JPS63157060A - Ｂ型肝炎コア抗原に対する抗体の検定 - Google Patents
Ｂ型肝炎コア抗原に対する抗体の検定Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
抗体を検出するための、Ｂ型肝炎コア抗原（以下ＨＢｃ
Ａｇと略記する）に対する単一モノクローナル抗体を用
いる阻害アッセイに関する。本発明はまた免疫原として
組換えＨＢｃＡｇ （ｒｌｌＢｃＡｇ）を用いる短い免
疫化スケ／ニールでの、）ｌＢｃＡｇに対するモノクロ
ーナル抗体の製法、およびＨＢｃＡｇに対するモノクロ
ーナル抗体を検出するための競合的アッセイによるハイ
ブリドーマ上澄み液のスクリーニング法にも関する。こ
のスクリーニング法はまた他の免疫原に対する抗体のス
クリーニングにも使用されつる。本発明はまたＨＢｃＡ
ｇに対するある種のモノクローナル抗体、およびそれら
抗体を産生ずるハイブリドーマ細胞系統にも関する。
Ａｇと略記する）に対する単一モノクローナル抗体を用
いる阻害アッセイに関する。本発明はまた免疫原として
組換えＨＢｃＡｇ （ｒｌｌＢｃＡｇ）を用いる短い免
疫化スケ／ニールでの、）ｌＢｃＡｇに対するモノクロ
ーナル抗体の製法、およびＨＢｃＡｇに対するモノクロ
ーナル抗体を検出するための競合的アッセイによるハイ
ブリドーマ上澄み液のスクリーニング法にも関する。こ
のスクリーニング法はまた他の免疫原に対する抗体のス
クリーニングにも使用されつる。本発明はまたＨＢｃＡ
ｇに対するある種のモノクローナル抗体、およびそれら
抗体を産生ずるハイブリドーマ細胞系統にも関する。
Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢ Ｖ）での感染は世界的な健康
上の問題であり、慢性のキャリアー（保菌者）はア／ア
およびアフリカの人口のほぼ１０％に達している。ＨＢ
Ｖに関連した死亡の主要な原因は、慢性の活性肝炎、肝
硬変および肝細胞癌である。慢性のキャリアーも新たに
感染した個体もかかる合併症で倒れる危険がある。重要
な伝染径路の一つは活性感染者であるかまたは慢性キャ
リアーである母親による分娩時の新生児の感染である。
上の問題であり、慢性のキャリアー（保菌者）はア／ア
およびアフリカの人口のほぼ１０％に達している。ＨＢ
Ｖに関連した死亡の主要な原因は、慢性の活性肝炎、肝
硬変および肝細胞癌である。慢性のキャリアーも新たに
感染した個体もかかる合併症で倒れる危険がある。重要
な伝染径路の一つは活性感染者であるかまたは慢性キャ
リアーである母親による分娩時の新生児の感染である。
他の伝染径路には健康に関する問題を治療するのに使用
される汚染された血液または血液製剤が包含される。
される汚染された血液または血液製剤が包含される。
ＨＢＶで感染すると、大量のウィルスおよび関連する粒
子が血清中に存在する。それら粒子はＤＮＡを含有しう
るが、しかし大半はそれらの表面にＢ型肝炎表面抗原（
ＨＢ ｓ Ａ ｇ ）を有する空のウィルス性エンベロ
ープである。ＨＢｓＡｇに対する抗体の出現は循環性Ｈ
ＢｓＡｇの消失約２か列後までは通常観察されない。こ
の期間中、その人物は感染力が高いが、ＨＢｓＡｇまた
はｔｌ Ｂ ｓ Ａ ｇに対する抗体のレベルが検出で
きないほど低いので臨床的には非感染性であると診断さ
れよう。
子が血清中に存在する。それら粒子はＤＮＡを含有しう
るが、しかし大半はそれらの表面にＢ型肝炎表面抗原（
ＨＢ ｓ Ａ ｇ ）を有する空のウィルス性エンベロ
ープである。ＨＢｓＡｇに対する抗体の出現は循環性Ｈ
ＢｓＡｇの消失約２か列後までは通常観察されない。こ
の期間中、その人物は感染力が高いが、ＨＢｓＡｇまた
はｔｌ Ｂ ｓ Ａ ｇに対する抗体のレベルが検出で
きないほど低いので臨床的には非感染性であると診断さ
れよう。
血清中に存在するウィルス粒子はそれらの表面被覆を脱
ぎ捨て、核キャプシドか露出していることが知られてい
る。１８ＭクラスおよびＩｇＧクラスの抗体のいずれも
核キャプシドコアのタンパク質に対して生成される。こ
のタンパク質はＢ型肝炎コア抗原（ＨＢｃＡｇ）として
知られている。感染の早期にはＩｇＭ抗−ＨＢｃＡｇ抗
体が産生され、それらの力価は循環性ＨＢ ｓ Ａ ｇ
力価が低下するに伴い上昇する。ＩｇＧ抗ＨＢｃＡｇ抗
体の力価は１８Ｍクラスの抗体力価が低下するに伴い、
かつ抗Ｉｆ Ｂ ｓ Ａ ｇ抗体力価かかなり上昇する
に先立ち上昇する。それゆえＨＢＶ免疫状態を診断する
場合ＨＢ ｃ Ａ ｇに対する１８ＭクラスおよびＩｇ
Ｇクラスの抗体の存在について検査することか好都合で
ある。
ぎ捨て、核キャプシドか露出していることが知られてい
る。１８ＭクラスおよびＩｇＧクラスの抗体のいずれも
核キャプシドコアのタンパク質に対して生成される。こ
のタンパク質はＢ型肝炎コア抗原（ＨＢｃＡｇ）として
知られている。感染の早期にはＩｇＭ抗−ＨＢｃＡｇ抗
体が産生され、それらの力価は循環性ＨＢ ｓ Ａ ｇ
力価が低下するに伴い上昇する。ＩｇＧ抗ＨＢｃＡｇ抗
体の力価は１８Ｍクラスの抗体力価が低下するに伴い、
かつ抗Ｉｆ Ｂ ｓ Ａ ｇ抗体力価かかなり上昇する
に先立ち上昇する。それゆえＨＢＶ免疫状態を診断する
場合ＨＢ ｃ Ａ ｇに対する１８ＭクラスおよびＩｇ
Ｇクラスの抗体の存在について検査することか好都合で
ある。
ＩｇＭ抗１１ Ｂ ｃ Ａ ｇ抗体および総抗ＨＢｃＡ
ｇ抗体を検出するためのイムノアッセイか開発されてき
た。
ｇ抗体を検出するためのイムノアッセイか開発されてき
た。
総抗ＨＢｃＡｇ抗体について商業的に利用しうる検定法
は、一般に感染した供与者から集められたＩＩ Ｂ ｃ
Ａ ｇに対する標識されたヒトポリクローナル抗体を
用いて、ＩＩ Ｂ ｃ Ａ ｇで被覆された固相への結
合を患者検体からの未標識抗体と競合させることからな
る競合的アッセイである。この種の商業的に利用しうる
アッセイの例としてはＣｏｒｚｙｍ’ｅ■エンザイムイ
ムノアツセイ（米国、イリノイ州シカゴのＡｂｂｏｔｔ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）があげられる。１８Ｍ
クラスの抗体についての最も普通に商業的に利用しつる
アッセイは多層サンドイッチアッセイと呼ばれつる。固
相抗１ｇＭ抗体か患者の検体からのすべてのＩｇＭ抗体
を捕捉するのに用いられる。次にＨＢｃＡｇを加えて、
検体からの特異的なＩｇＭクラス抗１１ Ｂ ｃ Ａ
ｇと結合させる。
は、一般に感染した供与者から集められたＩＩ Ｂ ｃ
Ａ ｇに対する標識されたヒトポリクローナル抗体を
用いて、ＩＩ Ｂ ｃ Ａ ｇで被覆された固相への結
合を患者検体からの未標識抗体と競合させることからな
る競合的アッセイである。この種の商業的に利用しうる
アッセイの例としてはＣｏｒｚｙｍ’ｅ■エンザイムイ
ムノアツセイ（米国、イリノイ州シカゴのＡｂｂｏｔｔ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）があげられる。１８Ｍ
クラスの抗体についての最も普通に商業的に利用しつる
アッセイは多層サンドイッチアッセイと呼ばれつる。固
相抗１ｇＭ抗体か患者の検体からのすべてのＩｇＭ抗体
を捕捉するのに用いられる。次にＨＢｃＡｇを加えて、
検体からの特異的なＩｇＭクラス抗１１ Ｂ ｃ Ａ
ｇと結合させる。
次に標識されたヒトポリクローナル抗ＨＢｃＡｇを用い
て、支持体に結合したすべてのＨＢｃＡｇを検出し、か
（して検体中におけるＩｇＭクラス抗ＩＩ Ｂ ｃ Ａ
ｇの存在か示される。この種の商業的に利用しつるア
ッセイの例はＣｏｒｚｙｍｅＯＭエンザイムイム／アッ
セイ（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ’１７
）かあげられる。いずれの検定法においても大量のヒ
トポリクローナル抗１１ Ｂ ｃ Ａ ｇが用いられる
。他の構成形態も可能である。
て、支持体に結合したすべてのＨＢｃＡｇを検出し、か
（して検体中におけるＩｇＭクラス抗ＩＩ Ｂ ｃ Ａ
ｇの存在か示される。この種の商業的に利用しつるア
ッセイの例はＣｏｒｚｙｍｅＯＭエンザイムイム／アッ
セイ（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ’１７
）かあげられる。いずれの検定法においても大量のヒ
トポリクローナル抗１１ Ｂ ｃ Ａ ｇが用いられる
。他の構成形態も可能である。
かかる検定法に必要とされる大量のヒトポリクローナル
抗ＨＢｃＡｇ抗体は好ましくは各回置じ提供者集団から
収集し、単離し、精製しそして放射性同位元素または酵
素で標識されねばならない。汚染された血液のこの広範
な処理に関連して健康上かなりの危険が存在しかつ経費
がかかる。かかる健康上の危険にさらされることなくＨ
ＢｃＡｇに対する抗体を一定かつ一貫して供給できるこ
とが好都合であろう。この要求はこれらイムノアッセイ
において代替されつるモノクローナル抗体により満たさ
れうる。
抗ＨＢｃＡｇ抗体は好ましくは各回置じ提供者集団から
収集し、単離し、精製しそして放射性同位元素または酵
素で標識されねばならない。汚染された血液のこの広範
な処理に関連して健康上かなりの危険が存在しかつ経費
がかかる。かかる健康上の危険にさらされることなくＨ
ＢｃＡｇに対する抗体を一定かつ一貫して供給できるこ
とが好都合であろう。この要求はこれらイムノアッセイ
において代替されつるモノクローナル抗体により満たさ
れうる。
ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎは１９７５年にモ
ノクローナル抗体を分泌する連続的ハイブリッド細胞系
統の確立についてはじめて報告している（ ｒＮａｔｕ
