ES2297855T3 - Anticuerpos monoclonales contra la hepatitis b. - Google Patents

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A UN ANTICUERPO MONOCLONAL QUE ES CAPAZ DE UNIRSE ESPECIFICAMENTE AL TIPO SILVESTRE DE HBSAG Y A AL MENOS DOS FORMAS MUTANTES DE HBSAG. DICHOS ANTICUERPOS SE PUEDEN UTILIZAR EN UN INMUNOENSAYO MEJORADO PARA LA DETECCION DE AMBOS MUTANTES ASILVESTRADOS Y DEL TIPO SILVESTRE DE HBSAG, Y SE PUEDEN UTILIZAR PARA LA INMUNIZACION PASIVA FRENTE A HBV.

Description

Anticuerpos monoclonales contra la hepatitis B.

En una escala global, el virus de la hepatitis B (VHB) es el más significativo de los virus hepatotropos en términos de número de personas infectadas de manera crónica y gravedad de las complicaciones de la infección.

La hepatitis B surgió como un problema mayor tras la introducción de la terapia parenteral, las campañas masivas de inmunización y la transfusión extensa de sangre y de hemoderivados. Los largos períodos de incubación, la alta incidencia de infecciones asintomáticas y la presentación de un estado infeccioso de portador hacen que el VHB sea adecuado para la transmisión por la sangre. Muchos trabajadores han proporcionado también evidencias para la transmisión sexual del VHB, y la transmisión del virus de la hepatitis B de madres portadoras a sus bebés puede producirse durante el período perinatal.

El VHB, un virus de ADN, es un miembro del grupo de virus hepadna. La microscopía electrónica del VHB revela una partícula esférica con doble cubierta con un diámetro de 42 nm denominada "partícula de Dane". Esas partículas virales exhiben un núcleo interno esférico electrónicamente denso con un diámetro de aproximadamente 22-25 nm y un recubrimiento externo de 7 nm de espesor. El recubrimiento externo del virus porta el antígeno de superficie (llamado en este documento "HBs" o "HBsAg") al que está dirigido el anticuerpo neutralizante del virus. Las partículas esféricas del núcleo interno de 20 nm de diámetro portan el antígeno del núcleo viral (HBcAg) y el antígeno e (HBeAg), el ADN viral, la actividad ADN polimerasa y una actividad proteína quinasa.

El HBsAg contiene el principal epítopo neutralizante del VHB, denominado determinante "a", que abarca los aminoácidos 124 a 147 y es común a todos los aislamientos de VHB, véase por ejemplo, Pugh y col. (1986). El desarrollo de anti-HBs tras la infección aguda o crónica de VHB está asociado generalmente con recuperación y un buen pronóstico. El Anti-HBs está asociado también con la producción de anticuerpos neutralizantes como resultado de la vacunación. La mayoría de los anti-HBs encontrados en sueros de convalecientes y posteriores a la vacunación se unen en la región del determinante "a", que tiene una estructura hasta indefinida hasta el momento. Está claro que el determinante "a" es altamente conformacional porque la desnaturalización de esa área por alquilación o reducción da lugar a partículas de HBsAg con antigenicidad muy reducida. Se piensa que los puentes disulfuro entre los residuos cisteína son los responsables de la conformación correcta. Una estructura posible del determinante "a" incluye un puente disulfuro entre los aminoácidos 124 y 137, que forma un primer bucle, y otro puente disulfuro entre los aminoácidos 139 y 147, que forma un segundo bucle.

Se piensa que anti-HBs se une predominantemente al segundo bucle pero se piensa que los epítopos no están confinados solamente a un bucle. La totalidad de la secuencia del determinante "a" contribuye probablemente a la estructura antigénica. El determinante "a" está conservado aunque existe un grado de variación en aislamientos normales de VHB. Se acepta una variación mayor en el primer bucle del epítopo supuesto, lo que implica tal vez que esta región no contribuye significativamente con el epítopo de neutralización.

El determinante "a" se encuentra en todos los subtipos de VHB y es la variación de aminoácidos dentro y alrededor del determinante "a" lo que da lugar a subtipos. El HBsAg puede clasificarse en cuatro subtipos inmunológicos principales, adw, ayw, adr, y ayr, cada uno con una distribución geográfica asociada. Los subtipos d/y y w/r están determinados por sustituciones de lisina por arginina en los aminoácidos 122 y 160 respectivamente.

Recientemente, se ha observado la presencia de HBsAg en las muestras de suero anti-HBs de ciertos pacientes. El HBsAg en esos pacientes puede no ser neutralizado por los anti-HBs presentes, lo que implica la presencia de variantes de HBsAg. Se han asociado variantes significativas (mutantes) con la vacunación, la terapia de anticuerpo monoclonal, la terapia de anticuerpo policlonal y con casos de infección de VHB difíciles de diagnosticar en laboratorios clínicos, véase por ejemplo, Carmen y col. (1992, 1993), Harrison y col. (1993), Hawkins y col. (1994), Howard y col. (1993), McMahon y col. (1992), Okamoto y col. (1992), y Wallace y col. (1994).

Tras el análisis los mutantes parecen haber sido seleccionados de una población mixta y parecen tener mutaciones puntuales que causan sustituciones de aminoácidos en el determinante "a". Se piensa que los mutantes surgen por mutaciones aleatorias dentro del gen que da lugar a una combinación de genotipos. En los mutantes descritos hasta la fecha, se piensa que la respuesta inmune es el factor predominante para la selección de los mutantes.

Generalmente, la adición de anticuerpos monoclonales a las células infectadas por virus in vitro da como resultado la selección de aislamientos que no son neutralizados por ese anticuerpo. Por consiguiente, no es sorprendente que los anticuerpos monoclonales administrados a los pacientes con replicación viral activa puedan dar como resultado la selección de los mutantes denominados de "escape".

Se han descrito varios mutantes de escape diferentes con significación clínica en individuos vacunados. En tres casos pudo encontrarse que resultó ser una mutación puntual en el codón para el aminoácido 145 en el determinante "a" de HBsAg la que dio como resultado un cambio de aminoácido de glicina a arginina. La administración de suero que contenía uno de tales mutantes del virus a un chimpancé probó que los agentes son transmisibles.

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En un virus mutante implicado en una infección descubierta en una población vacunada se encontró una mutación de lisina por ácido glutámico en el aminoácido 141 del determinante "a". Desde entonces se ha informado esa y otras mutaciones puntuales que dan como resultado una o más sustituciones de aminoácidos en el determinante "a" en individuos vacunados.

Los mutantes de escape son motivo de preocupación en varios informes. En primer lugar, existen fallos para detectar tales mutantes por medio de inmunoensayos. Los ensayos de diagnóstico están diseñados para conseguir alta sensibilidad y especificidad. Los ensayos para la detección de HBsAg dependen en la interacción entre un reactivo de anti-HBs y HBsAg en la muestra bajo investigación. Posteriormente se detecta un complejo anti-HBs/HBsAg resultante. Si hay una mutación significativa en el epítopo del HBsAg y no es reconocido por los anti-HBs, entonces no se detectará el HBsAg o el ensayo será muy poco sensible. El fallo para detectar un mutante de escape no sólo puede afectar a la persona que alberga el mutante; puede llevar a la transmisión de la infección a través de la sangre, productos de la sangre o de órganos donados. En segundo lugar, el VHB con HBsAg mutante puede infectar a individuos aunque hayan sido previamente inmunizados y tengan respuesta anti-HBs.

En el documento WO 94/26904 se describió un anticuerpo monoclonal para un mutante de escape en la posición 122. Ese anticuerpo es capaz de discriminar entre el HBsAg de tipo salvaje y la forma mutante y por lo tanto permite la identificación de la forma mutante.

El documento WO 95/21189 describe una proteína de antígeno de superficie de hepatitis B que comprende una región de envoltura antigénicamente modificada en la que están insertados al menos dos aminoácidos secuencia abajo de la posición 122.

El documento WO 94/21812 describe anticuerpos para uso en la detección de variantes específicas de proteínas de antígeno de superficie de hepatitis B que tienen una sustitución de glicina por arginina en la posición 145.

Waters y col., (1992) J. Clin. Invest. 90:2545-2597 describen una mutación del antígeno de superficie de hepatitis B en el aminoácido 145 que lleva a la evasión de la respuesta protectora anti-HBs y especulan que la mutación surgió como resultado de la presión inmune.

La presente invención se refiere a un anticuerpo monoclonal que es capaz de unirse específicamente a un HBsAg de tipo salvaje y al menos a dos, de preferencia más de dos, formas mutantes de HBsAg.

La presente invención proporciona un anticuerpo monoclonal P2D3 producido por el hibridoma denominado P2D3 y depositado en ECACC bajo número de acceso 97042331 y anticuerpos monoclonales que compiten de manera cruzada con el anticuerpo monoclonal P2D3 para unirse a un HbsAg de tipo salvaje (antígeno de superficie de hepatitis B) y al menos a dos formas mutantes de HBsAg, en el que las formas mutantes de HBsAg tienen una sustitución de aminoácidos con relación al HBsAg de tipo salvaje dentro de la secuencia que codifica los aminoácidos 133 a 145 del HBsAg. A menos que se especifique de otra manera, el término "un anticuerpo monoclonal de la presente invención" incluye al anticuerpo monoclonal P2D3 y anticuerpos monoclonales que compiten de manera cruzada con el anticuerpo monoclonal P2D3 como se definió anteriormente.

La capacidad de un anticuerpo monoclonal de la presente invención para unirse específicamente al HBsAg de tipo salvaje y al mutante sugiere que se une a una región del antígeno de superficie que está conservada entre la proteína del tipo salvaje y las formas mutantes. La región conservada y por lo tanto el determinante antigénico (o epítopo) puede estar en el determinante "a" mismo, en la región del determinante "a" o inclusive en una región no "a".

Debido a su capacidad para unirse específicamente a las formas mutantes de HBsAg así como también a la proteína del tipo salvaje, y por consiguiente para detectar mutantes de escape, un anticuerpo monoclonal de la presente invención es particularmente útil para mejorar la eficacia de los inmunoensayos para la detección de HBsAg, para el diagnóstico clínico de infecciones por VHB y también para las pruebas de selección de la sangre. La seguridad del suministro de sangre y del suministro de productos de la sangre puede mejorarse por medio del uso de un anticuerpo monoclonal de la invención en un ensayo de HBsAg, ya sea solo, es decir, como el único anticuerpo anti-HBs o, especialmente, además de otro u otros anticuerpos anti-HBs.

Las Figuras 1a y 1b de los dibujos que acompañan a este documento presentan las secuencias de aminoácidos y ácido nucleico de parte de la región de superficie del VHB que abarca al determinante "a". La Figura 1b de los dibujos presentados es una versión mecanografiada de la Figura 1a. En las Figuras 1a y 1b: la Línea 1 presenta variantes reconocidas de aminoácidos del subtipo adyw; la Línea 2 presenta la secuencia de consenso de aminoácidos del subtipo adyw; la Línea 3 presenta la secuencia de consenso del ácido nucleico del subtipo adyw; la Línea 4 presenta variantes reconocidas de ácidos nucleicos; la Línea 5 presenta variantes de ácido nucleico que codifican el HBsAg Mutante II (HBsAg MAM); y la Línea 6 presenta las variantes de ácido nucleico que codifican el HBsAg Mutante I (HBsAg NP).

