ES2297855T3 - Anticuerpos monoclonales contra la hepatitis b. - Google Patents
Anticuerpos monoclonales contra la hepatitis b. Download PDFInfo
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Abstract
LA INVENCION SE REFIERE A UN ANTICUERPO MONOCLONAL QUE ES CAPAZ DE UNIRSE ESPECIFICAMENTE AL TIPO SILVESTRE DE HBSAG Y A AL MENOS DOS FORMAS MUTANTES DE HBSAG. DICHOS ANTICUERPOS SE PUEDEN UTILIZAR EN UN INMUNOENSAYO MEJORADO PARA LA DETECCION DE AMBOS MUTANTES ASILVESTRADOS Y DEL TIPO SILVESTRE DE HBSAG, Y SE PUEDEN UTILIZAR PARA LA INMUNIZACION PASIVA FRENTE A HBV.
Description
Anticuerpos monoclonales contra la hepatitis
B.
En una escala global, el virus de la hepatitis B
(VHB) es el más significativo de los virus hepatotropos en términos
de número de personas infectadas de manera crónica y gravedad de las
complicaciones de la infección.
La hepatitis B surgió como un problema mayor
tras la introducción de la terapia parenteral, las campañas masivas
de inmunización y la transfusión extensa de sangre y de
hemoderivados. Los largos períodos de incubación, la alta
incidencia de infecciones asintomáticas y la presentación de un
estado infeccioso de portador hacen que el VHB sea adecuado para la
transmisión por la sangre. Muchos trabajadores han proporcionado
también evidencias para la transmisión sexual del VHB, y la
transmisión del virus de la hepatitis B de madres portadoras a sus
bebés puede producirse durante el período perinatal.
El VHB, un virus de ADN, es un miembro del grupo
de virus hepadna. La microscopía electrónica del VHB revela una
partícula esférica con doble cubierta con un diámetro de 42 nm
denominada "partícula de Dane". Esas partículas virales
exhiben un núcleo interno esférico electrónicamente denso con un
diámetro de aproximadamente 22-25 nm y un
recubrimiento externo de 7 nm de espesor. El recubrimiento externo
del virus porta el antígeno de superficie (llamado en este
documento "HBs" o "HBsAg") al que está dirigido el
anticuerpo neutralizante del virus. Las partículas esféricas del
núcleo interno de 20 nm de diámetro portan el antígeno del núcleo
viral (HBcAg) y el antígeno e (HBeAg), el ADN viral, la actividad
ADN polimerasa y una actividad proteína quinasa.
El HBsAg contiene el principal epítopo
neutralizante del VHB, denominado determinante "a", que abarca
los aminoácidos 124 a 147 y es común a todos los aislamientos de
VHB, véase por ejemplo, Pugh y col. (1986). El desarrollo de
anti-HBs tras la infección aguda o crónica de VHB
está asociado generalmente con recuperación y un buen pronóstico.
El Anti-HBs está asociado también con la producción
de anticuerpos neutralizantes como resultado de la vacunación. La
mayoría de los anti-HBs encontrados en sueros de
convalecientes y posteriores a la vacunación se unen en la región
del determinante "a", que tiene una estructura hasta indefinida
hasta el momento. Está claro que el determinante "a" es
altamente conformacional porque la desnaturalización de esa área
por alquilación o reducción da lugar a partículas de HBsAg con
antigenicidad muy reducida. Se piensa que los puentes disulfuro
entre los residuos cisteína son los responsables de la conformación
correcta. Una estructura posible del determinante "a" incluye
un puente disulfuro entre los aminoácidos 124 y 137, que forma un
primer bucle, y otro puente disulfuro entre los aminoácidos 139 y
147, que forma un segundo bucle.
Se piensa que anti-HBs se une
predominantemente al segundo bucle pero se piensa que los epítopos
no están confinados solamente a un bucle. La totalidad de la
secuencia del determinante "a" contribuye probablemente a la
estructura antigénica. El determinante "a" está conservado
aunque existe un grado de variación en aislamientos normales de
VHB. Se acepta una variación mayor en el primer bucle del epítopo
supuesto, lo que implica tal vez que esta región no contribuye
significativamente con el epítopo de neutralización.
El determinante "a" se encuentra en todos
los subtipos de VHB y es la variación de aminoácidos dentro y
alrededor del determinante "a" lo que da lugar a subtipos. El
HBsAg puede clasificarse en cuatro subtipos inmunológicos
principales, adw, ayw, adr, y ayr, cada uno con una distribución
geográfica asociada. Los subtipos d/y y w/r están determinados por
sustituciones de lisina por arginina en los aminoácidos 122 y 160
respectivamente.
Recientemente, se ha observado la presencia de
HBsAg en las muestras de suero anti-HBs de ciertos
pacientes. El HBsAg en esos pacientes puede no ser neutralizado por
los anti-HBs presentes, lo que implica la presencia
de variantes de HBsAg. Se han asociado variantes significativas
(mutantes) con la vacunación, la terapia de anticuerpo monoclonal,
la terapia de anticuerpo policlonal y con casos de infección de VHB
difíciles de diagnosticar en laboratorios clínicos, véase por
ejemplo, Carmen y col. (1992, 1993), Harrison y col. (1993), Hawkins
y col. (1994), Howard y col. (1993), McMahon y col. (1992), Okamoto
y col. (1992), y Wallace y col. (1994).
Tras el análisis los mutantes parecen haber sido
seleccionados de una población mixta y parecen tener mutaciones
puntuales que causan sustituciones de aminoácidos en el determinante
"a". Se piensa que los mutantes surgen por mutaciones
aleatorias dentro del gen que da lugar a una combinación de
genotipos. En los mutantes descritos hasta la fecha, se piensa que
la respuesta inmune es el factor predominante para la selección de
los mutantes.
Generalmente, la adición de anticuerpos
monoclonales a las células infectadas por virus in vitro da
como resultado la selección de aislamientos que no son
neutralizados por ese anticuerpo. Por consiguiente, no es
sorprendente que los anticuerpos monoclonales administrados a los
pacientes con replicación viral activa puedan dar como resultado la
selección de los mutantes denominados de "escape".
Se han descrito varios mutantes de escape
diferentes con significación clínica en individuos vacunados. En
tres casos pudo encontrarse que resultó ser una mutación puntual en
el codón para el aminoácido 145 en el determinante "a" de
HBsAg la que dio como resultado un cambio de aminoácido de glicina a
arginina. La administración de suero que contenía uno de tales
mutantes del virus a un chimpancé probó que los agentes son
transmisibles.
\newpage
En un virus mutante implicado en una infección
descubierta en una población vacunada se encontró una mutación de
lisina por ácido glutámico en el aminoácido 141 del determinante
"a". Desde entonces se ha informado esa y otras mutaciones
puntuales que dan como resultado una o más sustituciones de
aminoácidos en el determinante "a" en individuos
vacunados.
Los mutantes de escape son motivo de
preocupación en varios informes. En primer lugar, existen fallos
para detectar tales mutantes por medio de inmunoensayos. Los
ensayos de diagnóstico están diseñados para conseguir alta
sensibilidad y especificidad. Los ensayos para la detección de HBsAg
dependen en la interacción entre un reactivo de
anti-HBs y HBsAg en la muestra bajo investigación.
Posteriormente se detecta un complejo anti-HBs/HBsAg
resultante. Si hay una mutación significativa en el epítopo del
HBsAg y no es reconocido por los anti-HBs, entonces
no se detectará el HBsAg o el ensayo será muy poco sensible. El
fallo para detectar un mutante de escape no sólo puede afectar a la
persona que alberga el mutante; puede llevar a la transmisión de la
infección a través de la sangre, productos de la sangre o de
órganos donados. En segundo lugar, el VHB con HBsAg mutante puede
infectar a individuos aunque hayan sido previamente inmunizados y
tengan respuesta anti-HBs.
En el documento WO 94/26904 se describió un
anticuerpo monoclonal para un mutante de escape en la posición 122.
Ese anticuerpo es capaz de discriminar entre el HBsAg de tipo
salvaje y la forma mutante y por lo tanto permite la identificación
de la forma mutante.
El documento WO 95/21189 describe una proteína
de antígeno de superficie de hepatitis B que comprende una región
de envoltura antigénicamente modificada en la que están insertados
al menos dos aminoácidos secuencia abajo de la posición 122.
El documento WO 94/21812 describe anticuerpos
para uso en la detección de variantes específicas de proteínas de
antígeno de superficie de hepatitis B que tienen una sustitución de
glicina por arginina en la posición 145.
Waters y col., (1992) J. Clin. Invest.
90:2545-2597 describen una mutación del antígeno de
superficie de hepatitis B en el aminoácido 145 que lleva a la
evasión de la respuesta protectora anti-HBs y
especulan que la mutación surgió como resultado de la presión
inmune.
La presente invención se refiere a un anticuerpo
monoclonal que es capaz de unirse específicamente a un HBsAg de
tipo salvaje y al menos a dos, de preferencia más de dos, formas
mutantes de HBsAg.
La presente invención proporciona un anticuerpo
monoclonal P2D3 producido por el hibridoma denominado P2D3 y
depositado en ECACC bajo número de acceso 97042331 y anticuerpos
monoclonales que compiten de manera cruzada con el anticuerpo
monoclonal P2D3 para unirse a un HbsAg de tipo salvaje (antígeno de
superficie de hepatitis B) y al menos a dos formas mutantes de
HBsAg, en el que las formas mutantes de HBsAg tienen una sustitución
de aminoácidos con relación al HBsAg de tipo salvaje dentro de la
secuencia que codifica los aminoácidos 133 a 145 del HBsAg. A menos
que se especifique de otra manera, el término "un anticuerpo
monoclonal de la presente invención" incluye al anticuerpo
monoclonal P2D3 y anticuerpos monoclonales que compiten de manera
cruzada con el anticuerpo monoclonal P2D3 como se definió
anteriormente.
La capacidad de un anticuerpo monoclonal de la
presente invención para unirse específicamente al HBsAg de tipo
salvaje y al mutante sugiere que se une a una región del antígeno de
superficie que está conservada entre la proteína del tipo salvaje y
las formas mutantes. La región conservada y por lo tanto el
determinante antigénico (o epítopo) puede estar en el determinante
"a" mismo, en la región del determinante "a" o inclusive
en una región no "a".
Debido a su capacidad para unirse
específicamente a las formas mutantes de HBsAg así como también a la
proteína del tipo salvaje, y por consiguiente para detectar
mutantes de escape, un anticuerpo monoclonal de la presente
invención es particularmente útil para mejorar la eficacia de los
inmunoensayos para la detección de HBsAg, para el diagnóstico
clínico de infecciones por VHB y también para las pruebas de
selección de la sangre. La seguridad del suministro de sangre y del
suministro de productos de la sangre puede mejorarse por medio del
uso de un anticuerpo monoclonal de la invención en un ensayo de
HBsAg, ya sea solo, es decir, como el único anticuerpo
anti-HBs o, especialmente, además de otro u otros
anticuerpos anti-HBs.
