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TECHNISCHES
GEBIET DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung beruht auf der Feststellung, daß gegen
spezifische Epitope des Proteins E1 bzw. E2 von HCV gerichtete Antikörper zum
Nachweis von Virusantigenen in Wirtsgeweben verwendet werden können.
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STAND DER
TECHNIK
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Die
Infektion mit Hepatitis-C-Virus (HCV) stellt ein Hauptgesundheitsproblem
sowohl in den Industrieländern
als auch in Entwicklungsländern
dar. Schätzungsweise
sind etwa 1-5% der Weltbevölkerung
von dem Virus betroffen. Die HCV-Infektion scheint die wichtigste
Ursache für
eine transfusionsassoziierte Hepatitis zu sein und entwickelt sich
häufig
zu einer chronischen Leberschädigung.
Zudem gibt es Hinweise darauf, daß HCV an der Induktion von
hepatocellulärem
Karzinom beteiligt ist. Folglich besteht ein hoher Bedarf an zuverlässigen Diagnoseverfahren
und wirksamen Therapeutika. Ebenso werden empfindliche und spezifische Screening-Verfahren
für mit
HCV kontaminierte Blutprodukte sowie verbesserte Verfahren zur Kultivierung
von HCV benötigt.
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Bei
HCV handelt es sich um ein Positivstrang-RNA-Virus mit ungefähr 9.400
Basen, die für
wenigstens drei Struktur- und sechs Nichtstrukturproteine codieren.
Auf der Grundlage von Sequenzhomologie wurde den Strukturproteinen
die Funktion eines einzelnen Kernproteins und zweier Hüllproteine,
E1 und E2, zugeordnet. Das E1-Protein besteht aus 192 Aminosäuren und
enthält
5 bis 6 N-Glykosilierungsstellen, je nach HCV-Genotyp. Das E2-Protein
besteht aus 363 bis 370 Aminosäuren
mit 9 bis 11 N-Glykosilierungsstellen, je nach HCV-Genotyp (hinsichtlich
einer Übersicht,
siehe Major und Feinstone, 1997; Maertens und Stuyver, 1997). Das
E1-Protein enthält
verschiedene variable Domänen,
während
das E2-Protein zwei hypervariable Domänen enthält, von denen die größere Domäne am N-Terminus
des Proteins lokalisiert ist (Maertens und Stuyver, 1997). Die Hüllproteine
wurden mittels rekombinanter Techniken in Escherichia coli, Insektenzellen,
Hefezellen und Säugerzellen
produziert. Die Nutzung eines Expressionssystems in höheren Eukaryonten
und vor allem in einer Säugerzellkultur
führt zu
Hüllproteinen
sehr guter Qualität,
d.h. diese werden effektiv von Antikörpern in Patientenproben erkannt,
wie in der PCT/EP 95/03031 von Maertens et al. beschrieben.
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Weitere
HCV-E1- und -E2-Peptidantigene sowie deren Verwendung in Immuntests
sind in der WO 92/13892, der
DE
4209215 sowie der WO 96/40764 beschrieben.
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Zur
Zeit beruht der Nachweis von HCV in Zellen oder Geweben hauptsächlich auf
dem Aufzeigen von Virus-RNA. Allerdings handelt es sich beim RNA-Nachweis
in Zellen oder Geweben um eine mühselige
Technik, die entweder die Extraktion von RNA mit anschließender reverser
Transkription und Nested-PCR [etwa: ineinandergeschachtelte PCR-Reaktionen]
oder In-situ-RT-PCR und Hybridisierung beinhaltet. Da diese Techniken
auch zu einer falsch-positiven Reaktivität neigen, wird der Virus-RNA-Nachweis
ausschließlich
an Serumproben durchgeführt.
Es herrscht immer noch ein Mangel an zuverlässigen Verfahren für den Nachweis von
Virusproteinantigenen in Serum- und Gewebeproben.
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Die
Replikationsorte des HCV sind noch nicht vollständig aufgeklärt. Es wird
im allgemeinen angenommen, daß das
Virus in Hepatocyten repliziert, doch wird die Replikation in anderen
Geweben, wie beispielsweise Lymphoidgeweben, noch stark diskutiert.
Somit könnte
dieses Problem durch ein zuverlässiges
Verfahren zum Nachweis viraler Proteine oder das Virus selbst in
Zellen gelöst
werden.
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Der
Nachweis von Virusproteinen in Zellen wurde bislang durch das Fehlen
von Antikörpern,
die spezifisch an Virusproteine binden und die in der Lage sind,
die natürlichen
HCV-Proteinantigene (d.h. Antigene, wie sie vom Wirt nach Infektion
mit HCV exponiert werden) spezifisch zu erkennen, eingeschränkt. Demzufolge beschäftigen sich
bislang nur wenige Untersuchungen mit dem Aufzeigen des Vorhandenseins
von HCV-Virusproteinen in Wirtszellen (hinsichtlich eines Übersichtsartikels,
siehe Guido und Thung, 1996). Zudem wurden in vielen dieser Untersuchungen
aus dem Wirt stammende Antikörper
verwendet. Präparationen
mit aus dem Wirt abgeleiteten Antikörpern lassen sich allerdings
nicht leicht reproduzieren und können
mit Autoimmunantikörpern
ebenso wie mit Antikörpern
gegen andere bekannte oder selbst unbekannte Agentien verunreinigt
sein. Dagegen ist bekannt, daß in
Tieren produzierte Antikörper
nach Immunisierung mit rekombinanten Antigenen Antikörper mit
der gewünschten
Spezifität
ergeben. Um eine reproduzierbare Qualität zu besitzen, sind monoklonale
Antikörper
ebenso bevorzugt. Darüber
hinaus müssen
die Hüllproteine
des HCV von einem Säugerexpressionssystem
produziert werden, um Antigene hoher Qualität zu ergeben. Zur Zeit geht
diese Expressionsbedingung mit unbegreiflichen Problemen einher.
