultura ê mantida sob condições adequadas duran te um período de tempo suficiente para que o hibridoma segregue as moléculas de anticorpos para o meio. 0 meio contendo anticorpos é então recolhido. As moléculas de anticorpos podem então ser isoladas por técnicas bem conhecidas.
Para produzir uma concentração muito maior de anticorpos monoclonais, ligeiramente mais impuros, o hibridoma desejado pode ser injectado em ratos, preferivelmente singénicos ou semisingéni cos. 0 hibridoma provocará a formação de tumores produtores de anticorpos, após um período de incubação adequado, que resultarão numa elevada concentração do anticorpo desejado (cerca de 5-20 mg/ml) na corrente sanguínea e exsudado peritoneal (ascites) do rato hospedeiro.
Os meios úteis para a preparação destas composições são bem conhecidos na especialidade e encontram-se comercialmente dis poníveis e incluem meios de cultura sintáticos, ratos congénitos e semelhantes. Um meio sintético exemplar é o meio mínimo essencial de Dulbecco /”DMEM; Dulbecco et al. , Virol. 9:396 (l959)_J/ suplementado com 4,5 g/l de glucose, 20 mm de glutamina e 20/ de soro bovino fetal. Uma espécie exemplar de ratos congénitos é a Balb/c.
As composições de anticorpos monoclonais produzidas pelo método acima podem ser usadas, por exemplo, em sistemas de diagnós. tico e de imunopurificação nos quais é desejável a formação de um produto de imunoreacção contendo proteína latente do vírus do papiloma.
G. Hibridomas e outras células produtoras de anticorpos monoclonais e métodos para a sua preparação
Os hibridomas do presente invento são os que se caracterj. zam como possuindo a capacidade de produzir os anticorpos monocl.o nais do presente invento.
Os métodos para a produção de hibridomas que produzem (s_e gregam) moléculas de anticorpos possuindo uma imunoespecificidade
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EPG:11-5CRF 155.1
-39desejada, isto é, possuindo a capacidade de imunoreagir com uma proteína particular, um epitopo identificável numa proteína part_i cular e/ou um polipéptido, são bem conhecidos na especialidade. Particularmente adequada é a tecnologia de hibridomas descrita por Niman et al., Proc. Natl. Acad. 5ci. USA, 30:4949-4953 (1983) e por Galfre et al., Meth. Enzymol., 73:3-46 (l98l), descrições estas que são aqui incorporadas como referência.
Tipicamente, os hibridomas do presente invento são produzidos usando, nas técnicas acima, como imunogene uma proteína latente do vírus do papiloma ou um polipéptido do presente invento.
H. Sistemas de diagnóstico
Um sistema de diagnóstico em forma de estojo (kit), de acordo com o presente invento, inclui numa quantidade suficiente para pelo menos uma análise, uma proteína latente do vírus do papiloma substancialmente pura, polipéptido, anticorpo, anticorpo anti-polipéptido, anticorpo monoclonal ou anticorpo monoclonal anti-polipéptido de acordo com o presente invento, como um rsagsn te embalado separadamente. As instruções para uso do reagente em balado estão também tipicamente incluídas.
Tal como utilizado, o termo embalagem refere-se a uma na triz ou material sólido como vidro, plástico, papel, folha de alu. mínio ou semelhante capaz de suporter, dentro de limites fixados, um polipéptido, composição de anticorpos ou composição de antico_r pos monoclonais, de acordo com o presente invento. Assim, por exemplo, uma embalagem pode ser um frasco de vidro utilizado para conter quantidades da ordem do miligrama de um polipéptido contemplado ou pode ser uma placa com cavidades à qual foram operatj. vamente afixadas, isto é, ligadas quantidades da ordem do micrograma de um polipéptido contemplado de forma a este poder ser imu nologicamente ligado por um anticorpo.
As instrucções de uso incluem tipicamente uma expressão real descrevendo a concentração do reagente ou pelo menos um parâ metro do método de análise tal como as quantidades relativas de reagente e amostra a misturar, períodos de tempo de conservação para as misturas reagente/amostra, temperatura, condições tampão
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EPG:11-SCRF 155.1
-40e semelhantes.
Numa concretização, um sistema de diagnóstico para análise da presença de uma infecção latente provocada pelo vírus do p_a piloma numa amostra corporal compreende uma embalagem contendo um anticorpo do presente invento que imunoreage com uma proteína latente do vírus do papiloma. Preferivelmente, o anticorpo é um a_n ticorpo monoclonal do presente invento. Mais preferivelmente, as moléculas de anticorpos são as dos anticorpos produzidos por um hibridoma de acordo com o presente invento. Ainda mais preferidos são os estojos kits em que as moléculas de anticorpos estão ligadas a um marcador enzimático.
Assim, nas concretizações preferidas, um sistema de diagnóstico de acordo com o presente invento inclui ainda um marcador ou meios indicadores capazes de assinalar a formação de um complexo contendo uma molécula de anticorpo ou polipéptido do pre; sente invento.
□ termo complexo tal como utilizado rsfere-se ao produto de uma reacção de ligação específica tal como uma reacção anti. corpo-antigénio. Exemplos de complexos são os produtos de imunoreacçães.
Tal como aqui utilizados, os termos marcadores e meios indicadores nas suas diversas formas gramaticais, referem-se a átomos ou moléculas simples que estão directa ou indirectamente envolvidas na produção de um sinal detectável para indicar a presença de um complexo. Qualquer marcador ou meio indicador pode ser ligado ou incorporado numa proteína latente do vírus do papiloma substancialmente pura, polipéptido ou molécula de anticorpo que seja parte de uma composição de anticorpos ou anticorpos mono clonais de acordo com o presente invento, ou utilizado separadamente a esses átomos ou moléculas podem ser utilizados isolados ou em conjunção com reagentes adicionais. Esses marcadores são bem conhecidos em química de diagnóstico clínico e constituem uma parte do presente invento apenas no que se refere à sua utilização com os novos métodos e/ou sistemas de proteínas.
Qs meios de marcação podem ser constituídos por um agente
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EPG:11-SCRF 155.1 «c
S.'
-41marcador fluorescente que se liga quimicamente a anticorpos ou aja tigánios sem os desnaturar, para formar um fluorocromo (corante) o qual á um tracer imunofluorescente. Os agentes marcadores fluo rescentes adequados são fluorocromos como o isocianato de fluores. ceína (ICF), o isotiocianato de fluoresceina (ITCF), o cloreto de 5-dimetilamino-l-naftalenosulfonilo (CDAN5), o isotiocianato de tetr3metilrodamina (ITCTR), a lissamina, o cloreto de sulfonilo-rodamina 8200 (CS RD 8200) e semelhantes. Uma descrição das té_ç nicas de análise de imunofluorescência pode ser encontrada em DeLuca, Immunofluorescence Analysis, in Antibody As a Tool, Marchalonis, et al., eds., Oohn Wiley & Sons, Ltd., pg 189-231 (1982), que é aqui incorporado como referência.
Nas concretizações preferidas, o grupo indicador é um enzi ma como cocleária peroxidase (CP), fosfatase alcalina, glucose oxidase ou semelhante. Nos casos em que o grupo indicador pri nc_i pal ê umaenzima como CP ou glucose oxidase, são requeridos reageri tes adicionais para visualizar a formação de um complexo receptoj? -ligando (imunoreagente). Esses reagentes adicionais para CP incluem peróxido de hidrogénio e um precursor de um corante de oxidação como diaminobenzidina ou ortofenilenodiamina. Um reagente adicionai útil com a glucose oxidase ê o ácido 2,2'-azino-di-(3-etilbenzotiazolina-G-sulfónico) (ABTS).
0s elementos radioactivos são também agentes de marcação úteis. Um agente radiomarcadar exemplar é um elemento radioactivo que produza emissões de raios gama. Os elementos que emitem 124r 125γ 128T 132T 51r raios gama, como r, 1, 1, I e Lr representam uma classe de grupos indicadores de elementos radioactivos produtores 125 de emissões de raios gama. 0 I é particularmente preferido. Outro grupo de meios marcadores particularmente úteis é o constituído pelos elementos como ^^F, θ 1-^ qUe emj_tem positrões. 0s positrões emitidos produzem raios gama aquando de encontros com os electrões presentes no carpo dos animais. Também útil é um emissor beta, como ^^^índio ou H.
A ligação de marcadores, isto é, a marcação de polipéptidos e proteínas é bem conhecida na especialidade. Por exemplo,
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-42as moléculas de anticorpos produzidas por um hibridoma podem ser marcadas por incorporação metabólica de aminoácidos contendo radio, isótopos, proporcionados como um componente no meio de cultura. Veja-se por exemplo, Galfre et al., Meth. Enzymol., 73:3-46 (1931) As técnicas de conjugação ou acoplamento de proteínas através de grupos funcionais são particularmente aplicáveis. Veja-se por exemplo, Aurameas et al., Scand. 0. Immunol., Vol. 8 Supl. 7:7-23 (1978), Roduell et al., Biotech., 3:889-894 (1984) e a Patente U.S. N°. 4 493 795.
Os sistemas de diagnóstico podem também incluir, preferivelmente como embalagem separada, um agente ligante especifico.
Um agente ligante especifico é uma entidade molecular capaz de ligar selectivamente uma espécie de reagente do presente invento mas que não é ela própria uma proteína substancialmente pura, um polipéptido ou uma molécula de anticorpo do presente invento. Agentes ligantes específicos exemplares são as moléculas de anticorpos secundários, os complementos de proteínas ou fragmentos destas, a proteína A de 5. aureus e semelhantes. Preferivelmente, o agente ligante especifico pode ligar a molécula de anticorpo ou polipéptido do presente invento quando se encontra presente como parte de um complexo.
Em concretizações preferidas, o agente ligante específico é marcado. No entanto, quando o sistema de diagnóstico inclui um agente ligante específico que não seja marcado, o agente é tipic_a mente utilizado como meio ou reagente amplificador. Nestas concretizações, o agente ligante específico marcado é capaz de ligar especificamente o meio amplificador quando esse meio amplificador se encontra ligado a um complexo contendo espécies reagentes.
Os estojos de diagnóstico do presente invento podem ser utilizados num formato ELISA para detectar a presença ou quant_i dade de molécula de anticorpo que imunoreage com uma proteína latente do vírus do papiloma presente numa amostra de fluido orgáni. co como soro, plasma ou urina. ELI5A refere-se a uma análise imunosorbente de enzimas ligados que emprega um anticorpo ou ant_i génio ligado a uma fase sólida e um conjugado enzima-antigénio ou enzima-anticorpo para detectar e quantificar a quantidade de um
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-43antigénio ou anticorpo presente numa amostra. Uma descrição da técnica ELISA pode ser encontrada no Capítulo 22 da 4§ Edição de Basic and Clinicai Immunoloqy por D.P. Sites et al., publicada por Lange Medicai Publications of Los Altos, CA em 1932 e nas Patentes U.S. NS. 3 654 090; NS. 3 S50 752; e NS. 4 016 043 que são aqui incorporadas como referência.
Assim, nas concretizações preferidas a proteína substancialmente pura, polipéptido ou molécula de anticorpo do presente invento pode ser fixada a uma matriz sólida para formar um suporte sólido que é embalado separadamente nos sistemas de diagnóstico em questão.
reagente é tipicamente fixado à matriz sólida por adso_r ção a partir de um meio aquoso apesar de se poderem utilizar outros processos de fixação bem conhecidos na especialidade.
As matrizes sólidas úteis são bem conhecidas na especial_i dade. Esses materiais incluem o dextrano reticulado comercializei do sob a marca registada SEPHADEX da Pharmacia Fina Chemicals (Piscataiuay, N0); agarose; latex; esferas de poliestireno com cerca de 1 micron a cerca de 5 milimetros de diâmetro da Abbot L_a boratories of North Chicago, IL; cloreto de polivinilo, poliesti reno, poliacrilamida reticulada, tecidos à base de nitrocelulose ou nylon em forma de folhas, tiras ou pás; ou tubos, placas ou as cavidades de uma placa de microtítulo como as produzidas a pa_r tir de poliestireno ou cloreto de polivinilo.
As espécies reagentes, agente ligante específico marcado ou reagente amplificador de qualquer sistema de diagnóstico aqui descrito podem ser providenciados em solução, na forma de uma di_s persão líquida ou na forma de um pó s ubs ta ncial me nte seco, por exemplo em forma liofilizada. Quando os meios indicadores são constituídos por umaenzima, os substractos das enzimas podem também ser providenciados numa embalagem separada de um sistema. Um suporte sólido como a placa de microtítulo anteriormente descrita e um ou mais tampões podem também ser incluídos como elementos e_m balados separadamente neste sistema de análise de diagnóstico.
0s materiais de embalagem aqui discutidos em relação a sistemas de dignóstico são os vulgarmente utilizados em sistemas
303
FPG:11-3CRF 155.1
-44de diagnóstico. Esses materiais incluem garrafas e frascos de vi.
dro e plástico (por exemplo polietileno, polipropileno e policarbonato) e envelopes de plástico e de folha de plástico laminado e semelhantes.
Noutra concretização, um sistema de diagnóstico do presen te invento é útil para analisar a presença de anticorpos induzidos por uma infecção latente provocada pelo vírus do papiloma, is to é anticorpos anti-proteína latente do vírus do papiloma. Esse sistema compreende, em forma de estojo, uma embalagem contenda uma proteína latente do vírus do papiloma ou um polipéptido do presejn te invento. Preferivelmente, o polipéptido incluso contém uma se quência homóloga a uma porção de uma sequência deduzida de resíduos de aminoácidos derivada das estruturas de leitura aberta (FLA) da região F de um genoma sequenciado do vírus do papiloma. Mais pre. ferivelmente, o polipéptido incluso contém uma sequência deduzida a partir da FLA Fl, F2 ou E6 de um UPH.
Numa concretização prefere-se incluir num sistema de diagnóstico contemplado um polipéptido que esteja relacionado com um tipo particular de UPH, tal como é descrito aqui para os tipos 6, 11, 16, 18, 33 e 35. E particularmente preferido incluir um pol_i péptido do presente invento relacionado com UPH tipo 6, 11, 16, 18 ou 13, preferivelmente um cuja sequência seja uma das apresentadas anteriormente nas Tabelas 1, 2 ou 3.
Em face dos resultados discutidos nos Exemplos, torna-se evidente que um determinante antigénico significativo do vírus do papiloma humano que reage com anticorpos induzidos pela proteína latente do UPH tipo 16 é definido pela (contido em) sequência de resíduos de cinco aminoácidos -TYDSF- anteriormente descrita.
Além disso, apesar de cada um dos polipéptidos relacionados com o UPH tipo 16 do presente invento reagir com a maioria dos soros cojn tendo anticorposanti-proteína latente do UPH tipo 16, verificou-se que soros de pacientes individuais reagiram especificamente com um dos polipéptidos relacionados com UPH tipo 16 mas não com outro. Esta observação indica que existem determinantes antigénicos adicionais noutros péptidos contendo uma sequência que inclua a fórmula
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-45-LTYDSE-, -SAÍVTLTDYSE-, -HKSAIVTLTDYSE-, HK3AIV-, -SAIVTL-, ou -IVTLTD-, como anteriormente descrito.
Assim, c presente invento contempla ainda a descoberta de que o reconhecimento de anticorpos para as proteínas latentes do VPH tipo 16 em análises imunológicas é significativamente aumenta, do se os polipéptidos relacionados com VPH tipo 16, anteriormente descritos, forem utilizados em combinação com uma espécie difere_n te de polipéptido relacionado com VPH tipo 16. Uma concretização exemplar e preferida inclui em combinação os polipéptidos 66 e 245 ou 78 e Θ5, ou 66 e 78 e 85 e as combinações semelhantes.
Assim, numa concretização, um sistema de diagnóstico contém mais de uma espécie de polipéptidos do presente invento relacionada com VPH tipo 16. Preferivelmente, as espécies de polipéptidos estão presentes no sistema como uma mistura, apesar de as espécies individuais poderem estar presentes em embalagens separadas ou segregadas para locais separados no sistema. Este fo_r mato de combinação proporciona a capacidade de detectar um único estojo ou preferivelmente num único suporte sólido se misturados, anticorpos anti-proteína latente do vírus do papiloma possuindo imunoespecificidades diferentes, melhorando assim as capacidades de análise desses sistema.
Quando é desejável providenciar um sistema de diagnóstico capaz de ser utilizado para detectar e distinguir a exposição a tipos diferentes de vírus do papiloma, o estojo contêm mais do que um polipéptido, sendo os polipéptidos adicionais seleccionados com base na sua capacidade de produzir moléculas de anticorpos, aquando da imunização, que imunoreagem com as proteínas latejn tes do vírus do papiloma de um segundo tipo de vírus que é difere_n ta do tipo de virus do qual foi derivado o primeiro polipéptido. Além disso, os polipéptidos adicionais induzem moléculas de anticorpos que não imunoreagem com as proteínas latentes do vírus do papiloma expressas pelo primeiro tipo de virus. Assim, tal como aqui utilizado, o termo diferente significa que existe uma diferença substancial mensurável na capacidade de duas composições de moléculas de anticorpos induzidas par polipéptidos, para imunoreagir com proteínas latentes do virus do papiloma produzidas
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-46numa infecção latente provocada por um único tipo de vírus. Assim, diz-se que os polipéptidos são específicos para um dado tipo na sua capacidade de induzir composições de anticorpos que não reagem ambas com as proteínas latentes do vírus do papiloma de um só tipo de vírus.
Alternativamente, os polipéptidos são diferentes e portanto específicos para um dado tipo quando existe uma diferença substancial mensurável na sua capacidade de imunoreagir com anticorpos induzidos por uma proteína latente do vírus do papiloma de um dado tipo, relativamente à sua capacidade de imunoreagir com uma proteína de outro tipo. A diferença na imunoreacção quando medida por ELISA, como no Exemplo 4, é substancial se existir uma diferença superior a 0,05, mais preferivelmente superior a 0,1 e ainda mais preferivelmente superior a 0,4 na densidade óptica.
