CZ20003461A3 - Epitopy virových obalových proteinů a specifické protilátky proti těmto epitopům namířené: použití pro detekci virového antigenu HCV v hostitelské tkáni - Google Patents

Abstract

Protilátky proti dvěma novým epitopům obalových proteinů HCV, které umožňují rutinní detekci nativních obalových antigenů HCV ve tkáni nebo buňkách pocházejících z hostitele. Nové epitopyjsou: oblast El aa 307-326 a Nkoncová hypervariabilní oblast E2 aa 395-415. Protilátka, která reaguje s různými sekvencemi hypervariabilní domény E2. jsou popsány specifické monoklonální protilátky namířené proti těmto epitopům a umožňující rutinní detekci virového antigenu.

Description

Epitopy virových obalových proteinů a specifické protilátky proti těmto epitopům namířené: použití pro detekci virového antigenu HCV v hostitelské tkáni

Oblast techniky

Předkládaný vynález je založen na objevu, že protilátky namířené proti specifickým epitopům proteinů El a E2 z HCV mohou být použity k detekci virových antigenů v hostitelských tkáních.

Dosavadní stav techniky

Infekce virem hepatitidy C (HCV) je závažný zdravotní problém jak v rozvojových, tak v rozvinutých zemích. Odhaduje se, že přinejmenším 1 až 5 % světové populace je postiženo virem. Ukazuje se, že infekce HCV je nejdůležitější příčina hepatitid spojených s transfúzí a často progreduje do chronického jaterního poškození. Kromě toho existuje důkaz pro vztah HCV k indukci hepatocelulárního karcinomu. Proto poptávka po spolehlivých diagnostických metodách a účinných léčebných přípravcích je značná. Také jsou potřebné citlivé a specifické metody pro screening HCV-kontaminovaných krevních produktů a zlepšené metody kultivace HCV.

HCV je pozitivní vláknitý RNA virus o přibližně 9 400 bazích, které kódují alespoň tři strukturální a šest nestrukturálních proteinů. Na základě sekvenční homologie, strukturální proteiny byly funkčně určeny jako jeden jádrový protein a dva obalové proteiny: El a E2. Protein El se skládá ze 192 aminokyselin a obsahuje 5 až 6 N-glykosylačních míst, v závislosti na genotypu HCV. Protein E2 se skládá z 363 až 370 aminokyselin a obsahuje 9 až 11 N-glykosylačních míst, v závislosti na genotypu HCV (pro přehled viz Major a Feinstone, 1997; Maertens a Stuyver, 1997). Protein -El obsahuje různé variabilní domény, zatímco protein E2 obsahuje dvě hypervariabilní domény, ze kterých hlavní doména je umístěna v N-koncové části proteinu (Maertens a Stuyver, 1997). Obalové .proteiny byly vytvořeny rekombinantními technikami v Escherichia coli, hmyzích buňkách, kvasinkách a savčích buňkách. Použití expresního systému v kulturách vyšších eukaryot a zejména v savčích buňkách vedlo ke tvorbě obalových proteinů lepší kvality, tj. byly účinně rozpoznávány protilátkami ve vzorcích od pacientů, jak popsáno v PCT/EP 95/03031, Maertens et al.

V současné době detekce HCV v buňkách nebo tkáních spočívá hlavně v průkazu virové RNA. Avšak detekce RNA v buňkách nebo tkáních je těžkopádná technika, která buď vyžaduje izolaci RNA následovanou reverzní transkripcí a hnízdovou (nested) polymerázovou řetězovou reakcí (PCR) nebo zahrnuje in šitu RT-PCR a hybridizaci. Protože tyto techniky jsou také náchylné k falešně pozitivní reaktivitě, detekce virové RNA je výlučně prováděna na vzorcích séra. Spolehlivé způsoby detekce virových proteinových antigenů v séru a vzorcích tkáně stále chybí.

Replikační místa HCV ještě nejsou plně objasněna. Je obecně uznáváno, že virus se replikuje v hepatocytech, ale replikace v jiných tkáních, jako v lymfoidní tkáni, se ještě velice diskutuje. Proto může spolehlivý způsob detekce virových proteinů nebo viru samotného v buňkách vyřešit tuto spornou otázku.

Detekce virových proteinů v buňkách byla omezována nedostatkem protilátek, které specificky vážou virové proteiny a které jsou schopny specificky rozpoznat přirozené HCV proteinové antigeny (tj. antigeny, jak jsou exprimovány hostitelem po infekci HCV). V důsledku toho se dodnes pouze málo studií týká průkazu virových HCV proteinů systémem, aby poskytovaly V současné době je tato v hostitelských buňkách (pro přehled viz Guido a Tnung, 1996). Navíc v mnoha těchto studiích byly použity protilátky pocházející z hostitele. Přípravky obsahující protilátky pocházející z hostitele ale nemohou být snadno reprodukovány a tyto ·přípravky mohou být kontaminované autoimunitními protilátkami, jakož i protilátkami proti dalším známým 'nebo dokonce neznámým agens. Na rozdíl od toho je známo, že protilátky tvořené ve zvířatech po imunizaci rekombinantními antigeny budou poskytovat protilátky s požadovanou specifitou. Aby byla dosažena reprodukovatelná kvalita, jsou rovněž preferovány monoklonální protilátky. Navíc obalové proteiny HCV potřebují být produkovány savčím expresním antigeny spolehlivé kvality, podmínka exprese doprovázena nepochopitelnými problémy. Proto bylo popsáno pouze málo monoklonálních protilátek, které mohou být použity k detekci HCV obalových antigenů ve vzorku tkáně pacientů. Tyto protilátky byly namířeny proti N-koncové oblasti El, aminokyseliny (aa) 192 . až 226 (aa 192-226), (Hiramatsu et al., 1992, Kaito et al., 1994) nebo C-koncové doméně E2 aa 451-715 (Sansonno et al., 1997a, 1997b). Ale z těchto publikací a přehledů autorů Guido a Thung (1996) a Liang (1996) je očividné, že stále existuje potřeba dobře charakterizované protilátky umožňující účinnou a rutinní detekci přirozených HCV proteinových antigenů v séru a vzorcích tkáně. Tato potřeba byla nedávno potvrzena studií Driese a spolupracovníků (1999). Driesova skupina dokázala, že 61 % jedinců s pozitivním vyšetřením na HCV protilátku a negativním na RNA v séru byli nosiči HCV, protože ve vzorcích jaterní biopsie byla detekována HCV RNA, ale pouze jedna třetina těchto případů byla detekována immunohistochemickou technikou s použitím panelu protilátek. Tudíž rutinní detekci HCV antigenu v jaterních biopsiích .

stále chybí citlivost. Také detekce virových antigeňů v tělesných tekutinách, jako je sérum nebo plazma,je omezovaná stejným problémem. Doposud byla popsána pouze jedna jednoduchá technika umožňující detekci jádrového antigenu v těchto tekutinách. Ale pro detekci - jádrového proteinu tato technika vyžaduje kompletní denaturaci jádrového proteinu přítomného ve vzorku s použitím hydroxidu sodného (Kashiwakuma et al., 1996).

