ES2243002T3 - Anticuerpos y otras moleculas de union especificas para antigenos virales de la hepatitis b. - Google Patents
Anticuerpos y otras moleculas de union especificas para antigenos virales de la hepatitis b.Info
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Abstract
la invención se refiere a anticuerpos y a otras moléculas de unión específicos para antígenos virales de la hepatitis B (HBV), a péptidos que comprenden epítopos reconocidos por las moléculas y a líneas celulares capaces de producir anticuerpos. La invención se refiere además a la utilización de las moléculas en las diagnosis del virus de la hepatitis B (HBV). La invención se refiere además a un procedimiento para la diagnosis de la hepatitis B, el procedimiento comprende la puesta en contacto de la muestra sospechosa de contener partículas o antígenos de la hepatitis B con la molécula de unión específica de acuerdo con la invención. De forma más adecuada, la invención se refiere a un procedimiento para la diagnosis de la hepatitis B, el procedimiento comprende la puesta en contacto de la muestra sospechosa de contener partículas o antígenos de la hepatitis B con al menos una molécula de unión específica dirigida a la región S del HBV y al menos una molécula de unión específica De acuerdocon la invención. La invención se refiere además a un equipo de ensayo para la detección de partículas o antígeno de la hepatitis B, el equipo comprende una molécula de unión específica De acuerdo con la invención y medios para detectar cuándo la molécula de unión específica se une a una partícula o antígeno del virus de la hepatitis B.
Description
Anticuerpos y otras moléculas de unión
específicas para antígenos virales de la hepatitis B.
La presente invención se relaciona con un método
y un kit para el diagnóstico in vitro de la hepatitis B.
El virus que causa la hepatitis B o hepatitis
sérica parece infectar sólo al hombre y a los chimpancés. La
infección por el virus de la hepatitis B (VHB) en humanos tiene una
amplia distribución.
La infección de la hepatitis se transmite por
tres mecanismos generales: (1) por inoculación parenteral de sangre
o fluidos orgánicos infectados, ya sea en grandes cantidades, como
en las transfusiones sanguíneas, o en cantidades diminutas, como a
través de un pinchazo cutáneo; (2) por estrecho contacto familiar o
sexual, y (3) por algunas madres, quienes, infectadas durante la
gestación, transmiten el virus a sus hijos recién nacidos. En
condiciones naturales, el VHB no es altamente contagioso. La
transmisión por inhalación se produce raramente, si es que llega a
producirse.
La vía de transmisión por sangre o productos
sanguíneos contaminados es una amenaza importante para la salud
humana.
La infección con VHB da lugar frecuentemente a
enfermedad hepática autolimitada subclínica o aguda, o puede dar
lugar a infección crónica a largo plazo. La infección crónica por
VHB provoca un espectro de entidades morbosas que va desde la forma
más severa de hepatitis activa crónica (HAC)) hasta la hepatitis
persistente crónica menos grave (HPC) y hasta el estado de portador
asintomático (PAS). Se ha desarrollado recientemente una serie de
ensayos diagnósticos para ayudar al clínico a diferenciar las
infecciones por el virus de la hepatitis B de otras formas de
hepatitis vírica (es decir, VHA, VHE, VHC). Sin embargo, la
capacidad para distinguir entre una infección por hepatitis B aguda
(HA-B) y una infección por hepatitis B crónica
sintomática (HC-B) es aún problemática. Esto es
especialmente cierto, ya que los pacientes con HAC y HPC demuestran
con frecuencia un patrón cíclico de hepatitis, caracterizado por
exacerbaciones agudas (E.A.) de lesión hepática alternando con
función hepática normal.
Tras la infección con VHB, están presentes en el
suero grandes cantidades del virus y de partículas asociadas.
Durante las fases sintomáticas de la infección, los pacientes con
VHB tanto agudos como crónicos tienen elevados niveles de enzimas
hepáticas, poseen el antígeno de superficie de la hepatitis B
(HBsAg) en el suero y producen anticuerpos frente al antígeno de la
nucleocápside (HBcAg). No se detectan anticuerpos específicos para
el HBsAg o el antígeno de la hepatitis B e (HBeAg). La aparición de
anticuerpos para HBsAg no se observa normalmente hasta
aproximadamente dos meses después de desaparecer el HBsAg
circulante. Se sabe que las partículas víricas presentes en el suero
eliminan su capa superficial, exponiendo la nucleocápside, conocida
como el antígeno nuclear (HBcAg). La producción de anticuerpos para
HBcAg se produce inicialmente en el curso de la fase aguda de la
infección por VHB y puede persistir durante muchos años y los
pacientes con infección crónica pueden producir altos títulos de
anticuerpos anti-HBc.
El HBsAg se establece como el marcador más
importante de la infección por hepatitis B aguda o crónica,
detectable en el suero de individuos infectados. El rastreo de
HBsAg de sangre de donantes, por ejemplo, es esencial para evitar la
transmisión de la hepatitis B. Está claro que la sensibilidad es de
la mayor importancia en ensayos diagnósticos para el VHB.
Los antígenos de superficie del VHB (HBsAg) son
los productos de la traducción de un gran marco abierto de lectura
("ORF") que se demarca en tres dominios; cada uno de estos
dominios comienza con un codon ATG en-marco que
puede funcionar como sitio de iniciación de la traducción. Se hace
referencia a estos dominios como Pre-S1,
Pre-S2 y S en su respectivo orden 5' a 3' en el gen.
Así, estos dominios definen tres polipéptidos a los que se hace
referencia como S o HBsAg (226 aminoácidos), Pre-S2
+ S (281 aminoácidos) y Pre-S1 +
Pre-S2 + S (289-400 aminoácidos), a
los que también se hace referencia, respectivamente, como proteína
mayor (proteína S), proteína media (proteína M) y proteína grande
(proteína L) (Toillais y col., 1985, Nature, 317,
489-495).
El HBsAg en la parte de la envuelta vírica de VHB
tiene un determinante "a" específico de grupo bien
caracterizado y dos conjuntos de determinantes de subtipo
mutuamente excluyentes d/y y w/r. Así, cuatro subtipos mayores de
HBsAg - adw, ayw, adr y ayr - denotan los fenotipos del virión (Le
Bouvier y col., 1975, Amer. J. Med. Sci. 270, 165). Con la
subdivisión de la especificidad de "a" en a1, a2 y a3 y otras
especificidades intermedias que se redefinieron posteriormente como
subdeterminantes de w (w1-w4) en un taller
internacional en París en 1975 (Courouce y col., 1976, Bibl.
Hematol., Basel, Karger, Vol. 42), la aparición de subtipos de
HBsAg adquirió un considerable grado de complejidad. Estos subtipos
eran ayw1, ayw2, ayw3, ayw4, ayr, adw2, adw4 y adr. Con la
identificación del determinante q (Magnius y col., 1975, Acta
Pathol. Micr. Scand., 83B, 295-297), el número de
subtipos aumentó de ocho a nueve, debido a la subdivisión del
subtipo adr en una categoría q-positiva y una
q-negativa (Courouce-Pauty y col.,
1978, Vox Sang, 35, 304-308). La secuenciación de
los genomas completos codificantes de los subtipos adw2 y ayw3
reveló numerosas substituciones en todo el genoma (Valenzuela y
col., 1980, ICN-UCLA, Symposia on Animal Virus
Genetics, NY, Ac. Press, pp. 57-70). Se reivindicó
que una serie de estas substituciones en el gen S se asociaban con
la expresión de la especificidad de d e y (Okamoto y col., 1986, J.
Gen. Virol. 67, 2305-2314). Análisis de patrones de
reactividad con anticuerpos monoclonales después de la modificación
química del HBsAg revelaron la importancia de la Lys 122 para la
expresión del determinante d (Peterson y col., 1984, J. Immun. 132,
920-927). Estudios posteriores en donantes de
sangre portadores de antígenos de superficie de los subtipos
compuestos adyr y adwr, respectivamente, mostraron que
substituciones de aminoácidos en la posición 122 y 160 solas
explicaban la expresión de la especificidad d/y y w/r,
respectivamente (Okamoto y col., 1987, J. Virol., 61,
3030-3034). Los dos cambios de d a y y de w a r
estaban mediados por un cambio de Lys a Arg en las posiciones
correspondientes. Por lo tanto, existen variaciones mayores de
subtipos de HBsAg.
