PT1064309E - Epítopos em proteínas virais de envelope e anticorpos específicos dirigidos contra estes epítopos: utilização para a detecção de antigenes virais do hcv em tecido do hospedeiro - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO

"EPÍTOPOS EM PROTEÍNAS VIRAIS DE ENVELOPE E ANTICORPOS ESPECÍFICOS DIRIGIDOS CONTRA ESTES EPÍTOPOS: UTILIZAÇÃO PARA A DETECÇÃO DE ΑΝΤΙGENES VIRAIS DO HCV EM TECIDO DO HOSPEDEIRO"

ÁREA DA INVENÇÃO A presente invenção baseia-se na descoberta de anticorpos dirigidos contra epítopos específicos das proteínas EI e E2 do HCV poderem ser utilizados para detectar antigenes virais em tecidos do hospedeiro.

CONTEXTO DA INVENÇÃO A infecção pelo vírus da Hepatite C (HCV) é um problema de saúde importante em países desenvolvidos e em desenvolvimento. Estima-se que cerca de 1 até 5% da população mundial esteja afectada pelo vírus. A infecção pelo HCV parece ser a causa mais importante de hepatite associada a transfusão, e progride frequentemente para danos crónicos no fígado. Além disso, há evidências que implicam o HCV na indução de carcinoma hepatocelular. Em consequência, a procura de métodos de diagnóstico fiáveis e agentes terapêuticos eficazes é elevada. Também são necessários métodos de rastreio sensíveis e específicos de produtos sanguíneos contaminados com o HCV e métodos aperfeiçoados para a cultura do HCV. 0 HCV é um RN A vírus de filamentação positiva com aproximadamente 9 400 bases que codifica pelo menos três proteínas estruturais e seis não estruturais. Com base na homologia de sequências, as proteínas estruturais foram 2 funcionalmente classificadas como uma única proteína do "core" e duas proteínas de envelope: EI e E2. A proteína EI consiste em 192 aminoácidos e contém 5 até 6 sítios de N-glicosilação, dependendo do genótipo do HCV. A proteína E2 consiste em 363 até 370 aminoácidos contendo 9 até 11 sítios de N-glicosilação, dependendo do genótipo do HCV (para um artigo de revisão ver Major e Feinstone, 1997; Maertens e Stuyver, 1997) . A proteína EI contém vários domínios variáveis, ao passo que a proteína E2 contém dois domínios hipervariáveis, dos quais o domínio principal está localizado no terminal N da proteína (Maertens e Stuyver, 1997). As proteínas de envelope foram produzidas por técnicas recombinantes em Escherichia coli, células de insecto, células de levedura e células de mamífero. A utilização de um sistema de expressão em eucariotas superiores e, especialmente, em culturas de células de mamífero conduz a proteínas de envelope de qualidade superior, isto é, são efectivamente reconhecidas por anticorpos em amostras de pacientes, como descrito em PCT/EP 95/03031, atribuída a Maertens et al.

Outros antigenes peptídicos de EI e E2 do HCV e sua utilização em imunoensaios foram descritos em WO 92/13892, DE 4209215 e WO 96/40764.

Presentemente, a detecção do HCV em células ou tecidos baseia-se essencialmente na demonstração de RNA virai. No entanto, a detecção de RNA em células ou tecidos é uma técnica pesada que envolve a extracção de RNA seguida de transcrição reversa e PCR encaixada ou que inclui RT-PCR e hibridização in situ. Uma vez que estas técnicas também são propensas a reactividade positiva falsa, a detecção de RNA virai é exclusivamente efectuada em amostras de soro. Faltam ainda métodos fiáveis para a detecção de antigenes de proteínas virais em soro e amostras de tecidos. 3

Os sítios de replicação do HCV ainda não foram completamente elucidados. É geralmente aceite que o vírus se replica em hepatócitos, mas ainda está a ser altamente debatida a replicação noutros tecidos, como tecidos linfóides. Assim, um método fiável para a detecção de proteínas virais ou do próprio vírus em células poderá resolver esta questão. A detecção de proteínas virais em células tem sido obstada pela falta de anticorpos que se liguem especificamente a proteínas virais e que sejam capazes de reconhecer especificamente os antigenes de proteínas naturais do HCV (isto é, antigenes tal como expressos pelo hospedeiro após a infecção com o HCV) . Em consequência e até à data, apenas alguns estudos dizem respeito à demonstração da presença de proteínas virais do HCV em células-hospedeiro (para um artigo de revisão ver Guido e Thung, 1996). Além disso, foram utilizados em muitos destes estudos anticorpos derivados do hospedeiro. Todavia, as preparações contendo anticorpos derivados do hospedeiro não podem ser facilmente reproduzidas, e estas preparações podem estar contaminadas por anticorpos autoimunes, bem como por anticorpos contra outros agentes conhecidos ou mesmo desconhecidos. Em contraste, sabe-se que anticorpos produzidos em animais por imunização com antigenes recombinantes darão origem a anticorpos com a especificidade desejada. Para se obter qualidade reprodutível, também são preferidos anticorpos monoclonais. Adicionalmente, é necessário que as proteínas de envelope do HCV sejam produzidas por um sistema de expressão de mamífero para dar origem a antigenes de boa qualidade. Presentemente, a esta condição de expressão estão associados problemas incompreensíveis. Em consequência, só foram descritos poucos anticorpos monoclonais que podem ser 4 utilizados para detectar antigenes de envelope do HCV em espécimes de tecidos de pacientes. Estes anticorpos foram dirigidos contra a região N-terminal da El, aminoácidos (aa) 192-226 (Hiramatsu et al., 1992, Kaito et al., 1994), ou contra o domínio C-terminal da E2, aminoácidos 451-715 (Sansonno et al., 1997a, 1997b). Contudo, a partir destas publicações e dos artigos de revisão de Guido e Thung (1996) e Liang (1996) é evidente que ainda são necessários anticorpos bem caracterizados que permitam a detecção eficiente e de rotina de antigenes de proteínas naturais do HCV em soro e amostras de tecidos. Esta necessidade foi recentemente confirmada por um estudo de Dries e colaboradores (1999). 0 grupo de Dries demonstrou que 61% de indivíduos positivos quanto a anticorpos para o HCV e negativos quanto a RNA no soro eram portadores do HCV, pois foi possível detectar RNA do HCV em amostras de biopsias do fígado, mas apenas um terço destes casos conseguiu ser detectado por imuno-histoquímica utilizando um painel de anticorpos. Assim, ainda falta sensibilidade à detecção de rotina de antigenes do HCV em biopsias do fígado. Também a detecção de antigenes virais em fluidos corporais, como soro ou plasma, é dificultada pelo mesmo problema. Até à data apenas foi descrita uma única técnica que permite a detecção de antigenes do "core" nestes fluidos. No entanto, para detectar a proteína do "core", a técnica requer desnaturação completa da proteína do "core" presente na amostra utilizando hidróxido de sódio (Kashiwakuma et al., 1996) .