Daher sind bislang nur wenige monoklonale Antikörper beschrieben, die zum Nachweis
von HCV-Hüllantigenen
in Gewebeproben von Patienten verwendet werden könnten. Diese Antikörper waren
gegen den N-terminalen Bereich von E1, Aminosäuren (AS) 192-226 (Hiramatsu
et al., 1992, Kaito et al., 1994), oder die C-terminale Domäne von E2,
AS 451-715 (Sansonno et al., 1997a, 1997b), gerichtet. Allerdings
ist aus diesen Veröffentlichungen
sowie den Übersichtsartikeln
von Guido und Thung (1996) sowie Liang (1996) ersichtlich, daß immer
noch ein Bedarf an gut charakterisierten Antikörpern besteht, die einen effizienten
und routinemäßigen Nachweis
natürlicher HCV-Proteinantigene
in Serum- und Gewebeproben gestatten. Dieser Bedarf wurde kürzlich durch
eine Untersuchung von Dries und Mitarbeitern (1999) bestätigt. Die
Dries-Gruppe bewies, daß 61%
HCV-Antikörper-positiver
und Serum-RNA-negativer Individuen HCV-Träger waren, da HCV-RNA in Leberbiopsieproben
nachgewiesen werden konnte, wobei allerdings lediglich ein Drittel
dieser Fälle
durch Immunhistochemie unter Verwendung einer Antikörperreihe
nachgewiesen werden konnte. Somit fehlt es dem routinemäßigen Nachweis
von HCV-Antigen in Leberbiopsien immer noch an Empfindlichkeit.
Auch der Nachweis von Virusantigenen in Körperflüssigkeiten, wie beispielsweise
Serum oder Plasma, wird durch das gleiche Problem behindert. Bislang
wurde lediglich eine einzige Technik beschrieben, die den Nachweis
von Kernantigen in diesen Flüssigkeiten
gestattet. Allerdings erfordert diese Technik zum Nachweis des Kernproteins
eine vollständige
Denaturierung des in der Probe vorhandenen Kernproteins unter Verwendung
von Natriumhydroxid (Kashiwakuma et al., 1996).
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Daraus
läßt sich
zusammenfassend ableiten, daß die
Identfizierung neuer spezifischer HCV-Epitope, die Antikörpern zugänglich sind
und den Antigennachweis im Gewebe- und Körperflüssigkeitsproben gestatten,
dringend nötig
ist. Dabei stellen die HCV-Hüllproteine
mögliche
Kandidatenziele zum Auffinden solcher Epitope dar, da diese Proteine
in allen biologischen Proben, nämlich
in Flüssigkeiten,
auf der Membran des Virus sowie in Zellen vom frühesten Zeitpunkt der Infektion
(d.h. Viruseintritt) an durch den gesamten Replikationszyklus hindurch,
vorhanden sein sollten. Diese Hüllproteine
sind jedoch hochvariabel, so daß Antikörper mit
einer hohen Kreuzreaktivität
gegenüber
den unterschiedlichen Genotypen von HCV benötigt werden. Somit stellt die
Identifizierung solcher Epitope sowie die Suche nach Antikörpern mit
hoher Kreuzreaktivität
gegenüber
der Sequenzvariation des HCV eine große Herausforderung dar.
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Die
vorliegende Anmeldung betrifft spezifische monoklonale Antikörper, die
gegen bestimmte Epitope in den Hüllproteinen
von HCV gerichtet sind und die in der Lage sind, HCV-Antigen in
Gewebeproben von Patienten nachzuweisen. Insgesamt wurden zwei derartige
Epitope und die entsprechenden Antikörper gefunden: zum einen im
C-terminalen Bereich (AS 227-383) des Hüllproteins E1 und zum zweiten
im N-terminalen hypervariablen Bereich (hypervariable region, HVR)
von E2 (AS 384-450).
Obwohl der letztere Bereich und insbesondere der Bereich 395-415
als hypervariabel betrachtet wird, wurde von uns zu unserer Überraschung ein
Antikörper
charakterisiert, der mit verschiedenen bekannten Sequenzen des HVR
von E2 reagiert.
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ZIELE DER
ERFINDUNG
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Aus
der Literatur geht klar hervor, daß ein dringender Bedarf an
der Entwicklung zuverlässiger
Diagnoseverfahren, zuverlässiger
Impfstoffe sowie wirksamer Therapeutika gegen HCV besteht. Auch
werden empfindliche und spezifische Screening-Verfahren für mit HCV
kontaminierte Blutprodukte sowie verbesserte Verfahren zur Kultivierung
von HCV benötigt.
Neue Antikörper,
die in der Lage sind, das Virus in Tier- oder in-vitro-Modellen oder in seinem
natürlichen
Wirt nachzuweisen, können
bei der Konstruktion wirksamer Diagnosewerkzeuge und Therapeutika
behilflich sein. Diesbezüglich
beruht die vorliegende Erfindung auf der überraschenden Entdeckung monoklonaler,
entweder gegen E1 oder gegen E2-HVR gerichteter Antikörper, die
zum Nachweis von HCV-Antigenen in verschiedenen Geweben oder Zellen
verwendet werden können.
Zu diesen Geweben zählen
die Leber, aber ebenso aus Blutproben stammende Zellen. Daher richtet
sich die vorliegende Erfindung auf die Bereitstellung und Verwendung
eines Antikörpers,
der spezifisch an den HCV- Hüllproteinbereich
AS 227-450, der den Hauptteil (C- terminal)
des E1-Proteins abdeckt, sowie den N- terminalen Bereich des E2-Proteins
bindet. Diese Antikörper
gestatten den Nachweis natürlicher
HCV-Proteinantigene
und lassen sich zur Herstellung eines Nachweiskits für natürliches
HCV-Proteinantigen verwenden. Insbesondere entspricht das vollständige E1-Protein AS 192-383,
während
das vollständige
E2-Protein AS 384-747 entspricht (siehe: Major und Feinstone, 1997;
Maertens und Stuyver, 1997).
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Insbesondere
richtet sich die vorliegende Erfindung auf die Bereitstellung und
Verwendung eines wie oben definierten Antikörpers, der spezifisch an wenigstens
eines der folgenden Epitope bindet:
- – AS 307-326
des HCV-Proteins E1 (SEQ ID No. 30)
- – AS
395-415 des HCV-Proteins E2 (SEQ ID No. 31).
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Zudem
richtet sich die vorliegende Erfindung auf die Bereitstellung und
Verwendung eines wie oben definierten Antikörpers, bei dem es sich um einen
monoklonalen Antikörper
handelt. Diesbezüglich
richtet sich die vorliegende Erfindung auf die Bereitstellung und
Verwendung eines von der Hybridomlinie der ECACC-Hinterlegung mit der Zugangsnummer 98031215
oder 98031214 sezernierten monoklonalen Antikörpers.
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Es
sollte klar sein, daß die
vorliegende Erfindung auch auf die Bereitstellung und Verwendung
einer beliebigen funktionell äquivalenten
Variante bzw. eines beliebigen funktionell äquivalenten Fragments eines beliebigen
wie oben definierten Antikörpers,
ebenso wie mutanter Formen davon oder von Molekülen, die ähnliche funktionelle Bindungsreaktivitäten mit
SEQ ID No. 30 und 31 zeigen, wie beispielsweise aus Phagen- oder
anderen Bibliotheken erhaltene Sequenzen, gerichtet ist.