Otra variante reconocida de nucleótidos en la posición 143 es ACG por TCG, que da como resultado treonina en lugar de serina en esa posición.

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Un anticuerpo monoclonal supuesto de la presente invención puede seleccionarse por la capacidad de competir de manera cruzada con el anticuerpo monoclonal P2D3 por la unión a tres o más antígenos de referencia, a saber, un HBsAg de tipo salvaje y dos o más formas mutantes de HBsAg. Un experto es capaz de distinguir fácilmente la unión específica entre un anticuerpo y un antígeno de la unión no específica. Cualquier anticuerpo que es capaz de tal competencia cruzada por la unión a tres o más de tales antígenos de referencia es un anticuerpo monoclonal de la presente invención. Tal procedimiento de selección es en sí mismo parte de la presente invención. Debe notarse que el término "unión" se usa a través de la presente memoria descriptiva para indicar la unión específica.

Un HBsAg usado para selección y/o como antígeno en la producción de hibridomas y de anticuerpos monoclonales de la invención puede ser una proteína de extensión completa o puede ser un fragmento o derivado antigénico adecuado de un HBsAg de tipo salvaje o mutante.

Un anticuerpo monoclonal de la presente invención puede ser de cualquier clase de inmunoglobulina, por ejemplo, IgG, IgM o IgA, y de cualquier isotipo.

Las formas mutantes de HBsAg pueden encontrarse en los virus mutantes que tienen una mutación que lleva al menos a la sustitución de un aminoácido con relación al HBsAg de tipo salvaje, por ejemplo, como se encuentra en los denominados "mutantes de escape". Un HBsAg mutante puede tener una sustitución en el determinante "a" o en la región del determinante "a", por ejemplo, la mutación puede ser una mutación puntual. Una mutación, por ejemplo, una mutación puntual, puede estar dentro de la secuencia que codifica los aminoácidos 133 a 145 del HBsAg. La mutación puede llevar a una sustitución de aminoácidos en la posición 133 y/o en la posición 145. Pueden estar presentes otras y/o diferentes sustituciones, por ejemplo, en una o más cualesquiera de las posiciones 134, 141, 142, 143 y 144. Un HBsAg mutante puede, por ejemplo, tener sustituciones de aminoácidos con relación al tipo salvaje en una o más cualesquiera de las posiciones 143, 144 y 145. Tales mutaciones pueden estar presentes además de otras mutaciones, en el determinante "a" o en otra región.

Un anticuerpo monoclonal de la presente invención es capaz de competir de manera cruzada con el anticuerpo monoclonal P2D3 en la unión por ejemplo, a un HBsAg de tipo salvaje y a dos o más HBsAg mutantes diferentes como se describió anteriormente, por ejemplo, teniendo cada uno una mutación en una o más cualesquiera de las posiciones 133, 134, 141, 142, 143, 144 y 145. Como alternativa, la unión puede ser a un HBsAg mutante descrito anteriormente y a un HBsAg mutante que tiene una mutación en una región diferente.

Los ejemplos de las formas mutantes de HBsAg son aquellos que tienen las siguientes sustituciones con relación al tipo salvaje en la región del determinante "a":

HBsAg Mutante I (HBsAg "NP"): met por ile en el aminoácido 133; phe por his en el aminoácido 134; y asp por val en el aminoácido 144;

HBsAg Mutante II (HBsAg "MAM"): met por ile en el aminoácido 133; phe por asn en el aminoácido 134; pro por ser en el aminoácido 142; ser por leu en el aminoácido 143; y gly por lys en el aminoácido 145;

HBsAg Mutante III (HBsAg "SZ"): gly por arg en el aminoácido 145;

HBsAg Mutante IV (HBsAg "SP"): ser por met en el aminoácido 143.

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Un anticuerpo supuesto puede seleccionarse, por ejemplo, contra el HBsAg de tipo salvaje y contra dos o más cualesquiera de las formas mutantes descritas anteriormente. Por ejemplo, puede seleccionarse un anticuerpo monoclonal supuesto de la presente invención contra un HBsAg de tipo salvaje y contra dos o más HBsAg mutantes diferentes teniendo cada uno mutación(es) en una o más de las posiciones 133, 134, 141, 142, 143, 144 y 145, especialmente 143, 144 y 145. Como alternativa, puede usarse uno de tales mutantes con un HBsAg mutante que tenga una mutación en una región diferente. Las formas mutantes I y IV descritas anteriormente pueden usarse para selección.

Un anticuerpo monoclonal de la invención podrá ser capaz de unirse específicamente a un HBsAg se tipo salvaje y al menos a un HBsAg mutante que lleve un determinante "a" codificado por una secuencia que tenga mutaciones puntuales en uno o más de los codones que codifican los aminoácidos 143, 144 y 145. El anticuerpo monoclonal puede unirse a dos o más de tales HBsAg mutantes o a uno de tales HBsAg mutantes y a otro HBsAg mutante diferente.

Los ejemplos de anticuerpos monoclonales de la presente invención son aquellos producidos por los hibridomas denominados P2D3, M3A10 y M4F5, los que fueron depositados en la Colección Europea de las Cultivos Celulares (ECACC), Virus Research and Production Laboratory, Public Health Laboratory Service, Centre for Applied Microbiology & Research, Porton Down, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, Inglaterra, en conformidad con los términos del Tratado de Budapest en el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para los Objetivos de Procedimiento de Patente, 1977. Los números de acceso y las fechas de depósito de los hibridomas son los siguientes: Hibridoma P2D3: Número de Acceso ECACC 97042331, Fecha de Acceso: 23 de abril de 1997; Hibridoma M3A10: Número de Acceso ECACC 97042330, Fecha de Acceso: 23 de abril de 1997; Hibridoma M4F5: Número de Acceso ECACC 97042519, Fecha de Acceso: 25 de abril de 1997.

En esta memoria descriptiva, puede referirse a un anticuerpo monoclonal bajo la misma denominación que el hibridoma que la produce, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal denominado P2D3 está producido por el hibridoma P2D3 (ECACC 97042331). Los hibridomas P2D3 (ECACC 97042331), M3A10 (ECACC 97042330) y M4F5 (ECACC 97042519) y los anticuerpos monoclonales que producen se describen en detalle en las Ejemplos a continuación.

Cada uno de los anticuerpos monoclonales P2D3, M3A10 y M4F5 es capaz de unirse específicamente a (i) un HBsAg de tipo salvaje, (ii) HBsAg Mutante I (HBsAg NP) y (iii) HBsAg Mutante II (HBsAg MAM). Además, cada uno es capaz también de unirse específicamente al HBsAg Mutante III (HBsAg SZ) y al HBsAg Mutante IV (HBsAg SP). Los anticuerpos monoclonales P2D3 y M4F5 son anticuerpos IgG. El anticuerpo monoclonal M3A10 es un anticuerpo IgA.

Se sabe que el HBsAg de tipo salvaje tiene una serie de serotipos diferentes, y también que hay mutantes reconocidos, por ejemplo, Pugh y col. 1980. El término "HBsAg de tipo salvaje" como se usa en la presente memoria descriptiva incluye todos los HBsAg reconocidos en la técnica como tipo salvaje o que serían reconocidos como de tipo salvaje. El término incluye por consiguiente al HBsAg de tipo salvaje de todos los serotipos y de todas las variantes reconocidas. El término "HBsAg mutante" como se usa en este documento no incluye variantes reconocidas de tipo salvaje.

Los expertos en la técnica conocen pruebas de selección adecuadas e incluyen ensayos de competición cruzada y ensayos, por ejemplo, que usan anticuerpo monoclonal marcado radiactivamente para determinar especificidades de unión.

Como se indicó anteriormente, la capacidad de un anticuerpo monoclonal de la presente invención para unirse al HBsAg de tipo salvaje y al mutante sugiere que se une a una región del antígeno de superficie que está conservada entre la proteína de tipo salvaje y las formas mutantes. (Véase también la Discusión General a continuación). La localización y la secuencia de tal región conservada y por consiguiente un epítopo conservado pueden determinarse por medio de procedimientos conocidos, por ejemplo, por medio de mapeo del epítopo usando opcionalmente un anticuerpo monoclonal de la invención. Los péptidos y los polipéptidos del epítopo pueden producirse entonces, por ejemplo, de manera recombinante, por síntesis química o por una combinación de diferentes procedimientos. Un péptido o un polipéptido antigénico resultante puede también ser inmunogénico. Un epítopo contra el que está dirigido un anticuerpo monoclonal de la invención es en sí mismo parte de la presente invención.

La presente invención incluye fragmentos y derivados de un anticuerpo monoclonal de la presente invención, por ejemplo, fragmentos Fab y Fab_{2} y de conjugados. Los derivados incluyen derivados humanizados. Los procedimientos para producir fragmentos y derivados, que incluyen los derivados humanizados, son bien conocidos. Por ejemplo, los fragmentos y los derivados pueden producirse de manera recombinante. Los expertos en la técnica conocen muy bien los fragmentos y derivados de anticuerpos y sus usos. El término "anticuerpo monoclonal" como se usa en este documento incluye fragmentos y derivados del mismo.

La presente invención también proporciona un anticuerpo anti-idiotipo para un anticuerpo monoclonal de la presente invención. Tales anticuerpos, que comprenden una "imagen interna" del epítopo original, pueden usarse como sustitutos del epítopo y son particularmente útiles en el caso de epítopos conformacionales, puesto que es difícil mapear tales epítopos y puede no ser posible producir péptidos sintéticos de epítopo en tales casos.

Un anticuerpo monoclonal de la presente invención puede usarse en un inmunoensayo para la detección de HBsAg ("ensayo de VHB") y por consiguiente para las infecciones de hepatitis B, como sustituto o, especialmente, además de los anticuerpos anti-HBs utilizados actualmente en los ensayos de VHB. Tales ensayos pueden usarse para el diagnóstico clínico o para la selección de sangre, y la presente invención incluye procedimientos de diagnóstico y procedimientos de selección de sangre usando un inmunoensayo que comprende un anticuerpo monoclonal de la presente invención.

Un anticuerpo monoclonal de la presente invención puede también usarse terapéutica o preventivamente como antisuero para la inmunización pasiva y/o para definir un epítopo para uso como vacuna en la inmunización activa. La presente invención incluye tales antisueros y procedimientos de inmunización, y también epítopos definidos usando tales antisueros.

Otra aplicación de un anticuerpo monoclonal de la presente invención es en cromatografía de afinidad, por ejemplo, para purificar HBsAg de tipo salvaje o mutante, fragmentos antigénicos de los mismos, péptidos antigénicos o anticuerpos anti-idiotipo.

