DE4209215A1 - Hcv peptidantigene und verfahren zur bestimmung von hcv - Google Patents
Hcv peptidantigene und verfahren zur bestimmung von hcvInfo
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Description
Die Erfindung betrifft neue HCV Peptidantigene, ein Verfahren
zur Herstellung dieser Peptidantigene, sowie ein Verfahren
zur Bestimmung von HCV unter Verwendung der Peptidantigene.
Das Vorkommen von Virushepatitis in Abwesenheit serologischer
Marker von bisher bekannten hepatotropen Agenzien (z. B.
Hepatitis-A-Virus, Hepatitis-B-Virus, Hepatitis-Δ-Virus,
Cytomegalie-Virus und Epstein-Barr-Virus) wird als Non-A,
Non-B-Hepatitis (NANB-Hepatitis) bezeichnet. NANB-Hepatitis
wird wiederum unterteilt in parenteral und sporadisch über
tragene Non-A, Non-B-Hepatitis und enteral übertragene Non-A,
Non-B-Hepatitis. Für die parenteral und sporadisch übertrage
ne NANB-Hepatitis wurde vor kurzem das ursächliche Agenz, das
Hepatitis-C-Virus (HCV) isoliert (Choo Q.-L. et. al. Science
244 (1989) 359-362 und Kuo, G. et. al. Science 244 (1989)
362-364).
HCV ist weltweit eine wichtige Ursache von NANB-Hepatitis und
wird durch kontaminiertes Blut oder Blutprodukte, Blutüber
tragungen oder durch engen persönlichen Kontakt übertragen.
Die Aminosäuresequenz der HCV-Virusproteine ist aus
EP-A 03 18 216, EP-A 03 63 025, EP-A 3 88 232 und EP-A 03 96 748
bekannt. Das Genom des HCV hat eine Länge von 10,862 nt.
Die durch Translation hervorgehenden Proteine besitzen eine
Gesamtlänge von ca. 3000 Aminosäuren. Die Proteine lassen
sich in Strukturproteine (Hülle- und Kernproteine) und Nicht-
Strukturproteine (NS1-NS5) einteilen.
Die Bestimmung von HCV erfolgt zweckmäßig dadurch, daß durch
immunologische Tests Antikörper gegen in Körperflüssigkeiten
HCV nachgewiesen werden. Für derartige immunologische Tests
werden deshalb Bindepartner für Anti-HCV-Antikörper benötigt.
So ist es bekannt, in immunologischen Tests beispielsweise
das nicht-strukturelle C 100-3-HCV-Protein als Bindepartner
zu verwenden (Tests von ABBOTT LABORATORIES, USA und ORTHO
DIAGNOSTIC SYSTEMS INC., USA; Science 244 (1989) 359-364;
Van der Poel C. L. et. al. Lancet 337 (1991) 317; Alter H. J. J.
Gastroent. Hepatol. (suppl.) 1990, 78).
Nachteil dieser Tests ist, daß als Antigen ein rekombinantes
Protein verwendet wird. Proteine sind wegen ihrer Denatu
rierungsanfälligkeit und damit verringerter Löslichkeit und
Funktion in diagnostischen Tests schwer zu handhaben. Auch
die Größe des Meßsignals ist aufgrund der niedrigen Epitop
dichte auf einem Protein geringer als bei einem Test, bei dem
ein kurzkettiges Peptidantigen als Bindepartner des Antikör
pers verwendet wird. Weiter können bei Verwendung von Protei
nen oder langkettigen Peptiden als Antigene in einem
immunologischen Test vermehrt Kreuzreaktivitäten und unspezi
fische Bindungen von Antikörpern auftreten. Reaktionen mit
Proteinen sind zudem oft diffusionskontrolliert, was den
erwünschten kurzen Zeiten für immunologische Tests entgegen
steht. Außerdem ist die Herstellung von für die Diagnostik
einsetzbarem Protein in ausreichender Menge und Qualität
zeitraubend und kostenintensiv. Peptide sind durch Synthese
leicht zugänglich und sind definierte Moleküle.
Es ist demzufolge vorteilhaft, in einem immunologischen Test
auf Anti-HCV-Antikörper möglichst kurzkettige Peptidantigene,
die nur Ausschnitte der gesamten Proteine darstellen, zu
verwenden. Ein derartiges immunologisches Verfahren ist von
Okamoto (Japan J. Exp. Met. 60 (1990) 223-234) beschrieben.
Es hat sich jedoch gezeigt, daß das dort beschriebene
kurzkettige Peptidantigen (SEQ ID NO: 9), welches aus der
core-Region stammt, nicht ausreichend sensitiv für HCV ist.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es deshalb, Peptid
antigene zur Verfügung zu stellen, die spezifisch für Anti-
HCV-Antikörper sind und für immunologische Tests auf Anti-
HCV-Antikörper geeignet sind.
Diese Aufgabe wird gelöst durch die Peptidantigene
1: SerGlyLysProAlaIleIleProAspArgGluValLeuTyrArgGluPheAsp
2: GluCysSerGlnHisLeuProTyrIleGluGlnGlyMetMetLeuAlaGluGlnPhe LysGlnLysAlaLeuGlyLeuLeuGlnThrAlaSerArgGln
3: AlaValGlnThrAsnTrpGlnLysLeuGluThrPheTrpAlaLysHisMetTrpAsn
4: AsnProLysProGlnLysLysAsnLysArgAsnThrAsnArgArg
5: AsnProLysProGlnArgLysThrLysArgAsnThrAsnArgArg
6: ProGlnAspValLysPheProGlyGlyGlyGlnIleValGlyGlyVal
7: ProArgGlySerArgProSerTrpGlyProThrAspProArgArg
8: GlnLeuPheThrPheSerProArgArgHisTrpThrThrGlnGlyCysAsnCys SerIleTyrProGlyHisIleThrGlyHisArgMetAlaTrpAspMetMetMet AsnTrpSerProThrThrAlaLeuValMetAla
10: GlnLysLysAlaAlaArgAsnThrAsnArgArg
11: HisTrpThrThhrGlnGlySerAsnSerSerIleTyrProGlyHis
12: SerSerIleTyrProGlyHisIleThrGlyHisArgMetAlaTrpThhrMetMet
13: ProGluGlyArgThrTrpAlaGlnProGlyTyrProTrpProLeuTyr
2: GluCysSerGlnHisLeuProTyrIleGluGlnGlyMetMetLeuAlaGluGlnPhe LysGlnLysAlaLeuGlyLeuLeuGlnThrAlaSerArgGln
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12: SerSerIleTyrProGlyHisIleThrGlyHisArgMetAlaTrpThhrMetMet
13: ProGluGlyArgThrTrpAlaGlnProGlyTyrProTrpProLeuTyr
oder Peptidantigene, die Teilsequenzen dieser Peptidantigene
von mindestens vier, vorzugsweise von mindestens 7, Aminosäu
ren Länge darstellen.