Os polipéptidos específicos para um dado tipo, preferidos para inclusão nesta concretização do presente invento, incluem os polipéptidos relacionados com VPH tipo 16, tipo 18, tipo 6, tipo II e tipo 33, descritos anteriormente. Os usos exemplares de polipéptidos específicos para um dado tipo de acordo com o presente invento, num sistema de diagnóstico, são apresentados no Exemplo 14.
Nesta concretização de um estojo de diagnóstico utilizando polipéptidos específicos para um dado tipo é contemplado que os polipéptidos podem ser providenciados fisicamente separados no estojo, permitindo assim distinguir a presença de anticorpos que imunoreagem com um ou outro dos polipéptidos inclusos. Um estojo exemplar deste tipo inclui um primeiro suporte sólido possuindo operativamente fixado um primeiro polipéptido e um segundo suporte sólido possuindo operativamente fixado um segundo polipéptido, sendo os dois polipéptidos separados específicos para um dado tipo, para diferentes tipos de vírus do papiloma. Evidentemente, os dois suportes sólidos podem encontrar-se no mesmo ou em ciferentes meios, como no caso em que os suportes sólidos são cavidades de microtitulo e essas cavidades se encontram na mesma ou em diferentes placas de microtitulo. Adicionalmente, esta concreti69 303
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-47zação pode incluir um terceiro suporte sólido possuindo fixado um terceiro polipéptido específico para um dado tipo, suja especificidade é diferente da do primeiro e segundo polipéptido, s assim por diante.
Noutra concretização, podem incluir-se diferentes polipépt dos cada um específico para um dado tipo, um estojo de diagnóstico como uma mistura de todos os polipéptidos desejados, criando assim a capacidade de analisar a presença de anticorpos induzidos por infecções latentes do vírus da papiloma provocadas por mais de um tipo de vírus do papiloma usando um suporte sólido. Um estojo deste tipo compreende tipicamente um suporte sólido, como uma pia. ca de microtítulo, possuindo operativamente fixado numa cavidade individual uma mistura dos polipéptidos específicos para um dado tipo, para mais de um tipo de vírus do papiloma.
I. Métodos de análise presente invento contempla qualquer método que resulte na detecção de proteínas latentes do vírus do papiloma, particulajr mente as proteínas como as encontradas numa amostra de tecido como tecido de biopsia, tecido de mancha da uretra ou tecido de man cha mamária, pela produção de um imunocomplexo contendo uma prote_í na latente do vírus do papiloma substancialmente pura, um polipéptido ou molécula de anticorpo contida numa composição de anticorpos ou anticorpos monoclonais do presente invento.
Adicionalmente, o presente invento contempla qualquer método que resulte na detecção de moléculas de anticorpos que imuno reajam com proteínas latentes do vírus do papiloma ou com polipéptidos deduzidos a partir da sequência de nucleótidos de um genoma do vírus do papiloma, particularmente moléculas de anticorpos num fluido corporal vascular, como os encontrados no soro ou secreções vaginais de um paciente ou outra espécie animal portad_o ra de uma infecção latente provocada pelo vírus do papiloma, pela produção de um imunocomplexo contendo uma proteína latente do vírus do papiloma substancialmente pura, um polipéptido ou molécula de anticorpo contido numa composição de anticorpos ou anticorpos monoclonais do presente inventa.
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-480s entendidos na especialidade entenderão que existem numerosos procedimentos de química de diagnóstico clínico bem conhe eidos que podem ser utilizados para formar esses complexos. Assim, apesar de se descreverem no presente invento métodos exempla res res o invento não lhes fica limitado.
1♦ Marcação imuno-histoquímica de amostras de tecido presente invento contempla um processo para a detecção da presença de uma infecção latente, provocada pelo vírus do pap_i loma, em amostras de tecido. Nesta concretização, as moléculas de anticorpos do presente invento são utilizadas para detectar a infecção latente provocada pelo vírus do papiloma, através da sua capacidade para imunoreagir com as proteínas latentes do vírus do papiloma presentes em amostras de tecido infectadas com o vírus do papiloma como tecido de biopsia do epitélio cervical, tecido de biopsia de condiloma, tecido de manchas da uretra e tecido de manchas mamárias. Nas concretizaçães preferidas, as moléculas de anticorpos estão presentes como composição de anticorpos monoclonais e, mais preferivelmente são produzidas por um hibridoma listado na Tabela 4.
Por exemplo, uma amostra de biopsia pode ser obtida e pre parada por fixação para análise imuno-histoquímica, por técnicas bem conhecidas. Veja-se, por exemplo, Tubbs, Atlas of Immunohistoloqy, Americaç Society of Clinicai Pathology Press, Chicago. A amostra de biopsia preparada é misturada com uma composição conten do moléculas de anticorpos de acordo com o presente invento, para formar uma mistura de imunoreacção. A mistura assim formada é mantida sob condiçães de análise biológica durante um período de tempo suficiente para que se dê a imunoreacção entre quaisquer proteínas latentes do vírus do papiloma presentes na amostra e as moléculas de anticorpos adicionadas, para formar um produto de imunoreacção. A presença de um produto de imunoreacção é então analisada.
Nesta concretização, as moléculas de anticorpo utilizadas para detectar a infecção latente pelo vírus do papiloma em amostras de tecido, podem incluir moléculas substancialmente isoladas
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-49de anticorpos que imunoreajam com um polipéptido relacionado com a proteína latente do vírus do papiloma, preferivelmente um polipéptido deduzido da ELA E2. As moléculas exemplares de anticorpos desta classe são as isoladas por cromatografia de afinidade, usando polipéptidos imobilizados possuindo sequências relacionadas com o vírus do papiloma e isolados a partir de soro contendo anticorpos anti-proteína latente do vírus do papiloma, tal como encontrado num paciente portador de uma infecção latente provocada pelo vírus do papiloma. Os métodos de detecção exemplares são os descritos no Exemplo 16, usando a afinidade de moléculas de ari ticorpo isoladas do antisoro de um paciente infectado com VPH.
2. Detecção de anticorpos para a infecção latente provocada pelo vírus do papiloma
Podem empregar-se diversos protocolos, heterogéneos e homogéneos, de análise, quer competitivos quer não competitivos, p_a ra detectar a presença e preferivelmente a quantidade, de anticoj? pos que imunoreagem com proteínas latentes do vírus do papiloma num fluido corporal vascular, isto é, para detectar anticorpos a_n ti-proteína latente do vírus do papiloma.
Em particular, o presente invento contempla um formato ELISA como aqui discutido, para detectar a presença e quantificar as moléculas de anticorpos numa amostra de fluido corporal c_o mo soro, plasma, secreções vaginais ou urina, sendo essas moléculas de anticorpos as que imunoreagem com uma proteína latente do vírus do papiloma. Neste formato, o método emprega um antigénio ou anticorpo ligado a uma fase sólida (suporte sólido) e um co n jlj gado enzima-antigénio ou enzima-anticorpo para detectar e quantificar os anticorpos presentes na amostra. Em concretizações prefe ridas, o antigénio ligado à fase sólida é um polipéptido do presente invento.
Por exemplo, uma amostra de sangue humano é um suporte sói lido contendo um polipéptido do presente invento ligado são mistjj rados. A mistura assim formada é mantida sob condições de análise biológica durante um período de tempo suficiente para quaisquer anticorpos imunoreagirem com o polipéptido em fase sólida e formar um produto de imunoreacção. Um segundo anticorpo marcado, como
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c .· /-50anticorpos anti-IgA humano marcados com cocleária peroxidase, é então misturado com o primeiro suporte sólido contendo produto de imunoreacção e mantido sob condições de análise biológica durante um periodo de tempo suficiente para qualquer primeiro produto de imunoreacção imunoreagir com os anticorpos marcados e formar um segundo produto de imunoreacção. Os segundos produtos de imunoreacção marcados são então separados dos anticorpos marcados não reagidos, tipicamente por lavagem do suporte sólido de forma sufi, ciente para remover o marcador não ligado. A quantidade de produ. to de imunoreacção marcado é então analisada.
As condições de análise biológica são aquelas que mantêm a actividade biológica das moléculas de anticorpo e das moléculas de polipéptido do presente invento e das moléculas de anticorpo a ser analisadas. Essas condições incluem um intervalo de temperatura de 43C a cerca de 453C, preferivelmente cerca de 3730, um in tervalo de valores de pH de cerca de 5 a cerca de 9, preferivelmente cerca de 7 e uma força iónica variando entre a da água destilada a cerca de um molar em cloreto de sódio preferivelmente cerca da concentração salina fisiológica. Os métodos de optimiza. ção destas condições são bem conhecidos na especialidade.
Em concretizações preferidas, o método de análise formata do ELISA, de acordo com o presente invento, utiliza polipéptidos deduzidos das ELA El, E2 ou E6 do VPH tipo 16, particularmente os polipéptidos cujas sequências de resíduos de aminoácidos são as listadas na Tabela 1. Ainda mais preferidos são os polipéptidos do VPH tipo 16, 237, 245 e 246. Os polipéptidos adicionais relacionados com VPH tipo 16 preferidos para uso na detecção de anticorpos anti-proteína latente do vírus do papiloma são os listados na Tabela 2.
Noutra concretização, a presente análise contempla a detecção de anticorpos anti-proteina latente do VPH de tipos de virus do papiloma humano diferentes do tipo 16, por meio da utiliza, ção de polipéptidos relacionados com VPH deduzidos da região ELA E2 de outros vírus do papiloma genital. Os polipéptidos preferidos são os relacionados com VPH deduzidos dos tipos 6, 11, 1Θ e 33, particularmente os apresentados na Tabela 3.
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g.
-51Os métodos ELISA exemplares utilizando diversos polipápti dos são apresentados nos Exsmplos.
3. Detecção de anticorpos para a proteína latente do vírus do papiloma por análise ELISA de competição presente invento contempla um método de análise de competição para detectar a presença e preferivelmente quantificar, os anticorpos anti-proteí na. latente do vírus do papiloma, método este que utiliza uma análise ELISA básica em dois formatos de com petição diferentes.
Num formato, contempla-se um método para testar uma amostra de fluido corporal relativamente à presença de anticorpos anti-proteína latente do vírus do papiloma compreendendo os passos de:
(a) misturar substancialmente em simultâneo uma amostra de fluida corporal com (l) um polipéptido do presente invento fixado a um suporte sólido e (2) uma quantidade predeterminada de um anticorpo anti-polipéptido marcado em fase líquida, do presente invento, que imunoreaja com o polipéptido fixado para formar uma mistura de imunoreacção competitiva, possuindo uma fase líqui da e uma fase sólida. Preferivelmente, a amostra de fluido corpo ral é uma quantidade conhecida de sangue, soro, plasma, urina, s_a liva, sémen ou secrecção vaginal.
(b) manter a mistura sob condiçães de análise biológica durante um período de tempo predeterminado, tal como cerca de 10 minutos a cerca de 16 a 20 horas a uma temperatura de cerca de 4SC a cerca de 45SC, suficiente para quaisquer anticorpos anti-proteína latente do vírus do papiloma, presentes na amostra, imunoreagirem com o polipéptido e também suficiente para o anticorpo anti-polipéptido marcado competir para imunoreacção com os mesmos polipéptidos para formar produto de imunoreacção marcado contendo anti-polipéptido, em fase sólida.
(c) analisar a presença de qualquer produto de imunoreacção marcado contendo anti-polipéptido. Consequentemente, a presença de quaisquer anticorpos anti-proteína latente do vírus do papiloma na mistura de imunoreacção é também determinada. Pre69 303
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-52ferivelmente, a quantidade de qualquer produto de imunoreacção marcado contendo anti-polipéptido que se tenha formado, é determi nada e consequentemente também a quantidade de anticorpos anti-proteína latente do vírus do papiloma presente na amostra.
Noutro formato, uma análise competitiva ELISA do presente invento compreende os passos de:
(a) misturar substancialmente em simultâneo uma amostra de fluido corporal, tal como no formato anterior, com (l) um pol_i péptido do presente invento fixado a um suporte sólido e (2) uma quantidade predeterminada do mesmo ou um polipéptido imunologicamente reactivo em cruzado em fase líquida, para formar uma mistura de imunoreacção competitiva possuindo uma fase líquida e uma fase sólida;
(b) manter a mistura sob condições de análise biológica durante um período de tempo suficiente para quaisquer anticorpos anti-proteína latente do vírus do papiloma presentes na amostra imunoreagirem quer com o polipéptido em fase sólida quer com o p_o lipéptido em fase líquida, para formar um produto de imunoreacção contendo um polipéptido em fase sólida e em fase líquida; e (c) analisar a presença de qualquer produto de imunoreac ção formado contendo polipéptido em fase sólida e, consequentemen te, a presença de quaisquer anticorpos anti-proteína latente do vírus do papiloma é também determinada.
Numa concretização diferente do segundo formato, o polipéptido na fase líquida não é o mesmo, nem substancialmente imunologicamente reactivo em cruzado com o polipéptido na fase sólida. Assim, os dois polipéptidos incluídos na análise são polipéptidos diferentes específicos, cada um, para um dado tipo de v_í rus do papiloma, de acordo com a definição anterior de diferente. Por exemplo, um polipéptido relacionado com VPH tipo 16 està presente na fase sólida e um polipéptido relacionado com VPH tipo 6 está presente na fase líquida, por exemplo os polipéptidos 245 e K-70 respectivamente. Este formato de análise competitiva pro porciona um processo para distinguir o tipo de VPH presente que induziu os anticorpos anti-proteína latente do VPH detectados.
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-53Exemplos
Os exemplos que se seguem pretendem ilustrar, mas não l_i mitar, o presente invento.
1. Sintese dos polipéptidos
Os polipéptidos correspondentes, nas sequências de resíduos de aminoácidos, a porções de proteínas latentes codificadas por diversas ELA do VPH tipo 16 foram sintetizados quimicamente de acordo com os processos de fase sólida descritos na Patente U.S. N°. 4 631 211, cuja descrição é aqui incorporada como referência.
A sequência de resíduos de aminoácidos dos polipéptidos sintetizados e a sua localização na sequência de aminoácidos dedjj zida das ELA da região E de VPH encontra-se listada na Tabela 1.
Os polipéptidos adicionais relacionados com VPH foram sin tetizados pelos métodos em fase sólida acima, possuindo cada poli, péptido uma das sequências de resíduos de aminoácidos listadas nas Tabelas 2 e 3.
2. Preparação de anti-soro anti-polipéptido policlonal
a. Preparação de polipéptido reduzido
Os polipéptidos preparados como descrito no Exemplo 1 foram analisados para determinar o seu teor em cisteina. Misturou-se um volume de um mililitro (ml) de solução de tampão PR tampão fosfato de sódio D,1M, pH 7,2, ácido etilenodiaminotetraacétj. co (EDTA) 5 mM_7 contendo 125 micrograma (^g) de polipéptido, com 100 microlitro (yhl) de solução DTNB (ácido ditionitrobenzóico 1 mM em metanol) e maçteve-se à temperatura ambiente durante 30 minutos. A densidade óptica (D.O.) da mistura resultante foi medida a 412 nanómetro (nm) contra uma solução controlo apenas de ta_m pão P.E.. Por comparação com uma curva padrão usando glutatíona, na qual uma solução a 28^g/ml em tampão PE exibe cerca de 1,14 unidades de D.O. a 412 nm, determinou-se a quantidade de cisteina livre para cada um dos polipéptidos medidos. Os polipéptidos pos suindo menos de 75 por cento dos resíduos disponíveis de cisteina oxidados foram considerados reduzidos. Os polipéptidos possuindo
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-54mais de 75 por cento dos resíduos disponíveis de cisteína oxidados foram submetidos a redução como descrito abaixo.
Os polipéptidos foram reduzidos misturando 10 miligrama (mg) do polipéptido com 10 mg de ditiotreitol (DTT; Sigma Chemical Co. , St. Louis, MO) , em 1 ml de tampão fosfato 50 mM (pH 8,0) e mantendo a mistura à temperatura ambiente com agitação constante. Após 60 minutos de agitação adicionaram-se ainda 50 y<L de ácido acético concentrado e a mistura resultante foi então aplicai da a uma coluna de enchimento com um volume de enchimento de 15 ml, Sephadex G-10 (Pharmacia, Piscatauay, N0), previamente lavada com uma solução de ácido acético a 5 por cento (/) em água. A co luna foi passada com ácido acético a 5^ e o eluente resultante da coluna foi recolhido em fracções. Determinou-se a densidade ópti ca (D.O.) a 206 nm para cada fracção e as de D.0. definida a 206 nm do pico da primeira proteína foram reunidas e liofilizadas para originar polipéptido reduzido seco. 0 polipéptido seco foi dissolvido em tampão acetato (pH 4,0) a 5 mg/ml para originar polipéptido reduzido.
b. Preparação de imunoqéne conjugado polipéptido-HOL polipéptido reduzido preparado no Exemplo 1, foi conjugado com proteína de hemocianina de lapa do género Fissurella (HCL; Pacific Bio-Marine Laboratories, Venice, CA) usando o reagente de acoplamento éster N-hidroxisuccinimideto de m-maleimidobenzoílo (MBS; Sigma). Misturaram-se duzentos ydL de solução de HCL, dialisada em TP (tampão fosfato 10 mM, pH 7,2) a 20 mg HCL,/ /ml TP, com 55 yd de TP e em seguida misturou-se lentamente, por adição gota a gota, 85 yd de solução MBS (6 mg/ml em dimetil forma, mida, mantendo agitação contínua à temperatura ambiente. A mistu ra resultante foi mantida durante 30 minutos com agitação ã temp.e ratura ambiente e foi então aplicada a uma coluna de Sephadex G-25 (Pharmacia), ccm um volume de enchimento de 15 ml, previamente passada com TP 50 (tampão fosfato 50 mM, pH 6,0). A coluna foi passada com TP 50 e o eluente resultante da coluna foi recolhido em fracções, gota a gota (35 gotas por fracção). A D.O.