Em consequência, é urgentemente necessária a identificação de novos epítopos específicos do HCV que estejam acessíveis para anticorpos e que permitam a detecção de antigenes em amostras de tecidos ou fluidos corporais, tomados em conjunto. As proteínas de envelope do 5 HCV são alvos candidatos putativos para descobrir esses epítopos, uma vez que estas proteínas devem estar presentes em todas as amostras biológicas: em fluidos, na membrana do virus e em células do primeiro acontecimento da infecção (isto é, entrada virai) ao longo do ciclo completo de replicação. Todavia, estas proteínas de envelope são altamente variáveis, de modo que são necessários anticorpos com uma reactividade cruzada elevada para os diferentes genótipos do HCV. Assim, a identificação desses epítopos e a busca de anticorpos com reactividade cruzada elevada para a variação da sequência do HCV é um desafio a empreender. A presente candidatura refere-se a anticorpos monoclonais específicos, dirigidos contra epítopos particulares nas proteínas de envelope do HCV, que sejam capazes de detectar antigenes do HCV em espécimes de tecidos de pacientes. No total descobriram-se dois desses epítopos, e anticorpos correspondentes: um na região C-terminal (aminoácidos 227-383) da proteína de envelope EI e um na região hipervariável (HVR) N-terminal da E2 (aminoácidos 384-450). Apesar da última região, e mais especificamente a região 395-415, ser considerada hipervariável, caracterizámos, para nossa surpresa, um anticorpo que reage com várias sequências conhecidas da HVR da E2 .

OBJECTIVOS DA INVENÇÃO É claro da literatura que há uma necessidade urgente de desenvolver métodos de diagnóstico fiáveis, vacinas fiáveis e agentes terapêuticos eficazes para o HCV. Também são necessários métodos de rastreio sensíveis e específicos de produtos sanguíneos contaminados com o HCV e métodos aperfeiçoados de cultura do HCV. Novos anticorpos capazes 6 de detectar o vírus em modelos animais ou in vitro, ou no seu hospedeiro natural, podem ajudar a conceber ferramentas de diagnóstico e agentes terapêuticos eficientes. A este respeito, a presente invenção baseia-se na descoberta surpreendente de anticorpos monoclonais dirigidos contra a El ou HVR da E2 que podem ser utilizados para a detecção de antigenes do HCV em vários tecidos ou células. Estes tecidos incluem o fígado, mas também células derivadas de amostras sanguíneas. Em consequência, a presente invenção pretende fornecer e utilizar um anticorpo que se liga especificamente à região da proteína de envelope do HCV aminoácidos 227-450, que abrange a parte principal (C-terminal) da proteína El, e à região N-terminal da proteína E2. Estes anticorpos permitem detectar antigenes de proteínas naturais do HCV e podem ser utilizados para preparar um estojo de detecção de antigenes de proteínas naturais do HCV. De forma notável, a proteína El completa corresponde aos aminoácidos 192-383, ao passo que a proteína E2 completa corresponde aos aminoácidos 384-747 (ver: Major e Feinstone, 1997; Maertens e Stuyver, 1997).

Mais especificamente, a presente invenção pretende fornecer e utilizar um anticorpo como definido acima que se liga especificamente pelo menos a um dos seguintes epítopos: - aminoácidos 307-326 da proteína El do HCV (ID SEQ 30) - aminoácidos 395-415 da proteína E2 do HCV (ID SEQ 31).

Além disso, a presente invenção pretende fornecer e utilizar um anticorpo como definido acima que é um anticorpo monoclonal. A este respeito, a presente invenção pretende fornecer e utilizar um anticorpo monoclonal 7 segregado pela linha de hibridoma depositada na ECACC com o número de acesso 98031215 ou 98031214.

Deve ficar claro que a presente invenção também pretende fornecer e utilizar qualquer variante ou fragmento funcionalmente equivalente de qualquer anticorpo como definido acima, bem como respectivas formas mutantes, ou moléculas exibindo reactividades semelhantes de ligação funcional com as ID SEQ 30 e 31, tais como sequências obtidas de bibliotecas de fagos ou outras.

Adicionalmente, a presente invenção pretende fornecer e utilizar uma linha de células de hibridoma que segrega um anticorpo monoclonal que se liga especificamente à proteína EI do HCV (aminoácidos 227-383) ou à região hipervariável N-terminal da E2 do HCV (aminoácidos 384-450), que permite a detecção de antigenes de proteínas naturais do HCV e que pode ser utilizada para a preparação de um estojo de detecção de antigenes de proteínas naturais do HCV. Mais especificamente, a presente invenção pretende fornecer e utilizar a linha de células de hibridoma correspondente ao depósito da ECACC com o número de acesso 98031215 ou 98031214.

Suplementarmente, a presente invenção também pretende fornecer um método para a detecção de antigenes de proteínas naturais do HCV, compreendendo: fazer com que uma amostra de teste, que pode conter antigenes de proteínas do HCV, entre em contacto com um anticorpo como definido acima, ou com uma variante ou fragmento funcionalmente equivalente desse anticorpo, para formar um complexo anticorpo-antigene, e determinar o referido complexo antigene-anticorpo com um marcador apropriado. 8

Mais especificamente, a presente invenção pretende fornecer um método como definido acima em que a referida amostra de teste compreende células humanas, como células do sangue periférico, ou tecidos humanos, como tecido do figado.

Por fim, a presente invenção pretende fornecer um estojo de ensaio para detectar antigenes de proteínas naturais do HCV, compreendendo: - um anticorpo como definido acima, ou variante ou fragmento funcionalmente equivalente desse anticorpo, e marcadores apropriados que permitam determinar os complexos formados entre antigenes de proteínas do HCV numa amostra de teste e o referido anticorpo, ou variante ou fragmento funcionalmente equivalente desse anticorpo.

Considera-se que todos os objectivos da presente invenção foram atingidos pelas especificações apresentadas abaixo.