Geeignete Teilsequenzen sind in den Sequenzprotokollen
dargestellt.
Besonders bevorzugte Teilsequenzen sind:
aus SEQ ID NO: 2:
GluCysSerGlnHisLeuProTyrIleGluGlnGlyMetMetLeu
(SEQ ID NO: 2a)
MetMetLeuAlaGluGlnPheLysGlnLysAlaLeuGlyLeuLeuGlnThrAla
(SEQ ID NO: 2b)
aus SEQ ID NO: 2:
GluCysSerGlnHisLeuProTyrIleGluGlnGlyMetMetLeu
(SEQ ID NO: 2a)
MetMetLeuAlaGluGlnPheLysGlnLysAlaLeuGlyLeuLeuGlnThrAla
(SEQ ID NO: 2b)
MetMetLeuAlaGluGlnPheLysGlnLysAlaLeuGlyLeuLeuGlnThrAlaSerArg
Gln (SEQ ID NO: 2c)
HisLeuProTyrIleGlu (SEQ ID NO: 2d)
Ser Gln His Leu Pro Tyr Ile Glu Gln (SEQ ID NO: 2e)
Lys Ala Leu Gly Leu Leu Gln(SEQ ID NO: 2f)
Gln Lys Ala Leu Gly Leu Leu Gln Thr (SEQ ID NO: 2g)
aus SEQ ID NO: 4:
Lys Asn Lys Arg Asn Thr Asn Arg Arg (SEQ ID NO: 4a)
aus SEQ ID NO: 6:
ProGlnAspValLysPheProGlyGlyGlyGlnIle (SEQ ID NO: 6a)
Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Phe (SEQ ID NO: 6b)
Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val (SEQ ID NO: 6d)
Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly (SEQ ID NO: 6e)
Gln (SEQ ID NO: 2c)
HisLeuProTyrIleGlu (SEQ ID NO: 2d)
Ser Gln His Leu Pro Tyr Ile Glu Gln (SEQ ID NO: 2e)
Lys Ala Leu Gly Leu Leu Gln(SEQ ID NO: 2f)
Gln Lys Ala Leu Gly Leu Leu Gln Thr (SEQ ID NO: 2g)
aus SEQ ID NO: 4:
Lys Asn Lys Arg Asn Thr Asn Arg Arg (SEQ ID NO: 4a)
aus SEQ ID NO: 6:
ProGlnAspValLysPheProGlyGlyGlyGlnIle (SEQ ID NO: 6a)
Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Phe (SEQ ID NO: 6b)
Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val (SEQ ID NO: 6d)
Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly (SEQ ID NO: 6e)
Besonders bevorzugt werden Teilsequenzen, deren Länge maximal
9 Aminosäuren beträgt. Insbesondere sind dies die Sequenzen
SEQ ID NO: 6b, 6d, 6e, 2e, 2f, 2d, 2g, 4a.
Die Peptidantigene 1-3 sind im C 100-3-Bereich der HCV-
Proteine und die Peptidantigene 4-8, 10-13 im env/core-
Bereich der HCV-Proteine enthalten. Die erfindungsgemäßen
Peptidantigene 1-8, 10-13 und das Peptidantigen 9
(ArgGlyProArgLeuGlyValArgAlaThrArgLysThrSerGluArgSerGln
ProArgGlyArgArgGlnProIleProLysAlaArgArgProGluGlyArgThr
TrpAlaGlnProGlyTyrProTrpPro, Okamoto loc. cit) sind durch die
Sequenzprotokolle SEQ ID NO: 1-13 beschrieben.
Die Durchführung eines Anti-HCV-Antikörper-Nachweis erfolgt
nach den dem Fachmann geläufigen Methoden. Ein weiterer
Gegenstand der Erfindung ist deshalb ein Verfahren zur Be
stimmung von HCV-Antikörpern, welches dadurch gekennzeichnet
ist, daß die Probe mit einer Kombination von mindestens zwei
Peptidantigenen aus der Gruppe SEQ ID NO: 1-13 oder Peptid
antigenen, die Teilsequenzen dieser Peptidantigene von
mindestens vier, vorzugsweise von mindestens 7, Aminosäuren
Länge darstellen, inkubiert und unter Bedingungen, die die
Bildung eines Antikörper-Antigenkomplexes ermöglichen, die
Menge der an das Peptidantigen gebundenen Anti-HCV-Antikörper
bestimmt wird.
Erfindungsgemäß wird eine Kombination von mindestens zwei der
erfindungsgemäßen Peptidantigene oder Teilsequenzen davon
verwendet. Besonders bevorzugt ist es, die Peptidantigene
SEQ ID: 1-3 oder Teilsequenzen davon mit mindestens einem
Peptidantigen aus der Gruppe SEQ ID: 4-13 oder Teilsequen
zen davon zu kombinieren.
Geeignete Teilsequenzen von SEQ ID NO: 9 sind:
ArgGlyProArgLeuGlyValArgAlaThrArgLysThrSerGlnArgSerGlnProArg
Gly (SEQ ID NO: 9a)
SerGlnProArgGlyArgArgGlProIleProLysAlaArgArgProGluGlyArgThr (SEQ ID NO: 9b).
Lys Ala Arg Arg Pro Glu Gly Arg Thr Trp Ala Gln Pro Gly Tyr (SEQ ID NO: 9c)
SerGlnProArgGlyArgArgGlProIleProLysAlaArgArgProGluGlyArgThr (SEQ ID NO: 9b).