Por consiguiente, la presente invención proporciona un inmunoensayo para la detección de HBsAg, que comprende poner en contacto una muestra bajo investigación con un anticuerpo monoclonal de la presente invención, un fragmento o derivado del mismo, o una combinación de dos o más de los mismos, y detectar cualquier complejo antígeno-anticuerpo resultante.

El término "detección" se usa en este documento para indicar detección y/o determinación e incluye procedimientos cualitativos, cuantitativos y semicuantitativos.

El anticuerpo monoclonal de la invención, fragmento, derivado o combinación de los mismos pueden usarse con uno o más anticuerpos diferentes seleccionados de anticuerpos policlonales anti-HBs y otros anticuerpos monoclonales anti-HBs.

Un inmunoensayo de la presente invención puede estar en un formato homogéneo o heterogéneo. El formato puede ser un formato de captura o competitivo.

Un inmunoensayo para la detección de anticuerpos para el antígeno del núcleo de la hepatitis B (anti-HBc) puede realizarse simultáneamente con el ensayo para HBsAg. Los ensayos de combinación de antígenos anti-núcleo/superficie de VHB son conocidos y están en uso.

La presente invención además proporciona un kit de inmunoensayo que comprende un anticuerpo monoclonal de la presente invención o un fragmento o derivado del mismo, o una combinación de dos o más de los mismos, y otros reactivos necesarios para realizar un inmunoensayo para HBsAg y opcionalmente también los reactivos para detectar anticuerpos anti-HBc. Puede estar presente otro u otros anticuerpos anti-HBs seleccionados de anticuerpos policlonales anti-HBs y otros anticuerpos monoclonales anti-HBs, y los otros reactivos pueden seleccionarse de soluciones de lavado, diluyentes, soluciones patrón, reactivos de control y anticuerpos anti-HBs marcados.

La presente invención proporciona además una fase sólida adecuada para uso en un inmunoensayo en el que está inmovilizado un anticuerpo monoclonal de la presente invención, un fragmento o derivado del mismo, o una combinación de dos o más de los mismos. En la fase sólida puede también estar inmovilizado otro u otros anticuerpos anti-HBs seleccionados de anticuerpos policlonales anti-HBs y de otros anticuerpos monoclonales anti-HBs. Además, en la fase sólida puede estar inmovilizado un agente capaz de capturar anticuerpos anti-HBc además de los anticuerpos anti-HBs.

La presente invención proporciona además un antisuero adecuado para usar terapéutica o preventivamente para la inmunización pasiva que comprende un anticuerpo monoclonal de la presente invención, un fragmento o derivado del mismo, o una combinación de dos o más numeroso de los mismos.

La presente invención proporciona también una composición adecuada para uso terapéutica o preventivamente para la inmunización pasiva contra VHB que comprende un anticuerpo monoclonal de la presente invención, un fragmento o derivado del mismo, o una combinación de dos o más de los mismos, además con un vehículo farmacéuticamente adecuado.

Un antisuero o una composición de la invención puede comprender también otro u otros anticuerpos seleccionados de anticuerpos policlonales anti-HBs y otros anticuerpos monoclonal anti-HBs.

La presente invención proporciona además un procedimiento para la inmunización pasiva terapéutica o preventiva contra VHB que comprende administrar a un ser humano una cantidad terapéutica o preventivamente eficaz de un anticuerpo monoclonal de la invención, un fragmento o derivado del mismo o una combinación de dos o más de los mismos. También puede administrarse otro u otros anticuerpos seleccionados de anticuerpos monoclonales y policlonales anti-HBs.

Para cualquiera de las aplicaciones y usos según la presente invención, el anticuerpo monoclonal de la presente invención puede ser el anticuerpo monoclonal P2D3, el anticuerpo monoclonal M3A10, el anticuerpo monoclonal M4F5 o una combinación de dos de más de los mismos. Cualquiera de los anticuerpos monoclonales P2D3, M3A10 y M4F5 puede(n) usarse junto con cualquier otro anticuerpo monoclonal de la presente invención y/o con cualesquiera otros anticuerpos anti-HBV, especialmente anticuerpos anti-HBs. Puede usarse un fragmento o un derivado de un anticuerpo monoclonal de la invención.

La presente invención proporciona también un hibridoma capaz de producir un anticuerpo monoclonal de la presente invención, por ejemplo, el hibridoma P2D3 (Número de Acceso ECACC 97042331), el hibridoma M3A10 (Número de Acceso ECACC 97042330) y el hibridoma M4F5 (Número de Acceso ECACC 97042519).

La presente invención proporciona un procedimiento para producir un hibridoma capaz de producir un anticuerpo monoclonal de la presente invención, que comprende inmunizar un animal con el HBsAg de tipo salvaje o una forma mutante del HBsAg, inmortalizando las células productoras del anticuerpo para formar los hibridomas, seleccionar el cultivo del hibridoma resultante contra el HBsAg de tipo salvaje y dos o más formas mutantes del HBsAg, y seleccionar aquellos hibridomas que producen un anticuerpo monoclonal capaz de unirse específicamente al HBsAg de tipo salvaje y a dos o más formas mutantes del HBsAg.

Un anticuerpo monoclonal de la invención puede obtenerse cultivando un hibridoma de la invención in vitro o in vivo y obteniendo el anticuerpo monoclonal del medio de cultivo. En el caso de la producción in vivo, el medio de cultivo es líquido ascítico.

Los procedimientos para obtener y para seleccionar los hibridomas y los anticuerpos monoclonales son bien conocidos por los expertos en la técnica. Kohler y Milstein (1975) establecieron la metodología general y desde entonces ha habido numerosas publicaciones sobre el tema. Puede usarse cualquiera de tales procedimientos para obtener y para seleccionar los hibridomas y los anticuerpos monoclonales según un procedimiento de la presente invención. El antígeno utilizado para obtener los anticuerpos puede ser un HBsAg de tipo salvaje o una forma mutante de HBsAg, por ejemplo, como se describió anteriormente, por ejemplo, una o más de las formas mutantes I a IV descritas anteriormente. La selección de los hibridomas y de los anticuerpos monoclonales resultantes en cuanto a su capacidad para unirse específicamente a diferentes formas de HBsAg puede realizarse por medio de cualquier procedimiento convencional usando HBsAg de tipo salvaje y las formas mutantes elegidas. Como se describió anteriormente, la selección puede llevarse a cabo usando, como antígenos de referencia, un HBsAg de tipo salvaje y dos o más formas mutantes de HBsAg, por ejemplo, como se describió anteriormente, por ejemplo, dos o más de las formas mutantes
I a IV.

Para la selección, resulta particularmente conveniente usar un radioinmunoensayo de captura inversa de IgG, que es capaz de tener un fondo muy bajo y un gran intervalo dinámico, y tiene además la ventaja de ser fácil de implementar.

En un ensayo de captura inversa de IgG para un anticuerpo de interés, se inmoviliza una IgG anti-especie adecuada en una fase sólida, por ejemplo, micropocillos. Si los anticuerpos bajo investigación se han obtenido, por ejemplo, en ratones, la fase sólida se recubre con IgG anti-ratón. A continuación se incuba la muestra bajo investigación con la IgG anti-especie inmovilizada, con lo que se captura una proporción representativa de las IgG totales presentes. A continuación se incuba la fase sólida con un antígeno marcado adecuado, que forma un complejo solamente con el anticuerpo capturado de interés. A continuación puede detectarse cualquier complejo formado.

En el presente caso, se incuba una muestra bajo investigación, por ejemplo, un líquido sobrenadante de cultivo tisular de un cultivo de hibridoma o líquido ascítico, con anti-IgG inmovilizado. Los anticuerpos capturados se incuban por separado con un HBsAg de tipo salvaje marcado y con dos o más HBsAg mutantes marcados, por ejemplo, como se describió anteriormente, por ejemplo, seleccionados de las formas mutantes I a IV. Cualquier muestra que sea capaz de unirse específicamente al HBsAg de tipo salvaje y a dos o más antígenos de superficie mutantes contiene un anticuerpo monoclonal ese cae dentro de la presente invención.

Puede usarse de manera análoga un ensayo de IgM o IgA de fase inversa para obtener un anticuerpo monoclonal IgM o IgA.

Los inmunoensayos disponibles en el comercio para HBsAg son generalmente ensayos de fase heterogénea o de "captura", en los que se inmoviliza el anti-HBs en una fase sólida, usualmente micropocillos, pequeñas partículas o perlas. Cuando una muestra bajo investigación, generalmente suero, se pone en contacto con el anti-HBs inmovilizado, el HBsAg presente en la muestra debería unirse al anticuerpo inmovilizado. A continuación se detecta el antígeno capturado, generalmente usando un anti-HBs marcado. En los ensayos convencionales, el anticuerpo usado para la captura o para la detección puede ser monoclonal o policlonal.

Los anticuerpos policlonales, debido a su naturaleza, tienen un intervalo de especificidad y de selectividad. En el caso del VHB, esto puede dar como resultado la presencia en el antisuero de un anticuerpo que puede unirse a un mutante de escape. Sin embargo, eso no puede garantizarse, y existe un problema inherente para obtener la uniformidad del producto entre lote y lote. Los anticuerpos monoclonales tienen especificidad y selectividad definidas y pueden por consiguiente fallar en la detección de mutantes de escape.

El uso de un anticuerpo monoclonal de la presente invención, que sea capaz de unirse específicamente al HBsAg de tipo salvaje y al HBsAg mutante, o una combinación de dos o más de tales anticuerpos, incluyendo fragmentos y derivados de los mismos, en un inmunoensayo para HBsAg mejora el rendimiento del ensayo y reduce la posibilidad de que no se detecte el HBsAg mutante. Un anticuerpo monoclonal de la presente invención o una combinación de dos o más de tales anticuerpos puede usarse ya sea como el único reactivo de anticuerpo anti-HBs o, de preferencia, puede usarse además de anti-HBs policlonal y otro anti-HBs monoclonal, para la captura de antígeno y/o para la detección de cualquier complejo antígeno-anticuerpo resultante. Un anticuerpo monoclonal de la presente invención, o una combinación de dos o más de los mismos, puede usarse de manera análoga para anti-HBs convencional en un ensayo en fase homogénea para HBsAg. La presente invención por consiguiente proporciona un inmunoensayo para la detección de HBsAg, que comprende poner en contacto una muestra en la que se sospecha la presencia de HBsAg con un anticuerpo monoclonal de la presente invención, un fragmento o derivado del mismo, o una combinación de dos o más de los mismos, y detectar cualquier complejo antígeno-anticuerpo resultante. Puede usarse el anticuerpo monoclonal, fragmento, o derivado o combinación de los mismos con otro u otros anticuerpos anti-HBs seleccionados de anti-HBs policlonales y otros anticuerpos monoclonales anti-HBs.