Vzato dohromady, je proto nutně zapotřebí identifikace nových specifických HCV epitopů, které jsou dostupné pro protilátky a které umožňují detekci antigenu ve vzorcích tkáně nebo tělesné tekutiny. HCV obalové proteiny jsou předpokládané kandidátské cíle pro nalezení takových epitopů, protože tyto proteiny by měly být přítomny ve všech biologických vzorcích: v tekutinách, na membráně viru a v buňkách od nejčasnějšího okamžiku infekce (tj. vstupu viru), od počátku do konce kompletního replikačního cyklu. Ale, tyto obalové proteiny jsou vysoce variabilní, takže jsou potřebné protilátky s vysokou křížovou reaktivitou pro různé genotypy HCV. Tudíž identifikace takových epitopů a hledání protilátek s vysokou křížovou reaktivitou pro změny sekvence HCV je stimulující úkol.

Předkládaná přihláška se týká specifických monoklonálních protilátek namířených proti konkrétním epitopům v obalových proteinech HCV, které jsou schopny detekovat HCV antigen ve vzorcích tkáně pacientů. Byly nalezeny celkem dva takové epitopy a odpovídající protilátky: jeden v C-koncové oblasti (aa 227-383) obalového proteinu El a jeden v N-koncové hypervariabilní oblasti (HVR) E2 (aa 384450). Ačkoliv posledně zmíněná oblast, a konkrétněji oblast 395-415, je považovaná za hypervariabilní, původci vynálezu překvapivě popsali protilátku, která reaguje s různými známými sekvencemi HVR E2.

Podstata vynálezu

Z literatury je jasné, že existuje urgentní potřeba pro vývoj spolehlivých diagnostických metod, spolehlivých vakcín a účinných léčebných přípravků pro HCV. Jsou také zapotřebí senzitivní a specifické screeningové metody pro krevní produkty kontaminované HCV a zlepšené metody pro kultivaci HCV. Nové protilátky schopné detekovat virus ve zvířecích nebo in vitro modelech nebo v přirozeném hostiteli mohou pomoci při návrhu účinného diagnostického nástroje a léčebných přípravků. Z tohoto ohledu je předkládaný vynález založený na překvapivém objevu monoklonálních protilátek namířených proti buď El nebo E2-HVR, které mohou být použity pro detekci HCV antigenu v různých tkáních nebo buňkách. Tyto tkáně zahrnují játra, ale také buňky pocházející z krevních vzorků.

Předkládaný vynález se tudíž týká protilátky specificky vázající oblast HCV obalového proteinu zahrnující aminokyseliny 227 až 450 (aa 227-450), která zahrnuje hlavní část (C-koncovou část) proteinu El, a N-koncovou oblast proteinu E2 a také použití této protilátky. Tyto protilátky umožní detekci přirozených HCV proteinových antigenů a mohou být použity pro přípravu soupravy pro detekci přirozených HCV proteinových antigenů. Jmenovitě kompletní protein El odpovídá aa 192-383, zatímco kompletní protein E2 odpovídá aa 384-747 (viz: Major a Feinstone, 1997, Maertens a Stuyver, 1997) .

Konkrétněji se předkládaný vynález poskytuje protilátku a její použití, jak je definovaná výše, kterážto protilátka se specificky váže k alespoň jednomu z následujících epitopů: -aa 307-326 z HCV proteinu El (sekvence id. č. 30)

-aa 395-415 z HCV proteinu E2 (sekvence id. č. 31) .

⁶

Kromě toho se předkládaný vynález týká protilátky, jak je definovaná výše, která je monoklonální protilátka, a jejího použití. V tomto ohledu předkládaný vynález poskytuje monoklonální protilátku secernovanou hybridomovou .linií, která je uložena v ECACC a má přístupové číslo 98031215 nebo 98031214, a dále použití této protilátky.

Je jasné, že předkládaný vynález se také týká každé funkčně rovnocenné varianty nebo fragmentu každé takové protilátky, jak je definována výše, jakož i její mutované formy, nebo molekul projevujících podobnou funkční vazebnou reaktivitu se sekvencemi id. č. 30 a 31, jako jsou sekvence získané z fágových nebo jiných knihoven.

Kromě toho se předkládaný vynález poskytuje hybridomovou buněčnou linii secernující monoklonální protilátku, která se specificky váže k HCV proteinu El (aa 227-383) nebo HCV E2 N-koncové hypervariabilní oblasti (aa 384-450) a která umožňuje detekci přirozených HCV proteinových antigenu a může být použita pro přípravu soupravy pro detekci přirozených HCV proteinových antigenu, a týká se také použití této hybridomové linie. Konkrétněji se předkládaný vynález týká hybridomové buněčné linie odpovídající linii, která je uložena v ECACC a má přístupové číslo 98031215 nebo 98031214.

Dále předkládaný vynález poskytuje způsobu detekce přirozených HCV proteinových antigenů, který obsahuje:

kontakt testovaného vzorku, který může obsahovat HCV proteinové antigeny, s protilátkou, jak je definována výše, nebo s funkčně rovnocennou variantou či fragmentem uvedené protilátky za vzniku komplexu protilátka-antigen, a zjištění uvedených komplexů antigen-protilátka vhodným markeřem.

Konkrétněji se předkládaný vynález týká způsobu, jak je definován výše, kdy uvedený testovaný vzorek obsahuje lidské \

buňky,, například buňky periferní krve, nebo lidské tkáně, například jaterní tkáň. .....

Nakonec předkládaný vynález poskytuje testovací soupravu pro detekci přirozených HCV proteinových antigenů, která obsahuje:

- ·< protilátku, jak je definována výše, nebo funkčně rovnocennou variantu nebo fragment uvedené protilátky, a příslušné markéry, které umožní zjištění komplexu utvořeného mezi HCV proteinovými antigeny v testovaném vzorku a uvedenou protilátkou nebo funkčně rovnocennou variantou nebo fragmentem uvedené protilátky.

Příklady provedení vynálezu, uvedené dále, jsou v souladu se všemi zmíněnými předměty předkládaného vynálezu.

Vynález zde popsaný čerpá z dříve publikovaných prací a projednávaných patentových přihlášek. Příklady takové práce jsou vědecké články, patenty nebo projednávané patentově přihlášky. Všechny tyto publikace a přihlášky, citované výše v textu nebo níže, jsou zahrnuty v odkazech.

Je jasné, že detekce virových proteinů byla omezována nedostatkem protilátek, které specificky proteiny a které jsou schopny rozpoznat vázou virové přirozené HCV proteinové antigeny (tj . antigeny, jak jsou exprimovány hostitelem po infekci HCV). Předkládaný vynález se týká nálezu dvou nových epitopů HCV obalových proteinů, které umožňují rutinní detekci přirozených HCV proteinových antigenů pomocí protilátek namířených proti těmto epitopům v biologických vzorcích pocházejících z hostitele. Předkládaný vynález se tedy týká použití protilátek, které se specificky vážou k C-koncové oblasti HCV proteinu El (aa 227383) nebo k N-koncové oblasti HCV proteinu E2 (aa 384-450) pro přípravu soupravy pro detekci přirozeného HCV proteinového antigenu. Termín „protilátky, které se „protilátky

Termín specificky vážou k C-koncov^ oblasti HCV proteinu El (aa 227383) nebo k N-koncové oblasti HCV proteinu E2 (aa 384-450) se týká každé polyklonální nebo monoklonální protilátky, která se váže na virové částice hepatitidy C nebo každé molekuly pocházející z uvedené virové částice, konkrétněji k C-koncové oblasti proteinu El a N-koncové oblasti - proteinu E2. „Obalová oblast virů HCV, a tedy „C-koncová oblast HCV proteinu El (aa 227-383) nebo N-koncová oblast HCV proteinu E2 (aa 384-450) jsou pro odborníka známé oblasti (Wengler, 1991, Major a Feinstone, 1997, Maertens a Stuyver, 1997).