Lys Ala Arg Arg Pro Glu Gly Arg Thr Trp Ala Gln Pro Gly Tyr (SEQ ID NO: 9c)
Die Kombination der Antigene kann beispielsweise dadurch
erfolgen, daß mehrere einzelne Peptidantigene verwendet
werden oder daß Peptidantigene kovalent, zweckmäßig über eine
Aminosäurenbrücke, die sich von den natürlicherweise in den
HCV-Proteinen vorkommenden Aminosäuren-Sequenzfolgen unter
scheidet oder einen Peptid-Linker, aneinander gebunden sind.
Besonders bevorzugt sind Kombinationen der Antigene:
SEQ ID NO: 2b, 4 und 6
SEQ ID NO: 2b, 2c, 4 und 6
SEQ ID NO: 2a, 2b, 2c, 4 und 6
SEQ ID NO: 2a, 2b, 2c, 4, 6, 9a und 9b
SEQ ID NO: 2a, 2b, 4, 6, 9a und 3
SEQ ID NO: 2a, 2b, 4, 6 und 9a
SEQ ID NO: 2e, 2g, 4a, 6d, 6e
SEQ ID NO: 2d, 2f, 4a, 6c, 9c
SEQ ID NO: 11, 12, 8a
SEQ ID NO: 2b, 2c, 4 und 6
SEQ ID NO: 2a, 2b, 2c, 4 und 6
SEQ ID NO: 2a, 2b, 2c, 4, 6, 9a und 9b
SEQ ID NO: 2a, 2b, 4, 6, 9a und 3
SEQ ID NO: 2a, 2b, 4, 6 und 9a
SEQ ID NO: 2e, 2g, 4a, 6d, 6e
SEQ ID NO: 2d, 2f, 4a, 6c, 9c
SEQ ID NO: 11, 12, 8a
Die Antigene in den Kombinationen werden bevorzugt in etwa
gleichen molaren Mengen verwendet.
Die Kombination der Antigene SEQ ID NO: 11, 12, 8a ist beson
ders geeignet zur Erkennung von Seren von Patienten, bei
denen eine HCV-Infektion ausgeheilt ist (Rekonvaleszenz
seren).
Vorzugsweise werden die Antigene einzeln, ohne kovalente
Bindung aneinander, oder kovalent aneinander gebunden unter
Verwendung eines Peptid-Linkers eingesetzt.
Auf Grund der erhöhten Empfindlichkeit, die bei dem Infekti
onsparameter HCV notwendig ist, werden vorzugsweise zum Nach
weis heterogene Immunoassays verwendet. Diese heterogenen
Tests erlauben Waschschritte, die den Meßsignal-Hintergrund
erheblich reduzieren wodurch die Empfindlichkeit gesteigert
wird.
Beispielsweise kann die Bestimmung durch einen Radio-Immuno
assay, Enzym-Immunoassay oder durch Immunfloureszenz er
folgen. Üblicherweise wird hierzu das Peptidantigen immobili
siert. Die Probe, welche auf Anti-HCV-Antikörper untersucht
werden soll, wird zugegeben und die an das Antigen gebundenen
Antikörper über einen markierten Anti-Human-Immunglobulin-
Antikörper bestimmt. Die Immobilisierung des erfindungsge
mäßen Peptidantigens kann adsorbtiv, kovalent oder über ein
biologisches Bindungspaar wie Biotin/Streptavidin, Antikör
per/Antigen, oder Zucker/Lektin erfolgen. Dabei wird das
Peptidantigen an diesen Partner kovalent gebunden.
Die erfindungsgemäßen Peptidantigene werden vorzugsweise nach
den dem Fachmann geläufigen Methoden beispielsweise an Kugeln
(beads), Kunststoffröhrchen oder Mikrotiterplatten (bevorzugt
Polystyrol oder Copolymere von Polystyrol) immobilisiert.
Dies erfolgt vorzugsweise dadurch, daß das Peptidantigen
unspezifisch an der Oberfläche adsorbiert oder kovalent an
funktionalisierte oder aktivierte Oberflächen gebunden wird.
Die unspezifische Adsorption kann dadurch verbessert werden,
daß man das Peptidantigen mit einem Protein zu einem Konjugat
verknüpft und dieses Konjugat zur Adsorption verwendet (vgl.
z. B. EP-A 02 69 092). Die Bindung kann auch über einen immo
bilisierten Antikörper erfolgen. Dazu sollte das Peptidanti
gen so verändert werden, daß das Epitop nicht durch die
Bindung des Antikörpers blockiert wird z. B. durch Bildung
eines Peptid-Protein-Konjugats.
Die Konjugation des Peptidantigens an den Bindungspartner
erfolgt vorzugsweise über einen Spacer. Dieser Spacer enthält
zweckmäßig 10-50, vorzugsweise 10-30 Atome und ist eben
falls bevorzugt ein (im wesentlichen) lineares Molekül.
Beispiele hierfür sind Spacer aus Alkyl-, Polyether- oder
Polyamidketten. In einer besonders bevorzugten Ausführungs
form ist ein Peptidantigen einer Länge von 4-9 Aminosäuren
über einen linearen Spacer von 10-30 Atomen an den Träger
gebunden. Falls ein Spacer aus Aminosäuren verwendet werden
soll, besteht dieser zweckmäßig aus Aminosäuren, die nicht
der Sequenzfolge in unmittelbarer Umgebung des Peptidantigens
im HCV-Gen entsprechen.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das erfindungs
gemäße Peptidantigen kovalent an Biotin gebunden, wobei die
Immobilisierung über eine Avidin/Streptavidin-Festphase
erfolgt.
Ebenso geeignet sind Bestimmungsverfahren, bei denen die De
tektion nicht über einen markierten Antikörper, sondern über
ein markiertes, weiteres Peptidantigen SEQ ID NO: 1-13 oder
Teilsequenzen davon erfolgt.
Die Herstellung der erfindungsgemäßen Peptidantigene ist nach
den dem Fachmann geläufigen Methoden zur Peptidsynthese mög
lich. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist deshalb ein
Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemäßen Peptid
antigens, welches darin besteht, daß die das C-terminale Ende
bildende Aminosäure an einen Träger gebunden wird, vom C-ter
minalen Ende das Peptidantigen schrittweise aufgebaut und an
schließend vom Träger abgespalten wird.