Los inmunoensayos de diversos formatos diferentes, procedimientos para llevarlos a cabo y reactivos adecuados son bien conocidos y están descritos en diversos libros de texto y artículos de revisión, por ejemplo, Kemeny y Challacome 1988 y Tsu y Herzenberg 1980. En la presente invención puede usarse cualquier procedimiento para la detección de un antígeno.

Un ensayo según la presente invención puede ser un ensayo denominado "sándwich", un ensayo de competición o una reacción directa. El anticuerpo monoclonal, fragmento, derivado o combinación de los mismos puede inmovilizarse en una superficie sólida solo o en una mezcla con un antisuero policlonal anti-HBs y/o con otro u otros anticuerpos monoclonales anti-HBs. Como alternativa el anticuerpo monoclonal de la invención o la combinación de los mismos y cualquier otro anticuerpo pueden estar en una fase homogénea. Cualquier complejo anticuerpo-antígeno resultante puede detectarse usando anti-HBs marcado. En el caso de un ensayo de fase heterogénea, los anti-HBs usados para la detección pueden ser los mismos o diferentes de los usados para recubrir la superficie sólida.

Las superficies sólidas adecuadas en las que pueden inmovilizarse los anti-HBs son conocidas e incluyen las paredes internas de los pocillos de placas de microvaloración, perlas, partículas el denominado "látex". Pueden usarse membranas y tiras, por ejemplo, de nitrocelulosa o de papel. Puede incorporarse una membrana o una tira en un dispositivo de ensayo. Tales dispositivos son también bien conocidos. La invención incluye tales fases sólidas en las que se inmoviliza un anticuerpo monoclonal de la presente invención, o un fragmento o derivado del mismo, o una combinación de dos o más de los mismos.

Los anti-HBs usados para la detección de cualquier complejo antígeno-anticuerpo pueden marcarse con cualquier agente capaz de generar una señal directamente o indirectamente. Tal agentes son bien conocidos. Los agentes capaces de generar una señal directa incluyen radiomarcadores, marcadores cromogénicos y fluorescentes. Los agentes capaces de generar una señal indirectamente incluyen enzimas capaces de catalizar una reacción que dé lugar a un cambio de color.

La presente invención proporciona también un kit que comprende los componentes necesarios para realizar un inmunoensayo de la presente invención. Tal kit comprende, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal de la presente invención o una combinación de dos o más de los mismos inmovilizados en una superficie sólida, junto con recipiente(s) que comprende(n) otro(s) reactivo(s) necesario(s), por ejemplo, seleccionados de soluciones de lavado y diluyentes, soluciones patrón y reactivos de control, anticuerpos anti-HBs marcados y, en el caso de anti-HBs marcados con enzimas, reactivos de color.

Frecuentemente, un inmunoensayo para anticuerpos contra la proteína del núcleo de la hepatitis B (HBc) se lleva a cabo simultáneamente con el ensayo para HBs, por ejemplo, en el mismo micropocillo. La presente invención incluye el uso de un anticuerpo monoclonal de la presente invención en tales ensayos, y kits y fases sólidas recubiertas para uso con tales ensayos.

Como se indicó anteriormente, puede usarse un anticuerpo monoclonal de la presente invención para la inmunización pasiva, por ejemplo, durante el transplante de hígado de un paciente infectado con VHB. Para la inmunización pasiva, se lleva el anticuerpo a una forma adecuada para el uso como antisuero para administración parenteral, por ejemplo, en una forma que permita la derivatización incluyendo la humanización. La dosis de anticuerpo a usar dependerán de las circunstancias particulares de cada paciente y se determinarán caso por caso.

Un anticuerpo monoclonal de la presente invención, incluyendo combinaciones de dos más de tales anticuerpos, fragmentos y derivados de los mismos, pueden usarse solos o además de otros anticuerpos anti-HBs, policlonales o monoclonales. Además pueden incluirse otros anticuerpos anti-HBV.

Una forma mutante de HBsAg a la que se une un anticuerpo monoclonal de la presente invención puede usarse por sí misma como un antígeno; en la producción de anticuerpos monoclonales; y para la selección de los anticuerpos supuestos según la presente invención. Tal HBsAg mutante puede obtenerse de un sujeto sospechado de portar un mutante de escape del VHB. Tal sujeto será por lo general anti-HBs positivo y HBsAg positivo. Los sujetos adecuados pueden encontrarse entre los pacientes que han recibido terapia de anticuerpos monoclonales para la infección de VHB, en los sujetos vacunados, especialmente en los que se encuentra irrupción de la infección, y en casos de infección por VHB difíciles de diagnosticar en laboratorios clínicos usando ensayos convencionales actuales.

Por medio de tecnología de ADN recombinante puede producirse una forma del HBsAg mutante, por ejemplo, una de las formas mutantes descritas anteriormente, por ejemplo, formas mutantes I a IV. Puede insertarse el ADN que se presenta naturalmente que codifica la forma mutante en un huésped adecuado para la expresión del HBsAg mutante. Como alternativa, puede modificarse el ADN de tipo salvaje, por ejemplo, por mutagénesis dirigida a sitios, y a continuación usarse para obtener la expresión de una forma mutante.

El HBsAg obtenido de fuentes naturales, generalmente de la sangre de un sujeto seleccionado, tendrá glicosilación natural, y por lo general resulta de preferencia usar tal HBsAg como un antígeno. Los procedimientos para purificar HBsAg de la sangre son bien conocidos, véase por ejemplo, Cameron y col. 1980. Puede resultar de preferencia producir un HBsAg mutante recombinante que esté parcial o completamente glicosilado.

El HBsAg puede tener la longitud completa o puede usarse un fragmento antigénico adecuado. Tal fragmento puede obtenerse por medio de tecnología recombinante. Como alternativa, puede usarse un fragmento que es un péptido antigénico, por ejemplo, producido por síntesis química. Para el uso como vacuna, un antígeno debe ser inmunogénico, es decir, capaz de producir una respuesta protectora.

Los procedimientos para producir anticuerpos anti-idiotipo son bien conocidos. En el presente caso se usa un anticuerpo monoclonal de la presente invención como el antígeno en la producción de un anticuerpo anti-idiotipo, y los anticuerpos resultantes pueden seleccionarse contra un anticuerpo monoclonal de la presente invención. Un anticuerpo anti-idiotipo de la presente invención puede usarse por sí mismo como una vacuna, de una manera conocida.

Los siguientes Ejemplos no limitantes ilustran la presente invención.

Ejemplo I. Materiales y procedimientos 1: Pacientes

Los anticuerpos monoclonales descritos a continuación se obtuvieron contra el HBsAg mutante de dos pacientes. Esos pacientes se identificaron como resultado de marcadores serológicos incoherentes.

El paciente MAM era un portador de VHB. El suero fue inicialmente, en 1986, HBsAg positivo por el ensayo de hemaglutinación pasiva inversa basado en anticuerpos policlonales (RPH) pero negativo por un inmunoensayo enzimático monoclonal (EIA). En 1988 el paciente fue sometido a transplante renal. Cuando se ensayó nuevamente, el HBsAg se volvió detectable tanto por medio de ensayos basados en anticuerpos policlonales como monoclonales pero pasó a ser no detectable sólo por medio de ensayos de anticuerpos policlonales. El suero del paciente era anti-HBc y HBsAg positivo a lo largo del período de seguimiento.

El paciente NP fue sometido a transplante renal en 1985. En 1990 el paciente era seropositivo para anti-HBc pero no se detectaron HBsAg ni anti-HBs. La hemodiálisis se inició en 1993 y más adelante en ese año se detectó HBsAg solamente por medio de ensayos basados en anticuerpos policlonales.

Ninguno de los pacientes había sido vacunado previamente.

Las secuencias de los genes de HBsAg alrededor del determinante "a" se determinaron por medio de secuenciación de hebra única realizada directamente en los productos de PCR como está descrito en Hawkins y col., 1994.

2: Producción de Anticuerpos Monoclonales 2.1: Animales

Se usaron ratones Balb/c hembra.

2.2: Purificación de HBsAg

La purificación de HBsAg necesaria para la inmunización de los ratones se basó en el procedimiento descrito por Cameron y col., 1980.

Se fraccionó el suero HBsAg positivo haciendo pasar volúmenes de 20 ml a través de una columna de Sepharose 6B (Pharmacia Ltd.) de 100 x 5 cm de diámetro equilibrada con NaCl al 0,9% pH 7,6 tamponada con Tris y que contenía azida sódica al 0,1% (Tris/Sal/Az). Las fracciones ricas en HBsAg, ahora libres de albúmina y de IgG, se concentraron hasta un volumen de 9 ml por ultrafiltración en una celda de ultrafiltración de 200 ml con agitación montada con una membrana XM 100 A (Amicon Ltd.). A esto se le añadió 2,69 g de CsCl sólido y se ajustó el volumen hasta 10 ml dando una densidad de 1,2 g/cm^{3}. A continuación se sometió el material a ultracentrifugación durante tres días a 124000 g en dos tubos de 5 ml en una centrífuga con rotor basculante SW50-L (Beckman RIIC Ltd.) a 20ºC dando bandas isopícnicas en el gradiente de densidad autoformado.

Se retiró la banda de HBsAg principal que contenía las pequeñas partículas de 22 nm de ambos tubos, se combinaron y se llevó a 5 ml con una solución de CsCl en Tris/Sal/Az (2,885 g más 10 ml) que dio una densidad final de 1,2 g/cm^{3}. Se ultracentrifugó el material bajo las mismas condiciones anteriores en un tubo de 5 ml dando las segundas bandas isopícnicas. Se retiró la banda de HBsAg final y se dializó en PBS para eliminar el CsCl.

3: Inmunización de Animales

Se inyectaron cincuenta microlitros de HBsAg NP purificado mezclado en un volumen igual de adyuvante de Titermax (Vaxcel, Inc.) por vía subcutánea en un ratón Balb/c hembra. Tras aproximadamente dos meses se administró una dosis de 30 \mul por vía intraperitoneal (i.p) seguida tres meses más tarde por una dosis de 75 \mul administrada también por vía i.p. Los 25 \mul finales de HBsAg en solución salina se administraron por vía intravenosa tres días antes de la fusión.

Se usó el mismo protocolo al inmunizar el ratón con el HBsAg MAM.

4: Cultivo de Células de Mieloma

Se cultivaron células JK derivadas de P3-X63-Ag8653 (Kearney y col., 1979) en medio completo (véase Reactivos) a 37ºC en aire atmosférico con CO_{2} al 5% con una humedad de 100%.

Las células se dividieron 1:2 aproximadamente tres veces por semana y se mantuvieron en una concentración entre 2 x 10^{5} y 2 x 10^{6} células por ml. Para la fusión con esplenocitos se usaron solamente las células en fase de crecimiento logarítmico.

Para la fusión, se centrifugaron las células de mieloma a 1.500 g durante 10 minutos y se lavaron tres veces en el mismo volumen de medio incompleto (véase Reactivos). Se diluyeron las células JK resuspendidas 1:10 en medio incompleto y la se determinó la viabilidad y la concentración de las células contando las células usando una cámara de Neubauer. Se encontró que la concentración de células JK era de aproximadamente 5,87 x 10^{7} células/ml.