Las Figuras 1a y 1b de los dibujos que acompañan
a este documento presentan las secuencias de aminoácidos y ácido
nucleico de parte de la región de superficie del VHB que abarca al
determinante "a". La Figura 1b de los dibujos presentados es
una versión mecanografiada de la Figura 1a. En las Figuras 1a y 1b:
la Línea 1 presenta variantes reconocidas de aminoácidos del
subtipo adyw; la Línea 2 presenta la secuencia de consenso de
aminoácidos del subtipo adyw; la Línea 3 presenta la secuencia de
consenso del ácido nucleico del subtipo adyw; la Línea 4 presenta
variantes reconocidas de ácidos nucleicos; la Línea 5 presenta
variantes de ácido nucleico que codifican el HBsAg Mutante II
(HBsAg MAM); y la Línea 6 presenta las variantes de ácido nucleico
que codifican el HBsAg Mutante I (HBsAg NP).
Otra variante reconocida de nucleótidos en la
posición 143 es ACG por TCG, que da como resultado treonina en
lugar de serina en esa posición.
\newpage
Un anticuerpo monoclonal supuesto de la presente
invención puede seleccionarse por la capacidad de competir de
manera cruzada con el anticuerpo monoclonal P2D3 por la unión a tres
o más antígenos de referencia, a saber, un HBsAg de tipo salvaje y
dos o más formas mutantes de HBsAg. Un experto es capaz de
distinguir fácilmente la unión específica entre un anticuerpo y un
antígeno de la unión no específica. Cualquier anticuerpo que es
capaz de tal competencia cruzada por la unión a tres o más de tales
antígenos de referencia es un anticuerpo monoclonal de la presente
invención. Tal procedimiento de selección es en sí mismo parte de la
presente invención. Debe notarse que el término "unión" se usa
a través de la presente memoria descriptiva para indicar la unión
específica.
Un HBsAg usado para selección y/o como antígeno
en la producción de hibridomas y de anticuerpos monoclonales de la
invención puede ser una proteína de extensión completa o puede ser
un fragmento o derivado antigénico adecuado de un HBsAg de tipo
salvaje o mutante.
Un anticuerpo monoclonal de la presente
invención puede ser de cualquier clase de inmunoglobulina, por
ejemplo, IgG, IgM o IgA, y de cualquier isotipo.
Las formas mutantes de HBsAg pueden encontrarse
en los virus mutantes que tienen una mutación que lleva al menos a
la sustitución de un aminoácido con relación al HBsAg de tipo
salvaje, por ejemplo, como se encuentra en los denominados
"mutantes de escape". Un HBsAg mutante puede tener una
sustitución en el determinante "a" o en la región del
determinante "a", por ejemplo, la mutación puede ser una
mutación puntual. Una mutación, por ejemplo, una mutación puntual,
puede estar dentro de la secuencia que codifica los aminoácidos 133
a 145 del HBsAg. La mutación puede llevar a una sustitución de
aminoácidos en la posición 133 y/o en la posición 145. Pueden estar
presentes otras y/o diferentes sustituciones, por ejemplo, en una o
más cualesquiera de las posiciones 134, 141, 142, 143 y 144. Un
HBsAg mutante puede, por ejemplo, tener sustituciones de aminoácidos
con relación al tipo salvaje en una o más cualesquiera de las
posiciones 143, 144 y 145. Tales mutaciones pueden estar presentes
además de otras mutaciones, en el determinante "a" o en otra
región.
Un anticuerpo monoclonal de la presente
invención es capaz de competir de manera cruzada con el anticuerpo
monoclonal P2D3 en la unión por ejemplo, a un HBsAg de tipo salvaje
y a dos o más HBsAg mutantes diferentes como se describió
anteriormente, por ejemplo, teniendo cada uno una mutación en una o
más cualesquiera de las posiciones 133, 134, 141, 142, 143, 144 y
145. Como alternativa, la unión puede ser a un HBsAg mutante
descrito anteriormente y a un HBsAg mutante que tiene una mutación
en una región diferente.
Los ejemplos de las formas mutantes de HBsAg son
aquellos que tienen las siguientes sustituciones con relación al
tipo salvaje en la región del determinante "a":
- HBsAg Mutante I (HBsAg "NP"): met por ile en el aminoácido 133; phe por his en el aminoácido 134; y asp por val en el aminoácido 144;
- HBsAg Mutante II (HBsAg "MAM"): met por ile en el aminoácido 133; phe por asn en el aminoácido 134; pro por ser en el aminoácido 142; ser por leu en el aminoácido 143; y gly por lys en el aminoácido 145;
- HBsAg Mutante III (HBsAg "SZ"): gly por arg en el aminoácido 145;
- HBsAg Mutante IV (HBsAg "SP"): ser por met en el aminoácido 143.
\vskip1.000000\baselineskip
Un anticuerpo supuesto puede seleccionarse, por
ejemplo, contra el HBsAg de tipo salvaje y contra dos o más
cualesquiera de las formas mutantes descritas anteriormente. Por
ejemplo, puede seleccionarse un anticuerpo monoclonal supuesto de
la presente invención contra un HBsAg de tipo salvaje y contra dos o
más HBsAg mutantes diferentes teniendo cada uno mutación(es)
en una o más de las posiciones 133, 134, 141, 142, 143, 144 y 145,
especialmente 143, 144 y 145. Como alternativa, puede usarse uno de
tales mutantes con un HBsAg mutante que tenga una mutación en una
región diferente. Las formas mutantes I y IV descritas anteriormente
pueden usarse para selección.
Un anticuerpo monoclonal de la invención podrá
ser capaz de unirse específicamente a un HBsAg se tipo salvaje y al
menos a un HBsAg mutante que lleve un determinante "a"
codificado por una secuencia que tenga mutaciones puntuales en uno
o más de los codones que codifican los aminoácidos 143, 144 y 145.
El anticuerpo monoclonal puede unirse a dos o más de tales HBsAg
mutantes o a uno de tales HBsAg mutantes y a otro HBsAg mutante
diferente.
Los ejemplos de anticuerpos monoclonales de la
presente invención son aquellos producidos por los hibridomas
denominados P2D3, M3A10 y M4F5, los que fueron depositados en la
Colección Europea de las Cultivos Celulares (ECACC), Virus Research
and Production Laboratory, Public Health Laboratory Service, Centre
for Applied Microbiology & Research, Porton Down, Salisbury,
Wiltshire SP4 OJG, Inglaterra, en conformidad con los términos del
Tratado de Budapest en el Reconocimiento Internacional del Depósito
de Microorganismos para los Objetivos de Procedimiento de Patente,
1977. Los números de acceso y las fechas de depósito de los
hibridomas son los siguientes: Hibridoma P2D3: Número de Acceso
ECACC 97042331, Fecha de Acceso: 23 de abril de 1997; Hibridoma
M3A10: Número de Acceso ECACC 97042330, Fecha de Acceso: 23 de
abril de 1997; Hibridoma M4F5: Número de Acceso ECACC 97042519,
Fecha de Acceso: 25 de abril de 1997.
En esta memoria descriptiva, puede referirse a
un anticuerpo monoclonal bajo la misma denominación que el
hibridoma que la produce, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal
denominado P2D3 está producido por el hibridoma P2D3 (ECACC
97042331). Los hibridomas P2D3 (ECACC 97042331), M3A10 (ECACC
97042330) y M4F5 (ECACC 97042519) y los anticuerpos monoclonales
que producen se describen en detalle en las Ejemplos a
continuación.
Cada uno de los anticuerpos monoclonales P2D3,
M3A10 y M4F5 es capaz de unirse específicamente a (i) un HBsAg de
tipo salvaje, (ii) HBsAg Mutante I (HBsAg NP) y (iii) HBsAg Mutante
II (HBsAg MAM). Además, cada uno es capaz también de unirse
específicamente al HBsAg Mutante III (HBsAg SZ) y al HBsAg Mutante
IV (HBsAg SP). Los anticuerpos monoclonales P2D3 y M4F5 son
anticuerpos IgG. El anticuerpo monoclonal M3A10 es un anticuerpo
IgA.
Se sabe que el HBsAg de tipo salvaje tiene una
serie de serotipos diferentes, y también que hay mutantes
reconocidos, por ejemplo, Pugh y col. 1980. El término "HBsAg de
tipo salvaje" como se usa en la presente memoria descriptiva
incluye todos los HBsAg reconocidos en la técnica como tipo salvaje
o que serían reconocidos como de tipo salvaje. El término incluye
por consiguiente al HBsAg de tipo salvaje de todos los serotipos y
de todas las variantes reconocidas. El término "HBsAg mutante"
como se usa en este documento no incluye variantes reconocidas de
tipo salvaje.
Los expertos en la técnica conocen pruebas de
selección adecuadas e incluyen ensayos de competición cruzada y
ensayos, por ejemplo, que usan anticuerpo monoclonal marcado
radiactivamente para determinar especificidades de unión.
Como se indicó anteriormente, la capacidad de un
anticuerpo monoclonal de la presente invención para unirse al HBsAg
de tipo salvaje y al mutante sugiere que se une a una región del
antígeno de superficie que está conservada entre la proteína de
tipo salvaje y las formas mutantes. (Véase también la Discusión
General a continuación). La localización y la secuencia de tal
región conservada y por consiguiente un epítopo conservado pueden
determinarse por medio de procedimientos conocidos, por ejemplo, por
medio de mapeo del epítopo usando opcionalmente un anticuerpo
monoclonal de la invención. Los péptidos y los polipéptidos del
epítopo pueden producirse entonces, por ejemplo, de manera
recombinante, por síntesis química o por una combinación de
diferentes procedimientos. Un péptido o un polipéptido antigénico
resultante puede también ser inmunogénico. Un epítopo contra el que
está dirigido un anticuerpo monoclonal de la invención es en sí
mismo parte de la presente invención.
La presente invención incluye fragmentos y
derivados de un anticuerpo monoclonal de la presente invención, por
ejemplo, fragmentos Fab y Fab_{2} y de conjugados. Los derivados
incluyen derivados humanizados. Los procedimientos para producir
fragmentos y derivados, que incluyen los derivados humanizados, son
bien conocidos. Por ejemplo, los fragmentos y los derivados pueden
producirse de manera recombinante. Los expertos en la técnica
conocen muy bien los fragmentos y derivados de anticuerpos y sus
usos. El término "anticuerpo monoclonal" como se usa en este
documento incluye fragmentos y derivados del mismo.
La presente invención también proporciona un
anticuerpo anti-idiotipo para un anticuerpo
monoclonal de la presente invención. Tales anticuerpos, que
comprenden una "imagen interna" del epítopo original, pueden
usarse como sustitutos del epítopo y son particularmente útiles en
el caso de epítopos conformacionales, puesto que es difícil mapear
tales epítopos y puede no ser posible producir péptidos sintéticos
de epítopo en tales casos.
Un anticuerpo monoclonal de la presente
invención puede usarse en un inmunoensayo para la detección de HBsAg
("ensayo de VHB") y por consiguiente para las infecciones de
hepatitis B, como sustituto o, especialmente, además de los
anticuerpos anti-HBs utilizados actualmente en los
ensayos de VHB. Tales ensayos pueden usarse para el diagnóstico
clínico o para la selección de sangre, y la presente invención
incluye procedimientos de diagnóstico y procedimientos de selección
de sangre usando un inmunoensayo que comprende un anticuerpo
monoclonal de la presente invención.