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Darüber hinaus
richtet sich die vorliegende Erfindung auf die Bereitstellung und
Verwendung einer Hybridomzellinie, die einen monoklonalen Antikörper sezerniert,
der spezifisch an HCV-E1-Protein (AS 227-383) oder den N-terminalen hypervariablen
Bereich (AS 384-450) von HCV-E2 bindet und den Nachweis natürlicher HCV-Proteinantigene
gestattet sowie für
die Herstellung eines Nachweiskits für natürliches HCV-Proteinantigen
verwendet werden kann. Insbesondere richtet sich die vorliegende
Erfindung auf die Bereitstellung und Verwendung der der ECACC-Hinterlegung
mit der Zugangsnummer 98031215 oder 98031214 entsprechenden Hybridomzellinie.
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Weiterhin
richtet sich die vorliegende Erfindung auch auf die Bereitstellung
eines Verfahrens zum Nachweis natürlicher HCV-Proteinantigene,
bei dem man:
- – eine Testprobe, die HCV-Proteinantigene
enthalten kann, mit einem wie oben definierten Antikörper oder mit
einer funktionell äquivalenten
Variante bzw. einem funktionell äquivalenten
Fragment des Antikörpers unter
Ausbildung eines Antikörper-Antigen-Komplexes
in Kontakt bringt und
- – den
Antikörper-Antigen-Komplex
mit einem entsprechenden Marker bestimmt.
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Insbesondere
richtet sich die vorliegende Erfindung auf die Bereitstellung eines
wie oben definierten Verfahrens, wobei die Testprobe menschliche
Zellen, wie etwa periphere Blutzellen, oder menschliche Gewebe,
wie etwa Lebergewebe, umfaßt.
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Schließlich richtet
sich die vorliegende Erfindung auf die Bereitstellung eines Testkits
zum Nachweis natürlicher
HCV-Proteinantigene, umfassend:
- – einen
wie oben definierten Antikörper
oder eine funktionell äquivalente
Variante bzw. ein funktionell äquivalentes
Fragment des Antikörpers
sowie
- – entsprechende
Marker, die die Bestimmung der zwischen HCV-Proteinantigenen in
einer Testprobe mit dem Antikörper
bzw. einer funktionell äquivalenten
Variante bzw. einem funktionell äquivalenten
Fragment des Antikörpers
ausgebildeten Komplexe gestatten.
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Alle
Ziele der vorliegenden Erfindung werden als durch die Ausführungsformen,
wie sie nachfolgend aufgeführt
sind, erfüllt
angesehen.
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KURZE BESCHREIBUNG
DER TABELLEN UND ZEICHNUNGEN
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In
Tabelle 1 sind die Peptidsequenzen aller in der vorliegenden Anmeldung
genannten Peptide angegeben.
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In
Tabelle 2 ist die Kreuzreaktivität
von IGH 222 gegenüber
verschiedenen Sequenzen der hypervariablen Domäne in E2 gezeigt. Dabei wurden
alle Peptide biotinyliert, an mit Streptavidin beschichtete Mikrotiterplatten
gebunden und mit IGH 222 reagieren gelassen.
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In 1 ist
die Anfärbung
des E2-Antigens, sichtbar gemacht durch den monoklonalen Antikörper IGH 222,
auf einer Leberbiopsie eines HCV-Patienten gezeigt. Die Immunhistochemie
wurde an 4 µm
dicken Cryostat-Schnitten
frisch eingefrorener Materialien (die Leberbiopsie wurde in mit
flüssigem
Stickstoff gekühltem Isopentan
schockgefroren und bis zur Verwendung bei –70°C gelagert) unter Verwendung
eines aus drei Schritten bestehenden indirekten Immunoperoxidase-Verfahrens
durchgeführt.
Die Schnitte wurden über Nacht
bei 4°C
mit monoklonalem Antikörper
IGH 222 (gereinigtes IgG1:10 ng/µl) inkubiert.
Die sekundären bzw.
tertiären
Antikörper
bestanden aus Peroxidasekonjugiertem Kaninchen-Anti-Maus- bzw. Peroxidase konjugiertem
Schweine-Anti-Kaninchen-IgG (jeweils bezogen von Dakopatts, Kopenhagen,
Dänemark;
Arbeitsverdünnung
1:50 bzw. 1:100). Die Inkubationen wurden jeweils bei Raumtemperatur über 30 Minuten
durchgeführt,
woran sich jeweils ein Waschschritt mit drei Wechseln von phosphatgepufferter
Kochsalzlösung,
pH 7,2 anschloß.
Das Reationsprodukt wurde durch 15 minütige Inkubation in 100 mM Acetatpuffer
(pH 5,2) mit 0,05% 3-Amino-9-ethylcarbazol
sowie 0,01 H2O2 entwickelt,
was eine leuchtend rote Anfärbung
immunreaktiver Stellen ergab. Die Schnitte wurden mit Hämotoxilin
gegengefärbt.
Kontrollen (nicht gezeigt) bestanden aus irrelevanten monoklonalen
Antikörpern
von einem ähnlichen
Isotyp wie der primäre
Antikörper
oder aus Chromogen allein: Diese Kontrollen waren regelmäßig negativ.
Die Fotografie zeigt eine 25fache Vergrößerung. Die dunkelste Anfärbung zeigt
das Vorhandensein von HCV-Antigen ausschließlich in Hepatocyten (siehe
Pfeile).
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In 2A ist
die Anfärbung
des E1-Antigens, sichtbar gemacht durch den monoklonalen Antikörper IGH
207, auf einer Leberbiopsie eines HCV-Patienten gezeigt. Bei der
durchgeführten
Verfahrensweise handelt es sich um die gleiche wie die in 1 beschriebene,
außer
daß die
Konzentration des monoklonalen Antikörpers 30 ng/µl betrug.
Die Fotografie zeigt eine 10fache Vergrößerung, auf der die Anfärbung der
Zellen in den Lymphocyten in Filtraten das vorherrschende Merkmal
ist. Die dunkelste Anfärbung
zeigt das Vorhandensein von HCV-Antigen in Hepatocyten (siehe Pfeil)
sowie infiltrierenden Lymphocyten (siehe Doppelpfeil).
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In 2B ist
die Anfärbung
von E1-Antigen, sichtbar gemacht durch den monoklonalen Antikörper IGH
210, auf einer Leberbiopsie eines HCV-Patienten dargestellt. Die
Leberbiopsie wurde mit Formaldehyd fixiert und in Paraffin eingebettet.