4.1: Preparación de células de alimentación

Se usaron células de exudado peritoneal de ratón como una capa de células de alimentación para las células híbridas. Éstas se prepararon el día previo al inicio de la fusión. Para la preparación de las células de alimentación se usó medio completo frío que contenía hipoxantina, aminopterina y timidina (medio HAT-véase Reactivos). Se inyectaron cinco mililitros del medio en la cavidad peritoneal de un ratón Balb/c recientemente sacrificado y tras una agitación suave se retiró de manera aséptica conteniendo ahora células de exudado. Se añadieron cien microlitros de las células a cada pocillo de una placa estéril de 96 pocillos (se necesitaron 4-5 placas por bazo a fusionar). Todas las placas se examinaron en el día de la fusión para asegurar que estaban libres de cualquier contaminación bacteriana o fúngica visible.

4.2: Preparación de células del bazo

La preparación de las células del bazo de los ratones inmunizados con HBsAg MAM y con HBsAg NP se llevó a cabo por medio de un procedimiento similar.

El bazo se retiró cuidadosamente del ratón recientemente sacrificado y se colocó en una placa de petri que contenía 5 ml de medio completo frío. Se rompió cuidadosamente el bazo con la parte roma de un escalpelo separando de esta manera las células del tejido conectivo del bazo. A continuación se transfirió la suspensión celular a un recipiente universal estéril y se dejó sedimentar el resto en el fondo. Se retiró cuidadosamente el sobrenadante y se sedimentaron las células centrifugando a 150 g durante 10 minutos. Se lavaron las células tres tiempo en 10 ml de medio incompleto y se resuspendió el sedimento celular final en 10 ml de medio incompleto. El rendimiento y la viabilidad de las células del bazo se determinó utilizando una cámara de Neubauer. Se recogieron aproximadamente 7x10^{7} células del bazo de NP mientras que se obtuvieron 10x10^{7} células de un primer bazo de MAM y 2,5x10^{7} células del segundo bazo de MAM.

4.3: Fusión celular

Se mezclaron los esplenocitos con las células de mieloma en una relación de 4:1 y se centrifugó la mezcla a 1500 g durante 10 minutos. El eliminó el sobrenadante dejando un sedimento seco de células en el fondo del recipiente. Este se colocó en un baño de agua a 37ºC. El polietilenglicol 1540 (PEG) que se había esterilizado previamente en autoclave también se calentó en el baño de agua a 37ºC. Se aflojó el sedimento celular en el fondo del recipiente y se añadió 1 ml de la solución de PEG gota a gota mientras se mantenía el recipiente con agitación suave. Se dejó la mezcla de células/PEG a 37ºC durante un minuto y a continuación se añadieron otros 2 ml de medio incompleto caliente. Se añadió lentamente más medio incompleto de manera de duplicar el volumen cada minuto hasta haber añadido 25 ml de medio incompleto. A continuación se centrifugaron las células fusionadas a 1500 g durante 10 minutos y se resuspendió el sedimento en 10 ml de medio HAT. La suspensión celular se distribuyó uniformemente sobre cinco placas de células de alimentación y a continuación se colocaron en una incubadora de CO_{2}.

4.4: Cultivo de células híbridas

Tras aproximadamente una semana aparecieron grupos de células fusionadas en crecimiento. En esta etapa se realimentó a las células reemplazando 100 \mul del medio antiguo con medio HAT fresco. Tras aproximadamente 14 días de la fusión, se retiraron 100 \mul del líquido sobrenadante de cada pocillo en que se encontraron grupos de células fusionadas, y se analizó la presencia de anti-HBs. Se reemplazó el sobrenadante con medio completo que contenía hipoxantina y timidina (medio HT -véase Reactivos).

4.5: RIA de captura inversa para la detección de hibridomas secretores de anti-HBs

Se probaron los sobrenadantes de los cultivos de hibridoma viables en busca de anti-HBs en base a un ensayo captura inversa.

Se cubrieron micropocillos Nunc de base redonda con 100 \mul de una dilución 1:1000 en tampón Tris de la fracción IgG de IgG anti-ratón de conejo. Tras dos días a temperatura ambiente se lavaron los pocillos con solución salina de Tween y se extinguió durante una hora con seroalbúmina de bovino en tampón Tris (tampón Tris BSA-véase Reactivos). A continuación se sellaron los pocillos y se almacenaron húmedos a 4ºC. Todos los lavados se realizaron con solución salina de Tween.

Previo a realizar el ensayo, se eliminó el tampón Tris BSA. Se añadieron cien microlitros de una dilución 1:10 en solución salina tamponada con fosfato del sobrenadante de cada pocillo en que se encontraron grupos de células fusionadas con éxito a los pocillos de ensayo y se incubaron a 37ºC durante una hora. Tras lavar, se añadieron 100 \mul de ^{125}I-HBsAg de tipo salvaje y se dejó en una caja húmeda a temperatura ambiente durante la noche. A continuación se lavaron los pocillos de ensayo y se midió la reactividad de unión en un contador gamma de dieciséis canales. Los sobrenadantes que contenían anti-HBs dieron una unión mayor del marcador. Los hibridomas se volvieron a probar posteriormente por el mismo ensayo usando los marcadores ^{125}I-MAM y ^{125}I-NP en vez de ^{125}I-HBsAg de tipo salvaje. Cada ensayo realizado incluyó controles positivos y negativos. Los controles positivos usados fueron D2H5 y H3F5 monoclonales obtenidos contra HBsAg de tipo salvaje. Como controles negativos se usó un 3D3F2 monoclonal anti-VIH gag y solución salina tamponada con fosfato.

A partir de los resultados del ensayo, se eligieron los pocillos relacionados que contenían colonias que secretaban anti-HBs para otra selección y clonación.

Cuando las células tenían buen crecimiento, se aspiraron usando una pipeta pasteur de vidrio y se transfirieron de manera aséptica a placas estériles de 24 pocillos que contenían una capa de células de exudado peritoneal de ratón (CPE) en medio HT.

4.6: Clonación por dilución limitante

Se clonaron los hibridomas identificados como anti-HBs positivos por dilución limitante. Esto se realiza para asegurar que el anticuerpo secretado es homogéneo y monoespecífico. Para cada cultivo híbrido se calculó el volumen de suspensión celular que contenía 100 células y se añadió este volumen a 10ml de medio completo. Se añadieron cien microlitros de esta suspensión celular a cada uno de 48 pocillos de una placa de 96 pocillos que contenía células de alimentación en medio completo. Se añadieron otras cien células a los 5 ml restantes de medio completo y se añadieron 100 \mul de esta suspensión más concentrada a 24 pocillos de la placa. Finalmente, se adicionaron otras 100 células a la suspensión celular restante y se distribuyó esto en los últimos 24 pocillos. La variación en la concentración de células en cada placa dio tolerancia para recuentos celulares imprecisos y baja viabilidad de algunos cultivos. Este procedimiento se repitió para cada hibridoma seleccionado relacionado.

Tras aproximadamente cinco días de la clonación se examinaron las placas en busca de pocillos en los que era visible sólo una colonia. Se retiraron cien microlitros de sobrenadante de estos pocillos y se volvieron a realizar las pruebas para anti-HBs usando el ensayo de captura inversa descrito previamente.

Los clones que secretaban anti-HBs se expandieron a continuación como anteriormente y se realimentaron según necesidad por medio de la eliminación de 100 \mul de sobrenadante del cultivo tisular y su reemplazo con medio completo fresco.

4.7: Cultivo de clones híbridos

Una vez que las colonias eran lo suficientemente grandes para cubrir el pocillo, se expandieron en matraces de cultivo tisular de 12 cm^{2} que contenían células de alimentación y a continuación además en matraces de 25 cm^{2} y 75 cm^{2}. Las células se dividieron 1:2 aproximadamente cada 2-3 días con medio completo fresco.

Una vez establecido un buen crecimiento, se congelaron algunas células y se almacenaron bajo nitrógeno líquido en medio incompleto suplementado con sulfóxido de dimetilo al 10% y suero de ternera fetal al 50%.

4.8: Producción de líquido ascítico

Los ratones Balb/c femeninos con 12-20 semanas de edad se cebaron con 0,5 ml de pristano. Tras una a cuatro semanas cebado, se inyectó por vía intraperitoneal 1 ml de células clonadas de hibridoma, resuspendidas en medio incompleto. Se aspiró el líquido ascítico 1-3 semanas más tarde y se separó de las células por centrigufación a 3000 g durante 10 minutos. A continuación se almacenó el líquido ascítico a - 20ºC.

II. Caracterización de los anticuerpos monoclonales obtenidos contra HBsAg de tipo salvaje y mutante 1: Isotipado de anticuerpos monoclonales

El isotipado de los anticuerpos monoclonales se realizó usando un kit de Serotec (Serotech Limited, 22 Bankside Station Approach, Kidlington, Oxfords OX5 1BR) específicamente diseñado para identificar la clase y la subclase de anticuerpos monoclonales en sobrenadantes de cultivo tisular. Usado de acuerdo con las recomendaciones del fabricante, caracterizó fácilmente el anticuerpo monoclonal de ratón.

2: Electroforesis de proteínas séricas

Se probó el líquido ascítico de cada clon para detectar la presencia de una banda de proteína monoclonal por medio de electroforesis de proteínas séricas (SPE, Paragon Electrophoresis System, Beckman Ltd). Siguiendo el protocolo proporcionado, el kit identificó convenientemente aquellos líquidos ascíticos que contenían altos niveles de inmunoglobulina monoclonal.

El kit Paragon Serum Protein Electrophoresis está ideado para lograr la separación electroforética de las proteínas en un gel de agarosa tamponado. Tras la electroforesis, se inmovilizaron las proteínas en el gel en una solución fijadora y se secó gel hasta obtener una película. El patrón proteico se visualiza tiñendo la película con un colorante específico de proteínas y se interpreta el patrón visualmente.

3: Preparación de inmunoglobulina G

La inmunoglobulina G se preparó por cromatografía de intercambio iónico a partir de diversos líquidos ascíticos.

Se resuspendió el gel DE52 (Whatman Ltd), suministrado previamente hinchado, en un tampón de fosfato 0,2M pH 8,0. A continuación se dispersó el gel en agua destilada dando una fuerza de tampón 10 mM.

Se empaquetó una columna K9 (Pharmacia) con el gel DE52 dando una relación de gel con respecto al volumen de la muestra de 5:1. Todas las columnas se equilibraron con un volumen igual de tampón de fosfato 10 mM (Pb-véase Reactivos). Tras la diálisis durante la noche a 4ºC en PB 10 mM, se colocó la muestra en la parte superior de las columnas y se dejó absorber durante 30 minutos.