ｒｅＪ ２５Ｂ、４９５ （１９７５））。それ以來種
々の抗原に対するモノクローナル抗体の製法か白菜上よ
（知られて来た。任意の特定の抗原に対する特異的な望
ましい性質を有するモノクローナル抗体の生成は当該技
術の教示からは予想できない。
ノクローナル抗体を分泌する連続的ハイブリッド細胞系
統の確立についてはじめて報告している（ ｒＮａｔｕ
ｒｅＪ ２５Ｂ、４９５ （１９７５））。それ以來種
々の抗原に対するモノクローナル抗体の製法か白菜上よ
（知られて来た。任意の特定の抗原に対する特異的な望
ましい性質を有するモノクローナル抗体の生成は当該技
術の教示からは予想できない。
Ｃｉａｎｆｒｉｇｌｉａ氏（ｍ ＣｒＨｙｂｒｉｄｏｍ
ａＪ １２（４）、４５１−４５７）（１９８３）参照
〕は抗体を分泌するハイブリドーマを生成させるための
短期間免疫化スケジュールについて開示シてイル。
ａＪ １２（４）、４５１−４５７）（１９８３）参照
〕は抗体を分泌するハイブリドーマを生成させるための
短期間免疫化スケジュールについて開示シてイル。
ＨＢ ｓ Ａ ｇに対するモノクローナル抗体は多くの
グループに開示されている（例えば、Ｗａｎｄｓ氏（Ｉ
ｔＬの米国特許第４．２７１．１４５号および同第４．
４９１．６３２号全照）。Ｗａｎｄｓ氏他は、第１回目
の抗原投与が腹腔内に行われ、そして第２回目の投与が
少くとも３週間後に静脈内に行われることが決定的に重
要であると報告している。免疫化に用いられる抗原は汚
染されたヒト血漿から単離された。細胞融合は知られた
方法により行われた。
グループに開示されている（例えば、Ｗａｎｄｓ氏（Ｉ
ｔＬの米国特許第４．２７１．１４５号および同第４．
４９１．６３２号全照）。Ｗａｎｄｓ氏他は、第１回目
の抗原投与が腹腔内に行われ、そして第２回目の投与が
少くとも３週間後に静脈内に行われることが決定的に重
要であると報告している。免疫化に用いられる抗原は汚
染されたヒト血漿から単離された。細胞融合は知られた
方法により行われた。
抗ＨＢｓＡ、ｇ活性を評価するために３種の試験が用い
られた。ＨＢｓＡｇで被覆されたミクロ滴定プレートへ
の抗体の結合を〔目’Ｉ）−ＨＢｓＡｇまたは［１２５
＋３−ヤギ抗マウスＦ（ａｂ’）ｔのいずれかを用いて
探査した。第３のアッセイはＨＢｓＡｇで被覆されたヒ
ト〇−陰性赤血球を抗ＩＩ Ｂ ｓ Ａ ｇが凝集させ
る能力について検査した。彼らはかかる方法はＩｔ Ｂ
ｃ Ａ ｇに対するモノクローナル抗体の調製にも有
用であろうことを示唆している。
られた。ＨＢｓＡｇで被覆されたミクロ滴定プレートへ
の抗体の結合を〔目’Ｉ）−ＨＢｓＡｇまたは［１２５
＋３−ヤギ抗マウスＦ（ａｂ’）ｔのいずれかを用いて
探査した。第３のアッセイはＨＢｓＡｇで被覆されたヒ
ト〇−陰性赤血球を抗ＩＩ Ｂ ｓ Ａ ｇが凝集させ
る能力について検査した。彼らはかかる方法はＩｔ Ｂ
ｃ Ａ ｇに対するモノクローナル抗体の調製にも有
用であろうことを示唆している。
Ｔｅｄｄｅｒ氏（Ｉｌ！ 〔「Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
ＩＴｙｇｉｅｎｅＣａｍｂｒｉｄｇｅＪ ９０．１
３５−１４２ （１９８３）およびｒＰｒｏｃｅｅｄｉ
ｎｇｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｈｅｐａｔｉ
ｔｉｓＶｏｒｋｓｈｏｐｊ ２０１−２０８ （１９８
３）参照〕はＩｆ Ｂ ｃ Ａ ｇに対する６種のモノ
クローナル抗体の産生について報告している。マウスに
感染肝臓から精製したＨＢｃＡｇ ５０〜１００μ９
を３〜４回連続して腹腔内注射することによりそのマウ
スを免疫した。抗ＨＢｃＡｇを分泌するクローンを下記
捕捉アッセイを用いて確認した、すなわち、ウサギの抗
マウスＩｇＧで被覆された固相にすべての利用可能なマ
ウスＩｇＧを結合させ、精製ＨＢｃＡｇを添加して存在
するすべての抗１（Ｂ ｃ Ａ ｇに結合させ、［１ｆ
ｆｉＪ）−ヒト抗ＨＢｃＡｇを添加し、そして如何はど
の放射能が支持体に結合されたか測定する。支持体に結
合した放射能が存在することは、検査されたクローンが
抗ＨＢｃＡｇを分泌することを示している。Ｔｅｄｄｅ
ｒ氏池はまた、抗ＨＢｃＡｇ分泌性ハイブリッドを検出
するための代替法は商業的に入手しうる競合的ＲＩＡま
たはＥＬＩＳＡ試験の１種を用いればよいかも知れない
とも述べている。しかしながら彼らはかかるアッセイは
その価値が限定されることが予期されようと述べている
。
ＩＴｙｇｉｅｎｅＣａｍｂｒｉｄｇｅＪ ９０．１
３５−１４２ （１９８３）およびｒＰｒｏｃｅｅｄｉ
ｎｇｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｈｅｐａｔｉ
ｔｉｓＶｏｒｋｓｈｏｐｊ ２０１−２０８ （１９８
３）参照〕はＩｆ Ｂ ｃ Ａ ｇに対する６種のモノ
クローナル抗体の産生について報告している。マウスに
感染肝臓から精製したＨＢｃＡｇ ５０〜１００μ９
を３〜４回連続して腹腔内注射することによりそのマウ
スを免疫した。抗ＨＢｃＡｇを分泌するクローンを下記
捕捉アッセイを用いて確認した、すなわち、ウサギの抗
マウスＩｇＧで被覆された固相にすべての利用可能なマ
ウスＩｇＧを結合させ、精製ＨＢｃＡｇを添加して存在
するすべての抗１（Ｂ ｃ Ａ ｇに結合させ、［１ｆ
ｆｉＪ）−ヒト抗ＨＢｃＡｇを添加し、そして如何はど
の放射能が支持体に結合されたか測定する。支持体に結
合した放射能が存在することは、検査されたクローンが
抗ＨＢｃＡｇを分泌することを示している。Ｔｅｄｄｅ
ｒ氏池はまた、抗ＨＢｃＡｇ分泌性ハイブリッドを検出
するための代替法は商業的に入手しうる競合的ＲＩＡま
たはＥＬＩＳＡ試験の１種を用いればよいかも知れない
とも述べている。しかしながら彼らはかかるアッセイは
その価値が限定されることが予期されようと述べている
。
何故ならモノクローナル抗体は固相ＨＢｃＡｇ上に存在
するうちの単一エピトープしか封鎖しないであろうから
である。Ｔｅｄｄｅｒ氏他は競合的ＲＩ Ａを用いるモ
ノクローナル抗ＨＢ ＣＡ ｇ 抗体ヲ分泌する６種の
ハイブリドーマからの上澄み液の検査について報告して
いるが、しかし得られる阻害レベル（３２〜８８％）に
よっては競合的ＲＩＡ単独による抗体の信頼しうる検出
はできないであろうと述べている。
するうちの単一エピトープしか封鎖しないであろうから
である。Ｔｅｄｄｅｒ氏他は競合的ＲＩ Ａを用いるモ
ノクローナル抗ＨＢ ＣＡ ｇ 抗体ヲ分泌する６種の
ハイブリドーマからの上澄み液の検査について報告して
いるが、しかし得られる阻害レベル（３２〜８８％）に
よっては競合的ＲＩＡ単独による抗体の信頼しうる検出
はできないであろうと述べている。
Ｔｅｄｄｅｒ氏他はＨＢｃＡｇの存在について肝バイオ
プシーする際のモノクローナル抗ＨＢ ｃ Ａ ｇ 抗
体の使用について開示している。彼らは体液中のＨＢｃ
Ａｇに対する抗体を検出するための阻害アッセイ（例丸
ば拮抗、競合）における抗体の使用については開示して
いない。
プシーする際のモノクローナル抗ＨＢ ｃ Ａ ｇ 抗
体の使用について開示している。彼らは体液中のＨＢｃ
Ａｇに対する抗体を検出するための阻害アッセイ（例丸
ば拮抗、競合）における抗体の使用については開示して
いない。
Ｆｕｒｕｙａ氏他の〔「Ｊａｐａｎ Ｊ、 Ｍｅｄ、
Ｓｃｉ、 Ｂｉｏｌ、ｊ３７、１５１−１５９ （１９
８４）） もＨＢ ＣＡ ｇに対するモノクローナル
抗体の産生について報告している。マウスを、ヒトの血
漿から精製されたＨＢｃＡｇを用いて１週間間隔で３回
皮下および筋肉注射することにより免疫した。抗ＨＢｃ
Ａｇを分泌するクローンを免疫付着赤血球凝集（［ＡＩ
（Ａ）および逆受動赤血球凝集（ＲＰＨＩ）法により確
認した。この２種の試験により検出されたモノクローナ
ル抗体の数は１８であった。ｐｕｒｕｙａ氏池はハイブ
リドーマ上澄み液中におけるｔｌ Ｂ ｃ Ａ ｇに対
するモノクローナル抗体の検出に競合的アッセイを用い
ることは教示していない。
Ｓｃｉ、 Ｂｉｏｌ、ｊ３７、１５１−１５９ （１９
８４）） もＨＢ ＣＡ ｇに対するモノクローナル
抗体の産生について報告している。マウスを、ヒトの血
漿から精製されたＨＢｃＡｇを用いて１週間間隔で３回
皮下および筋肉注射することにより免疫した。抗ＨＢｃ
Ａｇを分泌するクローンを免疫付着赤血球凝集（［ＡＩ
（Ａ）および逆受動赤血球凝集（ＲＰＨＩ）法により確
認した。この２種の試験により検出されたモノクローナ
ル抗体の数は１８であった。ｐｕｒｕｙａ氏池はハイブ
リドーマ上澄み液中におけるｔｌ Ｂ ｃ Ａ ｇに対
するモノクローナル抗体の検出に競合的アッセイを用い
ることは教示していない。
Ｆｕｒｕｙａ氏他はモノクローナル抗体をペルオキシダ
ーゼで標識して、そのものを血清中の抗ＨＢｃＡｇ抗体
を測定するための阻害アッセイに使用することについて
開示している。抗ＨＢ ｃ Ａ ｇ抗体を含有する血清
を最適量のＨＢｃＡｇとインキュベーションした。・抗
ＨＢｃＡｇモノクローナル抗体で被覆されたガラスピー
ズを添加し、続いてペルオキシダーゼで標識された抗Ｉ
ｔ Ｂ ｃ Ａ ｇモノクローナル抗体、次にＯ−フエ
ニレンジアミンヲ加えた。酵素反応を停止させ、吸光度
（光学、農産、Ｏ，Ｄ、 ）を測定した。阻害％は下記
のようにして計算された。
ーゼで標識して、そのものを血清中の抗ＨＢｃＡｇ抗体
を測定するための阻害アッセイに使用することについて
開示している。抗ＨＢ ｃ Ａ ｇ抗体を含有する血清
を最適量のＨＢｃＡｇとインキュベーションした。・抗
ＨＢｃＡｇモノクローナル抗体で被覆されたガラスピー
ズを添加し、続いてペルオキシダーゼで標識された抗Ｉ