Un anticuerpo monoclonal de la presente
invención puede también usarse terapéutica o preventivamente como
antisuero para la inmunización pasiva y/o para definir un epítopo
para uso como vacuna en la inmunización activa. La presente
invención incluye tales antisueros y procedimientos de inmunización,
y también epítopos definidos usando tales antisueros.
Otra aplicación de un anticuerpo monoclonal de
la presente invención es en cromatografía de afinidad, por ejemplo,
para purificar HBsAg de tipo salvaje o mutante, fragmentos
antigénicos de los mismos, péptidos antigénicos o anticuerpos
anti-idiotipo.
Por consiguiente, la presente invención
proporciona un inmunoensayo para la detección de HBsAg, que
comprende poner en contacto una muestra bajo investigación con un
anticuerpo monoclonal de la presente invención, un fragmento o
derivado del mismo, o una combinación de dos o más de los mismos, y
detectar cualquier complejo antígeno-anticuerpo
resultante.
El término "detección" se usa en este
documento para indicar detección y/o determinación e incluye
procedimientos cualitativos, cuantitativos y semicuantitativos.
El anticuerpo monoclonal de la invención,
fragmento, derivado o combinación de los mismos pueden usarse con
uno o más anticuerpos diferentes seleccionados de anticuerpos
policlonales anti-HBs y otros anticuerpos
monoclonales anti-HBs.
Un inmunoensayo de la presente invención puede
estar en un formato homogéneo o heterogéneo. El formato puede ser
un formato de captura o competitivo.
Un inmunoensayo para la detección de anticuerpos
para el antígeno del núcleo de la hepatitis B
(anti-HBc) puede realizarse simultáneamente con el
ensayo para HBsAg. Los ensayos de combinación de antígenos
anti-núcleo/superficie de VHB son conocidos y están
en uso.
La presente invención además proporciona un kit
de inmunoensayo que comprende un anticuerpo monoclonal de la
presente invención o un fragmento o derivado del mismo, o una
combinación de dos o más de los mismos, y otros reactivos
necesarios para realizar un inmunoensayo para HBsAg y opcionalmente
también los reactivos para detectar anticuerpos
anti-HBc. Puede estar presente otro u otros
anticuerpos anti-HBs seleccionados de anticuerpos
policlonales anti-HBs y otros anticuerpos
monoclonales anti-HBs, y los otros reactivos pueden
seleccionarse de soluciones de lavado, diluyentes, soluciones
patrón, reactivos de control y anticuerpos anti-HBs
marcados.
La presente invención proporciona además una
fase sólida adecuada para uso en un inmunoensayo en el que está
inmovilizado un anticuerpo monoclonal de la presente invención, un
fragmento o derivado del mismo, o una combinación de dos o más de
los mismos. En la fase sólida puede también estar inmovilizado otro
u otros anticuerpos anti-HBs seleccionados de
anticuerpos policlonales anti-HBs y de otros
anticuerpos monoclonales anti-HBs. Además, en la
fase sólida puede estar inmovilizado un agente capaz de capturar
anticuerpos anti-HBc además de los anticuerpos
anti-HBs.
La presente invención proporciona además un
antisuero adecuado para usar terapéutica o preventivamente para la
inmunización pasiva que comprende un anticuerpo monoclonal de la
presente invención, un fragmento o derivado del mismo, o una
combinación de dos o más numeroso de los mismos.
La presente invención proporciona también una
composición adecuada para uso terapéutica o preventivamente para la
inmunización pasiva contra VHB que comprende un anticuerpo
monoclonal de la presente invención, un fragmento o derivado del
mismo, o una combinación de dos o más de los mismos, además con un
vehículo farmacéuticamente adecuado.
Un antisuero o una composición de la invención
puede comprender también otro u otros anticuerpos seleccionados de
anticuerpos policlonales anti-HBs y otros
anticuerpos monoclonal anti-HBs.
La presente invención proporciona además un
procedimiento para la inmunización pasiva terapéutica o preventiva
contra VHB que comprende administrar a un ser humano una cantidad
terapéutica o preventivamente eficaz de un anticuerpo monoclonal de
la invención, un fragmento o derivado del mismo o una combinación de
dos o más de los mismos. También puede administrarse otro u otros
anticuerpos seleccionados de anticuerpos monoclonales y
policlonales anti-HBs.
Para cualquiera de las aplicaciones y usos según
la presente invención, el anticuerpo monoclonal de la presente
invención puede ser el anticuerpo monoclonal P2D3, el anticuerpo
monoclonal M3A10, el anticuerpo monoclonal M4F5 o una combinación
de dos de más de los mismos. Cualquiera de los anticuerpos
monoclonales P2D3, M3A10 y M4F5 puede(n) usarse junto con
cualquier otro anticuerpo monoclonal de la presente invención y/o
con cualesquiera otros anticuerpos anti-HBV,
especialmente anticuerpos anti-HBs. Puede usarse un
fragmento o un derivado de un anticuerpo monoclonal de la
invención.
La presente invención proporciona también un
hibridoma capaz de producir un anticuerpo monoclonal de la presente
invención, por ejemplo, el hibridoma P2D3 (Número de Acceso ECACC
97042331), el hibridoma M3A10 (Número de Acceso ECACC 97042330) y
el hibridoma M4F5 (Número de Acceso ECACC 97042519).
La presente invención proporciona un
procedimiento para producir un hibridoma capaz de producir un
anticuerpo monoclonal de la presente invención, que comprende
inmunizar un animal con el HBsAg de tipo salvaje o una forma
mutante del HBsAg, inmortalizando las células productoras del
anticuerpo para formar los hibridomas, seleccionar el cultivo del
hibridoma resultante contra el HBsAg de tipo salvaje y dos o más
formas mutantes del HBsAg, y seleccionar aquellos hibridomas que
producen un anticuerpo monoclonal capaz de unirse específicamente
al HBsAg de tipo salvaje y a dos o más formas mutantes del
HBsAg.
Un anticuerpo monoclonal de la invención puede
obtenerse cultivando un hibridoma de la invención in vitro o
in vivo y obteniendo el anticuerpo monoclonal del medio de
cultivo. En el caso de la producción in vivo, el medio de
cultivo es líquido ascítico.
Los procedimientos para obtener y para
seleccionar los hibridomas y los anticuerpos monoclonales son bien
conocidos por los expertos en la técnica. Kohler y Milstein (1975)
establecieron la metodología general y desde entonces ha habido
numerosas publicaciones sobre el tema. Puede usarse cualquiera de
tales procedimientos para obtener y para seleccionar los hibridomas
y los anticuerpos monoclonales según un procedimiento de la
presente invención. El antígeno utilizado para obtener los
anticuerpos puede ser un HBsAg de tipo salvaje o una forma mutante
de HBsAg, por ejemplo, como se describió anteriormente, por ejemplo,
una o más de las formas mutantes I a IV descritas anteriormente. La
selección de los hibridomas y de los anticuerpos monoclonales
resultantes en cuanto a su capacidad para unirse específicamente a
diferentes formas de HBsAg puede realizarse por medio de cualquier
procedimiento convencional usando HBsAg de tipo salvaje y las formas
mutantes elegidas. Como se describió anteriormente, la selección
puede llevarse a cabo usando, como antígenos de referencia, un
HBsAg de tipo salvaje y dos o más formas mutantes de HBsAg, por
ejemplo, como se describió anteriormente, por ejemplo, dos o más de
las formas mutantes
I a IV.
I a IV.
Para la selección, resulta particularmente
conveniente usar un radioinmunoensayo de captura inversa de IgG,
que es capaz de tener un fondo muy bajo y un gran intervalo
dinámico, y tiene además la ventaja de ser fácil de
implementar.
En un ensayo de captura inversa de IgG para un
anticuerpo de interés, se inmoviliza una IgG
anti-especie adecuada en una fase sólida, por
ejemplo, micropocillos. Si los anticuerpos bajo investigación se han
obtenido, por ejemplo, en ratones, la fase sólida se recubre con
IgG anti-ratón. A continuación se incuba la muestra
bajo investigación con la IgG anti-especie
inmovilizada, con lo que se captura una proporción representativa de
las IgG totales presentes. A continuación se incuba la fase sólida
con un antígeno marcado adecuado, que forma un complejo solamente
con el anticuerpo capturado de interés. A continuación puede
detectarse cualquier complejo formado.
En el presente caso, se incuba una muestra bajo
investigación, por ejemplo, un líquido sobrenadante de cultivo
tisular de un cultivo de hibridoma o líquido ascítico, con
anti-IgG inmovilizado. Los anticuerpos capturados
se incuban por separado con un HBsAg de tipo salvaje marcado y con
dos o más HBsAg mutantes marcados, por ejemplo, como se describió
anteriormente, por ejemplo, seleccionados de las formas mutantes I a
IV. Cualquier muestra que sea capaz de unirse específicamente al
HBsAg de tipo salvaje y a dos o más antígenos de superficie
mutantes contiene un anticuerpo monoclonal ese cae dentro de la
presente invención.
Puede usarse de manera análoga un ensayo de IgM
o IgA de fase inversa para obtener un anticuerpo monoclonal IgM o
IgA.
Los inmunoensayos disponibles en el comercio
para HBsAg son generalmente ensayos de fase heterogénea o de
"captura", en los que se inmoviliza el anti-HBs
en una fase sólida, usualmente micropocillos, pequeñas partículas o
perlas. Cuando una muestra bajo investigación, generalmente suero,
se pone en contacto con el anti-HBs inmovilizado,
el HBsAg presente en la muestra debería unirse al anticuerpo
inmovilizado. A continuación se detecta el antígeno capturado,
generalmente usando un anti-HBs marcado. En los
ensayos convencionales, el anticuerpo usado para la captura o para
la detección puede ser monoclonal o policlonal.
Los anticuerpos policlonales, debido a su
naturaleza, tienen un intervalo de especificidad y de selectividad.
En el caso del VHB, esto puede dar como resultado la presencia en el
antisuero de un anticuerpo que puede unirse a un mutante de escape.
Sin embargo, eso no puede garantizarse, y existe un problema
inherente para obtener la uniformidad del producto entre lote y
lote. Los anticuerpos monoclonales tienen especificidad y
selectividad definidas y pueden por consiguiente fallar en la
detección de mutantes de escape.
El uso de un anticuerpo monoclonal de la
presente invención, que sea capaz de unirse específicamente al HBsAg
de tipo salvaje y al HBsAg mutante, o una combinación de dos o más
de tales anticuerpos, incluyendo fragmentos y derivados de los
mismos, en un inmunoensayo para HBsAg mejora el rendimiento del
ensayo y reduce la posibilidad de que no se detecte el HBsAg
mutante. Un anticuerpo monoclonal de la presente invención o una
combinación de dos o más de tales anticuerpos puede usarse ya sea
como el único reactivo de anticuerpo anti-HBs o, de
preferencia, puede usarse además de anti-HBs
policlonal y otro anti-HBs monoclonal, para la
captura de antígeno y/o para la detección de cualquier complejo
antígeno-anticuerpo resultante. Un anticuerpo
monoclonal de la presente invención, o una combinación de dos o más
de los mismos, puede usarse de manera análoga para
anti-HBs convencional en un ensayo en fase
homogénea para HBsAg. La presente invención por consiguiente
proporciona un inmunoensayo para la detección de HBsAg, que
comprende poner en contacto una muestra en la que se sospecha la
presencia de HBsAg con un anticuerpo monoclonal de la presente
invención, un fragmento o derivado del mismo, o una combinación de
dos o más de los mismos, y detectar cualquier complejo
antígeno-anticuerpo resultante. Puede usarse el
anticuerpo monoclonal, fragmento, o derivado o combinación de los
mismos con otro u otros anticuerpos anti-HBs
seleccionados de anti-HBs policlonales y otros
anticuerpos monoclonales anti-HBs.