DESCRIÇÃO BREVE DE TABELAS E FIGURAS A Tabela 1 apresenta as sequências peptídicas de todos os péptidos mencionados nesta candidatura. A Tabela 2 mostra a reactividade cruzada do IGH 222 com várias sequências do domínio hipervariável da E2. Todos os péptidos foram biotinilados, ligados a placas de microtítulo revestidas com estreptavidina e deixados reagir com IGH 222. 9 A Figura 1 mostra a coloração de antigenes da E2, revelada pelo anticorpo monoclonal IGH 222, numa biopsia do fígado de um paciente infectado com o HCV. Efectuou-se imuno-histoquímica em secções de criostato de 4 μιη de espessura de materiais congelados de fresco (a biopsia do fígado foi congelada instantaneamente em isopentano arrefecido com azoto líquido e armazenada a -70°C até à utilização), utilizando um procedimento indirecto de peroxidase imunológica em três passos. As secções foram incubadas durante a noite a 4°C com o anticorpo monoclonal IGH 222 (IgGi purificada: 10 ng/μΐ). Os anticorpos secundário e terciário consistiram em IgG de coelho anti-ratinho conjugado com peroxidase e IgG de suíno anti-coelho conjugado com peroxidase, respectivamente (ambos obtidos da Dakopatts, Copenhaga, Dinamarca; diluição de processamento 1/50 e 1/100, respect ivamente) . Cada incubação foi efectuada durante 30 minutos à temperatura ambiente e seguida de uma lavagem em três mudas de solução salina tamponada com fosfato, pH 7,2. O produto reaccional foi desenvolvido por incubação durante 15 minutos em tampão acetato 100 mM (pH 5,2), contendo 0,05% de 3-amino-9- etilcarbazolo e 0,01% de H2O2, resultando em coloração vermelho vivo de sítios com reactividade imunológica. As secções foram contra-coradas com hemotoxilina. Os controlos (não mostrado) consistiram em anticorpos monoclonais irrelevantes de isotipo semelhante ao do anticorpo primário, ou em cromogénio isoladamente: estes controlos foram consistentemente negativos. A fotografia mostra uma ampliação de 25X. A coloração mais escura revela a presença de antigenes do HCV apenas em hepatócitos (ver setas). A Figura 2A mostra a coloração de antigenes da El, revelada pelo anticorpo monoclonal IGH 207, numa biopsia do fígado 10 de um paciente infectado com o HCV. 0 procedimento seguido é idêntico ao descrito na figura 1, com a excepção da concentração do anticorpo monoclonal, que foi 30 ng/μΐ. A fotografia mostra uma ampliação de 10X onde a coloração das células nos infiltrados de linfócitos é dominante. A coloração mais escura revela a presença de antigenes do HCV em hepatócitos (ver seta) e em linfócitos em infiltração (ver seta dupla). A Figura 2B mostra a coloração de antigenes da El, revelada pelo anticorpo monoclonal IGH 210, numa biopsia do fígado de um paciente infectado com o HCV. A biopsia do fígado foi fixada com formaldeído e embebida em parafina. As secções foram pré-tratadas por aquecimento (método de micro-ondas) e por digestão com proteases. A concentração do anticorpo foi 6 ng/μΐ. A fotografia mostra uma célula mononuclear isolada claramente corada (seta) num campo de hepatócitos que não ficam corados com este monoclonal. A Figura 3 mostra a coloração, revelada pelo anticorpo monoclonal IGH 207, de antigenes da El intracelulares em células mononucleares do sangue periférico. Glóbulos brancos periféricos (0,5 χ 106) foram suspensos em 200 μΐ de PBS-saponina 0,1%, adicionaram-se 2 μρ de IGH 207 e deixou-se o sistema reagir durante 25 minutos a 4°C. As células foram lavadas três vezes com 3 ml de PBS-saponina 0,1% e três vezes com PBS-NaN3 0,2%. Por fim, as células foram novamente suspensas em 250 μΐ de PBS-NaN3 0,2% e foram analisadas por citometria de fluxo. Depois de reter a fracção de células mononucleares (coluna da direita), representou-se graficamente a fluorescência (coluna da esquerda). As amostras 1-5 são derivadas de portadores 11 crónicos do HCV, ao passo que a amostra 6 é derivada de um portador de sangue saudável. A coluna da esquerda mostra dois exemplos da retenção da fracção de células mononucleares (amostras 2 e 6), ao passo que a coluna da direita mostra a fluorescência encontrada nestas células mononucleares. Se bem que a amostra de controlo não exiba nenhuma coloração com este anticorpo monoclonal, há um sinal positivo acentuado em todos os pacientes infectados com o HCV, exceptuando o paciente 4 para o qual se obteve um sinal mais fraco. A Figura 4 mostra a coloração, revelada pelo anticorpo monoclonal IGH 201, de antigenes da EI intracelulares em células mononucleares do sangue periférico. A técnica foi semelhante à descrita para a Figura 3. As amostras 7-11 são derivadas de portadores crónicos do HCV, ao passo que a amostra 12 é derivada de um portador de sangue saudável. A coluna da esquerda mostra dois exemplos da retenção da fracção de células mononucleares (amostras 7 e 12), ao passo que a coluna da direita mostra a fluorescência encontrada nestas células mononucleares. Apesar da amostra de controlo revelar uma coloração de fundo mais elevada, a reacção nas amostras dos pacientes pode ser facilmente distinguida com base nas duas populações que se podem detectar: uma população com uma coloração semelhante à do controlo e uma segunda população com uma coloração de intensidade elevada, não observada no controlo. É claro que a detecção de proteínas virais tem sido dificultada