ｔ Ｂ ｃ Ａ ｇモノクローナル抗体、次にＯ−フエ
ニレンジアミンヲ加えた。酵素反応を停止させ、吸光度
（光学、農産、Ｏ，Ｄ、 ）を測定した。阻害％は下記
のようにして計算された。
Ｆｕｒｕｙａ氏他の検定法は２重抗体アッセイである。
固定されたモノクローナル抗体および標識されたモノク
ローナル抗体はＨＢｃＡｇ分子上の異なる部位に結合し
なければならない。それらが同じ部位に結合した場合は
、結合部位が固定された抗体で占拠され、標識された抗
体が結合できないので、偽りの陽性結果が生じよう。こ
のことは固定された抗体と標識された抗体が相異してお
りかつＨＢｃＡｇ分子上の異なるエピトープに対して特
異的でなければならないか、またはそれらかＨＢｃＡｇ
分子上に１個所以上存在するエピトープに対して特異的
でなければならないことを意味する。恐らくこれらの限
定があるゆえに、２重モノクローナル抗体型の抗ＨＢ
ｃ Ａ ｇ 用アッセイが商品化されないと考えられる
。
ローナル抗体はＨＢｃＡｇ分子上の異なる部位に結合し
なければならない。それらが同じ部位に結合した場合は
、結合部位が固定された抗体で占拠され、標識された抗
体が結合できないので、偽りの陽性結果が生じよう。こ
のことは固定された抗体と標識された抗体が相異してお
りかつＨＢｃＡｇ分子上の異なるエピトープに対して特
異的でなければならないか、またはそれらかＨＢｃＡｇ
分子上に１個所以上存在するエピトープに対して特異的
でなければならないことを意味する。恐らくこれらの限
定があるゆえに、２重モノクローナル抗体型の抗ＨＢ
ｃ Ａ ｇ 用アッセイが商品化されないと考えられる
。
Ｔｅｄｄｅｒ氏他においてもＦｕｒｕｙ３氏他において
も、抗ＨＢｃＡｇモノクローナル抗体はマウスをヒトＨ
ＢｃＡｇで免疫することにより産生された。ヒトの肝臓
または血漿からのＨＢ ｃ Ａ ｇの精製は骨か折れか
つ健康上相当の危険がある。Ｍｕｒｒａｙ氏曲（ヨーロ
ッパ特許第０．０１３．８２８号）はＨＢｃＡｇをコー
ドする組換えＤＮＡで形質転換された大腸菌について開
示している。この形質転換された大腸菌により発現され
るポリペプチドはヒトポリクローナル抗ＨＢｃＡｇ抗体
と反応し、そしてｒ ｔｌ Ｂ ｃ Ａ ｇと呼ばれる
。
も、抗ＨＢｃＡｇモノクローナル抗体はマウスをヒトＨ
ＢｃＡｇで免疫することにより産生された。ヒトの肝臓
または血漿からのＨＢ ｃ Ａ ｇの精製は骨か折れか
つ健康上相当の危険がある。Ｍｕｒｒａｙ氏曲（ヨーロ
ッパ特許第０．０１３．８２８号）はＨＢｃＡｇをコー
ドする組換えＤＮＡで形質転換された大腸菌について開
示している。この形質転換された大腸菌により発現され
るポリペプチドはヒトポリクローナル抗ＨＢｃＡｇ抗体
と反応し、そしてｒ ｔｌ Ｂ ｃ Ａ ｇと呼ばれる
。
本発明は
（１）検体、およびｔｌ Ｂ ＣＡ ｇに対する標識さ
れた抗体とを固形支持体に結合されたＩＩ Ｂ ｃ Ａ
ｇと一緒にインキュベートし、 （２）支持体を洗浄して標識された抗体の結合しなかっ
た部分を除去し、そして （３） ＨＢｃＡｇに結合する゛かまたはＨＢ ＣＡ
ｇに結合しなかった（１識された抗体により生成される
ングナルを測定する、 ことにより患者検体中のＨＢｃＡｇに対する抗体を検出
するための改良された単一の一抗体阻害アッセイを提供
するものである。改良点とは、標識された抗体として競
合的ＥＬＩＳＡアッセイにおいてヒト抗ＨＢｃＡｇポリ
クローナル抗体と有効に競合するモノクローナル抗体を
使用することにある。
れた抗体とを固形支持体に結合されたＩＩ Ｂ ｃ Ａ
ｇと一緒にインキュベートし、 （２）支持体を洗浄して標識された抗体の結合しなかっ
た部分を除去し、そして （３） ＨＢｃＡｇに結合する゛かまたはＨＢ ＣＡ
ｇに結合しなかった（１識された抗体により生成される
ングナルを測定する、 ことにより患者検体中のＨＢｃＡｇに対する抗体を検出
するための改良された単一の一抗体阻害アッセイを提供
するものである。改良点とは、標識された抗体として競
合的ＥＬＩＳＡアッセイにおいてヒト抗ＨＢｃＡｇポリ
クローナル抗体と有効に競合するモノクローナル抗体を
使用することにある。
本発明の検定法においては検体および標識されたモノク
ローナル抗体は結合されたＨＢｃＡｇと同時にインキュ
ベートされることができるし、または検体を最初にイン
キュベートすることもできる。いずれの操作も阻害アッ
セイと呼ばれる。同時インキュベーションを含む操作は
また競合アッセイ、とも呼ばれる。抗体は検出可能な部
分を直接とりつけることによるか、または検出可能な部
分に直接結合しておりかつ抗体に結合する他の物質との
結合により標識されうる。
ローナル抗体は結合されたＨＢｃＡｇと同時にインキュ
ベートされることができるし、または検体を最初にイン
キュベートすることもできる。いずれの操作も阻害アッ
セイと呼ばれる。同時インキュベーションを含む操作は
また競合アッセイ、とも呼ばれる。抗体は検出可能な部
分を直接とりつけることによるか、または検出可能な部
分に直接結合しておりかつ抗体に結合する他の物質との
結合により標識されうる。
本発明は、支持体に結合したＨＢｃＡｇおよび標識され
たモノクローナル抗体からなる前記改良されたアッセイ
を実施するための試薬キットにも関する。
たモノクローナル抗体からなる前記改良されたアッセイ
を実施するための試薬キットにも関する。
本発明はまた、本発明の検定法において有用な、ＨＢｃ
Ａｇに対するモノクローナル抗体についてハイブリドー
マ上澄み液をスクリーニングするための競合的イムノア
ッセイ法にも関するものである。このスクリーニング法
は、 （１）上澄み検体および標識されたヒト抗ＨＢｃＡｇポ
リクローナル抗体を、支持体に結合されたＨＢｃＡｇと
一緒にインキュベートし、（２）支持体を洗浄して標識
された抗体の結合しなかった部分を除去し、そして （３）結合された標識された抗体を検出する、ことから
なる。
Ａｇに対するモノクローナル抗体についてハイブリドー
マ上澄み液をスクリーニングするための競合的イムノア
ッセイ法にも関するものである。このスクリーニング法
は、 （１）上澄み検体および標識されたヒト抗ＨＢｃＡｇポ
リクローナル抗体を、支持体に結合されたＨＢｃＡｇと
一緒にインキュベートし、（２）支持体を洗浄して標識
された抗体の結合しなかった部分を除去し、そして （３）結合された標識された抗体を検出する、ことから
なる。
本発明のスクリーニング法は多重エピトープを有する抗
原に対する抗体の検出に一般的に応用されうる。抗原に
対するヒトポリクローナル抗体の標識されたものを用い
ることにより、ポリクローナル抗体と有効に競合しうる
モノクローナル抗体が確認されうる。
原に対する抗体の検出に一般的に応用されうる。抗原に
対するヒトポリクローナル抗体の標識されたものを用い
ることにより、ポリクローナル抗体と有効に競合しうる
モノクローナル抗体が確認されうる。
本発明はまた合計で１００Ｉｉ＠未満のｒＨＢｃＡｇを
３ａ間より少ない期間腹腔内および静脈注射することに
よりマウスを免疫し、この免疫されたマウスからの脾臓
細胞をマウスミエローマ細胞と融合させ、融合した細胞
を選択培地中で培養して連続的なハイブリッド細胞系統
を生成させ、そしてこの細胞をクローンさせて所望の抗
体を産生ずる細胞を単離することからなる、ｒＨＢｃＡ
ｇに対する親和性の高いモノクローナル抗体の製法をも
包含するものである。最後に本発明はこの方法により産
生されるある種の細胞系統およびモノクローナル抗体に
も関する。
３ａ間より少ない期間腹腔内および静脈注射することに
よりマウスを免疫し、この免疫されたマウスからの脾臓
細胞をマウスミエローマ細胞と融合させ、融合した細胞
を選択培地中で培養して連続的なハイブリッド細胞系統
を生成させ、そしてこの細胞をクローンさせて所望の抗
体を産生ずる細胞を単離することからなる、ｒＨＢｃＡ
ｇに対する親和性の高いモノクローナル抗体の製法をも
包含するものである。最後に本発明はこの方法により産
生されるある種の細胞系統およびモノクローナル抗体に
も関する。
ＨＢ ｃ Ａｇに対する標識されたモノクローナル抗体
であって、−抗体阻害アッセイにおいて標識されたヒト
ポリクローナル抗ＨＢ ｃ Ａ ｇの代わりに実際上使
用されうる抗体が製造できようことは本発明以前は予測
できなかった。大きなタンパク質であるＩＩ Ｂ ｃ
Ａ ｇは多数のエピトープを有することが予想され、そ
しである特定のエピトープはある種の人物には免疫応答
を生じつるが他の人物には生じない。そのエピトープに
対するモノクローナル抗体は該エピトープに対して免疫
応答しない人物に誤った陰性結果を生ずる可能性がある
。
であって、−抗体阻害アッセイにおいて標識されたヒト
ポリクローナル抗ＨＢ ｃ Ａ ｇの代わりに実際上使
用されうる抗体が製造できようことは本発明以前は予測
できなかった。大きなタンパク質であるＩＩ Ｂ ｃ
Ａ ｇは多数のエピトープを有することが予想され、そ
しである特定のエピトープはある種の人物には免疫応答
を生じつるが他の人物には生じない。そのエピトープに
対するモノクローナル抗体は該エピトープに対して免疫
応答しない人物に誤った陰性結果を生ずる可能性がある
。
本発明に関連して、ＨＢｃＡｇに対する標識されたモノ
クローナル抗体は、その抗体がヒトポリクローナル抗Ｈ
Ｂ ｃ Ａ ｇと有効に競合するならば単一の抗体阻害
アッセイに使用されうることが見出された。モノクロー
ナル抗ＨＢｃＡｇ抗体は、それが下記実施例１ （Ｃ）
（ｉ ）（ａ ）および（ｂ）に記載される競合的Ｅｔ
、ｉｓＡアッセイにおいて少なくとも４０％の拮抗を生
ずるならば有効に競合すると見なされる。ここで競合％
は （式中、応答は光学濃度、吸光度または蛍光をさす）に
より計算される。
