DE69830174T2

DE69830174T2 - Antikörper und sonstige bindungsmoleküle gegen hepatitis b virusantigene

Info

Publication number: DE69830174T2
Application number: DE69830174T
Authority: DE
Inventors: Petronella Wilhelmina PAULIJ; Jacqueline Marjolijn VAN KESSEL-KOENS
Original assignee: Biomerieux BV
Current assignee: Biomerieux BV
Priority date: 1997-06-27
Filing date: 1998-06-22
Publication date: 2006-01-26
Anticipated expiration: 2018-06-23
Also published as: US6541198B1; WO1999000424A3; EP0993470B1; WO1999000424A2; ATE295375T1; ES2243002T3; DE69830174D1; EP0993470A2; AU8630898A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren und ein Kit für die in vitro-Diagnose von Hepatitis B.
Das Virus, welches Hepatitis B oder Serum-Hepatitis verursacht, scheint nur Menschen und Schimpansen zu infizieren. Die Infektion mit Hepatitis B-Virus (HBV) von Menschen ist weit verbreitet.
Die Hepatitisinfektion wird durch drei allgemeine Mechanismen übertragen: (1) durch parenterale Inokulation von infiziertem Blut oder Körperflüssigkeiten, entweder in großen Mengen wie bei Bluttransfusionen oder in kleinsten Mengen wie durch zufällige Stiche in die Haut; (2) durch engen familiären oder sexuellen Kontakt; und (3) durch einige Mütter, die während der Schwangerschaft infiziert wurden, welche das Virus auf ihre neugeborenen Kinder übertragen. Unter natürlichen Bedingungen ist HBV nicht in hohem Maße ansteckend. Eine Übertragung durch Einatmen tritt selten, wenn überhaupt auf.
Der Übertragungsweg über kontaminiertes Blut oder Blutprodukte ist die Hauptbedrohung für die menschliche Gesundheit.
Eine Infektion mit HBV führt oft zu einer subklinischen oder akuten selbstbegrenzten Leberkrankheit oder kann zu einer chronischen Langzeitinfektion führen. Die chronische HBV-Infektion ruft ein Spektrum von Krankheiten hervor, das von der stärksten Form der chronischen aktiven Hepatitis (CAH) bis zu der weniger ernsten chronischen persistenten Hepatitis (CPH) bis zu einem asymptomatischen Zustand eines Trägers (ASC) reicht. Eine Gruppe diagnostischer Tests wurde vor kurzem entwickelt, um dem Kliniker bei der Unterscheidung von Hepatitis B-Virusinfektionen von anderen Formen viraler Hepatitis (d. h. HAV, HEV, HCV) zu helfen. Jedoch ist die Möglichkeit, zwischen einer akuten Hepatitis B (AH-B) Infektion und einer symptomatischen chronischen Hepatitis B (CH-B) Infektion zu unterscheiden, immer noch mit Problemen behaftet. Dieses trifft insbesondere deswegen zu, da CAH- und CPH-Patienten oft ein zyklisches Muster der Hepatitis zeigen, das durch akute Verschlimmerungen (A. E.) der Leberschädigung gekennzeichnet ist, die sich mit einer normalen Leberfunktion abwechseln.
Nach einer Infektion mit HBV liegen große Mengen des Virus und damit verbundener Partikel im Serum vor. Während symptomatischer Phasen der Infektion weisen sowohl akute als auch chronische HBV-Patienten erhöhte Leberenzymspiegel auf, besitzen in ihrem Serum das Hepatitis B-Oberflächenantigen (HBsAg) und erzeugen Antikörper gegen das Nukleokapsidantigen (HBcAg). Antikörper, die für das HBsAg oder das Hepatitis Be-Antigen (HBeAg) spezifisch sind, werden nicht nachgewiesen. Das Auftreten des Antikörpers gegen HBsAg wird gewöhnlich nicht vor ungefähr zwei Monaten nach dem Verschwinden von zirkulierendem HBsAg beobachtet. Von den Viruspartikeln, die im Serum vorliegen, ist bekannt, dass diese ihre Oberflächenhülle abstoßen, was das Nukleokapsid freilegt, welches als das Kernantigen (HBcAg) bekannt ist. Die Antikörperproduktion von HBcAg tritt früh im Verlauf der akuten Phase der HBV-Infektion auf und kann für viele Jahre fortbestehen, und chronisch infizierte Patienten können hohe Titer an anti-HBc-Antikörpern erzeugen.
Der HBsAg hat sich als der wichtigste Marker der akuten oder chronischen Hepatitis B-Infektion durchgesetzt, der im Serum von infizierten Individuen nachweisbar ist. Das Screenen auf HBsAg im Donorblut ist beispielsweise wesentlich, um eine Übertragung von Hepatitis B zu vermeiden. Es ist klar, dass die Empfindlichkeit in diagnostischen HBV-Tests von äußerster Wichtigkeit ist.
HBV-Oberflächenantigene (HBsAg):
Die HBV-Oberflächenantigene (HBsAg) sind die Translationsprodukte eines großen offenen Leserasters (ORF), das in drei Domänen unterteilt ist; jede dieser Domänen beginnt mit einem im Raster liegenden ATG-Codon, das in der Lage ist, als eine Translationsinitiationsstelle zu fungieren. Diese Domänen werden in ihrer entsprechenden 5' nach 3' Reihenfolge in dem Gen als Pre-S1, Pre-S2 und S bezeichnet. So definieren diese Domänen drei Polypeptide, welche als S oder HBsAg (226 Aminosäuren), Pre-S2 + S (281 Aminosäuren) und Pre-S1 + Pre-S2 + S (289-400 Aminosäuren) bezeichnet werden, welche ebenfalls als Hauptprotein (S-Protein), mittleres Protein (M-Protein) bzw. großes Protein (L-Protein) bezeichnet werden (Toillais et al., 1985, Nature, 317, 489-495).
Definition eines HBsAg-Untertyps:
Das HBsAg in dem Teil der Virushülle von HBV weist eine gut charakterisierte gruppenspezifische Determinante "a" und zwei Sätze von sich gegenseitig ausschließenden Untertyp-Determinanten d/y und w/r auf. So bezeichnen die vier Hauptuntertypen von HBsAg – adw, ayw, adr und ayr – die Phänotypen des Virions (Le Bouvier et al., 1975, Amer. J. Med. Sci. 270, 165). Mit der Unterteilung der "a"-Spezifität in a1, a2, a3 und andere intermediäre Spezifitäten, welche später bei einem internationalen Workshop in Paris in 1975 als Unterdeterminanten von w (w1-w4) umdefiniert wurden (Courouce et al., 1976, Bibl Hematol, Basel, Karger, Bd. 42), erlangte die Frage der HBsAg-Untertypen einen beträchtlichen Grad an Komplexität. Diese Untertypen waren ayw1, ayw2, ayw3, ayw4, ayr und adw2, adw4 und adr. Mit der Identifikation der q-Determinante (Magnius et al., 1975, Acta Pathol Micr Scand, 83B, 295-297) aufgrund der Unterteilung des adr-Untertyps in eine q-positive und eine q-negative Kategorie stieg die Anzahl der Untertypen von 8 auf 9 (Courouce-Pauty et al., 1978, Vox Sang, 35, 304-308). Das Sequenzieren der vollständigen Genome, welche die adw2- und ayw3-Untertypen kodierten, zeigte zahlreiche Substitutionen über das gesamte Genom hinweg (Valenzuela et al., 1980, ICN-UCLA, Symposia on Animal Virus Genetics, NY, Ac. Press, Seiten 57-70). Es wurde behauptet, dass eine Anzahl dieser Substitutionen in dem S-Gen mit der Expression der d- und y-Spezifität in Zusammenhang steht (Okamoto et al., 1986, J Gen Virol, 67, 2305-2314). Eine Analyse der Reaktivitätsmuster mit monoklonalen Antikörpern nach chemischer Modifikation von HBsAg zeigte die Bedeutung von Lys 122 für die Expression der d-Determinante (Peterson et al., 1984, J Immun, 132, 920-927). Spätere Untersuchungen an zwei Blutspendern, welche Oberflächenantigene von zusammengesetzten Untertypen adyr bzw. adwr trugen, zeigten, dass Aminosäuresubstitutionen an Position 122 und 160 allein die Expression der d/y- bzw. w/r-Spezifität erklärten (Okamoto et al., 1987, J Virol, 61, 3030-3034). Sowohl die Änderung von d nach y als auch von w nach r wurde durch eine Verschiebung von Lys nach Arg an den entsprechenden Positionen vermittelt. Daher liegen größere Variationen der Untertypen von HBsAg vor.