260 foi determinada para cada fracção e reuniram-se as fracções
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Pt
-55correspondentes aos picos. As fracções reunidas foram misturadas com 1 ml de polipéptido reduzido 5 mg/ml em tampão acetato (pH 4,0)_/, analisou-se e ajustou-se o pH com hidróxido de sódio ou ácido clorídrico, como necessário para manter a mistura entre pH 7,0 e 7,5, mantendo sempre agitação à temperatura ambiente, duran te 3 horas. A mistura agitada foi então combinada com uma quanti. dade suficiente de PBS (solução salina tamponada com fosfato) para perfazer um volume final'de 2,0 ml, para produzir solução de polipéptido conjugado com HCL.
c. Imunização de coelhos para produzir anti-soro anti-polipéptidos policlonais
Imunizaram-se coelhos da Nova Zelândia brancos obtidos do SCRF Vivarium (Research Institute of Scripps Clinic, La Jolla, CA), usando soluções de polipéptido conjugado com HCL preparadas no Exemplo 2b, pelo esquema seguinte de inoculação. A primeira inoculação compreendeu quatro infecçoes subcutâneas administradas em locais ao longo do dorso dos animais, possuindo cada infecção aproximadamente 375 ^1 de uma solução preparada por mistura de 3 mg de mycobacterium (DIECO Laboratories, Detroit, Ml), 1,5 ml de adjuvante incompleto de Ereund (IFA; Sigma) e 1,5 ml de PBS contendo 250 ^1 de solução de polipéptido conjugado com HCL, tendo esta mistura sido emulsificada durante cinco minutos antes da inoculação. A segunda inoculação fci administrada de forma semelhante, 14 dias após a primeira inoculação, usando a mesma mistura mas omitindo a micobactéria (mycobacterium). A terceira ino culação foi administrada 21 dias após a primeira inoculação, compreendendo 1 ml de uma mistura, bem agitada, de 250yul de solução de polipéptido conjugado com HCL, 950 ^1 de PBS e 8D0yxl de solução de hidróxido de alumínio (10 mg/ml em água esterilizada) e foi injectada intraperitonealmente.
antisoro foi Dbtido dos coelhos acima imunizados, por sangria das veias da orelha 28 e 35 dias após a primeira infecção para originar anti-soro anti-polipéptido, de rato.
Ds anti-soros anti-polipéptido, de coelho originados para os polipéptidos cujas sequências de resíduos de aminoácidos são
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-56.^Ufapresentadas na Tabela 1, foram então analisados pelo teste ELISA descrito no Exemplo 3. Todos os antisoros de coelho assim preparados e analisados pelo teste ELISA imunoreagiram com o polipépt_i do imunizante a títulos em excesso de 1:2560.
3. Testes ELISA
As moléculas de anticorpos contidas em composições de ant corpos e de anticorpos monoclonais foram examinadas em relação à sua capacidade de imunoreagir com diversos polipéptidos usando um procedimento de imunoanálise (ELISA) de enzimas ligados.
Adicionaram-se cem yxl de solução de revestimento (tampão de carbonato de sódio 0,1 M, pH 9,2) contendo polipéptido, como descrito no Exemplo la, a uma concentração de 10 y<g por ml de solução de revestimento, a cada uma das cavidades de uma placa de microtítulo com 96 cavidades e a placa foi mantida durante a noite à temperatura ambiente para permitir a adsorção do polipéptido às paredes das cavidades. Em seguida, a solução de revestimento foi removida por inversão e agitação forte, as cavidades foram passadas por duas vezes com água destilada e misturaram-se em cada cavidade (suporte sólido) 150 jYL de solução bloqueadora albij mina de soro bovino a 3% (ASB; <u/v) em PBS_/r para bloquear o excesso de locais de proteínas.
As cavidades foram mantidas durante 20 minutos à temperatura ambiente e em seguida a solução bloqueadora foi removida por agitação. A cada cavidade adicionaram-se 100 yLL de uma solução contendo anti-soro de coelho anti-péptido, preparado como descrito no Exemplo 2c e efectuou-se a diluição em série em tampão bloqueador. As misturas de imunoreacção fase líquida/sólida resultantes foram mantidas durante 60 minutos à temperatura ambiente para permitir a formação de um primeiro produto de imunoreacção, ligado à fase sólida, entre o polipéptido ligado à fase sólida e os anticorpos misturados. As fases líquidas e sólidas foram então separadas, as cavidades foram lavadas 5 vezes com água destilada e o excesso de líquido foi removido por agitação.
Adicionaram-se cenyil de uma solução contendo IgG anti-coelho de cabra marcado com glucose oxidase (Cooper Biomedical,
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-57Malvern, PA), diluído 1:1000 em solução bloqueadora, a cada uma das cavidades para formar uma segunda mistura de imunoreacção fase sólida/líquida (mistura de imunoreacção marcadora). As cavid£ des foram mantidas durante uma hora a 37SC para permitir a formação de um segundo produto de imunoreacção entre o anticorpo marca do e qualquer anticorpo ligado à fase sólida, do primeiro produto de imunoreacção e em seguida lavadas 5 vezes com água destilada para isolar o marcador ligado à fase sólida, contendo os produtos de imunoreacção. □ excesso de líquido foi seguidamente removido das cavidades.
Preparou-se de fresco, antes da utilização, uma solução de um substrato cromogénico misturando (l) 28 ml de uma solução preparada de glucose contendo 2,1% de glucose (uí/v) em TP /“t ampão fosfato 0,1 M (pH 6,0)_/, tendo a referida solução de glucose sido mantida em repouso durante a noite para permitir a mutarotação da glucose, (2) 200 de uma solução contendo 0,1% (iu/v) de cocleária peroxidase em TP e (3) 2 00 ^1 de uma solução de ABTS contendo o corante ABTS preparado de fresco (2,2'-diazino-di-/-3-etilbenzotiazolinasulfonato (ó)_/ de diamónio; Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN) a uma concentração de 45 mg por ml de TP Adicionaram-se então 100 yUl da solução de substrato cromogénico a cada uma das cavidades para formar uma mistura reaccional reveladora. Depois de manter a mistura reaccional reveladora no escuro durante 1 hora, à temperatura ambiente, mediu-se directamente a D.0. de solução na cavidade usando um sistema de leitura múltipla da placa de microtitulo (Bio-Tek Instr., Winooski, VT ) com um fil tro de 415 nm.
Os resultados do teste ELISA acima, foram expressos como uma diluição da composição de anticorpos que proporcionou aproximadamente 50% da D.0. máxima que a solução de substrato cromogôn_i co produziu usando antigénio não diluído, reagindo positivamente. As moléculas de anticorpo contidas nestas composiçães foram cons_i deradas como possuindo a capacidade de imunoreagir com um polipéptido em fase sólida se a diluição para atingir 50% da D.0. máxima fosse superior a 1:4.
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4. Isolamento de antisoro policlonal de coelhos por afinidade por polipéptidos
Para aumentar a especificidade do antisoro anti-polipépt_i do de coelho, estes antisoros foram isolados por afinidade usando ligandos de polipéptido em fase sólida, como descrito no presente invento.
Dissolveram-se em água cinco miligramas de polipéptido, preparado como descrito no Exemplo 1, acoplando-se seguidamente a AH-Sepharose 4B (Pharmacia) de acordo com as instruções do fabricante, para formar um suporte sólido polipéptido-agarose. Preparou-se uma coluna com 3 ml de volume de enchimento usando o supor te sólido polipéptido-agarose e equilibrou-se o sistema por passa gem de tampão NET (NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, Tris-HCl 20 mM, pH 7,5). Aplicaram-se cerca de 10 ml de um antisoro anti-polipéptido de coelho preparado como descrito no Exemplo 2c, na coluna equilibrada e a coluna foi então lavada com um volume 30 vezes superior ao seu, de tampão NET. Seguidamente aplicou-se tampão citrato 100 mM (pH 3,0) na coluna e o eluente foi recolhido em fracçães. A D.0. das fracçães foi medida a 280 nm, determinaram-se as fracçães contendo pico e estas foram reunidas para originar uma mistura contendo anticorpo. 0 pH da mistura foi medido e ajustado a 7,0 usando Tris-base e efectuou-se então a diálise da mistura em PBS para originar uma solução contendo moléculas de anticorpo de coelho purificadas por afinidade.
A solução resultante de moléculas de anticorpo de coelho purificadas por afinidade representa um anticorpo substancial mente isolado porque mais de 50/£ das moléculas de anticorpo contidas na solução apresentam a capacidade de imunoreagir com uma proteína latente do VPH.
Cada antisoro anti-polipéptido de coelho isolado por afinidade pelo processo acima, foi isolado usando o mesmo polipéptido utilizado na preparação do imunogéne que originou esse antisçj ro particular. D antisoro anti-polipéptido de coelho que foi is£ lado por afinidade (IA) por este método inclui anti-polipéptido 235 de coelho (anti-235 de coelho), seguidamente referido como ajq ti-235 IA de coelho, anti-236 IA de coelho, anti-245 IA de coelho
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<-595. Detecção de proteínas latentes do vírus do',:papil oma por imunomanchas Western usando anticorpos policlonais anti-polipéptido
Usando análises de imunomanchas Western, prepararam-se e examinaram-se lisatos de tecidos de cultura de células contendo VPH e diversas amostras de biopsia, relativamente à presença de proteínas latentes do vírus do papiloma humano.
As linhas de células do carcinoma cervical humano, C-33A (HTB-31), HT-3 (HTB-32), Hela (CCLg), CaSki (CRL 1550), MS 751 (HTB 34) e SiHa (HTB 35) foram obtidas do American Type Culture Collection (ATCC; Rockville, MD), possuem as designações ATCC i_n dicadas entre parêntesis à frente do seu nome e foram cultivadas usando os meios e métodos recomendados por ATCC.
As células feitas crescer em cultura de monocamadas foram agrupadas e lavadas duas vezes com PBS-EDTA (PBS contendo 0,02/6 de EDTA), peletizadas para recolher as células lavadas e ο ΡΒΞ-EDTA foi removido para originar um pelete de células compacto. 0 pelete de células compacto foi re-suspenso por mistura em vórtice, em PBS a 49C a uma concentração de 0,1 g de pelete de células com pacto por 0,5 ml de PBS e lisado por adição de 0,5 ml de 2ΧΞΒ (is. to é, um tampão preparado com uma concentração dupla da concentra ção do tampão da amostra) para originar células lisadas. 0 tampão de amostra (SB) contém 2% de SDS, ditioltreitol 50 mM, 10% de gl_i cerol, Tris-HCl 125 mM pH 6,8 e fluoreto de fenilmetilsulfonilo (FFMS), 1 mM.
0s tecidos de biopsia de condilomas obtidos de Dr. Z.Bekassy (Departamento de Ginecologia, Lund University Hospital,
Lund, Suieden) , foram pesados, moídos e suspendidos em SB a uma concentração de 0,1 mg por ml. A suspensão molda foi rompida por meio de três pancadas num triturador de assentamento livre de um homogeneizador dounce e em seguida sonificada durante 1,5 horas num sonificador contido num banho de água. A suspensão sonificada foi congelada a -70SC e descongelada em 4 ciclos de congelaçãci -descongelação e a suspensão resultante foi centrifugada a cerca de 12 000 xg numa microcentrlfuga para remover os fragmentos de
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-60tecido. 0 sobrenadante resultante foi retido para originar um l_i sato de tecido de condiloma.
Os lisatos celulares foram submetidos a electroforese em SDS-gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) num gel viscoso, 7,5% usando Laemmli, Nature, 226: al., Infect. Immun., incorporado como referêri celular por lamela de lamela contendo proteílar (Bio-Rad Laboratoes na preparação marcar da tripsina, 21,5 kd;
anidrase carbónica, 31 kd; ovalbumina, 42,7 kd; albumina de soro bovina, 66,2 kd; fosforilase b, 97,4 kd; beta-galactosidase, 116,25 kd; e miosina, 200 kd, todas em unidades de mil daltons (kilodaltons).
um sistema tampão descontinuo descrito por :6B0-6B5 (1970) e modificado por Black et 33:212-272 (1981), método esse que é aqui cia, usando 100 microlitros (^il) de lisato gel, flanqueada em ambos os lados por uma nas pré-coradas, marcadoras de peso molecu ries, Richmond, CA). As proteínas present dora incluem: lisozima, 14.4 kd; inibido |h· ta
Após electroforese e electromanchação usando uma unidade de transferência Bio-Rad (BioRad, Richmond, CA) em nitrocelulose, como descrito por Toiubin et al. , Proc. Natl. Acad. 5ci. , USA, 76: :4350-4354 (1979), método este que é aqui incorporado como referê cia, a mancha foi bloqueada com uma solução de BLOTTO 5% de le te em pó magro em PBS contendo 0,025% de antiespuma A (Sigma Chemical Corp. St. Louis, M0)_7 por imersão da mancha em BLOTTO durante 1 hora com agitação. As manchas bloqueadas foram então mari tidas em BLOTTO contendo antisoro anti-polipéptido de coelho ou antisoro anti-polipéptido de coelho IA como indicado,a uma diluição de 1:100 em BLOTTO, durante 2 horas à temperatura ambiente p_a ra permitir a formação de um produto de imunoreacção entre as com posições de anticorpos e as proteínas latentes do vírus do papil_o ma presentes como fase sólida nas manchas. Em seguida, as manchas foram lavadas em BLOTTO três vezes durante cerca de 1 minuto, 20 minutos e 20 minutos, respectivamente, para remover o antisoro a_n ti-péptido não ligado. As manchas lavadas foram então mantidas durante 30 minutos em BLOTTO contendo IgG anti-coelho de cabra (Sigma) conjugado com fosfatase alcalina, diluído a 1:1000 para permitir a formação de um segundo produto de imunoreacção entre o
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-61segundo anticorpo misturado θ o produto de imunoreacção primeiramente formado, presente na fase sólida da mancha. A mancha foi então lavada em PBS-T (P8S contendo 0,5/ de Ttueen 20), uma vez djj rante 5 minutos e 4 vezes durante 30 minutos cada uma, para remover o segundo anticorpo misturado, não ligado. A mancha lavada foi então mantida numa solução de substrato cromogénico contendo revelador, durante cerca de 4 horas à temperatura ambiente, para visualizar os produtos de imunoreacção presentes na mancha.
A solução reveladora foi preparada misturando 5 ml de Tris 1,5 M (pH 8,8), 45 ml de água, 5 mg de indicador azul de nitrotetrazólio, 0,2 ml de MgCl^ 1 M e 2,5 mg de 5-bromo-4-cloroindoxilfosfato.
Os resultadas obtidos usando o teste de imunomanchas Western para detecção da proteína latente do vírus do papiloma, são apresentados nas Figuras 2 e 3.
Por exemplo, as lamelas 1-4 da Figura 2 ilustraram que a proteína difusa possuindo um peso molecular de cerca de 112 kd foi detectada em lisatos de células SiHa e HeLa, mas não em lisatos de células CaSki ou C-33A, usando anti-soro anti-236 policlonal de coelho. A mesma proteína difusa de 112 kd foi também detectada pela formação de um produto de imunoreacção em imunomanchas, usando antisoro anti-245 de coelho.
As lamelas 6 e 7 da Figura 2, demonstram que a proteína filamentosa de 54 kd do VPH foi detectada por análise de imunomari chas de lisatos celulares de tecidos de biopsia de condilomas com antisoro anti-236 de coelho. A proteína filamentosa de 48 kd do VPH foi também detectada por imunoreacção em manchas usando anti-235 de coelho, anti-245 de coelho e anti-247 de coelho.
A Figura 3 demonstra que um antisoro policlonal originado contra o polipéptido 236 pode ser utilizado como reagente específico para um dado tipo, para distinguir as infecçães provocadas pelo VPH tipo 16 e pelo VPH tipo 18. Como apresentado na Figura 3, as proteínas filamentosas de 54 kd e 58 kd foram ambas detecta das na análise de imunomanchas de lisatos de células CaSki (lamela 2), mas não foram detectadas em lisatos de células HeLa (lame69 303
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A proteína nuclear de 51 kd foi detectada por análise de imunomanchas de lisatos de células CaSki, com anti-245 de coelho isolado por afinidade.
Os resultados acima, demonstram que o antisoro anti-pépti do produzido contra polipéptidos deduzidos a partir das ELA da re gião E dos vírus do papiloma, exibem a capacidade de imunoreagir com proteínas latentes do vírus do papiloma. Nalguns casos, um antisoro anti-polipéptido apresenta a capacidade de imunoreagir com uma proteína latente produzida por um, mas não por outro tipo de VPH, isto é, é um antisoro específico para um dado tipo.
6. Preparação de hibridomas e de anticorpos monoclonais anti-polipéptido a. Imunizações de ratos
Todos os hibridomas foram produzidos usando células do ba ço de ratos 129 &ιχ+ imunizados, obtidos no SCRF Vivarium (La Ool. la, CA) com uma idade de cerca de 3 semanas no início da imunização.
Cada um dos polipéptidos listado na tabela 1 foi conjuga do com KLH e utilizado como imunogéne para produzir os hibridomas descritos no presente invento.
Cada rato a imunizar com um polipéptido particular recebeu primeiramente uma infecção intraperitoneal (IP) de uma suspen são que continha uma mistura emulsificada de cerca de 62,5yx.l de uma solução de polipéptido conjugado com HCL, preparada como no Exemplo 2b, 0,43 ml de PBS e 0,5 ml de adjuvante completo de Freund (ACF). Cerca de duas semanas mais tarde, cada rato recebei uma infecção IP de uma suspensão contendo cerca de 32 ^1 da mesma solução de polipéptido conjugado com HCL que anteriormente, 0,47 ml de PBS e 0,5 ml de suspensão de alúmen (hidróxido de alumínio a 10 mg/ml em PBS). Cerca de 7 a 10 dias após a segunda ijn fecção, o antisoro dos ratos foi recolhido no soro lacriroal e o título do antisoro foi determinado usando o procedimento ELISA descrito no Exemplo 3, à excepção das modificações descritas aba_i xo.
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-63Z;
Depois de se revestirem as cavidades de microtítulo com o mesmo polipéptido que o utilizado na imunização dos ratos, as cavidades foram bloqueadas como anteriormente descrito e em seguida misturaram-se diluições em série de anti-soro do soro lacrimal dos ratos, diluido em tampão bloqueador e a mistura foi mantida como descrito anteriormente. Quando foi necessário anticorpo conjugado com glucose oxidase no método ELISA, utilizou-se conjugado IgG anti-rato de cabra em vez de IgG anti-coelho (Copper Biomedical). Nos casos em que se determinou um titulo de soro lacrimal inferior a 1:3200 para atingir 50% da densidade óptica D.D. máxima a 415 nm, administrou-se uma infecção adicional ao rato 2 semanas após a segunda infecção contendo o mesmo inóculo que a segunda i_n fecção.