Termín „váže se označuje, že protilátky podle předkládaného vynálezu jsou fyzikálně spojeny s HCV proteiny. Zejména, že se protilátky specificky vážou k HCV obalovým proteinům, z čehož vyplývá, že zde není v podstatě křížová reaktivita s dalšími složkami HCV nebo jinými proteiny. Vazba protilátky k HCV proteinům může být prokázána každou metodou nebo testem v oboru známých, jako jsou vazebné testy, a testy typu ELISA a RIA nebo kompetitivní testy (např. viz Current protocols in immunology). Je jasné, že oblast HCV obalového proteinu, která se váže k protilátce, nepotřebuje být složena ze sousedních sekvencí.

Termín „monoklonální protilátka zde používaný se týká protilátkového přípravku, který má homogenní populaci protilátek. Termín není omezen, co se týče druhu nebo zdroje protilátek, ani není úmyslem omezovat způsob, kterým jsou vytvořeny. Kromě toho se termín „protilátka také týká humanizovaných protilátek, ve kterých alespoň část oblasti rámce imunoglobulinu pochází ze sekvencí lidského imunoglobulinu a jednořetězcových protilátek, jak je popsáno v patentu Spojených Států č. 4 946 778, a fragmentů protilátek, jako jsou F_ab, F(_ab)2, F_v, a dalších fragmentů, které podržely antigenní vazebnou funkci a specifitu základní protilátky. V termínu „protilátka jsou také zahrnuty divalentní, trivalentní a tetravalentní protilátky, jak popsáno v EP přihlášce č. 97870092, Lorré et al., které si podržely antigenní vazebnou funkci a specifitu základní protilátky. Je jasné, že protilátky, jak jsou popsány v předkládaném vynálezu, mohou být použity ve způsobu detekce přirozených HCV proteinových antigenů. .

Termín „testovaný vzorek se týká každého vzorku získaného od hostitele, jako je sérum, plazma, sliny, hlen, mozkomíšní mok nebo biopsie. V tomto ohledu jsou termíny „testovaný vzorek a „biologický vzorek zde používány zaměnitelně. Termín „biopsie se konkrétně týká vzorku obsahujícího buňky, obzvláště lidské buňky. Kromě toho se tento termín týká také vzorku pocházejícího z tekuté tkáně, jako jsou buňky periferní krve, nebo z pevné tkáně, jako je jaterní tkáň. V případě, že detekce antigenů se provádí na biopsii, je použit termín „detekce in sítu.

Termín „souprava pro detekci přirozeného HCV proteinového antigenů se týká soupravy pro detekci každého HCV proteinového antigenů, výhodně detekci C-koncové oblasti HCV proteinu El (aa227-383) nebo N-koncové oblasti HCV proteinu E2 (aa384-450) v jejich přirozené nebo původní pozici, přednostně antigenů, jak se vyskytují v testovaném vzorku, každou metodou odborníkovi známou. Jinými slovy, posledně zmíněný termín se týká vizualizace přítomnosti C-koncové oblasti HCV proteinu El (aa 227-383) nebo N-koncové oblasti HCV proteinu E2 (aa 384-450) v jejich přirozené hostitelské buňce nebo tkáni nebo na nich, vazbou protilátek podle předkládaného vynálezu. Detekční souprava zahrnuje následující složky:

(i) prostředky pro izolaci testovaného vzorku, když je to třeba (ii) případně roztok pro permeabilizaci buněk, • ·

- \;^: (iii) protilátku, jak je popsaná v tomto textu, nebo její funkčně rovnocennou variantu nebo fragment, ............

(iv) případně sekundární a terciární protilátky, (v) případně inkubační a/nebo promývací pufry, (vi) případně barvicí roztok.

Výhodně je uvedená souprava používaná pro - in šitu detekci HCV obalových proteinů.

Přirozená hostitelská buňka nebo tkáň může být každá hostitelská buňka nebo tkáň pocházející z kteréhokoliv hostitelského druhu. Termín přirozená hostitelská buňka se zejména týká buněk periferní krve a přirozené tkáň se týká jaterní tkáně (viz také část Příklady předkládané přihlášky). Přirozený hostitel se týká především lidí, ale může se také týkat primátů kromě člověka nebo dalších savců.

Konkrétněji se předkládaný vynález týká protilátek, které se specificky vážou na alespoň jeden z následujících epitopů: aa 307-326 HCV proteinu El a aa 395-415 HCV proteinu E2. Posledně zmíněné protilátky jsou secernované hybridomy uloženými v European Collection of Cell Cultures (ECACC), Centre for Applied Microbiology & Research, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, Velká Británie (tel: +44 1980 612512; fax: +44 1980 611315), 13. března, 1998, kterým byla přidělena následující přístupová čísla: 98031215 pro hybridom

17II10F4D10 secernující mAb IGH 222, která váže epitop aa395415 (sekvence id. č. 31), a 98031214 pro hybridom 14H11B2 secernující mAb IGH 207, která váže epitop aa307-326 (sekvence id. č. 30) . V tomto ohledu by mělo být jasné, že protilátky, které se vážou na části uvedených epitopů, jsou také částí předkládaného vynálezu. Například, protilátky vázající se k následujícím epitopům jsou také zahrnuty: aa307-311, aa308-312, aa309-313, aa310-314, aa311-315, aa312316, aa312-317, aa313-318, aa314-319, aa315-320, aa316-321, aa317-322, aa318-323, aa319-324, aa320-325, aa321-326, aa30711

312, aa308-313, aa309-314, aa310-315, aa311-316, aa312-317, aa313-318, aa314-319, aa315-320, aa316-321, aa317-322, aa318323, aa319-324, aa320-325, aa321-326, aa307-313, aa308-314, aa309-315, aa310-316, aa311-317, aa312-318, aa313-319, aa314320, aa315-321, aa316-322, aa317-323, aa318-324, aa319-325, aa320-326, aa307-314, aa308-315, aa309-316, aa310-317, aa311318, aa312-319, aa313-320, aa314-321, aa315-322, aa316-323, aa317-324, aa318-325, aa319-326, aa307-315, aa308-316, aa309317, aa310-318, aa311-319, aa312-320, aa313-321, aa314-322, aa315-323, aa316-324, aa317-325, aa318-326, aa307-316, aa308317, aa309-318, aa310-319, aa311-320, aa312-321, aa313-322, aa314-323, aa315-324, aa316-325, aa317-326, aa307-317, aa308318, aa309-319, aa310-320, aa311-321, aa312-322, aa313-323, aa314-324, aa315-325, aa316-326, aa307-318, aa308-319, aa309320, aa310-321, aa311-322, aa312-323, aa313-324, aa314-325, aa315-326, aa307-319, aa308-320, aa309-321, aa310-322, aa311323, aa312-324, aa313-325, aa314-326, aa307-320, aa308-321, aa309-322, aa310-323, aa311-324, aa312-325, aa313-326, aa307321, aa308-322, aa309-323, aa310-324, aa311-325, aa312-326, aa307-322, aa308-323, aa309-324, aa310-325, aa311-326, aa307323, aa308-324, aa309-325, aa310-326, aa307-324, aa308-325, aa309-326, aa307-325, aa308-326, a, aa395-399, aa396-400, aa397-401, aa398-402, aa399-403, aa400-404, aa401-405, aa402406, aa403-407, aa404-408, aa405-409, aa406-410, aa407-411, aa408-412, aa409-413, aa410-414, aa411-415, aa395-400, aa396401, aa397-402, aa398-403, aa399-404, aa400-405, aa401-406, aa402-407, aa403-408, aa404-409, aa405-410, aa406-411, aa407412, aa408-413, aa409-414, aa4l0-415, aa395-401, aa396-402, aa397-403, aa398-404, aa399-405, aa400-406, aa401-4Q7, aa402408, aa403-409, aa404-410, aa405-411, aa406-412, aa407-413, aa408-414, aa409-415, aa395-402, aa396-403, aa397-404, aa398405, aa399-406, aa400-407, aa401-408, aa402-409, aa403-410, aa404-411, aa405-412, aa406-413, aa407-414, aa408-415, aa395·· ^;··

·· ·.