pela ausência de anticorpos que se liguem especificamente a proteínas virais e que sejam capazes de reconhecer os antigenes de proteínas naturais do HCV (isto é, antigenes de proteínas tal como expressos pelo 12 hospedeiro após infecção com o HCV). A presente invenção baseia-se na descoberta de dois novos epítopos nas proteínas de envelope do HCV que permitem a detecção de rotina de antigenes de proteínas naturais do HCV, por intermédio de anticorpos dirigidos contra estes epítopos, em amostras biológicas derivadas do hospedeiro. Assim, a presente invenção refere-se à utilização de anticorpos que se ligam especificamente à região C-terminal da proteína El do HCV (aminoácidos 227-383) ou à região N-terminal da proteína E2 do HCV (aminoácidos 384-450) para a preparação de um estojo de detecção de antigenes de proteínas naturais do HCV. O termo "anticorpos que se ligam especificamente à região C-terminal da proteína El do HCV (aminoácidos 227-383) ou à região N-terminal da proteína E2 do HCV (aminoácidos 384-450)" refere-se a qualquer anticorpo policlonal ou monoclonal que se liga a uma partícula virai da hepatite C ou qualquer molécula derivada dessa partícula virai, mais particularmente à região C-terminal da proteína El e à região N-terminal da proteína E2. A "região de envelope" dos vírus HCV e, assim, "a região C-terminal da proteína El do HCV (aminoácidos 227-383) ou a região N-terminal da proteína E2 do HCV (aminoácidos 384-450)" são regiões bem conhecidas do experimentado na área (Wengler, 1991; Major e Feinstone, 1997; Maertens e Stuyver, 1997). O termo "ligação" indica que os anticorpos da presente invenção estão fisicamente conectados a proteínas do HCV. Em particular, que os anticorpos se ligam especificamente às proteínas de envelope do HCV, implicando que não existem substancialmente reacções cruzadas com outros componentes do HCV ou outras proteínas. A ligação do anticorpo a proteínas do HCV pode ser demonstrada por qualquer método ou ensaio conhecido na área, tal como o tipo de ensaios de ligação, ELISA e RIA, ou ensaios de competição (por 13 exemplo, ver "Current protocols in immunology"). Deve ficar claro que não é necessário que a região de uma proteína de envelope do HCV que se liga a um anticorpo seja composta por uma sequência contígua. 0 termo "anticorpo monoclonal" utilizado aqui refere-se a uma composição de anticorpos com uma população homogénea de anticorpos. 0 termo não é limitador da espécie ou fonte do anticorpo, nem se pretende que seja limitado pelo modo como é produzido. Adicionalmente, o termo "anticorpo" também se refere a anticorpos humanizados em que pelo menos uma porção das regiões de arcabouço ("framework") de uma imunoglobulina é derivada de sequências de imunoglobulinas humanas e anticorpos de cadeia simples, como descrito na patente U.S. N° 4 946 778, e a fragmentos de anticorpos, como Fab, F. (ab)2, Fv e outros fragmentos que retêm a função de ligação a antigenes e a especificidade do anticorpo paterno. No termo "anticorpo" também estão incluídos diacorpos, triacorpos e anticorpos tetravalentes, como descrito na candidatura EP N° 97870092.0, atribuída a Lorré et al., que retêm a função de ligação a antigenes e a especificidade do anticorpo paterno. Deve ficar claro que os anticorpos tal como descritos na presente invenção podem ser utilizados num método para a detecção de antigenes de proteínas naturais do HCV. 0 termo "amostra de teste" refere-se a qualquer amostra obtida de um hospedeiro, como soro, plasma, saliva, muco, fluido da espinal-medula ou biopsias. A este respeito, os termos "amostra de teste" e "amostra biológica" são aqui utilizados de forma intermutável. O termo "biopsia" refere-se particularmente a uma amostra compreendendo células, em particular células humanas. Além disso, o último termo também se refere a uma amostra derivada de tecido líquido, como células do sangue periférico, ou de tecido sólido, 14 como tecido do fígado. No caso da detecção de antigenes ser efectuada numa biopsia, utiliza-se o termo "detecção in situ". 0 termo "estojo de detecção de antigenes de proteínas naturais do HCV" refere-se a um estojo para a detecção de qualquer antigene de proteínas do HCV, preferencialmente à detecção da região C-terminal da proteína EI do HCV (aminoácidos 227-383) ou da região N-terminal da proteína E2 do HCV (aminoácidos 384-450) na sua posição natural ou original, preferencialmente os antigenes tal como estão presentes numa amostra de teste, por qualquer método conhecido do experimentado na área. Por outras palavras, o último termo refere-se à visualização da presença da região C-terminal da proteína EI do HCV (aminoácidos 227-383) ou da região N-terminal da proteína E2 do HCV (aminoácidos 384-450) na sua célula ou tecido hospedeiro natural, ou sobre esta, por ligação dos anticorpos da presente invenção. O estojo de detecção compreende os componentes seguintes: (i) quando apropriado, um meio para isolar uma amostra de teste, (ii) possivelmente uma solução para permeabilizar células, (iii) um anticorpo como descrito aqui, ou respectiva variante ou fragmento funcionalmente equivalente, (iv) possivelmente anticorpos secundários e possivelmente terciários, (V) possivelmente tampões de incubaçao e/ou lavagem, (vi) possivelmente uma solução de coloração.