Schnitte wurden einer Vorbehandlung von Wärme (Mikrowellenverfahren) und
durch Protease unterzogen. Die Konzentration des Antikörpers betrug
6 ng/µl.
Die Fotografie zeigt eine deutlich angefärbte isolierte mononukleäre Zelle
(Pfeil) in einem Feld von Hepatocyten, die durch diesen monokonalen
Antikörper
nicht angefärbt
werden.
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In 3 ist
die durch den monoklonalen Antikörper
IGH 207 sichtbar gemachte Anfärbung
von intrazellulärem
E1-Antigen in peripheren mononukleären Blutzellen dargestellt.
Periphere weiße
Blutzellen (0,5 × 106) wurden in 200 µl PBS-0,1% Saponin suspendiert,
mit 2 µg
IGH 207 versetzt und damit 25 Minuten bei 4°C reagieren gelassen. Die Zellen
werden dreimal mit 3 ml PBS-0,1% Saponin und dreimal mit PBS-0,2%
NaN3 gewaschen. Schließlich werden die Zellen in
250 µl
PBS-0,2% NaN3 resuspendiert und mittels
Durchflußcytometrie
analysiert. Nach dem Eingrenzen der mononukleären Zellfraktion (rechte Spalte)
wurde die Fluoreszenz graphisch aufgetragen (linke Spalte). Proben
1-5 stammen aus chronischen HCV-Trägern, während Probe 6 aus einem gesunden
Blutträger
stammt. Die linke Spalte zeigt zwei Beispiele der Eingrenzung der
mononukleären
Zellfraktion (Beispiele 2 und 6), während die rechte Spalte die
in diesen mononukleären
Zellen gefundene Fluoreszenz zeigt. Während die Kontrollprobe überhaupt
keine Anfärbung
mit diesem monoklonalen Antikörper
zeigt, liegt bei allen HCV-Patienten, außer bei Patient 4, für den ein
schwächeres
Signal erhalten wurde, ein deutlich positives Signal vor.
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In 4 ist
die durch den monoklonalen Antikörper
IGH 201 sichtbar gemachte Anfärbung
von intrazellulärem
E1-Antigen in peripheren mononukleären Blutzellen dargestellt.
Die Technik war dabei ähnlich
wie die in 3. Proben 7-11 stammen aus chronischen
HCV-Trägern, während Probe
12 aus einem gesunden Blutträger
stammt. Die linke Spalte zeigt zwei Beispiele der Eingrenzung der
mononukleären
Zellfraktion (Proben 7 und 12), während die rechte Spalte in
diesen mononukleären
Zellen gefundene Fluoreszenz zeigt. Obwohl die Kontrollprobe eine
höhere
Hintergrundanfärbung
zeigt, läßt sich
die Reaktion in den Patientenproben leicht unterscheiden, und zwar
auf der Grundlage der beiden Populationen, die nachgewiesen werden
können: eine
Population mit einer ähnlichen
Anfärbung
wie in der Kontrolle sowie eine zweite Population mit einer Anfärbung hoher
Intensität,
die in der Kontrolle nicht beobachtet wird.
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Es
ist klar, daß der
Nachweis von Virusproteinen bislang durch das Fehlen von Antikörpern, die
spezifisch an Virusproteine binden und in der Lage sind, die natürlichen
HCV-Proteinantigene (d.h. Proteinantigene, wie sie vom Wirt nach
einer Infektion mit HCV exprimiert werden) zu erkennen, beeinträchtigt wurde.
Die vorliegende Erfindung beruht auf der Entdeckung von zwei neuen
Epitopen auf den HCV-Hüllproteinen,
die einen routinemäßigen Nachweis
natürlicher
HCV-Proteinantigene mittels gegen diese Epitope gerichtete Antikörper in
aus dem Wirt stammenden biologischen Proben gestatten. Somit betrifft
die vorliegende Erfindung die Verwendung von spezifisch an den C-terminalen
Bereich des HCV-Proteins E1 (AS 227-383) oder den N-terminalen Bereich
des HCV-Proteins
E2 (AS 384-450) bindenden Antikörpern
zur Herstellung eines Nachweiskits für natürliches HCV-Proteinantigen. Der Begriff "spezifisch an den
C-terminalen Bereich
des HCV-Proteins E1 (AS 227-383) oder den N-terminalen Bereich des
HCV-Proteins E2 (AS 384-450) bindende Antikörper" bezieht sich auf einen beliebigen polyklonalen
oder monoklonalen Antikörper,
der an ein Hepatitis-C-Viruspartikel oder ein beliebiges aus dem
Viruspartikel stammendes Molekül,
insbesondere an den C-terminalen Bereich des E1-Proteins sowie den
N-terminalen Bereich des E2-Proteins,
bindet. Der "Hüllbereich" der HCV-Viren, und
damit "der C-terminale
Bereich des HCV-Proteins E1 (AS 227-383) oder der N-terminale Bereich
des HCV- Proteins
E2 (AS 384-450)",
stellen für
den Fachmann allgemein bekannten Bereiche dar (Wengler, 1991; Major
und Feinstone, 1997; Maertens und Stuyver, 1997).
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Der
Begriff "binden" deutet an, daß die Antikörper der
vorliegenden Erfindung physikalisch mit HCV-Proteinen verbunden
sind, insbesondere, daß die
Antikörper
spezifisch an die HCV-Hüllproteine
binden, wodurch impliziert wird, daß weitgehend keine Kreuzreaktion
mit anderen Bestandteilen des HCV oder anderen Proteinen vorliegt.
Die Bindung des Antikörpers
an HCV-Proteine läßt sich
mit einem beliebigen, im Fachgebiet bekannten Verfahren oder Test
demonstrieren, wie beispielsweise Tests oder Kompetitionstests vom Bindungs-,
ELISA- und RIA-Typ (z.B. siehe Current protocols in immunology).
Dabei sollte es klar sein, daß der
Bereich eines HCV-Hüllproteins,
der an einen Antikörper
bindet, nicht aus einer zusammenhängenden Sequenz aufgebaut sein
muß.
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Der
Begriff "monoklonaler
Antikörper", wie er hier verwendet
wird, bezieht sich auf eine Antikörperzusammensetzung mit einer
homogenen Antikörperpopulation.