クローナル抗体は、その抗体がヒトポリクローナル抗Ｈ
Ｂ ｃ Ａ ｇと有効に競合するならば単一の抗体阻害
アッセイに使用されうることが見出された。モノクロー
ナル抗ＨＢｃＡｇ抗体は、それが下記実施例１ （Ｃ）
（ｉ ）（ａ ）および（ｂ）に記載される競合的Ｅｔ
、ｉｓＡアッセイにおいて少なくとも４０％の拮抗を生
ずるならば有効に競合すると見なされる。ここで競合％
は （式中、応答は光学濃度、吸光度または蛍光をさす）に
より計算される。
本発明において得られる結果は、）ＨＢｃＡｇ上に免疫
優性エピトープまたは部位が存在すること、およびここ
に記載されるようにして産生される七ツクローナル抗体
がそのエピトープまたは部位に特異的であることを示し
ている。ここで用いられる部位なる用語は密接に関連す
るかまたは隣接するエピトープからなる。免疫優性エピ
トープまたは部位は実際上すべての宿主生物により産生
されるポリクローナル抗体（こより認識されるエピトー
プまたは部位である。このことは各宿主の総ポリクロー
ナル集団を包含する抗体の少なくとも一部分かこのエピ
トープまたは部位を認識しなければならないことを意味
する。
優性エピトープまたは部位が存在すること、およびここ
に記載されるようにして産生される七ツクローナル抗体
がそのエピトープまたは部位に特異的であることを示し
ている。ここで用いられる部位なる用語は密接に関連す
るかまたは隣接するエピトープからなる。免疫優性エピ
トープまたは部位は実際上すべての宿主生物により産生
されるポリクローナル抗体（こより認識されるエピトー
プまたは部位である。このことは各宿主の総ポリクロー
ナル集団を包含する抗体の少なくとも一部分かこのエピ
トープまたは部位を認識しなければならないことを意味
する。
本発明のモノクローナル抗体の調製はマウスの免疫で開
始される。雌のＢＡＬＢ／ｃ系マウスが好ましいが、し
かしながら他の系統のマウスも機能することが予想され
る。使用される免疫原はＨＢｃＡｇの粗製の、または手
積製のまたは精製された調製物であることができる。組
換えＨＢｃＡｇが使用されるのが好ましく、そして日本
のミドリ十字社により犬腸閑中に生成された組換えＨＢ
ｃＡｇが最も好ましい。
始される。雌のＢＡＬＢ／ｃ系マウスが好ましいが、し
かしながら他の系統のマウスも機能することが予想され
る。使用される免疫原はＨＢｃＡｇの粗製の、または手
積製のまたは精製された調製物であることができる。組
換えＨＢｃＡｇが使用されるのが好ましく、そして日本
のミドリ十字社により犬腸閑中に生成された組換えＨＢ
ｃＡｇが最も好ましい。
驚くべきことに、非常に短い免疫化プロトコルが高アフ
イニテイモノクローナル抗体の産生を刺激するのに効果
的であることが判明した。
イニテイモノクローナル抗体の産生を刺激するのに効果
的であることが判明した。
最も好ましい免疫化スケジュールは実施例１に示されて
いる。他の短期間スケジュールも効果的であると予想さ
れる。これらのスケジュールは一般に１００μ９未満の
免疫原、そして好ましくは約５０μ９の免疫原を３週間
より下、好ましくは２週間投与することを包含すべきで
ある。
いる。他の短期間スケジュールも効果的であると予想さ
れる。これらのスケジュールは一般に１００μ９未満の
免疫原、そして好ましくは約５０μ９の免疫原を３週間
より下、好ましくは２週間投与することを包含すべきで
ある。
用いられる免疫原はフロイント完全または不完全アジュ
バントのようなアジュバントと混合することができる。
バントのようなアジュバントと混合することができる。
免疫化は前記の如くイン・ビボでなされるのか好ましい
が、イン・ビトロ操作も知られておりそして同じく機能
することが予想される。
が、イン・ビトロ操作も知られておりそして同じく機能
することが予想される。
免疫された動物の脾臓細胞をミエローマ細胞系統と融合
させて連続的なハイブリッド細胞系統を生成させるには
白菜上棟々の方法か知られている。これらの操作のいず
れでも機能することが予想されるがＫｏｈｌｅｒおよび
Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（ＪＥｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａ
ｌ ｏｆ ｌｉ＋ｍｕｎｏｌｏｇｙＪ ６．５１１−５
１９（１９７６）’３照）の方法が好ましい。この融合
操作にかけられる脾臓細胞は存在する細胞の全集団であ
ることもできるし、またこれら細胞のうち、間Ｊの抗原
に対して反応性である表面イムノグロブリンを有するこ
とを基準として選択された部分集団であることもできる
。脾臓細胞対ミエローマ細胞の比率は約ｌ；ｌ〜約１０
：１まで変動しつるが、好ましい比率は約５：ｌである
。融合培地の総量は１０’個の牌臓細胞当たり約０．５
〜ｌ、 ０ｘ（ｌが適当である。
させて連続的なハイブリッド細胞系統を生成させるには
白菜上棟々の方法か知られている。これらの操作のいず
れでも機能することが予想されるがＫｏｈｌｅｒおよび
Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（ＪＥｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａ
ｌ ｏｆ ｌｉ＋ｍｕｎｏｌｏｇｙＪ ６．５１１−５
１９（１９７６）’３照）の方法が好ましい。この融合
操作にかけられる脾臓細胞は存在する細胞の全集団であ
ることもできるし、またこれら細胞のうち、間Ｊの抗原
に対して反応性である表面イムノグロブリンを有するこ
とを基準として選択された部分集団であることもできる
。脾臓細胞対ミエローマ細胞の比率は約ｌ；ｌ〜約１０
：１まで変動しつるが、好ましい比率は約５：ｌである
。融合培地の総量は１０’個の牌臓細胞当たり約０．５
〜ｌ、 ０ｘ（ｌが適当である。
多くのミエローマ細胞系統が知られておりそして一般に
入手しうる。これらのいずれのものでも使用できる。選
択される細胞系統は、融合しなかったミエローマ細胞は
選択培地中で生存しないが、ハイブリッドは生存しつる
ように、薬物感受性のような選択可能なマーカーを有し
ていなければならない。その細胞系統が「非分泌型」、
すなわちそのものは融合前に内因性イムノグロブリンを
産生じないことも好ましい。
入手しうる。これらのいずれのものでも使用できる。選
択される細胞系統は、融合しなかったミエローマ細胞は
選択培地中で生存しないが、ハイブリッドは生存しつる
ように、薬物感受性のような選択可能なマーカーを有し
ていなければならない。その細胞系統が「非分泌型」、
すなわちそのものは融合前に内因性イムノグロブリンを
産生じないことも好ましい。
好ましくはないか、「分泌型」細胞系統を使用すること
もできる。好ましい重合プロモーターは分子量約１００
０〜４０００を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ
）である。他の融合プロモーターまたは電気融合法も機
能を果たすと予想される。
もできる。好ましい重合プロモーターは分子量約１００
０〜４０００を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ
）である。他の融合プロモーターまたは電気融合法も機
能を果たすと予想される。
融合に続き、融合した細胞および未融合脾臓細胞および
未融合ミエローマ細胞の混合物を希釈し、そして未融合
ミエローマ細胞の生育を援けない選択培地中で培養する
。最も普通に用いられる選択培地はＨＡＴ （ヒボキサ
ンチン、アミノプテリンおよびチミジン）培地である。
未融合ミエローマ細胞の混合物を希釈し、そして未融合
ミエローマ細胞の生育を援けない選択培地中で培養する
。最も普通に用いられる選択培地はＨＡＴ （ヒボキサ
ンチン、アミノプテリンおよびチミジン）培地である。
この培地中で約１週間経過後には未融合ミエローマおよ
び未融合脾臓細胞か死ぬ。細胞を限界希釈にかけて各組
織培養容器中に細胞１個ずつが入るようにすることがで
きる。
び未融合脾臓細胞か死ぬ。細胞を限界希釈にかけて各組
織培養容器中に細胞１個ずつが入るようにすることがで
きる。
各細胞培養容器中の上澄み液をＨＢｃＡｇに対する特異
的な抗体の存在について評価する。
的な抗体の存在について評価する。
ＨＢｃＡｇと反応する抗体を同定するには種々のアッセ
イ用構成が用いられうるが、しかしヒトポリクローナル
抗体と有効に競合するモノクローナル抗体を選択するた
めには、ＨＢｃＡｇに対して特異的なヒトポリクローナ
ル抗体を用いる競合的イムノアッセイスクリーニング法
を行うのが好ましい。これらヒト抗ＨＢｃＡｇ抗体は感
染した個体から単離される。適当なアッセイの一つを以
下に記載するが、当業者がそれらを変形することは容易
であろう。アッセイは少量、典型的には約５０ｎ９のＨ
ＢｃＡｇを適当には固形支持体、代表的にはミクロ滴定
プレートに吸着させることにより行われる。次に細胞培
養容器の上澄み液を標識されたヒトポリクローナル抗Ｈ
ＢｃＡｇ抗体と競合せしめる。＾ｂｂｏｔｔ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製のＨＲＰ（セイヨウワサビペル
オキシダーゼ）に接合されたヒト抗ＨＢｃＡｇが好まし
い標識された抗ＨＢｃＡｇである。適当なインキュベー
ション期間に続き、固形支持体を洗浄しそして結合した
標識量を測定する。ヒトポリクローナル抗ＨＢｃＡｇの
結合を実質的に阻害する抗体を分泌するハイブリドーマ
を選択してさらに特性を調べ゛ る。支持体上に低
濃度のＨＢｃＡｇを使用しそしてインキュベーション時
間を短くする、すなわち一般的には約１時間以下にする
と高アフイニテイ抗体の選択が促進される。