Definition eines HBsAg-Genotyps:
Das Sequenzieren von Virusgenomen und der Vergleich haben vier genomische Gruppen von HBV mit einer Divergenz von 8 % oder mehr des vollständigen Genoms definiert, und diese wurden mit A-D bezeichnet (Okamoto et al., 1988, J Gen Virol, 69, 2575-2583). Genome, welche den Untertyp adw kodierten, wurden in den genomischen Gruppen A-C gefunden, während die Genome, welche ayw kodierten, in Gruppe D und Gruppe B gefunden wurden (Sastrosoewignjo et al., 1991, J Gastroenterol Hepatol, 6, 491-498). Genome, welche sowohl den adr- als auch den ayr-Untertyp kodierten, traten in der genomischen Gruppe C zusammen mit adw auf.
Ebenso wurden zwei neu Genotypen von HBV, welche mit E und F bezeichnet wurden, vor kurzem identifiziert (Norder et al., 1994, Virology, 198, 489-503).
Immune Escape-Mutanten in Bezug auf die Genotypen:
Neben der genetischen Variabilität von HBV, auf der Basis der Divergenz der HBV-Stämme über lange Zeiträume hinweg, was zu geografischen Untertypen und Genotypen führte, wurde in letzter Zeit ein beträchtliches Interesse auf zwei Arten von Immune Escape-Mutanten gerichtet. Die erste von diesen, welche beschrieben werden soll, war eine Mutation von Trp 28 zu einem Stoppcodon in der Vorkernsequenz, die spezifisch die Expression von HBeAg verhinderte, während sie die von HBcAg unbeeinträchtigt ließ (Carman et al., 1989, Lancet, ii, 588-591; Brunetto et al., 1991, Proc NatI Acad Sci USA, 88, 4186-4190).
Vaccine Escape-Mutanten werden so beschrieben, dass diese die "a"-Determinante von HBsAg beinhalten, wobei ein wichtiger Teil von dieser durch eine Schleife gebildet wird, welche die Aminosäurereste 139-147 umfasst, die durch eine Disulfidbrücke zwischen zwei Cysteinresten an diesen Positionen stabilisiert wird (Waters et al., 1991, Virua Res, 22, 1-12; Stirk et al., 1992, Intervirology, 33, 148-158). Eine Mutation von Gly zu Arg im Rest 145 von HBsAg wurde bei mehreren Geimpften in Italien (Carman et al., 1990, Lancet, ii, 325-329) und Singapur (Harrison et al., 1991, J Hepatol 13 (SuppI 4), S105-107) gezeigt. Eine andere vermutete Vaccine Escape-Mutation von Lys zu Glu an Position 141 wurde nur aus Westafrika berichtet (Allison et al., 1993, Abstr. Ixth int Congr of Virology, Glasgow, Seiten 1-118; Howard et al., 1993, Abstr. Int Symp on Viral Hepatitis and Liver Disease, Tokyo, Seiten 1-75). Interessanterweise wurde diese Mutante bisher nur in Verbindung mit dem ayw4-Untertyp gefunden. In neuerer Zeit wurden verschiedene neue Mutanten neben anderen in der Literatur beschrieben von Brind et al., 1997, J. of Hepatology 26: 228-235; Kohno et al., 1996, J. of gen. virol. 77: 1825-1831; Ni et al., 1995, Res. Virol. 146: 397-407.
Aus dem oben Stehenden ist klar, dass alle Sorten von Mutationen in den HBsAg-Proteinen nachgewiesen werden müssen, um Blut von Spendern und aus anderen Quellen zu screenen.
Beispielsweise zeigten bereits Okomoto et al. (1992), dass die Affinität zwischen HBsAg-Mutanten und monoklonalen anti-HBs-Antikörpern mit bekannter Epitopspezifität durch Substitution an der Aminosäure 145 oder 126 in der S-Region verschlechtert wurde (Okamoto et al., 1992, Pediatric Research 32: 264-268). Die Substitution von Arginin für Glycin an der Aminosäure 145 in dem Hefe-Vakzin führt ebenfalls zu einer deutlich verringerten Bindung durch monoklonale Antikörper (Waters et al., 1992, J. of clin. invest. 90: 2543-2547). Es wird weiterhin beschrieben, dass die Antigenizität von HBsAg durch Substitution von Aminosäure 141 geschwächt wird (Karthigesu et al., 1994, J. Gen. Virol. 75: 443-448).
Es wurden bereits verschiedene HBsAg-positive Fälle beschrieben, die übersehen wurden, da die derzeitigen serologischen Tests dabei versagen, einige Formen von Varianten des Antigens nachzuweisen (Suzuki et al., 1995, Int. Hepatology Comm. 4: 121-125; Carman et al., 1995, The Lancet 345: 1406-1407; Jongerius et al., 1997, Ned Tijdschr Geneesk 141 (22) 1128).
Um den obigen Problemen zu begegnen, haben viele Diagnostikunternehmen ihre Tests verändert, indem sie polyklonale Antikörper als Einfang-Antikörper verwenden, statt dass sie hochspezifisch monoklonale Antikörper verwenden.
Die Nachteile der Verwendung von polyklonalen Antikörpern liegen jedoch hauptsächlich in der schlechten Reproduzierbarkeit und der unbekannten Spezifität und Empfindlichkeit der einzelnen Antikörper in der Gesamtmenge aller Antikörper, die in dem polyklonalen Serum vorliegen.
Es wir daher immer unbekannt bleiben, ob neu dokumentierte Varianten vor dem Screenen nachgewiesen werden.
Ein anderer Ansatz ist das Auffinden neuer monoklonaler Antikörper gegen die S-Region von HBsAg, welche eine gut konservierte Region erkennen.
Die S-Region von HBsAg ist von äußerster Wichtigkeit und daher die erste Region, die erforscht werden sollte. Die Pre-S-Region von HBsAg ist ebenfalls ein möglicher Kandidat.
Eine Anzahl immunogener Epitope in der Pre-S-Region von HBsAg wurde beschrieben. Beispielsweise beschreiben Meisal et al., Intervirology, 37(6), 1994, 330-339, zwei Epitope, die zwischen den Aminosäuren 131-144, bezeichnet als Gruppe I, und zwischen 162-168, bezeichnet als Gruppe III, angeordnet sind.
Ein fast gleicher Bereich, die Aminosäuren 130-145, wurde verwendet, um den monoklonalen Antikörper H8 zu charakterisieren, Lee et al., Biochemistry and Molecular Biology International, 40(6), 1996, 1077-1085; Lee et al., Biochemistry and Molecular Biology International, 34(1), 1994, 159-168; Park et al., Molecules and Cells, 4(4), 1994, 413-417; und EP 0 521 348 .
Drei Gruppen von immunogenen Domänen wurden identifiziert von Nimms et al., Virology, 176, 1990, 604-619, und in EP 0 456 215 . Die erste Gruppe erstreckte sich von Aminosäure 130 bis Aminosäure 132 von HBsAg. Die zweite Gruppe erforderte ein mannosereiches Glycan an Asparagin 123, und die dritte Gruppe wurde durch den Carboxyl-Endbereich von HBsAg, insbesondere die Aminosäurereste 150-174 gebildet.
Neurath et al., Molecular immunology, 24, 1987, 975-980, beschreiben einen möglichen Einfluss der Aminosäure 132 von HBsAg auf die Bindung von monoklonalem F376. Es wurde vorgeschlagen, dass möglicherweise ebenso die Aminosäuren 128-131 beteiligt sein könnten.