Cerca de um més após o titulo do soro lacrimal se tornar superior a 1:3200, o rato receber uma infecção final de uma suspensão contendo cerca de 32^1 da mesma solução de polipéptido conjugado com HCL, como anteriormente e 0,47 ml de PBS, infecção esta que foi administrada por via intravenosa (IV) numa veia da cauda.
b. Fusão de hibridomas
Recolheram-se células do baço dos ratos imunizados no Exemplo 6a, cerca de 3 dias após a infecção final e a fusão com células de mieloma foi conduzida como aqui se descreve. Mistura.
g ram-se cerca de 1x10 células de baço (ATCC CRF 1581) de cada um γ
dos ratos com cerca de 2x10 células de mieloma SP2/0-Ag 14 num meio de fusão compreendendo 40% de PEG (Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN). Após a fusão celular, as células de hibridoma resultantes foram semeadas em placas de microtítulo com 96 cavida^ des, cultivadas em meio HAT (hipoxantina, aminopetrina e timidina) como é bem conhecido, e as culturas de hibridomas sobreviventes resultantes foram analisadas em relação à sua capacidade de prodju zir moléculas de anticorpo que imunoreajam com o polipéptido imu nizante, usando o procedimento ELISA modificado descrito no Exemplo 6a, com a excepção de os sobrenadantes da cultura de hibridoma terem sido utilizados em lugar do antisoro lacrimal de rato.
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-64- ....... Os sobrenadantes de cultura de hibridomas analisados em relação à presença de moléculas de anticorpo anti-polipéptido na análise ELISA foram considerados positivos se a densidade óptica (D.O.) a 414 nm de sobrenadante de cultura diluido a 1:2 fosse sjj perior a quatro vezes a D.O. obtida para o meio de cultura contro lo. Uma fusão típica foi plaqueada em trinta placas de microtí tjj lo de 96 cavidades e originou de 10 a 60 culturas de hibridoma por fusão, que imunoreagiram com o polipéptido imunizado na anál_i se ELISA.
As moléculas de anticorpos produzidas por um hibridoma particular, seleccionado pelos métodos de análise que se seguem, são referidas aqui por caracteres que indicam l) o polipéptido utilizado para imunizar o rato que dota as células do baço para uma fusão particular e 2) a placa de cultura de 96 cavidades de cuja sequência e número de cavidades foi isolada a célula de hibridoma resistente a meio HAP. 0 caracter específico referente às moléculas é aqui listado como uma palavra em que o número que precede a coluna é a designação do polipéptido e os símbolos que se seguem designam a cavidade de microtítulo (por ex., 247:11D12)
Os hibridomas isolados são apresentados na Tabela 5, aba_i
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-65Tabela 5
Hibridomas
Polipéptido Hibridomas To
I munizante_Hibridomas_tais produzidos
235 1G5,2A5,2C9,2F9,2G7 3C5,3E9,3F12,3G5,4F5,
4F7,4G12,5A6,5D3,5D7,
5G11,6D11,6G9,6H4,7B8,7E9,
7F12,7Gl,BG4,BG10,8H10,
9C7,9F5,9G10,11E1,89
236 1C4,1C12,1F6,2A11,2D5, 2F11,3G4,4D1,6H5,BC11, 8G6,9C11,9H5,1OC3,11C4, 11G2,11G6,11H8,12D5
238 2D4,4D4,5A1O,BE9,8G1O,
1OC1O,1OC11,1OE1O
245 2A1,2F11,4E3,4F7,BD4,
11E3,13D11,14C6,15FB,15F10, 17C6
Θ
246 1010,2H4,3F2,4GH,708,9E1 6
247 IBS,1C2,1F11,2C9,2G12 ,
4D11,5F7,5F8,7G7,9E3,
9G2,9G6,9G9,10F7,11D11,
12B11,12C10,13E11,14D10,
17D10 20 c♦ Purificação de anticorpos monoclonais por CLFP
Preparou-se uma composição de anticorpos monoclonais por recolha do fluido ascite de um rato que tinha recebido uma infecção IP de uma cultura de hibridomas e mantido por métodos bem conhecidos. Centrifugaram-se dois ml do fluido ascite resultante durante 15 min a 12 000 xg, recolheu-se o sobrenadante e filtrou69 303
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-66-se através de um filtro Acrodise de 0,2^ιλ (Gelman) para originar fluido ascite filtrado.
Ligaram-se em série duas colunas de Superose 6 e Superose 12 (Pharmacia) num equipamento CLFP e equilibraram-se com PBS durante 60 min a um caudal de 0,5 ml/min. Aplicaram-se quinhentos ^a1 dofluido ascite filtrado às colunas equilibradas e cromatografou-se a um caudal de 0,4 ml/min, usando PBS. 0 eluente resulta_n te foi analisado para determinar a densidade óptica (D.O.) a 280 nm e recolheram-se fracções de 1 ml do eluente. As fracções foram analisadas pelo processo ELISA, para averiguação da presença de moléculas de anticorpos anti-polipéptido usando o polipéptido imunizante descrito no Exemplo 6b. Tipicamente, determinaram-se duas fracções contendo a maior parte dos anticorpos anti-pol ipép t_i do e as duas fracções de 1 ml foram entSo reunidas para originar uma solução de anticorpos monoclonais purificados por CLFP possuiri do um titulo anti-polipéptido superior a 1:2560 como determinado pelo método ELISA descrito no Exemplo 6b.
Por este procedimento, os anticorpos monoclonais 247:4D11, 235:B9 e 245:11E3 foram purificados por CLFP, possuindo uma concentração de proteína conhecida, baseada nas medições de D.O. tomadas a 280.
Cada uma das soluções contendo moléculas de anticorpos m_o noclonais purificados por CLFP representa um anticorpo substancia_l mente puro uma vez que mais de 50% da proteína contida na solução é composta por moléculas de proteína que formam locais de combina ção de anticorpos.
7. Detecção por imunomanchas Western de proteínas latentes do vírus do papiloma usando anticorpos monoclonais anti-polipéptido □s anticorpos monoclonais preparados como descrito no Exemplo 6, foram usados para detectar proteínas latentes do vírus do papiloma humano, presentes em tecidos contendo VPH, pelos mesmos processos de análise por imunomanchas Western descritos no Exemplo 5, mas com as excepções aqui notificadas.
Misturou-se uma mancha de nitrocelulose electromanchada e
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-67bloqueada, preparada como no Exemplo 5, com uma solução contendo solução de anticorpos purificada por CLFP, preparada como descrito no Exemplo 6c, diluida a uma concentração de 32 yxg por ml de BLOTTO para 247:4011 ou a uma concentração de 25y^.g por ml de BLOTTO diluído (a 2% de leite) para 235:B9, e manteve-se nessa so lução como previamente descrito para permitir a formação de um produto de imunoreacção. Tal como anteriormente, a mancha foi la. vada e em seguida foi mantida durante 45 minutos numa solução de BLOTTO contendo anticorpos anti-rato de coelho (Cooper Biomedical) diluída a uma concentração de cerca de 1:500 para permitir a formação de um produto de imunoreacção. Em seguida, a mancha foi la. vada em BLOTTO por 3 vezes durante 1, 20 e 20 minutos e em seguida mantida numa solução BLOTTO contendo IgG anti-coelho de cabra conjugado com fosfatase alcalina, como previamente descrito. As lavagens subsequentes e o desenvolvimento foram efectuados como anteriormente.
A imunomancha resultante, apresentada na Figura 4, demons. tra a detecção das proteínas filamentosas de 54 kd e 48 kd em lisatos de células CaSki (lamela 4) usando o anticorpo monoclonal 247:4D11. Também se observou em lisatos de células CaSki uma pro teína especifica de UPH adicional, possuindo um peso molecular de cerca de 58 kd. A proteína de 58 kd crê-se ser um produto do pro cessamento celular (glicosilação) da proteína filamentosa de 54 kd. 0 anticorpo monoclonal 247:4011 também imunoreage com a proteína filamentosa de 54 kd presente em lisatos de células HeLa, mas não imunoreage significativamente com a preparação apresentada de lisatos de células SiHa ou HT-3 (lamelas 2 e 5, respectivamente).
Pelos métodos de análise de imunomanchas acima, demonstroui -se que os anticorpos monoclonais imunoreagem com todas as prote_í nas latentes do vírus do papiloma. Por exemplo, a proteína filamentosa de 54 kd foi detectada por imunomanchas de lisatos de células HeLa, CaSki e SiHa, usando os anticorpos monoclonais 235:B9 ou 247:4D11. A proteína filamentosa de 48 kd foi detectada de forma semelhante em lisatos de células CaSki usando os mesmos anticorpos monoclonais. A proteína nuclear foi detectada por imuno
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-68manchas de lisatos de células CaSki usando o anticorpo monoclonal 245:11E3. A proteína difusa foi detectada por imunomanchas de l_i satos de células HeLa e SiHa, usando os anticorpos monoclonais 235:B9, 238:8E9, 247:10F7 e 247:11D11.
8. Detecção imuno-histoquímica de proteínas latentes do vírus do papiloma
a. Detecção em células de tecido de cultura contendo
VPH
Cultivaram-se as linhas de células de carcinoma cervical HT-3, MS751, C-33A, SiHa, HeLa e CaSki, como descrito no Exemplo 5. Seleccionaram-se culturas de mono-camada semi-confluentes, passaram-se com ΡΒΞ para remover o excesso de meio de cultura e secaram-se ac ar durante 10 minutos. As culturas secas ao ar foram então fixadas inundando a cultura com acetona fria (-20SC) d_u rante 5 minutos. As culturas fixadas foram então mantidas durante cerca de 15 minutos em peróxido de hidrogénio a 3%, seguido de cinquenta imersães rápidas (isto é, mergulhos) em PBS à temperatjj ra ambiente. As culturas foram então mantidas primeiro em ΡΒΞ djj rante 2 minutos e em seguida numa solução de PBS continuamente agitada contendo 8% de soro normal de cavalo e 0,01% de timerosal durante 1 hora à temperatura ambiente para formar amostras com l_o cais de ligação de proteínas não específicas, bloqueados.
As amostras bloqueadas foram mantidas à temperatura ambiente durante 60 minutos com uma solução contendo uma composição de anticorpos anti-péptido para formar um produto de imunoreacção contendo o anticorpo misturado e a amostra bloqueada. Como descrito abaixo, utilizaram-se diversos anticorpos diferentes nestas análises, com diluições diferentes. Em seguida, a amostra imunoreagida foi mergulhada 20 vezes em PBS, mantida durante 2 minutos em PBS (isto é 20 mergulhos mais dois minutos) e este processo foi repetido duas vezes (isto é, num total de 3 vezes, 20 mergulhos cada, mais 2 min.). A amostra foi então mantida numa solução de 0,5% de BLOTTO (0,5% de leite em pó magro, 0,01% de timero sal, 0,025% de antiespuma A em PBS) contendo IgG anti-rato de cavalo, biotinilado (Vector Labs, Burlingame, CA) a uma concentração de 7 ^g por ml, durante 45 minutos à temperatura ambiente, pa
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-69ra permitir a formação de um produto de imunoreacção entre o IgG biotinilado misturado e os anticorpos de rato ligados, presentes na amostra. Em seguida, a amostra foi passada três vezes em PBS, 20 mergulhos de cada vez, mais 2 minutos e em seguida mantida à temperatura ambiente em tampão NHT (NaCl 0,3 M, Hepes 20 mM, pH 6,5, 0,01% de timerosal) contendo avidina D-peroxidase (Vector Labs) a 12 y^g por ml, durante 30 minutos, para permitir ao reagente avidina a formação de um complexo com a biotina presente no segundo produto de imunoreacção. Em seguida, a amostra foi passada três vezes em PBS, 20 imersães de cada vez mais 2 minutos e depois mantida em tampão AEC, preparado por mistura de (l) 4 ml de dimetilformamida contendo 50 mg de aminoetilcarbazole (Sigma), (2) 80 de peróxido de hidrogénio e (3) 200 ml de tampão acetato de sódio 100 mM pH 5,5 durante 10 minutos à temperatura ambieri te para permitir a ocorrência de uma reacção de desenvolvimento de cor na amostra. Após o desenvolvimento, as amostras foram ag_i tadas para remover o excesso de liquido, passadas por água e em seguida mantidas em corante hematoxilina de Mayer (Sigma) durante 3 minutos, seguido de uma passagem com água. A amostra corada foi então montada em 50% de glicerol em água e analisada ao micros cópio.
Os resultados da coloração imuno-histoquímica (imunocoloração) de linhas de células contendo VPH são apresentados na Tabe^ la 6.
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Tabela 6
Imunocoloração de linhas de células de tecidos de cultura contendo VPhF
Linha de células Composição de anticorpos
235:B9
HeLa | + + + |
CaSki | + + + |
SiHa | + + + |
MS751 | + + + |
HT-3 | — |
C33-A | _ _ _ |
245:11E3 247:4011 + + + + +++ +++
--- + + + +++ +++
Determinou-se uma reacção significativa e positiva pela presença do padrão de coloração cor de ferrugem característico (+++), em comparação com a cor azul acinzentado do contra-corante hema^ toxilina gue predomina na ausência de corante peroxidase dependente dos anticorpos (-). Nalguns casos, observou-se uma imuno reacção fraca (+).
anticorpo monoclonal 235:B9 foi feito imunoreagir com a amostra bloqueada usando uma solução contendo anticorpos purificados por CLFP, preparada como descrito no Exemplo 6c, a uma concentração de 25^<g por ml de BLOTTO 0,2% (0,2% de leite em pó magro, 0,01% de timerosal, 0,025% de anti-espuma A em PBS). 0 anticorpo monoclonal 245:11E3 foi feito imunoreagir com a amostra bloqueada usando uma solução de fluido ascite preparada como descrito no Exemplo 6c e diluida a 1:40 em soro normal de ca valo a 10% (10% v/v em PBS). 0 anticorpo monoclonal 247:4011 foi feito imunoreagir com a amostra bloqueada usando uma solução contendo anticorpos purificados por CLFP a uma concentração de 100^ug por ml de soro normal de cavalo a 10%.
Os resultados da Tabela 6 demonstram a capacidade de um anticorpo monoclonal do presente invento imunoreagir com proteínas latentes do VPH num formato de imunocoloração, usando linhas de células infectadas com VPH. A especificidade para as proteí69 303
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-71nas latentes do virus do papiloma é demonstrada pela capacidade destes anticorpos de imunoreagir com células que se sabe conterem VPH (HeLa, CaSki, SiHa e MS75l) mas não com células que não conte nham VPH (HT-3 e C33-A).
b. Detecção de proteínas latentes do vírus do papiloma em amostras de tecido
Obtiveram-se tecidos de biopsia de carcinoma cervical huma no fixados em formamina e embebidos em parafina através do Dr. Ca_r penter (UCSD Medicai Center, San Diego, CA), Dr. 0. Robb (Dept. of Pathology, Green Hospital, La Oolla, CA) e Dr. W. Lancaster (Georgetoiun University Washington, DG). Obtiveram-se manchas de Papanicolaou (pap) através do Dr. 0. Willems (OB/GYN, Scripps Clinic, La Oolla, CA). Estas amostras de tecido foram submetidas ao mesmo procedimento de coloração imuno-histoquímica que o descrito no Exemplo Ba, com as excepções aqui notificadas.
Os tecidos embebidos fixados em formalina foram primeiramente desparafinizados em xileno por 50 imersões seguidas de uma imersão de 2 minutos para formar uma amostra re-hidratada. Em se guida, a amostra re-hidratada foi processada como descrito no Exemplo Ba iniciando com o passo de manter a amostra em solução de peróxido de hidrogénio a 3%.
As superfícies lisas contendo manchas pap foram secas ao ar durante 10 minutos e em seguida fixadas por manutenção em 67% de acetona/33% de metanol durante 10 minutos a -20SC. As manchas pap fixadas foram então processadas como descrito no Exemplo Ba, iniciando com o passo de manter a amostra na solução de peróxido a 3%.
0s resultados da imunocoloração de diversas amostras de tecido de biópsia usando anticorpos monoclonais do presente inven to, são apresentados na Tabela 7.
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-72- | ||||
Tabela 7 | ||||
Imunocoloração de biopsias | de tecido | contendo VPH1 | ||
2 Composição de anticorpos | ||||
NS. | ||||
Tecido Amostras | 235:B9 | 245;11E3 | 247:4011 | |
Mancha pap^ | ||||
Condilomatos o | 3 | 3/3 | N.T. | N.T. |
Não infectado | 1 | o/i | N.T. | N.T. |
Biopsia4 | ||||
Displasia cervical | ||||
VPH tipo 16 | 14 | 14/14 | 14/14 | ll/ll |
VPH tipo 31 | 3 | 3/3 | 2/2 | 2/2 |
VPH tipo 11 | 2 | 2/2 | 0/2 | 0/2 |
Sem tipo | 2 | 2/2 . | N.T. | 1/1 |
Cancro cervical | B | 5/B | 5/0 | 2/2 |
Epitélio normal | 2 | 1/2 | 0/1 | 0/2 |
Epitélio não infectado | 1 | 0/1 | o/i | 0/1 |
1 Os resultados da imunocoloração | são apresentados como | o número | ||
de tecidos que apresentou | um teste positivo | sobre o número to- | ||
tal de amostras testadas. | Contabilizou-se | uma reacção | positiva | |
sempre que a coloração foi | como | descrito na | nota 1 da | Tabela 6. |
2 Os anticorpos monoclonais | 235:B9 | , 245:11E3 | e 247:4011 | foram fe_i |
tos imunoreagir usando as condições descritas na nota 2 da Tabe la 6.
As manchas pap obtidas de pacientes possuindo condilomas cervicais confirmados colposcopicamente foram designadas condilomatjj sas. A mancha pap designada não infectada foi derivada de uma virgem comprovada que se acreditou não apresentar risco de exposição a infecção genital provocada pelo VPH.