Im einzelnen wird dazu eine Aminosäure beispielsweise über
ihre Carboxygruppe an ein unlösliches, leicht filtrierbares
Polymer geknüpft, und dann vom C-terminalen Ende her die
Peptidkette schrittweise aufgebaut. Zu diesem Zweck wird eine
N-geschützte Aminosäure mit einer reaktiven Gruppierung des
Kunstharzes zur Reaktion gebracht. Von der am Trägerpartikel
kovalent verankerten Aminosäure wird die Nα-Schutzgruppe
entfernt und das resultierende Aminoacylpolymer mit der
nächsten N-geschützten Aminosäure umgesetzt. Von dem am
Trägerharz kovalent gebundenen Dipeptid wird die Nα-Schutz
gruppe entfernt und das resultierende Aminoacylpolymer mit
der nächsten N-geschützten Aminosäure umgesetzt. Alle
überschüssigen Reagentien und Beiprodukte werden durch
einfaches Filtrieren entfernt. Ist die gewünschte Peptid
sequenz auf diese Weise hergestellt, wird die kovalente
Bindung zwischen der C-terminalen Aminosäure und der Anker
gruppierung des polymeren Trägers gespalten. Der unlösliche
Träger wird durch einfache Filtration von dem nun in Lösung
befindlichen Peptid entfernt. Das Peptid wird mittels chroma
tographischer Methoden gereinigt.
Beispielsweise können die erfindungsgemäßen Peptidantigene
nach Merrifield, JACS 85 (1964) 2146 hergestellt werden. Eine
gegebenenfalls erforderliche Biotinylierung kann beispiels
weise nach PNAS USA 80 (1983) 4045 erfolgen. Ein bevorzugtes
Biotinylierungsmittel hierfür ist Biotinylaminocapronsäure-N
hydroxysuccinimidester.
Ein bevorzugtes Verfahren zur Herstellung von biotinylierten
Peptidantigenen ist die Einführung des Biotinrestes am N-Ter
minus während einer Festphasensynthese des Peptidantigens.
Dieses Verfahren wird bevorzugt dann verwendet, wenn das
Peptidantigen mehrere ε-Lysin-Aminogruppen enthält, die nicht
biotinyliert werden sollen. Dies ist beispielsweise dann der
Fall, wenn man N-α-Fmoc-N-ε-biotinyl-aminocaproyl)lysin, N-α-
Fmoc-N-ε-Biotinyllysin oder bei Biotinylierung der N-termina
len Aminosäuren Biotin, Biotinylaminocapronsäure oder
Dimethoxytritylbiotin mit einem Aktivierungsreagenz wie zum
Beispiel Dicyclohexylcarbodiimid oder als Aktivester ein
setzt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird ein Nach
weisantikörper der beispielsweise gegen den Fc-Teil von huma
nem IgG gerichtet ist, immobilisiert. Vorzugsweise wird
hierzu ein monoklonaler Antikörper verwendet. Das Peptidanti
gen befindet sich dann in Lösung. Der nachzuweisende Antikör
per (Analyt) und auch alle anderen Antikörper der
Probenflüssigkeit werden vom Wandantikörper gebunden. Der ge
bundene Antikörper kann dann den Analyten binden, der mit
einem geeigneten Nachweissystem, z. B. kompetitiv mit einem
Peptidantigen-Enzymkonjugat nachgewiesen werden kann.
Mit den erfindungsgemäßen Peptidantigenen ist es auch mög
lich, durch die dem Fachmann geläufigen Verfahren der Immuni
sierung Antikörper zu erhalten, mit denen das Virus selbst in
einem immunologischen Test nachgewiesen werden kann.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist deshalb ein Verfah
ren zur Herstellung von Antikörpern, welches dadurch gekenn
zeichnet ist, daß ein Säugetier mit einem erfindungsgemäßen
Peptid, welches gegebenenfalls an einen Träger gebunden ist,
immunisiert wird und die Antikörper nach bekannten Verfahren
z. B. aus dem Serum oder der Milz gewonnen werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden B-Lymphozyten der
immunisierten Tiere in Gegenwart von transformierenden Agen
zien mit einer geeigneten Zellinie fusioniert, die Zellinie,
welche die gewünschten Antikörper produziert, kloniert und
kultiviert und aus den Zellen oder dem Kulturüberstand die
monoklonalen Antikörper gewonnen.
Mit diesem Antikörper ist es möglich, HCV-Viren direkt zu be
stimmen. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist deshalb
ein Verfahren zur Bestimmung von HCV-Viren, welches dadurch
gekennzeichnet ist, daß die Probe mit einem erfindungsgemäßen
Antikörper unter Bedingungen, die eine Antigen-Antikörperkom
plexbildung erlauben, inkubiert, und die Menge des gebildeten
Antikörper-Antigenkomplexes bestimmt wird.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur
Herstellung von Impfstoffen unter Verwendung der erfindungs
gemäßen Peptidantigene sowie ein Vakzin zur Behandlung von
HCV-Infektionen, enthaltend als Immunogen ein gegebenenfalls
trägergebundenes Peptidantigen SEQ ID NO: 1-8, 10-13 oder
Teilsequenzen davon oder mindestens zwei Peptidantigene SEQ
ID NO: 1-13 oder Teilsequenzen davon in einer pharmakolo
gisch effektiven Dosis und in einer pharmazeutisch akzep
tablen Formulierung.
Die Herstellung dieser Impfstoffe kann nach den bekannten Me
thoden durchgeführt werden. Bevorzugt werden jedoch die Pep
tidantigene zunächst lyophilisiert und anschließend, ggf.
unter Zusatz von Hilfsstoffen, suspendiert.
Die Impfung mit dem erfindungsgemäßen Vakzin oder Vakzin
kombinationen kann durch die dem Fachmann geläufigen Methoden
erfolgen, beispielsweise intradermal, intramuskulär, intra
peritoneal, intravenös, subkutan und intranasal.
Zur intramuskulären oder subkutanen Gabe kann das Vakzin bei
spielsweise in physiologischer Kochsalzlösung suspendiert
sein. Zur intranasalen oder intraoccularen Applikation kann
das Vakzin, beispielsweise in Form eines Sprays oder einer
wäßrigen Lösung angewendet werden. Für lokale, beispielsweise
orale Gabe ist es häufig erforderlich, die Immunogene zeit
weise gegen Inaktivierung zu schützen, beispielsweise gegen
proteolytische Enzyme in der Mundhöhle oder im Magen. Ein
derartiger vorübergehender Schutz kann beispielsweise durch
Verkapselung der Immunogene erfolgen. Diese Verkapselung kann
beispielsweise durch Überziehen mit einem Schutzmittel
(Mikroverkapselung) oder bei Einbettung einer Vielzahl von
erfindungsgemäßen Immunogenen in einen schützenden Träger
(Makroverkapselung) erfolgen.