Dash et al., Hepatology, 13 (1), 1991, 124-142, verwendeten ein synthetisches Peptid, das dem Aminosäurebereich 120-145 von HBsAg entsprach, um polyklonale Antikörper zu erzeugen.
Man sollte bedenken, dass es Varianten von HBsAg gibt, von denen bekannt ist, dass sie kein von Pre-S kodiertes Protein in ihrem Virusmaterial aufweisen (Santantonio et al., 1992, Virology, 188, 948-952).
In derselben Referenz wird die Heterogenität von HBV-Pre-S-Sequenzen, welche für die Hüllproteine kodieren, durch DNA-Amplifikation und direkte Sequenzierung der Virusgenome beschrieben. Bei einigen Patienten wurden Deletionen in der Pre-S-Region gefunden, die sich hauptsächlich an dem aminoterminalen Ende der Pre-S-Region häuften. Die Daten zeigten ein hohes Vorherrschen von HBV-Genomen, die nur Deletionsmutanten von Pre-S-Proteinen exprimieren können, und die meisten von diesen können überhaupt kein Pre-S2-Protein exprimieren. Nach den Ergebnissen sollten die meisten Deletionen die HBs-Synthese nicht verhindern.
Die beschriebene Heterogenität von Pre-S-Mutanten lässt voraussagen, dass falsche negative Ergebnisse erhalten werden können, wenn Enzymimmuntests mit monoklonalen Antikörpern gegen Pre-S-Proteine allein für deren Nachweis in Seren chronischer Träger verwendet werden.
Es ist das oben beschriebene Problem, auf welches die vorliegende Erfindung gerichtet ist.
Offenbart wird ein Molekül, welches in der Lage ist, spezifisch an eine Hepatitis B-Antigendeterminante zu binden, und welches entweder ein monoklonaler Antikörper ist oder mit diesem kreuzweise in Konkurrenz tritt, der gegen wenigstens einen Teil der Aminosäuresequenz RDSHPQAMQWNSTTFHQALLDPRVRGLYFPAGGSSSGT gerichtet ist.
Ebenso offenbart werden Fragmente, die wenigstens einen Teil der Aminosäuresequenz RDSHPQAMQWNSTTFHQAL oder SHPQAMQWNSTTFHQALLDPR oder ALLDPRVRGLYFPAGGSSSGT und die Fragmente MQWN, STTFHQA oder VRGLYFPA umfassen.
Ein bevorzugtes Molekül, welches in der Lage ist, spezifisch an eine Hepatitis B-Antigendeterminante zu binden, und welches entweder ein monoklonaler Antikörper ist oder kreuzweise mit diesem in Konkurrenz tritt, wird von der Zelllinie HB.OT104A, HB.OT107C oder HB.OT230B sezerniert. Diese Zelllinien wurden bei der European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), Centre for Applied Microbiology and Research, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, Vereinigtes Königreich, unter den Zugangsnummern ECACC-97062610, ECACC-(97062609 und 98042805) bzw. ECACC-97062608 hinterlegt.
Diese Hepatitis B-Antigendeterminante ist in der Pre-S-Region von HBV lokalisiert.
Ein spezifisches Bindungsmolekül wie z. B. ein Antikörper tritt mit einem anderen kreuzweise in Konkurrenz, wenn dieser genau an denselben oder einen über die Konformation verknüpften Ort wie der andere bindet. Über die Konformation verknüpfte Orte können benachbarte Orte auf der Polypeptidkette oder dem Antigen sein, oder sie können mittels der Sekundärstruktur der Polypeptidkette verknüpft sein, was eine benachbarte Faltung von ansonsten nicht benachbarten Bereichen bewirken kann. Experimente zur Kreuzkonkurrenz sind relativ leicht durchzuführen (Waters et al., 1991), und so ist es eine einfache Sache, festzustellen, ob ein gegebener Antikörper oder ein anderes spezifisches Bindungsmolekül mit dem monoklonalen Antikörper, auf den oben speziell Bezug genommen wurde, kreuzweise in Konkurrenz tritt.
Spezifische Bindungsmoleküle, die wenigstens teilweise mit den spezifizierten monoklonalen Antikörpern kreuzweise in Konkurrenz treten (d. h. deren Kreuzkonkurrenz signifikant größer ist als %) sind in der Erfindung nützlich. Spezifische Bindungsmoleküle, welche vollständig kreuzkonkurrieren (d. h. deren Kreuzkonkurrenz nicht signifikant weniger als 100 % ist), sind wenigstens in manchen Fällen bevorzugt.
Spezifische Bindungsmoleküle, die in der Erfindung nützlich sind, sind oft selbst Antikörper. Während polyklonale Antikörper nicht ausgeschlossen sind, sind monoklonale Antikörper im Allgemeinen aufgrund ihrer sehr viel präziseren Spezifität bevorzugt. Die monoklonale Antikörpertechnik hat sich seit der ursprünglichen Arbeit von Köhler und Milstein (1975, Nature, 256, 495) gut etabliert, und es gibt heute viele verfügbare Vorschriften zur routinemäßigen Erzeu gung von monoklonalen Antikörpern. Geeignete Techniken sind beispielsweise jene von Gefter et al., (1977, Somatic Cell Genetics, 3, 231), Köhler et al., (1976, Euro. J. Immuvirol., 292-295) und Goding ("Monoclonal antibodies: Principle and Practice" (2. Ausgabe, 1986) Academic Press. New York).
Typischerweise ist die verwendete Vorschrift wie folgt:

– Ein Versuchstier (wie z. B. eine Maus) wird immunologisch mit dem Antigen, gegen welches Antikörper erzeugt werden sollen, herausgefordert;
– die Milzzellen des Tiers werden dann mit Zellen einer Myelomzelllinie verschmolzen, und die resultierenden Hybridomfusionszellen werden auf einem selektiven Medium plattiert;
– ein Screenen auf spezifische Antikörper wird durch irgendeine geeignete Technik, z. B. durch die Verwendung von anti-Immunglobulin-Antikörpern aus einer anderen Spezies, unternommen.

Während die Verwendung humaner monoklonaler Antikörper im Prinzip für gewisse Anwendungen, insbesondere die Therapie von Menschen und die in vivo-Diagnose, bevorzugt sein kann, machen technische Schwierigkeiten die herkömmliche Hybridomtechnik für die Erzeugung vieler humaner monoklonaler Antikörper ungeeignet. Daher werden in der Praxis oft nicht humane monoklonale Antikörper wie beispielsweise solche aus Mäusen verwendet.
Chimäre Antikörper, insbesondere chimäre monoklonale Antikörper, sind ebenfalls vom Umfang der Erfindung umfasst. Solche chimären Antikörper umfassen ausreichende Aminosäuresequenzen von HB.OT104A, HB.OT107C, HB.OT230B, damit sie deren charakteristische Spezifität aufweisen. Mindestens sind die Komplementarität-determinierenden Regionen des spezifischen Antikörpers in einem hinreichenden Ausmaß vorhanden, um die Spezifität beizubehalten. Es können vollständige V_H- und V_L-Domänen vorliegen oder sogar ganze antikörperbindende Fragmente wie z. B. die enzymatisch abgeleiteten Fab- oder F(ab')₂-Fragmente.
Verschiedene unterschiedliche Technologien existieren zum Herstellen von chimären Antikörpern. Beispielsweise wurden chimäre Antikörper, bestehend aus einem humanen C-Bereich, verschmolzen mit einem V-Bereich aus Nagetieren, beschrieben (Morrison et al., 1984, PNAS, 81, 6851-6855; Boulianne et al., 1984, Nature, 312, 643-646; Neuberger et al., 1985, Nature, 314, 268-270).