イ用構成が用いられうるが、しかしヒトポリクローナル
抗体と有効に競合するモノクローナル抗体を選択するた
めには、ＨＢｃＡｇに対して特異的なヒトポリクローナ
ル抗体を用いる競合的イムノアッセイスクリーニング法
を行うのが好ましい。これらヒト抗ＨＢｃＡｇ抗体は感
染した個体から単離される。適当なアッセイの一つを以
下に記載するが、当業者がそれらを変形することは容易
であろう。アッセイは少量、典型的には約５０ｎ９のＨ
ＢｃＡｇを適当には固形支持体、代表的にはミクロ滴定
プレートに吸着させることにより行われる。次に細胞培
養容器の上澄み液を標識されたヒトポリクローナル抗Ｈ
ＢｃＡｇ抗体と競合せしめる。＾ｂｂｏｔｔ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製のＨＲＰ（セイヨウワサビペル
オキシダーゼ）に接合されたヒト抗ＨＢｃＡｇが好まし
い標識された抗ＨＢｃＡｇである。適当なインキュベー
ション期間に続き、固形支持体を洗浄しそして結合した
標識量を測定する。ヒトポリクローナル抗ＨＢｃＡｇの
結合を実質的に阻害する抗体を分泌するハイブリドーマ
を選択してさらに特性を調べ゛ る。支持体上に低
濃度のＨＢｃＡｇを使用しそしてインキュベーション時
間を短くする、すなわち一般的には約１時間以下にする
と高アフイニテイ抗体の選択が促進される。
前記した方法を用いることにより、ヒト抗ＨＢ ｃ Ａ
ｇと効果的に競合するモノクローナル抗体を分泌する
５種のハイブリドーマが確認された。
ｇと効果的に競合するモノクローナル抗体を分泌する
５種のハイブリドーマが確認された。
これら抗体および対応する細胞系統は７Ａ８．４ ；７
Ａ７ ； ７Ａ１３．１ ； ７Ａ１４．１および７Ａ
１５．１と表示される。これら細胞系統は米国ＡＴＣＣ
（Ａｍｅｒｉｃａｎ ＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅ Ｃｏ１
１ｅｃｔｉｏｎ）にＭＰＥＰ ６０８．０ｉｐ に従い
寄託されている。ＡＴＣＣ寄託番号はそれぞれＨＢ−９
２６５、ＨＢ−９２６２、ＨＢ−９２６４、ＨＢ −９
２６３およびＨＢ−９２６１である。最初の３種の抗体
はＩｇＧ２ｂサブクラスでありそして後二者はＩｇＧ１
サブクラスである。
Ａ７ ； ７Ａ１３．１ ； ７Ａ１４．１および７Ａ
１５．１と表示される。これら細胞系統は米国ＡＴＣＣ
（Ａｍｅｒｉｃａｎ ＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅ Ｃｏ１
１ｅｃｔｉｏｎ）にＭＰＥＰ ６０８．０ｉｐ に従い
寄託されている。ＡＴＣＣ寄託番号はそれぞれＨＢ−９
２６５、ＨＢ−９２６２、ＨＢ−９２６４、ＨＢ −９
２６３およびＨＢ−９２６１である。最初の３種の抗体
はＩｇＧ２ｂサブクラスでありそして後二者はＩｇＧ１
サブクラスである。
ＨＢｃＡｇの免疫優性エピトニプまたは部位に対して特
異的なモノクローナル抗体の選択につい′て記載したが
、この方法は他の系における他の抗原に一般的に応用し
うることが予想される。
異的なモノクローナル抗体の選択につい′て記載したが
、この方法は他の系における他の抗原に一般的に応用し
うることが予想される。
これは関心のある他のヒトウィルス抗原または動物のウ
ィルス抗原上の免疫優性エピトープまたは部位の確認に
有用であろう。
ィルス抗原上の免疫優性エピトープまたは部位の確認に
有用であろう。
もし組換え抗原が免疫化に使用される場合は、選択され
た抗体が発現系中に存在する他の抗原と反応しないこと
が証明されなければならない。
た抗体が発現系中に存在する他の抗原と反応しないこと
が証明されなければならない。
抗体が天然の抗原および組換え抗原の双方とほぼ同等に
反応することも示されねばならない。
反応することも示されねばならない。
このことは、その抗体が組換え抗原を用いるアッセイ法
での使用が意図されている場合は特に重要である。これ
らアッセイはよく知られたＥＬＩＳＡ法で行われうる。
での使用が意図されている場合は特に重要である。これ
らアッセイはよく知られたＥＬＩＳＡ法で行われうる。
本願の場合、選択されたハイブリドーマは大腸菌溶解物
のいずれの成分とも反応せずまた天然のＩＩ Ｂ ｃ
Ａ ｇおよび組換えＨＢｃＡｇとほぼ同等に反応するこ
とが示された。
のいずれの成分とも反応せずまた天然のＩＩ Ｂ ｃ
Ａ ｇおよび組換えＨＢｃＡｇとほぼ同等に反応するこ
とが示された。
Ｂ型肝炎ｅ抗原（ｔｌＢｅＡｇ）はＩｆ Ｂ ｃ Ａ
ｇに関連していることか知られているので、選択された
抗体がｆｌＢｅＡｇ抗原と反応するか否か判定すること
が望ましい。モノクローナル抗体のクラスおよびサブク
ラスは知られた操作により判定される。
ｇに関連していることか知られているので、選択された
抗体がｆｌＢｅＡｇ抗原と反応するか否か判定すること
が望ましい。モノクローナル抗体のクラスおよびサブク
ラスは知られた操作により判定される。
選択されたハイブリッド細胞系統は、その細胞集団が１
個の細胞クローンに由来することおよびそのハイブリド
ーマが安定しておりかつ所望される抗体を産生ずること
が保証されるように限界希釈によりさらにクローンする
。一旦完了すると、適当な培地中でしばらく培養するこ
とにより少量の細胞および抗体が産生されつる。
個の細胞クローンに由来することおよびそのハイブリド
ーマが安定しておりかつ所望される抗体を産生ずること
が保証されるように限界希釈によりさらにクローンする
。一旦完了すると、適当な培地中でしばらく培養するこ
とにより少量の細胞および抗体が産生されつる。
かかる培養を行う方法は良く知られている。
比較的大量の抗体を産生させるには、所望のハイブリド
ーマをマウスの腹腔に注射し、そこでその細胞が繁殖し
て抗体を腹水中または腹腔浸出物中に分泌する。これは
マウスの注射用に約ｌＸｌ０’個の細胞が得られるまで
ノ＼イブリッド細胞系統を組織培養フラスコ中で生育さ
せることにより達成される。ＢＡＬＢ／ｃ系マウスへの
注射に先立ち、マウスに２．６．１０．１４−テトラメ
チルペンタデカンを予め与える。ハイブリドーマ細胞の
注射２〜３週間後に腹水を集める。この腹水を４°Ｃで
１１０００Ｘで１５分間遠心分離して所望の抗体を含有
する腹水上澄み液を得る。所望の抗体が得られるという
事実は、腹水から得られる抗体を組織培養物から得られ
る抗体の選択および特性化に最初に用いられたと同じ一
連のアッセイにかけることにより確認される。
ーマをマウスの腹腔に注射し、そこでその細胞が繁殖し
て抗体を腹水中または腹腔浸出物中に分泌する。これは
マウスの注射用に約ｌＸｌ０’個の細胞が得られるまで
ノ＼イブリッド細胞系統を組織培養フラスコ中で生育さ
せることにより達成される。ＢＡＬＢ／ｃ系マウスへの
注射に先立ち、マウスに２．６．１０．１４−テトラメ
チルペンタデカンを予め与える。ハイブリドーマ細胞の
注射２〜３週間後に腹水を集める。この腹水を４°Ｃで
１１０００Ｘで１５分間遠心分離して所望の抗体を含有
する腹水上澄み液を得る。所望の抗体が得られるという
事実は、腹水から得られる抗体を組織培養物から得られ
る抗体の選択および特性化に最初に用いられたと同じ一
連のアッセイにかけることにより確認される。
腹水からのモノクローナル抗体は所望に応じさらに精製
されうる。これは種々の知られた方法によりなされうる
。
されうる。これは種々の知られた方法によりなされうる
。
本発明のモノクローナル抗体は種々の知られた方法を用
いて異なる酵素に接合されうる。セイヨウワサビペルオ
キシターセ（ＨＲＰ）またはアルカリホスファターゼ（
ＡＬＫＰ）を用いるのが一般に好ましい。これらモノク
ローナル抗体はまた他の種類の標識、例えば蛍光標識、
放射性同位元素またはその他のもので標識され、ること
もできる。
いて異なる酵素に接合されうる。セイヨウワサビペルオ
キシターセ（ＨＲＰ）またはアルカリホスファターゼ（
ＡＬＫＰ）を用いるのが一般に好ましい。これらモノク
ローナル抗体はまた他の種類の標識、例えば蛍光標識、
放射性同位元素またはその他のもので標識され、ること
もできる。
標識されたモノクローナル抗ＨＢｃＡｇ抗体は抗Ｉｆ
Ｂ ｃ Ａ ｇ特異性を示すイムノグロブリンを検出す
るための競合的アッセイを実施するのに用いられうる。
Ｂ ｃ Ａ ｇ特異性を示すイムノグロブリンを検出す
るための競合的アッセイを実施するのに用いられうる。
これら抗体の標識づけは検出しうる部分を直接付着させ
るかまたはそれ自体が検出可能な部分に直接結合してお
りかつ抗体に結合する他の物質との結合を含めた多（の
方法により達成されうる。検出可能な部分の適当なもの
をあげれば、酵素、蛍光性プローブおよび同位元素であ
る。抗体に結合できかつそれら自身が標識されることの
できる他の物質には、タンパク質Ａおよび抗一種特異的
抗体（例えば抗−マウスＩｇＧ抗体）が包含されつる。
るかまたはそれ自体が検出可能な部分に直接結合してお
りかつ抗体に結合する他の物質との結合を含めた多（の
方法により達成されうる。検出可能な部分の適当なもの
をあげれば、酵素、蛍光性プローブおよび同位元素であ
る。抗体に結合できかつそれら自身が標識されることの
できる他の物質には、タンパク質Ａおよび抗一種特異的
抗体（例えば抗−マウスＩｇＧ抗体）が包含されつる。
かかる検定方法に代表的な形式は、ＩＩ Ｂ ｃ Ａ
ｇで被覆された固十目を供給し、そして患者の検体中に
存在することが疑われる抗体をｔｌ Ｂ ｃ Ａ ｇへ
の結合に関して標識された抗体と競合させる。もしその
検体か抗ＨＢｃＡｇ抗体を含有している場合は、それら
抗体が標識された抗体の結合を阻害しよう。酵素が標識
として使用される場合は、酵素の存在かその酵素用の基
質を添加することにより判定されるならば陽性検体は吸