Das Verkapselungsmaterial kann semipermiabel sein oder beim
Einbringen in den menschlichen oder tierischen Körper semi
permeabel werden. Üblicherweise wird für die Verkapselung
eine biologisch abbaubare Substanz als Träger verwendet.
Die nachfolgenden Beispiele und Sequenzprotokolle erläutern
die Erfindung weiter.
Das Peptid wurde mittels Fmoc-Festphasensythese hergestellt.
Die Reaktionen wurden an einem Labortec (Schweiz) SP 640
(Fluorenylmethyloxycarbonyl) Peptidsynthesizer durchgeführt.
Die Kupplungsreaktionen wurden bezüglich Fmoc-Aminosäure-
Derivat mit 2.2 Äquivalenten Dicyclohexylcarbodiimid und 2.2
Äquivalenten N-Hydroxybenzotriazol während 90 Minuten durch
geführt. Als Reaktionsmedium kam Dimethylformamid zum
Einsatz. Die Fmoc-Gruppe wurde mittels 20% Piperiden in DMF
in 10 und 20 Minuten abgespalten. 2.0 Äquivalente von den
folgenden Aminosäure-Derivaten kamen zum Einsatz: Pro,
Arg (mit PMC (Pentamethylchroman)-Schutzgruppe), Gly, Ser (mit
tert.-Butyl-Schutzgruppe), Trp, Thr (mit tert.-Butyl-Schutz
gruppe), Asp (mit tert.-Butylester-Schutzgruppe). Die
Kupplungsreaktionen wurden mit der Hälfte der Reagentien
wiederholt. Der Kupplungserfolg wurde mittels Kaiser-Test
(Anal. Biochemistry 34 (1970) 595) geprüft, die Harzbeladung
wurde mittels UV-Absorption der freigesetzten Fulven-Gruppe
nach jeder Piperidin-Spaltung ermittelt. Das Peptid wurde an
5 g Wang-Harz (Polystyrol/1% Divinylbenzol) mit einer Ladung
von 0.50 mMol/g synthetisiert (JACS, 95 (1973) 1328). Nach der
Synthese betrug der Beladungsgrad noch 0.39 mMol/g.
Die Freisetzung des Peptids wurde mit 200 ml Trifluoressig
säure, 200 ml Dichlormethan, 10 ml Ethandithiol, 10 ml m-Kre
sol, 5 ml Ethylmethylsulfid und 5 ml Wasser in 30 Minuten bei
Raumtemperatur. Die Abspaltlösung wurde mehrmals mit Toluol
eingeengt, dann das Peptid mit Diethylether gefällt.
Zur Entfernung der Scavenger und anderer kleiner Moleküle
wurde das Rohmaterial über eine Sephadex G10-Säule gereinigt.
Es wurden nach Lyophilisieren 3.2 g Material einer Reinheit
von 42% (RP-HPLC) erhalten. Um das Material auf die Endrein
heit von <95% zu bringen, wurden 400 mg Peptid über eine
präparative RP-HPLC-Säule (40mmx250mm) gefüllt mit C18-Mate
rial (5 Mikrometer, 300 Angström) und einem Was
ser/Trifluoressigsäure-,Acetonitril/Trifluoressigsäure-
Gradienten gereinigt. Es fielen nach Lyophilisation 118 mg
96.5%iges (HPLC) weißes Material an. Die Identität des Mate
rials wurde mittels FAB-MS geprüft.
Zur Biotinylierung des Peptidantigens aus Beispiel 1 wird ein
Moläquivalent möglichst konzentriert (Löslichkeit ist von der
Aminosäuresequenz abhängig) in Argon-gesättigtem Kaliumphos
phatpuffer (0,1 mol/l, pH 8,0) gelöst und mit 3 Äquivalenten
D-Biotinyl-ε-aminocapronsäure-N-hydroxysuccinimidester gelöst
in Argon-gesättigtem Dimethylformamid (Lösung von 1 µmol Re
agenz in 5 µl DMF) versetzt.
Man rührt das Reaktionsgemisch 2 Stunden bei Raumtemperatur
unter Argon unter ständiger Kontrolle mittels analytischer
RP-HPLC. Wenn <5% Edukt vorhanden sind wird der Reaktionsan
satz direkt auf eine präparative RP-HPLC-Säule gegeben und
das Produktmaterial mittels einem 0.1% Trifluoressigsäu
re/Wasser- zu 0.1% Trifluoressigsäure/Acetonitril-Gradienten
(Steigung: 0% auf 100% in 90 Minuten) gereinigt. Das Produkt
material wird durch Einengen und Lyophilisation der Produkt
fraktionen erhalten. Die Ausbeuten liegen zwischen 40% und
90%. Als Analytik dienen für die Reinheit HPLC, HPCE und TLC,
für die Identität FAB-MS (Molpeak) und TLC mit spezifischen
Anfärbereagentien (p-Dimethylaminozimtaldehyd auf Biotin) und
Gehaltsbestimmung über Mikroanalyse (Nitrogen).