• · '· ·.

• .· · '

- ··;;.·

403, aa396-404, aa397-405, aa398-406, aa399-407, aa400-408, aa401-409, aa402-410, aa403-411, . aa404-412, aa405-413, aa406414, aa407-415, aa395-403, aa396-404, aa397-405, aa398-406, aa399-407, aa404-408, aa401-409, aa402-410, aa403-411, aa404412, aa405-413, aa406-414, aa407-415, aa395-404, aa396-405, aa397-406, aa398-407, aa399-408, aa400-409,. aa401-410, aa402411, aa403-412, aa404-413, aa405-414, aa406-415, aa395-405, aa396-406, aa397-407, aa398-408, aa399-409, aa400-410, aa401411, aa402-412, aa403-413, aa404-414, aa405-415, aa395-406, aa396-407, aa397-408, aa398-409, aa399-410, aa400-411, aa401412, aa402-413, aa403-414, aa404-415, aa395-407, aa396-408, aa397-409, aa398-410, aa399-411, aa400-412, aa401-413, aa402414, aa403-415, aa395-408, aa396-409, aa397-410, aa398-411, aa399-412, aa400-413, aa401-414, aa402-415, aa395-409, aa396410, aa397-411, aa398-412, aa399-413, aa400-414, aa401-415, aa.395-410, aa396-411, aa397-412, aa398-413, aa399-414, aa400415, aa395-411, aa396-412, aa397-413,. aa398-414, aa399-415, aa395-412, aa396-413, aa397-414, aa398-415, aa395-413, aa396414, aa397-415, aa395-414 a 396-415.

Předkládaný vynález se také týká funkčně rovnocenných variant nebo fragmentů výše uvedených protilátek. Termín „funkčně rovnocenné varianty nebo fragmenty se vztahuje ke každé variantě nebo fragmentu uvedených protilátek v oboru známých, které si uchovají antigenní vazebnou funkci a specifitu základní protilátky.

Konkrétněji se posledně zmíněný termín týká humanizovaných protilátek a jednořetězcových protilátek, jak je definováno výše, a fragmentů protilátek, jako jsou F_ab, F(ab)2r F_v, apod. Jsou také zahrnuty divalentní, trivalentní a tetravalentní protilátky, jak je popsáno výše, jakož i jejich mutované formy, nebo molekuly projevující podobnou funkční vazebnou reaktivitu se sekvencemi id. č. 30 a 31, jako jsou sekvence získané z fágových nebo jiných knihoven,

• · • •	• •	9 4 4 •	« '· ·	4 · •	4 9	• * 9 9 .· ·
• 9	« •
•	•				. ·	•	• - '·
• ·		• · ·	• 4 4	*'· ·	··		9 4

jak je popsáno autory Ladner, 1995, Maclennan, 1995 a Cannon et al., 1996. Skutečně každý peptid popsaný těmito autory, přirozený nebo ne, který umožňuje detekci přirozených HCV proteinových antigenů, je částí předkládaného vynálezu.

Předkládaný vynález se také týká hybridomových buněčných linií secernujících protilátky, jak jsou definovány výše. V tomto ohledu by mělo být jasné, že technika hybridomů pro získávání mAbs je odborníkovi dobře známá, např. v podstatě podle autorů Kohler a Milstein (1975). Mělo by také být jasné, že mapování epitopů, na které se mAbs specificky vážou, může být prováděno každou metodou v oboru známou, jako jsou metody popsané v PCT/EP 97/07268, Depla et al.

Předkládaný vynález se také týká způsobu detekce přirozených HCV proteinových antigenů, který zahrnuje:

- kontakt testovaného vzorku, který možná obsahuje HCV proteinové antigeny, s protilátkou, jak je definována výše, nebo s funkčně rovnocennou variantou nebo fragmentem uvedené protilátky tak, aby se vytvořil komplex protilátka-antigen, a

- určování uvedeného komplexu antigen-protilátka vhodným markérem.

Výhodně je uvedený způsob používaný pro in sítu detekci HCV obalových proteinů.

Termín určující uvedený komplex antigen-protilátka vhodným markérem se týká každého způsobu v oboru známého, který detekuje nebo vizualizuje shora uvedené komplexy antigen-protilátka, jako je fluorescenční průtoková cytometrie, vazebné testy, testy typu ELISA a RIA nebo kompetitivní testy (viz část Příklady, Hertogs et al., 1993, a WO 93/04084, Mehta et al.). Podobně termín vhodný markér týká se k každého markéru v oboru známého, jako jsou markéry popsané ve WO 93/04084, Mehta et al. a Coligan et al., 1992, které vizualizují shora uvedené komplexy antigen-protilátka.

φ Φ ' · ·* · φ .φ _: • « · φ Φ · φ φφφ Φ • φ. φ . φ · · φφ také týká proteinových

ΦΦ φ · φ · ·» • Φ e Φ · · • Φ · * • 9 · Φ · • φ · · φφ φφφ φφφ

V tomto ohledu se předkládaný vynález testovací - soupravy pro detekci přirozených HCV antigenů, která zahrnuje: protilátku/ jak je definována výše, nebo funkčně rovnocennou variantu nebo fragment: uvedené protilátky, a vhodné markéry, které umožní zjištění komplexů vytvořených mezi HCV' proteinovými antigeny v testovaném vzorku s uvedenou protilátkou nebo funkčně rovnocennou variantou nebo fragmentem uvedené protilátky.

Předkládaný vynález bude teď podrobněji vysvětlen pomocí následujících příkladů, které vyloží obzvlášť výhodná provedení. Avšak mělo by být poznamenáno, že tato provedení jsou pouze ilustrující a nemohou být jakkoliv vykládána jako omezující vynález..

Popis obrázků

Tabulka 1 poskytuje peptidové sekvence všech peptidů uvedených v této přihlášce.

Tabulka 2 ukazuje křížovou reaktivitu IGH 222 pro různé sekvence hypervariabilní domény v E2. Všechny peptidy byly biotinylovány, navázány na streptavidinem potažené mikrotitrační destičky a ponechány reagovat s IGH 222.