La secuenciación de genomas víricos y la
comparación han definido cuatro grupos genómicos de VHB con una
divergencia del 8% o más del genoma completo y se les designó con
A-D (Okamoto y col., 1988, J. Gen. Virol., 69,
2575-2583). Se encontraron genomas codificantes del
subtipo adw en los grupos genómicos A-C, mientras
que se encontraron todos los genomas codificantes de ayw en el
grupo D y en el grupo B (Sastrosoewignjo y col., 1991, J.
Gastroenterol. Hepatol., 6, 491-498). Los genomas
codificantes tanto del subtipo adr como del ayr aparecían en el
grupo genómico C junto con adw.
También se identificaron recientemente dos nuevos
genotipos de VHB designados con E y F (Norder y col., 1994,
Virology, 198, 489-503).
Aparte de la variabilidad genética del VHB en
base a la divergencia de las cepas de VHB a lo largo de prolongados
períodos de tiempo, que dan lugar a subtipos y genotipos
geográficamente relacionados, se ha centrado recientemente un
considerable interés en dos tipos de mutantes de escape inmune. El
primero de éstos que se va a describir era una mutación del Trp 28
a un codon de parada en la secuencia prenuclear, que evitaba
específicamente la expresión de HBsAg, aunque dejando la de HBcAg
sin afectar (Carman y col., 1989, Lancet, ii, 588- 591; Brunetto y
col., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88,
4186-4190).
Se han descrito mutantes de escape vacunales que
tienen el determinante "a" de HBsAg, una parte importante del
cual está formada por un bucle que abarca los residuos de
aminoácidos 139-147 estabilizado por un puente
disulfuro entre dos residuos de cisteína en estas posiciones (Waters
y col., 1991, Virus Res., 22, 1-12; Stirk y col.,
1992, Intervirology, 33, 148-158). Se reveló una
mutación de Gly a Arg en el residuo 145 de HBsAg en varios vacunados
en Italia (Carman y col., 1990, Lancet, ii,
325-329) y Singapur (Harrison y col., 1991, J.
Hepatol. 13 (supl. 4), S105-107). Otra supuesta
mutación de escape vacunal de Lys a Glu en la posición 141 ha sido
sólo descrita de África Occidental (Allison y col., 1993, Abstr.
Ixth Int. Congr. of Virology, Glasgow, pp. 1-118;
Howard y col., 1993, Abstr. Int. Symp. on Viral Hepatitis and Liver
Disease, Tokyo, pp. 1-75). Es interesante el hecho
de que este mutante sólo ha sido encontrado hasta la fecha en
asociación con el subtipo ayw4. Más recientemente, varios nuevos
mutantes fueron, entre otros, descritos en la literatura por Brind y
col., 1997, J. of Hepatology, 26: 228-235; Kohno y
col., 1996, J. of Gen. Virol. 77: 1825-1831; Ni y
col., 1995, Res. Virol. 146: 397-407.
Está claro por lo anterior que se ha de detectar
todo tipo de mutaciones en las proteínas de HBsAg para rastrear la
sangre de donantes y otras fuentes.
Por ejemplo, Okomoto y col. (1992) ya mostraron
que la afinidad entre mutantes de HBsAg y anticuerpos monoclonales
anti-HBs con especificidadepitópica conocida se
alteraba por substitución en el aminoácido 145 ó 126 en la región S
(Okamoto y col., 1992, Pediatric Research 32:
264-268). La substitución con arginina de la
glicina en el aminoácido 145 en la vacuna de levaduras también da
lugar a una unión marcadamente reducida por anticuerpos monoclonales
(Waters y col., 1992, J. of Clin. Invest., 90:
2543-2547). También se ha descrito que la
antigenicidad de HBsAg se debilita por substitución del aminoácido
141 (Karthigesu y col., 1994, J. Gen. Virol., 75:
443-448).
Se han descrito ya varios casos de positividad a
HBsAg que han desestimado por el fallo de los ensayos serológicos
actuales para detectar algunas formas variantes del antígeno
(Suzuki y col., 1995, Int. Hepatology Comm., 4:
121-125; Carman y col., 1995, The Lancet 345:
1406-1407; Jongerius y col., 1997, Ned Tijdschr
Geneesk 141 (22), 1128).
Afrontando los problemas anteriores, muchas
compañías de diagnóstico cambiaron sus ensayos usando anticuerpos
policlonales como anticuerpos de captura en lugar de usar
anticuerpos monoclonales altamente específicos.
Sin embargo, los inconvenientes de usar
anticuerpos policlonales se dirigen principalmente a la pobre
reproductibilidad y a la especificidad y sensibilidad desconocidas
de los anticuerpos individuales en el total de todos los
anticuerpos presentes en el suero policlonal.
Se desconocerá siempre, por lo tanto, si se
detectarán variantes recién documentadas antes del rastreo.
Otra aproximación es hallar nuevos anticuerpos
monoclonales para la región S de HBsAg que reconozcan una región
bien conservada.
La región S de HBsAg es de la mayor importancia
y, por lo tanto, es la primera región que se ha de investigar. La
región pre-S de HBsAg es también un posible
candidato.
Se ha descrito una serie de epitopos
inmunogénicos en la región pre-S de HBsAg. Por
ejemplo, Meisal y col., Intervirology, 37(6), 1994,
330-339, describen dos epitopos localizados entre
los aminoácidos 131-144, llamado grupo I, y entre
162-168, llamado grupo III.
Se usó una región casi similar, los aminoácidos
130-145, para caracterizar el anticuerpo monoclonal
H8, Lee y col., Biochemistry and Molecular Biology International,
40(6), 1996, 1077-1085; Lee y col.,
Biochemistry and Molecular Biology International, 34(1),
1994, 159-168; Park y col., Molecules and Cells,
4(4), 1994, 413-417, y EP
0.521.348.
0.521.348.
Tres grupos de dominios inmunogénicos fueron
identificados por Nimms y col., Virology, 176, 1990,
604-619, y en EP 0.456.215. El primer grupo se
extendía desde el aminoácido 130 hasta el aminoácido 132 de HBsAg.
El segundo grupo requería un glicano rico en manosa en la
asparraguina 123 y el tercer grupo estaba formado por la región
carboxi-terminal de HBsAg, específicamente por los
residuos de aminoácidos 150-174.
Neurath y col., Molecular Immunology, 24, 1987,
975-980, describen una posible influencia del
aminoácido 132 de HBsAg sobre la unión del F376 monoclonal. Se
sugería que posiblemente también los aminoácidos
128-131 podrían estar implicados.
Dash y col., Hepatology, 13(1), 1991,
124-142, usaron un péptido sintético correspondiente
a la región de aminoácidos 120-145 de HBsAg para
producir anticuerpos policlonales.
Habría que hacer notar que hay variantes de HBsAg
conocidas que no tienen una proteína codificada
pre-S en su material vírico (Santantonio y col.,
1992, Virology, 188, 948-952).
En la misma referencia, se describe la
heterogeneidad de las secuencias pre-S del VHB
codificantes de las proteínas de la envuelta por amplificación de
ADN y secuenciación directa de los genomas víricos. En algunos
pacientes, se vieron deleciones en la región pre-S,
principalmente agrupadas en el extremo
amino-terminal de la región pre-S2.
Los datos indicaban una alta prevalencia de genomas de VHB que sólo
pueden expresar mutantes de deleción de las proteínas
pre-S2 y la mayor parte de ellos no pueden expresar
una proteína pre-S2 en absoluto. Según los
resultados, la mayoría de las deleciones no deben prevenir la
síntesis de HBs.