光度が低くなろう。もしその検体か抗ＩＩ Ｂ ｃ Ａ
ｇ抗体を含有しない場合は、標識された抗体はＩｔ
Ｂ ｃ Ａ ｇに結びつきそして吸光度か高くなろう。
ｇで被覆された固十目を供給し、そして患者の検体中に
存在することが疑われる抗体をｔｌ Ｂ ｃ Ａ ｇへ
の結合に関して標識された抗体と競合させる。もしその
検体か抗ＨＢｃＡｇ抗体を含有している場合は、それら
抗体が標識された抗体の結合を阻害しよう。酵素が標識
として使用される場合は、酵素の存在かその酵素用の基
質を添加することにより判定されるならば陽性検体は吸
光度が低くなろう。もしその検体か抗ＩＩ Ｂ ｃ Ａ
ｇ抗体を含有しない場合は、標識された抗体はＩｔ
Ｂ ｃ Ａ ｇに結びつきそして吸光度か高くなろう。
本発明の標識されたモノクローナル抗体がかかるアッセ
イにおいて使用可能であるべきためには、これらはヒト
ポリクローナル抗Ｉｆ Ｂ ｃ ＝−ｇ抗体を含有する
検体の実質上すべてと有効に競合しなければならない。
イにおいて使用可能であるべきためには、これらはヒト
ポリクローナル抗Ｉｆ Ｂ ｃ ＝−ｇ抗体を含有する
検体の実質上すべてと有効に競合しなければならない。
このことを考察する場合のもう一つの事項は、ヒトポリ
クローナル抗ＩＩ Ｂ ｃ Ａ ｇ抗体を含有する検体
の実質上すへてかモツクローナル抗体と同じエピトープ
を認識する抗体の集団を含有しない場合は、そのモノク
ローナル抗体は臨床上使用できまいということである。
クローナル抗ＩＩ Ｂ ｃ Ａ ｇ抗体を含有する検体
の実質上すへてかモツクローナル抗体と同じエピトープ
を認識する抗体の集団を含有しない場合は、そのモノク
ローナル抗体は臨床上使用できまいということである。
これはモノクローナル抗体によって認識されるエピトー
プを認識しないこれらヒトポリクローナル抗ＨＢｃＡｇ
抗体を含有する抗体が抗ＨＢｃＡｇ抗体を含有しないと
して誤って分類されて、患者の臨床状態が誤って診断さ
れる可能性があるからである。もしあるエピトープがヒ
トポリクローナル抗ＨＢｃＡｇ抗体を含有する検体の実
質上すべてにより認識されるならば、その部位が免疫優
性であると言いつる。
プを認識しないこれらヒトポリクローナル抗ＨＢｃＡｇ
抗体を含有する抗体が抗ＨＢｃＡｇ抗体を含有しないと
して誤って分類されて、患者の臨床状態が誤って診断さ
れる可能性があるからである。もしあるエピトープがヒ
トポリクローナル抗ＨＢｃＡｇ抗体を含有する検体の実
質上すべてにより認識されるならば、その部位が免疫優
性であると言いつる。
本発明のモノクローナル抗体がＨＢｃＡｇの免疫優性エ
ビ□トープに対して特異的であることは以下のようにし
て証明された。すなわち、以下に記載される過沃素酸塩
法を用いてモノクローナル抗体７Ａ６．４および？ＡＩ
３．１をＨＲＰに接合させ、次にｌ ： ２０００およ
び１ ： ２４００に希釈した。ミドリ十字社製ｒＨＢ
ｃＡｇ ５０ ｎ９をミクロ滴定プレートの各ウェル上
に被覆した。ＨＲＰ接合されたモノクローナル抗体およ
び患者の血漿の同量を各ウェルに添加しそして室温で９
０分間インキュベートした。次にこのプレートを洗浄し
、各ウェルに基質０−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）を
加え、そして室温で１５分間インキュベートした。ＩＮ
硫酸の添加により酵素反応を停止させ、そして４９２ｎ
ｍでの吸光度を測定した。患者の検体２１個が臨床的な
微候および／または肝炎マーカーの独立した評価に基づ
き陽性であると分類された。全２１個の検体中に存在す
るポリクローナル抗ＨＢｃＡｇ抗体がＨＲＰ標識された
７Ａ８．４と有効に競合した。４８個の陰性検体も検査
してＨＲＰ標識された７Ａ６．４と競合する抗体を含有
しないことが判明した。
ビ□トープに対して特異的であることは以下のようにし
て証明された。すなわち、以下に記載される過沃素酸塩
法を用いてモノクローナル抗体７Ａ６．４および？ＡＩ
３．１をＨＲＰに接合させ、次にｌ ： ２０００およ
び１ ： ２４００に希釈した。ミドリ十字社製ｒＨＢ
ｃＡｇ ５０ ｎ９をミクロ滴定プレートの各ウェル上
に被覆した。ＨＲＰ接合されたモノクローナル抗体およ
び患者の血漿の同量を各ウェルに添加しそして室温で９
０分間インキュベートした。次にこのプレートを洗浄し
、各ウェルに基質０−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）を
加え、そして室温で１５分間インキュベートした。ＩＮ
硫酸の添加により酵素反応を停止させ、そして４９２ｎ
ｍでの吸光度を測定した。患者の検体２１個が臨床的な
微候および／または肝炎マーカーの独立した評価に基づ
き陽性であると分類された。全２１個の検体中に存在す
るポリクローナル抗ＨＢｃＡｇ抗体がＨＲＰ標識された
７Ａ８．４と有効に競合した。４８個の陰性検体も検査
してＨＲＰ標識された７Ａ６．４と競合する抗体を含有
しないことが判明した。
７Ａ６．４および７Ａ１３．１を用いて得られた実験結
果と市販のＣｏｒｚｙｍｅ＠ アッセイ（Ａｂｂｏｔ
ｔＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）を用いて得られた結果
とを比較して下記第１表に示す。
果と市販のＣｏｒｚｙｍｅ＠ アッセイ（Ａｂｂｏｔ
ｔＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）を用いて得られた結果
とを比較して下記第１表に示す。
第１表
Ｚ生ｊ＝’ＩＰ＠ ０．００２ ＋０．
００４ ＋ ０．０２１ ＋１
０、Ｈ５＋ ０．３５６ ＋ ０．０２７
＋２ ０．０１４ ＋ ０．０２０ ＋ ０．
０２３ ＋３ １．１１２ − １．２７６ − ０
．８７１ −４ １、Ｈ７−１，２６３−１，０２３−
５１，１７４−１，１４３−０，’８１２ −６ ０．
２４５ ＋ ０．４０３ ＋ ０．０３６ ＋７ １．
０６５−１．２７５−０．４４７ ＋８ ０．
１１０ ＋ ０．４１４ ＋０
．０４９ ＋９ ０．９４４ − １．３３２
− ０．９９１ −１０ ０．９１０ − １．３２
１ − ０．８８８ −陰性対照 １．２２３
− １．１１９ − １．１０８ −これ
らの結果は、本発明のモノクローナル抗体７Ａ６．４お
よび７Ａ１３．ｌが免疫優性エピトープを認識すること
、および本発明方法がヒトポリクローナル抗体に基づく
市販の方法と等価と言える臨床的に有用な結果をもたら
すことを示している。
００４ ＋ ０．０２１ ＋１
０、Ｈ５＋ ０．３５６ ＋ ０．０２７
＋２ ０．０１４ ＋ ０．０２０ ＋ ０．
０２３ ＋３ １．１１２ − １．２７６ − ０
．８７１ −４ １、Ｈ７−１，２６３−１，０２３−
５１，１７４−１，１４３−０，’８１２ −６ ０．
２４５ ＋ ０．４０３ ＋ ０．０３６ ＋７ １．
０６５−１．２７５−０．４４７ ＋８ ０．
１１０ ＋ ０．４１４ ＋０
．０４９ ＋９ ０．９４４ − １．３３２
− ０．９９１ −１０ ０．９１０ − １．３２
１ − ０．８８８ −陰性対照 １．２２３
− １．１１９ − １．１０８ −これ
らの結果は、本発明のモノクローナル抗体７Ａ６．４お
よび７Ａ１３．ｌが免疫優性エピトープを認識すること
、および本発明方法がヒトポリクローナル抗体に基づく
市販の方法と等価と言える臨床的に有用な結果をもたら
すことを示している。
実施例 ｌ
Ｂ型肝炎コア抗原に対するモノクローナル抗体の調製
Ａ、免疫化および融合
大腸菌ベクター系中に発現された組換え型Ｂ型肝炎コア
抗原（ｒＨＢｃＡｇ） ［大阪、ミドリ十字社製］を用
いて雌のＢＡＬＢ／ｃ系マウスを免疫した。
抗原（ｒＨＢｃＡｇ） ［大阪、ミドリ十字社製］を用
いて雌のＢＡＬＢ／ｃ系マウスを免疫した。
マウスには合計５０μ９を２週間にわたり５回注射した
。第１回目の注射はフロイント完全アジュバント中に乳
化したｌＯμ９を腹腔内投与した。
。第１回目の注射はフロイント完全アジュバント中に乳
化したｌＯμ９を腹腔内投与した。
この注射を第７８目に反復した。次に第１３８目にｌＯ
μ９を腹腔内に、第１４８目に腹腔内５μ９および静脈
内５μ９、そして第１５８目に腹腔内５μ９および静脈
内５μ９をそれぞれアジュバントなしで３日連続してマ
ウスに注射した。２日後マウスを殺して肺臓をとり出し
た。
μ９を腹腔内に、第１４８目に腹腔内５μ９および静脈
内５μ９、そして第１５８目に腹腔内５μ９および静脈
内５μ９をそれぞれアジュバントなしで３日連続してマ
ウスに注射した。２日後マウスを殺して肺臓をとり出し
た。
脾臓細胞の単一細胞懸濁液およびマウスミエローマＰ３
−Ｘ６３／Ａｇ８．６５３細胞を標準法により調製した
。Ｉ Ｘ １０’個の脾臓細胞を２．７Ｘ１０’個のＰ
３−Ｘ６３／Ａｇ８，８５３ミエローマ細胞と混合し、
そして細胞を低速遠心分離によりペレット状となした。
−Ｘ６３／Ａｇ８．６５３細胞を標準法により調製した
。Ｉ Ｘ １０’個の脾臓細胞を２．７Ｘ１０’個のＰ
３−Ｘ６３／Ａｇ８，８５３ミエローマ細胞と混合し、
そして細胞を低速遠心分離によりペレット状となした。
媒体を吸引しそしてペレットを穏やかに叩くことにより
とり出した。イスコーブス（Ｉｓｃｏｖｅｓ）境地（米
国カリフォルニア州すンタモニカの１ｒｖｉｎｅ ５ｃ
ｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）中４５％ＰＥＧ（平均分子量１
５００）および５％ジメチルスルホキシドを含有するポ
リエチレングリコール（ＰＥＧ）溶液（０，８ｘｆ２）
を１分間かかって滴下し続いて３７℃の水浴中で１分間
インキュベートした。１０％ウシ胎児血清、０．１ｍＭ