Obrázek 1 ukazuje barvení antigenu E2 odkrytého prostřednictvím monoklonální protilátky. IGH 222 v jaterní biopsii pacienta s HCV. Imunohistochemické vyšetření se provádělo na 4 pm silných kryostatických řezech z čerstvě zmrazeného materiálu (jaterní biopsie byla bleskově zmražena v tekutém dusíku s izopentanem a uložena v -70 °C do použití) s. použitím troj stupňového nepřímého imuno-peroxidázového postupu. Řezy byly inkubovány přes noc ve 4 °C s monoklonální protilátkou IGH 222 (purifikovaný IgGi, 10 ng/μΐ). Sekundární a terciární protilátky sestávaly z králičího proti-myšího lg konjugovaného s peroxidázou á prasečího proti-králičího lg ·· · * · · · · · # • ·'· - ·• · · .9

9. 'λ*·'...

konjugovaného s peroxidázou, v daném pořadí (oba získané -od firmy Dakopatts, Kodaň, Dánsko, pracovní roztok 1/50 a 1/100, v daném pořadí). Každá inkubace se prováděla 30-minut při teplotě místnosti a byla následována trojitým promytím. ve fyziologickém roztoku pufrovaném fosfáty, pH 7,2. Reakční produkt byl vyvíjen inkubací 15 minut ve 100 mM acetátovém pufru ,_f (pH 5,2), obsahujícím 0,05% 3-amino-9-etyl-karbazol a 0,01% H₂O₂, což mělo za následek jasně červené zbarvení imunoreaktivních míst. Řezy byly obarveny hematoxylinem jako kontrastní barvou. Kontroly (neukázáno) se skládaly z irelevantních monoklonálních protilátek podobného izotypu jako primární protilátka nebo ze samotného chromogenu, tyto kontroly byly shodně negativní. Fotografie ukazuje 25 x zvětšení. Nej tmavější barvení odhalilo výskyt antigenu HCV pouze v hepatocytech (viz šipky).

Obrázek 2A ukazuje barvení antigenu El odhaleného monoklonální protilátkou IGH 207 v jaterní biopsii pacienta s HCV. Sledovaný postup je totožný s postupem popsaným u obrázku 1, až na koncentraci monoklonální protilátky, která byla 30 ng/μΙ. Snímek ukazuje 10 x zvětšení, při kterém je dominantní barvení buněk v infiltrátech lymfocytů. Nej tmavší barvení ukázalo výskyt HCV antigenu v hepatocytech' (viz šipka) a v infiltrujících lymfocytech (viz dvojitá šipka).

Obrázek 2B ukazuje barvení antigenu El odhaleného monoklonální protilátkou IGH 210 v jaterní biopsii pacienta s HCV. Jaterní biopsie byla fixována formaldehydem a zalita parafínem. Řezy byly předběžně zpracovány teplem (mikrovlnná metoda) a štěpením proteázou. Koncentrace protilátky byla 6 ng/μΙ. Snímek ukazuje zřetelně obarvenou izolovanou mononukleární buňku (šipka) v poli hepatocytů, které se touto monoklonální protilátkou neobarvily.

Obrázek 3 ukazuje barvení odhalené monoklonální protilátkou IGH 207 intracelulárního antigenu El

v mononukleárních buňkách periferní krve. Periferní bílé krvinky (0,5xl0⁶) byly suspendovány ve 200 μΐ PBS s 0,-1% saponinem, byly přidány 2 pg IGH 207 a ponechány reagovat 20 minut ve 4°C. Buňky byly třikrát promyty se 3 ml PBS s 0,1% saponinem a třikrát s PBS-0,2% NaN₃. Nakonec byly buňky resuspendovány ve 250 μΐ PBS-0.2% NaN₃ a analyzovány průtokovou cytometrií. Po oddělení frakce mononukleárních buněk (pravý sloupec) byla fluorescence vynesena do grafu (levý sloupec). Vzorky 1-5 pocházejí od chronických nosičů HCV, zatímco vzorek 6 pochází z krve zdravého jedince. Levý sloupec ukazuje dva příklady oddělení frakce mononukleárních buněk (vzorky 2 a 6), zatímco pravý sloupec ukazuje fluorescenci zjištěnou v těchto mononukleárních buňkách. Zatímco kontrolní vzorek neukazuje vůbec žádné barvení touto monoklonální protilátkou, u všech HCV pacientů je zřetelný pozitivní signál, až na pacienta 4, u kterého byl získán slabší signál.

Obrázek 4 ukazuje barvení odhalené monoklonální protilátkou IGH201 intracelulárního antigenu El v mononukleárních buňkách periferní krve. Technika byla stejná jak je popsáno pro obrázek 3. Vzorky 7-11 pochází od HCV chronických nosičů, zatímco vzorek 12 pochází oč zdravého jedince. Levý sloupec ukazuje dva příklady oddělení frakce mononukleárních buněk (vzorky 7 a 12), zatímco pravý sloupec ukazuje fluorescenci zjištěnou v těchto mononukleárních buňkách. Ačkoli kontrolní vzorek vykazuje vyšší barvení pozadí, reakce ve vzorcích pacientů může být snadno rozlišena na základě dvou populací, které mohou být detekovány: populace s podobným barvením jako u kontrol a další populace s vysokou intenzitou barvení, u kontrol nepozorovanou.

.*· <9.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Příprava monoklonálních protilátek proti El a E2

Myši byly imunizovány se zkrácenými, variantami El (aa 192-326) a E2 (aa 384-673) exprimovanými rekombinantním virem vakcinie, jak je popsáno v PCT/EP 95/03031 Maertens et al. Po imunizaci byly myší splenocyty fúzovány s myelomovou buněčnou linií. Výsledné hybridomy secernující specifické protilátky proti El nebo E2 byly vybrány pomocí testu ELISA.

Příklad 2

Selekce monoklonálních protilátek

U rozsáhlé série (celkem 25, 14 detailně, tyto lze získat od firmy Innogenetics NV, Gent, Belgie) monoklonálních protilátek namířených proti El nebo E2 bylo hodnoceno barvení na přirozený HCV antigen v jaterních biopsiích pacientů s HCV a u kontrol (viz níže). Barvení bylo prováděno buď na zmrazených řezech nebo na biopsiích fixovaných formaldehydem (protokoly, viz legendy obrázků). Pouze tři monoklonální protilátky ukázaly jasné a specifické barvení. Všechny další monoklonální protilátky buď nedávaly žádné nebo velmi slabé barvení, nebo vykazovaly nespecifické barvení. Stojí za povšimnutí, že byly zaznamenány dva různé typy barvení antigenu. Monoklonální protilátka IGH 222, namířená proti E2, jasně barvila hepatocyty (obrázek 1), zatímco IGH 207 a IGH 210, namířené proti El, barvily lymfocyty infiltrující játra (obrázky 2a a 2b) . IGH 207 také barvila hepatocyty, ale • · slabší měrou než IGH 222 (srovnej obrázky 1 a 2a) . Tento typ barvení byl ověřen na sérii biopsií od pěti různých pacientů.

Monoklonální	Obalový	Typ barvení
protilátka	protein
IGH 200	El	negativní
IGH 201	El	slabé
IGH 202	. El	negativní
IGH 204	El	slabé
IGH 207	El	silná pozitivita lymfocytů, slabší pozitivita hepatocytů
IGH 209	El	negativní
IGH 210	El	pozitivní lymfocyty (pozorováno pouze po fixaci formaldehydem)
IGH 212	E2	slabé
IGH 214	E2	negativní
IGH 215	E2	negativní
IGH 216	E2	negativní
IGH 219	E2	negativní
IGH 221	E2	negativní
IGH 222	E2	silná pozitivita hepatocytů

Příklad 3

Identifikace monoklonálních protilátek umožňujících detekci virového obalového antigenu v buňkách periferní krve.