La heterogeneidad descrita de los mutantes
pre-S predice que se pueden obtener resultados
falso-negativos cuando se usan enzimoinmunoensayos
con anticuerpos monoclonales para proteínas pre-S
únicamente para su detección en suero de portadores crónicos.
Es hacia el problema anterior hacia donde la
invención se dirige.
Se describe una molécula que es capaz de unirse
específicamente a un determinante antigénico de la hepatitis B y que
es, o presenta competición cruzada con, un anticuerpo monoclonal
dirigido contra al menos parte de la secuencia de aminoácidos
RDSHPQAMQWNSTTFHQA-LLDPRVRGLYFPAGGSSSGT. También se
describen fragmentos que contienen al menos parte de la secuencia de
aminoácidos RDSHPQAMQWNSTTFHQAL o SHPQAMQWNSTTFHQ
ALLDPR o ALLDPRVRGL-YFPAGGSSSGT y fragmentos MQWN, STTFHQA o VRGLYFPA.
ALLDPR o ALLDPRVRGL-YFPAGGSSSGT y fragmentos MQWN, STTFHQA o VRGLYFPA.
Una molécula preferida capaz de unirse
específicamente a un determinante antigénico de la hepatitis B y
que es, o presenta competición cruzada con, un anticuerpo monoclonal
segregado por la línea celular HB.OT104A, HB.OT107C o HB.OT230B.
Estas líneas celulares han sido depositadas en la European
Collection of Animal Cell Cultures
(ECACC), Centre for Applied Microbiology and Research, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, Reino Unido, bajo los números de acceso ECACC-97062610, ECACC-(97062609 y 98042805) o ECACC-97062608, respectivamente.
(ECACC), Centre for Applied Microbiology and Research, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, Reino Unido, bajo los números de acceso ECACC-97062610, ECACC-(97062609 y 98042805) o ECACC-97062608, respectivamente.
Dicho determinante antigénico de la hepatitis B
se localiza en la región pre-S del VHB.
Una molécula de unión específica, tal como un
anticuerpo, presenta competición cruzada con otra si se une
precisamente a la misma localización, o a una conformacionalmente
ligada, que el otro. Las localizaciones conformacionalmente ligadas
pueden ser localizaciones adyacentes sobre la cadena polipeptídica
del antígeno, o pueden estar ligadas en virtud de la estructura
secundaria de la cadena polipeptídica, que puede provocar el
plegamiento adyacente de regiones por lo demás no adyacentes. Los
experimentos de competición cruzada son relativamente fáciles de
llevar a cabo (Waters y col., 1991) y, por lo tanto, es sencillo
determinar si un anticuerpo dado u otra molécula de unión específica
compite cruzadamente con el anticuerpo monoclonal al que se ha
hecho específicamente referencia anteriormente.
Las moléculas de unión específica que presentan
competición cruzada al menos parcial con los anticuerpos
monoclonales especificados (es decir, cuya competición cruzada es
significativamente mayor que %) son útiles en la invención. Se
prefieren las moléculas de unión específica que presentan
competición cruzada total (es decir, cuya competición cruzada no es
significativamente menor del 100%), al menos en algunas
circunstancias.
Las moléculas de unión específica útiles en la
invención serán con frecuencia ellas mismas anticuerpos. Aunque no
se excluyen los anticuerpos policlonales, se preferirán, en general,
los anticuerpos monoclonales, debido a su especificidad mucho más
precisa. La tecnología de los anticuerpos monoclonales se ha
establecido bien desde el trabajo original de Köhler y Milstein
(1975, Nature, 256, 495) y existen hoy en día muchos protocolos
disponibles para la generación rutinaria de anticuerpos
monoclonales. Son técnicas adecuadas, por ejemplo, las de Gefter y
col. (1977, Somatic Cell Genetics, 3, 231), Köhler y col. (1976,
Euro. J. Immuvirol., 292-295) y Goding
("Monoclonal antibodies: Principle and Practice" (2ª Edición,
1986), Academic Press, New York).
Típicamente, el protocolo usado es el
siguiente:
- -
- un animal experimental (tal como un ratón) es inmunológicamente inoculado con el antígeno contra el cual se van a producir anticuerpos;
- -
- se fusionan entonces las células esplénicas del animal con células de una línea celular de mieloma y se plaquean las células de fusión del hibridoma resultante en medio selectivo;
- -
- se realiza el rastreo de anticuerpos específicos por cualquier técnica, por ejemplo, usando anticuerpos anti-inmunoglobulinas de otras especies.
Aunque el uso de anticuerpos monoclonales humanos
puede ser, en principio, preferido para determinadas aplicaciones,
en particular para la terapia humana y el diagnóstico in
vivo, las dificultades técnicas hacen que la tecnología de
hibridomas convencional sea inapropiada para la generación de muchos
anticuerpos monoclonales humanos. Por lo tanto, se usan con
frecuencia en la práctica anticuerpos monoclonales no humanos,
tales como de origen murino.
También se incluyen en el alcance de la invención
anticuerpos quiméricos, particularmente anticuerpos monoclonales
quiméricos. Dichos anticuerpos quiméricos incluyen suficientes
secuencias de aminoácidos de HB.OT104A, HB.OT107C y HB.OT230B como
para tener su especificidad característica. Como mínimo, las
regiones determinantes de complementariedad del anticuerpo
especificado estarán presentes en un grado suficiente para mantener
la especificidad. Puede ser que estén presentes todos los dominios
V_{H} y V_{L}, o incluso todos los fragmentos de unión a
anticuerpo, tales como los fragmentos Fab o F(ab')_{2}
enzimáticamente derivados.
Existen varias tecnologías diferentes para
preparar anticuerpos quiméricos. Por ejemplo, se han descrito
anticuerpos quiméricos consistentes en una región C humana
fusionada a una región V de roedor (Morrison y col., 1984, PNAS,
81, 6851-6855; Boulianne y col., 1984, Nature, 312,
643-646; Neuberger y col., 1985, Nature, 314,
268-270).
También se han descrito anticuerpos totalmente
humanizados, particularmente anticuerpos monoclonales. Existen
actualmente tres métodos independientes para humanizar anticuerpos
no humanos (particularmente murinos). Reichmann y col. (1988,
Nature, 332, 323-327) usaron mutagénesis dirigida a
sitio sobre ADN de una sola hebra. En otra aproximación, tanto Jones
y col. (1986, Nature, 321, 522-525) como Queen y
col. (1989, PNAS, 86, 10029-10033) construyeron toda
la región V usando oligonucleótidos solapantes que incorporaban
regiones determinantes de complementariedad de roedores
("CDR") en un marco humano. Más recientemente, Lewis y Crowe
(1991, Gene, 101, 297-302) han adaptado la
metodología de la reacción en cadena de polimerasa ("PCR") a
la injertación de CDR de roedores en marcos de inmunoglobulinas
humanas.
Se pueden determinar las secuencias de
aminoácidos de los dominios variables de las cadenas pesadas y
ligeras de los anticuerpos monoclonales a partir de ADN
complementario clonado y de las regiones hipervariables (o regiones
determinantes de complementariedad, CDR) identificadas según Kabal y
col. (en "Sequences of Proteins of Immunological Interest", US
Department of Health and Human Services, US Government Printing
Office, 1987). Usando cualquiera de los métodos anteriores, se
pueden injertar estas CDR en un marco humano.
Los anticuerpos de un solo dominio ("dAbs")
de Ward y col. (1989, Nature, 341, 544-546)
representan otra clase de moléculas de unión específica (tanto si
son o no apropiados para ser considerados como "anticuerpos"),
que pueden ser usadas dentro del alcance de la presente invención.
En esta aproximación, se usa PCR u otra tecnología apropiada para
clonar un gen V_{H} o V_{L} y expresarlo en un hospedador
heterólogo, tal como E. coli.