Los inmunoensayos de diversos formatos
diferentes, procedimientos para llevarlos a cabo y reactivos
adecuados son bien conocidos y están descritos en diversos libros
de texto y artículos de revisión, por ejemplo, Kemeny y Challacome
1988 y Tsu y Herzenberg 1980. En la presente invención puede usarse
cualquier procedimiento para la detección de un antígeno.
Un ensayo según la presente invención puede ser
un ensayo denominado "sándwich", un ensayo de competición o
una reacción directa. El anticuerpo monoclonal, fragmento, derivado
o combinación de los mismos puede inmovilizarse en una superficie
sólida solo o en una mezcla con un antisuero policlonal
anti-HBs y/o con otro u otros anticuerpos
monoclonales anti-HBs. Como alternativa el
anticuerpo monoclonal de la invención o la combinación de los mismos
y cualquier otro anticuerpo pueden estar en una fase homogénea.
Cualquier complejo anticuerpo-antígeno resultante
puede detectarse usando anti-HBs marcado. En el caso
de un ensayo de fase heterogénea, los anti-HBs
usados para la detección pueden ser los mismos o diferentes de los
usados para recubrir la superficie sólida.
Las superficies sólidas adecuadas en las que
pueden inmovilizarse los anti-HBs son conocidas e
incluyen las paredes internas de los pocillos de placas de
microvaloración, perlas, partículas el denominado "látex".
Pueden usarse membranas y tiras, por ejemplo, de nitrocelulosa o de
papel. Puede incorporarse una membrana o una tira en un dispositivo
de ensayo. Tales dispositivos son también bien conocidos. La
invención incluye tales fases sólidas en las que se inmoviliza un
anticuerpo monoclonal de la presente invención, o un fragmento o
derivado del mismo, o una combinación de dos o más de los
mismos.
Los anti-HBs usados para la
detección de cualquier complejo antígeno-anticuerpo
pueden marcarse con cualquier agente capaz de generar una señal
directamente o indirectamente. Tal agentes son bien conocidos. Los
agentes capaces de generar una señal directa incluyen
radiomarcadores, marcadores cromogénicos y fluorescentes. Los
agentes capaces de generar una señal indirectamente incluyen enzimas
capaces de catalizar una reacción que dé lugar a un cambio de
color.
La presente invención proporciona también un kit
que comprende los componentes necesarios para realizar un
inmunoensayo de la presente invención. Tal kit comprende, por
ejemplo, un anticuerpo monoclonal de la presente invención o una
combinación de dos o más de los mismos inmovilizados en una
superficie sólida, junto con recipiente(s) que
comprende(n) otro(s) reactivo(s)
necesario(s), por ejemplo, seleccionados de soluciones de
lavado y diluyentes, soluciones patrón y reactivos de control,
anticuerpos anti-HBs marcados y, en el caso de
anti-HBs marcados con enzimas, reactivos de
color.
Frecuentemente, un inmunoensayo para anticuerpos
contra la proteína del núcleo de la hepatitis B (HBc) se lleva a
cabo simultáneamente con el ensayo para HBs, por ejemplo, en el
mismo micropocillo. La presente invención incluye el uso de un
anticuerpo monoclonal de la presente invención en tales ensayos, y
kits y fases sólidas recubiertas para uso con tales ensayos.
Como se indicó anteriormente, puede usarse un
anticuerpo monoclonal de la presente invención para la inmunización
pasiva, por ejemplo, durante el transplante de hígado de un paciente
infectado con VHB. Para la inmunización pasiva, se lleva el
anticuerpo a una forma adecuada para el uso como antisuero para
administración parenteral, por ejemplo, en una forma que permita la
derivatización incluyendo la humanización. La dosis de anticuerpo a
usar dependerán de las circunstancias particulares de cada paciente
y se determinarán caso por caso.
Un anticuerpo monoclonal de la presente
invención, incluyendo combinaciones de dos más de tales anticuerpos,
fragmentos y derivados de los mismos, pueden usarse solos o además
de otros anticuerpos anti-HBs, policlonales o
monoclonales. Además pueden incluirse otros anticuerpos
anti-HBV.
Una forma mutante de HBsAg a la que se une un
anticuerpo monoclonal de la presente invención puede usarse por sí
misma como un antígeno; en la producción de anticuerpos
monoclonales; y para la selección de los anticuerpos supuestos
según la presente invención. Tal HBsAg mutante puede obtenerse de un
sujeto sospechado de portar un mutante de escape del VHB. Tal
sujeto será por lo general anti-HBs positivo y HBsAg
positivo. Los sujetos adecuados pueden encontrarse entre los
pacientes que han recibido terapia de anticuerpos monoclonales para
la infección de VHB, en los sujetos vacunados, especialmente en los
que se encuentra irrupción de la infección, y en casos de infección
por VHB difíciles de diagnosticar en laboratorios clínicos usando
ensayos convencionales actuales.
Por medio de tecnología de ADN recombinante
puede producirse una forma del HBsAg mutante, por ejemplo, una de
las formas mutantes descritas anteriormente, por ejemplo, formas
mutantes I a IV. Puede insertarse el ADN que se presenta
naturalmente que codifica la forma mutante en un huésped adecuado
para la expresión del HBsAg mutante. Como alternativa, puede
modificarse el ADN de tipo salvaje, por ejemplo, por mutagénesis
dirigida a sitios, y a continuación usarse para obtener la
expresión de una forma mutante.
El HBsAg obtenido de fuentes naturales,
generalmente de la sangre de un sujeto seleccionado, tendrá
glicosilación natural, y por lo general resulta de preferencia usar
tal HBsAg como un antígeno. Los procedimientos para purificar HBsAg
de la sangre son bien conocidos, véase por ejemplo, Cameron y col.
1980. Puede resultar de preferencia producir un HBsAg mutante
recombinante que esté parcial o completamente glicosilado.
El HBsAg puede tener la longitud completa o
puede usarse un fragmento antigénico adecuado. Tal fragmento puede
obtenerse por medio de tecnología recombinante. Como alternativa,
puede usarse un fragmento que es un péptido antigénico, por
ejemplo, producido por síntesis química. Para el uso como vacuna, un
antígeno debe ser inmunogénico, es decir, capaz de producir una
respuesta protectora.
Los procedimientos para producir anticuerpos
anti-idiotipo son bien conocidos. En el presente
caso se usa un anticuerpo monoclonal de la presente invención como
el antígeno en la producción de un anticuerpo
anti-idiotipo, y los anticuerpos resultantes pueden
seleccionarse contra un anticuerpo monoclonal de la presente
invención. Un anticuerpo anti-idiotipo de la
presente invención puede usarse por sí mismo como una vacuna, de una
manera conocida.
Los siguientes Ejemplos no limitantes ilustran
la presente invención.
Los anticuerpos monoclonales descritos a
continuación se obtuvieron contra el HBsAg mutante de dos pacientes.
Esos pacientes se identificaron como resultado de marcadores
serológicos incoherentes.
El paciente MAM era un portador de VHB. El suero
fue inicialmente, en 1986, HBsAg positivo por el ensayo de
hemaglutinación pasiva inversa basado en anticuerpos policlonales
(RPH) pero negativo por un inmunoensayo enzimático monoclonal
(EIA). En 1988 el paciente fue sometido a transplante renal. Cuando
se ensayó nuevamente, el HBsAg se volvió detectable tanto por medio
de ensayos basados en anticuerpos policlonales como monoclonales
pero pasó a ser no detectable sólo por medio de ensayos de
anticuerpos policlonales. El suero del paciente era
anti-HBc y HBsAg positivo a lo largo del período de
seguimiento.
El paciente NP fue sometido a transplante renal
en 1985. En 1990 el paciente era seropositivo para
anti-HBc pero no se detectaron HBsAg ni
anti-HBs. La hemodiálisis se inició en 1993 y más
adelante en ese año se detectó HBsAg solamente por medio de ensayos
basados en anticuerpos policlonales.
Ninguno de los pacientes había sido vacunado
previamente.
Las secuencias de los genes de HBsAg alrededor
del determinante "a" se determinaron por medio de secuenciación
de hebra única realizada directamente en los productos de PCR como
está descrito en Hawkins y col., 1994.
Se usaron ratones Balb/c hembra.
La purificación de HBsAg necesaria para la
inmunización de los ratones se basó en el procedimiento descrito
por Cameron y col., 1980.
Se fraccionó el suero HBsAg positivo haciendo
pasar volúmenes de 20 ml a través de una columna de Sepharose 6B
(Pharmacia Ltd.) de 100 x 5 cm de diámetro equilibrada con NaCl al
0,9% pH 7,6 tamponada con Tris y que contenía azida sódica al 0,1%
(Tris/Sal/Az). Las fracciones ricas en HBsAg, ahora libres de
albúmina y de IgG, se concentraron hasta un volumen de 9 ml por
ultrafiltración en una celda de ultrafiltración de 200 ml con
agitación montada con una membrana XM 100 A (Amicon Ltd.). A esto se
le añadió 2,69 g de CsCl sólido y se ajustó el volumen hasta 10 ml
dando una densidad de 1,2 g/cm^{3}. A continuación se sometió el
material a ultracentrifugación durante tres días a 124000 g en dos
tubos de 5 ml en una centrífuga con rotor basculante
SW50-L (Beckman RIIC Ltd.) a 20ºC dando bandas
isopícnicas en el gradiente de densidad autoformado.
Se retiró la banda de HBsAg principal que
contenía las pequeñas partículas de 22 nm de ambos tubos, se
combinaron y se llevó a 5 ml con una solución de CsCl en
Tris/Sal/Az (2,885 g más 10 ml) que dio una densidad final de 1,2
g/cm^{3}. Se ultracentrifugó el material bajo las mismas
condiciones anteriores en un tubo de 5 ml dando las segundas bandas
isopícnicas. Se retiró la banda de HBsAg final y se dializó en PBS
para eliminar el CsCl.
Se inyectaron cincuenta microlitros de HBsAg NP
purificado mezclado en un volumen igual de adyuvante de Titermax
(Vaxcel, Inc.) por vía subcutánea en un ratón Balb/c hembra. Tras
aproximadamente dos meses se administró una dosis de 30 \mul por
vía intraperitoneal (i.p) seguida tres meses más tarde por una dosis
de 75 \mul administrada también por vía i.p. Los 25 \mul
finales de HBsAg en solución salina se administraron por vía
intravenosa tres días antes de la fusión.
Se usó el mismo protocolo al inmunizar el ratón
con el HBsAg MAM.
Se cultivaron células JK derivadas de
P3-X63-Ag8653 (Kearney y col., 1979)
en medio completo (véase Reactivos) a 37ºC en aire atmosférico con
CO_{2} al 5% con una humedad de 100%.