As amostras de biopsia incluiram biopsias de displasias cervicais que foram analisadas em relação à presença de um tipo par69 303
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-73ticular de UPH por hibridação de ácido nucleico DeUilliers et al. , Lancet, ii:703 (l987)_7, onde indicado. Analisaram-se biópsias de cancro cervical possuindo estados de UPH desconhec_i dos. Analisaram-se duas biópsias epiteliais de cirurgia, aparentemente normais, possuindo estados de UPH desconhecidos. Obteve-se uma biopsia epitelial de uma fêmea com seis anos de idade que se acreditou não apresentar risco de exposição a infecção genital provocada por UPH.
Os resultados da Tabela 7 demonstram a léculas de anticorpos monoclonais para imunorea latentes do UPH presentes em amostras de tecido amostras apresentaram 100% de reactividade posi gativos, quando se utilizou 235:09 em amostras meios independentes, conterem infecção latente capacidade das mogir com proteínas de biopsia. Estas tiva, sem falsos ne que se sabia, por provocada pelo UPH.
Os resultados da Tabela 7 também demonstram que alguns anticorpos monoclonais têm a capacidade de imunorreagir com uma proteína latente produzida por um tipo VPH mas não outro, i.e., uma molécula de anticorpo específico de tipo. Por exemplo, enquanto o anticorpo monoclonal 235: B9 imunorreagiu por imuno colo ração com os tecidos de displasia do tipo VPH tendo uma designação de tipo 11, 16 ou 31, os anticorpos monoclonais 245:11E7 e 247:4D11 imunorreagiram com as displasias contendo VPH tipo 15 e tipo 31 mas não com as displasias contendo VPH tipo 11.
Adicionalmente, a detecçSo de proteínas latentes do UPH por imunocoloraçSo indica a localização celular das proteínas latentes, proporcionando assim uma caracterização adicional destas proteínas. Por exemplo, o anticorpo monoclonal 247:4011 produziu um padrão de imunocoloração em células CaSki ou em vários tecidos de biopsia contendo UPH que foi distribuído sobre os componentes da célula associados ao filamento citoplasmático. Assim, as proteínas de 46 kd, 54 kd e 58 kd, detectadas por imunomanchas com o anticorpo monoclonal 247:4D11, como mostrado no Exemplo 7, foram ainda caracterizadas como sendo proteínas latentes do tipo filamentoso com base na sua distribuição em células imunocoradas. Observou-se um padrão de coloração filamentoso semelhante usando o anticorpo monoclonal 235:B9 para imunocorar manchas pap, amostras de biopsia e células de cultura de tecidos contendo UPH.
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-74/7 // anticorpo monocional 245:11E3 produziu um padrão de imu nocoloração carac terístico err. células CaSki, que se encontrava l.o calizado nos núcleos. Assim, a proteína de 51 kd, detectada por imunomanchas com este anticorpo monocional, como descrito no Exem pio 7, foi ainda caracterizada cama sendo uma proteína latente do tipo nuclear.
Os anticorpos monoclonais 238:8E9, 247:10F7 e 247:11011 produziram um padrão de imunocoloração característico em células HeLa e células SiHa que se localizava, de uma maneira difusa em torno quer dos núcleos quer do citoplasma das células coradas.
Uma vez que estes anticorpos monoclonais detectaram a proteína l_a tente de 112 kd na análise de imunomanchas descrita no Exemplo 7, esta proteína foi ainda caracterizada como sendo uma proteína latente difusa.
9. Detecção de anticorpos anti-proteína latente do VPH no sangue humano
Os antisoros de pacientes diagnosticados como possuindo uma infecção latente provocada pelo VPH, na forma de lesães de con diloma histologicamente confirmadas, foram obtidos através dos Drs. R. Robb e 0. Willems (Scripps Clinic, La Uolla, CA).
Seguindo um processo ELISA semelhante ao descrito no Exejn pio 3, estes antisoros foram avaliados em relação à sia capacidade de ligar os polipéptidos 237, 245 e 246 com as excepçães que se anotam em seguida.
Adicionaram-se cinquenta ^1 de solução de revestimento contendo 1 /tg de polipéptido 237, 245 ou 246 às cavidades de uma placa de microtítulo e manteve-se a 49C durante a noite para permitir a adsorção do polipéptido às paredes das cavidades. Seguidamente, as cavidades foram lavadas como anteriormente e bloqueadas por adição e manutenção de tampão SNC (10% de soro normal de cabra em P8S) durante 90 minutos a 37SC. As cavidades foram então esvaziadas por inversão e agitação para remover o excesso de líquido e foram secas a 379C durante 1 hora para originar placas secas.
Adicionou-se a cada cavidade cem y/L de solução contendo
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antisoro de paciente diluído em tampão SNC para formar uma mistura de imunoreacção e essa mistura foi mantida a 379C durante 1 h_o ra para permitir que os anticorpos no antisoro imunoreagissem com os polipéptidos adsorvidos nas paredes das cavidades, formando um produto de imunoreacção contendo polipéptido. As cavidades foram então lavadas 5 vezes com PBS-T (0,5/° de Ttueen 20 em PBS) para r_e mover o antisoro não ligado e o excesso de líquido foi removido por agitação.
Adicionaram-se a cada cavidade cem 1 de uma solução contendo conjugado IgA monoclonal anti-imuno globulina humana, marcado com cocleária peroxidase (Banssen, Piscataiuay, Nd) diluído 1:5000 em tampão SNC e manteve-se durante 1 hora a 379C para permitir a formação de um segundo produto de imunoreacção entre os anticorpos humanos ligados e o conjugado marcado adicionado. A solução adicionada foi então removida, as cavidades foram lavadas como anteriormente e o excesso de líquido foi removido por agitação.
Preparou-se de fresco uma solução de substrato peroxidase misturando (l) 50 ml de tampão de desenvolvimento /~ècido cítrico 0,12 M, fosfato de sódio dibásico 0,26 M (pH 5,0)_/, (2) 1 ml de OPD (l mg de ortofenilenodiamina por ml de água) e (3) 25 yx.1 de peróxido de hidrogénio a 30/. Adicionaram-se então cem y*l da solução de substrato peroxidase a cada uma das cavidades para formar uma mistura reveladora de cor. Depois de manter a mistura rj3 veladora de cor no escuro durante 20 minutos à temperatura ambie_n te, a D.0. da mistura reaccional foi medida usando um dispositivo de leitura múltipla equipado com um filtro de 492 nm.
Os antisoros de 6 pacientes condilomatosas diferentes, quando testados pelo processo ELISA acima, demonstraram níveis elevados de moléculas de anticorpos para a imunoglobulina IgA que imunoreagiram com os polipéptidos 237, 245 e 246. Em contraste, os antisoros de três pacientes de controlo saudáveis não imunorea giram com os polipéptidos 237, 245 ou 246. Além disso, o antisoro de um paciente com condiloma do VPH tipo 11 não imunoreagiu com nenhum dos polipéptidos.
antisoro de um paciente portador de VPH foi também de69 303
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íí monstrado imunoreagir com proteínas latentes do VPH usando um formato de imunomanchas.
antisoro que imunoreagiu no formato ELISA acima, usando o polipéptido 245, foi isolado por afinidade como descrito no Exemplo 4. 0 antisoro anti-polipéptido 245 isolado por afinidade (anti-245 IA) foi então utilizado na análise de imunomanchas descrita no Exemplo 5, em manchas que continham lisatos celulares preparados a partir de células CaSki, SiHa, HeLa, C-33A e HT-3 quando esta análise de imunomanchas foi conduzida usando anticorpos IgA monoclonais anti-imunoglobulina humana, marcados com fosfatase alcalina, em vez de anticorpos IgG anti-coelho de cabra, como descrito para imunomanchas no Exemplo 5. Detectou-se uma proteína latente do VPH de 58 kd paenas nos lisatos de células CaSki. Estes resultados indicam que a presença de anticorpos humanos anti-protelna latente do VPH pode ser demonstrada usando o formato de imunomanchas.
10. Isolamento de uma proteína latente do vírus do papiloma
Dispersaram-se cem mg de esferas Macrosphere Amino de 300 A (Alltech Associates, Deerfield, IL) em 15 ml de tampão fosfato 50 mM (pH 7,0) e a dispersão foi desgaseifiçada. As esferas foram recolhidas da dispersão desgaseificada, por centrifugação e o pelete resultante foi recuperado e re-suspendido em 13,5 ml de tampão fosfato 50 mM (pH 7,5) para formar uma suspensão de esferas desgaseificada. Adicionaram-se com agitação, 1,5 ml de gluta^ raldeldo aquoso a 25% (FM Science, Cherry Hill, NJ) e continuou-se a agitação durante 3 minutos para formar esferas acopladas a glutaraldeído. Adicionou-se então água às esferas acopladas, com agitação, para levar o volume final a 50 ml e as esferas foram eri tão recolhidas por centrifugação e lavadas em 50 ml de água por três vezes, para formar esferas activadas.
Diluíu-se uma dada quantidade de antisoro de coelho anti-polipéptido 236, preparado como descrito no Exemplo 2c e contendo cerca de 500 mg de proteína total, com um volume igual de PBS e centrifugou-se a 12 000 rpm a 4SC durante 15 min num rotor 0A69 303
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-200 (Beckman). 0 sobrenadante resultante Foi extractado com um volume igual de clorofórmio e a fase aquosa foi dialisada durante a noite contra tampão A (Tris-HCl 100 mM, pH 8,0) para formar antisoro de coelho dialisado.
Aplicaram-se cerca de 9 ml de antisoro de coelho dialisado numa coluna PD-10 (Pharmacia Fine Chemicals, Piscatau/ay, N.0.) previamente equilibrado com 25 ml de tampão A. Rejeitaram-se os primeiros 25 ml de eluente que saíram da coluna e guardou-se a por ção restante. Seguidamente adicionaram-se quatro ml de tampão A à coluna e o eluente resultante foi novamente guardado e misturado com o eluente previamente guardado. A mistura foi passada através de um filtro acrodisco de nitrocelulose de 0,2 yx-(Gelman Sciences, Ann Arbor, Ml) para formar um antisoro de coelho filtra do.
antisoro de coelho filtrado foi aplicado a uma coluna de permuta aniónica Mono Q equipada num aparelho CLFP automatizado (Pharmacia) usando tampão A como tampão equilibrante. A coluna foi então lavada em tampão A e aplicou-se então um gradiente de eluição compreendendo um gradiente de 0-30/ de tampSo B (NaCl 0,5 M em tampão A). As fracções eluídas por gradiente resultantes foram analisadas em relação à imunoreactividade de anticorpos anti-polipéptido como medida no teste ELISA descrito no Exemplo 3 e as fracções contendo anticorpos foram reunidas para formar uma s_o lução de anticorpos anti-polipéptido 236 purificada por CLFP (anti-236 CLFP).
Misturou-se um ml de anti-236 CLFP determinado por D.0.
280 para ter uma concentração de 6 mg/ml, com 10 mg de esferas activadas e a mistura foi mantida a 4SC durante 60 minutos com agitação contínua. Seguidamente, as esferas agitadas foram isola das das moléculas de anticorpos não ligadas, por centrifugação, re-suspendidas em 1 ml de tampão glicina 1 M (pH 7,0) e mantidas durante 30 minutos à temperatura ambiente para bloquear o excesso de locais activos presentes nas esferas. As esferas bloqueadas foram então isoladas do tampão glicina por centrifugação para for, mar esferas conjugadas com anti-236.
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-78As esferas conjugadas com anti-236 foram lavadas primeiro com 1 ml de tampão citrato 5 mM, pH 3,0 para eluir o excesso de glicina e foram então lavadas duas vezes em 1 ml de PBS e em seguida 2 vezes em tampão RIPA (preparado por mistura de 2 ml de nonidet P-40 (NP40), 2 g de desoxicolato de sódio, 0,2 g de SDS, ml de EDTA 0,5 M e PBS suficiente para perfazer um volume final de 200 ml) para formar esferas conjugadas com anti-236, equilibrei das.
Preparou-se um pelete de 0,12 g de células HeLa compactas como descrito no Exemplo 5, congelou-se a -709C, descongelou-se e suspendem-se então em 1 ml de tampão RIPA. A suspensão de células HeLa foi então agitada por três pancadas num almofariz num homogeneizador dounce e a suspensão agitada foi centrifugada a 12 000 xg durante 15 minutos numa microcentrifuga. 0 sobrenadante resultante foi recolhido e misturado com esferas conjugadas com anti-236 equilibradas e a mistura foi mantida durante 2 horas a ABC sob agitação contínua para permitir a formação de um produto de imunoreacção entre os anticorpos conjugados e a proteína l_a tente difusa do vírus do papiloma. A mistura foi então colocada numa coluna e as esferas contidas na mistura foram lavadas por passagem da coluna com 1 ml de tampão RIPA, 1 ml de tampão L8 (0,2 de NP 40, Tris-HCl 20 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM), 1 ml de HCI 1 M e 1 ml de CaCl^ 2,5 mM em 5% de PBS. A coluna lavada, adicionaram-se então 200^/1 de citrato de sódio 50 mM, pH 3,0 e recolheu-se o eluente. Adicionou-se tampão fosfato de sódio 1 M (pH 7,5), ao eluente, em quantidade suficiente para neutralizar o tampão c_i trato a cerca de pH 7,0 e o eluente neutralizado foi então misturado com ácido tricloroacético a 100% suficiente para atingir 15% de ATOA de forma a precipitar as proteínas presentes no eluente.
precipitado de proteínas foi recolhido e lavado com acetona e as proteínas foram então re-suspendidas em SB e analisadas por DSS-PAGE como descrito no Exemplo 5.
A análise DSS-PAGE das proteínas lavadas com acetona isoladas de células HeLa demonstrou uma proteína possuindo um peso molecular aparente de cerca de 112 kd que imunoreagiu no teste de imunomanchas com o antisoro de coelho anti-245, preparado no Exem
303 EPG:11-SCRE
155.1
í.>
-79plo 2c.
11. Detecção de moléculas de anticorpo anti-proteína latente do VPH usando polipéptidos em série relacionados com VPH tipo 16
Os polipéptidos apresentados na Tabela 2 e os polipéptidos 245 e um polipéptido de controlo 65, foram utilizados num tes. te ELISA semelhante ao descrito no Exemplo 9, para detectar moléculas de anticorpos anti-proteína latente do VPH, com as excepções que se notificam a seguir.
Adicionaram-se cinquenta de uma solução de revestimento contendo polipéptido às cavidades de uma placa de microtltulo com 96 cavidades de fundo plano (immunolon II, Dynatech, Chantilly, VA) de forma a cada cavidade conter 1 yxg de apenas um dos polipéptidos apresentados na Tabela 8. As cavidades foram mantidas, lavadas e bloqueadas como anteriormente. As placas foram então secas como anteriormente e seguidamente adicionaram-se, a cada ca vidade, 100 yxl de soro de paciente diluído l/lO em tampão NGS, p£ ra formar uma mistura de imunoreacção que foi mantida e depois l_a vada como anteriormente.
produto de imunoreacção foi detectado usando um conjuga do IgA anti-humano monoclonal marcado com cocleária peroxidase (Janssen) diluído 1:3000 em NGS, como anteriormente. Preparou-se da mesma forma uma segunda série de cavidades com a excepção de o conjugado marcado ser anti IgG (Ortho Diagnostics, Ontario, Canada) , em vez de IgA. Mediu-se a densidade óptica da mistura reaccional corada resultante a cerca de 490 nm (DO^^g) e as medições são apresentadas na Tabela 8.
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-80Tabela 8
Imunoreacção de antisoro de paciente infectado com VPH com polipéptidos de VPH tipo 16
N°. | Sequência de polipéptidos | Paciente N9. | |||
1 | 2 | ||||
IqA | IqG | IqA | IqA | ||
653 | SSEWQRDQFLSQV 0,077 | 0,028 | 0,081 | 0,038 | |
66 | SSTWHWTGHNVKHKSAIVTLTYD | 0,129 | 0,049 | 0,149 | 0,060 |
245 | HKSAIVTLTYDSEWQRDQC | 0,343 | 0,041 | 0,308 | 0,911 |
71 | HKSAIVTLTYDSEWQRDC | 0,307 | ND2 | 0,280 | ND |
72 | HKSAIVTLTYDSEWQRC | 0,126 | ND | 0,120 | ND |
73 | HKSAIVTLTYDSEWQC | 0,421 | 0,040 | 0,329 | 1,012 |
74 | HKSAIVTLTYDSEWC | ND | 0,082 | 0,436 | 0,863 |
75 | HKSAIVTLTYDSEC | ND | 0,032 | 0,396 | 1,361 |
79 | KSAIVTLTYDSEWQRDQC | 0,201 | 0,021 | 0,178 | 0,386 |
80 | SAIVTLTYDSEWQRDQC | 0,36 0 | 0,020 | 0,365 | 0,796 |
81 | AIVTLTYDSEWQRDQC | 0,303 | 0,031 | 0,283 | 0,287 |
82 | IVTLTYDSEWQRDQC | 0,252 | 0,045 | 0,251 | 0,066 |
83 | VTLTYDSEWQRDQC | 0,123 | 0,041 | 0,189 | 0,065 |
84 | TLTYDSEWQRDQC | 0,090 | 0,032 | 0,092 | 0,049 |
85 | LTYDSEWQRDQC | 0,123 | 0,034 | 0,083 | 0,066 |
Branco^ | 0,014 | ND | 0,010 | 0,028 | |
1 | Branco indica que se adicionou | tampão SGN | em vez | de um | poli- |
péptido.
ND indica não determinado.
polipéptido 45 é um polipéptido controlo cuja sequência foi descrita por Schoolnick et al. , na Requisição publicada NQ. EPO 0257754A2.
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-810s resultados na Tabela 8 mostram que todos os polipéptidos que incluiam quer a sequência -LTYDSF- quer, no caso do polipéptido 66, a sequência -HKSAIVTLTYD-, imunoreagiram mais fortemente com IgG ou IgA, presente no antisoro do paciente, que o péptido de controlo 65. 0 paciente 1 foi diagnosticado como possuijn do uma infecção latente por UPH tipo 18 e o paciente 2 foi histologicamente confirmado como tendo carcinoma celular escamoso do cérvix.