HCV-Antikörper werden in einem 2-Schritt-Sandwich-Immunoassay
bestimmt. Zum Nachweis werden die Reagentien mit folgender
Zusammensetzung verwendet:
Reagenz 1:
0.10 µg/ml (Peptidantigene 1, 3, 4, 5, 6) oder 0.25 µg/ml (Peptidantigene 2, 4, 7), biotinyliertes Peptidantigen oder eine 1 : 1 Mischung solcher Peptidantigene
0.10 µg/ml (Peptidantigene 1, 3, 4, 5, 6) oder 0.25 µg/ml (Peptidantigene 2, 4, 7), biotinyliertes Peptidantigen oder eine 1 : 1 Mischung solcher Peptidantigene
40 mmol/l Phosphatpuffer pH 7.0
0.9 Gew.-% NaCl
10 Vol.-% Rinderserum
0.9 Gew.-% NaCl
10 Vol.-% Rinderserum
Reagenz 2:
20 mU/ml eines Konjugats aus polyklonalem Antikörper gegen humanes Immunglobulin (Schaf) und Peroxidase
20 mU/ml eines Konjugats aus polyklonalem Antikörper gegen humanes Immunglobulin (Schaf) und Peroxidase
40 mmol/l Phosphatpuffer pH 7.0
0.05 Gew.-% Tween® 20
0.05 Gew.-% Tween® 20
0.2% Rinderserumalbumin
0.2% Rinder-IgG
0.2% Rinder-IgG
In einem mit Streptavidin beschichteten Polystyrolröhrchen
(hergestellt nach Beispiel 1 von EP-A 03 44 578) werden 1 ml
Reagenz 1 und 10 µl Probe eine Stunde bei Raumtemperatur in
kubiert. Anschließend wird dreimal mit Leitungswasser gewa
schen und mit 1 ml Reagenz 2 für eine Stunde bei Raumtempe
ratur inkubiert. Anschließend wird dreimal mit Leitungswasser
gewaschen. Zur Nachweisreaktion werden 1 ml ABTS® (2,2′-
Azino-di-(3-ethyl-benzthiazolinsulfonat(6))-Diammoniumsalz,
1,9 mmol/l, in 100 mmol/l Phosphatcitratpuffer pH 4.4 mit 3.2
mmol/l Natrium-perborat) zugegeben. Nach 60 min wird die
Extinktion bei 420 nm photometrisch gemessen. Die Ergebnisse
zeigt Tabelle 1.
Serum 1 war negativ im Test im Ortho-HCV-Antikörper ELISA-Test
system von ORTHO DIAGNOSTIC SYSTEMS INC. jedoch positiv aufgrund
des klinischen Bildes.
Die Seren 2-5 wurden nach dem Test von Ortho Laboratories, die
Seren 6 und 7 mit dem ABBOTT HCV EIA, Kat.No. 3 A53-24, ABBOTT
LABORATORIES INC. als positiv identifiziert.
Die Peptidantigene 1-6 wurden mit Dimethoxytrityl-Biotin fest
phasenbiotinyliert an der ε-Aminogruppe eines zusätzlich N-termi
nal eingeführten Lysins.
Die Peptidantigenmischungen 1+4 und 3+6 wurden in einem mola
ren Mischungsverhältnis von 1 : 1 eingesetzt.
Es wurden weitere Seren mit Peptiden und Peptidmischungen in
einem Zweischritt-Sandwich-Immunoassay auf mit Streptavidin
beschichteten Mikrotiterplatten geprüft.
Die Durchführung der Bestimmung erfolgte weitgehend analog
Beispiel 3. Dabei wurden folgende Reagentien verwendet:
Reagenz 1:
50 ng Peptid (oder die in den Tabellenerklärungen genannten Mengen) in 100 µl Inkubationspuffer (40 mmol/l Phosphatpuffer, pH 7,0, 0,9 Gew.-% NaCl, 10 Vol.-% Rinderserum.
Reagenz 2:
Konjugat aus polyklonalem Antikörper gegen humanes Immunglobulin (Schaf) undd Peroxidase (Peroxidaseaktivität 20 mU/ml), 40 mmol/l Phosphatpuffer pH 7,0, 0,05 Gew.-% Tween® 20, 0,2% Rinderserumalbumin, 0,2% Rinder-IgG.
Reagenz 1:
50 ng Peptid (oder die in den Tabellenerklärungen genannten Mengen) in 100 µl Inkubationspuffer (40 mmol/l Phosphatpuffer, pH 7,0, 0,9 Gew.-% NaCl, 10 Vol.-% Rinderserum.
Reagenz 2:
Konjugat aus polyklonalem Antikörper gegen humanes Immunglobulin (Schaf) undd Peroxidase (Peroxidaseaktivität 20 mU/ml), 40 mmol/l Phosphatpuffer pH 7,0, 0,05 Gew.-% Tween® 20, 0,2% Rinderserumalbumin, 0,2% Rinder-IgG.
Waschlösung
40 mmol/l Phosphatpuffer pH 7,0, 0,9 Gew.-% Natriumchlorid, 0,05 Gew.-% Tween® 20.
40 mmol/l Phosphatpuffer pH 7,0, 0,9 Gew.-% Natriumchlorid, 0,05 Gew.-% Tween® 20.
Farbreagenz
10 mg ABTS®, 80 µl 0,4% H₂O₂ in 10 ml Citrat-Phosphatpuffer (pH 4,4, 100 mmol/l).
10 mg ABTS®, 80 µl 0,4% H₂O₂ in 10 ml Citrat-Phosphatpuffer (pH 4,4, 100 mmol/l).
Pro Napf (well) einer mit Streptavidin beschichteten Mikrotiter
platte werden Serum (1 : 10 verdünnt in 50 µl Inkubationspuffer
und 100 µl Reagenz 1 zugegeben. Es wird eine Stunde bei Raumtem
peratur inkubiert und anschließend fünfmal mit je 200 µl Waschlö
sung gewaschen. Es werden 150 µl Reagenz 2 zugegeben, eine Stunde
bei Raumtemperatur inkubiert und dreimal mit je 200 µl Waschlö
sung gewaschen. Es werden 150 µl Farbreagenz zugegeben, eine
Stunde bei Raumtemperatur inkubiert und die Extinktion bei 420 nm
photometrisch gemessen.
Die Tabellen II, III, IV, V und VI zeigen die Ergebnisse.
In den Tabellen bedeuten:
Tabelle II:
Ortho: relative Größe des Meßsignals im Test von Ortho (vgl.
Beispiel 3).
Leeres Feld: Meßwert kleiner als zweifacher Leerwert oder identisch mit Leerwert (bestimmt mit biotinyliertem, mit HCV-Antikörpern nicht reaktivem Peptid (nonsens-Sequenz)).
Voller Kreis: Meßwert dreifacher Leerwert oder größer bei 50 ng Peptid pro Napf.
Leerer Kreis: Meßwert zweifacher Leerwert bei 50 ng Peptid pro Napf.
Volles Quadrat: Meßwert dreifacher Leerwert oder größer bei 250 ng Peptid pro Napf.
Leeres Quadrat: Meßwert zweifacher Leerwert oder größer bei 250 ng Peptid pro Napf.
*: Negativkontrollen.