Dabei stellt der Begriff keine Beschränkung hinsichtlich der Spezies
oder Quelle des Antikörpers
dar, noch soll dieser durch die Art und Weise, in der er hergestellt
wird, beschränkt
sein. Darüber
hinaus bezieht sich der Begriff "Antikörper" auch auf humanisierte
Antikörper,
bei denen wenigstens ein Teil der Gerüstbereiche eines Immunglobulins
von menschlichen Immunglobulinsequenzen abgeleitet ist, sowie auf
einkettige Antikörper,
wie im US-Patent 4,946,778 beschrieben, sowie auf Fragmente von
Antikörpern,
wie z.B. Fab, F'(ab)2, Fv, und andere Fragmente, die die antigenbindende Funktion
und Spezifität
des Ausgangsantikörpers
beibehalten. Der Begriff "Antikörper" umfaßt auch
Diabodies (bispezifische Antikörper),
Triabodies (trispezifische Antikörper)
und tetravalente Antikörper,
wie sie in der EP-Anmeldung Nr. 97870092.0 von Lorré et al. beschrieben
sind, in denen die antigenbindende Funktion und Spezifität des Ausgangsantikörpers erhalten
ist. Dabei sollte klar sein, daß die
Antikörper,
wie sie in der vorliegenden Erfindung beschrieben sind, in einem
Verfahren zum Nachweis natürlicher
HCV-Proteinantigene verwendet werden könnten.
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Der
Begriff "Testprobe" bezieht sich auf
eine beliebige, aus einem Wirt gewonnene Probe, wie beispielsweise
Serum, Plasma, Speichel, Schleim, Rückenmarksflüssigkeit oder Biopsien. Diesbezüglich werden die
Begriffe "Testprobe" und "biologische Probe" hier wechselseitig
verwendet. Der Begriff "Biopsie" bezieht sich insbesondere
auf eine Probe, die Zellen, insbesondere menschliche Zellen, umfaßt. Darüber hinaus
bezieht sich der letztere Begriff auch auf eine aus flüssigem Gewebe,
wie beispielsweise peripheren Blutzellen, oder aus festem Gewebe,
wie beispielsweise Lebergewebe, stammende Probe. Falls der Antigennachweis
an einer Biopsie durchgeführt
wird, wird der Begriff "in-situ-Nachweis" verwendet.
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Der
Begriff "Nachweiskit
für natürliches
HCV-Proteinantigen" bezieht
sich auf einen Kit zum Nachweis eines beliebigen HCV-Proteinantigens,
vorzugsweise den Nachweis des C-terminalen Bereichs des HCV-Proteins
E1 (AS 227-383) oder des N-terminalen Bereichs des HCV-Proteins E2 (AS 384-450)
in deren natürlicher oder
ursprünglicher
Position, vorzugsweise der Antigene, wie sie in einer Testprobe
vorhanden sind, mit einem beliebigen, dem Fachmann bekannten Verfahren.
Mit anderen Worten: der letztere Begriff bezieht sich auf die Sichtbarmachung
des Vorhandenseins des C-terminalen Bereichs von HCV-E1-Protein
(AS 227-383) oder des N-terminalen
Bereichs des HCV-Proteins E2 (AS 384-450) in oder auf deren natürlicher
Wirtszelle oder natürlichem
Gewebe durch Bindung der Antikörper
der vorliegenden Erfindung. Der Nachweiskit umfaßt die folgenden Komponenten:
- (i) gegebenenfalls ein Mittel zur Isolierung
einer Testprobe,
- (ii) möglicherweise
eine Lösung
zur Permeabilisierung von Zellen,
- (iii) einen wie hier beschriebenen Antikörper oder eine funktionell äquivalente
Variante bzw. ein funktionell äquivalentes
Fragment davon,
- (iv) möglicherweise
sekundäre
und möglicherweise
tertiäre
Antikörper,
- (v) möglicherweise
Inkubations- und/oder Waschpuffer,
- (vi) möglicherweise
eine Färbelösung.
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Vorzugsweise
wird der Kit für
den in-situ-Nachweis von HCV-Hüllproteinen
verwendet.
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Bei
der natürlichen
Wirtszelle bzw. dem natürlichen
Gewebe kann es sich um eine beliebigen, aus einer beliebigen Wirtsspezies
stammende Wirtszelle bzw. ein beliebiges, aus einer beliebigen Wirtsspezies stammendes
Gewebe handeln. Insbesondere bezieht sich die natürliche Wirtszelle
auf periphere Blutzellen und das natürliche Gewebe auf Lebergewebe
(siehe auch Beispielteil der vorliegenden Anmeldung). Der natürliche Wirt
bezieht sich insbesondere auf den Menschen, kann sich aber auch
auf nichtmenschliche Primaten oder andere Säugetiere beziehen.
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Insbesondere
betrifft die vorliegende Erfindung Antikörper, die spezifisch an wenigstens
eines der folgenden Epitope binden: AS 307-362 des HCV-Proteins
E1 und AS 395-415 des HCV-Proteins E2. Die letzteren Antikörper werden
von bei der European Collection of Cell Cultures (ECACC), Centre
for Applied Microbiology & Research,
Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, UK Royaume-Uni (Tel: +44 1980 612512; Fax: +44
1980 611315) am 13. März
1998 hinterlegten Hybridomen sezerniert, denen die folgenden Zugangsnummern
erteilt wurden: 98031215 für
das Hybridom 17H10F4D10, das den monoklonalen Antikörper (mAb)
IGH 222 sezerniert, welcher das Epitop AS 395-415 (SEQ ID No. 31)
bindet, sowie 98031214 für
das Hybridom 14H11B2, das den monoklonalen Antikörper (mAb) IGH 207 sezerniert,
welcher an das Epitop AS 307-326
(SEQ ID No. 30) bindet. Diesbezüglich
sollte klar sein, daß Antikörper, die
an Teile der genannten Epitope binden, ebenso Teil der vorliegenden
Erfindung sind. So sind beispielsweise Antikörper, die an die folgenden
Epitope binden, hiermit ebenso umfaßt:
AS 307-311, AS 308-312,
AS 309-313, AS 310-314, AS 311-315,