Los dominios variables de cadenas pesadas y
ligeras pueden ser amplificados a partir del hibridoma usando la
reacción en cadena de polimerasa (PCR) y clonados en vectores de
expresión. Los dominios variables aislados pueden ser rastreados
para la unión a antígeno y se puede determinar su afinidad. Se
pueden obtener otros anticuerpos de un solo dominio directamente
amplificando por los genes de dominio variable reorganizados a
partir de ADN esplénico de un ratón inmunizado. Se puede clonar el
ADN amplificado en un vector y rastrearlo luego en cuanto a
actividad de unión a antígeno. Un refinamiento usando bacteriófago
como vector de expresión permite al fago que lleva los genes
variables ser seleccionado directamente con antígeno, ya que se
expresan sobre la superficie celular (McCafferty y col., 1990,
Nature, 348, 552-554).
La tecnología de dAbs indica cómo la metodología
del ADN recombinante está cambiando por completo la generación de
moléculas que tienen capacidades de unión específica. Por esta
razón, si no por otra, la invención no ha de ser considerada como
restringida a anticuerpos, tal como se entienden el sentido clásico
(ya sean policlonales o monoclonales).
También se describe una línea celular o cultivo
celular capaz de expresar, y preferiblemente segregar, moléculas de
unión específica según se ha descrito anteriormente.
En este aspecto de la invención, se encuentran
líneas celulares de hibridomas a las que se ha hecho referencia
específicamente antes. Estas líneas celulares han sido depositadas
en la European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), Centre
for Applied Microbiology and Research, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG,
Reino Unido, bajo los números de acceso y fechas mostrados en la
siguiente tabla:
| Línea celular | Fecha de depósito | Nº de acceso |
| HB.OT104A | 26-06-1997 | 97062610 |
| HB.OT107C | 26-06-1997 | 97062609 |
| 28-04-1998 | 98042805 | |
| HB.OT230B | 26-06-1997 | 97062608 |
Estos depósitos han sido hechos bajo los términos
del Tratado de Budapest.
Se ha descrito anteriormente un método
generalizado para producir otros anticuerpos monoclonales. Para
asegurarse de que puedan ser utilizados en la invención, se puede
hacer reaccionar un experimento de competición cruzada simple con
anticuerpos segregados por la línea celular depositada.
Se pueden usar los anticuerpos antes definidos y
otras moléculas de unión en aplicaciones diagnósticas en combinación
con anticuerpos específicamente dirigidos a otras regiones del VHB,
como la región S.
Si se usa en combinación, sólo es necesaria una
prueba. En este caso, los anticuerpos dirigidos contra la región S
sí reconocen también las variantes de VHB que carecen de la región
pre-S.
Los anticuerpos y otras moléculas de unión,
cuando se usan según la presente invención, superan la omisión de
individuos infectados por VHB en el diagnóstico de la infección por
VHB. Con estos anticuerpos, el concepto de prueba de HBsAg basado
en la región S del VHB podría mejorar. Se confirma la detección de
mutantes de
HBsAg.
HBsAg.
Los anticuerpos y otras moléculas de unión que se
usan en la presente invención son herramientas útiles para la
detección de la expresión de VHB en células y extractos celulares
tanto in vivo como in vitro con fines de purificación
y para una variedad de técnicas de análisis bioquímicos e
inmunológicos para estudiar la función de estas proteí-
nas.
nas.
También se describe un péptido consistente en al
menos una parte de la secuencia de aminoácidos
RDSHPQ-AMQWNSTTFHQALLDPRVRGLYFPAGGSSSGT.
En una realización específica, el péptido tiene
al menos parte de la secuencia de aminoácidos RDSHPQAMQWNS
TTFHQAL. Un fragmento específico preferido es MQWN.
TTFHQAL. Un fragmento específico preferido es MQWN.
En otra realización específica, el fragmento es
un péptido que tiene al menos parte de la secuencia de aminoácidos
SHPQAMQWNSTTFHQALLDPR. Un fragmento específico preferido es
STTFHQA.
Otro fragmento es un péptido que tiene al menos
parte de la secuencia de aminoácidos ALLDPRVRGLYF
PAGGSSSGT. Un fragmento específico preferido es VRGLYFPA.
PAGGSSSGT. Un fragmento específico preferido es VRGLYFPA.
La definición de péptidos óptimos (sintéticos o
recombinantes) que representan dominios inmunodominantes de HBsAg,
capaces de substituir a los péptidos o proteínas existentes en
pruebas diagnósticas es de crucial importancia para detectar todas
las posibles muestras positivas a HBsAg.
Estos péptidos pueden ser sintetizados con una
elevada reproductibilidad y son fácilmente purificados y, por lo
tanto, bien adecuados para mejorar aún más y estandarizar la
serología del VHB.
Los péptidos sintéticos tienen la ventaja de
estar químicamente bien definidos, permitiendo así la producción
fácil y reproducible con altos rendimientos, bien adecuada para
aplicación en ensayos diagnósticos, que pueden ser fabricados y
usados con mayor reproductibilidad.
Contrariamente a las proteínas HBsAg naturales,
los péptidos usados en la presente invención tienen la gran ventaja
de ser de un origen no infeccioso seguro.
El término "péptido", tal como se usa aquí,
se refiere a una cadena molecular de aminoácidos con actividad
biológica y no se refiere a una longitud específica del producto.
Por lo tanto, entre otros, se incluyen proteínas, proteínas o
péptidos de fusión, oligopéptidos y polipéptidos.
Si es necesario, los péptidos para uso en la
invención pueden ser modificados in vivo o in vitro,
por ejemplo, por glicosilación, amidación, carboxilación o
fosforilación. Son variantes funcionales, por ejemplo, las sales de
adición de ácido, las amidas, los ésteres, y específicamente los
ésteres C-terminales, y los derivados
N-acilo de los péptidos.
El término "al menos una parte", tal como se
usa aquí, significa una subsecuencia de la secuencia identificada de
aminoácidos. Dicha parte o fragmento es una región que tiene uno o
más determinantes antigénicos de las proteínas HBsAg. Se pueden
producir fragmentos, entre otros, por escisión enzimática de
moléculas precursoras, usando endonucleasas de restricción para el
ADN y proteasas para los (poli)péptidos. Otros métodos
incluyen la síntesis química de los fragmentos o la expresión de
fragmentos peptídicos por fragmentos de ADN.
La preparación de los péptidos o fragmentos de
los mismos para uso en la invención es efectuada por medio de uno o
más métodos conocidos de química orgánica para la síntesis de
péptidos o con ayuda de técnicas de ADN recombinante, que también
son conocidas en este campo. Los péptidos pueden también combinarse
en una sola molécula.
Como ya se ha indicado anteriormente, los
péptidos usados en la invención pueden igualmente ser preparados con
ayuda de técnicas de ADN recombinante. Esta posibilidad tiene
importancia particularmente cuando se incorpora el péptido en una
secuencia repetitiva ("en tándem") o cuando se puede preparar
el péptido como un constituyente de una proteína o polipéptido
(mucho mayor) o como una proteína de fusión con, por ejemplo, (parte
de) la \beta-galactosidasa. Este tipo de
péptidos, por lo tanto, pueden ser igualmente usados en la
invención.
Los péptidos o sus fragmentos preparados y
descritos anteriormente pueden ser también usados para producir
anticuerpos, tanto policlonales como monoclonales, y otras moléculas
de unión.
Según la presente invención, se facilita un
método para el diagnóstico de la hepatitis B, cuyo método consiste
en poner en contacto la muestra sospechosa de contener partículas o
antígenos de la hepatitis B con al menos una molécula de unión
específica dirigida a la región S del VHB y al menos una molécula de
unión específica según la presente invención, según se
reivindica.
Los métodos de diagnóstico según la presente
invención pueden ser llevados a cabo in vitro.
Un método particularmente adecuado para la
detección de HBsAg en una muestra se basa en una reacción de
competición entre un péptido según la invención provisto de una
substancia de marcaje y partículas o antígenos de la hepatitis B
(presentes en la muestra), mediante la cual el péptido y el antígeno
compiten con la molécula de unión específica según la presente
invención unida a un soporte sólido.