Nález, že infil.tráty lymfocytů v játrech mohou být barveny na HCV obalové antigeny, pobídl původce vynálezu k vyšetření mononukleárních buněk periferní krve. Aby bylo možné intracelulární barvení, byly buňky periferní krve permeabilizovány saponinem, což pak umožnilo reakci t · · w · · » · · ' <

s monoklonálními protilátkami IGH 201 nebo 207 (namířenými proti Ela vykazujícími slabou a silnou pozitivitu v jaterní biopsii, v daném pořadí). Nakonec byla reaktivita ověřována na fluorescenčním přístroji pro třídění buněk s použitím sekundárních protilátek značených FITC. IGH 207, která již barvila infiltrát lymfocytů v játrech, vykázala vysokou specifitu. Tato monoklonální protilátka skoro nebarvila pozadí a vzorky 4 z 5 pacientů zřetelně, barvila pozitivně (obrázek 3) . Druhá monoklonální protilátka,, IGH 201 (vázající se k sekvenci id.č. 29, ECAGC přístupové číslo: 98031216), která je také namířena proti El, poskytovala vyšší pozadí, ale Íntracelulární El byl detekován u 5 z 5 pacientů, jak může být vyvozeno ze sloupkového diagramu ukázaného na obrázku 4, který ukazuje jasnou subpopulaci buněk s vyšším stupněm fluorescence ve srovnání s kontrolním vzorkem.

Příklad 4

Mapování reaktivních monoklonálních protilátek proti El nebo E2

Všech 14 monoklonálních protilátek bylo mapováno vzhledem k jejich příslušným epitopům s použitím peptidového prohledávání proteinů El a E2, proti kterým byly protilátky tvořeny. Tyto peptidy byly biotinylovány, navázány na mikrotitrační destičky senzibilizované streptavidinem a ponechány reagovat s monoklonálními protilátkami. Jako pozitivní kontrola sloužily rekombinantní obalové proteiny.

Reaktivita každé monoklonální protilátky může být přiřazena specifické epitopové oblasti, která je definována dvěma překrývajícími se peptidy (pro detaily o sekvencích viz tabulku 1).

·· '·	•	» · ·
i : : .	•	2 · > · v · · ··
b · « «· ···	• • · ·	• ·*; · ··. *'·· ·· -

Peptidy '

aa Reaktivní monoklonální protilátkyoblast - ...........

V1V2	192-226	IGH	201,	204,	202
V2V3	212-244	IGH	201,	204,	202
V3V4	230-263
HR	261-290
V5C4	288-327	IGH	207,	210,	209
C4V6	307-340	IGH	207,	210,	209
Rekombinantní	192-326	IGH	201,	207,	210
HVR I	384-415	IGH	.222,	215
HVRl/Cla	395-428	IGH	222,	215
Cla	413-447
Clb	430-467
HVR II	460-487	IGH	212,	214,	221
C2a	480-513	IGH	219,	216
C2b	500-530
V3-C3	523-566
V4	561-590
C4a	578-627
C4b	621-648
C4c	641-673
Rekombinantní	384-673	IGH	222,	215,	212

200

200

204, 202, 200,

214, 221, 219,

209

216

Epitop pro IGH 201 může být definován jako oblast 212226 (sekvence id. č. 29), pro IGH 207 a IGH 210 to je 307-326 (sekvence id. č. 30) a pro IGH 222 to je 395-415 (sekvence id. č. 31). Oblast aminokyselin IGH 201 je poněkud variabilní oblast HCV proteinu El a, co se týče in šitu detekce HCV, byla již dříve publikována (Hiramatsu et al. 1992, Kaito et al., 1994). Ale ze studií původců vynálezu je jasné, že protilátky namířené proti tomuto epitopu jsou méně vhodné pro in šitu detekci HCV, protože barvení jaterní biopsie s touto protilátkou bylo negativní a barvení lymfocytů periferní krve vykázalo značně velké pozadí. Na rozdíl od toho, IGH 207 a IGH 210..... rozpoznávají kompletní konzervativní oblast - El (Maertens a Stuyver, 1997). Monoklonální protilátka IGH -222 rozpoznává oblast E2, která je částí N-koncové hypervariabilní domény E2, a ukázalo se, že je- velmi vyhovující pro účinnou in šitu detekci HCV.

Příklad 5

Určení křížově reaktivity variabilních epitopů

IGH 222 byla dále charakterizována s použitím rozšířené série peptidů odvozených z různých sekvencí N-koncového hypervariabilního epitopů E2. Tabulka 2 ukazuje shrnutí těchto pokusů. Z této tabulky je možno uzavřít, že tato monoklonální protilátka reaguje s několika sekvencemi, ale nedokáže reagovat s některými jinými. Znalost tohoto epitopů je pro odborníka dostačující k vytváření dalších protilátek proti tomuto epitopů s lepší reaktivitou pro jiné sekvence, které nejsou rozpoznávány IGH 222. Takové sekvence jsou například peptidy s čísly 490, 940, 884, 484 a 494, ale v oblasti mezi aa 395-415 se mohou vyskytnout další sekvence, proti kterým reakce IGH 222 může selhat.

Z těchto příkladů je jasné, že epitopy rozpoznávané monoklonálními protilátkami IGH 201, 207, 210 a 222 jsou lehce přístupné pro vazbu protilátek a umožňují detekci antigenů v jaterních biopsiích a buňkách periferní krve. Vlastnosti monoklonálních protilátek IGH 201, 207, 210 a 222 jsou dosti jedinečné, protože jiné monoklonální protilátky namířené proti stejným epitopům měly za následek vysoké pozadí a nepřítomnost specifického barvení. Například monoklonální protilátky IGH 207, 209 a 210 všechny rozpoznávají stejný epitop, nicméně IGH 209 není schopná barvit antigen El u žádného buněčného typu, zatímco IGH 210 barví pouze lymfocyty a IGH 207 barví jak lymfocyty tak hepatocyty. S předkládaným vynálezem, by mělo být pro odborníka proveditelné produkovat rozsáhlou řadu protilátek (buď polyklonální nebo monoklonální povahy, v různých živočišných druzích), které mohou být použity pro detekci přirozených HCV proteinových antigenů.

Potřeba produkovat série protilátek proti danému epitopu odráží skutečnost, že chování protilátky není výlučně určováno rozpoznávaným epitopem, ale také sekundárními vlastnostmi, jako například afinitou a aviditou k epitopu, rozpustností, izotypem a živočišným druhem, ve kterém je protilátka vytvářena. Pro každou aplikaci může být požadována protilátka s různými 'sekundárními vlastnostmi. Tudíž produkce těchto rozsáhlých sérií protilátek umožní, že u některých z nich budou identifikovány podobné vlastnosti jako mají IGH 201, 207, 210 a 222, tj . že dovedou odhalit přítomnost HCV obalového proteinu v biologických vzorcích hostitele. Vskutku znalost, že tyto epitopy jsou dobře přístupné na HCV obalových proteinech, jak jsou exprimovaný v hostiteli,, poskytuje nezbytnou informaci pro vývoj testů pro detekci těchto antigenů nejen in sítu, jak je předkládáno zde, ale také v roztoku (např. v plazmě nebo séru). Monoklonální protilátky IGH 201, 207, 210 nebo 222 nebo další protilátky vyvinuté proti stejnému epitopu, ale s optimálními vlastnostmi pro detekci rozpustného antigenu, eventuálně v kombinaci s dalšími, mohou být také použity k vývoji podobných testů.