Se recuperó la inmunoglobulina G del líquido ascítico por elución en etapas con PB 10mM, 30 mM y 60 mM. Se dejó correr cada tampón a través de la columna y se controló la densidad óptica del eluyente y se registró a 280 nm (Espectrofotómetro Ultra Violet, LKB Ltd.). Se recogieron los tres diferentes eluyentes por separado y se analizaron para detectar la actividad anti-HBs en el RIA de captura inversa. Pudo identificarse el eluyente que contenía la mayoría de la reactividad anti-HBs.

Se calcularon las concentraciones de proteínas de las IgG de líquido ascítico determinando sus absorbancia en 280nm usando un valor de E1% 1 cm de 1,4 en un espectrofotómetro.

4: Preparación de inmunoglobulina A

Como con IgG, la IgA se preparó usando cromatografía de intercambio iónico. La separación se realizó, sin embargo, en un gel de Sephacryl. Como con DE52, el gel se equilibró con tampón de fosfato 10mM. Se colocó la muestra en la parte superior de la columna y se dejó absorber durante 30 minutos. Como anteriormente, el líquido ascítico se separó por elución en etapas. El eluyente se controló y a continuación se probó para detectar la reactividad anti-HBs.

5: Procedimiento de Radiomarcado

El marcado de las fracciones de inmunoglobulinas se realizó mediante el procedimiento de iodogen (Salacinski y col., 1979).

Se recubrieron inicialmente tubos de vidrio de 7,5 x 10 cm con 5 \mug de cloroformo. A los tubos de iodogen se les añadieron 15 \mug de proteína en PBS. Finalmente se añadió Na^{125}I (0,5 miCi, Amersham International Plc) y se dejó proceder la reacción en el tubo durante 10 minutos sobre hielo. El iodogen actúa como agente oxidante suave para el Na^{125}I para unirse a un residuos tirosina en la proteína.

A continuación se empaquetó una columna K9 con Sephadex G-25 y se equilibró en tampón Tris BSA. Se añadió yoduro no radiactivo (KI/NaI) en PBS a la columna G25 ya que éste reduce la tendencia de que el ^{125}I se pegue a la columna. A continuación se retiró la mezcla de reacción del tubo de iodogen y se transfirió a la columna. El tampón Tris BSA se usó a continuación para eluir y se controló el eluyente. Se recogió la fracción de proteína marcada con ^{125}I del primer pico y se detuvo a medida que comenzó a disminuir el pico. A continuación se almacenó la proteína marcada a 4ºC en tampón Tris salino que contenía BSA al 5%.

Se continuó la elución hasta la aparición de ^{125}I libre (es decir el segundo pico). La altura de este pico comparada con la altura del primer pico dio una estimación del porcentaje de ^{125}I unido.

III. Resultados 1: Pacientes

Se probaron los sueros de los pacientes MAM y NP en una serie de ensayos para HBsAg. Los resultados de la comparación de los procedimientos basados en anticuerpos monoclonales y policlonales se muestran en la Tabla 1 a continuación.

TABLA 1 Ensayos de detección de HBsAg: una comparación

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Los resultados de la secuenciación revelaron varias mutaciones puntuales en el determinante "a" de ambos pacientes. Las mutaciones se encontraron en el ADN de VHB amplificado del paciente NP (subtipo ayw) en los codones del antígeno de superficie que codifican los aminoácidos 133, 134 y 144. Las mutaciones se encontraron en los codones que codifican los aminoácidos 133, 134, 142, 144 y 145 en el ADN de VHB amplificado del paciente MAM (subtipo adr). Esas mutaciones se detectaron previamente y tras el transplante. Las secuencias no difirieron entre el período en que HBsAg fue detectable por medio de cualquier ensayo basado en anticuerpos policlonales solos con respecto al tiempo en que HBsAg fue detectable tanto por medio de ensayos basados en anticuerpos monoclonales como policlonales. Las mutaciones se muestran en la Tabla 2.

El HBsAg MAM es HBsAg Mutante I y el HBsAg NP es HBsAg Mutante II. La secuencia completa de aminoácidos de HBsAg, y la secuencia de nucleótidos que lo codifican, se presentan en Valenzuela y col. (1979).

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TABLA 2 Mutaciones detectadas en el determinante "a" de HBsAg de los pacientes MAM y NP

2

2: Identificación y distribución de anticuerpos monoclonales secretores de anti-HBs

Los hibridomas que secretaban anti-HBs se identificaron inicialmente usando el ensayo de captura inversa (véase la sección II, 4.5). Aproximadamente una semana tras la fusión se probaron todos los pocillos que contenían grupos de crecer en crecimiento para detectar la actividad anti-HBs. Cada ensayo realizado incluyó controles negativos y positivos.

Las células que surgieron de la fusión de MAM se probaron en RIA en primer lugar con el ^{125}I HBsAg MAM mientras que aquellas que surgieron de la fusión de NP se probaron con el ^{125}I HBsAg NP. Los resultados del ensayo darían una indicación de aquellos clones que estaban produciendo anticuerpos contra sus antígenos de superficie respectivos. Se consideraron positivos los hibridomas que dieron recuentos por encima de 750 cpm. Se ha mostrado que de los 320 clones de MAM probados, el 10% fueron positivos mientras que el 8% de los 200 clones de NP fueron positivos.

Para comprobar si existe cualquier reactividad contra el HBsAg de tipo salvaje (WT), se probaron clones de las fusiones de NP y de MAM, sin tener en cuenta si eran positivos en el ensayo previo en RIA de captura inversa usando el marcador ^{125}I HBsAg WT. Como anteriormente, una unión aumentada del marcador indicó un resultado positivo. Se consideraron positivos los hibridomas que dieron recuentos por encima de 650 cpm. De los 320 clones de MAM probados, el 6% dio resultados positivos mientras que se encontró que el 4% de los clones de NP se unieron al ^{125}I HBsAg WT.

Con los resultados obtenidos hasta el momento fue posible identificar aquellos clones que secretaban anti-HBs que estaban reconociendo específicamente y por consiguiente uniéndose al antígeno de superficie de hepatitis B de MAM, de NP o del WT.

Para determinar si había alguna reactividad cruzada dentro de estos hibridomas se probaron los clones de NP con ^{125}I HBsAg MAM y los clones de MAM con el ^{125}I HBsAg NP. Se encontró que 4 de los clones de MAM reconocieron el marcador de NP mientras que 5 de los clones de NP fueron reconocidos por el marcador de MAM.

Los clones se habían probado con todas las combinaciones de marcador. Fue por lo tanto posible identificar aquellos hibridomas que habían dado coherentemente resultados positivos fuertes ya sea con el ^{125}I HBsAg MAM, ^{125}I HBsAg de NP o con ^{125}I HBsAg de WT. Los anticuerpos monoclonales pueden ahora dividirse en las siguientes categorías: 1) específico de MAM; 2) específico de NP; 3) específico de MAM/NP; 4) específico de MAM/WT; 5) específico de NP/WT; 6) específico de NP/WT/MAM.

Se eligieron ocho hibridomas relacionados con NP y diez relacionados con MAM que cayeron en una de las categorías enumeradas anteriormente. Se eligieron estos hibridomas porque presentaron buen crecimiento celular y también resultaron positivos en repetidas veces al probarse la actividad anti-HBs.

A continuación se clonaron los dieciocho hibridomas elegidos por dilución limitante. Tras aproximadamente catorce días de la clonación, se probaron los pocillos que contenían colonias únicas en el ensayo de captura inversa con los tres marcadores. Seis de los ocho hibridomas de NP clonaron con éxito y se encontró que fueron todavía positivos para actividad anti-HBs.

Sin embargo, con los clones de MAM, se encontró que solamente seis de los diez hibridomas elegidos clonaron. Los intentos de volver a clonar los hibridomas a partir de sus respectivas colonias relacionadas no resultaron satisfactorios a pesar de aumentar la concentración de células añadidas a cada placa. Los seis hibridomas clonados satisfactoriamente que contenían colonias únicas se probaron para actividad anti-HBs. De los seis, se encontró que dos hibridomas, M3C9 y M3A10, ambos con especificidad cruzada triple resultaron aún positivos para anti-HBs. Los hibridomas derivados de la fusión de MAM resultaron ser extremadamente inestables a medida que sufrían pasajes.

Se eligieron al menos tres clones positivos de cada hibridoma para la expansión. Los clones se propagaron en cultivo y se probaron nuevamente dos semanas más tarde. Todos los clones de NP continuaron siendo positivos para la secreción de anti-HBs. Sin embargo de los clones de MAM, M3C9 resultó también ser extremadamente inestable dando resultados negativos en RIA.

Los hibridomas secretores positivos finales de cada fusión se muestran en la Tabla 3 a continuación. La tabla también da la especificidad del anticuerpo monoclonal y sus valores de RIA redondeados hasta los 500 cpm más cercanos.

TABLA 3 Clones derivados de fusiones de NP y de MAM con su respectiva especificidad y valores de RIA

3

Se realizó una segunda fusión de MAM. La fusión se llevó a cabo como se describió anteriormente. Sin embargo, el rendimiento de células del bazo fue sólo del 25% de la registrada en la fusión original de MAM. Aproximadamente una semana más tarde, se probaron todos los pocillos que contenían grupos de células en crecimiento para detectar actividad anti-HBs usando RIA de captura inversa. Como anteriormente, cada ensayo realizado incluyó controles negativos y positivos. Se probaron todas las células que surgieron de la fusión con cada uno de los marcadores, ^{125}I HBsAg MAM, ^{125}I HBsAg NP y ^{125}I HBsAg de WT.

De los 68 clones probados, solamente tres produjeron resultados positivos. Se encontró que un clon resultó específico de MAM mientras que los otros dos, M4H2 y M4F5, resultaron con especificidad cruzada para WT/NP/MAM (Tabla 4). Sin embargo, como se describe con más detalle a continuación, M4H2 probó ser inestable, como algunos de los hibridomas de la primera fusión de MAM. Se estabilizó eventualmente como un clon específico de MAM.

TABLA 4 Clones derivados de la segunda fusión de MAM con sus respectivas especificidades y valores de RIA

4

Los tres hibridomas mostraron buen crecimiento celular y se clonaron por dilución limitante. La clonación en esta ocasión resultó satisfactoria y todos los pocillos que contenían colonias únicas se probaron en RIA de captura inversa con los tres los marcadores. Los clones resultaron ser aún positivos para actividad anti-HBs.

Se eligieron cinco clones positivos para la expansión. Tras otro crecimiento en cultivo, se seleccionaron los clones y resultaron ser aún positivos para producción de anti-HBs.

El número final de hibridomas positivos relacionados y sus especificidades de anticuerpo y reactividad cruzada obtenidos de la fusión de NP y de las dos fusiones de MAM se muestran en la Tabla 5.

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TABLA 5 Número final de clones con sus respectivas especificidades y valores de RIA

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5

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Se realizaron otros estudios competición cruzada usando los anticuerpos P2D3, M4F5 y M3A10 con HBsAg WT, NP y MAM. Cada uno de esos anticuerpos compitieron de manera cruzada con alguno de los otros anticuerpos monoclonales obtenidos. En esta etapa M4H2 aparecía aún como una cruzada triple.