Preferencialmente, esse estojo é utilizado para a detecção in situ de proteínas de envelope do HCV. 15 A célula ou tecido hospedeiro natural pode ser qualquer célula ou tecido hospedeiro derivado de qualquer espécie de hospedeiro. Em particular, a célula hospedeiro natural refere-se a células do sangue periférico e o tecido natural refere-se a tecido do fígado (ver também a secção de Exemplos da presente candidatura). 0 hospedeiro natural refere-se, em particular, a humanos, mas também pode referir-se a primatas não humanos ou outros mamíferos.

Mais especificamente, a presente invenção refere-se a anticorpos que se ligam especificamente pelo menos a um dos seguintes epítopos: aminoácidos 307-326 da proteína EI do HCV e aminoácidos 395-415 da proteína E2 do HCV. Os últimos anticorpos são segregados por hibridomas depositados na European Collection of Cell Cultures (ECACC), Centre for Applied Microbiology & Research, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, R.U. (Telefone: +44 1980 612512; fax: +44 1980 611315) em 13 de Março de 1998, aos quais foram atribuídos os seguintes números de acesso: 98031215 para o hibridoma 17H10F4D10 que segrega o mAb IGH 222, que se liga ao epítopo aminoácidos 395-415 (ID SEQ 31), e 98031214 para o hibridoma 14H11B2 que segrega o mAb IGH 207, que se liga ao epítopo aminoácidos 307-326 (ID SEQ 30). A este respeito, deve ficar claro que anticorpos que se ligam a partes desses epítopos também fazem parte da presente invenção. Por exemplo, também são aqui incluídos anticorpos que se ligam aos seguintes epítopos: aminoácidos 307-311, aminoácidos 308-312, aminoácidos 309-313, aminoácidos 310-314, aminoácidos 311-315, aminoácidos 312-316, aminoácidos 312-317, aminoácidos 313-318, aminoácidos 314-319, aminoácidos 315-320, aminoácidos 316-321, aminoácidos 317-322, aminoácidos 318-323, aminoácidos 319-324, aminoácidos 320-325, aminoácidos 321-326, aminoácidos 307-312, aminoácidos 308-313, aminoácidos 309-314, aminoácidos 310- 16 315, aminoácidos 311-316, aminoácidos 312-317, aminoácidos 313- 318, aminoácidos 314-319, aminoácidos 315-320, aminoácidos 316-321, aminoácidos 317-322, aminoácidos 318- 323, aminoácidos 319-324, aminoácidos 320-325, aminoácidos 321-326, aminoácidos 307-313, aminoácidos 308-314, aminoácidos 309-315, aminoácidos 310-316, aminoácidos 311- 317, aminoácidos 312-318, aminoácidos 313-319, aminoácidos 314- 320, aminoácidos 315-321, aminoácidos 316-322, aminoácidos 317-323, aminoácidos 318-324, aminoácidos 319- 325, aminoácidos 320-326, aminoácidos 307-314, aminoácidos 308- 315, aminoácidos 309-316, aminoácidos 310-317, aminoácidos 311-318, aminoácidos 312-319, aminoácidos 313- 320, aminoácidos 314-321, aminoácidos 315-322, aminoácidos 316-323, aminoácidos 317-324, aminoácidos 318-325, aminoácidos 319-326, aminoácidos 307-315, aminoácidos 308- 316, aminoácidos 309-317, aminoácidos 310-318, aminoácidos 311- 319, aminoácidos 312-320, aminoácidos 313-321, aminoácidos 314-322, aminoácidos 315-323, aminoácidos 316- 324, aminoácidos 317-325, aminoácidos 318-326, aminoácidos 307-316, aminoácidos 308-317, aminoácidos 309-318, aminoácidos 310-319, aminoácidos 311-320, aminoácidos 312- 321, aminoácidos 313-322, aminoácidos 314-323, aminoácidos 315- 324, aminoácidos 316-325, aminoácidos 317-326, aminoácidos 307-317, aminoácidos 308-318, aminoácidos 309-319, aminoácidos 310-320, aminoácidos 311-321, aminoácidos 312- 322, aminoácidos 313-323, aminoácidos 314-324, aminoácidos 315-325, aminoácidos 316-326, aminoácidos 307- 318, aminoácidos 308-319, aminoácidos 309-320, aminoácidos 310-321, aminoácidos 311-322, aminoácidos 312-323, aminoácidos 313-324, aminoácidos 314-325, aminoácidos 315- 326, aminoácidos 307-319, aminoácidos 308-320, aminoácidos 309- 321, aminoácidos 310-322, aminoácidos 311-323, aminoácidos 312-324, aminoácidos 313-325, aminoácidos 314- 17 326, aminoácidos 307-320, aminoácidos 308-321, aminoácidos 309- 322, aminoácidos 310-323, aminoácidos 311-324, aminoácidos 312-325, aminoácidos 313-326, aminoácidos 307-321, aminoácidos 308-322, aminoácidos 309-323, aminoácidos 310- 324, aminoácidos 311-325, aminoácidos 312-326, aminoácidos 307-322, aminoácidos 308-323, aminoácidos 309- 324, aminoácidos 310-325, aminoácidos 311-326, aminoácidos 307- 323, aminoácidos 308-324, aminoácidos 309-325, aminoácidos 310-326, aminoácidos 307-324, aminoácidos 308- 325, aminoácidos 309-326, aminoácidos 307-325, aminoácidos 308- 326, e, aminoácidos 395-399, aminoácidos 396-400, aminoácidos 397-401, aminoácidos 398-402, aminoácidos 399-403, aminoácidos 400-404, aminoácidos 401-405, aminoácidos 402-406, aminoácidos 403-407, aminoácidos 404-408, aminoácidos 405-409, aminoácidos 406-410, aminoácidos 407-411, aminoácidos 408-412, aminoácidos 409-413, aminoácidos 410-414, aminoácidos 411-415, aminoácidos 395-400, aminoácidos 396-401, aminoácidos 397-402, aminoácidos 398- 403, aminoácidos 399-404, aminoácidos 400-405, aminoácidos 401-406, aminoácidos 402-407, aminoácidos 403-408, aminoácidos 404-409, aminoácidos 405-410, aminoácidos 406- 411, aminoácidos 407-412, aminoácidos 408-413, aminoácidos 409-414, aminoácidos 410-415, aminoácidos 395-401, aminoácidos 396-402, aminoácidos 397-403, aminoácidos 398- 404, aminoácidos 399-405, aminoácidos 400-406, aminoácidos 401- 407, aminoácidos 402-408, aminoácidos 403-409, aminoácidos 404-410, aminoácidos 405-411, aminoácidos 406- 412, aminoácidos 407-413, aminoácidos 408-414, aminoácidos 409-415, aminoácidos 395-402, aminoácidos 396-403, aminoácidos 397-404, aminoácidos 398-405, aminoácidos 399-406, aminoácidos 400-407, aminoácidos 401-408, aminoácidos 402- 409, aminoácidos 403-410, aminoácidos 404-411, aminoácidos 405-412, aminoácidos 406-413, aminoácidos 407- 18 414, aminoácidos 408-415, aminoácidos 395-403, aminoácidos 396-404, aminoácidos 397-405, aminoácidos 398-406, aminoácidos 399-407, aminoácidos 400-408, aminoácidos 401- 409, aminoácidos 402-410, aminoácidos 403-411, aminoácidos 404-412, aminoácidos 405-413, aminoácidos 406-414, aminoácidos 407-415,aminoácidos 395-403, aminoácidos 396- 404, aminoácidos 397-405, aminoácidos 398-406, aminoácidos 399- 407, aminoácidos 400-408, aminoácidos 401-409, aminoácidos 402-410, aminoácidos 403-411, aminoácidos 404- 412, aminoácidos 405-413, aminoácidos 406-414, aminoácidos 407-415, aminoácidos 395-404, aminoácidos 396-405, aminoácidos 397-406, aminoácidos 398-407, aminoácidos 399-408, aminoácidos 400-409, aminoácidos 401-410, aminoácidos 402- 411, aminoácidos 403-412, aminoácidos 404-413, aminoácidos 405-414, aminoácidos 406-415, aminoácidos 395- 405, aminoácidos 396-406, aminoácidos 397-407, aminoácidos 398-408, aminoácidos 399-409, aminoácidos 400-410, aminoácidos 401-411, aminoácidos 402-412, aminoácidos 403- 413, aminoácidos 404-414, aminoácidos 405-415, aminoácidos 395-406, aminoácidos 396-407, aminoácidos 397-408, aminoácidos 398-409, aminoácidos 399-410, aminoácidos 400-411, aminoácidos 401-412, aminoácidos 402-413, aminoácidos 403- 414, aminoácidos 404-415, aminoácidos 395-407, aminoácidos 396-408, aminoácidos 397-409, aminoácidos 398- 410, aminoácidos 399-411, aminoácidos 400-412, aminoácidos 401-413, aminoácidos 402-414, aminoácidos 403-415, aminoácidos 395-408, aminoácidos 396-409, aminoácidos 397- 410, aminoácidos 398-411, aminoácidos 399-412, aminoácidos 400- 413, aminoácidos 401-414, aminoácidos 402-415, aminoácidos 395-409, aminoácidos 396-410, aminoácidos 397- 411, aminoácidos 398-412, aminoácidos 399-413, aminoácidos 400-414, aminoácidos 401-415, aminoácidos 395-410, aminoácidos 396-411, aminoácidos 397-412, aminoácidos 398- 19 413, aminoácidos 399-414, aminoácidos 400-415, aminoácidos 395-411, aminoácidos 396-412, aminoácidos 397-413, aminoácidos 398-414, aminoácidos 399-415, aminoácidos 395-412, aminoácidos 396-413, aminoácidos 397-414, aminoácidos 398-415, aminoácidos 395-413, aminoácidos 396-414, aminoácidos 397-415, aminoácidos 395-414 e 396-415. A presente invenção também se refere a variantes ou fragmentos funcionalmente equivalentes dos anticorpos acima indicados. O termo "variantes ou fragmentos funcionalmente equivalentes" refere-se a qualquer variante ou fragmento conhecido na área desses anticorpos que retém a função de ligação a antigenes e a especificidade do anticorpo paterno.