Vollständig humanisierte Antikörper, insbesondere monoklonale Antikörper, werden ebenfalls offenbart. Es gibt derzeit drei unterschiedliche Methoden zur Humanisierung nicht humaner Antikörper (insbesondere aus Mäusen). Reichmann et al. (1988, Nature, 332, 323-327) verwendeten eine gezielte Mutagenese von ssDNA. In einem anderen Ansatz konstruierten sowohl Jones et al. (1986, Nature, 321, 522-525) als auch Queen et al. (1989, PNAS, 86, 10029-10033) den vollständigen V-Bereich, indem überlappende Oligonukleotide, welche die Komplementarität-determinierenden Regionen (CDRs) von Nagetieren beinhalteten, in einem humanen Gerüst verwendet werden. Noch später haben Lewis und Crowe (1991, Gene, 101, 297-302) die Methodik der Polymerasekettenreaktion (PCR) angepasst, um Nager-CDRs auf humane Immunglobulingerüste zu pfropfen.
Die Aminosäuresequenzen der schweren und leichten Kette der variablen Domänen der monoklonalen Antikörper können aus klonierter komplementärer DNA bestimmt werden, und die hypervariablen Regionen (oder Komplementarität-determinierenden Regionen CDRs) können gemäß Kabat et al. (in "Sequences of Proteins of Immunological Interest", US Department of Health and Human Services, US Government Printing Office, 1987) identifiziert werden. Unter Verwendung irgendeiner der obigen Methoden können diese CDRs auf ein Humangerüst gepfropft werden.
Die Antikörper mit einer einzigen Domäne (dAbs) von Ward et al. (1989, Nature, 341, 544-546) stellen eine weitere Klasse von spezifischen Bindungsmolekülen dar (ob diese richtig als "Antikörper" zu betrachten sind oder nicht), welche im Umfang der vorliegenden Erfindung verwendet werden können. Bei diesem Ansatz wird die PCR oder eine andere geeignete Technologie verwendet, um ein V_H- oder V_L-Gen zu klonieren und in einem heterologen Wirt, wie z. B. E. coli, zu exprimieren.
Die variablen Domänen mit schwerer und leichter Kette können aus Hybridomen amplifiziert werden, indem die Polymerasekettenreaktion (PCR) verwendet wird, und in Expressionsvektoren kloniert werden. Die isolierten variablen Domänen können im Hinblick auf die Bindung an Antigen gescreent werden und deren Affinität bestimmt werden. Andere Antikörper aus einer einzigen Domäne könne direkt durch Amplifizieren der umgeordneten Gene der variablen Domäne aus der Milz-DNA einer immunisierten Maus erhalten werden. Die amplilfizierte DNA kann in einen Vektor kloniert werden und dann im Hinblick auf die Antigenbindungsaktivität gescreent werden. Eine Verfeinerung unter Verwendung des Bakteriophagen als einem Expressionsvektor ermöglicht, dass der Phage, welcher die variablen Gene trägt, direkt mit Antigen selektiert wird, da diese auf der Zelloberfläche exprimiert werden (McCafferty et al., 1990, Nature, 348, 552-554).
Die dAbs-Technologie zeigt, wie die rekombinante DNA-Methodik die Erzeugung von Molekülen mit spezifischen Bindungsfähigkeiten vollständig verändert. Auch aus diesem Grund sollte die Erfindung nicht als auf Antikörper beschränkt, wie sie im klassischen Sinne verstanden werden (ob polyklonal oder monoklonal), betrachtet werden.
Ebenfalls offenbart wird eine Zelllinie oder Zellkultur, die in der Lage ist, spezifische Bindungsmoleküle, wie sie oben beschrieben wurden, zu exprimieren und vorzugsweise zu sezernieren.
Unter diesen Aspekt der Erfindung fallen die Hybridomzelllinien, auf welche oben speziell Bezug genommen wurde. Diese Zelllinien wurden bei der European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), Centre for Applied Microbiology and Research, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, Vereinigtes Königreich unter den Zugangsnummern und Daten, die in der folgenden Tabelle gezeigt sind, hinterlegt:
Diese Hinterlegungen wurden gemäß dem Budapester Vertrag vorgenommen.
Ein verallgemeinertes Verfahren zur Erzeugung anderer monoklonaler Antikörper wurde oben beschrieben. Um sicher zu stellen, dass diese in der Erfindung verwendet werden können, kann ein einfaches Kreuzkonkurrenzexperiment mit Antikörpern umgesetzt werden, die von der hinterlegten Zelllinie sezerniert wurden.
Die oben definierten Antikörper und andere Bindungsmoleküle können in diagnostischen Anwendungen in Kombination mit Antikörpern verwendet werden, die spezifisch gegen andere Regionen des HBV, wie die S-Region, gerichtet sind.
Wenn sie in Kombination verwendet werden, ist nur ein Test notwendig. In diesem Fall erkennen die Antikörper, die gegen die S-Region gerichtet sind, ebenso die HBV-Varianten, welchen die Pre-S-Region fehlt.
Die Antikörper und andere Bindungsmoleküle überwinden, wenn sie gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden, das Übersehen von HBV-infizierten Individuen bei der Diagnose der HBV-Infektion. Mit diesen Antikörpern konnte das HBsAg-Testkonzept, das auf der S-Region von HBV basiert, verbessert werden. Der Nachweis von Mutanten von HBsAg wird bestätigt.
Die Antikörper und anderen Bindungsmoleküle, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sind nützliche Hilfsmittel zum Nachweis der HBV-Expression in Zellen und Zellextrakten, sowohl in vivo als auch in vitro, zu Reinigungszwecken und für eine Vielzahl von biochemischen und immunologischen Analysetechniken, um die Funktion dieser Proteine zu untersuchen.
Ebenfalls offenbart wird ein Peptid, welches wenigstens einen Teil der Aminosäuresequenz RDSHPQAMQWNSTTFHQALLDPRVRGLYFPAGGSSSGT umfasst.
In einer speziellen Ausführungsform umfasst das Peptid wenigstens einen Teil der Aminosäuresequenz RDSHPQAMQWNSTTFHQAL. Ein bevorzugtes spezielles Fragment ist MQWN.
In einer anderen speziellen Ausführungsform ist das Fragment ein Peptid, welches wenigstens einen Teil der Aminosäuresequenz SHPQAMQWNSTTFHQALLDPR umfasst. Ein bevorzugtes spezielles Fragment ist STTFHQA.
Ein anderes Fragment ist ein Peptid, das wenigstens einen Teil der Aminosäuresequenz ALLDPRVRGLYFPAGGSSSGT umfasst. Ein bevorzugtes spezielles Fragment ist VRGLYFPA.
Die Definition optimaler Peptide (synthetisch oder rekombinant), welche immundominante Domänen von HBsAg darstellen, die in der Lage sind, die bestehenden Peptide oder Proteine in diagnostischen Tests zu ersetzen, ist von entscheidender Bedeutung, um alle möglichen HBsAg-positiven Proben nachzuweisen.
Diese Peptide können in hohem Maße reproduzierbar synthetisiert werden und werden leicht gereinigt, womit sie gut geeignet sind für eine weitere Verbesserung und Standardisierung der HBV-Serologie.
Synthetische Peptide haben den Vorteil, dass sie chemisch gut definiert sind, womit sie eine leichte und reproduzierbare Herstellung in hohen Ausbeuten ermöglichen, wobei sie gut für die Anwendung in diagnostischen Tests geeignet sind, welche mit höherer Reproduzierbarkeit hergestellt und verwendet werden können.
Im Gegensatz zu natürlichen HBsAg-Proteinen weisen die Peptide, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, den großen Vorteil auf, dass diese aus einer sicheren nicht infektiösen Quelle stammen.
Der Ausdruck "Peptid", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf eine Molekülkette von Aminosäuren mit einer biologischen Aktivität und bezieht sich nicht auf eine bestimmte Länge des Produkts. Somit sind unter anderem Proteine, Fusionsproteine oder -peptide, Oligopeptide und Polypeptide umfasst.
Wenn nötig können Peptide zur Verwendung in der Erfindung in vivo oder in vitro, beispielsweise durch Glykosylierung, Amidierung, Carboxylierung oder Phosphorylierung, modifiziert werden. Funktionale Varianten sind beispielsweise Säureadditionssalze, Amide, Ester und insbesondere C-terminale Ester und N-Acylderivate der Peptide.