Estos resultados indican además que los anticuerpos monoclonales de la invención se unen a un epítopo distinto.

Se eligió un clon positivo de cada hibridoma relacionado y se inyectó en un ratón Balb/c previamente cebado con pristano. Una a tres semanas tras la inoculación intraperitoneal, se recogió el líquido ascítico de los ratones. Todos los clones produjeron con éxito tumores ascíticos en los ratones. La cantidad de líquido ascítico obtenido de cada ratón varió desde 1 ml hasta 5 ml.

Se realizaron estudios de competición cruzada mas extensos usando diversos anticuerpos diferentes, cada uno con HBsAg WT, MAM y NP. Esos ensayos se realizaron según el protocolo de RIA de captura inversa presentado anteriormente con las siguientes modificaciones: los micropocillos se recubrieron con un anticuerpo anti-HBs policlonal de cabra. En cada se añadieron 100 \mul del antígeno y se incubó durante la noche, a continuación se añadieron 50 \mul de cada uno de los anticuerpos monoclonales, marcado con ^{125}I y sin marcar, y se determinó la unión. Los resultados se presentan en las Tablas 6a, 6b y 6c. En esas Tablas, se presentan horizontalmente los anticuerpos marcados y verticalmente los anticuerpos sin marcar.

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9

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Los resultados mostrados en las Tabla 6a, 6b y 6c confirman que los anticuerpos con especificidad cruzada triple M4F5 y P2D3 se unen a un epítopo común.

Se encontró que M3A10 resultó ser previamente un anticuerpo con especificidad cruzada triple (véase Tabla 4). El hecho que es un anticuerpo IgA (véase Sección III.4 a continuación) puede explicar los pobres resultados de unión mostrados en la Tabla 6a ya que esta clase de anticuerpos (IgA) es difícil de purificar.

Como se muestra anteriormente, el hibridoma M4H2, que se produjo en la segunda fusión de MAM, resultó ser inicialmente de especificidad cruzada triple (véase Tabla 4). Sin embargo, tras otro crecimiento en cultivo, ese hibridoma mostró unión decreciente a ^{125}I HBsAg WT y al ^{125}I HBsAg NP. La reiteración de pruebas para actividad anti-HBs contra el HBsAg WT y NP durante un período de tiempo revelaron resultados negativos. Sin embargo, M4H2 continuó reconociendo y uniéndose fuertemente al ^{125}I HBsAg MAM. Parece por consiguiente, que la especificidad de clon era inicialmente inestable y con el paso del tiempo evolucionó a un hibridoma secretor de anticuerpos específicos de MAM.

La unión de los anticuerpos marcados con ^{125}I a diversos HBsAg diferentes se midió usando un RIA en el que el HBsAg estaba inmovilizado a la fase sólida (micropocillos) por medio de un anti-HBs policlonal de cabra con que se recubrieron los micropocillos. Los HBsAg usados fueron HBsAg WT, MAM y NP, que se describieron anteriormente, HBsAg SP y HBsAg SZ. El HBsAg SP, que es del serotipo adw, tiene una mutación en el codón para el aminoácido 143 que lleva a la sustitución de met por ser. En el HBsAg SZ, del serotipo adr, una mutación lleva a la sustitución de arg por gly en la posición 145. (HBsAg SP es HBsAg Mutante IV y HBsAg SZ es HBsAg Mutante III). Como control se usó una combinación de sueros humanos normales que se había probado y había resultado estar libre de marcadores de hepatitis B (NHS). Este es un ejemplo de un inmunoensayo según la presente invención. Los resultados se presentan en la Tabla 7 a continuación.

TABLA 7

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Estos resultados muestran que los anticuerpos con especificidad cruzada triple detectan el HBsAg de tipo salvaje y también HBsAg de diversos mutantes diferentes, incluyendo HBsAg mutante diferente del usado para la selección de los anticuerpos. Estos resultados confirman además que los anticuerpos con especificidad cruzada triple se unen a un epítopo común a la proteína de tipo salvaje y a formas mutantes y demuestran la utilidad de los anticuerpos en los ensayos de HBsAg. Usando tales anticuerpos es posible detectar la presencia de mutantes de escape.

3: Isotipado de anticuerpos monoclonales

El isotipado de los anticuerpos monoclonales se realizó usando un kit de Serotec. Cada reactivo de isotipado estaba constituido por anticuerpo monoclonal purificado de rata específico para una única clase-subclase de inmunoglobulina, acoplado a glóbulos rojos de oveja. Los anticuerpos acoplados de rata reconocieron la porción de cadena pesada de la inmunoglobulina de ratón. El principio del sistema de prueba estaba basado en la aglutinación de glóbulos rojos donde se producía un resultado positivo de aglutinación cuando un anticuerpo altamente específico reconocía y se unía al isotipo particular al que estaba dirigido. La unión formó una red en el fondo del pocillo de la placa de microvaloración. Un resultado negativo se produjo cuando se ponían las células reactivas en un sobrenadante que contenía una clase de anticuerpo que no reconocían. Las células reactivas caían al fondo del pocillo formando un pequeño "botón".

Los isotipos de los anticuerpos monoclonales se muestran en la Tabla 8.

TABLA 8 Clases de inmunoglobulinas de anticuerpos monoclonales

11

4: Análisis SPE y purificación de anti-HBs de líquido ascítico

Se demostró la presencia de proteína monoclonal en el líquido ascítico de todos los clones por electroforesis de proteínas del suero. La movilidad electroforética de la banda de proteína monoclonal varió ligeramente para cada líquido ascítico monoclonal diferente, pero fue idéntica para los diferentes lotes de líquido ascítico obtenidos del mismo clon. La disparidad en la distancia de migración entre clones fue el resultado de las cargas iónicas diferentes en las proteínas monoclonales. La intensidad de tinción observada en la banda monoclonal de SPE dio una indicación de la cantidad de proteína monoclonal presente. Esto varió entre los líquidos ascíticos recogidos de diferentes clones. Sin embargo, no se observó una banda en la SPE con M4B12, el anticuerpo monoclonal específico de MAM. Cuando se probó el líquido ascítico recuperado en el RIA para actividad anti-HBs, el resultado fue negativo; todos los otros líquidos ascíticos dieron los resultados positivos esperados. Como anteriormente el anticuerpo monoclonal específico de MAM probó ser inestable cambiando de hibridoma secretor positivo a negativo. (El hibridoma relacionado con M4B12 ha sido reclonado y se probará nuevamente).

La preparación de inmunoglobulinas a partir de líquidos ascíticos se realizó como se describió en las secciones III, 3 y III, 4 anteriormente. La inmunoglobulina G se preparó por medio de cromatografía de intercambio iónico en DE52 mientras que IgA se preparó en una columna de Sephacryl. Se obtuvieron tres picos separados al aumentar la fuerza iónica de PB 10 mM hasta 30 mM y finalmente 60 mM para cada líquido ascítico monoclonal. Los tamaños de los picos variaron de un líquido monoclonal a otro. Se recogió el eluyente en cada pico. A continuación se midieron las IgG/IgA anti-HBs en las diferentes concentraciones del tampón en el ensayo de captura inversa con ^{125}I HBsAg MAM, ^{125}I HBsAg NP y ^{125}I HBsAg WT. El ensayo permitió realizar una comparación directa de resultados entre las diferentes fracciones de tampón realizadas. A partir del ensayo, fue posible elegir la fracción que mostró la actividad anti-HBs más alta. Se determinaron las concentraciones de proteína de las fracciones elegidas (Tabla 9). La cantidad de IgG/IgA obtenida de cada anticuerpo monoclonal varió entre cada lote de líquido ascítico recogido.

TABLA 9 Cantidad de IgG/IgA recogida de 1 ml de cada líquido ascítico monoclonal

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La intensidad de tinción de la banda monoclonal en la SPE mostró correlación fuertemente positiva con los resultados de concentración de proteína de la Tabla 7. Por ejemplo P4C11 mostró una banda teñida muy oscura en la SPE y tenía una concentración proteica elevada mientras que P2H9 mostró una banda débilmente teñida y tenía una concentración proteica baja.

Discusión general

Los resultados de los ensayos de detección de HBsAg han confirmado que como resultado de mutaciones, puede no detectarse HBsAg en suero por medio de algunos sistemas basados en anticuerpos monoclonales. Tales mutaciones pueden provocar el fallo del anticuerpo de captura o del anticuerpo de detección conjugado a unir. Estos resultados muestran la importancia de realizar pruebas para un segundo marcador en casos sospechosos de infecciones por VHB cuando el ensayo inicial de selección para HBsAg es negativo. NP y MAM hubieran mostrado un único perfil anti-HBc si se hubieran realizado pruebas para HBsAg con un ensayo basado en anticuerpos monoclonales. La presencia de HBsAg en las muestras se reveló al realizar pruebas por los sistemas basados en anticuerpos policlonales.

Se detectó una mutación en el aminoácido 145 (glicina por lisina) en el paciente MAM. Aunque esta mutación era diferente de la descrita previamente en los mutantes de escape de vacunas (glicina por arginina), la sustitución de aminoácidos fue tal que el efecto predicho en la estructura del antígeno es similar.

El paciente NP no tenía una mutación en el codón 145 sino múltiples mutaciones como con el paciente MAM. No se ha determinado cuál de las mutaciones es responsable de la pérdida de detectabilidad. Resulta interesante destacar que en el paciente MAM las secuencias de nucleótidos no variaron con el cambio en la especificidad de HBsAg en los ensayos de detección de HBsAg. Esto pudo haber sido por el surgimiento del virus de tipo salvaje presente en menos de 15-20% de la carga viral total, el límite de detección por análisis de secuencia directa.

La producción de anticuerpos monoclonales contra los antígenos de superficie de hepatitis B mutantes fue satisfactoria. El número de clones producidos en la fusión de NP y la fusión inicial de MAM y la distribución relativa de las especificidades de los anticuerpos resultantes fueron favorables. Para identificar los hibridomas secretores de anti-HBs, fue necesario un ensayo sensible pero rápido de selección. Se eligió un radioinmunoensayo de captura inversa de IgG. El ensayo, aunque sencillo de implementar, es capaz de tener un fondo muy bajo y un intervalo dinámico grande. La unión relativa por los clones positivos de HBsAg de tipo salvaje y HBsAg mutante marcados fue indudablemente alta y coherente dando resultados fiables.

La selección los hibridomas se realizó inicialmente probando aquellos clones derivados de la fusión de MAM con ^{125}I HBsAg MAM y los clones de NP con ^{125}I HBsAg NP. Los resultados de este ensayo dieron una indicación de aquellos clones que producían específicamente anti-HBs que reconocían y por consiguiente se unían al HBsAg MAM o al HBsAg NP. Todos los clones producidos como resultado de las dos fusiones se probaron a continuación con ^{125}I HBsAg WT. Ningún clon único dio una reacción positiva solamente con el HBsAg WT. Se encontraron reacciones cruzadas de MAM/WT o de NP/WT.