• · ··· ·’

SEZNAM CITOVANÉ LITERATURY

Cannon, E., Ladner R., and McCoy D. Phage-display technology. IVD Technology 1996, Nov/Dec.

Current protocols in immunology. Eds Coligan J., Kruisbeek A., Margulis D., Shevach E., and Strober W., Wiley Interscience, 1992.

Dries V., Von Both I., Miiller Μ., Gerken G., Schirmacher P., Odenthal M., Bartenschlager R., Drebber U., Meyer Zum Bůschenfelde K.-H. And Dienes H.P. Detection of Hepatitis C virus in paraffin-embedded liver biopsies of patients negative for viral RNA in sérum. Hepatology 1999: 29: 223229.

Guido M and Thung S. The value of identifying hepatitis C virus in liver pathology specimens. Hepatology 1996: 23: 376379.

Hiramatsu I1T., Hayashi N., Haruna Y., Kasahara A., Eusamoto H., Moři C., Fuke I.. Okayama H. and Kamada T. Immunohistochemical detection of hepatitis C virus-infécted hepatocytes in chronic liver disease with monoclonal antibodies to core, envelope and NS3 regions of the hepatitis C virus genome. Hepatology 1992: 16: 306-311.

Kaito M., Watanabe S., Tsukiyama-Kohara K., Yamaguchi K., Kobayashi Y., Konishi M., Yokoi M., Ishida S., Suzuki S. and Kohara M. Hepatitis C virus particle detected by immunoelectron microscopic study. J. Gen. Virol. 1994: 75: 1755-1760.

Kashiwakuma T., Hasegawa A., Kajita T., Takata A., Moři H., Ohta Y., Tanaka E., Kiyosawa K., Tanaka T., Tanaka S., Hattori N. and Kohara M. Detection of hepatitis C virus specific core protein in sérum of patients by a sensitive fluorescence enzyme immunoassay. J. Immunol. Meth. 1996: 190: 79-89.

·· · ·' · ·· ·· ♦ · * · 9 9 4 ·, · _r · . 4'

4 4 9 · · · · ‘11 ,»- · * · · 9 '4 '· '· -φ- · * ' · · · · · · » · ·· ··· ··· ··· ·· ' - ·'· '

Kohler and Milstein, (1975) Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Natúre 256: 495. ‘

Liang, T.J. (1996) Hepatology elsewhere 23: 376-379.

Ladner, R.. Constrained peptides as binding entities. Tibtech 1995, 13:426-430.

Maclennan J. Engineering microprotein ligands for large-scale affinity purification. Biotechnology 1995, 13:1181-1183. Maertens G. and Stuyver L. Genotypes and genetic variation of hepatitis C virus. In: The molecular medicine of viral hepatitis. Ed: Harrison T.J. and Zuckerman A.J. 1997 Major M.E. and Feinstone S.M. The molecular virology of hepatitis C. Hepatology 1997: 25:1527-1538.

Sansonno D., Cornacchiulo V., Racanelli V. and Dammacco F. In šitu simultaneous detection of hepatitis C virus RNA and hepatitis C virus-related antigens in hepatocellular carcinoma. Cancer 1997: 80: 22-33.

Sansonno D., Gesualdo L., Manno C., Schena F. and Dammacco F. Hepatitis C virus-related proteins in kidney tissue from hepatitis C virus-infected patients with cryoglobulinemic membranoproliferative glomerulonephritis. Hepatology 1997:

25: 1237-1244.

«>·· ·'··

Tabulka

co 05 05 1

ιο 05 05 |

Ό 05 05 1

Ό 05 05 I

' CO 05 05 t

CO 05 05 |

CO 05 05 I

CO 03 03 ι

ιη <Ν <Ν t

CO 03 05 I

CD 05 05 ι

Ό* •ϋ1 05 ι

Π CO 05 I

ο σι 03 ι

θ' 03 η I

Ο 4# Μ

1 05

1 05

1 05

1 05

1 05

1 05

05

1 05

I 03

03

05

05

1 Ο

1 τ-4

ι 00

1 ο·

(tí

σι

σι

σι

<η

σι

σ

σι

σι

σι

σ

σ

ι-4

m

CO

CO

ο

ctí

ι-4

ι-1

r-4

«Η

τ—i

γ-1

ι-4 .

τ-4 ιη C0 ο Γ—i

ι-4

ι-4

ι-4

05

03

05

05

m

O -t

τ-ϊ

co

σ\

CO

m

^5» ’

η

'C*

Π

05

CO

03

Ο

CO

σι

ω Ή

ο·

co

γΗ

Γ~

ο

θ'

00

05

Π

Π

Π

η

03

ιη

γ-^

η

ο

00

Ο

ο

ο

ο

Ο

ο

η

m

Μ

ο

Ο

ι-4

ι-4

ο

xu

τ-4

ι—)

ι-4

τ—1

ι-4

τ-4

ι-4

τ-4

ι-4

ι-4

1-4

1—1

γ4

γ4

ι-4

Ο C

05

03

03

05

03

CS

03

05

05

05

03

m

+4

ιο

'φ

>

>

>

>

>

>

>

>

>

>

>

>

>

CJ

>

ε

γ--ϊ

ι-4

1-4

1-4

ι-4

Γ—1

ι-4

ι-4

ι-4

ι-4

ϊ-4

05

m d

ιη

Ό

>

>

>

>

>

>

>

>

>

>

>

> Ε

>

Ο

£

4-1

O c

Φ

O (tí

Λ t—í <3 O 03 05 n

LO o ro X) σ i—) r-i

X! Λ X} i—í i-4 r-4 ω

x

Ό •r4

4-5 cx

Φ d4

υ	Ο	CJ	CJ	CJ	CJ	CJ	CJ	CJ	CJ
ο	ο	u	o	u	O	CJ	CJ	CJ	0	CJ
04	04	04	Cu	dl	d»	dl	dl	dl	04	04
Ε-ι	É4	E-4	&4	£4	XI	2	X	X	X	X
	Ε	*—5 ►*-<	►—4	E	E	E	E	E	»TW	*4
3	£	X	3	X	X	XI	XI	XI	3	X
Η	Η	>	>	H	H	H	t-4	H	H	H
2	£	<	<	>	E	XI	2	a	a	H
Α		o	o	Q	E	£	2	CJ	£4	Q
	2	w	63	Q	A	A	A	£	63	O
<	2	XI	XI	2	2	<		2	<	<
Η	Η	OÍ	o	63	63	63	63	63	63	63
X	X	£	£	X	>4	X	X)	X	fc.	£
£	>	H	>	>	>	>	>	>	>	>
Η	Η	H	H	H	1-4	H	H	H	H	K
cn	cn	cn	cn	cn	cn	cn	cn	cn	cn	tn
cn	cn	cn	cn	cn	cn	cn	cn	cn	cn	CD
£	£	£	£	£	£	£	s	£	£	Z
dl	tn	cn	cn	cn	dl	04	cn	dl	cn	cn
υ	CJ	CJ	CJ	CJ	O	O	o	CJ	CJ	u
Q	Q	Q	A	□	Q	Q	Q	O	Q	Q
£	£	£	£	£	Z	Z	z	£	£	z
Η	&4	£4	£-i	£4	£4	£4	£4	£4	£4	C4
>	>			XI	>	H	XI	X!	XI	>
£	K	£	£	>	E	K	E		—1	a
>4	>4		χ	£	>4	X	X	X	X	£4
XI	1-4	cn	cn	X)	H	1-4	XI	XI	f-4	X
ο	O	£		o	O	CJ	O	CJ	CJ	a
£+	cn	cn	cn	cn	cn	cn	cn	cn	cn	cn
cn			Eh	£4	i>	2	cn	£	<
	£			2	2		£	2	s	£
2		tO	ty	rO	2	2	o		2	K
			►>	•g	X	X	X	s<		X
Ο	63	w	63	63	£	04	£4	2	o	63
>4	>4	>	>	XI	H	>	XI		H	X