Mais especificamente, o último termo refere-se a anticorpos humanizados e anticorpos de cadeia simples como definidos acima e a fragmentos de anticorpos, como Fab, F-(ab)2f Fv e afins. Também estão incluídos diacorpos, triacorpos e anticorpos tetravalentes, como descrito acima, bem como respectivas formas mutantes ou moléculas que exibem reactividades semelhantes de ligação funcional com as ID SEQ 30 e 31, tais como sequências obtidas de bibliotecas de fagos ou outras, como descrito por Ladner, 1995; Maclennan, 1995, e Cannon et ai., 1996. De facto, qualquer péptido descrito por estes autores, restringido ou não, que permita a detecção de antigenes de proteínas naturais do HCV faz parte da presente invenção. A presente invenção também se refere a linhas de células de hibridoma que segregam anticorpos como definidos acima. A este respeito, deve ser claro que a tecnologia de hibridoma para obter mAbs é bem conhecida do experimentado na área, por exemplo, essencialmente de acordo com Kohler e Milstein (1975). Também deve ser claro que o mapeamento dos epítopos aos quais se ligam especificamente os mAbs pode 20 ser feito por qualquer método conhecido na área, como os descritos em PCT/EP 97/07268, atribuída a Depla et ai. A presente invenção também se refere a um método para detectar antiqenes de proteínas naturais do HCV, que compreende: fazer com que uma amostra de teste, que pode conter antigenes de proteínas do HCV, entre em contacto com um anticorpo como definido acima, ou com uma variante ou fragmento funcionalmente equivalente desse anticorpo, para formar um complexo anticorpo-antigene, e determinar o referido complexo antigene-anticorpo com um marcador apropriado.

Preferencialmente, esse método é utilizado para a detecção in situ de proteínas de envelope do HCV. O termo "determinar o referido complexo antigene-anticorpo com um marcador apropriado" refere-se a qualquer método conhecido na área que detecta, ou visualiza, os complexos antigene-anticorpo acima indicados, tal como fluorescência, citometria de fluxo, ensaios do tipo de ligação, ELISA e RIA, ou ensaios de competição (ver secção de Exemplos, Hertogs et al., 1993, e WO 93/04084, atribuída a Mehta et al.). De modo semelhante, o termo "marcador apropriado" refere-se a qualquer marcador conhecido na área, como os descritos em WO 93/04084, atribuída a Mehta et al., e Coligan et al., 1992, que visualiza os complexos antigene-anticorpo acima indicados. A este respeito, a presente invenção também se refere a um estojo de ensaio para detectar antigenes de proteínas naturais do HCV, compreendendo: um anticorpo como definido acima, ou uma variante ou fragmento funcionalmente 21 equivalente desse anticorpo, e marcadores apropriados que permitam determinar os complexos formados entre antigenes de proteínas do HCV numa amostra de teste e o referido anticorpo, ou uma variante ou fragmento funcionalmente equivalente desse anticorpo. A presente invenção será agora ilustrada por referência aos exemplos seguintes que apresentam especificações particularmente vantajosas. No entanto, deve notar-se que estas especificações são meramente ilustrativas, não podendo ser consideradas restritivas da invenção de modo nenhum.

EXEMPLOS

Exemplo 1: Geração de anticorpos monoclonais contra El e E2 .

Imunizaram-se ratinhos com versões truncadas de El (aminoácidos 192-326) e E2 (aminoácidos 384-673), expressas por vírus vacínia recombinante, como descrito em PCT/EP 95/03031, atribuída a Maertens et al. Após a imunização, esplenócitos dos ratinhos foram fundidos a uma linha de células de mieloma. Seleccionaram-se por ELISA os hibridomas resultantes que segregam anticorpos específicos para El ou E2.

Exemplo 2: Selecção de anticorpos monoclonais.

Avaliou-se uma série grande de monoclonais (25 no total, dos quais 14 em pormenor; os últimos podem ser obtidos da Innogenetics NV, Gent, Bélgica) dirigidos contra a El ou E2 quanto à coloração de antigenes nativos do HCV em biopsias do fígado de pacientes infectados com o HCV e controlos 22 (ver abaixo). A coloração foi feita quer em crio-secções quer em biopsias fixadas com formaldeido (quanto aos protocolos, ver as legendas das figuras). Apenas três anticorpos monoclonais revelaram uma coloração clara e especifica. Todos os outros anticorpos monoclonais deram origem a coloração nula ou muito fraca, ou exibiram coloração inespecifica. Notavelmente observaram-se dois padrões diferentes de coloração de antigenes. 0 monoclonal IGH 222, dirigido contra a E2, corou claramente hepatócitos (Figura 1), ao passo que o IGH 207 e IGH 210, dirigidos contra a El, coraram linfócitos em infiltração no fígado (Figuras 2a e 2b). O IGH 207 também corou hepatócitos, mas num grau mais fraco do que o IGH 222 (comparar as Figuras 1 e 2a) . Este padrão de coloração foi confirmado numa série de biopsias de cinco pacientes diferentes.

Monoclonal envelope padrão de coloração IGH 200 El negativo IGH 201 El fraco IGH 202 El negativo IGH 204 El fraco IGH 207 El positividade forte de linfócitos, positividade mais fraca de hepatócitos IGH 209 El negativo IGH 210 El positivo em linfócitos (notado só após fixação com formaldeido) IGH 212 E2 fraco IGH 214 E2 negativo IGH 215 E2 negativo IGH 216 E2 negativo IGH 219 E2 negativo IGH 221 E2 negativo IGH 222 E2 positividade forte de hepatócitos 23

Exemplo 3: Identificação de anticorpos monoclonais que permitem detectar antigenes virais de envelope em células do sangue periférico. A descoberta de que infiltrados de linfócitos no fígado podem ser corados quanto a antigenes de envelope do HCV fez-nos olhar também para células mononucleares do sangue periférico. Para permitir a coloração intracelular, as células do sangue periférico foram permeabilizadas com saponina e, em seguida, deixaram-se reagir com os anticorpos monoclonais IGH 201 ou 207 (dirigidos contra a EI e exibindo positividade fraca e forte nas biopsias do fígado, respectivamente). Por fim, verificou-se a reactividade num aparato de triagem de células fluorescentes utilizando anticorpos secundários etiquetados com FITC. 0 IGH 207, que já tinha corado os infiltrados de linfócitos no fígado, exibiu especificidade elevada. Com este monoclonal quase não se detectou coloração de fundo, e 4 de 5 pacientes foram claramente corados positivamente (Figura 3). 0 segundo monoclonal, IGH 201 (que se liga à ID SEQ 29; número de acesso da ECACC: 98031216), que também é dirigido contra a El, dá origem a um fundo mais elevado, mas detectou-se El intracelular em 5 de 5 pacientes, como se pode deduzir dos histogramas apresentados na Figura 4, que mostram uma subpopulação clara de células com um grau mais elevado de fluorescência em comparação com a amostra de controlo.