Las células se dividieron 1:2 aproximadamente
tres veces por semana y se mantuvieron en una concentración entre 2
x 10^{5} y 2 x 10^{6} células por ml. Para la fusión con
esplenocitos se usaron solamente las células en fase de crecimiento
logarítmico.
Para la fusión, se centrifugaron las células de
mieloma a 1.500 g durante 10 minutos y se lavaron tres veces en el
mismo volumen de medio incompleto (véase Reactivos). Se diluyeron
las células JK resuspendidas 1:10 en medio incompleto y la se
determinó la viabilidad y la concentración de las células contando
las células usando una cámara de Neubauer. Se encontró que la
concentración de células JK era de aproximadamente 5,87 x 10^{7}
células/ml.
Se usaron células de exudado peritoneal de ratón
como una capa de células de alimentación para las células híbridas.
Éstas se prepararon el día previo al inicio de la fusión. Para la
preparación de las células de alimentación se usó medio completo
frío que contenía hipoxantina, aminopterina y timidina (medio
HAT-véase Reactivos). Se inyectaron cinco
mililitros del medio en la cavidad peritoneal de un ratón Balb/c
recientemente sacrificado y tras una agitación suave se retiró de
manera aséptica conteniendo ahora células de exudado. Se añadieron
cien microlitros de las células a cada pocillo de una placa estéril
de 96 pocillos (se necesitaron 4-5 placas por bazo
a fusionar). Todas las placas se examinaron en el día de la fusión
para asegurar que estaban libres de cualquier contaminación
bacteriana o fúngica visible.
La preparación de las células del bazo de los
ratones inmunizados con HBsAg MAM y con HBsAg NP se llevó a cabo
por medio de un procedimiento similar.
El bazo se retiró cuidadosamente del ratón
recientemente sacrificado y se colocó en una placa de petri que
contenía 5 ml de medio completo frío. Se rompió cuidadosamente el
bazo con la parte roma de un escalpelo separando de esta manera las
células del tejido conectivo del bazo. A continuación se transfirió
la suspensión celular a un recipiente universal estéril y se dejó
sedimentar el resto en el fondo. Se retiró cuidadosamente el
sobrenadante y se sedimentaron las células centrifugando a 150 g
durante 10 minutos. Se lavaron las células tres tiempo en 10 ml de
medio incompleto y se resuspendió el sedimento celular final en 10
ml de medio incompleto. El rendimiento y la viabilidad de las
células del bazo se determinó utilizando una cámara de Neubauer. Se
recogieron aproximadamente 7x10^{7} células del bazo de NP
mientras que se obtuvieron 10x10^{7} células de un primer bazo de
MAM y 2,5x10^{7} células del segundo bazo de MAM.
Se mezclaron los esplenocitos con las células de
mieloma en una relación de 4:1 y se centrifugó la mezcla a 1500 g
durante 10 minutos. El eliminó el sobrenadante dejando un sedimento
seco de células en el fondo del recipiente. Este se colocó en un
baño de agua a 37ºC. El polietilenglicol 1540 (PEG) que se había
esterilizado previamente en autoclave también se calentó en el baño
de agua a 37ºC. Se aflojó el sedimento celular en el fondo del
recipiente y se añadió 1 ml de la solución de PEG gota a gota
mientras se mantenía el recipiente con agitación suave. Se dejó la
mezcla de células/PEG a 37ºC durante un minuto y a continuación se
añadieron otros 2 ml de medio incompleto caliente. Se añadió
lentamente más medio incompleto de manera de duplicar el volumen
cada minuto hasta haber añadido 25 ml de medio incompleto. A
continuación se centrifugaron las células fusionadas a 1500 g
durante 10 minutos y se resuspendió el sedimento en 10 ml de medio
HAT. La suspensión celular se distribuyó uniformemente sobre cinco
placas de células de alimentación y a continuación se colocaron en
una incubadora de CO_{2}.
Tras aproximadamente una semana aparecieron
grupos de células fusionadas en crecimiento. En esta etapa se
realimentó a las células reemplazando 100 \mul del medio antiguo
con medio HAT fresco. Tras aproximadamente 14 días de la fusión, se
retiraron 100 \mul del líquido sobrenadante de cada pocillo en que
se encontraron grupos de células fusionadas, y se analizó la
presencia de anti-HBs. Se reemplazó el sobrenadante
con medio completo que contenía hipoxantina y timidina (medio HT
-véase Reactivos).
Se probaron los sobrenadantes de los cultivos de
hibridoma viables en busca de anti-HBs en base a un
ensayo captura inversa.
Se cubrieron micropocillos Nunc de base redonda
con 100 \mul de una dilución 1:1000 en tampón Tris de la fracción
IgG de IgG anti-ratón de conejo. Tras dos días a
temperatura ambiente se lavaron los pocillos con solución salina de
Tween y se extinguió durante una hora con seroalbúmina de bovino en
tampón Tris (tampón Tris BSA-véase Reactivos). A
continuación se sellaron los pocillos y se almacenaron húmedos a
4ºC. Todos los lavados se realizaron con solución salina de
Tween.
Previo a realizar el ensayo, se eliminó el
tampón Tris BSA. Se añadieron cien microlitros de una dilución 1:10
en solución salina tamponada con fosfato del sobrenadante de cada
pocillo en que se encontraron grupos de células fusionadas con
éxito a los pocillos de ensayo y se incubaron a 37ºC durante una
hora. Tras lavar, se añadieron 100 \mul de
^{125}I-HBsAg de tipo salvaje y se dejó en una
caja húmeda a temperatura ambiente durante la noche. A continuación
se lavaron los pocillos de ensayo y se midió la reactividad de unión
en un contador gamma de dieciséis canales. Los sobrenadantes que
contenían anti-HBs dieron una unión mayor del
marcador. Los hibridomas se volvieron a probar posteriormente por
el mismo ensayo usando los marcadores ^{125}I-MAM
y ^{125}I-NP en vez de
^{125}I-HBsAg de tipo salvaje. Cada ensayo
realizado incluyó controles positivos y negativos. Los controles
positivos usados fueron D2H5 y H3F5 monoclonales obtenidos contra
HBsAg de tipo salvaje. Como controles negativos se usó un 3D3F2
monoclonal anti-VIH gag y solución salina tamponada
con fosfato.
A partir de los resultados del ensayo, se
eligieron los pocillos relacionados que contenían colonias que
secretaban anti-HBs para otra selección y
clonación.
Cuando las células tenían buen crecimiento, se
aspiraron usando una pipeta pasteur de vidrio y se transfirieron
de manera aséptica a placas estériles de 24 pocillos que contenían
una capa de células de exudado peritoneal de ratón (CPE) en medio
HT.
Se clonaron los hibridomas identificados como
anti-HBs positivos por dilución limitante. Esto se
realiza para asegurar que el anticuerpo secretado es homogéneo y
monoespecífico. Para cada cultivo híbrido se calculó el volumen de
suspensión celular que contenía 100 células y se añadió este volumen
a 10ml de medio completo. Se añadieron cien microlitros de esta
suspensión celular a cada uno de 48 pocillos de una placa de 96
pocillos que contenía células de alimentación en medio completo. Se
añadieron otras cien células a los 5 ml restantes de medio completo
y se añadieron 100 \mul de esta suspensión más concentrada a 24
pocillos de la placa. Finalmente, se adicionaron otras 100 células
a la suspensión celular restante y se distribuyó esto en los
últimos 24 pocillos. La variación en la concentración de células en
cada placa dio tolerancia para recuentos celulares imprecisos y
baja viabilidad de algunos cultivos. Este procedimiento se repitió
para cada hibridoma seleccionado relacionado.
Tras aproximadamente cinco días de la clonación
se examinaron las placas en busca de pocillos en los que era
visible sólo una colonia. Se retiraron cien microlitros de
sobrenadante de estos pocillos y se volvieron a realizar las
pruebas para anti-HBs usando el ensayo de captura
inversa descrito previamente.
Los clones que secretaban
anti-HBs se expandieron a continuación como
anteriormente y se realimentaron según necesidad por medio de la
eliminación de 100 \mul de sobrenadante del cultivo tisular y su
reemplazo con medio completo fresco.
Una vez que las colonias eran lo suficientemente
grandes para cubrir el pocillo, se expandieron en matraces de
cultivo tisular de 12 cm^{2} que contenían células de alimentación
y a continuación además en matraces de 25 cm^{2} y 75 cm^{2}.
Las células se dividieron 1:2 aproximadamente cada
2-3 días con medio completo fresco.
Una vez establecido un buen crecimiento, se
congelaron algunas células y se almacenaron bajo nitrógeno líquido
en medio incompleto suplementado con sulfóxido de dimetilo al 10% y
suero de ternera fetal al 50%.
Los ratones Balb/c femeninos con
12-20 semanas de edad se cebaron con 0,5 ml de
pristano. Tras una a cuatro semanas cebado, se inyectó por vía
intraperitoneal 1 ml de células clonadas de hibridoma, resuspendidas
en medio incompleto. Se aspiró el líquido ascítico
1-3 semanas más tarde y se separó de las células por
centrigufación a 3000 g durante 10 minutos. A continuación se
almacenó el líquido ascítico a - 20ºC.
El isotipado de los anticuerpos monoclonales se
realizó usando un kit de Serotec (Serotech Limited, 22 Bankside
Station Approach, Kidlington, Oxfords OX5 1BR) específicamente
diseñado para identificar la clase y la subclase de anticuerpos
monoclonales en sobrenadantes de cultivo tisular. Usado de acuerdo
con las recomendaciones del fabricante, caracterizó fácilmente el
anticuerpo monoclonal de ratón.
Se probó el líquido ascítico de cada clon para
detectar la presencia de una banda de proteína monoclonal por medio
de electroforesis de proteínas séricas (SPE, Paragon Electrophoresis
System, Beckman Ltd). Siguiendo el protocolo proporcionado, el kit
identificó convenientemente aquellos líquidos ascíticos que
contenían altos niveles de inmunoglobulina monoclonal.
El kit Paragon Serum Protein Electrophoresis
está ideado para lograr la separación electroforética de las
proteínas en un gel de agarosa tamponado. Tras la electroforesis, se
inmovilizaron las proteínas en el gel en una solución fijadora y se
secó gel hasta obtener una película. El patrón proteico se visualiza
tiñendo la película con un colorante específico de proteínas y se
interpreta el patrón visualmente.
La inmunoglobulina G se preparó por
cromatografía de intercambio iónico a partir de diversos líquidos
ascíticos.
Se resuspendió el gel DE52 (Whatman Ltd),
suministrado previamente hinchado, en un tampón de fosfato 0,2M pH
8,0. A continuación se dispersó el gel en agua destilada dando una
fuerza de tampón 10 mM.
Se empaquetó una columna K9 (Pharmacia) con el
gel DE52 dando una relación de gel con respecto al volumen de la
muestra de 5:1. Todas las columnas se equilibraron con un volumen
igual de tampón de fosfato 10 mM (Pb-véase
Reactivos). Tras la diálisis durante la noche a 4ºC en PB 10 mM, se
colocó la muestra en la parte superior de las columnas y se dejó
absorber durante 30 minutos.