Leeres Feld: Meßwert kleiner als zweifacher Leerwert oder identisch mit Leerwert (bestimmt mit biotinyliertem, mit HCV-Antikörpern nicht reaktivem Peptid (nonsens-Sequenz)).
Voller Kreis: Meßwert dreifacher Leerwert oder größer bei 50 ng Peptid pro Napf.
Leerer Kreis: Meßwert zweifacher Leerwert bei 50 ng Peptid pro Napf.
Volles Quadrat: Meßwert dreifacher Leerwert oder größer bei 250 ng Peptid pro Napf.
Leeres Quadrat: Meßwert zweifacher Leerwert oder größer bei 250 ng Peptid pro Napf.
*: Negativkontrollen.
Tabelle III
Leeres Feld: wie Tabelle II.
Voller Kreis: Meßwert vierfacher Leerwert oder größer bei 50 ng Peptid pro Napf.
Leerer Kreis: Meßwert dreifacher Leerwert oder größer als 50 ng Peptid pro Napf.
n.t.: Messung nicht durchgeführt.
2a, 2b, 3, 4, 6: Anstelle eines einzelnen Peptidantigens wurde in Reagenz 1 eine Mischung aus je 10 ng der genannten Peptide verwendet.
*: Negativkontrollen.
Voller Kreis: Meßwert vierfacher Leerwert oder größer bei 50 ng Peptid pro Napf.
Leerer Kreis: Meßwert dreifacher Leerwert oder größer als 50 ng Peptid pro Napf.
n.t.: Messung nicht durchgeführt.
2a, 2b, 3, 4, 6: Anstelle eines einzelnen Peptidantigens wurde in Reagenz 1 eine Mischung aus je 10 ng der genannten Peptide verwendet.
*: Negativkontrollen.
Tabelle IV
Die Bedeutung der Symbole entspricht den Angaben zu Tabelle II.
Die Peptidmischungen enthielten jeweils 50 ng der einzelnen Peptide.
Die Seren S1, S9 und S22 sind negativ im Ortho-Test, jedoch positiv aufgrund des klinischen Bildes.
Die Peptidmischungen enthielten jeweils 50 ng der einzelnen Peptide.
Die Seren S1, S9 und S22 sind negativ im Ortho-Test, jedoch positiv aufgrund des klinischen Bildes.
Tabellen V, Vi und VII
Ergebnisse von Immunoassays analog Beispiel 3, wobei im Reagenz 1
folgende Peptidkonzentrationen eingesetz wurden:
Bei Verwendung von mehreren Antigenen in Kombination werden die Einsatzmengen entsprechend der Anzahl der verschiedenen Antigene reduziert.
Bei Verwendung von mehreren Antigenen in Kombination werden die Einsatzmengen entsprechend der Anzahl der verschiedenen Antigene reduziert.
SEQ ID NO: 2a 50 µg/ml
SEQ ID NO: 2b 50 µg/ml
SEQ ID NO: 2b 50 µg/ml
| SEQ ID NO: 2d | |
| 100 µg/ml | |
| SEQ ID NO: 2f | 100 µg/ml |
| SEQ ID NO: 2h | 100 µg/ml |
| SEQ ID NO: 4 | 400 µg/ml |
| SEQ ID NO: 4a | 350 µg/ml |
| SEQ ID NO: 4b | 250 µg/ml |
| SEQ ID NO: 4c | 300 µg/ml |
| SEQ ID NO: 6 | 350 µg/ml |
| SEQ ID NO: 6a | 350 µg/ml |
| SEQ ID NO: 6b | 350 µg/ml |
| SEQ ID NO: 6c | 250 µg/ml |
| SEQ ID NO: 6d | 300 µg/ml |
| SEQ ID NO: 8a | 900 µg/ml |
| SEQ ID NO: 9a | 350 µg/ml |
| SEQ ID NO: 9c | 350 µg/ml |
| SEQ ID NO: 11 | 300 µg/ml |
| SEQ ID NO: 12 | 550 µg/ml |
+/-: pos./neg. (Der Cutoff für ein positives Signal im Immunoassay
wie Beispiel 3 ist definiert als die mittlere Extinktion bei
420 nm plus 2 Standardabweichungen eines Kollektivs von 6 negativen
Kontrollseren. Die Proben sind mit Inkubationspuffer 1 : 100
verdünnt.)
Claims (16)
1. HCV Peptidantigene mit den Aminosäuresequenzen
SEQ ID NO: 1-8, 10-13 oder mit Teilsequenzen davon
mit mindestens 4 Aminosäuren Länge.
2. HCV Peptidantigene nach Anspruch 1 mit Teilsequenzen von
maximal 9 Aminosäuren Länge.
3. HCV Peptidantigene nach Anspruch 2 mit den Teilsequenzen
SEQ ID NO: 6b, 6d, 6e, 2e, 2f, 2d, 2g, 4a.
4. HCV Peptidantigene gemäß Anspruch 1 mit den Teilsequen
zen SEQ ID NO: 2a, 2b, 2c, 2h, 4b, 6a, 6c, 8a.
5. Kombination von HCV-Peptidantigenen aus
SEQ ID NO: 2b, 4 und 6
SEQ ID NO: 2b, 2c, 4 und 6
SEQ ID NO: 2a, 2b, 2c, 4 und 6
SEQ ID NO: 2a, 2b, 2c, 4, 6, 9a und 9b
SEQ ID NO: 2a, 2b, 4, 6, 9a und 3
SEQ ID NO: 2a, 2b, 4, 6 und 9a
SEQ ID NO: 2e, 2g, 4a, 6d, 6e
SEQ ID NO: 2d, 2f, 4a, 6c, 9c oder
SEQ ID NO: 11, 12, 8a.
SEQ ID NO: 2b, 4 und 6
SEQ ID NO: 2b, 2c, 4 und 6
SEQ ID NO: 2a, 2b, 2c, 4 und 6
SEQ ID NO: 2a, 2b, 2c, 4, 6, 9a und 9b
SEQ ID NO: 2a, 2b, 4, 6, 9a und 3
SEQ ID NO: 2a, 2b, 4, 6 und 9a
SEQ ID NO: 2e, 2g, 4a, 6d, 6e
SEQ ID NO: 2d, 2f, 4a, 6c, 9c oder
SEQ ID NO: 11, 12, 8a.