cj d

tn cn £

z w

Ě o

Oj >

CJ

CJ dl <

s

H

»T* 2		í
d	X	2
H	a	*r*
£4	cn	CJ
£4	>	E-i
£4	X	H
dl	61	►—4
>	>	CD
cn	cn	04
	CJ	X
£	CJ	H
2	X	cn
2	Q	CJ
3	CJ	£

X	*>	CJ
£4	&	D
04	5s	a
£4	<	>
X	cn	£4
<	CJ	63
	61	>*4
£		2
CJ	2	d
dí	2	dl
cn	CJ	cn
cn	>	H
2	X	£4
2	X	61
63	A	X

σ cn cj

H

H

E

CJ >4

H cn

2Í

CN

CN

CN

W

O

H

Ή c

'Γ0 >

<0 ^4- + + + +1 I I I 1 o

a

N

O

Pí

4~>

CO

CTJ	tn	CO	CD	co	O	co	co	kD	co	co
i-l	vH	i—C	T—{	rU	rH	í~-1	r-i	rH	r-i	rU
X)	N?	-stf	'm1	N?	*3*	*a	C		««(	«31
o	1	1	1	1	1	1	1	1	1	1
	*3*	*3<	in	-a		-5?	X?		*3<	Ν’
(TJ	CO	cn	cn	cn	O	cn	cn	cn	cn	cn
(TJ	ΓΟ	ro	ro	ro	m	CO	ro	m	co	ro

cn	LO	CN	O	co	*31		31	o	o
ro	CO	cn	CN	00	cn	co	CO	N*	cn
r4	'S?	Ν’	m	co	NS>		CO	cn	Nf

>o

f?

C-i	P-t	r<	Ε-·	Η	E-<	£-<	£<
2J	Z	Z	Z	Z	Z	Z	Z	Z	z
>	H	>	H	>	>	H	H	>	H
XJ	XJ	X)	X)	XI	XI	XJ	XI	XI	XJ
O!	p~]	o	O	o	o	*T* ‘	O	o	o
H		H	H	H	H	>	H	H	H
Lí	£5	Pí	Lí	Lí	Lí	z	Z	Lí	n
cn	O	O	O	O	O	o	o	O	o
<	Lí	cn	OÍ	<	cn	Lí	Lí	tn	Lí
cn	CU	<	<	cn	eu	CU	<	<
o	o	u	O	o	o	O	O	O	o
cu	cn	cu	XI	cu	o	—4	CU	cu	Pí
cn	<	cn	cn	cn	cn	<	Ch	Pí	cn
Cu	Cu	Cu	Cu	a	ú,	Cu	Cu	lu	Cu
XI	Z	X!	Z	XI	§	&j	XJ	J	XJ
cn	cn	cn	o	cn	cn	K	cn	cn	cn
>	>	<	C-l	>	>	>	>	£·	>
XJ	XJ	XI	XI	XI	XJ	H	XJ	XJ	XI
O	pí	C-*	“4	o	cn	O	o		o
Pí	Z	cn	Pí	d	o	Cu	cn	O	cu
£<	£<	=H	<	=4	C-t	z	g		Ch
Z	E-i	EH		Q	cn	£-i	2		E-<
cn	Lí	►*4	tú	cn	cn	*r4 ►M	Pí	XJ	Pí

CN

Tabulka

Φ υ

c

Φ >

Φ

CZ) o

o cn

JtJ

O cn

TO

CN

CN

CN tú

O cn

Ή

G

Ή •π

CP

OJ

Φ

Φ

C

SC

G

Φ

Ό •H

4~>

a φ

a >

φ

G φ

4->

Ž £

Ή	XD
G	(C
>	XJ
•H	C3
+J	4-»
CTJ
>	>1
Su	c
Φ	Φ
N	XJ
C	Π5
O	C
Λί	N
Φ	>.
Z	>

< ·

Claims (13)

1. Použití protilátek, které se specificky vážou k C-koncové oblasti HCV proteinu El (aminokyseliny 227 až 383) nebo k Ň-koncové oblasti HCV proteinu E2 (aminokyseliny 384 až 450) pro přípravu soupravy pro detekci přirozeného proteinového antigenu HCV.

2. Použití protilátky podle nároku 1, kdy uvedená protilátka specificky váže jeden z následujících epitopů:

- aminokyseliny 307 až 326 HCV proteinu El (sekvence id.

č. 30)

- aminokyseliny 395 až 415 HCV proteinu E2 (sekvence id.

č. 31).

3. Použití protilátek podle kteréhokoliv z nároků 1 nebo 2, kde uvedená protilátka je monoklonální protilátka.

4. Použití protilátek podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, kde uvedená protilátka je secernována hybridomovou linií uloženou v ECACC jako vzorek číslo 98031214 nebo 98031215.

5. Použití funkčně rovnocenné varianty nebo , fragmentu protilátky podle kteréhokoliv z nároků i až 4.

6. Monoklonální protilátka secernovaná hybridomovou linií uloženou v ECACC jako vzorek číslo 98031214.

7. Funkčně rovnocenná varianta nebo fragment protilátky podle nároku 6.

8. Hybridomová buněčná linie, uložená v ECACC jako vzorek 98031214.

tftf

9. ' Způsob detekce přirozených HCV proteinových antigenů vyznačující se tím, že obsahuje kroky, kdy:

testovaný vzorek, který může obsahovat HCV proteinové antigeny, se přivede do kontaktu s protilátkou podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4 nebo s funkčně rovnocennou variantou nebo fragmentem uvedené protilátky, aby se vytvořil komplex protilátka-antigen, a

- komplex antigen-protilátka se detekuje vhodným markérem.

10. Způsob podle nároku 9vyzna čující se tím, že testovaný vzorek obsahuje lidské buňky nebo tkáně.

11. Způsob podle nároku 10 vyzná.čující se tím, že lidské buňky jsou buňky periferní krve.

12. Způsob podle nároku 10 vyznačující se tím, že lidská tkáň je jaterní tkáň.

13. Testovací souprava pro detekci přirozených HCV proteinových antigenů vyznačující se tím, že obsahuje:

- protilátku podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4 nebo funkčně rovnocennou variantu nebo fragment uvedené protilátky, a -vhodné markéry, které umožňují detekci komplexů utvořených mezi HCV proteinovými antigeny v testovaném vzorku s protilátkou nebo funkčně rovnocennou variantou nebo fragmentem uvedené protilátky.