ヒボキサンチンおよび１−６×１０−’Ｍのチミジンを
補充したイスコーブス培地２０ｒｒｔＱを加え、細胞を
マウス腹膜内マクロファージからなる支持細胞層を含有
する９６ウエルのプレート１２個に塗布した。
とり出した。イスコーブス（Ｉｓｃｏｖｅｓ）境地（米
国カリフォルニア州すンタモニカの１ｒｖｉｎｅ ５ｃ
ｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）中４５％ＰＥＧ（平均分子量１
５００）および５％ジメチルスルホキシドを含有するポ
リエチレングリコール（ＰＥＧ）溶液（０，８ｘｆ２）
を１分間かかって滴下し続いて３７℃の水浴中で１分間
インキュベートした。１０％ウシ胎児血清、０．１ｍＭ
ヒボキサンチンおよび１−６×１０−’Ｍのチミジンを
補充したイスコーブス培地２０ｒｒｔＱを加え、細胞を
マウス腹膜内マクロファージからなる支持細胞層を含有
する９６ウエルのプレート１２個に塗布した。
Ｂ、ハイブリドーマの選択および生育
細胞が融合したのち、それらを１０％つ７胎児血清、Ｏ
，１ｇ＋Ｍヒポキサンチン、４．ＯＸ１０７Ｍアミノプ
テリンおよび１．６ＸＩＯ−’Ｍチミジン（ＨＡ Ｔ培
地）を補充したイスコーブス培地中湿った大気中ＣＯ３
含量５％で３７°Ｃにおいて培養した。数週間後にはウ
ェルの３０１個に肉眼で見つるクローンが存在しており
、組織培養上澄み液を抗体分泌について検査した。ＨＢ
ｃＡｇに対するモノクローナル抗体は以下の６項に記載
されるようにしてｒＨＢｃＪｇで被覆されたプレートを
用い、競合的ＥＬＩＳＡでの反応性により確認した。
，１ｇ＋Ｍヒポキサンチン、４．ＯＸ１０７Ｍアミノプ
テリンおよび１．６ＸＩＯ−’Ｍチミジン（ＨＡ Ｔ培
地）を補充したイスコーブス培地中湿った大気中ＣＯ３
含量５％で３７°Ｃにおいて培養した。数週間後にはウ
ェルの３０１個に肉眼で見つるクローンが存在しており
、組織培養上澄み液を抗体分泌について検査した。ＨＢ
ｃＡｇに対するモノクローナル抗体は以下の６項に記載
されるようにしてｒＨＢｃＪｇで被覆されたプレートを
用い、競合的ＥＬＩＳＡでの反応性により確認した。
大腸菌タンパク質に対する抗体は、これも下記０項に記
載されるようにして、大腸菌溶解物で被覆されたプレー
ト上の間接ＥＬＩＳＡにより検出した。
載されるようにして、大腸菌溶解物で被覆されたプレー
ト上の間接ＥＬＩＳＡにより検出した。
Ｃ，モノクローナル抗体の反応性についての特性化
（１）競合的ＥＬＩＳＡ
ａ）組織培養上澄み液をＨＢｃＡｇに対する抗体でかつ
セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と接合した
ものであるヒトポリクローナル抗体〔米国イリノイ州／
カゴのＡｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ＄３
Ｃｏｒｚｙｍｅ■ エンザイムイムノアツセイキットか
らのＩＩ ＲＰ−ヒト抗［Ｉ Ｂ ｃ Ａ ｇ 、最小
濃度２μｇ／ｌ〕を用いる競合的アッセイでｒＨＢｃＡ
ｇに対する抗体活性について検査した。ポリスチレンミ
クロ滴定プレート（１ｍｍｕｌｏｎ ＩＩ、米国バージ
ニア州アレクサンドリアのＤｙｎａｔｅｃｈ製）をｐＨ
９，６の０．０５Ｍの炭酸塩−重炭酸塩緩衝液中に希釈
したｒＨＢｃＡｇタンパク５０ｎ９を含有する液体１０
０μｇで被覆した。４°Ｃで一夜吸着させた後、ウェル
を０１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するｐＨ
７，２の燐酸緩衝食塩溶液（ＰＢＳ）を用いて３回洗浄
した。ポリスチレン上の未反応部位を１％ＢＳＡ−ＰＢ
Ｓを用い周囲温度で１時間遮蔽した。溶液を吸引し、そ
してウェル中に組織培養上澄み液とＨＲＰ−ヒト抗ｔｌ
Ｂ ｃ Ａ ｇとの（１： ｌ）ｉ合物１００μＱを
加えた。室温で１時間インキュベーションしそしてプレ
ート洗浄操作を再び行ったのち、０．３％ Ｈ２Ｏ２を
含有するｐＨ４，０の０．０５Ｍクエン酸中の０．４＋
ＩＩＭ ２．２’−アジノーン（３−エチル−ベンズチ
アゾリンスルホネート） （ＡＢＴＳ、米国メリーラ
ンド州のＫｉｒｋｅｇａａｒｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒｙ
製）１００ｙ（ｌを基質として各ウェルに加えた。この
プレートを室温で２０分間インキュベートし、続いてミ
クロ滴定プレート読取り装置で４１０ｙｍでの吸光度を
測定した。陰性のヒト血清対照に比較して計算した場合
にｒＨＢｃＡｇに対するヒトポリクローナル抗血清の結
合を杓、１０％以上阻害した抗体を分泌するハイブリド
ーマ７種を選択してさらに評価した。
セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と接合した
ものであるヒトポリクローナル抗体〔米国イリノイ州／
カゴのＡｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ＄３
Ｃｏｒｚｙｍｅ■ エンザイムイムノアツセイキットか
らのＩＩ ＲＰ−ヒト抗［Ｉ Ｂ ｃ Ａ ｇ 、最小
濃度２μｇ／ｌ〕を用いる競合的アッセイでｒＨＢｃＡ
ｇに対する抗体活性について検査した。ポリスチレンミ
クロ滴定プレート（１ｍｍｕｌｏｎ ＩＩ、米国バージ
ニア州アレクサンドリアのＤｙｎａｔｅｃｈ製）をｐＨ
９，６の０．０５Ｍの炭酸塩−重炭酸塩緩衝液中に希釈
したｒＨＢｃＡｇタンパク５０ｎ９を含有する液体１０
０μｇで被覆した。４°Ｃで一夜吸着させた後、ウェル
を０１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するｐＨ
７，２の燐酸緩衝食塩溶液（ＰＢＳ）を用いて３回洗浄
した。ポリスチレン上の未反応部位を１％ＢＳＡ−ＰＢ
Ｓを用い周囲温度で１時間遮蔽した。溶液を吸引し、そ
してウェル中に組織培養上澄み液とＨＲＰ−ヒト抗ｔｌ
Ｂ ｃ Ａ ｇとの（１： ｌ）ｉ合物１００μＱを
加えた。室温で１時間インキュベーションしそしてプレ
ート洗浄操作を再び行ったのち、０．３％ Ｈ２Ｏ２を
含有するｐＨ４，０の０．０５Ｍクエン酸中の０．４＋
ＩＩＭ ２．２’−アジノーン（３−エチル−ベンズチ
アゾリンスルホネート） （ＡＢＴＳ、米国メリーラ
ンド州のＫｉｒｋｅｇａａｒｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒｙ
製）１００ｙ（ｌを基質として各ウェルに加えた。この
プレートを室温で２０分間インキュベートし、続いてミ
クロ滴定プレート読取り装置で４１０ｙｍでの吸光度を
測定した。陰性のヒト血清対照に比較して計算した場合
にｒＨＢｃＡｇに対するヒトポリクローナル抗血清の結
合を杓、１０％以上阻害した抗体を分泌するハイブリド
ーマ７種を選択してさらに評価した。
ｂ）組換えｔｌ Ｂ ｃ Ａ ｇに対して反応性である
モノクローナル抗体を産生ずる７種のハイプリドーマか
らの組織培養上澄み液をＣｏｒｚｙｍｅ■ エンザイム
イムノアツセイキットを用い、Ａｂｂｏｔｔ社の製品折
込み紙記載の操作に従い検査した。上澄み液をＨＲＰ−
ヒト抗ＨＢｃＡｇ （最小濃度２ μｇ／ ｚＱ）と混
合しく１ ： １）そしてこの混合物３００μＱをＢ型
肝炎ウィルスに感染したヒトの血景に由来するＨＢｃＡ
ｇで被覆されたポリスチレンビーズの１つとインキュベ
ートした。水浴中４０°Ｃで２時間インキュベーション
したのち、液体を吸引しそしてビーズを４〜６峠の蒸留
水で３回洗った。
モノクローナル抗体を産生ずる７種のハイプリドーマか
らの組織培養上澄み液をＣｏｒｚｙｍｅ■ エンザイム
イムノアツセイキットを用い、Ａｂｂｏｔｔ社の製品折
込み紙記載の操作に従い検査した。上澄み液をＨＲＰ−
ヒト抗ＨＢｃＡｇ （最小濃度２ μｇ／ ｚＱ）と混
合しく１ ： １）そしてこの混合物３００μＱをＢ型
肝炎ウィルスに感染したヒトの血景に由来するＨＢｃＡ
ｇで被覆されたポリスチレンビーズの１つとインキュベ
ートした。水浴中４０°Ｃで２時間インキュベーション
したのち、液体を吸引しそしてビーズを４〜６峠の蒸留
水で３回洗った。
ビーズをアッセイ用の試験管に移し、そして０、００２
％の過酸化水素を含有するクエン酸塩−燐酸塩緩衝液中
の２３．７ｍＭ ＯＰ Ｄ溶液〔Ｏ−フェニレンジアミ
ン２ＨＣσ〕３００μｇを添加して室温で３０分間反応
せしめた。ＩＮ硫酸１ｆｆＣの添加により反応を停止さ
せそして４９２ｎｉ＋での吸光度を測定した。７種の細
胞系統すべてが、ヒト由来Ｉｆ Ｂ ｃ Ａ ｇと反応
しかつ陰性のヒト血清対照に比較して計算した場合にＨ
ＢｃＡｇに対するヒトポリクローナル抗体の結合を約４
０％以上阻害するモノクローナル抗体を産生じた。これ
ら細胞系統はまた以下に記載されるように大腸菌タンパ
ク質に対する抗体の存在についても検査した。
％の過酸化水素を含有するクエン酸塩−燐酸塩緩衝液中
の２３．７ｍＭ ＯＰ Ｄ溶液〔Ｏ−フェニレンジアミ
ン２ＨＣσ〕３００μｇを添加して室温で３０分間反応
せしめた。ＩＮ硫酸１ｆｆＣの添加により反応を停止さ
せそして４９２ｎｉ＋での吸光度を測定した。７種の細
胞系統すべてが、ヒト由来Ｉｆ Ｂ ｃ Ａ ｇと反応
しかつ陰性のヒト血清対照に比較して計算した場合にＨ
ＢｃＡｇに対するヒトポリクローナル抗体の結合を約４
０％以上阻害するモノクローナル抗体を産生じた。これ
ら細胞系統はまた以下に記載されるように大腸菌タンパ
ク質に対する抗体の存在についても検査した。
（ｉｉ） 間接ＥＬＩＳＡ
Ｉｎ＋ｍｕｌｏｎ ＩＩプレートを前記したようにして
組換えＨＢｃＡｇ ５０ ｎ９または超音波処理された
大腸菌５μ９を含有する液体５０μＱで被覆した。この
プレートを１％ＢＳＡ−ＰＢＳで遮蔽し、そしてウェル