Der Ausdruck "wenigstens ein Teil von", wie er hierin verwendet wird, meint eine Untersequenz der identifizierten Aminosäuresequenz. Dieser Teil oder das Fragment ist ein Bereich mit einer oder mehreren antigenen Determinanten der HBsAg-Proteine. Fragmente können unter anderem durch enzymatische Spaltung von Vorläufermolekülen hergestellt werden, wobei Restriktionsendonukleasen für die DNA und Proteanen für die (Poly)Peptide verwendet werden. Andere Methoden umfassen die chemische Synthese der Fragmente oder die Expression von Peptidfragmenten über DNA-Fragmente.
Die Herstellung der Peptide oder Fragmente von diesen zur Verwendung in der Erfindung wird mittels einer der bekannten organisch-chemischen Methoden zur Peptidsynthese oder mit Hilfe von rekombinanten DNA-Techniken bewirkt, welche ebenfalls im Stand der Technik bekannt sind. Peptide können ebenfalls in einem einzigen Molekül kombiniert werden.
Wie bereits oben angegeben, können die Peptide, die in der Erfindung verwendet werden, in gleicher Weise mit Hilfe von rekombinanten DNA-Techniken hergestellt werden. Diese Möglichkeit ist insbesondere dann wichtig, wenn das Peptid in eine sich wiederholende Sequenz ("in tandem") eingebaut wird oder wenn das Peptid als ein Bestandteil eines (viel größeren) Proteins oder Polypeptids oder als ein Fusionsprotein mit beispielsweise (einem Teil von) β-Galactosidase hergestellt wird. Dieser Typ von Peptiden kann daher in gleicher Weise in der Erfindung verwendet werden.
Die oben hergestellten und beschriebenen Peptide oder Fragmente von diesen können ebenso verwendet werden, um Antikörper, sowohl polyklonal als auch monoklonal, und andere Bindungsmoleküle herzustellen.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Diagnose von Hepatitis B bereit gestellt, wobei das Verfahren das Inkontaktbringen der Probe, die im Verdacht steht, Hepatitis B-Partikel oder -Antigene zu enthalten, mit wenigstens einem spezifischen Bindungsmolekül, das gegen die S-Region von HBV gerichtet ist, und wenigstens einem spezifischen Bindungsmolekül gemäß der vorliegenden Erfindung, wie sie beansprucht ist, umfasst. Verfahren zur Diagnose gemäß der Erfindung können in vitro durchgeführt werden.
Ein besonders geeignetes Verfahren zum Nachweis von HBsAg in einer Probe basiert auf einer kompetitiven Reaktion zwischen einem Peptid gemäß der Erfindung, das mit einer markierenden Substanz versehen ist, und Hepatitis B-Partikeln oder -Antigenen (die in der Probe vorliegen), wodurch das Peptid und das Antigen im Wettbewerb stehen mit dem spezifischen Bindungsmolekül gemäß der vorliegenden Erfindung, das an einem festen Träger befestigt ist.
Eine andere bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung richtet sich auf ein Verfahren zum Nachweis von Antikörpern gegen Hepatitis B, wobei das Verfahren das Inkontaktbringen der Probe, die im Verdacht steht, Antikörper gegen Hepatitis B-Partikel oder -Antigene zu enthalten, mit wenigstens einem Peptid, wie es oben offenbart ist, umfasst.
Bei in vitro-Tests wird eine gewisse Form von Trägern verwendet, um die Bindungsmoleküle oder Peptide gemäß der vorliegenden Erfindung zu immobifisieren. Träger, welche verwendet werden können, sind beispielsweise die Innenwand einer Mikrotestvertiefung oder einer Küvette, ein Röhrchen oder eine Kapillare, eine Membran, ein Filter, ein Teststreifen oder die Oberfläche eines Teilchens, wie beispielsweise eines Latexteilchens, eines Aldehydteilchens (wie z. B. eines keramischen magnetisierbaren Teilchens mit aktiven Aldehydoberflächengruppen), ein Erythrozyt, ein Farbstoffsol, ein Metallsol oder eine Metallverbindung als Solpartikel, ein Trägerprotein wie z. B. BSA oder KLH.
Ebenso wird eine gewisse Form der Markierung verwendet, um eine Antigen-Antikörper-Wechselwirkung nachzuweisen. Markierungssubstanzen können radioaktiv oder nicht radioaktiv sein, wie z. B. ein radioaktives Isotop, eine fluoreszierende Verbindung, eine chemilumineszierende Verbindung, ein Enzym, ein Farbstoffsol, ein Metallsol oder eine Metallverbindung als Solpartikel. Abhängig von dem Format des Tests können entweder die spezifischen Bindungsmoleküle innerhalb des Umfangs der Erfindung markiert werden, oder es werden andere spezifische Bindungsmoleküle, welche an diese binden, markiert. Immuntests (einschließlich Radioimmuntests) und immunometrische Tests (einschließlich immunometrischen Radiotests und Enzymimmunsorbens-Tests) können verwendet werden, wie auch Immunoblottechniken.
In vitro-Tests können viele Formate haben. Einige hängen von der Verwendung von markierten spezifischen Bindungsmolekülen wie z. B. Antikörpern ab (deren Verwendung innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung eingeschlossen ist), wogegen einige die Wechselwirkung von Antikörper (oder einem anderen spezifischen Bindungsmolekül) und Antigen nachweisen, indem die resultierende Ausfällung beobachtet wird. Diese sind im Stand der Technik gut bekannt.
In vitro-Tests werden oft durchgeführt, indem Kits verwendet werden. Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Testkit zum Nachweis eines Hepatitis B-Partikels oder -Antigens bereitgestellt, wobei das Kit ein spezifisches Bindungsmolekül, wie es oben beschrieben wurde, und Mittel zum Nachweisen, ob das spezifische Bindungsmolekül an einen Hepatitis B-Partikel oder -Antigen gebunden hat, umfasst, wie es beansprucht wird.
Die Testmethodik kann beispielsweise die von irgendeinem der Tests sein, auf die oben Bezug genommen wurde. Kompetitive und insbesondere Sandwich-Immuntest-Kits sind bevorzugt. Das spezifische Bindungsmolekül und das Nachweismittel können in getrennten Kompartimenten des Kits bereitgestellt werden. Das spezifische Bindungsmolekül kann gebunden an einen festen Träger bereitgestellt werden. Das Nachweismittel kann ein nachweisbar markiertes zweites spezifisches Bindungsmolekül umfassen (welches selbst ein Antikörper (monoklonal, aber vorzugsweise polyklonal) sein kann, welches an den gebundenen Hepatitis B-Partikel oder das -Antigen bindet.
Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Testkit zum Nachweis eines Hepatitis B-Partikels oder -Antigens, wobei das Kit wenigstens ein Bindungsmolekül, das gegen die S-Region des HBV gerichtet ist, und wenigstens ein spezifisches Bindungsmolekül gemäß der vorliegenden Erfindung und Mittel zum Nachweisen, ob das spezifische Bindungsmolekül an einen Hepatitis B-Partikel oder an ein -Antigen gebunden hat, umfasst.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Testkit zum Nachweis von Antikörpern gegen Hepatitis B, wobei das Kit wenigstens ein Peptid gemäß der vorliegenden Erfindung und Mittel zum Nachweisen, ob das Peptid an Antikörper gegen Hepatitis B gebunden hat, umfasst.
Beim Durchführen einer Sandwich-Reaktion zum Nachweis von Antikörpern gegen Hepatitis B kann das Testkit beispielsweise ein Peptid gemäß der Erfindung, das auf einem festen Träger, beispielsweise der Innenwand einer Mikrotestvertiefung beschichtet ist, und entweder ein markiertes Peptid oder einen markierten anti-Antikörper umfassen.
Zur Durchführung einer Kompetitionsreaktion kann das Testkit ein Peptid, das auf einem festen Träger beschichtet ist, und ein markiertes spezifisches Bindungsmolekül umfassen.