6. Verfahren zur Herstellung von Peptidantigenen nach den
Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die das
C-terminale Ende bildende Aminosäure an einen Träger
gebunden wird, vom C-terminalen Ende das Peptidantigen
schrittweise aufgebaut und anschließend vom Träger abge
spalten wird.
7. Verfahren zur Bestimmung von HCV-Antikörpern, dadurch
gekennzeichnet, daß die Probe mit einer Kombination von
mindestens zwei Peptidantigenen aus der Gruppe SEQ ID
NO: 1-13 oder Peptidantigenen, die Teilsequenzen
dieser Peptidantigene von mindestens 4 Aminosäuren Länge
darstellen, inkubiert und, unter Bedingungen, die die
Bildung eines Antikörper-Antigenkomplexes ermöglichen
die Menge der an das Peptidantigen gebundenen HCV-Anti
körper bestimmt wird.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß
die Kombination mindestens ein Peptidantigen mit 4-9
Aminosäuren Länge enthält, welches eine Teilsequenz von
SEQ ID NO: 1-13 darstellt.
9. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß
eine Kombination von mindestens zwei HCV-Antigenen aus
der Gruppe SEQ ID NO: 1, 2, 2a, 2b, 2c, 2d, 2e, 2f, 2g,
2h, 3, 4, 4a, 4b, 5, 6, 6a, 6b, 6c, 6d, 6e, 7, 8, 9, 9a,
9b, 9c, 10, 11, 12, 13 verwendet wird.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß
als Kombinationen
SEQ ID NO: 2b, 4 und 6
SEQ ID NO: 2b, 2c, 4 und 6
SEQ ID NO: 2a, 2b, 2c, 4 und 6
SEQ ID NO: 2a, 2b, 2c, 4, 6, 9a und 9b
SEQ ID NO: 2a, 2b, 4, 6, 9a und 3
SEQ ID NO: 2a, 2b, 4, 6 und 9a
SEQ ID NO: 2e, 2g, 4a, 6d, 6e
SEQ ID NO: 2d, 2f, 4a, 6c, 9c oder
SEQ ID NO: 11, 12, 8a
verwendet werden.
SEQ ID NO: 2b, 4 und 6
SEQ ID NO: 2b, 2c, 4 und 6
SEQ ID NO: 2a, 2b, 2c, 4 und 6
SEQ ID NO: 2a, 2b, 2c, 4, 6, 9a und 9b
SEQ ID NO: 2a, 2b, 4, 6, 9a und 3
SEQ ID NO: 2a, 2b, 4, 6 und 9a
SEQ ID NO: 2e, 2g, 4a, 6d, 6e
SEQ ID NO: 2d, 2f, 4a, 6c, 9c oder
SEQ ID NO: 11, 12, 8a
verwendet werden.
11. Verfahren zur Herstellung von Antikörpern gegen HCV-
Antigene, dadurch gekennzeichnet, daß ein Säugetier mit
einem gegebenenfalls trägergebundenen Peptidantigen
SEQ ID NO: 1-8, 10-13 oder einer Teilsequenz davon
immunisiert wird, polyklonale Antikörper gewonnen werden
oder Zellen dieser Tiere, die Antikörper produzieren, zu
Zellinien immortalisiert werden und aus diesen Zellinien
monoklonale Antikörper gewonnen werden.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß
als Peptidantigene, die Teilsequenzen darstellen, SEQ ID
NO: 1, 2, 2a, 2b, 2c, 2d, 2e, 2f, 2g, 2h, 3, 4, 4a, 4b,
5, 6, 6a, 6b, 6c, 6d, 6e, 7, 8, 9, 9a, 9b, 9c, 10, 11,
12, 13 verwendet werden.
13. Verfahren zur Bestimmung von HCV-Viren, dadurch gekenn
zeichnet, daß die Probe mit einem Antikörper nach
Anspruch 11 oder 12 unter Bedingungen, die eine Antigen-
Antikörperkomplexbildung erlauben, inkubiert wird, und
die Menge des gebildeten Antikörper-Antigenkomplexes
bestimmt wird.
14. Vakzin zur Behandlung von HCV-Infektionen, enthaltend
ein gegebenenfalls trägergebundenes Peptidantigen SEQ OD
NO: 1-8, 10-13 oder mindestens zwei Peptidantigene
SEQ ID NO: 1-13 oder Peptidantigene, die Teilsequenzen
dieser Peptidantigene von mindestens 4 Aminosäuren Länge
darstellen als Immunogen, in einer pharmakologisch
effektiven Dosis und in einer pharmazeutisch akzeptablen
Formulierung.
15. Vakzin nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß als
Peptidantigene, die Teilsequenzen
SEQ ID NO: 2b, 4 und 6
SEQ ID NO: 2b, 2c, 4 und 6
SEQ ID NO: 2a, 2b, 2c, 4 und 6
SEQ ID NO: 2a, 2b, 2c, 4, 6, 9a und 9b
SEQ ID NO: 2a, 2b, 4, 6, 9a und 3
SEQ ID NO: 2a, 2b, 4, 6 und 9a
SEQ ID NO: 2e, 2g, 4a, 6d, 6e
SEQ ID NO: 2d, 2f, 4a, 6c, 9c
SEQ ID NO: 11, 12, 8a
verwendet werden.
SEQ ID NO: 2b, 4 und 6
SEQ ID NO: 2b, 2c, 4 und 6
SEQ ID NO: 2a, 2b, 2c, 4 und 6
SEQ ID NO: 2a, 2b, 2c, 4, 6, 9a und 9b
SEQ ID NO: 2a, 2b, 4, 6, 9a und 3
SEQ ID NO: 2a, 2b, 4, 6 und 9a
SEQ ID NO: 2e, 2g, 4a, 6d, 6e
SEQ ID NO: 2d, 2f, 4a, 6c, 9c
SEQ ID NO: 11, 12, 8a
verwendet werden.
16. Verfahren zur Herstellung von Impfstoffen unter Verwen
dung der Peptidantigene SEQ ID NO 1-8, 10-13 oder
von mindestens zwei der Peptidantigene SEQ ID NO:
1-13 oder Peptidantigene, die Teilsequenzen dieser
Peptidantigene von mindestens 4 Aminosäuren Länge
darstellen, als Immunogene.
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