Fstes resultados mostram que o antisoro de um paciente in fectado com VPH imunoreage com os polipéptidos relacionados com o VPH tipo 16. Os resultados demonstram que a imunoreacção depende da presença de -LTYDSE- ou, no caso do polipéptido 66, de um epitopo menos bem caracterizado.
12. Determinação do epitopo de ligação para um anticorpo monoclonal anti-polipéptldo de VPH anticorpo monoclonal 245:11E3 foi analisado em relação à sua capacidade de imunoreagir com os polipéptidos relacionados com o VPH tipo 16, segundo um processo ELISA em fase sólida, seme lhante ao descrito no Exemplo 3, com as excepçães que se notificam em seguida.
Os polipéptidos apresentados na Tabela 9 foram adsorvidos nas paredes de cada uma das cavidades de uma placa de microtltulo de 96 cavidades (uma espécie de polipéptido par cavidade) e em se guida as cavidades foram bloqueadas com tampão SNC (soro normal de cavalo a 10% em PBS), em vez de solução bloqueadora. Em segui, da, adicionaram-se 50 1 de anticorpo monoclonal 245:11E3 diluído em série em duas diluiçães usando tampão SNC, a cada cavidade bl_o queada. A mistura foi mantida como anteriormente e formou-se um produto de imunoreacção. 0 produto de imunoreacção ligado à fase sólida foi detectado usando o conjugado IgG anti-rato de cabra, como descrito no Exemplo 6a e os resultados apresentados na Tabela 9 são expressos como titulo necessário para obter 50% da D.O. máxima a 415 nm.
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-82Tabela 9
Esquema dos epitopos de Mab 245:11E3
NS. | Sequência peptídica | Titulo |
235 | MADPAGTNGEEGTGC | <1:8 |
2 37 | TYDSEWQRDQFLSQVKIPC | 1:512 |
245 | HKSAIVTLTYDSEWQRDQC | 1:512 |
74 | HKSAIVTLTYDSEWC | 1:512 |
75 | HKSAIVTLTYDSEC | 1:512 |
76 | HKSAIVTLTYDSC | 1:256 |
77 | HKSAIVTLTYDC | 1:120 |
70 | HKSAIVTLTYC | <1:0 |
Os resultados na Tabela 9 indicam que o epitopo para o p.o lipéptido relacionado com o VPH tipo 16 ligado ao anticorpo monoclonal 245:11E3, inclui a sequência de resíduos de aminoácidos -TYDSE-.
13. Detecção de moléculas de anticorpos anti-protelna latente do VPH no sangue humano, usando uma combinação de polipéptidos relacionados com o VPH tipo 16
Os polipéptidos, relacionados com o VPH tipo 16, 237, 245 e 246 foram incluídos num teste ELISA semelhante ao descrito no Exemplo 9, para detectar moléculas de anticorpos anti-protelna latente do VPH no sangue de pacientes, com as excepções a seguir notificadas.
antisoro foi obtido de 46 pacientes diagnosticados como possuindo infecçães latentes provocadas pelo VPH, na forma de diversas lesões de condiloma ou graus de displasia cervical, confir mados histologicamente como indicado na Tabela 10. Estes antisoros foram, cada um, adicionados a cavidades individuais possuindo adsorvidos os polipéptidos 237, 245 ou 246 e foram testados como descrito no Exemplo 9, reiativamente à presença de moléculas de anticorpos anti-protelna latente do VPH (imunoglobulina IgA),cap zes de imunoreacção com os polipéptidos relacionados com o VPH t po 16. Os resultados são apresentados na Tabela 10.
Ih· |ω
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Tabela 10
Detecção de IgA de paciente que imunoreage com polipéptidos do VPH tipo 161 | |||||
Paciente | 2 | ||||
Número | 2 37 | 245 | 246 | Branco | Histoloqia |
1 | 0,441 | 0,550 | 0,273 | 0,159 | Cancro SC Grau 2/3 |
2 | 0,273 | 0,413 | 0,144 | 0,066 | CIN2 |
3 | 0,148 | 0,243 | 0,095 | 0,050 | CIN3 |
4 | 0,091 | 0,211 | 0,066 | 0,026 | Biopsia uterina negativa |
5 | 0,155 | 0', 333 | 0,099 | 0,061 | CIN2 |
6 | 0,281 | 0,349 | 0,307 | 0,070 | CIN3 |
7 | 0,150 | 0,198 | 0,111 | 0,133 | CIN2 |
8 | 0,157 | 0,227 | 0,077 | 0,031 | +/- CIN1 |
9 | 0,279 | 0,615 | 0,278 | 0,119 | CIN1 |
10 | 0,271 | 0,290 | 0,152 | 0,073 | +/- CIN1 |
11 | 0,196 | 0,228 | 0,08 3 | 0,011 | CIN3 |
12 | 0,332 | 0,271 | 0,057 | 0,058 | CIN2 |
13 | 0,528 | 0,608 | 0,311 | 0,041 | CIN1 |
14 | 0,352 | 0,431 | 0,253 | 0,068 | CIN2 |
15 | 0,32 0 | 0,318 | 0,224 | 0,048 | CIN2 |
16 | 0,947 | 1,052 | 0,393 | 0,048 | CIN3 |
17 | 0,159 | 0,588 | 0,064 | 0,008 | CIN3 |
18 | 0,136 | 0,477 | 0,078 | 0,026 | CIN2 |
19 | 0,181 | 0,390 | 0,198 | 0,034 | CIN3+AM |
20 | 0,515 | 0,639 | 0,299 | 0,096 | CIN2 |
21 | 0,232 | O,2B1 | 0,138 | 0,02 3 | CIN3 |
22 | 0,105 | 0,271 | 0,105 | 0,022 | CIN3 |
23 | 0,517 | 0,539 | 0,134 | 0,120 | CIN1 |
24 | 0,101 | 0,128 | 0,037 | 0,065 | +/- CIN1 |
25 | 0,515 | 0,654 | 0,285 | 0,187 | CIN2 |
26 | 0,349 | 0,525 | 0,254 | 0,146 | CIN2 |
27 | 0,102 | 0,207 | 0,068 | 0,054 | Cancro SC microinvasivo |
28 | 0,035 | 0,067 | 0,026 | 0,026 | MALE LAB WORKER |
29 | 0,080 | 0,078 | 0,018 | 0,027 | Í.TAEE LAB WORKER |
30 | 0,101 | 0,142 | 0,107 | 0,029 | CIN1 |
31 | 0,052 | 0,007 | 0,024 | 0,011 | Lesão OB/GIN não visivel |
32 | 0,005 | 0,072 | 0,107 | 0,000 | Lesão OB/GIN não visível |
33 | 0,026 | 0,050 | 0,000 | 0,000 | Verruga OB/GIN visível |
34 | 0,000 | 0,027 | 0,000 | 0,012 | CIN1 |
35 | 0,02 0 | 0,598 | 0,02 3 | 0,02 3 | Lesão OB/GIN não visivel |
36 | 0,174 | 0,243 | 0,022 | 0,048 | CIN2 |
37 | 0,017 | 0,066 | 0,000 | 0,027 | +/- COMI |
38 | 0,177 | 0,361 | 0,136 | 0,098 | CIN2 |
39 | 0,216 | 0,437 | 0,108 | 0,037 | CIN2 |
40 | 0,186 | 0,211 | 0,145 | 0,046 | CIN2 |
41 | 0,046 | 0,141 | 0,024 | 0,037 | Verruga OB/GIN visível |
42 | 0,000 | 0,042 | 0,000 | 0,019 | Verruga OB/GIN visível |
43 | 0,073 | 0,211 | 0,064 | 0,054 | Lesão OB/GIN não visivel |
44 | 0,074 | 0,114 | 0,08 3 | 0,023 | Verruga OB/GIN visível |
45 | 0,007 | 0,059 | 0,04 0 | 0,044 | Verruga OB/GIN visivel |
46 | 0,000 | 0,057 | 0,000 | 0,034 | Verruga OB/GIN visivel |
00 | 0,012 | 0,000 | 0,000 | 0,000 | Sem adição de soro |
00 | 0,000 | 0,000 | 0,012 | 0,003 | Sem adição de soro |
00 | 0,006 | 0,010 | 0,019 | 0,019 | Sem adição de soro |
303
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Os resultados são expressos como para as cavidades possuindo polipéptido 237, 245 ou 246 adsorvido por cavidade e ta_m bém para as cavidades controlo que não possuem polipéptido adsorvido (Branco).
A histologia é referida para cada doador de antisoro. CEN indi. ca neoplasia cervical intraepitelial. CIN fronteira, (+/-CIN ) comporta usualmente VPH de algum tipo, CINl representa displasia suave, CIN2 representa displasia moderada e CIN3 representa dis. plasia severa ou carcinoma in situ antes da penetração na camada de células basais. Apresentam-se também outras caracterizações histológicas.
Os resultados apresentados na Tabela 10 indicam que os p_a cientes portadores de infecções latentes pelo VPH e que exibem di. ferentes estágios de displasia ou condiloma cervical, contêm no seu sangue moléculas de anticorpos IgA que imunoreagem não só com um, mas com diversas espécies diferentes de polipéptido relacionado com VPH tipo 16.
Assim, o presente invento contempla o uso de diferentes espécies de polipéptido cujas sequências sejam todas deduzidas de um tipo de VPH, em combinações umas com as outras. Estes difere_n tes polipéptidos podem ser incluídos em cavidades separadas do teste ELISA ou estojo de diagnóstico praticado, como acima, ou pçi dem ser combinados em conjunto e adsorvidos num único suporte sólido, como uma só cavidade. Uma combinação preferida inclui os polipéptidos 237, 245 e 246 em cavidades separadas de uma única placa de microtítulo.
14. Detecção de moléculas de anticorpos anti-prcteína latente do VPH no sangue humano, usando uma combinação de polipéptidos específicos, cada um, para um dado tipo de VPH
Os painéis de antisoro obtidos de pacientes possuindo infecções latentes provocadas pelo VPH, diagnosticadas histologicamente a diversos graus de displasia, foram analisados num teste
ELISA semelhante ao descrito no Exemplo 9 com as excepções que
303
EPG:11-SCRF 155.1
-85se seguem.
Adicionaram-se cinquenta ^1 de solução de revestimento, c_o mo controlo contendo 1 ^ug de qualquer dos péptidos K69, K70, K72 ou 245 ou contendo 1^g de VP (viriães purificados do vírus do pa piloma, isolados por processos virológicos padrão de verrugas de alce contendo proteínas do virião do vírus do papiloma, conservadas) às cavidades de uma placa de microtítulo de fundo plano com 96 cavidades (Costar, Cambridge, MA) e manteve-se como anteriormente para dsorver o material adicionado às paredes das cavidades. As cavidades foram bloqueadas usando tampão SNH em vez de tampão SNG. Em seguida, adicionaram-se a cada cavidade 50 1 de soro de paciente diluído 1:20 em tampão SNH para formar uma mistura de imunoreacção e a mistura foi mantida a 37SC durante 2 horas para permitir a formação de um produto de imunoreacção contendo polipéptido .
Adicionaram-se a cada cavidade cinquenta de uma solução contendo conjugado de imunoglobulina IgA anti-humana policlonal purificada por afinidade, marcada com fosfatase alcalina (Dakopatts, Copenhagen, Denmark) diluída 1:800 em tampão SNH e manteve-se durante 2 horas a 379C para permitir a formação de um produto de imunoreacção entre os anticorpos humanos ligados e o conjugado marcado adicionado. A solução adicionada foi então removida, as cavidades foram passadas como anteriormente usando ta_m pão SNH e o excesso de liquido foi removido por agitação.
Adicionaram-se então, cinquenta y^l de uma solução de subs trato PNPP /~f os f at° de p-nitrofenilo; SIGMA Chemical Corp. St. Louis, M0; a uma concentração de 1 mg por ml de tampão dietanolamina, 9,B% (v/v), pH 9,5, contendo 0,01% de MgCl__7 a cada uma das cavidades para formar uma solução de desenvolvimento de cor. Após manter a mistura durante 45 minutos à temperatura ambiente, a D.0. da solução foi medida usando uma placa de leitura de análi. se múltipla, equipada com um filtro de 405 nm.
Os resultados da medição das moléculas de anticorpo de imunoglobulina IgA são apresentados na Tabela 11.
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-86Tabela 11
Detecção de tipo específico de IgA em antisoro de paciente infectado com VPH //
Polipéptido específico para tipo Paciente de VPH_
Número | His toloqia^ | 2 PV | 163 | 6\ | 185 | 33é |
1 | Cancro SC | 0 | 0,614 | 0 | 0 | 0,025 |
2 | CIN2 | 0 | 0,277 | N.D. | 0 | 0,005 |
3 | CIN3 | 0,128 | 0,622 | 0,134 | 0 | 0,057 |
4 | Normal | 0,048 | 0,154 | 0,052 | 0 | 0,037 |
6 | CIN3 | 0,071 | 0,638 | 0,182 | 0 | 0,153 |
7 | CIN2 | 0 | 0,018 | 0 | 0 | 0,005 |
8 | +/- CIN | 0,045 | 0,273 | 0,016 | 0 | 0,049 |
10 | +/- CIN | 0,057 | 0,696 | 0,099 | 0 | 0,046 |
11 | CIN3 | 0 | 0,086 | 0 | 0 | 0 |
12 | CIN2 | 0 | 0,524 | 0 | 0 | 0,027 |
13 | CIN1 | 0 | 0,156 | 0,014 | 0 | 0,039 |
14 | CIN2 | 0,02 3 | 0,462 | 0,115 | 0 | 0,072 |
15 | CIN2 | 0 | 0,358 | 0,110 | 0 | 0,070 |
17 | CIN3 | 0,012 | 0,088 | 0,050 | 0 | 0,02 3 |
18 | CIN2 | 0 | 0,362 | 0,026 | 0 | 0,003 |
20 | CIN2 | 0,020 | 0,342 | 0,079 | 0,052 | 0,064 |
21 | CIN3 | 0,036 | 0,143 | 0,017 | 0 | 0,022 |
22 | CIN3 | 0,008 | 0,046 | 0,035 | 0 | 0,026 |
24 | +/- CIN | 0,029 | 0,277 | 0 | 0 | 0 |
26 | CIN2 | 0,030 | 0,368 | 0,220 | 0 | 0,153 |
27 | Cancro SC | 0,082 | 0,439 | 0 | 0 | 0,034 |
28 | N.D. | 0,142 | 0,071 | 0,037 | 0 | 0,008 |
30 | CIN1 | 0,038 | N.D. | 0,080 | 0 | 0,049 |
31 | Normal | 0,003 | 0,007 | 0,041 | 0,010 | 0,024 |
32 | Normal | 0,056 | 0,089 | 0,077 | 0,038 | 0,020 |
33 | Verruga genital | 0,028 | 0,071 | 0 | 0 | 0,028 |
34 | CIN1 | 0,010 | 0,022 | 0,083 | 0 | 0,060 |
36 | CIN2 | 0,151 | 0,041 | 0,077 | 0,415 | 0,064 |
37 | +/- CIN | 0,088 | 0,104 | 0,073 | 0 | 0,058 |
38 | CIN2 | 0,040 | 0,495 | 0,010 | 0 | 0,218 |
39 | CIN2 | 0,006 | 0,304 | 0 | 0 | 0,047 |
40 | CIN2 | 0,032 | 0,301 | 0,017 | 0 | 0,006 |
42 | Verruga genital | 0,030 | 0,108 | 0,04 3 | 0 | 0,017 |
43 | Normal | 0,011 | 0,026 | 0,003 | 0 | 0 |
44 | Verruga genital | 0,011 | 0,064 | 0,036 | 0 | 0,023 |
45 | Verruga genital | 0,018 | 0,04 0 | 0,030 | 0,007 | 0,021 |
47 | Mononucleose | 0,004 | 0,071 | 0,04 3 | 0 | 0,037 |
54 | Cancro SC | 0,064 | 0,384 | 0 | 0 | 0,036 |
61 | UVI | 0,037 | 0,569 | 0,297 | 0 | 0,168 |
62 | Glaucoma | 0 | 0,084 | 0,041 | 0 | 0 |
63 | N.D. | 0,052 | 0,198 | 0,035 | 0 | 0,038 |
64 | Convulsães | 0 | 0,189 | 0 | 0 | 0 |
65 | N.D. | 0,003 | 0,050 | 0,031 | 0 | 0,068 |
66 | CIN1 | 0,009 | 0,026 | 0,046 | 0 | 0,028 |
67 | CIN1 | 0,059 | 0,267 | 0,001 | 0 | 0,018 |
68 | N.D. | 0,011 | 0,060 | 0,039 | 0 | 0,029 |
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-87Tabela 11 (continuação)
69 | N.D. | 0 | 0,030 | 0,050 | 0 | 0,056 | |
70 | CIN2 | 0,021 | 0,030 | 0,04 3 | 0 | 0,04 3 | |
71 | Verrugas vaginais | 0,016 | 0,029 | 0,052 | 0 | 0,029 | |
72 | +/- CIN | 0,086 | 0,066 | 0,076 | 0 | 0,025 | |
73 | N.D. | 0,038 | 0,059 | 0,045 | 0 | 0,037 | |
74 | Normal | 0,002 | 0,017 | 0,066 | 0 | 0,042 | |
75 | Metaplasia | 0,042 | 0,096 | 0,265 | o, | 0001 | 0,115 |
76 | CIN 2-3 | 0,02 0 | 0,070 | 0,058 | 0 | 0,030 | |
77 | CIN1 | 0 | 0,022 | 0 | 0 | 0,046 | |
78 | CIN2 | 0,004 | 0,040 | 0,035 | 0 | 0,08 0 | |
79 | Doença autoimune | 0,013 | 0,454 | 0 | 0 | 0 | |
80 | Pulso fixo | 0 | 0,2 38 | 0 | 0 | 0,017 | |
Bl | N.D. | 0,022 | 0,219 | 0,026 | 0, | 004 | 0,058 |
82 | Diabetes juvenis | 0,009 | 0,346 | 0 | 0, | 007 | 0 |
83 | Migraine | 0 | 0,131 | 0 | 0, | 026 | 0 |
84 | 5 inuitis | 0,027 | 0,315 | 0 | 0 | 0 | |
85 | N.D. | 0 | 0,035 | 0,012 | 0 | 0,040 | |
86 | N.D. | 0,640 | 0,364 | 0 | 0 | 0 | |
87 | N.D. | 0,014 | 0,069 | 0,040 | 0 | 0,061 | |
88 | N.D. | 0,019 | 0,067 | 0,028 | 0 | 0,038 | |
89 | N.D. | 0,028 | 0,056 | 0,029 | 0 | 0,022 | |
90 | N.D. | 0,007 | 0,086 | 0,35 | 0 | 0,057 | |
91 | N.D. | 0,002 | 0,100 | 0,39 | 0 | 0,023 | |
92 | N.D. | 0,067 | 0,106 | 0,720 | 0 | 0,032 | |
93 | N.D. | 0,045 | 0,052 | 0,132 | 0 | 0,054 | |
94 | N.D. | 0,031 | 0,082 | 0,076 | 0 | 0,054 |
A histologia é referida para cada doador de antisoro como na njg ta 2 da Tabela 10.