Ebenfalls offenbart wird die Verwendung eines spezifischen Bindungsmoleküls zur in vitro-Diagnose von Hepatitis B. Die Antikörper und andere Bindungsmoleküle können bei der Entwicklung und Qualitätskontrolle von serologischen Tests und für den direkten Nachweis von HBV nützlich sein.
Ebenso wird die Verwendung der spezifischen Bindungsmoleküle, wie sie offenbart sind, in immunologischen und biochemischen Verfahren, die darauf abzielen, das Protein in voller Länge in einer Testflüssigkeit oder einer Gewebeprobe nachzuweisen, offenbart.
Die Erfindung wird weiter durch die folgenden Beispiele veranschaulicht:
Beispiel 1: Herstellung und Selektion von (monoklonalen) Antikörpern
Die anti-PreS-Mäuseantikörper HB.OT107C, HB.OT104A und HB.OT230B wurden hergestellt, indem Balb/c-Mäusen natives HBsAg in Freund's vollständigem Adjuvans injiziert wurde. Das HBsAg wurde aus Seren von HBV-infizierten Spendern erhalten. Nach zwei Monaten wurde den Mäusen eine Verstärkungsinjektion mit dem Antigen, gemischt mit Freund's unvollständigem Adjuvans verabreicht, was nach zwei Wochen wiederholt wurde. Drei Tage später wurde die Milz entfernt, und Milzlymphozyten wurden gemäß dem CRL manual G6-1 mit Mäusemyelom zellen P3x63Ag8653 (ATCC CRL 1580) gemäß Standardverfahren verschmolzen, wobei Polyethylenglykol 1000 verwendet wurde. Die Hybridomzellen wurden im Hinblick auf die Produktion von anti-PreS-Antikörpern gescreent, wobei spezifische Peptide und/oder denaturiertes HBsAg verwendet wurden. Mehrere Zyklen der Klonierung durch Grenzverdünnung waren notwendig, um eine stabile Zelllinie mit 100 % Klonalität zu erhalten.
Beispiel 2: Bestimmung des Minimalepitops der Antikörper
Materialien und Verfahren:
Das Minimalepitop von HB.OT107C und HB.OT104A wurde bestimmt, indem das standardmäßige Pepscan-Verfahren verwendet wurde (Geysen et al., 1987, J. Immunol. Meth. 102, 259-274). Peptide, die auf der Sequenz "MQWNSTTFHQAL" basierten, wurden am N- oder C-Ende verkürzt und mit HB.OT104A und HB.OT107C getestet. Ähnliche Experimente wurden mit verkürzten Peptiden, die auf der Sequenz "LDPRVRGLYFPA" basierten, und Mab HB.OT230B durchgeführt. Zur Bestimmung des Minimalepitops von NB.OT107C wurde die Reihe mit Peptiden, die auf der Sequenz "STTFHQAL" basierten, die am C-terminalen Ende verkürzt wurde, ausgedehnt.
Ergebnisse:
Die Ergebnisse, die in Tabelle 3 gezeigt sind, zeigen, dass das erste Methionin (M) am N-Terminus der Pre-S2-Sequenz für die Reaktivität von Mab HB.OT104A wesentlich ist. Das Minimalepitop umfasst möglicherweise wenigstens die Aminosäuren "MQW". Im Fall von HB.OT107C sinkt die Reaktivität, wenn das Serin (S) oder das Threonin (T) am C-Terminus entfernt werden. Das Epitop von HB.OT107C könnte die Aminosäuren S (124) und T (126) einschließen.
Tabelle 3. Reaktivität der Mab's HB.OT107C und HB.OT104A mit Peptiden auf der Basis der Sequenz "120-MQWNSTTFHQAL-131".
Das Epitop von HB.OT107C wurde weiter untersucht, indem Peptide verwendet wurden, die auf der Sequenz "STTFHQAL" basierten. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt. Die minimale reaktive Sequenz umfasst die Aminosäuren "STTF". Dieses ist in Übereinstimmung mit den Ergebnissen, die in Tabelle 3 gezeigt sind. Die Reaktivität der Sequenz "STTFHQA" ist vergleichbar mit der Reaktivität des ursprünglichen 12-er Peptids "MQWNSTTFHQAL", wenn aber die Sequenz "STTFHQA" an der C-terminalen Seite verkürzt wird, sinkt die Reaktivität. Eine sehr niedrige aber messbare Reaktivität wird immer noch mit der Sequenz "STT" erhalten.
Tabelle 4. Kartierung des Minimalepitops von Mab HB.OT107C unter Verwendung von Peptiden auf der Basis der Sequenz "124-STTFHQAL-131".
Im Fall von HB.OT230B wurde die höchste Reaktivität erhalten mit dem vollständigen 12-er Peptid einschließlich der Sequenz "132-LDPRVRGLYFPA-143". Die Entfernung des Alanins (A) am C-Terminus des Peptids führt zu einer starken Abnahme der Reaktivität mit dem Antikörper. Peptide, bei welchen das Leucin (L) und/oder die Asparaginsäure (D) am N-Terminus entfernt werden, zeigen immer noch eine hohe Reaktivität. Die Eliminierung des ersten Prolins (P) am N-Terminus vermindert jedoch in starkem Maße die Reaktivität des Peptids, wenn aber sowohl P als auch das erste Arginin (R) entfernt werden, steigt die Reaktivität wieder. Entsprechend den Ergebnissen umfasst das Minimalepitop von HB.OT230 möglicherweise die Sequenz "VRGLYFPA".
Tabelle 5. Kartierung des Minimalepitops von HB.OT230B unter Verwendung von Peptiden, die auf der Sequenz "DPRVRGLYFPA" basieren.
Beispiel 3: Ersatz von Aminosäuren durch Alanin (A)
Materialien und Verfahren:
In 12-er Peptiden, die mit den Mab's HB.OT104A und/oder HB.OT107C ("MQWNSTTFHQAL" und "STTFHQALLDPR") oder HB.OT230B ("LDPRVRGLYFPA") reagierten, wurde jede Aminosäure durch ein Alanin (A) ersetzt. Wenn Alanin (A) natürlich in der Grundsequenz erschien, wurde dieses durch Serin (S) ersetzt. Die Reaktivität von jedem Peptid wurde unter Verwendung der standardmäßigen Pepscan-Technologie bestimmt.
Ergebnisse:
Die Ergebnisse der Ala-Untersuchung auf der Basis des Peptids "MQWNSTTFHQAL" sind in Tabelle 6 gezeigt. Wenn das Methionin (M) oder das Tryptophan (W) am N-Terminus durch Alanin (A) ersetzt wurden, wurde die Reaktivität des Peptids mit dem Mab HB.OT104A stark vermindert. Dieser Fund ist in Übereinstimmung mit den Ergebnissen der Epitopkartierung. Das Minimalepitop von HB.OT104A umfasst möglicherweise die Sequenz "MQW", aber scheinbar sind die Aminosäuren M (120) und W (122) für die Reaktivität des Antikörpers am wichtigsten.
Die Reaktivität von HB.OT107C war am empfindlichsten gegenüber Substitutionen, die das Serin (S) oder das Phenylalanin (F) betrafen, die in der Mitte des Peptids angeordnet sind. In allen Fällen fiel jedoch die Reaktivität nie drastisch ab. Entsprechend der Epitopkartierung sind sowohl S (124) als auch F (127) in dem Bereich lokalisiert, der von HB.OT107C erkannt wird. Die Ergebnisse wurden in einer Ala-Untersuchung auf der Basis des Peptids "124-STTFHQALLDPR-135" (Ergebnisse sind in Tabelle 7 gezeigt) bestätigt, aber in diesem Fall wies der Austausch beider Aminosäuren eine drastischere Wirkung auf die Reaktivität des Peptids auf. Sowohl Serin (S-124) als auch das Phenylalanin (F-127) scheinen für die Reaktivität von HB.OT107C wichtig zu sein.
Tabelle 6. Ala-Untersuchung von HB.OT104A und HB.OT107C. Austausch von jeder folgenden Aminosäure in der Peptidsequenz "120-MQWNSTTFHQAL-131". A-130 wird durch Serin (S) ersetzt.