Otra realización preferida de la presente
invención se dirige a un método para la detección de anticuerpos
para la hepatitis B, cuyo método consiste en poner en contacto la
muestra sospechosa de contener anticuerpos para partículas o
antígenos de la hepatitis B con al menos un péptido como se ha
descrito anteriormente.
En los ensayos in vitro, se usa alguna
forma de soporte para inmovilizar las moléculas o péptidos de unión
según la presente invención. Los soportes que se pueden usar son,
por ejemplo, la pared interna de un pocillo de microensayo o una
cubeta, un tubo o capilar, una membrana, un filtro, una tira de
ensayo o la superficie de una partícula, como, por ejemplo, una
partícula de látex, una partícula de aldehído (tal como una
partícula magnetizable de cerámica con grupos superficiales
aldehído activos), un eritrocito, un sol colorante, un sol metálico
o un compuesto metálico como partícula de sol, o una proteína de
soporte tal como BSA o KLH.
También se usa alguna forma de marcaje para
detectar la interacción antígeno-anticuerpo. Las
substancias de marcaje pueden ser radiactivas o no radiactivas,
como un isótopo radiactivo, un compuesto fluorescente, un compuesto
quimioluminiscente, una enzima, un sol colorante o un sol metálico o
compuesto metálico como partícula de sol. Dependiendo del formato
del ensayo, se pueden marcar las moléculas de unión específica
dentro del alcance de la invención u otras moléculas de unión
específica que se unan a ellas. Se pueden usar inmunoensayos
(incluyendo radioinmunoensayos) y ensayos inmunométricos (incluyendo
radioensayos inmunométricos y ensayos inmunosorbentes ligados a
enzimas), al igual que técnicas de inmunotransferencia.
Los ensayos in vitro pueden adoptar muchos
formatos. Algunos dependen del uso de moléculas de unión específica
marcadas, tales como anticuerpos (cuyo uso se incluye en el alcance
de la invención), mientras que algunos detectan la interacción de
anticuerpo (u otra molécula de unión específica) y antígeno
observando la precipitación resultante. Éstos son bien conocidos en
la técnica.
Los ensayos in vitro serán con frecuencia
llevados a cabo usando kits. Según otro aspecto de la presente
invención, se facilita un kit de ensayo para la detección de
partículas o antígenos de la hepatitis B, consistiendo el kit en
una molécula de unión específica según se ha descrito antes y medios
para detectar si la molécula de unión específica se une a una
partícula o antígeno de la hepatitis B según se reivindica.
La metodología de ensayo puede ser, por ejemplo,
cualquiera de los ensayos a los que se ha hecho referencia
anteriormente. Se prefieren los kits de inmunoensayo competitivo y
especialmente en sandwich. La molécula de unión específica y los
medios de detección pueden ser presentados en compartimentos
separados del kit. La molécula de unión específica puede ser
presentada unida a un soporte sólido. Los medios de detección
pueden consistir en una segunda molécula de unión específica
marcada detectable (que puede ser a su vez un anticuerpo
monoclonal, pero preferiblemente policlonal) que se une a la
partícula o antígeno de la hepatitis B unidos.
Una realización preferida de la presente
invención es un kit de ensayo para la detección de una partícula o
antígeno de la hepatitis B, cuyo kit consiste en al menos una
molécula de unión dirigida a la región S del VHB y al menos una
molécula de unión específica según la presente invención y medios
para detectar si la molécula de unión específica se une a una
partícula o antígeno de la hepatitis B.
Otra realización preferida de la presente
invención es un kit de ensayo para la detección de anticuerpos para
la hepatitis B, cuyo kit consiste en al menos un péptido según la
presente invención y medios para detectar si el péptido se une a
anticuerpos para la hepatitis B.
Al llevarse a cabo una reacción en sandwich para
la detección de anticuerpos para la hepatitis B, el kit de ensayo
puede consistir, por ejemplo, en un péptido según la invención
depositado en un soporte sólido, por ejemplo, la pared interna de
un pocillo de microensayo, y o bien un péptido marcado, o bien un
anti-anticuerpo marcado.
Para llevar a cabo una reacción de competición,
el kit de ensayo puede incluir un péptido depositado en un soporte
sólido y una molécula de unión específica marcada.
También se describe el uso de una molécula de
unión específica para el diagnóstico in vitro de la hepatitis
B. Los anticuerpos y otras moléculas de unión pueden ser útiles en
el desarrollo y el control de calidad de ensayos serológicos y para
la detección directa del VHB.
También se describe el uso de las moléculas de
unión específica descritas en métodos inmunológicos y bioquímicos
destinados a detectar la proteína de longitud completa en una
muestra de fluido o tejido de ensayo.
La invención es además ejemplificada mediante los
siguientes ejemplos:
Se produjeron los anticuerpos murinos
anti-PreS HB.OT107C, HB.OT104A y HB.OT230B
inyectando ratones Balb/c con HBsAg nativo en adyuvante completo de
Freund. Se obtuvo el HBsAg de sueros de donantes infectados con VHB.
Después de dos meses, se reforzó a los ratones con el antígeno
mezclado en adyuvante incompleto de Freund, repitiéndolo después de
dos semanas. Tras días después, se extirpó el bazo y se fusionaron
los linfocitos esplénicos según el manual CRL G6-1
con células de mieloma de ratón P3x63Ag8653 (ATCC CRL 1580) usando
polietilenglicol 1000 según métodos estándar. Se rastrearon las
células de hibridoma en cuanto a la producción de anticuerpos
anti-PreS usando péptidos específicos y/o HBsAg
desnaturalizado. Se necesitaron varios ciclos de clonación por
dilución limitante para conseguir una línea celular estable con un
100% de clonalidad.
Se determinó el epitopo mínimo de HB.OT107C y
HB.OT104A usando el método pepscan estándar (Geysen y col., 1987, J.
Immunol. Meth. 102, 259-274). Se acortaron péptidos
basados en la secuencia "MQWNSTTFHQAL" en el extremo N o C y se
estudiaron con HB.OT104A y HB.OT107C. Se realizaron experimentos
similares con péptidos acortados basados en la secuencia
"LDPRVRGLYFPA" y mAb HB.OT230B. Para la determinación del
epitopo mínimo de HB.OT107C, se prolongó la serie con péptidos
basados en la secuencia "STTFHQAL" acortados en el extremo
C.
Los resultados mostrados en la Tabla 3 indican
que la primera metionina (M) en el extremo N de la secuencia
Pre-S2 es esencial para la reactividad del mAb
HB.OT104A. El epitopo mínimo probablemente incluye al menos los
aminoácidos "MQW". En el caso de HB.OT107C, la reactividad
disminuye si se elimina la serina (S) o la treonina (T) del extremo
C. El epitopo de HB.OT107C podría incluir los aminoácidos S (124) y
T (126).