Exemplo 4: Mapeamento dos anticorpos monoclonais reactivos contra El ou E2.

Todos os 14 anticorpos monoclonais foram mapeados para os seus epítopos respectivos utilizando péptidos que 24 procederam ao varrimento das proteínas EI e E2 contra as quais foram dirigidos os anticorpos. Estes péptidos foram biotinilados, ligados a placas de microtítulo sensibilizadas com estreptavidina e deixados reagir com os anticorpos monoclonais. Como controlo positivo verificaram-se proteínas de envelope recombinantes.

Para cada anticorpo monoclonal, a reactividade pôde ser atribuída a uma região específica de epítopos definida por dois péptidos com sobreposição (quanto a pormenores das sequências, ver a Tabela 1). Péptidos região de aminoácidos monoclonais reactivos V1V2 192-226 IGH 201, 204, 202, 200 V2V3 212-244 IGH 201, 204, 202, 200 V3V4 230-263 HR 261-290 V5C4 288-327 IGH 207, 210, 209 C4V6 307-340 IGH 207, 210, 209 recombinante 192-326 IGH 201, 207, 210, 204, 202, 200, 209 HVR I 384-415 IGH 222, 215 HVRl/Cla 395-428 IGH 222, 215 Cia 413-447 Clb 430-467 HVR II 460-487 IGH 212, 214, 221 C2a 480-513 IGH 219, 216 C2b 500-530 V3-C3 523-566 V4 561-590 C4a 578-627 C4b 621-648 C4c 641-673 recombinante 384-673 IGH 222, 215, 212, 214, 221, 219, 216 25 0 epítopo para o IGH 201 pode ser definido como a região 212-226 (ID SEQ 29), para o IGH 207 e IGH 210, este é 307-326 (ID SEQ 30), e para o IGH 222 este é 395-415 (ID SEQ 31) . A região de aminoácidos do IGH 201 é uma região bastante variável da proteína EI do HCV e já foi previamente relatada em conexão com a detecção in situ do HCV (Hiramatsu et ai., 1992, Kaito et ai., 1994). No entanto e a partir dos nossos estudos é claro que anticorpos dirigidos contra este epítopo são menos adequados para a detecção in situ do HCV, pois a coloração da biopsia do fígado com este anticorpo foi negativa e a coloração em linfócitos do sangue periférico exibiu um fundo considerável. Em contraste, o IGH 207 e IGH 210 reconhecem uma região completamente conservada da EI (Maertens e Stuyver, 1997). O monoclonal IGH 222 reconhece uma região da E2 que faz parte do domínio hipervariável N-terminal da E2 e demonstrou ser muito adequado para a detecção in situ eficiente do HCV.

Exemplo 5: Determinação de reactividade cruzada em epítopos variáveis.

Caracterizou-se suplementarmente o IGH 222 utilizando uma série estendida de péptidos derivados de várias sequências do epítopo hipervariável N-terminal da E2. A Tabela 2 mostra um resumo destas experiências. Desta tabela pode concluir-se que este monoclonal reage com várias sequências mas não consegue reagir com algumas outras. O conhecimento deste epítopo é suficiente para o experimentado na área dirigir anticorpos adicionais contra este epítopo com melhor reactividade com outras sequências que não são reconhecidas pelo IGH 222. Essas sequências são, a título exemplif icativo, os péptidos com # 490, 940, 884, 484 e 26 494, mas podem encontrar-se outras sequências na região entre os aminoácidos 395-415 contra as quais o IGH 222 pode não conseguir reagir. A partir destes exemplos fica claro que os epitopos reconhecidos pelos anticorpos monoclonais IGH 201, 207, 210 e 222 estão facilmente acessíveis para a ligação de anticorpos e permitem a detecção do antigene em biopsias do fígado e células do sangue periférico. As propriedades dos anticorpos monoclonais IGH 201, 207, 210 e 222 são bastante únicas, uma vez que outros monoclonais dirigidos contra os mesmos epitopos resultaram em fundo elevado e ausência de coloração específica. Por exemplo, todos os anticorpos monoclonais IGH 207, 209 e 210 reconhecem o mesmo epítopo; no entanto, o IGH 209 não consegue corar antigenes da EI em nenhum tipo de células, ao passo que o IGH 210 cora apenas linfócitos e o IGH 207 cora linfócitos e hepatócitos. Com a presente invenção, deve ser exequível para o experimentado na área produzir grandes séries de anticorpos (de natureza policlonal ou monoclonal, em várias espécies) que podem ser utilizados para a detecção de antigenes de proteínas naturais do HCV. A necessidade de produzir uma série de anticorpos contra um dado epítopo reflecte o facto do comportamento de um anticorpo não ser exclusivamente determinado pelo epítopo reconhecido, mas também por propriedades secundárias, como afinidade e avidez para o epítopo, solubilidade, isotipo e a espécie onde é gerado. Para cada aplicação pode ser necessário um anticorpo com diferentes propriedades secundárias. Assim, a produção dessas grandes séries de anticorpos irá permitir identificar alguns deles como tendo propriedades semelhantes ao IGH 201, 207, 210 e 222, isto é, ser capaz de revelar a presença de proteínas de envelope do HCV em amostras biológicas do hospedeiro. De 27 facto, o conhecimento de que estes epítopos estão claramente acessíveis nas proteínas de envelope do HCV, tal como expressas no hospedeiro, fornece a informação necessária para desenvolver ensaios com a finalidade de detectar estes antigenes não só in situ, como apresentado aqui, mas também em solução (por exemplo, em plasma ou soro) . Os anticorpos monoclonais IGH 201, 207, 210 ou 222, ou outros desenvolvidos contra o mesmo epítopo mas com características óptimas para detectar antigenes solúveis, possivelmente em combinação com outros, também podem ser utilizados para desenvolver esse ensaio.