AS 312-316, AS 312-317, AS 313-318, AS 314-319,
AS 315-320,
AS 316-321, AS 317-322, AS 318-323, AS 319-324, AS 320-325, AS 321-326, AS 307-312,
AS 308-313,
AS 309-314, AS 310-315, AS 311-316, AS 312-317,
AS 313-318, AS 314-319,
AS 315-320, AS 316-321, AS 317-322,
AS 318-323, AS 319-324,
AS 320-325, AS 321-326, AS 307-313,
AS 308-314, AS 309-315, AS 310-316, AS 311-317,
AS 312-318,
AS 313-319, AS 314-320, AS 315-321, AS 316-322, AS 317-323, AS 318-324, AS 319-325,
AS 320-326,
AS 307-314, AS 308-315, AS 309-316, AS 310-317,
AS 311-318, AS 312-319,
AS 313-320, AS 314-321, AS 315-322,
AS 316-323, AS 317-324,
AS 318-325, AS 319-326, AS 307-315,
AS 308-316, AS 309-317, AS 310-318, AS 311-319,
AS 312-320,
AS 313-321, AS 314-322, AS 315-323, AS 316-324, AS 317-325, AS 318-326, AS 307-316,
AS 308-317,
AS 309-318, AS 310-319, AS 311-320, AS 312-321,
AS 313-322, AS 314-323,
AS 315-324, AS 316-325, AS 317-326,
AS 307-317, AS 308-318,
AS 309-319, AS 310-320, AS 311-321,
AS 312-322, AS 313-323, AS 314-324, AS 315-325,
AS 316-326,
AS 307-318, AS 308-319, AS 309-320, AS 310-321, AS 311-322, AS 312-323, AS 313-324,
AS 314-325,
AS 315-326, AS 307-319, AS 308-320, AS 309-321,
AS 310-322, AS 311-323,
AS 312-324, AS 313-325, AS 314-326,
AS 307-320, AS 308-321,
AS 309-322, AS 310-323, AS 311-324,
AS 312-325, AS 313-326, AS 307-321, AS 308-322,
AS 309-323,
AS 310-324, AS 311-325, AS 312-326, AS 307-322, AS 308-323, AS 309-324, AS 310-325,
AS 311-326,
AS 307-323, AS 308-324, AS 309-325, AS 310-326,
AS 307-324, AS 308-325,
AS 309-326, AS 307-325, AS 308-326
sowie AS 395-399, AS 396-400,
AS 397-401, AS 398-402,
AS 399-403, AS 400-404, AS 401-405,
AS 402-406, AS 403-407,
AS 404-408, AS 405-409, AS 406-410, AS 407-411,
AS 408-412,
AS 409-413, AS 410-414, AS 411-415, AS 395-400, AS 396-401, AS 397-402, AS 398-403,
AS 399-404,
AS 400-405, AS 401-406, AS 402-407, AS 403-408,
AS 404-409, AS 405-410,
AS 406-411, AS 407-412, AS 408-413,
AS 409-414, AS 410-415,
AS 395-401, AS 396-402, AS 397-403,
AS 398-404, AS 399-405, AS 400-406, AS 401-407,
AS 402-408,
AS 403-409, AS 404-410, AS 405-411, AS 406-412, AS 407-413, AS 408-414, AS 409-415,
AS 395-402,
AS 396-403, AS 397-404, AS 398-405, AS 399-406,
AS 400-407, AS 401-408,
AS 402-409, AS 403-410, AS 404-411,
AS 405-412, AS 406-413,
AS 407-414, AS 408-415, AS 395-403,
AS 396-404, AS 397-405, AS 398-406, AS 399-407,
AS 400-408,
AS 401-409, AS 402-410, AS 403-411, AS 404-412, AS 405-413, AS 406-414, AS 407-415,
AS 395-403,
AS 396-404, AS 397-405, AS 398-406, AS 399-407,
AS 400-408, AS 401-409,
AS 402-410, AS 403-411, AS 404-412,
AS 405-413, AS 406-414,
AS 407-415, AS 395-404, AS 396-405,
AS 397-406, AS 398-407, AS 399-408, AS 400-409,
AS 401-410,
AS 402-411, AS 403-412, AS 404-413, AS 405-414, AS 406-415, AS 395-405, AS 396-406,
AS 397-407,
AS 398-408, AS 399-409, AS 400-410, AS 401-411,
AS 402-412, AS 403-413,
AS 404-414, AS 405-415, AS 395-406,
AS 396-407, AS 397-408,
AS 398-409, AS 399-410, AS 400-411,
AS 401-412, AS 402-413, AS 403-414, AS 404-415,
AS 395-407,
AS 396-408, AS 397-409, AS 398-410, AS 399-411, AS 400-412, AS 401-413, AS 402-414,
AS 403-415,
AS 395-408, AS 396-409, AS 397-410, AS 398-411,
AS 399-412, AS 400-413,
AS 401-414, AS 402-415, AS 395-409,
AS 396-410, AS 397-411,
AS 398-412, AS 399-413, AS 400-414,
AS 401-415, AS 395-410, AS 396-411, AS 397-412,
AS 398-413,
AS 399-414, AS 400-415, AS 395-411, AS 396-412, AS 397-413, AS 398-414, AS 399-415,
AS 395-412,
AS 396-413, AS 397-414, AS 398-415, AS 395-413,
AS 396-414, AS 397-415,
AS 395-414 und AS 396-415.
-
Ebenso
betrifft die vorliegende Erfindung funktionell angegebenen Antikörper. Der
Begriff "funktionell äquivalente
Varianten bzw. Fragmente" bezieht
sich auf alle im Fachgebiet bekannte Varianten bzw. Fragmente der
genannten Antikörper,
in denen die antigenbindende Funktion und Spezifität des Ausgangsantikörpers erhalten
ist.
-
Insbesondere
bezieht sich der letzte Begriff auf humanisierte Antikörper und
einkettige Antikörper,
wie oben definiert, sowie auf Fragmente von Antikörpern, wie
beispielsweise Fab, F'(ab)2, Fv und dergleichen. Ebenso umfaßt sind
Diabodies, Triabodies sowie tetravalente Antikörper, wie oben beschrieben,
ebenso wie mutante Formen davon oder Moleküle, die ähnliche funktionelle Bindungsreaktivitäten mit
SEQ ID No. 30 und 31 zeigen, wie beispielsweise aus Phagen- oder
anderen Bibliotheken erhaltene Sequenzen, wie von Ladner, 1995; Maclennan,
1995 und Cannon et al., 1996 beschrieben. In der Tat sind alle von
diesen Autoren beschriebenen Peptide, die den Nachweis natürlicher
HCV-Proteinantigene gestatten, eingeschränkt oder nicht, Teil der vorliegenden
Erfindung.
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft ebenso Hybridomzellinien, die wie
oben definierte Antikörper
sezernieren. Diesbezüglich
sollte klar sein, daß die
Hybridomtechnik zur Gewinnung von mAbs einem Fachmann allgemein
bekannt ist und beispielsweise im wesentlichen nach Kohler und Milstein
(1975) erfolgt. Ebenso sollte klar sein, daß die Kartierung der Epitope,
an die die mAbs spezifisch binden, mit einem beliebigen, im Fachgebiet
bekannten Verfahren, wie beispielsweise denjenigen, die in der PCT/EP
97/07268 von Depla et al. beschrieben sind, durchgeführt werden
kann.