Se investigó aún más el epitopo de HB.OT107C
usando péptidos basados en la secuencia "STTFHQAL". En la Tabla
4 se muestran los resultados. La secuencia reactiva mínima incluye
los aminoácidos "STTF". Esto concuerda con los resultados
mostrados en la Tabla 3. La reactividad de la secuencia
"STTFHQA" es comparable a la reactividad del péptido
12-mérico original, "MQWNSTTFHQAL", pero, si se
acorta la secuencia "STTFHQA" en el lado
C-terminal, la reactividad disminuye. Aún se obtiene
una reactividad muy baja, pero que se puede medir, con la secuencia
"STT".
| Mapa de epitopo mínimo del mAb HB.OT107C usando péptidos basados en la secuencia "124-STTFHQAL-131" | |
| Secuencia | Reactividad |
| HB.OT107C | |
| MQWNSTTFHQAL | 2061 |
| NSTTFHQAL | 2045 |
| STTFHQAL | 2102 |
| STTFHQA | 2174 |
| STTFHQ | 1777 |
| STTFH | 1757 |
| STTF | 1626 |
| STT | 327 |
| ST | 97 |
| S | 218 |
En el caso de HB.OT230B, se obtuvo la mayor
reactividad con el péptido 12-mérico completo, que
incluía la secuencia
"132-LDPRVRGLYFPA-143". La
eliminación de la alanina (A) del extremo C del péptido da lugar a
un fuerte descenso de la reactividad con el anticuerpo. Los
péptidos en los que se elimina la leucina (L) y/o el ácido
aspártico (D) del extremo N aún muestran una alta reactividad. La
eliminación de la primera prolina (P) del extremo N, sin embargo,
reduce fuertemente la reactividad del péptido, pero, si se eliminan
tanto P como la primera arginina (R), la reactividad aumenta de
nuevo. Según los resultados, el epitopo mínimo de HB.OT230 incluye
probablemente la secuencia "VRGLYFPA".
| Mapa de epitopo mínimo de HB.OT230B usando péptidos basados en la secuencia "DPRVRGLYFPA" | |||
| Secuencia | HB.OT230B | Secuencia | HB.OT230B |
| DPRVRGLYFPA | 1753 | LDPRVRGLYFP | 208 |
| PRVRGLYFPA | 1036 | LDPRVRGLYF | 103 |
| RVRGLYFPA | 650 | LDPRVRGLY | 102 |
| VRGLYFPA | 1467 | LDPRVRGL | 90 |
| RGLYFPA | 302 | LDPRVRG | 87 |
| GLYFPA | 282 | LDPRVR | 73 |
| LYFPA | 365 | LDPRV | 88 |
| YFPA | 96 | LDPR | 78 |
| FPA | 77 | LDP | 85 |
| PA | 80 | LD | 89 |
| A | 92 | L | 88 |
| LDPRVRGLYFPA | 2022 |
En péptidos 12-méricos reactivos
con los mAbs HB.OT104A y/o HB.OT107C ("MQWNSTTFHQAL" y
"STTFH QALLDPR") o HB.OT230B ("LDPRVR GLYFPA"), se
substituyó cada aminoácido por una alanina (A). Si la alanina (A)
aparecía de forma natural en la secuencia básica, se la substituyó
por serina (S). Se determinó la reactividad de cada péptido usando
la tecnología pepscan estándar.
En la Tabla 6, se muestran los resultados del
estudio Ala basado en el péptido "MQWNSTTFHQAL". Si se
substituía la metionina (M) o el triptófano (W) en el extremo N por
alanina (A), la reactividad del péptido con el mAb HB.OT104A
disminuía fuertemente. Este hallazgo concuerda con los resultados
del mapa de epitopos. El epitopo mínimo de HB.OT104A probablemente
incluye la secuencia "MQW", pero, aparentemente, los
aminoácidos M (120) y W (122) son los más esenciales para la
reactividad del anticuerpo.
La reactividad de HB.OT107C era más sensible a
las substituciones considerando la serina (S) o la fenilalanina (F)
localizadas en mitad del péptido. En todos los casos, sin embargo,
la reactividad nunca cayó drásticamente. Según el mapa de epitopos,
tanto S (124) como F (127) se localizan en un área reconocida por
HB.OT107C. Los resultados fueron confirmados en un estudio Ala
basado en el péptido
"124-STTFHQALLDPR-135" (en la
Tabla 7 se muestran los resultados), pero, en este caso, la
substitución de ambos aminoácidos tuvo un efecto más drástico sobre
la reactividad del péptido. Tanto la serina (S-124)
como la fenilalanina (F-127) parecen ser
importantes para la reactividad de HB.OT107C.
| Estudio Ala de HB.OT104A y HB.OT107C. Substitución de cada aminoácido subsiguiente en la secuencia | |||
| peptídica "120-MQWNSTTFHQAL-131". A-130 es substituido por serina (S) | |||
| Secuencia | HB.OT104B | HB.OT107C | Aminoácido |
| MQWNSTTFHQAL | 2198 | 2353 | - |
| AQWNSTTFHQAL | 460 | 2292 | M |
| MAWNSTTFHQAL | 1932 | 2281 | Q |
| MQANSTTFHQAL | 93 | 2224 | W |
| MQWASTTFHQAL | 2157 | 2501 | N |
| MQWNATTFHQAL | 1753 | 1679 | S |
| MQWNSATFHQAL | 2060 | 2319 | T |
| MQWNSTAFHQAL | 1853 | 1983 | T |
| MQWNSTTAHQAL | 2214 | 1601 | F |
| MQWNSTTFAQAL | 2025 | 2314 | H |
| MQWNSTTFHAAL | 2264 | 2097 | Q |
| MQWNSTTFHQSL | 2263 | 2086 | A |
| MQWNSTTFHQAA | 2138 | 1873 | L |
| Estudio Ala de HB.OT107C en base al péptido "124-STTFHQALLDPR-135" | ||
| Secuencia | HB.OT107C | Aminoácido |
| STTFHQALLDPR | 2426 | - |
| ATTFHQALLDPR | 427 | S |
| SATFHQALLDPR | 1285 | T |
| STAFHQALLDPR | 1425 | T |
| STTAHQALLDPR | 220 | F |
| STTFAQALLDPR | 2279 | H |
| STTFHAALLDPR | 2342 | Q |
| STTFHQSLLDPR | 1714 | A |
| STTFHQAALDPR | 2058 | L |
| STTFHQALADPR | 2206 | L |
| STTFHQALLAPR | 1728 | D |
| STTFHQALLDAR | 1961 | P |
| STTFHQALLDPA | 2506 | R |
| Estudio Ala de HB.OT230B. Cada aminoácido subsiguiente en la secuencia 132-LDPRVRGLYFPA-143 fue | ||
| substituido por alanina (A). Se substituyó A (143) por serina (S) | ||
| Secuencia | HB.OT230B | Aminoácido |
| LDPRVRGLYFPA | 2211 | - |
| ADPRVRGLYFPA | 1408 | L |
| LAPRVRGLYFPA | 960 | D |
| LDARVRGLYFPA | 1895 | P |
| LDPAVRGLYFPA | 1745 | R |
| LDPRARGLYFPA | 1553 | V |
| LDPRVAGLYFPA | 2060 | R |
| LDPRVRALYFPA | 946 | G |
| LDPRVRGAYFPA | 93 | L |
| LDPRVRGLAFPA | 157 | Y |
| LDPRVRGLYAPA | 1155 | F |
| LDPRVRGLYFAA | 1363 | P |
| LDPRVRGLYFPS | 1845 | A |
En la Tabla 8, se muestran los resultados del
estudio de substitución con Ala considerando la reactividad del mAb
HB.OT230B. Está claro que la substitución de la leucina
(L-139) o de la tirosina (Y-140)
tenía un efecto drástico sobre la reactividad del mAb HB.OT230B.
Probablemente, ambos aminoácidos son esenciales para la
reactividad. Según los resultados del mapa, el epitopo mínimo de
HB.OT230B incluye los aminoácidos "RGLYFPA" (véanse los
resultados del mapa de epitopos mínimos), pero claramente los
aminoácidos L (139) e Y (140) son muy cruciales para la
reactividad.
Se incluyeron diversas substituciones de
aminoácidos en péptidos basados en la secuencia "MQWNSTTFHQAL",
"STTFHQALLDPR" o "LDPGVRGLYFPA". Las mayoría de las
substituciones fueron previamente descritas por Norder y col. (1994)
y se basaban en variaciones naturales (subtipos) en la región
Pre-S2. Se estudiaron los péptidos con los mAbs
HB.OT104C y/o HB.OT107C y/o HB.OT230B. Se menciona cada substitución
en las Tablas 9, 10 ó 11. Se determinó la reactividad de cada
péptido usando la tecnología pepscan estándar como se ha descrito
previamente.