Por consiguiente resultó posible identificar aquellos clones que reconocían el HBsAg MAM o el HBsAg NP. También fueron identificados aquellos clones que se unían también al HBsAg NP y al WT. Para probar cualquier reactividad cruzada entre los hibridomas se probaron los clones producidos a partir de la fusión de MAM con ^{125}I HBsAg NP y viceversa. Como resultado de los ensayos de selección, fue posible categorizar los clones como se presentan en la sección de Resultados.

Los controles positivos incluidos en el ensayo fueron dos anticuerpos monoclonales conocidos de HBsAg WT, H3F5 y D2H5 mientras que los controles negativos fueron PBS y 3D3F2, un monoclonal anti-VIH gag. Según lo esperado cuando se usa en el RIA de ^{125}I HBsAg WT, H3F5 y D2H5 dieron resultados fuertemente positivos. Sin embargo cuando se probaron nuevamente contra ^{125}I HBsAg MAM solamente H3F5 dio una lectura positiva y fue negativo cuando se probó con el ^{125}I HBsAg NP. Aunque D2H5 produjo una señal positiva con el ^{125}I HBsAg NP fue muy débil cuando se probó nuevamente contra ^{125}I HBsAg MAM. Las mutaciones en el HBsAg MAM eliminaron el epítopo para D2H5 mientras que aquellas en el HBsAg NP eliminaron el epítopo para H3F5.

Los resultados obtenidos al probar con el HBsAg mutante SP y de SZ muestran que los anticuerpos con reactividad cruzada triple son capaces de detectar otras formas mutantes de HBsAg además de aquellas usadas en el procedimiento de selección. Esto confirma que los anticuerpos se unen a un epítopo que está conservado entre la proteína de tipo salvaje y las formas mutantes, y confirma de esa manera el valor de incluir tales anticuerpos en un ensayo de HBsAg.

Aunque algunos de los hibridomas de las fusiones de MAM resultaron ser inestables, se obtuvieron reacciones cruzadas triples satisfactorias fácilmente a partir de las fusiones de MAM y de NP. Las formas mutantes de HBsAg diferentes de las formas MAM y NP pueden usarse para obtener y/o seleccionar anticuerpos monoclonales según los protocolos descritos anteriormente.

Nota: La Figura 1b es una versión mecanografiada del la Figura 1a. En caso de cualquier discrepancia entre la Figura 1a y la Figura 1b, se tomará a la Figura 1a como la versión auténtica.

Reactivos

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Tampón Tris 0,02 M pH 7,6 (tampón Tris)

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Tampón Tris BSA 0,02 M

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Añadir BSA al 0,5% al tampón Tris 0,02 M pH 7,6.

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Tampón Fosfato 0,2 M (PB)

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Solución A = KH_{2}PO_{4} 0,2 M

Solución B = Na_{2}HPO_{4} 0,2 M

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Tomar 200 ml de solución B. Ajustar el pH hasta 8,0 con la solución A.

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PB 10, 20, 30 y 60 mM

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Para PB 10 mM diluir PB 0,2 M 1:20 en agua destilada.

Para PB 30 mM diluir PB 0,2 M 1:6,6 en agua destilada.

Para PB 60 mM diluir PB 0,2 M 1:3,3 en agua destilada.

Claims (31)

1. El anticuerpo monoclonal P2D3 como el producido por el hibridoma denominado P2D3 y depositado en ECACC bajo número de acceso 97042331, o un anticuerpo monoclonal que compite de manera cruzada con el anticuerpo monoclonal P2D3 para unirse a un antígeno de superficie de hepatitis B de tipo salvaje, también denominado HBsAg, y al menos a dos formas mutantes de HBsAg, en el que las formas mutantes de HBsAg tienen una sustitución de aminoácidos con relación al HBsAg de tipo salvaje dentro de la secuencia que codifica los aminoácidos 133 a 145 del HBsAg.

2. Un anticuerpo monoclonal según la reivindicación 1, en el que una forma mutante de HBsAg tiene la secuencia de HBsAg presente en un mutante de escape del VHB.

3. Un anticuerpo monoclonal según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que la sustitución de aminoácidos es el resultado de una mutación puntual.

4. Un anticuerpo monoclonal según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que un HBsAg mutante tiene una sustitución de aminoácidos con relación al HBsAg de tipo salvaje en más de una de las posiciones 133, 134, 141, 142, 143, 144 y 145.

5. Un anticuerpo monoclonal según una de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la sustitución está en una o más cualesquiera de las posiciones 143, 144 y 145.

6. Un anticuerpo monoclonal según la reivindicación 1 que compite de manera cruzada con el anticuerpo monoclonal P2D3 para unirse a un HBsAg de tipo salvaje y al menos a dos de las siguientes formas mutantes de HBsAg:

HBsAg Mutante I, denominado también HBsAg "NP": subtipo ayw, mutaciones met por ile en el aminoácido 133; phe por his en el aminoácido 134; y asp por val en el aminoácido 144;

HBsAg Mutante II (HBsAg "MAM"): subtipo adr, mutaciones met por ile en el aminoácido 133; phe por asn en el aminoácido 134; pro por ser en el aminoácido 142; ser por leu en el aminoácido 143; y gly por lys en el aminoácido 145;

HBsAg Mutante III, denominado también HBsAg "SZ": subtipo adr, mutación gly por arg en el aminoácido 145;

HBsAg Mutante IV, denominado también HBsAg "SP": subtipo adw, mutación ser por met en el aminoácido 143.

7. Un anticuerpo monoclonal según la reivindicación 1, que es el anticuerpo monoclonal M2A10 como se produce por medio del hibridoma denominado M3A10 y depositado en ECACC bajo número de acceso ECACC 97042330.

8. Un anticuerpo monoclonal según la reivindicación 1, que es el anticuerpo monoclonal M4F5 como se produce por medio del hibridoma denominado M4F5 y depositado en ECACC bajo número de acceso ECACC 97042519.

9. Un anticuerpo monoclonal según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en una forma humanizada.

10. Un fragmento o un derivado de un anticuerpo monoclonal según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, cuyo fragmento o derivado compite de manera cruzada con el anticuerpo monoclonal P2D3 en la unión al HBsAg de tipo salvaje y al menos a dos formas mutantes de HBsAg.

11. Un procedimiento para producir un hibridoma capaz de producir un anticuerpo monoclonal según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, que comprende inmunizar un animal con un HBsAg de tipo salvaje o una forma mutante del antígeno HBsAg, opcionalmente en la forma de un fragmento antigénico adecuado o derivado del mismo, inmortalizar células productoras de anticuerpos para formar hibridomas, seleccionar los cultivos de hibridomas para competición cruzada con el anticuerpo monoclonal P2D3 o un anticuerpo monoclonal según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4 para unirse a un HBsAg de tipo salvaje y dos o más formas mutantes de HBsAg, opcionalmente en la forma de un fragmento antigénico adecuado o derivado del mismo, y seleccionar aquellos hibridomas que producen anticuerpos que compiten de manera cruzada.

12. Un hibridoma capaz de producir un anticuerpo monoclonal según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.

13. El hibridoma denominado P2D3 y depositado en ECACC bajo número de acceso ECACC 97042331.

14. El hibridoma denominado M3A10 y depositado en ECACC bajo número de acceso ECACC 97042330.

15. El hibridoma denominado M4F5 y depositado en ECACC bajo número de acceso ECACC 97042519.

16. Un procedimiento para producir un anticuerpo monoclonal según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 que comprende cultivar, in vitro o in vivo, un hibridoma según una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15 o como se obtiene por medio de un procedimiento según la reivindicación 11, y obtener el anticuerpo monoclonal a partir del medio de cultivo.

17. Un inmunoensayo para la detección de HBsAg, que comprende poner en contacto una muestra bajo investigación con un anticuerpo monoclonal según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, un fragmento o derivado del mismo según la reivindicación 10, o una combinación de dos o más de los mismos, y detectar cualquier complejo antígeno-anticuerpo resultante.

18. Un inmunoensayo según la reivindicación 17, en el que el anticuerpo monoclonal, fragmento, derivado o combinación de los mismos se usa en combinación con otro u otros anticuerpos seleccionados de anticuerpos policlonales anti-HBs y otros anticuerpos monoclonales anti-HBs.

19. Un inmunoensayo según la reivindicación 17 o la reivindicación 18 en un formato homogéneo o heterogéneo.

20. Un inmunoensayo según la reivindicación 19, en un formato de captura o competitivo.

21. Un inmunoensayo según una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 20, en el que se realiza un inmunoensayo para la detección de anticuerpos para la proteína del núcleo de hepatitis B (HBc) simultáneamente con el ensayo para HBsAg.

22. Un kit de inmunoensayo que comprende un anticuerpo monoclonal según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, un fragmento o derivado del mismo según la reivindicación 10, o una combinación de dos o más de los mismos, y otros reactivos necesarios para llevar a cabo un inmunoensayo para HBsAg y opcionalmente también reactivos para detectar anticuerpos anti-HBc.

23. Un kit según la reivindicación 22, que comprende también reactivos para detectar anticuerpos anti-HBc.

24. Un kit según la reivindicación 22 o la reivindicación 23, que comprende también otros anticuerpos anti-HBs seleccionados del grupo constituido por anticuerpos policlonales anti-HBs y anticuerpos monoclonales anti-HBs.

25. Un kit según una cualquiera de las reivindicaciones 22 a 24, en el que los reactivos necesarios para llevar a cabo un inmunoensayo para HBsAg se seleccionan de soluciones de lavado, diluyentes, soluciones patrón, reactivos de control y anticuerpos anti-HBs marcados.

26. Una fase sólida, adecuada para uso en un inmunoensayo, sobre el que se inmoviliza un anticuerpo monoclonal según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, un fragmento o derivado del mismo según la reivindicación 10, o una combinación de dos o más de los mismos.

27. Una fase sólida según la reivindicación 26, en el que otro u otros anticuerpos anti-HBs seleccionados de anticuerpos anti-HBs policlonales y otros anticuerpos anti-HBs monoclonales están también inmovilizados en la fase sólida.

28. Una fase sólida según la reivindicación 26 o la reivindicación 27 sobre la que se inmoviliza también un agente que captura anticuerpos anti-HBc.

29. Una composición adecuada para usar terapéutica o preventivamente para inmunización pasiva contra el VHB que comprende un anticuerpo monoclonal según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, un fragmento o derivado según la reivindicación 10, o una combinación de dos o más de los mismos, mezclados con un vehículo farmacéuticamente adecuado.

30. Una composición según la reivindicación 29 que comprende también otros anticuerpos seleccionados del grupo constituido por anticuerpos policlonales anti-HBs y anticuerpos monoclonales anti-HBs.

31. Un anticuerpo anti-idiotipo para un anticuerpo monoclonal según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, o un fragmento o derivado del mismo según la reivindicación 10.