VP são os viriães do papiloma controlo isolados de verrugas de alce.
indica que □ polipéptido 245 incluido na cavidade, possuia uma sequência deduzida do VPH tipo 16.
indica que o polipéptido K70 foi incluído na cavidade e pojs suia uma sequência deduzida do VPH tipo 6.
1Θ indica que o polipéptido K69 foi incluído na cavidade e possuía uma sequência deduzida do VPH tipo 18.
indica que o polipéptido K72 foi incluido na cavidade e po.s suia uma sequência deduzida do VPH tipo 33.
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-88Os resultados na Tabela 11 mostram que os pacientes porta dores de diversas infecçães latentes de VPH contêm no seu sangue moléculas de anticorpos de imunoglobulina IgA que imunoreagem pre ferencialmente com um e não com outro polipéptido relacionado com o VPH de um dado tipo. Por exemplo, o paciente 1 é um indivíduo infectado com VPH tipo 16 confirmado, como determinado usando V_i raType DNA Typing Kit (Molecular Diagnostics, Gaithersburg, MD) e o seu sangue continha moléculas de anticorpos IgA que imunoreagem substancialmente com polipéptido 245 relacionado com VPH tipo 16 e imunoreagem apenas num pequeno grau com polipéptido K72 relacio nado com VPH tipo 33. 0 paciente 36 continha no seu sangue molécu las de anticorpos IgA que imunoreagem preferencialmente com polipéptido K69 relacionado com VPH tipo 18. Os pacientes 75 e 92 continham no seu sangue moléculas de anticorpos IgA que imunoreagem preferencial mente com polipéptido K70 relacionado com VPH tipo 6.
Os resultados na Tabela 11 demonstram uma concretização do presente invento em que os polipéptidos relacionados com VPH, cujas sequências de resíduos de aminoácidos são deduzidas a partir de diferentes tipos de VPH, podem ser usados para detectar e distinguir, de maneira especifica para cada tipc, moléculas de a_n ticorpos que são induzidas por um dado tipo de VPH mas não por ojj tro. Os polipéptidos específicos para um dado tipo relacionados com VPH podem ser incluídos em cavidades separadas do teste ELISA praticado ou estojo de diagnóstico, como acima, ou podem ser combinados em conjunto e adsorvidos num único suporte sólido, como numa única cavidade.
Conduziu-se um teste semelhante usando conjugados de ant_i corpos marcados para detectar as imunoglobulinas IgA e IgG num painel de antisoro de doador. Neste teste, os resultados foram primeiramente obtidos como acima para o antisoro contendo moléculas de anticorpos de imunoglobulina IgA que imunoreagiram com os polipéptidos específicos para um dado tipo de VPH, apresentados na Tabela 12.
Em seguida, efectuou-se um teste ELISA semelhante no mesmo painel de antisoro com a excepção de se terem utilizado 50 ixl
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de uma solução contendo conjugado de imunoglobulina IgG policlonal anti-humana marcada com cocleária peroxidase (Dakopatts) diluída 1:800 em tampão SNH em lugar do conjugado IgA. Após a formação de um segundo produto de imunoreacção seguida de lavagem c_o mo anteriormente, adicionaram-se a cada cavidade 50 yxl de uma solução de substrato ABTS (ABTS numa concentração de 0,2 mg por ml de citrato 0,002 M, pH 5,0, 0,009% de peróxido de hidrogénio) para formar uma mistura de desenvolvimento de cor. Após manter a mistura reaccional reveladora no escuro durante 20 minutos à temperatura ambiente, mediu-se a D.0. da solução usando um dispositi. vo de leitura múltipla equipado com um filtro de 415 nm.
0s resultados de detecção de moléculas de anticorpos IgA e IgG no sangue humano que imunoreagem com polipéptidos relaciona dos com o VPH, são apresentados na Tabela 12, com os mesmos cabeçalhos que na Tabela 11.
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-9 0Detecção de tipo especifico de I gA e IgG em antisoro de paciente infectado com VPH co vQ vo
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380 0,378 0,284 0,886 ^4CMA<CAvOACOOvOrHCNA<tAvOACOOVO ι—I »—I Í—t ι—I ·—I »—I —C r—| r—I ι—I CN
H N ΙΛ sí ΙΛ J rCN CN CM CN CN CN CN
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Χ· •jcA
-9115. Isolamento de moléculas de anticorpos anti-proteína latente do VPH do sangue humano por afinidade de liqandos de polipéptidos
Dissolveram-se em água dez mg de polipéptido 245, prepara do como descrito no Exemplo 1 e acoplaram-se subsequentemente a 4 ml de esferas compactas de CH-Sepharose (Pharmacia), de acordo com as instruções do fabricante para formar um suporte sólido polipéptido 245-agarose. 0 suporte preparado foi primeiramente lavado com 10 ml de KSCN 4 M e em seguida com 400 ml de ΡΒΞ para formar um suporte 245 equilibrado. Preparou-se da mesma forma um segundo suporte usando um polipéptido de controlo que não possuia qualquer homologia com a sequência das ELA da região E do VPH, pa ra formar um suporte sólido equilibrado.
Recolheram-se os antisoros de pacientes CIN possuindo moléculas de anticorpos imunoreactivas com o polipéptido 245, como determinado usando o procedimento descrito no Exemplo 9. Aplicaram-se ao suporte sólido dois ml do antisoro recolhido a um caudal de 5 ml por hora e o eluente que saiu do suporte foi recolhido.
Em seguida o eluente recolhido foi aplicado da mesma forma ao suporte 245 equilibrado e este foi então lavado com cerca de B0 ml de PBS contendo NaCl 0,5 M para remover qualquer material que não tivesse imunoreagido especificamente com o polipéptido contido no suporte 245.
As moléculas de anticorpos que imunoreagiram foram então removidas por eluição do suporte 245, por adição de KSCN 4 M a um caudal de 5 ml por hora e recolha do eluente em fracções. A D.O. das fracções foi medida a 2B0 nm, determinaram-se as fracções cori tendo picos e reuniram-se para originar uma mistura contendo anti. corpos. A mistura foi então dialisada contra PBS para originar uma solução contendo moléculas de anticorpos anti-proteína latente do VPH purificadas, isoladas por meio do polipéptido C45. As moléculas de anticorpos contidas na solução assim preparada são referidas como moléculas de anticorpos anti-proteína latente do VPH purificadas por afinidade ou isoladas por afinidade.
As moléculas de anticorpos isoladas por afinidade resul69 303
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-92tantes representam um anticorpo substancialmente isolado porque mais de 50% das moléculas de anticorpos contidas na solução possuem a capacidade de imunoreagir com um polipéptido relacionado com o VPH tipo 16. Como demonstrado no presente invento, estas moléculas de anticorpos possuem também a capacidade de imunoreagir com uma proteína latente do VPH.
16. Detecção de proteínas latentes do VPH nucleares usando moléculas de anticorpos humanos anti-proteína latente do VPH
a. Análise de imunomanchas Western
A linha de células NIH3T3/HPV16 é uma linha de células NIH3T3 de fibroblasto de ratos firmemente transectada com o VPH tipo 16 (Yasumoto et al. , 0♦ Virol. , 57: 572-577, 19B6) e foi obti. da do Dr. 0. DiPaolo. C4II é uma linha de células de carcinoma cervical portadora de VPH tipo 18 (Yee et al., Am. 0. Pathol♦, 119:361-366, 1985) e foi obtida do ATCC e cultivada de acordo com as especificações do ATCC.
As linhas de células HT-3, CaSki e SiHa, descritas no Exemplo 5, NIH3T3/HPV16 e C4II e a linha de células normais NIH3T3 (ATCC) foram submetidas a um teste de imunomanchas Western, como descrito no Exemplo 5, com as excepçães que se seguem.
Os lisatos celulares foram submetidos a SDS-PAGE como anteriormente, mas usando geles de poliacrilamida a 7% e as proteínas marcadoras de peso molecular indicadas na legenda da Figura 5. Depois de transferir os lisatos celulares submetidos a electroforese para nitrocelulose e realização de bloqueio, as manchas bloqueadas foram mantidas durante 12 horas em (a) solução de moléculas de anticorpos humanos anti-proteína latente do vírus do papiloma humano isoladas por afinidade pelo polipéptido 245, preparada no Exemplo 15 e diluída 1:10 em BLOTTO, (b) sobrenadante de cultura não diluído do hibridoma 245:11E3 preparado como no Exemplo 6b ou (c) solução contendo moléculas de anticorpos de coelho anti-polipéptido 245 isoladas por afinidade, preparada no Exemplo 4 e diluída 1:32 em BLOTTO para permitir a formação de um produto de imunoreacção entre as composiçães de anticorpos misturadas e
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-93- ·ζ,;
as proteínas latentes do vírus do papiloma presentes como fase s_ó lida nas manchas.
As manchas lavadas foram então mantidas em BLOTTO contendo fosfatase alcalina conjugada com (a) IgA anti-humana, (b) IgG anti-rato ou (c) IgG anti-coelho, respectivamente, cada um diluído 1:1000, para permitir a formação de um segundo produto de imunoreacção entre o segundo anticorpo adicionado e o primeiro produ to de imunoreacção, inicialmente formado, presente na fase sólida da mancha. As manchas foram então lavadas e os produtos de imuno reacção em fase sólida foram visualizados usando a solução revela dora de substrato cromogénico para os tempos de desenvolvimento indicados na legenda da Figura 5.
Os resultados obtidos na análise de imunomanchas Western para detectar proteínas latentes do vírus do papiloma com moléculas de anticorpos humanos, são apresentados na Figura 5.
Por exemplo, as moléculas de anticorpos humanos imunoreagiram com uma proteína de 48 kd em células C4II, com uma proteína de 48 kd e 26 kd em células NIH3T3/HPV16 e com uma proteína de 58 kd em células CaSki, com uma exposição prolongada (porção à esquerda da Figura 5A) mas não se verificou a ocorrência de imunoreacção com as células controlo HT-3 ou NIH3T3.
Como caracterização adicional, o anticorpo monoclonal 245:11E3 imunoreagiu com a proteína de 58 kd em células CaSki mas não em células HT-3 ou SiHa (Figura 5b). Os anticorpos de coelho isolados por afinidade imunoreagiram predominantemente com a proteína de 48 kd e minimamente com as proteínas de 51 kd e 58 kd em células CaSki (Figura 5c).
b. Detecção imuno-histoquímica de CaSki, C-33A,
HT-3, SiHa e HeLa
Prepararam-se células de cultura de tecidos para detecção imuno-histoquímica como descrito no Exemplo Ba, com a excepção de as células fixadas terem sido bloqueadas em SNH a 8% durante 30 minutos e terem sido feitas imunoreagir durante 90 minutos usando uma solução contendo quer (a) moléculas de anticorpos humanos an69 303
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-94ti-proteína latente do VPH, isoladas por afinidade pelo polipépti do 245, preparadas no Exemplo 15 e diluídas 1:5 em BLOTTO, quer (b) moléculas de anticorpos presentes num sobrenadante da cultura do hibridoma 245:11AE3, preparado no Exemplo 6b e diluído 1:18 em BLOTTO. Os resultados demonstraram que ambos os tipos de moléculas imunoreagiram com as células CaSki infectadas com VPH tipo 16, mas não imunoreagiram com as outras linhas de células testadas. 0 produto de imunoreacção visualizado em células CaSki mostrou uma coloração forte no núcleo das células. A localização nuclear foi confirmada por fraccionamento subcelular de células CaSki para isolar os núcleos e subsequentes análises dos núcleos isolados pa. ra identificar uma proteína de 58 kd por imunomanchas Western de acordo com o Exemplo 16a.
Estas análises indicam que ambas as moléculas de anticorpos isoladas por afinidade pelo polipéptido 245, quer humanas quer de ratos, imunoreagem com uma proteína latente do VPH nuclear, de 5B kd e também com uma proteína latente do VPH de 26 kd e 48 kd.
17. Correlação entre a severidade da displasia e os anticorpos IqA anti-proteína latente do VPH
A determinação das moléculas na análise estatística do sangue humano, foi efectuada sobre os resultados da imunoreacção ELISA, obtidos pela análise ELISA no Exemplo 9, usando as amostras de antisoro obtido de pacientes possuindo displasias histolo gicamente confirmadas como CIN1, CIN2 ou CIN3, como definido na nota 2 da Tabela 10. A Tabela 13 apresenta os resultados da análise estatística.
Tabela 13
CIN | Tamanho de | D.0. 492 | Desvia | |
Severidade | A mos tra | Média | Padrão | |
CIN1 | 32 | 0,137 | 0,198 | |
CIN2 | 20 | 0,162 | 0,126 | |
CIN3 | 14 | 0,32 0 | 0,174 | |
1 A D.0. a | 492 | nm foi medida por | imunoreacção das | moléculas de ajn |
ticorpos | IgA | do paciente com o | polipéptido 245, | na análise ELISA |
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-950s resultados mostram a existência de uma correlação entre a severidade da displasia e a imunoreactividade dos anticorpos anti-protelna latente do VPH com o polipéptido 245. Assim, os métodos e sistemas de diagnóstico do presente invento para a detecção de moléculas de anticorpos anti-proteínas latentes do vírus do papiloma, podem ser utilizados para correlacionar a imunoreactividade do IgA do paciente e os títulos de IgA com a severidade das lesões e displasia genitais induzidas pelo vírus do p_a piloma.
A descrição do presente invento, incluindo as concretizações específicas e exemplos, pretende ser apenas ilustrativa e não deve ser tomada como limitativa. Podem efectuar-se diversas modificações sem sair do âmbito e campo de aplicação do presente inve nto.
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Claims (18)
1 - Processo de preparação de um polipéptido representado por uma fórmula seleccionada de entre as do grupo consistindo em:
MADPAGTNGEEGTGC,
HEDEDKENDGDSLPTC,
RPFKSNKSTCC,
CCDWCIAAFGLTPSI,
TYDSEWQRDQFLSQVKIPC,
HKSAIVTLTYDSEWQRDQC, e CINCQKPLCPEEKQRH caracterizado por este ser efectuado por síntese orgânica sequencial em fase sólida, partindo de primeiras subunidades que incluem um primeiro grupo funcional que reage com a funcionalidade reacti ua de partículas reactivas encerradas num recipiente, que constituem o meio para a síntese e um segundo grupo funcional reactivo que é protegido daquela reacção por um grupo protector ligado covalentemente, selectivamente removível, formando-se assim uma ligação covalente selectivamente cindível entre as primeiras subuni dades e as partículas de modo a formar um meio de síntese contendo subunidades ligadas a partículas; os grupos protectores dos segundos grupos funcionais reactivos são removidos, de modo a for. mar um meio de síntese contendo subunidades ligadas a partículas possuindo grupos funcionais reactivos livres;
os meios de síntese, contendo subunidades ligadas a part_í cuias possuindo grupos funcionais reactivos livres, são misturados com um excesso de outras subunidades conhecidas, idênticas que contêm (i) um grupo funcional que é capaz de reagir com os grupos reactivos livres das subunidades ligadas a partículas e (ii) um segundo grupo funcional reactivo que é protegido dessa reacção por ser covalentemente ligado a um grupo protector removi vel selectivamente;
os grupos reactivos livres são reagidos com os grupos f uri cionais misturados de modo a formarem ligações covalentes, acopl.a rem a subunidade à partícula e assim formarem produtos reaccionais ligados à partícula;
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EPG:11-SCRF 155.1 as subunidades não reagidas são separadas dos produtos reaccionais ligados às partículas;
os grupos protectores do segundo grupo funcional reactivo das unidades acopladas são removidos para formar produtos reaccio nais ligados às partículas contendo grupos funcionais reactivos livres ;
sendo os passos anteriores repetidos até se sintetizarem produtos reaccionais ligados a partículas contendo o número e ti^ po desejado de subunidades reagidas;
a ligação selectivamente cindível, entre as subunidades e as partículas é cindida para formar uma mistura de produtos reaccionais livres, cindidos e partículas reagidas e finalmente separam-se os produtos reaccionais livres, cindidos das partículas reagidas e recuperam-se os produtos reaccionais livres, separados .