En base al péptido "MQWNSTTFHQAL", las
substituciones de aminoácidos naturales no tenían efectos
importantes sobre la reactividad del mAb HB.OT104A (véase la Tabla
9). En el caso de HB.OT107C, la reactividad resultó afectada si se
substituía la treonina (T-126) del extremo C del
péptido por histidina (H) (véase la Tabla 9). La substitución de la
leucina C-terminal (L-131) por
glutamina (Q) o la substitución de la arginina
(R-135) por glicina (G) dieron también como
resultado una marcada reducción de la reactividad del péptido.
| Reactividad del péptido "MQWNSTTFHQAL" con los mAbs HB.OT107C y HB.OT104A incluyendo | |||
| substituciones de aminoácidos naturales | |||
| Secuencia | HB.OT104A | HB.OT107C | Mutación |
| MQWNSTTFHQAL | 2198 | 2098 | |
| MQWTSTTFHQAL | 2173 | 2343 | N/T |
| MQWNSTAFHQAL | 1598 | 2241 | T/A |
| MQWNSTHFHQAL | 2098 | 192 | T/H |
| MQWNSTTLHQAL | 2456 | 2595 | F/L |
| MQWNSTTFQQAL | 2621 | 2591 | H/Q |
| MQWNSTTFHQVL | 1992 | 1926 | A/V |
| MQWNSTTFHQTL | 2282 | 2332 | A/T |
| MHWNSTTFHQAL | 1993 | 2071 | Q/H |
| Reactividad del péptido "STTFHQALLDPR" con el mAb HB.OT107C incluyendo substituciones de | ||
| aminoácidos naturales | ||
| Secuencia | HB.OT107C | Mutación |
| STTFHQALLDPR | 2426 | - |
| STTFHQALQDPR | 83 | L/Q |
| STTFHQALLDPG | 81 | R/G |
La reactividad de HB.OT230B resultó afectada por
la substitución de glicina (G-138) por valina (V) y
de fenilalanina (F-141) por leucina (L). Estos
resultados concuerdan con el estudio Ala que mostró que la
substitución de glicina (G-138) por alanina (A) y
de fenilalanina (F-141) por alanina (A) reducía la
reactividad del péptido.
| Reactividad del péptido "LDPRVRGLYFPA" con el mAb HB.OT230B incluyendo substituciones de | ||
| aminoácidos naturales | ||
| Secuencia | HB.OT230B | Mutación |
| LDPRVRGLYFPA | 2211 | - |
| QDPRVRGLYFPA | 1876 | L/Q |
| LDPGVRGLYFPA | 1388 | R/G |
| LDPRVRALYFPA | 1120 | G/A |
| LDPRVRVLYFPA | 280 | GN |
| LDPRVRGLYLPA | 400 | F/L |
| LDPRVRGLYFPP | 1591 | A/P |
Se usó un suero de pacientes mutante en HBsAg
para investigar la sensibilidad de inmunoensayos que incluían una
molécula de unión según la presente invención.
En un ensayo, llamado "ensayo básico", sólo
se usan anticuerpos monoclonales murinos dirigidos a la región S de
HBsAg. En otro ensayo (que es el ensayo según la presente
invención), llamado "ensayo mejorado", se añade un anticuerpo
monoclonal murino dirigido a la región pre-S de
HBsAg a los anticuerpos monoclonales ya presentes en el ensayo
básico.
Específicamente, se revistieron pocillos de
microelisa con dichos anticuerpos monoclonales. Cada pocillo de
microelisa contenía una esfera de conjugado
anti-HBs marcado con HRP que incluía anticuerpo para
HBsAg (anti-HBs) copulado a peroxidasa de rábano
picante ("HRP"), que sirve como conjugado con
tetrametilbenzidina (TMB) y peróxido como substrato.
Se incubaron la muestra de ensayo o controles
apropiados en los pocillos de microelisa.
La esfera de conjugado se disuelve en la muestra
y se forma un complejo de anticuerpo/HBsAg/anticuerpo marcado
enzimáticamente de fase sólida. Después de un lavado y de incubación
con substrato TMB, se produce color, que se vuelve amarillo cuando
se detiene la reacción con ácido sulfúrico. Si hay presencia de
HBsAg en la muestra, se desarrolla un color. Sin embargo, cuando la
muestra está libre de HBsAg, no se forma, o se forma poco, color
con la adición de substrato. Dentro de unos límites, la cantidad de
HBsAg en la muestra es proporcional al desarrollo de color.
Se estudia la muestra sin diluir.
Ambos ensayos (ensayo básico y mejorado) fueron
llevados a cabo según el mismo procedimiento.
El suero de paciente mutante en HBsAg es:
- -
- Suero de paciente 1: Mutante 129R/133T.
Esta muestra fue una amable donación del Dr. T.
Cuijpers (descrito en Jongerius y col., 1997, Ned Tijdschr Geneesk
141 (22), 1128).
En cada pocillo de ambas placas, se pipetearon
100 \mul de sobrenadante de cultivo o control. Se cubrió la placa,
se agitó durante 15 segundos y se incubó a 37 \pm 2ºC durante 1
hora \pm 5 minutos en una incubadora OT500. Después de la
incubación, se lavaron las placas cuatro veces con tampón fosfato
usando un lavador OT400. En cada pocillo, se pipetearon 100 \mul
de substrato TMB y se incubó a 18-25ºC durante 30
\pm 2 minutos. Se detuvo entonces la reacción añadiendo 100 \mul
de ácido sulfúrico 1M. Después de hacer el blanco en el lector
OT510 al aire, se leyó la absorbancia de la solución en cada pocillo
a 450 \pm 5 nm.
En la Tabla 12 se muestran los resultados de
ambos ensayos.
Para la muestra 129R/133T, el valor de corte para
el ensayo básico era 132 y el valor de corte para el ensayo mejorado
era 110.
Esta muestra dio un resultado negativo en el
ensayo básico, pero dio un resultado positivo en el ensayo
mejorado.
Está claro que el ensayo mejorado resultó más
reactivo en comparación con el ensayo básico.
| Absorbancia medida a 450 nm del suero de paciente mutante en HBsAg 129R/133T y control negativo | ||||
| estudiados en el ensayo básico y el ensayo mejorado | ||||
| Suero mutante de paciente | Ensayo básico | Pos/neg | Ensayo mejorado | Pos/neg |
| 129R/133T | 94 | neg | 113 | pos |
| Blanco | 82 | neg | 60 | neg |
| neg = resultado negativo | ||||
| pos = resultado positivo | ||||
| Blanco = media de 3 pocillos individuales |
Debido a la falta de sueros de pacientes mutantes
en HBsAg bien documentados y disponibles (a excepción de la muestra
descrita en el ejemplo 5), se preparó un panel mutante HBsAg
recombinante.
Se preparó el panel mutante HBsAg como sigue: Se
cultivaron tanto células Cos I como células HepG2 como monocapa en
frascos de Roux de 75 cm^{2} en 10 ml de medio MEM de Dulbecco
que contenía un 10% de suero de ternera fetal ("FCS") en una
incubadora a 37ºC. Cuatro horas antes de la electroporación, se
reemplazó el
medio.
medio.
Tras la tripsinización, se diluyeron las células
en 5 ml de medio y se centrifugaron durante 10 minutos a 233 g en
una centrífuga Beckmann GP. Para las líneas de células Cos I, se
diluyeron 1,5 x 10^{6} células en 200 \mul de solución salina
tamponada con fosfatos ("PBS") y, para las líneas de células
HepG2, se diluyeron 5 x 10^{6} células en 500 \mul de medio. Se
añadieron entonces 20 \mul de solución de ADN estéril de cada
construcción recombinante de HBsAg a la suspensión celular. Se
incubaron las mezclas sobre hielo durante 5 minutos y se pipetearon
en una cubeta de 4 mm. Se electroporaron nueve combinaciones de
células Cos I más ADN por 300 V y 125 \muF y se electroporaron
cuatro combinaciones de células HepG2 más ADN por 235 V y 960 \muF
con el Pulsador Génico Biorad. De nuevo, se incubaron las mezclas
sobre hielo durante 5 minutos. Se diluyeron las células
electroporadas en 5 ml de medio y se cultivaron en placas de 9 cm
en una incubadora a 37ºC. Después de aproximadamente una semana de
cultivo, se recogió el sobrenadante y se guardó a -20 \pm
2ºC.