LISTA DE REFERÊNCIAS

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Tabela 1

péptidos de EI

YQVRNSTGLYHVTNDCPNSSIVYEAADAILHTPGC

YEVRNVSGIYHVTNDCSNSSIVYEAADMIMHTPGC

VEVKNNSNSYMATNDCSNSSIIWQLEGAVLHTPGC

VEVKNTSTSYMVTNDCSNSSIVWQLEGAVLHTPGC

LEWRNTSGLYVLTNDCSNSSIVYEADDVILHTPGC

INYRNVSGIYHVTNDCPNSSIVYEADHHILHLPGC

VPYRNASGIYHITNDCPNSSIVYEADNLILHAPGC

LTYGNSSGLYHLTNDCSNSSIVLEADAMILHLPGC

LNYANKSGLYHLTNDCPNSSIVYEANGMILHLPG

IQVKNASGIYHLTNDCSNSSIVFEAETMILHLPGC

LEYRNASGLYMVTNDCSNGSIVYEAGDIILHLPGC

IVYEAADMIMHTPGCVPCVRENNS SRCWV

VRENNSSRCWVALTPTLAARNASVPTTTIRRHVD

HVDLLVGAAAFCSAMYVGDLCGSVFLVSQL

SQLFTISPRRHETVQDCNCSIYPGHITGHRMAWDMMMNWS

SI YPGHITGHRMAWDMMMNWSPTTALWSQLLRI

HTRVSGGAAASNTRGLVSLFSPGSAQKIQLVN

NTRGLVSLFSPGSAQKIQLVNTNGSWHINRTALN

LVNTNGSWHINRTALNCNDSLQTGFFAALFYKHKF

NDSLQTGFFAALFYKHKFNSSGCPERLASCRSIDKFAQ

RSIDKFAQGWGPLTYTEPNSSDQRPYCW

SDQRPYCWHYAPRPCGIVPASQVCGPVYCFTPSP

SQVCGPVYCFTPSPWVGTTDRFGVPTYNWG

GVPTYNWGANDSDVLILNNTRPPRGNWFGCTWMNGTGFTK

TCGG

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TDCFRKHPEATYARCGSGPWLTPRCMVHYPYRLWHYPCTV

NFTIF

TVNF TIFKVRMYVGGVEHRF EAACNWTR EAACNWTRGERCDLEDRDRSELSPLLLSTTEWQ KTTNRLVSMFASGPKQNVHLINT HTTSTLAS LFSPGASQRIQLVNT HVTCTLTSLFRPGASQKIQLVNT

Genótipo nome # Amino- ácidos la VIV2 1071 192-226 lb VIV2 888 192-226 2a VIV2 1019 192-226 2c VIV2 1074 192-226 3 VIV2 1008 192-226 4 VIV2 1075 192-226 5 VIV2 1084 192-226 6 VIV2 1023/1085 192-226 7 VIV2 1334 192-225 9 VIV2 1333 192-226 10 VIV2 1332 192-226 lb V2V3 1036 212-244 lb V3V4 1022 230-263 lb HR 1150 261-290 lb V5C4 1176 288-327 lb C4V6 1039 307-340 lb HVR I 1139 384-415 lb HVR 1173 395-428 I /Cia lb Cia 1149 413-447 lb Clb 1148 430-467 lb HVR II 1020 460-487 lb C2a 1147 480-513 lb C2b 1143 500-530 lb V3-C3 1178 523-566 lb V4 1142 561-590 lb C4a 16 583-627 lb C4b 1141 621-648 lb C4c 1140 641-673 - HVR I 485 394-416 - HVR I 492 395-416 _ HVR I 489 394-416 30 30 Tabela 1 (continuação) péptidos de EI Genótipo nome # Amino- ácidos AHNARTLTGMFSLGARQKIQLINT - HVR I 520 394-416 SDTRGLVSLFSPGSAQKIQLVNT - HVR I 886 394-416 SSTQSLVSWLSQGPSQKIQLVNT - HVR I 494 394-416 HTMTGIVRFFAPGPKQNVHLINT - HVR I 484 394-416 RAMSGLVSLFTPGAKQNIQLINT - HVR I 884 394-416 HVTGTLTSLFRPGASQKIQLVNT - HVR I 940 394-416

Tabela 2 sequência # região de aminoácidos 1139 384-415 485 394-416 492 395-416 520 394-416 886 394-416 494 394-416 484 394-416 884 394-416 940 394-416 490 394-416

Reconhecimento por IGH 222 + + + + +

HTRVSGGAAASNTRGLVSLFSPGSAQKIQLVN

KTTNRLVSMFASGPKQNVHLINT

HTTSTLASLFSPGASQRIQLVNT

AHNARTLTGMFSLGARQKIQLINT

SDTRGLVSLFSPGSAQKIQLVNT

SSTQSLVSWLSQGPSQKIQLVNT

HTMTGIVRFFAPGPKQNVHLINT

RAMSGLVSLFTPGAKQNIQLINT

HVTGTLTSLFRPGASQKIQLVNT

RTTQGLVSLFSRGAKQDIQLINT mutações não conservativas nos péptidos que não reagem com o IGH 222 estão mostradas a cheio

Lisboa, 13 de Novembro de 2006

Claims (6)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de um anticorpo que é segregado pela linha de células de hibridoma do depósito da ECACC com o número de acesso 98031214 ou pela linha de células de hibridoma do depósito da ECACC com o número de acesso 98031215, ou variante ou fragmento funcionalmente equivalente de qualquer um desses anticorpos, para a preparação de um estojo de detecção de antigenes de proteínas naturais do HCV.

2. Anticorpo monoclonal segregado por uma linha de células de hibridoma do depósito da ECACC com o número de acesso 98031214 ou 98031215.

3. Variante ou fragmento funcionalmente equivalente do anticorpo de acordo com a Reivindicação 2.

4. Linha de células de hibridoma do depósito da ECACC com o número de acesso 98031214 ou 98031215.

5. Método para a detecção de antigenes de proteínas naturais do HCV, compreendendo: fazer com que uma amostra de teste, que pode conter antigenes de proteínas do HCV, entre em contacto com um anticorpo de acordo com a Reivindicação 2 ou 3, para formar um complexo anticorpo-antigene, e determinar o referido complexo antigene-anticorpo com um marcador apropriado. 2 Método de acordo com a Reivindicação 5, em que a referida amostra de teste compreende células ou tecidos humanos. Método de acordo com a Reivindicação 6, em que as referidas células humanas sao células do sangue periférico. Método de acordo com a Reivindicação 6, em que o referido tecido humano é tecido do fígado.

9. Estojo de ensaio para a detecção de antigenes de proteínas naturais do HCV, compreendendo: um anticorpo de acordo com a Reivindicação 2 ou 3, e, opcionalmente, marcadores apropriados que permitem determinar os complexos formados entre antigenes de proteínas do HCV numa amostra de teste e o referido anticorpo. Lisboa, 13 de Novembro de 2006