2 - Processo de preparação de um polipéptido compreendendo não mais de cerca de 50 residuos de aminoácido e onde a sequêjn cia de resíduos de aminoácido incluída possui a fórmula:
-TYDSE-,
-LTYDSE-,
-SAIVTLTYDSE-, e -HKSAIVTLTYDSE-, caracterizado por
a) reagir um primeiro grupo funcional de primeiras subunidades, com a funcionalidade reactiva de partículas reactivas encerradas num recipiente, que constituem o meio de síntese e pro teger um segundo grupo funcional reactivo das primeiras subunidades com um grupo protector ligado covalentemente e selectivamente removível, formando uma ligação covalente, selectivamente cindível entre as subunidades e as partículas, obtendo-se um meio de síntese contendo subunidades ligadas a partículas;
b) remover os grupos protectores, formando um meio de síntese contendo subunidades ligadas a partículas possuindo grupos funcionais reactivos livres ;
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-98c) misturar os meios de síntese obtidos em b) com um excesso de outras subunidades que contêm (i) um grupo funcional capaz de reagir com os grupos reactivos livres das subunidades liga das a partículas e (ii) um segundo grupo funcional reactivo que é protegido por ligação covalente a um grupo protector removível se? lectivamente;
d) reagir os grupos reactivos livres com os grupos funcionais misturados de modo a formarem produtos reaccionais ligados à partícula;
e) separar as subunidades não reagidas dos produtos reac cionais ligados às partículas;
f) remover os grupos protectores das unidades acopladas ;
g) repetir os passos anteriores até se sintetizarem produtos reaccionais ligados a partículas;
h) cindir a ligação selectivamente cíndivel, entre as subunidades e as partículas, formando uma mistura de produtos reac cionais livres, cindidos e partículas reagidas;
i) separar os produtos reaccionais livres, cindidos das partículas reagidas e recuperar os produtos reaccionais livres separados.
3 - Processo de preparação de um polipéptido compreendendo não mais de 50 resíduos de aminoácido e incluindo uma sequência de aminoácidos uma fórmula seleccionada de entre as do grupo constituído por:
-HKSAIV-,
-SAIVTL-,
-IVTLTD-,
-TGILTVTYHSE-,
-HA I VTVT YDSE-,
-NAIVTLTYSSE-,
-NGIVTVTFVTE-, e -ILTVTcaracterizado por
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-99a) reagir um primeiro grupo funcional de primeiras subunidades, com a funcionalidade reactiva de partículas reactivas encerradas num recipiente, que constituem o meio de síntese e pr_o teger um segundo grupo funcional reactivo das primeiras subunidades com um grupo protector ligado covalentemente e selectivamente removível, formando uma ligação covalente, selectivamente cindível entre as subunidades e as partículas, obtendo-se um meio de síntese contendo subunidades ligadas a partículas;
b) remover os grupos protectores, formando um meio de síntese contendo subunidades ligadas a partículas possuindo grupos funcionais reactivos livres ;
c) misturar os meios de síntese obtidos em b) com um excesso de outras subunidades que contêm (i) um grupo funcional capaz de reagir com os grupos reactivos livres das subunidades liga das a partículas e (ii) um segundo grupo funcional reactivo que é protegido por ligação covalente a um grupo protector removível sja lectivamente;
d) reagir os grupos reactivos livres com os grupos funcionais misturados de modo a formarem produtos reaccionais ligados à partícula;
e) separar as subunidades não reagidas dos produtos reac cionais ligados às partículas;
f) remover os grupos protectores das unidades acopladas;
g) repetir os passos anteriores atê se sintetizarem produtos reaccionais ligados a partículas ;
h) cindir a ligação selectivamente cíndivel, entre as subunidades e as partículas, formando uma mistura de produtos reaç^ cionais livres, cindidos e partículas reagidas;
i) separar os produtos reaccionais livres, cindidos das partículas reagidas e recuperar os produtos reaccionais livres separados.
4 - Processo de preparação de um polipéptido caracterizado por este conter não mais de cerca de 50 resíduos de aminoácido e incluir uma sequência de resíduos de aminoácidos representada
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-100pela fórmula:
XZX ' , onde Z é uma sequência de resíduos de aminoácido contendo pelo me nos 5 resíduos de aminoácido possuindo uma sequência corresponderi do a uma porção da sequência representada pela fórmula:
ΗΚΞΑIVTLTYDSE, onde X é hidrogénio ou pelo menos um resíduo de aminoácido e onde X’ é hidroxilo ou pelo menos um resíduo de aminoácido, sendo o re ferido polipéptido capaz de imuno-reagir com anticorpos de protej. na anti-vírus do papiloma humano latente.
5 - Processo de acordo com a reivindicação 4, caracteriza do por Z ser uma sequência de resíduos de aminoácido que inclui uma sequência de resíduos de aminoácido representada por uma fórmula seleccionada do grupo constituído por:
-TYDSE-,
-LTYDSE-,
-SAI VTLTYDSE-, e -HKSAIVTLTYDSE-.
6 - Processo de acordo com a reivindicação 4, caracteriza do por o dito polipéptido ter uma sequência de resíduos de aminoácido representada por uma fórmula seleccionada do grupo constituído por:
SSTWHWTGHNVKHKSA IVTLT YD, HKSAIVTLTYDSEWQRDC,
HKSAIVTLTYDSEWQRC,
HKSAIVTLTYDSEWQC,
HKSAIVTLTYDSEWC,
HKSAIVTLTYDSEC,
HKSAIVTLTYDSC , HKSAIVTLTYDC , HKSAIVTLTYC,
KSAIVTLTYDSEWQRDQC,
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-101SA I VTLTYDSEWQRDQC,
AIVTLTYDSEWQRDQC,
IVTLTYDSEWQRDQC,
VTLTYDSEWQRDQC,
TLTYDSEWQRDQC, e LTYDSEWQRDQC.
7 - Processo de preparação de um polipéptido compreendendo não mais de 50 resíduos de aminoácido e incluindo uma sequência de resíduos de aminoácido representada pela fórmula:
XTYDSEX' onde X é hidrogénio ou pelo menos um resíduo de aminoácido e onde X' é hidroxilo ou pelo menos um resíduo de aminoácido com a condjL ção de X’ não incluir a sequência de resíduos de aminoácido WQRDQFLSQV, caracterizado por
a) reagir um primeiro grupo funcional de primeiras subunidades, com a funcionalidade reactiva de partículas reactivas encerradas num recipiente, que constituem o meio de síntese e pro teger um segundo grupo funcional reactivo das primeiras subunidades com um grupo protector ligado covalentemente e selectivamente removível, formando uma ligação covalente, selectivamente cindível entre as subunidades e as partículas, obtendo-se um meio de sintese contendo subunidades ligadas a partículas;
b) remover os grupos protectores, formando um meio de síntese contendo subunidades ligadas a partículas possuindo grupos funcionais reactivos livres;
c) misturar os meios de síntese obtidos em b) com um excesso de outras subunidades que contêm (i) um grupo funcional capaz de reagir com os grupos reactivos livres das subunidades liga, das a partículas e (ii) um segundo grupo funcional reactivo que é protegido por ligação covalente a um grupo protector removível s_e lectivamente;
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-102d) reagir os grupos reactivos livres com os grupos funcionais misturados de modo a formarem produtos reaccionais ligados à partícula;
e) separar as subunidades não reagidas dos produtos reaç cionais ligados às partículas;
f) remover os grupos protectores das unidades acopladas;
g) repetir os passos anteriores até se sintetizarem produtos reaccionais ligados a partículas;
h) cindir a ligação selectivamente cindível, entre as subunidades e as partículas, formando uma mistura de produtos reac cionais livres, cindidos e partículas reagidas;
i) separar os produtos reaccionais livres, cindidos das partículas reagidas e recuperar os produtos reaccionais livres separados.
8 - Processo de acordo com a reivindicação 7, caracteriza do por X' ser uma sequência de resíduos de aminoácido representada por uma fórmula seleccionada do grupo constituído por:
W,
WQ,
WQR ,
WQRD,
WQRDQ,
WQRDQF,
WQRDQFL,
WQRDQFLS, e
WQRDQFLSQ.
9 - Processo de preparação de um polipéptido compreendendo não mais de 50 resíduos de aminoácido e incluindo uma sequência de resíduos de aminoácido representada por uma fórmula seleccionada do grupo constituído por:
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-103-TDYSE-,
-LTDYSE-,
-SAIVTLTDYSE-,
-HKSAIVTLTDYSE-,
-HKSAIV- ,
-SAIVTL-, e -IVTLTD-; e onde o referido polipéptido não contém a sequência de resíduos de aminoácido -WRQRDQFLSQV-, caracterizado por
a) reagir um primeiro grupo funcional de primeiras subunidades, com a funcionalidade reactiva de partículas reactivas encerradas num recipiente, que constituem o meio de sintese e pro teger um segundo grupo funcional reactivo das primeiras subunidades com um grupo protector ligado covalentemente e selectivamente removível, formando uma ligação covalente, selectivamente cindível entre as subunidades e as partículas, obtendo-se um meio de síntese contendo subunidades ligadas a partículas;
b) remover os grupos protectores, formando um meio de sintese contendo subunidades ligadas a partículas possuindo grupos funcionais reactivos livres;
c) misturar os meios de síntese obtidos em b) com um excesso de outras subunidades que contêm (i) um grupo funcional capaz de reagir com os grupos reactivos livres das subunidades liga das a partículas e (ii) um segundo grupo funcional reactivo que é protegido por ligação covalente a um grupo protector removível s_e lectivamente;
d) reagir os grupos reactivos livres com os grupos funcionais misturados de modo a formarem produtos reaccionais ligados à partícula;
e) separar as subunidades não reagidas dos produtos reac cionais ligados às partículas;
f) remover os grupos protectores das unidades acopladas;
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-104-
g) repetir os passos anteriores até se sintetizarem produtos reaccionais ligados a partículas;
h) cindir a ligação selectivamente cindiuel, entre as subunidades e as partículas, formando uma mistura de produtos reaç cionais livres, cindidos e partículas reagidas;
i) separar os produtos reaccionais livres, cindidos das partículas reagidas e recuperar os produtos reaccionais livres separados.
10 - Processo de preparação de um polipéptido possuindo uma sequência de resíduos de aminoácido representada pela fórmula seleccionada do grupo constituído por:
SSTWHWTGHNVKHKSAIVTLTYD,
HKSAIVTLTYDSEWQRDC, HKSAIVTLTYDSEWQRC, HKSAIVTLTYDSEWQC, HKSAIVTLTYDSEWC, HKSAIVTLTYDSEC,
HKSAIVTLTYDSC,
HKSAIVTLTYDC,
HKSAIVTLTYC,
KSAIVTLTYDSEWQRDC,
ΞΑIVTLTYDSEWQRDC,
AIVTLTYDSEWQRDC, IVTLTYDSEWQRDC,
VTLTYDSEWQRDC, e LTYDSEWQRDC, caracterizado por
a) reagir um primeiro grupo funcional de primeiras subunidades, com a funcionalidade reactiva de partículas reactivas encerradas num recipiente, que constituem o meio de síntese e prjí teger um segundo grupo funcional reactivo das primeiras subunidades com um grupo protector ligado covalentemente e selectivamente removível, formando uma ligação covalente, selectivamente cindível entre as subunidades e as partículas, obtendo-se um meio de síntese contendo subunidades ligadas a partículas;
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-105tf
b) remover os grupos protectores, formando um meio de síntese contendo subunidades ligadas a partículas possuindo grupos funcionais reactivos livres;
c) misturar os meios de síntese obtidos em b) com um excesso de outras subunidades que contêm (i) um grupo funcional capaz de reagir com os grupos reactivos livres das subunidades liga das a partículas e (ii) um segundo grupo funcional reactivo que é protegido por ligação covalente a um grupo protector removível s_e lectivamente;
d) reagir os grupos reactivos livres com os grupos funcionais misturados de modo a formarem produtos reaccionais ligados à partícula;
e) separar as subunidades não reagidas dos produtos reaç cionais ligados às partículas;
f) remover os grupos protectores das unidades acopladas;
g) repetir os passos anteriores até se sintetizarem produtos reaccionais ligados a partículas;
h) cindir a ligação selectivamente cindível, entre as subunidades e as partículas, formando uma mistura de produtos reac cionais livres, cindidos e partículas reagidas;
i) separar os produtos reaccionais livres, cindidos das partículas reagidas e recuperar os produtos reaccionais livres separados.
11 - Processo de produção de moléculas de anticorpo ou nno léculas de anticorpo monoclonal que imunorreagem com um polipépt_i do possuindo a fórmula:
5STWHWTGHNVKHKSA IVTLTYDSEWRDC, EKTGILTVTYHSETQRTRC, HKHAIVTVTYOSEEQRQQC,
HKNAIVTLTYSSEEQRQQC, ou SKNGIVTVTFVTEQQQQMC, caracterizado por se efectuar a sua indução, se recolherem as mol.é cuias de anticorpo com a imuno-especificidade apropriada para o
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-106polipéptido e se isolarem ou purificarem.
12 - Processo de produção de moléculas de anticorpo ou mo, léculas de anticorpo monoclonal que imunorreagem com um polipépti. do possuindo a fórmula:
MADPAGTNGEEGTGC, HEDEDKENDGDSLPTC, RPFKSNKSTCC ,
CCDWCIAAFGLTPSI, TYDSEWQRDQFLSQVKIPC, HKSAIUTLTYDSEWQRDQC, e CINCQKPLCPEEKQRH, caracterizado por se efectuar a sua indução, se recolherem as molé^ cuias de anticorpo com a imuno-especificidade apropriada para o polipéptido e se isolarem ou purificarem.
13 - Processo de produção de um anticorpo monoclonal compreendendo moléculas de anticorpo que imunorreagem com uma prote_í na do vírus do papiloma humano latente, caracterizado por se iniciar uma cultura de hibridoma monoclonal compreendendo um meio nu triente contendo um hibridoma seleccionado do grupo que consiste em 235:B9, 245:11E3 e 247:4011, manter a cultura sob condições sjj ficientes e durante um período de tempo suficiente para o hibridjq ma segregar moléculas de anticorpo no meio, recolher o meio contendo o anticorpo e, opcionalmente, isolar as moléculas de anticorpo.
14 - Processo de obtenção de um hibridoma que produz mol.é cuias de anticorpo que imunorreagem com uma proteína de vírus do papiloma humano latente, sendo o referido hibridoma seleccionado do grupo de hibridomas constituído por 235:B9, 245:11E3 e 247:4D11, caracterizado por o hibridoma ser obtido por fusão de uma célula produtora de anticorpo com um mieloma ou outra linha celular auto-perpetuante.
15 - Processo de determinação da presença de uma infecção por vírus do papiloma num indivíduo humano caracterizado por compreender os passos de:
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-107a) Formar uma mistura de imunorreacção por mistura de uma amostra de Fluido corporal do referido indivíduo com um polipéptido representado pela fórmula seleccionada do grupo consisti_n do em:
HKSAIVTLTYDSEWQRDQC , e CCDWCIAAFGLTPSI ;
b) manter a dita mistura de imunorreacção sob condições de ensaio biológicas durante um período de tempo suficiente para que quaisquer anticorpos de proteína latente anti-vlrus do papiljo ma presentes na amostra imunorreajam com o dito polipéptido para formar um produto de imunorreacção contendo o polipéptido; e
c) determinar a presença de qualquer produto de imunorreacção contendo polipéptido que se tenha formado e assim a presença de qualquer infecção por vírus do papiloma no referido indivíduo.
16 - Processo de determinação da presença de anticorpos de proteína latente anti-virus do papiloma humano num indivíduo huma no, caracterizado por compreender os passos de:
a) formar uma mistura de imunorreacção por mistura de uma amostra de fluido corporal do referido indivíduo com um polipéptido não compreendendo mais do que cerca de 50 residuos de am_i noácido e incluindo uma sequência de resíduos de aminoácido repre sentada pela fórmula:
XZX ’ , onde Z é uma sequência de resíduos de aminoácido contendo pelo me nos 5 resíduos de aminoácido possuindo uma sequência corresponden do a uma porção da sequência representada pela fórmula:
HKSAIVTLTYDSE , onde X é hidrogénio ou pelo menos um resíduo de aminoácido e onde
X1 é hidroxilo ou pelo menos um residuo de aminoácido, sendo o re ferido polipéptido capaz de imunorreagir com anticorpos de prote_I na latente anti-virus do papiloma humano;
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EPG:11-SCRF 155.1
-10 8b) manter a dita mistura de imunorreacção sob condições de ensaio biológicas durante um período de tempo suficiente para que quaisquer anticorpos de proteína latente anti-vírus do papil.o ma presentes na amostra imunorreajam com o dito polipéptido para formar um produto de imunorreacção contendo o polipéptido; e
c) determinar a presença de qualquer produto de imunorreacção contendo polipéptido que se tenha formado e assim a presença de qualquer proteína latente anti-vírus de papiloma humano no referido indivíduo.
17 - Processo de acordo com a reivindicação 16, caracterí zado por o referido polipéptido ter uma sequência de resíduos de aminoácido representada por uma fórmula seleccionada de entre o grupo consistindo em:
SSTWHWTGHNVKHKSAIVTLTYD,
HKSAIVTLTYDSEWQRDC,
HKSAIVTLTYDSEWQRC,
HKSAIVTLTYDSEWQC,
HKSAIVTLTYDSEWC,
HKSAIVTLTYDSEC,
HKSAIVTLTYDSC,
HKSAIVTLTYDC,
HKSAIVTLTYC,
KSA IVTLTYDSEWQRDC,
SAIVTLTYDSEWQRDC,
AIVTLTYDSEWQRDC,
IVTLTYDSEWQRDC,
VTLTYDSEWQRDC,
TLTYDSEWQRDC, e LTYDSEWQRDC.
18 - Processo para determinar a presença de anticorpos de proteína latente anti-vírus de papiloma humano num indivíduo huma. no, caracterizado por compreender os passos de:
a) formar uma mistura de imunorreacção por mistura de uma amostra de fluido corporal do referido indivíduo com um polipépt_i
69 303
EPG:11-SCRF 155.1
-109do não compreendendo mais do que cerca de 50 resíduos de aminoác_i do e incluindo uma sequência de resíduos de aminoácido possuindo uma fórmula seleccionada do grupo consistindo em:
-TGILTVTYHSE-,
-HAIVTVTYDSE-,
-NAIVTLTYSSE-,
-NGIVTVTFVTE-, e -ILTVT- ;
b) manter a dita mistura de imunorreacção sob condições de ensaio biológicas durante um período de tempo suficiente para que quaisquer anticorpos de proteína latente anti-vírus do papilçí ma presentes na amostra imunorreajam com o dito polipéptido para formar um produto de imunorreacção contendo o polipéptido; e
c) determinar a presença de qualquer produto de imunorreacção contendo polipéptido que se tenha formado e assim a presença de qualquer proteína latente anti-vírus de papiloma humano no referido indivíduo.
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