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft ebenso ein Verfahren zum Nachweis
natürlicher
HCV-Proteinantigene, bei dem man:
- – eine Testprobe,
die HCV-Proteinantigene enthalten kann, mit einem wie oben definierten
Antikörper
oder mit einer funktionell äquivalenten
Variante bzw. einem funktionell äquivalenten
Fragment des Antikörpers unter
Ausbildung eines Antikörper-Antigen-Komplexes
in Kontakt bringt und
- – den
Antikörper-Antigen-Komplex
mit einem entsprechenden Marker bestimmt.
-
Vorzugsweise
wird das genannte Verfahren zum in-situ-Nachweis von HCV-Hüllproteinen verwendet.
-
Der
Ausdruck "den Antikörper-Antigen-Komplex
mit einem entsprechenden Marker bestimmt" bezieht sich auf ein beliebiges, im
Fachgebiet bekanntes Verfahren, mit dem man die oben angegebenen
Antigen-Antikörper-Komplexe
nachweist bzw. sichtbar macht, wie beispielsweise Fluoreszenzdurchflußcytometrie,
Tests vom Bindungs-, ELISA- und RIA-Typ oder Kompetitionstests (siehe
Beispielteil, Hertogs et al., 1993, und WO 93/04084 von Mehta et
al.). In ähnlicher
Weise bezieht sich der Begriff "entsprechender
Marker" auf einen
beliebigen im Fachgebiet bekannten Marker, wie beispielsweise denjenigen,
die in der WO 93/04084 von Mehta et al. sowie bei Coligan et al.,
1992, beschrieben sind, wobei der Marker die oben angegebenen Antigen-Antikörper-Komplexe sichtbar
macht.
-
Diesbezüglich betrifft
die vorliegende Erfindung auch einen Testkit zum Nachweis natürlicher HCV-Proteinantigene,
umfassend: einen wie oben definierten Antikörper oder eine funktionell äquivalente
Variante bzw. ein funktionell äquivalentes
Fragment des Antikörpers
sowie entsprechende Marker, die die Bestimmung der zwischen HCV-Proteinantigenen
in einer Testprobe mit dem Antikörper
bzw. einer funktionell äquivalenten
Variante bzw. einem funktionell äquivalenten
Fragment des Antikörpers
ausgebildeten Komplexe gestatten.
-
Die
vorliegende Erfindung wird im folgenden unter Bezugnahme auf die
folgenden Beispiele, in denen besonders vorteilhafte Ausführungsformen
aufgeführt
sind, veranschaulicht. Dabei sollte jedoch angemerkt werden, daß diese
Ausführungsformen
lediglich der Veranschaulichung dienen und auf keinen Fall als Beschränkung der
Erfindung zu verstehen sind.
-
BEISPIELE
-
Beispiel 1: Erzeugung
monoklonaler Antikörper
gegen E1 und E2
-
Mäuse wurden
mit verkürzten
Versionen von E1 (AS 192-326)
und E2 (AS 384-673), die jeweils durch rekombinantes Vacciniavirus
exprimiert wurden, wie in der PCT/EP 95/03031 von Maertens et al.
beschrieben, immunisiert. Nach der Immunisierung wurden Milzzellen
der Maus mit einer Myelomzellinie fusioniert. Die erhaltenen, spezifische
Antikörper
für E1
bzw. E2 sezernierenden Hybridome wurden mittels ELISA selektioniert.
-
Beispiel 2: Selektion
monoklonaler Antikörper
-
Eine
lange Reihe (insgesamt 25, davon 14 ausführlich; die letzteren können von
der Firma Innogenetics NV, Gent, Belgien, bezogen werden) von gegen
E1 bzw. E2 gerichteten monoklonalen Antikörpern wurde hinsichtlich der
Anfärbung
von nativem HCV-Antigen in Leberbiopsien von HCV-Patienten sowie
Kontrollen bewertet (siehe unten). Die Anfärbung wurde dabei entweder
an Kryoschnitten oder an mit Formaldehyd fixierten Biopsien (hinsichtlich
Vorschriften, siehe Erklärungen
zu den Abbildungen) durchgeführt.
Lediglich drei monoklonale Antikörper
zeigten eine deutliche und spezifische Anfärbung. Alle anderen monoklonalen
Antikörper ergaben
entweder keine oder nur eine sehr schwache Anfärbung oder zeigten eine unspezifische
Anfärbung. Bemerkenswerterweise
wurden zwei unterschiedliche Antigenanfär bungsmuster beobachtet. Der
gegen E2 gerichtete monoklonale Antikörper IGH 222 färbte eindeutig
Hepatocyten an (1), während IGH 207 und IGH 210,
die jeweils gegen E1 gerichtet sind, infiltrierende Lymphozyten
in der Leber anfärbten
(2a und 2b). IGH
207 färbte
auch Hepatocyten an, aber in einem geringeren Ausmaß als IGH
222 (vergleiche 1 und 2a). Dieses
Anfärbemuster
wurde an einer Reihe von Biopsien aus fünf unterschiedlichen Patienten
bestätigt.
-
-
Beispiel 3: Identifizierung
monoklonaler Antikörper,
die den Nachweis von viralem Hüllantigen
in peripheren Blutzellen gestatten
-
Die
Feststellung, daß Lymphozyteninfiltrate
in der Leber auf HCV-Hüllantigene
angefärbt
werden können,
veranlaßte
uns, auch periphere mononukleäre
Blutzellen zu betrachten. Um eine intrazelluläre Anfärbung zu gestatten, wurden
periphere Blutzellen mit Saponin permeabilisiert und anschließend mit
den monoklonalen Antikörpern
IGH 201 bzw. 207 (gerichtet gegen E1 und ein schwach bzw. stark
positives Ergebnis auf den Leberbiopsien zeigend) reagieren gelassen.
Schließlich
wurde die Reaktivität
an einem Fluoreszenzzellsortierungsgerät unter Verwendung sekundärer FITC-markierter
Antikörper überprüft. Dabei
zeigte IGH 207, der bereits die Lymphozyteninfiltrate in der Leber
anfärbt,
eine hohe Spezifität.
Mit diesem monoklonalen Antikörper wurde
fast keine Hintergrundanfärbung
nachgewiesen, wobei vier von fünf
Patienten eine eindeutig positive Anfärbung aufwiesen (3).
Der zweite monoklonale Antikörper,
IGH 201 (Bindung an SEQ ID 29 ; ECACC-Zugangsnummer: 98031216),
der ebenso gegen E1 gerichtet ist, ergab ein höheres Hintergrundsignal, doch
wurde intrazelluläres
E1 in fünf
von fünf
Patienten nachgewiesen, wie sich aus den in 4 dargestellten
Histogrammen ableiten läßt, die
eine deutliche Subpopulation von Zellen mit einem höheren Grad
an Fluoreszenz im Vergleich mit der Kontrollprobe zeigen.