Tabelle 7. Ala-Untersuchung von HB.OT107C auf der Basis des Peptids "124-STTFHQALLDPR-135".
Tabelle 8. Ala-Untersuchung von HB.OT230B. Jede nachfolgende Aminosäure in der Sequenz 132-LDPRVRGLYFPA-143 wurde durch Alanin (A) ersetzt. A (143) wurde durch Serin (S) ersetzt.
In Tabelle 8 sind die Ergebnisse der Ala-Austauschuntersuchung gezeigt, welche die Reaktivität des Mab HB.OT230B betrachten. Es ist klar, dass der Austausch von Leucin (L-139) oder Tyrosin (Y-140) eine drastische Wirkung auf die Reaktivität des Mab HB.OT230B aufwies. Möglicherweise sind beide Aminosäuren für die Reaktivität wesentlich. Entsprechend den Kartierungsergebnissen umfasst das Minimalepitop von HB.OT230B die Aminosäuren "RGLYFPA" (siehe Ergebnisse der Kartierung des Minimalepitops), aber offensichtlich sind die Aminosäuren L (139) und Y (140) für die Reaktivität am entscheidensten.
Beispiel 4: Reaktivität von Pre-S2-Antikörpern mit Peptiden die natürlich auftretende Aminosäuresubstitutionen einschließen
Materialien und Verfahren:
Verschiedene Aminosäuresubstitutionen wurden in Peptide eingeschlossen, die auf der Sequenz "MQWNSTTFHQAL", "STTFHQALLDPR" oder "LDPGVRGLYFPA" basierten. Die meisten Substitutionen wurden vorher von Norder et al. (1994) beschrieben und basierten auf natürlich auftretenden (Untertyp) Variationen innerhalb der Pre-S2-Region. Die Peptide wurden mit den Mab's HB.OT104C und/oder HB.OT107C und/oder HB.OT230B getestet. Jede Substitution ist in den Tabellen 9, 10 oder 11 erwähnt. Die Reaktivität jedes Peptids wurde bestimmt, indem die standardmäßige Pepscan-Technologie, wie sie bereits beschrieben wurde, verwendet wurde.
Ergebnisse:
Auf der Basis des Peptids "MQWNSTTFHQAL" hatten natürlich auftretende Aminosäuresubstitutionen keine wesentliche Wirkung auf die Reaktivität des Mab HB.OT104A (siehe Tabelle 9). Im Fall von HB.OT107C wurde die Reaktivität beeinträchtigt, wenn das Threonin (T-126) am C- Terminus des Peptids durch Histidin (H) ersetzt wurde (siehe Tabelle 9). Ebenso führte der Austausch des C-terminalen Leucins (L-131) durch Glutamin (Q) oder der Austausch von Arginin (R-135) durch Glycin (G) zu einer starken Abnahme der Reaktivität des Peptids.
Tabelle 9. Reaktivität des Peptids "MQWNSTTFHQAL" mit den Mab's HB.OT107C und HB.OT104A, welche natürlich auftretende Aminosäuresubstitutionen beinhalteten.
Tabelle 10. Reaktivität des Peptids "STTFHQALLDPR" mit dem Mab HB.OT107C, welcher natürlich auftretende Aminosäuresubstitutionen beinhaltete.
Die Reaktivität von HB.OT230B wurde durch den Austausch von Glycin (G-138) durch Valin (V) und von Phenylalanin (F-141) durch Leucin (L) beeinträchtigt. Diese Ergebnisse sind in Übereinstimmung mit der Ala-Untersuchung, welche zeigte, dass der Austausch von Glycin (G-138) durch Alanin (A) und von Phenylalanin (F-141) durch Alanin (A) die Reaktivität des Peptids verminderte.
Tabelle 11. Reaktivität des Peptids "LDPRVRGLYFPA" mit dem Mab HB.OT230B, welcher natürlich auftretende Aminosäuresubstitutionen beinhaltete.
Beispiel 5: Screenen von Patientenserum mit HBsAg-Mutante
Materialien und Verfahren:
Ein Patientenserum mit HBsAg-Mutante wurde verwendet, um die Empfindlichkeit von Immuntests zu untersuchen, welche das Bindungsmolekül gemäß der vorliegenden Erfindung umfassten.
In einem Test, "Basistest" genannt, werden nur monoklonale Mäuseantikörper verwendet, welche gegen die S-Region von HBsAg gerichtet sind. In dem anderen Test (welches der Test gemäß der vorliegenden Erfindung ist), "verbesserter Test" genannt, wird ein monoklonaler Mäuseantikörper, welcher gegen die Pre-S-Region von HBsAg gerichtet ist, zu den monoklonalen Antikörpern zugegeben, die bereits in dem Basistest vorliegen.
Insbesondere wurden Mikroelisa-Vertiefungen mit den monoklonalen Antikörpern beschichtet. Jede Mikroelisa-Vertiefung enthielt ein Kügelchen eines HRP-markierten anti-HBs-Konjugats, welches den Antikörper gegen HBsAg (anti-HBs), gekoppelt an Meerrettich-Peroxidase (HRP) umfasste, was als das Konjugat mit Tetramethylbenzidin (TMB) und Peroxid als dem Substrat dient.
Die Testprobe oder geeignete Kontrollen wurden in den Mikroelisa-Vertiefungen inkubiert.
Das Konjugat-Kügelchen löst sich in der Probe, und es wird ein Festphasen-Antikörper/HBsAg/Enzym-markierter Antikörper-Komplex gebildet. Nach einer Wäsche und Inkubation mit TMB-Substrat wird eine Farbe erzeugt, welche gelb wird, wenn die Reaktion mit Schwefel säure gestoppt wird. Wenn HBsAg in der Probe vorliegt, entwickelt sich eine Farbe. Wenn jedoch die Probe frei von HBsAg ist, bildet sich bei der Zugabe des Substrats keine oder nur eine geringe Farbe. Innerhalb gewisser Grenzen ist die Menge an HBsAg in der Probe proportional zu der Farbentwicklung.
Die Probe wurde unverdünnt getestet.
Beide Tests (Basis- und verbesserter Test) wurden gemäß demselben Verfahren durchgeführt.
Das Patientenserum mit HBsAg-Mutante ist:

– Patientenserum 1: Mutante 129R/133T.

Diese Probe war eine freundliche Gabe von Dr. T. Cuijpers (beschrieben in Jongerius et al., 1997, Ned Tijdschr Geneesk 141 (22) 1128).
In jede Vertiefung beider Platten wurden 100 μl Kulturüberstand oder Kontrolle pipettiert. Die Platte wurde abgedeckt, für 15 Sekunden geschüttelt und bei 37 ± 2°C für 1 Stunde ± 5 Minuten in einem OT500-Inkubator inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Platten viermal mit Phosphatpuffer gewaschen, wobei eine OT400-Waschvorrichtung verwendet wurde. In jede Vertiefung wurden 100 μl TMB-Substrat pipettiert und bei 18-25°C für 30 ± 2 Minuten inkubiert. Dann wurde die Reaktion gestoppt, indem 100 μl 1 M Schwefelsäure zugegeben wurden. Nachdem der Nullwert des OT510-Lesegeräts mit Luft eingestellt wurde, wurde die Extinktion der Lösung in jeder Vertiefung bei 450 ± 5 nm abgelesen.
Ergebnisse:
Die Ergebnisse von beiden Tests sind in Tabelle 12 aufgelistet.
Für die Probe 129R/133T betrug der Grenzwert für den Basistest 132, und der Grenzwert für den verbesserten Test betrug 110.
Diese Probe wurde in dem Basistest negativ getestet, aber in dem verbesserten Test positiv getestet.
Es ist klar, dass gefunden wurde, dass der verbesserte Test im Vergleich zum Basistest reaktiver war.
Tabelle 12. Gemessene Extinktion bei 450 nm von Patientenserum mit HBsAg-Mutante 129R/133T und negativer Kontrolle, getestet in dem Basistest und dem verbesserten Test.