Se recuperó la inmunoglobulina G del líquido
ascítico por elución en etapas con PB 10mM, 30 mM y 60 mM. Se dejó
correr cada tampón a través de la columna y se controló la densidad
óptica del eluyente y se registró a 280 nm (Espectrofotómetro Ultra
Violet, LKB Ltd.). Se recogieron los tres diferentes eluyentes por
separado y se analizaron para detectar la actividad
anti-HBs en el RIA de captura inversa. Pudo
identificarse el eluyente que contenía la mayoría de la reactividad
anti-HBs.
Se calcularon las concentraciones de proteínas
de las IgG de líquido ascítico determinando sus absorbancia en
280nm usando un valor de E1% 1 cm de 1,4 en un
espectrofotómetro.
Como con IgG, la IgA se preparó usando
cromatografía de intercambio iónico. La separación se realizó, sin
embargo, en un gel de Sephacryl. Como con DE52, el gel se equilibró
con tampón de fosfato 10mM. Se colocó la muestra en la parte
superior de la columna y se dejó absorber durante 30 minutos. Como
anteriormente, el líquido ascítico se separó por elución en etapas.
El eluyente se controló y a continuación se probó para detectar la
reactividad anti-HBs.
El marcado de las fracciones de inmunoglobulinas
se realizó mediante el procedimiento de iodogen (Salacinski y col.,
1979).
Se recubrieron inicialmente tubos de vidrio de
7,5 x 10 cm con 5 \mug de cloroformo. A los tubos de iodogen se
les añadieron 15 \mug de proteína en PBS. Finalmente se añadió
Na^{125}I (0,5 miCi, Amersham International Plc) y se dejó
proceder la reacción en el tubo durante 10 minutos sobre hielo. El
iodogen actúa como agente oxidante suave para el Na^{125}I para
unirse a un residuos tirosina en la proteína.
A continuación se empaquetó una columna K9 con
Sephadex G-25 y se equilibró en tampón Tris BSA. Se
añadió yoduro no radiactivo (KI/NaI) en PBS a la columna G25 ya que
éste reduce la tendencia de que el ^{125}I se pegue a la columna.
A continuación se retiró la mezcla de reacción del tubo de iodogen y
se transfirió a la columna. El tampón Tris BSA se usó a
continuación para eluir y se controló el eluyente. Se recogió la
fracción de proteína marcada con ^{125}I del primer pico y se
detuvo a medida que comenzó a disminuir el pico. A continuación se
almacenó la proteína marcada a 4ºC en tampón Tris salino que
contenía BSA al 5%.
Se continuó la elución hasta la aparición de
^{125}I libre (es decir el segundo pico). La altura de este pico
comparada con la altura del primer pico dio una estimación del
porcentaje de ^{125}I unido.
Se probaron los sueros de los pacientes MAM y NP
en una serie de ensayos para HBsAg. Los resultados de la
comparación de los procedimientos basados en anticuerpos
monoclonales y policlonales se muestran en la Tabla 1 a
continuación.
Los resultados de la secuenciación revelaron
varias mutaciones puntuales en el determinante "a" de ambos
pacientes. Las mutaciones se encontraron en el ADN de VHB
amplificado del paciente NP (subtipo ayw) en los codones del
antígeno de superficie que codifican los aminoácidos 133, 134 y 144.
Las mutaciones se encontraron en los codones que codifican los
aminoácidos 133, 134, 142, 144 y 145 en el ADN de VHB amplificado
del paciente MAM (subtipo adr). Esas mutaciones se detectaron
previamente y tras el transplante. Las secuencias no difirieron
entre el período en que HBsAg fue detectable por medio de cualquier
ensayo basado en anticuerpos policlonales solos con respecto al
tiempo en que HBsAg fue detectable tanto por medio de ensayos
basados en anticuerpos monoclonales como policlonales. Las
mutaciones se muestran en la Tabla 2.
El HBsAg MAM es HBsAg Mutante I y el HBsAg NP es
HBsAg Mutante II. La secuencia completa de aminoácidos de HBsAg, y
la secuencia de nucleótidos que lo codifican, se presentan en
Valenzuela y col. (1979).
\vskip1.000000\baselineskip
Los hibridomas que secretaban
anti-HBs se identificaron inicialmente usando el
ensayo de captura inversa (véase la sección II, 4.5).
Aproximadamente una semana tras la fusión se probaron todos los
pocillos que contenían grupos de crecer en crecimiento para
detectar la actividad anti-HBs. Cada ensayo
realizado incluyó controles negativos y positivos.
Las células que surgieron de la fusión de MAM se
probaron en RIA en primer lugar con el ^{125}I HBsAg MAM mientras
que aquellas que surgieron de la fusión de NP se probaron con el
^{125}I HBsAg NP. Los resultados del ensayo darían una indicación
de aquellos clones que estaban produciendo anticuerpos contra sus
antígenos de superficie respectivos. Se consideraron positivos los
hibridomas que dieron recuentos por encima de 750 cpm. Se ha
mostrado que de los 320 clones de MAM probados, el 10% fueron
positivos mientras que el 8% de los 200 clones de NP fueron
positivos.
Para comprobar si existe cualquier reactividad
contra el HBsAg de tipo salvaje (WT), se probaron clones de las
fusiones de NP y de MAM, sin tener en cuenta si eran positivos en el
ensayo previo en RIA de captura inversa usando el marcador
^{125}I HBsAg WT. Como anteriormente, una unión aumentada del
marcador indicó un resultado positivo. Se consideraron positivos
los hibridomas que dieron recuentos por encima de 650 cpm. De los
320 clones de MAM probados, el 6% dio resultados positivos mientras
que se encontró que el 4% de los clones de NP se unieron al
^{125}I HBsAg WT.
Con los resultados obtenidos hasta el momento
fue posible identificar aquellos clones que secretaban
anti-HBs que estaban reconociendo específicamente y
por consiguiente uniéndose al antígeno de superficie de hepatitis B
de MAM, de NP o del WT.
Para determinar si había alguna reactividad
cruzada dentro de estos hibridomas se probaron los clones de NP con
^{125}I HBsAg MAM y los clones de MAM con el ^{125}I HBsAg NP.
Se encontró que 4 de los clones de MAM reconocieron el marcador de
NP mientras que 5 de los clones de NP fueron reconocidos por el
marcador de MAM.
Los clones se habían probado con todas las
combinaciones de marcador. Fue por lo tanto posible identificar
aquellos hibridomas que habían dado coherentemente resultados
positivos fuertes ya sea con el ^{125}I HBsAg MAM, ^{125}I
HBsAg de NP o con ^{125}I HBsAg de WT. Los anticuerpos
monoclonales pueden ahora dividirse en las siguientes categorías:
1) específico de MAM; 2) específico de NP; 3) específico de MAM/NP;
4) específico de MAM/WT; 5) específico de NP/WT; 6) específico de
NP/WT/MAM.
Se eligieron ocho hibridomas relacionados con NP
y diez relacionados con MAM que cayeron en una de las categorías
enumeradas anteriormente. Se eligieron estos hibridomas porque
presentaron buen crecimiento celular y también resultaron positivos
en repetidas veces al probarse la actividad
anti-HBs.
A continuación se clonaron los dieciocho
hibridomas elegidos por dilución limitante. Tras aproximadamente
catorce días de la clonación, se probaron los pocillos que contenían
colonias únicas en el ensayo de captura inversa con los tres
marcadores. Seis de los ocho hibridomas de NP clonaron con éxito y
se encontró que fueron todavía positivos para actividad
anti-HBs.
Sin embargo, con los clones de MAM, se encontró
que solamente seis de los diez hibridomas elegidos clonaron. Los
intentos de volver a clonar los hibridomas a partir de sus
respectivas colonias relacionadas no resultaron satisfactorios a
pesar de aumentar la concentración de células añadidas a cada placa.
Los seis hibridomas clonados satisfactoriamente que contenían
colonias únicas se probaron para actividad anti-HBs.
De los seis, se encontró que dos hibridomas, M3C9 y M3A10, ambos
con especificidad cruzada triple resultaron aún positivos para
anti-HBs. Los hibridomas derivados de la fusión de
MAM resultaron ser extremadamente inestables a medida que sufrían
pasajes.
Se eligieron al menos tres clones positivos de
cada hibridoma para la expansión. Los clones se propagaron en
cultivo y se probaron nuevamente dos semanas más tarde. Todos los
clones de NP continuaron siendo positivos para la secreción de
anti-HBs. Sin embargo de los clones de MAM, M3C9
resultó también ser extremadamente inestable dando resultados
negativos en RIA.
Los hibridomas secretores positivos finales de
cada fusión se muestran en la Tabla 3 a continuación. La tabla
también da la especificidad del anticuerpo monoclonal y sus valores
de RIA redondeados hasta los 500 cpm más cercanos.
Se realizó una segunda fusión de MAM. La fusión
se llevó a cabo como se describió anteriormente. Sin embargo, el
rendimiento de células del bazo fue sólo del 25% de la registrada en
la fusión original de MAM. Aproximadamente una semana más tarde, se
probaron todos los pocillos que contenían grupos de células en
crecimiento para detectar actividad anti-HBs usando
RIA de captura inversa. Como anteriormente, cada ensayo realizado
incluyó controles negativos y positivos. Se probaron todas las
células que surgieron de la fusión con cada uno de los marcadores,
^{125}I HBsAg MAM, ^{125}I HBsAg NP y ^{125}I HBsAg de WT.
De los 68 clones probados, solamente tres
produjeron resultados positivos. Se encontró que un clon resultó
específico de MAM mientras que los otros dos, M4H2 y M4F5,
resultaron con especificidad cruzada para WT/NP/MAM (Tabla 4). Sin
embargo, como se describe con más detalle a continuación, M4H2 probó
ser inestable, como algunos de los hibridomas de la primera fusión
de MAM. Se estabilizó eventualmente como un clon específico de
MAM.
Los tres hibridomas mostraron buen crecimiento
celular y se clonaron por dilución limitante. La clonación en esta
ocasión resultó satisfactoria y todos los pocillos que contenían
colonias únicas se probaron en RIA de captura inversa con los tres
los marcadores. Los clones resultaron ser aún positivos para
actividad anti-HBs.
Se eligieron cinco clones positivos para la
expansión. Tras otro crecimiento en cultivo, se seleccionaron los
clones y resultaron ser aún positivos para producción de
anti-HBs.
El número final de hibridomas positivos
relacionados y sus especificidades de anticuerpo y reactividad
cruzada obtenidos de la fusión de NP y de las dos fusiones de MAM
se muestran en la Tabla 5.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizaron otros estudios competición cruzada
usando los anticuerpos P2D3, M4F5 y M3A10 con HBsAg WT, NP y MAM.
Cada uno de esos anticuerpos compitieron de manera cruzada con
alguno de los otros anticuerpos monoclonales obtenidos. En esta
etapa M4H2 aparecía aún como una cruzada triple.
Estos resultados indican además que los
anticuerpos monoclonales de la invención se unen a un epítopo
distinto.