-
Beispiel 4: Kartierung
der reaktiven monoklonalen Antikörper
gegen E1 oder E2
-
Alle
14 monoklonalen Antikörpern
wurden mittels Kartierung ihren jeweiligen Epitopen zugeordnet, wobei
Peptide, die das E1- und E2-Protein, gegen das die Antikörper produziert
worden waren, überstreichen, verwendet
wurden. Diese Peptide wurden biotinyliert, an Streptavidin-sensibilisierte
Mikrotiterplatten gebunden und mit den monoklonalen Antikörpern reagieren
gelassen. Als Positivkontrolle wurden rekombinante Hüllproteine überprüft.
-
Bei
jedem monoklonalen Antikörper
konnte eine Reaktivität
jeweils einem durch zwei überlappende Peptide
(hinsichtlich Einzelheiten zu den Sequenzen, siehe Tabelle (I))
definierten spezifischen Epitopbereich zugeordnet werden.
-
-
Das
Epitop für
IGH 201 läßt sich
als Bereich 212-226 (SEQ ID 29) definieren, wobei für IGH 207
und IGH 210 dieser Bereich bei 307-326 (SEQ ID 30) und für IGH 222
bei 395-415 (SEQ ID 31) liegt. Bei dem Aminosäurebereich von IGH 201 handelt
es sich um einen eher variablen Bereich des E1-Proteins von HCV,
der bereits zuvor im Zusammenhang mit dem in situ-Nachweis von HCV
erwähnt
wurde (Hiramatsu et al., 1992, Kaito et al., 1994). Allerdings geht
aus unseren Untersuchungen eindeutig hervor, daß gegen dieses Epitop gerichtete
Anti körper
sich für
den in situ-Nachweis von HCV weniger eignen, da die mit diesem Antikörper angefärbte Leberbiopsie
negativ war und die Anfärbung
auf peripheren Blutlymphozyten einen beträchtlichen Hintergrund zeigte.
Dagegen wird von IGH 207 und IGH 210 ein vollständig konservierter Bereich
von E1 erkannt (Maertens und Stuyver, 1997). Der monoklonale Antikörper IGH
222 erkennt einen Bereich von E2, bei dem es sich um einen Teil
der hypervariablen N-terminalen
Domäne
von E2 handelt und der sich als sehr geeignet für einen effizienten in situ-Nachweis
von HCV erwies.
-
Beispiel 5: Bestimmung
der Kreuzreaktivität
auf variablen Epitopen
-
Unter
Verwendung einer ausgedehnten Reihe von aus verschiedenen Sequenzen
des hypervariablen N-terminalen Epitops von E2 abgeleiteten Peptiden
wurde IGH 222 weiter charakterisiert. In Tabelle 2 ist eine Zusammenfassung
dieser Experimente dargestellt. Aus dieser Tabelle läßt sich
schließen,
daß dieser
monoklonale Antikörper
zwar mit mehreren Sequenzen reagiert, jedoch mit einigen anderen
nicht reagiert. Die Kenntnis diesem Epitops reicht dem Fachmann
aus, um zusätzliche
Antikörper
gegen dieses Epitop mit einer besseren Reaktivität gegenüber anderen Sequenzen, die
durch IGH 222 nicht erkannt werden, zu produzieren. Solche Sequenzen
sind beispielsweise die Peptide mit der Nr. 490, 940, 884, 484 und
494, doch können
in dem Bereich zwischen AS 395-415 weitere Sequenzen gefunden werden,
gegen die IGH 222 keine Reaktion zeigt.
-
Diese
Beispiele machen klar, daß die
von den monoklonalen Antikörpern
IGH 201, 207, 210 und 222 erkannten Epitope leicht für die Bindung
von Antikörpern
zugänglich
sind und den Nachweis des Antigens in Leberbiopsien und peripheren
Blutzellen gestatten. Die Eigenschaften der monoklonalen Antikörper IGH
201, 207, 210 und 222 sind ziemlich einzigartig, da andere, gegen die
gleichen Epitope gerichtete monoklonale Antikörper zu einem höheren Hintergrund
und dem Fehlen einer spezifischen Anfärbung führten. So erkennen beispielsweise
die monoklonalen Antikörper
IGH 207, 209 und 210 jeweils das gleiche Epitop, doch ist IGH 209
nicht in der Lage, E1-Antigen in irgendeinem anderen Zelltyp anzufärben, während IGH
210 lediglich Lymphozyten und IGH 207 sowohl Lymphozyten als auch
Hepatozyten anfärbt.
Mit der vorliegenden Erfindung sollte es dem Fachmann möglich sein,
eine lange Reihe von Antikörpern
(entweder polyklonaler oder monoklonaler Natur, in verschiedenen
Spezies) zu produzieren, die sich zum Nachweis natürlicher
HCV-Proteinantigene verwenden lassen.
-
Die
Notwendigkeit, eine Reihe von Antikörpern gegen ein gegebenes Epitop
zu produzieren, spiegelt die Tatsache wieder, Verhalten eines Antikörpers nicht
ausschließlich
durch das erkannte Epitop, sondern auch durch sekundäre Eigenschaften,
wie beispielsweise Affinität
und Avidität
für das
Epitop, Löslichkeit,
Isotyp sowie die Spezies, in der er erzeugt wird, bestimmt wird.
Dabei kann für
jede Anwendung jeweils ein Antikörper mit
unterschiedlichen Sekundäreigenschaften
erforderlich sein. Somit gestattet die Produktion einer derartig langen
Reihe von Antikörpern
die Identifizierung einiger dieser Antikörper, die ähnliche Eigenschaften wie IGH 201,
207, 210 und 222 aufweisen, d.h. die Möglichkeit, das Vorhandensein
von HCV-Hüllprotein
in biologischen Proben des Wirts aufzuzeigen. In der Tat wird durch
das Wissen darum, daß diese
Epitope eindeutig auf den HCV-Hüllproteinen,
wie sie im Wirt exprimiert werden, zugänglich sind, die notwendige
Information zur Entwicklung von Tests zum Nachweis dieser Antigene
nicht nur in situ, wie hier dargestellt, sondern auch in Lösung (z.b.
in Plasma oder Serum), bereitgestellt. Die monoklonalen Antikörper IGH
201, 207, 210 oder 222 oder andere gegen das gleiche Epitop entwickelte
Antikörper,
die jedoch optimale Eigenschaften für den Nachweis von löslichem Antigen
aufweisen, können
möglicherweise
in Kombination mit anderen auch zur Entwicklung eines solchen Tests
verwendet werden.
-
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