Se estudiaron los sobrenadantes derivados de las
9 líneas de células Cos I y de las 4 líneas de células HepG2 en un
ensayo inmunosorbente ligado a enzimas ("ELISA") basado en un
principio de sandwich de una etapa. De nuevo, se comparó el ensayo
básico con el ensayo mejorado según la presente invención.
Todas las muestras fueron estudiadas sin
diluir.
Ambos ensayos (ensayo básico y mejorado) fueron
llevados a cabo según el mismo procedimiento.
Se pipetearon 100 \mul de sobrenadante de
cultivo o de control en cada pocillo de ambas placas. Se cubrió la
placa, se agitó durante 15 segundos y se incubó a 37 \pm 2ºC
durante 1 hora \pm 5 minutos en una incubadora OT500. Tras la
incubación, se lavaron las placas cuatro veces con tampón fosfato
usando un lavador OT400. En cada pocillo, se pipetearon 100 \mul
de substrato TMB y se incubó a 18-25ºC durante 30
\pm 2 minutos. Se detuvo entonces la reacción añadiendo 100 \mul
de ácido sulfúrico 1 M. Después de hacer el blanco en el lector
OT510 al aire, se leyó la absorbancia de la solución en cada
pocillo a 450 \pm 5 nm.
En la Tabla 13 se muestran los resultados de
ambos ensayos.
Las construcciones, es decir, las líneas de
células Cos I y las líneas de células HepG2, fueron estudiadas por
separado en dos operaciones de ensayo. Operación 1: para todas las
líneas de células Cos I, el valor de corte para el ensayo básico
era 126, y el valor de corte para el ensayo mejorado era 133.
Operación 2: para las líneas de células HepG2 (tipo salvaje y
129/133), el valor de corte para el ensayo básico era 103 y el
valor de corte para el ensayo mejorado era 96.
Tres muestras que dieron negativo en el ensayo
básico dieron positivo en el ensayo mejorado, es decir, que la
mutación Cos I 129/145R, Cos I 145R y HepG2 129/133 dieron negativo
en el ensayo básico y positivo en el ensayo mejorado.
En todos los casos, el ensayo mejorado resultó
más reactivo (sensible) en comparación con el ensayo básico.
| Absorbancia medida a 450 nm de 9 líneas de células Cos I, 4 líneas de células HepG2 y dichos controles | ||||
| negativos estudiados en el ensayo básico y el ensayo mejorado | ||||
| Línea celular/mutación S | Ensayo básico | Pos/neg | Ensayo mejorado | Pos/neg |
| Cos I 129 | 1288 | pos | 2377 | pos |
| Cos I 129/133 | > 3000 | pos | > 3000 | pos |
| Cos I 129/145R | 115 | neg | 1451 | pos |
| Cos I 145A | 1638 | pos | > 3000 | pos |
| Cos I 145R | 125 | neg | > 3000 | pos |
| Cos I WT | > 3000 | pos | > 3000 | pos |
| Cos I 129/145A | 1609 | pos | 2717 | pos |
| Cos I 133 | 587 | pos | 1456 | pos |
| Blanco 1 Cos | 94 | neg | 119 | neg |
| HepG2 129/133 | 97 | neg | 105 | pos |
| HepG2 WT | 238 | pos | 425 | pos |
| HepG2 133 | 110 | pos | 165 | pos |
| HepG2 145A | 231 | pos | 467 | pos |
| Blanco 2 HepG2 | 68 | neg | 51 | neg |
| neg = resultado negativo | ||||
| pos = resultado positivo | ||||
| WT = tipo salvaje |
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Akzo Nobel N.V.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Velperweg 76
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Amhem
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Países Bajos
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): 6824 BM
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Anticuerpos y otras moléculas de unión específicas para los antígenos víricos de la hepatitis B
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 7
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMA LEÍBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disco flotante
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- PROGRAMA: PatentIn Release #1.0, Versión #1.30 (EPO)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 38 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Virus de la hepatitis B
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Asp Ser His Pro Gln Ala Met Gln Trp Asn
Ser Thr Thr}
\sac{Phe His Gln Ala Leu Leu Asp Pro Arg Val Arg
Gly Leu Tyr}
\sac{Phe Pro Ala Gly Gly Ser Ser Ser Gly
Thr}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Virus de la hepatitis B
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Asp Ser His Pro Gln Ala Met Gln Trp Asn
Ser Thr Thr}
\sac{Phe His Gln Ala Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Virus de la hepatitis B
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser His Pro Gln Ala Met Gln Trp Asn Ser Thr
Thr Phe His}
\sac{Gln Ala Leu Leu Asp Pro Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Virus de la hepatitis B
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Leu Leu Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr
Phe Pro Ala}
\sac{Gly Gly Ser Ser Ser Gly Thr}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 4 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Virus de la hepatitis B
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met Gln Trp Asn}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 7 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Virus de la hepatitis B
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Thr Thr Phe His Gln Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 8 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Virus de la hepatitis B
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala}
Claims (8)
1. Método para el diagnóstico in vitro de
la hepatitis B, cuyo método consiste en hacer reaccionar una muestra
sospechosa de contener partículas o antígenos de la hepatitis B con
al menos una molécula de unión específica (I) inmovilizada sobre un
soporte que es, o presenta competición cruzada con, un anticuerpo
monoclonal, dirigida contra al menos parte de la secuencia de
aminoácidos mostrada en la SEC. ID Nº 1, y con al menos una molécula
de unión específica (II) inmovilizada sobre un soporte dirigida a la
región S del VHB, y en detectar la unión de las moléculas de unión
específicas a la partícula o el antígeno de la hepatitis B.
2. Métodos según la reivindicación 1, donde la
molécula de unión específica (I) se dirige contra al menos parte de
la secuencia de aminoácidos mostrada en las SEC. ID. Nº 2, 3 ó
4.
3. Método según la reivindicación 1 ó la
reivindicación 2, donde la molécula de unión específica (I) se
dirige contra al menos parte de la secuencia de aminoácidos
mostrada en la SEC. ID. Nº 5, 6 ó 7.
4. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1-3, donde la molécula de unión
específica (I) es segregada por la línea celular HB.OT104A,
depositada bajo el número ECACC 97062610, la línea celular
HB.OT107C, depositada bajo el número ECACC 98042805 ó la línea
celular HB.OT230B, depositada bajo el número ECACC 97062608.
5. Kit de ensayo para la detección de una
partícula o antígeno de la hepatitis B, cuyo kit consiste en al
menos una molécula de unión específica (I) que es, o presenta
competición cruzada con, un anticuerpo monoclonal, dirigida contra
al menos parte de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC. ID
Nº 1; al menos una molécula de unión específica (II) dirigida a la
región S del VHB, y medios para detectar si una molécula de unión
específica se une a la partícula o el antígeno de la hepatitis B,
que incluye al menos una molécula de unión dirigida contra el
antígeno superficial de la hepatitis B (HBsAg).
6. Kit de ensayo según la reivindicación 5, donde
la molécula de unión específica (I) se dirige contra al menos parte
de la secuencia de aminoácidos mostrada en las SEC. ID. Nº 2, 3 ó
4.
7. Kit de ensayo según la reivindicación 5 ó la
reivindicación 6, donde la molécula de unión específica (I) se
dirige contra al menos parte de la secuencia de aminoácidos mostrada
en la SEC. ID. Nº 5, 6 ó 7.
8. Kit de ensayo según cualquiera de las
reivindicaciones 5-7, donde la molécula de unión
específica (I) es segregada por la línea celular HB.OT104A,
depositada bajo el número ECACC 97062610, la línea celular
HB.OT107C, depositada bajo el número ECACC 98042805 ó la línea
celular HB.OT230B, depositada bajo el número ECACC 97062608.
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| EP97201968 | 1997-06-27 | ||
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