Se eligió un clon positivo de cada hibridoma
relacionado y se inyectó en un ratón Balb/c previamente cebado con
pristano. Una a tres semanas tras la inoculación intraperitoneal, se
recogió el líquido ascítico de los ratones. Todos los clones
produjeron con éxito tumores ascíticos en los ratones. La cantidad
de líquido ascítico obtenido de cada ratón varió desde 1 ml hasta 5
ml.
Se realizaron estudios de competición cruzada
mas extensos usando diversos anticuerpos diferentes, cada uno con
HBsAg WT, MAM y NP. Esos ensayos se realizaron según el protocolo de
RIA de captura inversa presentado anteriormente con las siguientes
modificaciones: los micropocillos se recubrieron con un anticuerpo
anti-HBs policlonal de cabra. En cada se añadieron
100 \mul del antígeno y se incubó durante la noche, a continuación
se añadieron 50 \mul de cada uno de los anticuerpos monoclonales,
marcado con ^{125}I y sin marcar, y se determinó la unión. Los
resultados se presentan en las Tablas 6a, 6b y 6c. En esas Tablas,
se presentan horizontalmente los anticuerpos marcados y
verticalmente los anticuerpos sin marcar.
\newpage
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
\cr
\cr}
\newpage
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
\cr \cr
\cr}
\newpage
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
\cr \cr
\cr}
\newpage
Los resultados mostrados en las Tabla 6a, 6b y
6c confirman que los anticuerpos con especificidad cruzada triple
M4F5 y P2D3 se unen a un epítopo común.
Se encontró que M3A10 resultó ser previamente un
anticuerpo con especificidad cruzada triple (véase Tabla 4). El
hecho que es un anticuerpo IgA (véase Sección III.4 a continuación)
puede explicar los pobres resultados de unión mostrados en la Tabla
6a ya que esta clase de anticuerpos (IgA) es difícil de
purificar.
Como se muestra anteriormente, el hibridoma
M4H2, que se produjo en la segunda fusión de MAM, resultó ser
inicialmente de especificidad cruzada triple (véase Tabla 4). Sin
embargo, tras otro crecimiento en cultivo, ese hibridoma mostró
unión decreciente a ^{125}I HBsAg WT y al ^{125}I HBsAg NP. La
reiteración de pruebas para actividad anti-HBs
contra el HBsAg WT y NP durante un período de tiempo revelaron
resultados negativos. Sin embargo, M4H2 continuó reconociendo y
uniéndose fuertemente al ^{125}I HBsAg MAM. Parece por
consiguiente, que la especificidad de clon era inicialmente
inestable y con el paso del tiempo evolucionó a un hibridoma
secretor de anticuerpos específicos de MAM.
La unión de los anticuerpos marcados con
^{125}I a diversos HBsAg diferentes se midió usando un RIA en el
que el HBsAg estaba inmovilizado a la fase sólida (micropocillos)
por medio de un anti-HBs policlonal de cabra con
que se recubrieron los micropocillos. Los HBsAg usados fueron HBsAg
WT, MAM y NP, que se describieron anteriormente, HBsAg SP y HBsAg
SZ. El HBsAg SP, que es del serotipo adw, tiene una mutación en el
codón para el aminoácido 143 que lleva a la sustitución de met por
ser. En el HBsAg SZ, del serotipo adr, una mutación lleva a la
sustitución de arg por gly en la posición 145. (HBsAg SP es HBsAg
Mutante IV y HBsAg SZ es HBsAg Mutante III). Como control se usó
una combinación de sueros humanos normales que se había probado y
había resultado estar libre de marcadores de hepatitis B (NHS).
Este es un ejemplo de un inmunoensayo según la presente invención.
Los resultados se presentan en la Tabla 7 a continuación.
Estos resultados muestran que los anticuerpos
con especificidad cruzada triple detectan el HBsAg de tipo salvaje
y también HBsAg de diversos mutantes diferentes, incluyendo HBsAg
mutante diferente del usado para la selección de los anticuerpos.
Estos resultados confirman además que los anticuerpos con
especificidad cruzada triple se unen a un epítopo común a la
proteína de tipo salvaje y a formas mutantes y demuestran la
utilidad de los anticuerpos en los ensayos de HBsAg. Usando tales
anticuerpos es posible detectar la presencia de mutantes de
escape.
El isotipado de los anticuerpos monoclonales se
realizó usando un kit de Serotec. Cada reactivo de isotipado estaba
constituido por anticuerpo monoclonal purificado de rata específico
para una única clase-subclase de inmunoglobulina,
acoplado a glóbulos rojos de oveja. Los anticuerpos acoplados de
rata reconocieron la porción de cadena pesada de la inmunoglobulina
de ratón. El principio del sistema de prueba estaba basado en la
aglutinación de glóbulos rojos donde se producía un resultado
positivo de aglutinación cuando un anticuerpo altamente específico
reconocía y se unía al isotipo particular al que estaba dirigido. La
unión formó una red en el fondo del pocillo de la placa de
microvaloración. Un resultado negativo se produjo cuando se ponían
las células reactivas en un sobrenadante que contenía una clase de
anticuerpo que no reconocían. Las células reactivas caían al fondo
del pocillo formando un pequeño "botón".
Los isotipos de los anticuerpos monoclonales se
muestran en la Tabla 8.
Se demostró la presencia de proteína monoclonal
en el líquido ascítico de todos los clones por electroforesis de
proteínas del suero. La movilidad electroforética de la banda de
proteína monoclonal varió ligeramente para cada líquido ascítico
monoclonal diferente, pero fue idéntica para los diferentes lotes de
líquido ascítico obtenidos del mismo clon. La disparidad en la
distancia de migración entre clones fue el resultado de las cargas
iónicas diferentes en las proteínas monoclonales. La intensidad de
tinción observada en la banda monoclonal de SPE dio una indicación
de la cantidad de proteína monoclonal presente. Esto varió entre los
líquidos ascíticos recogidos de diferentes clones. Sin embargo, no
se observó una banda en la SPE con M4B12, el anticuerpo monoclonal
específico de MAM. Cuando se probó el líquido ascítico recuperado en
el RIA para actividad anti-HBs, el resultado fue
negativo; todos los otros líquidos ascíticos dieron los resultados
positivos esperados. Como anteriormente el anticuerpo monoclonal
específico de MAM probó ser inestable cambiando de hibridoma
secretor positivo a negativo. (El hibridoma relacionado con M4B12
ha sido reclonado y se probará nuevamente).
La preparación de inmunoglobulinas a partir de
líquidos ascíticos se realizó como se describió en las secciones
III, 3 y III, 4 anteriormente. La inmunoglobulina G se preparó por
medio de cromatografía de intercambio iónico en DE52 mientras que
IgA se preparó en una columna de Sephacryl. Se obtuvieron tres picos
separados al aumentar la fuerza iónica de PB 10 mM hasta 30 mM y
finalmente 60 mM para cada líquido ascítico monoclonal. Los tamaños
de los picos variaron de un líquido monoclonal a otro. Se recogió el
eluyente en cada pico. A continuación se midieron las IgG/IgA
anti-HBs en las diferentes concentraciones del
tampón en el ensayo de captura inversa con ^{125}I HBsAg MAM,
^{125}I HBsAg NP y ^{125}I HBsAg WT. El ensayo permitió realizar
una comparación directa de resultados entre las diferentes
fracciones de tampón realizadas. A partir del ensayo, fue posible
elegir la fracción que mostró la actividad anti-HBs
más alta. Se determinaron las concentraciones de proteína de las
fracciones elegidas (Tabla 9). La cantidad de IgG/IgA obtenida de
cada anticuerpo monoclonal varió entre cada lote de líquido
ascítico recogido.
\vskip1.000000\baselineskip
La intensidad de tinción de la banda monoclonal
en la SPE mostró correlación fuertemente positiva con los
resultados de concentración de proteína de la Tabla 7. Por ejemplo
P4C11 mostró una banda teñida muy oscura en la SPE y tenía una
concentración proteica elevada mientras que P2H9 mostró una banda
débilmente teñida y tenía una concentración proteica baja.
Los resultados de los ensayos de detección de
HBsAg han confirmado que como resultado de mutaciones, puede no
detectarse HBsAg en suero por medio de algunos sistemas basados en
anticuerpos monoclonales. Tales mutaciones pueden provocar el fallo
del anticuerpo de captura o del anticuerpo de detección conjugado a
unir. Estos resultados muestran la importancia de realizar pruebas
para un segundo marcador en casos sospechosos de infecciones por
VHB cuando el ensayo inicial de selección para HBsAg es negativo. NP
y MAM hubieran mostrado un único perfil anti-HBc si
se hubieran realizado pruebas para HBsAg con un ensayo basado en
anticuerpos monoclonales. La presencia de HBsAg en las muestras se
reveló al realizar pruebas por los sistemas basados en anticuerpos
policlonales.
Se detectó una mutación en el aminoácido 145
(glicina por lisina) en el paciente MAM. Aunque esta mutación era
diferente de la descrita previamente en los mutantes de escape de
vacunas (glicina por arginina), la sustitución de aminoácidos fue
tal que el efecto predicho en la estructura del antígeno es
similar.
El paciente NP no tenía una mutación en el codón
145 sino múltiples mutaciones como con el paciente MAM. No se ha
determinado cuál de las mutaciones es responsable de la pérdida de
detectabilidad. Resulta interesante destacar que en el paciente MAM
las secuencias de nucleótidos no variaron con el cambio en la
especificidad de HBsAg en los ensayos de detección de HBsAg. Esto
pudo haber sido por el surgimiento del virus de tipo salvaje
presente en menos de 15-20% de la carga viral total,
el límite de detección por análisis de secuencia directa.
La producción de anticuerpos monoclonales contra
los antígenos de superficie de hepatitis B mutantes fue
satisfactoria. El número de clones producidos en la fusión de NP y
la fusión inicial de MAM y la distribución relativa de las
especificidades de los anticuerpos resultantes fueron favorables.
Para identificar los hibridomas secretores de
anti-HBs, fue necesario un ensayo sensible pero
rápido de selección. Se eligió un radioinmunoensayo de captura
inversa de IgG. El ensayo, aunque sencillo de implementar, es capaz
de tener un fondo muy bajo y un intervalo dinámico grande. La unión
relativa por los clones positivos de HBsAg de tipo salvaje y HBsAg
mutante marcados fue indudablemente alta y coherente dando
resultados fiables.
La selección los hibridomas se realizó
inicialmente probando aquellos clones derivados de la fusión de MAM
con ^{125}I HBsAg MAM y los clones de NP con ^{125}I HBsAg NP.
Los resultados de este ensayo dieron una indicación de aquellos
clones que producían específicamente anti-HBs que
reconocían y por consiguiente se unían al HBsAg MAM o al HBsAg NP.
Todos los clones producidos como resultado de las dos fusiones se
probaron a continuación con ^{125}I HBsAg WT. Ningún clon único
dio una reacción positiva solamente con el HBsAg WT. Se encontraron
reacciones cruzadas de MAM/WT o de NP/WT.
Por consiguiente resultó posible identificar
aquellos clones que reconocían el HBsAg MAM o el HBsAg NP. También
fueron identificados aquellos clones que se unían también al HBsAg
NP y al WT. Para probar cualquier reactividad cruzada entre los
hibridomas se probaron los clones producidos a partir de la fusión
de MAM con ^{125}I HBsAg NP y viceversa. Como resultado de los
ensayos de selección, fue posible categorizar los clones como se
presentan en la sección de Resultados.