Beispiel 6: Screenen einer Gruppe rekombinanter HBsAg-Mutanten
Materialien und Verfahren:
Aufgrund des Fehlens gut dokumentierter und verfügbarer Patientenseren mit HBsAg-Mutante (mit der Ausnahme der Probe, die in Beispiel 5 beschrieben wird), wurde eine Gruppe rekombinanter HBsAg-Mutanten hergestellt.
Die Gruppe von HBsAg-Mutanten wurde wie folgt hergestellt: Sowohl Cos I-Zellen als auch HepG2-Zellen wurden als Einzelschicht in 75 cm² Roux-Kolben in 10 ml Dulbecco's MEM-Medium, das 10 % fötales Kalbsserum (FCS) enthielt, in einem 37°C-Inkubator kultiviert. Vier Stunden vor der Elektroporation wurde das Medium erneuert.
Nach einer Trypsinierung wurden die Zellen in 5 ml Medium verdünnt und 10 Minuten bei 233 g in einer Beckmann GP-Zentrifuge zentrifugiert. Für Cos I-Zelllinien wurden 1,5 × 10⁶ Zellen in 200 μl phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) verdünnt, für HepG2-Zelllinien wurden 5 × 10⁶ Zellen in 500 μl Medium verdünnt. Dann wurden 20 μl sterile DNA-Lösung von jedem rekombinanten HBsAg-Konstrukt zu der Zellsuspension zugegeben. Die Mischungen wurden für 5 Minuten auf Eis inkubiert und in eine 4 mm-Küvette pipettiert. Neun Kombinationen von Cos I-Zellen plus DNA wurden bei 300 V und 125 μF einer Elektroporese unterzogen, vier Kombinationen von HepG2-Zellen plus DNA wurden bei 235 V und 960 μF mit dem Biorad Gene Pulser einer Elektroporese unterzogen. Wieder wurden die Mischungen für 5 Minuten auf Eis inkubiert. Die einer Elektroporation unterzogenen Zellen wurden in 5 ml Medium verdünnt und in 9 cm-Schalen in einem 37°C-Inkubator kultiviert. Nach ungefähr einer Woche der Kultivierung wurde der Überstand geerntet und bei –20 ± 2°C gelagert.
Der Überstand, der von 9 Cos I-Zelllinien und 4 HepG2-Zelllinien stammte, wurde in einem Enzymimmunsorbens-Test (ELISA) auf der Grundlage eines Einschritt-Sandwich-Tests getestet. Wieder wurde der Basistest mit dem verbesserten Test gemäß der vorliegenden Erfindung verglichen.
Alle Proben wurden unverdünnt getestet.
Beide Tests (Basis- und verbesserter Test) wurden gemäß demselben Verfahren durchgeführt.
In jede Vertiefung von beiden Platten wurden 100 μl des Kulturüberstands oder der Kontrolle pipettiert. Die Platte wurde abgedeckt, für 15 Sekunden geschüttelt und bei 37 ± 2°C für 1 Stunde ± 5 Minuten in einem OT500-Inkubator inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Platten viermal mit Phosphatpuffer gewaschen, indem eine OT400-Waschvorrichtung verwendet wurde. In jede Vertiefung wurden 100 μl TMB-Substrat pipettiert und bei 18-25°C für 30 ± 2 Minuten inkubiert. Dann wurde die Reaktion gestoppt, indem 100 μl 1 M Schwefelsäure zugegeben wurden. Nach Einstellen des Nullwerts des OT510-Lesegeräts mit Luft wurde die Extinktion der Lösung in jeder Vertiefung bei 450 ± 5 nm abgelesen.
Ergebnisse:
Die Ergebnisse beider Tests sind in Tabelle 13 aufgelistet.
Die Konstrukte, d. h. Cos I-Zelllinien und HepG2-Zelllinien, wurden getrennt in zwei Testläufen getestet. Lauf 1: Für alle Cos I-Zelllinien betrug der Grenzwert für den Basistest 126, der Grenzwert für den verbesserten Test betrug 133. Lauf 2: Für die HepG2-Zelllinien (Wildtyp und 129/133) betrug der Grenzwert für den Basistest 103, der Grenzwert für den verbesserten Test betrug 96.
Drei Proben, die in dem Basistest negativ getestet wurden, wurden in dem verbesserten Test positiv getestet, d. h. die Mutation Cos I 129/145R, Cos I 145R und HepG2 129/133 wurden in dem Basistest negativ und in dem verbesserten Test positiv getestet.
In allen Fällen wurde gefunden, dass der verbesserte Test im Vergleich zu dem Basistest reaktiver (empfindlicher) war.
Tabelle 13. Gemessene Extinktion bei 450 nm von 9 Cos I-Zelllinien, 4 HepG2-Zelllinien und den negativen Kontrollen, die in dem Basistest und dem verbesserten Test getestet wurden.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zur in vitro Diagnose von Hepatitis B, wobei das Verfahren umfasst: ein Reagieren einer Probe, die in Verdacht steht, Hepatitis B Teilchen oder Antigene zu enthalten, beide mit wenigstens einem spezifischen, auf einem Träger immobilisierten Bindungsmolekül (I), das entweder ein monoklonaler Antikörper ist oder mit einem monoklonalen Antikörper kreuzweise in Konkurrenz tritt, der gegen wenigstens einen Teil der Aminosäuresequenz, wie in Sequenz ID No.: 1 gezeigt, gerichtet ist, und wenigstens einem spezifischen, auf einem Träger immobilisierten Bindungsmolekül (II), das gegen die S-Region von HBV gerichtet ist; und Detektieren von Bindung des spezifischen Bindungsmoleküls zu dem Hepatitis B Teilchen oder Antigen.
Verfahren gemäß Anspruch 1, worin das spezifische Bindungsmolekül (I) gegen wenigstens einen Teil der Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID. Nrn.: 2, 3 oder 4 gezeigt, gerichtet ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, worin das spezifische Bindungsmolekül (I) gegen wenigstens einen Teil der Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID. Nrn.: 5, 6 oder 7 gezeigt, gerichtet ist.
Verfahren gemäß eines beliebigen der Ansprüche 1-3, worin das spezifische Bindungsmolekül (I) von der Zelllinie HB.OT104A, hinterlegt unter der Nummer ECACC 97062610, der Zelllinie HB.OT107C, hinterlegt unter der Nummer ECACC 98042805, oder der Zelllinie HV.OT230B, hinterlegt unter der Nummer ECACC 97062608 ausgeschieden wird.
Assay Kit für die Bestimmung eines Hepatitis B Teilchens oder Antigens, wobei das Kit umfasst: wenigstens ein spezifisches Bindungsmolekül (I), das entweder ein monoklonaler Antikörper ist oder mit einem monoklonalen Antikörper kreuzweise in Konkurrenz tritt, der gegen wenigstens einen Teil der Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID No.: 1 gezeigt, gerichtet ist; wenigstens ein spezifisches Bindungsmolekül (II), das gegen die S-Region von HBV gerichtet ist; und Mittel zur Bestimmung, ob ein spezifisches Bindungsmolekül an das Hepatitis B Teilchen oder Antigen gebunden ist, umfassend wenigstens ein Bin dungsmolekül, das gegen das Hepatitis B Oberflächen-Antigen (HBsAg) gerichtet ist.
Assay Kit gemäß Anspruch 5, worin das spezifische Bindungsmolekül (I) gegen wenigstens einen Teil der Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID Nrn.: 2, 3 oder 4 gezeigt, gerichtet ist
Assay Kit gemäß Anspruch 5 oder 6, worin das spezifische Bindungsmolekül (I) gegen wenigstens einen Teil der Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID Nrn.: 5, 6 oder 7 gezeigt, gerichtet ist.
Assay Kit gemäß eines beliebigen der Ansprüche 5-7, worin das spezifische Bindungsmolekül (I) von der Zelllinie HB.OT104A, hinterlegt unter der Nummer ECACC 97062610, von der Zellinie HB.OT107C, hinterlegt unter der Nummer ECACC 98042805, oder von der Zelllinie HB.OT230B, hinterlegt unter der Nummer ECACC 97062608 ausgeschieden wird.