Los controles positivos incluidos en el ensayo
fueron dos anticuerpos monoclonales conocidos de HBsAg WT, H3F5 y
D2H5 mientras que los controles negativos fueron PBS y 3D3F2, un
monoclonal anti-VIH gag. Según lo esperado cuando
se usa en el RIA de ^{125}I HBsAg WT, H3F5 y D2H5 dieron
resultados fuertemente positivos. Sin embargo cuando se probaron
nuevamente contra ^{125}I HBsAg MAM solamente H3F5 dio una lectura
positiva y fue negativo cuando se probó con el ^{125}I HBsAg NP.
Aunque D2H5 produjo una señal positiva con el ^{125}I HBsAg NP
fue muy débil cuando se probó nuevamente contra ^{125}I HBsAg MAM.
Las mutaciones en el HBsAg MAM eliminaron el epítopo para D2H5
mientras que aquellas en el HBsAg NP eliminaron el epítopo para
H3F5.
Los resultados obtenidos al probar con el HBsAg
mutante SP y de SZ muestran que los anticuerpos con reactividad
cruzada triple son capaces de detectar otras formas mutantes de
HBsAg además de aquellas usadas en el procedimiento de selección.
Esto confirma que los anticuerpos se unen a un epítopo que está
conservado entre la proteína de tipo salvaje y las formas mutantes,
y confirma de esa manera el valor de incluir tales anticuerpos en un
ensayo de HBsAg.
Aunque algunos de los hibridomas de las fusiones
de MAM resultaron ser inestables, se obtuvieron reacciones cruzadas
triples satisfactorias fácilmente a partir de las fusiones de MAM y
de NP. Las formas mutantes de HBsAg diferentes de las formas MAM y
NP pueden usarse para obtener y/o seleccionar anticuerpos
monoclonales según los protocolos descritos anteriormente.
Nota: La Figura 1b es una versión mecanografiada
del la Figura 1a. En caso de cualquier discrepancia entre la Figura
1a y la Figura 1b, se tomará a la Figura 1a como la versión
auténtica.
\vskip1.000000\baselineskip
Tampón Tris 0,02 M pH 7,6 (tampón Tris)
Tampón Tris BSA 0,02 M
\vskip1.000000\baselineskip
Añadir BSA al 0,5% al tampón Tris 0,02 M pH
7,6.
\vskip1.000000\baselineskip
Tampón Fosfato 0,2 M (PB)
\vskip1.000000\baselineskip
Solución A = KH_{2}PO_{4} 0,2 M
Solución B = Na_{2}HPO_{4} 0,2 M
\vskip1.000000\baselineskip
Tomar 200 ml de solución B. Ajustar el pH hasta
8,0 con la solución A.
\vskip1.000000\baselineskip
PB 10, 20, 30 y 60 mM
\vskip1.000000\baselineskip
Para PB 10 mM diluir PB 0,2 M 1:20 en agua
destilada.
Para PB 30 mM diluir PB 0,2 M 1:6,6 en agua
destilada.
Para PB 60 mM diluir PB 0,2 M 1:3,3 en agua
destilada.
Claims (31)
1. El anticuerpo monoclonal P2D3 como el
producido por el hibridoma denominado P2D3 y depositado en ECACC
bajo número de acceso 97042331, o un anticuerpo monoclonal que
compite de manera cruzada con el anticuerpo monoclonal P2D3 para
unirse a un antígeno de superficie de hepatitis B de tipo salvaje,
también denominado HBsAg, y al menos a dos formas mutantes de
HBsAg, en el que las formas mutantes de HBsAg tienen una sustitución
de aminoácidos con relación al HBsAg de tipo salvaje dentro de la
secuencia que codifica los aminoácidos 133 a 145 del HBsAg.
2. Un anticuerpo monoclonal según la
reivindicación 1, en el que una forma mutante de HBsAg tiene la
secuencia de HBsAg presente en un mutante de escape del VHB.
3. Un anticuerpo monoclonal según la
reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que la sustitución de
aminoácidos es el resultado de una mutación puntual.
4. Un anticuerpo monoclonal según una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 3, en el que un HBsAg mutante tiene una
sustitución de aminoácidos con relación al HBsAg de tipo salvaje en
más de una de las posiciones 133, 134, 141, 142, 143, 144 y
145.
5. Un anticuerpo monoclonal según una de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que la sustitución está en una o más
cualesquiera de las posiciones 143, 144 y 145.
6. Un anticuerpo monoclonal según la
reivindicación 1 que compite de manera cruzada con el anticuerpo
monoclonal P2D3 para unirse a un HBsAg de tipo salvaje y al menos a
dos de las siguientes formas mutantes de HBsAg:
- HBsAg Mutante I, denominado también HBsAg "NP": subtipo ayw, mutaciones met por ile en el aminoácido 133; phe por his en el aminoácido 134; y asp por val en el aminoácido 144;
- HBsAg Mutante II (HBsAg "MAM"): subtipo adr, mutaciones met por ile en el aminoácido 133; phe por asn en el aminoácido 134; pro por ser en el aminoácido 142; ser por leu en el aminoácido 143; y gly por lys en el aminoácido 145;
- HBsAg Mutante III, denominado también HBsAg "SZ": subtipo adr, mutación gly por arg en el aminoácido 145;
- HBsAg Mutante IV, denominado también HBsAg "SP": subtipo adw, mutación ser por met en el aminoácido 143.
7. Un anticuerpo monoclonal según la
reivindicación 1, que es el anticuerpo monoclonal M2A10 como se
produce por medio del hibridoma denominado M3A10 y depositado en
ECACC bajo número de acceso ECACC 97042330.
8. Un anticuerpo monoclonal según la
reivindicación 1, que es el anticuerpo monoclonal M4F5 como se
produce por medio del hibridoma denominado M4F5 y depositado en
ECACC bajo número de acceso ECACC 97042519.
9. Un anticuerpo monoclonal según una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 8, en una forma humanizada.
10. Un fragmento o un derivado de un anticuerpo
monoclonal según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, cuyo
fragmento o derivado compite de manera cruzada con el anticuerpo
monoclonal P2D3 en la unión al HBsAg de tipo salvaje y al menos a
dos formas mutantes de HBsAg.
11. Un procedimiento para producir un hibridoma
capaz de producir un anticuerpo monoclonal según una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 9, que comprende inmunizar un animal con un
HBsAg de tipo salvaje o una forma mutante del antígeno HBsAg,
opcionalmente en la forma de un fragmento antigénico adecuado o
derivado del mismo, inmortalizar células productoras de anticuerpos
para formar hibridomas, seleccionar los cultivos de hibridomas para
competición cruzada con el anticuerpo monoclonal P2D3 o un
anticuerpo monoclonal según una cualquiera de las reivindicaciones
2 a 4 para unirse a un HBsAg de tipo salvaje y dos o más formas
mutantes de HBsAg, opcionalmente en la forma de un fragmento
antigénico adecuado o derivado del mismo, y seleccionar aquellos
hibridomas que producen anticuerpos que compiten de manera
cruzada.
12. Un hibridoma capaz de producir un anticuerpo
monoclonal según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.
13. El hibridoma denominado P2D3 y depositado en
ECACC bajo número de acceso ECACC 97042331.
14. El hibridoma denominado M3A10 y depositado
en ECACC bajo número de acceso ECACC 97042330.
15. El hibridoma denominado M4F5 y depositado en
ECACC bajo número de acceso ECACC 97042519.
16. Un procedimiento para producir un anticuerpo
monoclonal según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 que
comprende cultivar, in vitro o in vivo, un hibridoma
según una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15 o como se
obtiene por medio de un procedimiento según la reivindicación 11, y
obtener el anticuerpo monoclonal a partir del medio de cultivo.
17. Un inmunoensayo para la detección de HBsAg,
que comprende poner en contacto una muestra bajo investigación con
un anticuerpo monoclonal según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, un fragmento o derivado del mismo según la
reivindicación 10, o una combinación de dos o más de los mismos, y
detectar cualquier complejo antígeno-anticuerpo
resultante.
18. Un inmunoensayo según la reivindicación 17,
en el que el anticuerpo monoclonal, fragmento, derivado o
combinación de los mismos se usa en combinación con otro u otros
anticuerpos seleccionados de anticuerpos policlonales
anti-HBs y otros anticuerpos monoclonales
anti-HBs.
19. Un inmunoensayo según la reivindicación 17 o
la reivindicación 18 en un formato homogéneo o heterogéneo.
20. Un inmunoensayo según la reivindicación 19,
en un formato de captura o competitivo.
21. Un inmunoensayo según una cualquiera de las
reivindicaciones 17 a 20, en el que se realiza un inmunoensayo para
la detección de anticuerpos para la proteína del núcleo de hepatitis
B (HBc) simultáneamente con el ensayo para HBsAg.
22. Un kit de inmunoensayo que comprende un
anticuerpo monoclonal según una cualquiera de las reivindicaciones
1 a 9, un fragmento o derivado del mismo según la reivindicación 10,
o una combinación de dos o más de los mismos, y otros reactivos
necesarios para llevar a cabo un inmunoensayo para HBsAg y
opcionalmente también reactivos para detectar anticuerpos
anti-HBc.
23. Un kit según la reivindicación 22, que
comprende también reactivos para detectar anticuerpos
anti-HBc.
24. Un kit según la reivindicación 22 o la
reivindicación 23, que comprende también otros anticuerpos
anti-HBs seleccionados del grupo constituido por
anticuerpos policlonales anti-HBs y anticuerpos
monoclonales anti-HBs.
25. Un kit según una cualquiera de las
reivindicaciones 22 a 24, en el que los reactivos necesarios para
llevar a cabo un inmunoensayo para HBsAg se seleccionan de
soluciones de lavado, diluyentes, soluciones patrón, reactivos de
control y anticuerpos anti-HBs marcados.
26. Una fase sólida, adecuada para uso en un
inmunoensayo, sobre el que se inmoviliza un anticuerpo monoclonal
según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, un fragmento o
derivado del mismo según la reivindicación 10, o una combinación de
dos o más de los mismos.
27. Una fase sólida según la reivindicación 26,
en el que otro u otros anticuerpos anti-HBs
seleccionados de anticuerpos anti-HBs policlonales
y otros anticuerpos anti-HBs monoclonales están
también inmovilizados en la fase sólida.
28. Una fase sólida según la reivindicación 26 o
la reivindicación 27 sobre la que se inmoviliza también un agente
que captura anticuerpos anti-HBc.
29. Una composición adecuada para usar
terapéutica o preventivamente para inmunización pasiva contra el VHB
que comprende un anticuerpo monoclonal según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, un fragmento o derivado según la
reivindicación 10, o una combinación de dos o más de los mismos,
mezclados con un vehículo farmacéuticamente adecuado.
30. Una composición según la reivindicación 29
que comprende también otros anticuerpos seleccionados del grupo
constituido por anticuerpos policlonales anti-HBs y
anticuerpos monoclonales anti-HBs.
31. Un anticuerpo anti-idiotipo
para un anticuerpo monoclonal según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, o un fragmento o derivado del mismo según
la reivindicación 10.
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