に組織培養上澄み液５０μａを加えた。プレートを３７
°Ｃで１時間インキュベートし、０．１％ＢＳＡ−ＰＢ
Ｓ ３００ｕ＆テ３回洗い続いｒＯ，１％ＢＳＡ−ＰＢ
Ｓ中に１ ＋ ２０００に希釈したＨＲＰ−ヤギ抗マウ
スイムノグロブリン（米国ペンシルベニア州のＣｏｏｐ
ｅｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ製）５０μＱを各ウェルに
添加した。３７℃で１時間インキュベートしたのち、プ
レートを前記したようにして洗い、そしてＡＢＴＳを含
有する基質溶液を用いて発色させた。
組換えＨＢｃＡｇ ５０ ｎ９または超音波処理された
大腸菌５μ９を含有する液体５０μＱで被覆した。この
プレートを１％ＢＳＡ−ＰＢＳで遮蔽し、そしてウェル
に組織培養上澄み液５０μａを加えた。プレートを３７
°Ｃで１時間インキュベートし、０．１％ＢＳＡ−ＰＢ
Ｓ ３００ｕ＆テ３回洗い続いｒＯ，１％ＢＳＡ−ＰＢ
Ｓ中に１ ＋ ２０００に希釈したＨＲＰ−ヤギ抗マウ
スイムノグロブリン（米国ペンシルベニア州のＣｏｏｐ
ｅｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ製）５０μＱを各ウェルに
添加した。３７℃で１時間インキュベートしたのち、プ
レートを前記したようにして洗い、そしてＡＢＴＳを含
有する基質溶液を用いて発色させた。
４１０ｎｍでの吸光度測定により、すべての７種の細胞
系統が抗ＨＢｃＡｇに関して陽性であるが抗大腸菌タン
パク質に関しては陰性であることが示された。
系統が抗ＨＢｃＡｇに関して陽性であるが抗大腸菌タン
パク質に関しては陰性であることが示された。
間接ＥＬＩＳＡ試験に続き７種の細胞系統を広がらせ、
限界希釈により再クローンさせそしである試験ではｒＨ
ＢｃＡｇを用いまた他の試験ではヒト由来ｔ（Ｂ ｃ
Ａ ｇを用いて前記Ｃ（ｉ）（ｂ）項に記載の競合的Ｅ
ＬＩＳＡアッセイで数回再検査した。これらは１ｇサブ
クラスおよび交差反応性についても検査した。再検査で
は、７種の再クローンされた細胞系統のうち５種がｔｌ
Ｂ ｃ Ａ ｇに対するモノクローナル抗体に関して
陽性であると判明した。
限界希釈により再クローンさせそしである試験ではｒＨ
ＢｃＡｇを用いまた他の試験ではヒト由来ｔ（Ｂ ｃ
Ａ ｇを用いて前記Ｃ（ｉ）（ｂ）項に記載の競合的Ｅ
ＬＩＳＡアッセイで数回再検査した。これらは１ｇサブ
クラスおよび交差反応性についても検査した。再検査で
は、７種の再クローンされた細胞系統のうち５種がｔｌ
Ｂ ｃ Ａ ｇに対するモノクローナル抗体に関して
陽性であると判明した。
（ｉｉｉ） モノクローナル抗体のサブクラス分けは
前記した組換えＨＢｃＡｇ被覆プレートを用いてなされ
た。特異的なサブクラス分は用接合体はＺｙｓｅｄ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ （米国カリフォルニア州）社
から購入し、０．１％ＢＳＡ−ＰＢＳ中にｌ：３００に
希釈して使用した。
前記した組換えＨＢｃＡｇ被覆プレートを用いてなされ
た。特異的なサブクラス分は用接合体はＺｙｓｅｄ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ （米国カリフォルニア州）社
から購入し、０．１％ＢＳＡ−ＰＢＳ中にｌ：３００に
希釈して使用した。
（ｉｖ）′交差反応性の検定
他のＢ型肝炎ウィルス抗原と比較してＨＢｃＡｇに対す
るモノクローナル抗体の特異性を商業的に入手しつるア
ッセイ（抗ＨＢｅ ＥＩＡおよびＡＵＳ旧＾、Ａｂｂ６
ｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）を用いそして販売
者の教示に従い肝炎ｅ抗原および表面抗原に対する交差
反応性について検査することにより判定した。
るモノクローナル抗体の特異性を商業的に入手しつるア
ッセイ（抗ＨＢｅ ＥＩＡおよびＡＵＳ旧＾、Ａｂｂ６
ｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）を用いそして販売
者の教示に従い肝炎ｅ抗原および表面抗原に対する交差
反応性について検査することにより判定した。
抗体の特性を第２表に示す。ＥＬＩＳＡ競合アッセイＣ
（ｉ）（ｂ）を反復して得られる平均結果を第３表に示
す。
（ｉ）（ｂ）を反復して得られる平均結果を第３表に示
す。
第２表
７人６．４ ＩｇＧｔｂ
” −７人７
ＩｇＧｔｂ
−＋ −７Ａ１３．１ １ｇＧｔ、
−＋ −７へ１４．１ １ｇＧ＋
＋ −７Ａ１５．１ ＩｇＧ、
−＋ 一本 イム／アッセイにより測定した大腸菌タ
ンパク質またはＢ型肝炎ウィルス抗原に対する反応性。
” −７人７
ＩｇＧｔｂ
−＋ −７Ａ１３．１ １ｇＧｔ、
−＋ −７へ１４．１ １ｇＧ＋
＋ −７Ａ１５．１ ＩｇＧ、
−＋ 一本 イム／アッセイにより測定した大腸菌タ
ンパク質またはＢ型肝炎ウィルス抗原に対する反応性。
負の記号（−）は何ら反応性かないことを示し、正の記
号（＋）は反応性があることを示す。
号（＋）は反応性があることを示す。
第３表
７Ａ６．４ ９６．７±１．１ ８７．７±３，５
７八７ ７９．８±５．６
３８．３±６．４７Ａ１３．１ ９５．７±
１．３ ８４．８±０．４７＾１４．１ ９
０．４±１．２ ８２．６±１６７Ａ１５．１
８５．８±４．６ ７８．５工６．９
＋ヒト血清 ９８．１±０．５ ９５．４±１
．６−ヒト血清 １７．７±７．７ ３．９
±０．９木 陰性対照としてのＰＢＳに基づき計算り、
腹水産生 第１表および第２表に列挙された抗体を産生ずるレロー
ンを組織培養フラスコ中で適当な濃度となるまで生育さ
せそして２．６．１０．１４−テトラメチルペンタデカ
ン〔Ｐｒ１ｓｔｅｎｅ■、ＡｌｄｒｉｃｈＣｈｅｍｉｃ
ａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ製］を予め与えたＢＡＬＢ／ｃ系
マウスに所定のクローンの細胞ｌＸｌ０’個を注射する
ことにより腹水液を産生させた。２〜３週間後、腹水を
集め、４°Ｃおよびｌ０ＱＯＸ ＠で１５分間遠心分離
して腹水上澄み液を得た。腹水中のモノクローナル抗体
をイムノグロブリンサブクラスに関して特性を調べた。
７八７ ７９．８±５．６
３８．３±６．４７Ａ１３．１ ９５．７±
１．３ ８４．８±０．４７＾１４．１ ９
０．４±１．２ ８２．６±１６７Ａ１５．１
８５．８±４．６ ７８．５工６．９
＋ヒト血清 ９８．１±０．５ ９５．４±１
．６−ヒト血清 １７．７±７．７ ３．９
±０．９木 陰性対照としてのＰＢＳに基づき計算り、
腹水産生 第１表および第２表に列挙された抗体を産生ずるレロー
ンを組織培養フラスコ中で適当な濃度となるまで生育さ
せそして２．６．１０．１４−テトラメチルペンタデカ
ン〔Ｐｒ１ｓｔｅｎｅ■、ＡｌｄｒｉｃｈＣｈｅｍｉｃ
ａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ製］を予め与えたＢＡＬＢ／ｃ系
マウスに所定のクローンの細胞ｌＸｌ０’個を注射する
ことにより腹水液を産生させた。２〜３週間後、腹水を
集め、４°Ｃおよびｌ０ＱＯＸ ＠で１５分間遠心分離
して腹水上澄み液を得た。腹水中のモノクローナル抗体
をイムノグロブリンサブクラスに関して特性を調べた。
腹水液中のモノクローナル抗体の特異性は組織培養物中
に生成したものから得られた特異性と同じであった。
に生成したものから得られた特異性と同じであった。
腹水中で産生されたモノクローナル抗体を前記Ｃ（ｉ）
（ａ）項記載のようにして競合的ＥＬＩＳ＾にかけて得
られたデータを第４表に示す。
（ａ）項記載のようにして競合的ＥＬＩＳ＾にかけて得
られたデータを第４表に示す。
第４表
ｌＸＩＯ３９７，０９２，３９６，５８６，８ｇ５．３
５ＸＩＯ３８８，４６４，５８５，０４８，２４５，７
ＩＸＩＯ’ ７６．９ ５４，６ ６３，８ ２９．
６ ３４．３５ＸＩＯ’ ２５，７ １４．０ １６
．６ １４．５ ８．４木 陰性対照としての非特異的
腹水に基つき計算Ｅ モノクローナル抗体の精製 １ｇＧモノクローナル抗体をタンパク質Ａクロマトグラ
フィーにより腹水液から精製した。カラムにタンパク質
Ａセファロース（ＰｈａｒｍａｃｉａＦｉｎｅ Ｃｈｅ
ｍｉｃａｌｓ製）１０７ＩＱを充填しそして３．０Ｍ’
ＪａＣＱ、 ｌ、Ｑ〜１グリ／ン（ｐＨ８，８）で平衡
となした。
５ＸＩＯ３８８，４６４，５８５，０４８，２４５，７
ＩＸＩＯ’ ７６．９ ５４，６ ６３，８ ２９．
６ ３４．３５ＸＩＯ’ ２５，７ １４．０ １６
．６ １４．５ ８．４木 陰性対照としての非特異的
腹水に基つき計算Ｅ モノクローナル抗体の精製 １ｇＧモノクローナル抗体をタンパク質Ａクロマトグラ
フィーにより腹水液から精製した。カラムにタンパク質
Ａセファロース（ＰｈａｒｍａｃｉａＦｉｎｅ Ｃｈｅ
ｍｉｃａｌｓ製）１０７ＩＱを充填しそして３．０Ｍ’
ＪａＣＱ、 ｌ、Ｑ〜１グリ／ン（ｐＨ８，８）で平衡
となした。
腹水１０ｘ＆をこの緩衝液１０ＲＱと混合してこのカラ
ムに充填した。２８０ ｎｍでの吸収が基準値に戻るま
でカラムをこの緩衝液で洗った。モノクローナル抗体は
ｐＦＩ３．０のＯ，１Ｍクエン酸ナトリウムを用いて溶
離しそして５ＭＱずつのフラクションを集めた。２８０
ｎｍでの吸収により判定される、タンパク質を含有す
るフラクションを果め、ｌ’ＯｍＭ燐酸ナトリウム、３
００ ｍＭ塩化ナトリウム（ｐＨ７，０）で透析しそし
て０．２μｍフィルターでが過した。精製したモノクロ
ーナル抗体をもとの量の６倍に濃縮してそのタンパク、
関度、純度および免疫学的反応性について評価した。
ムに充填した。２８０ ｎｍでの吸収が基準値に戻るま
でカラムをこの緩衝液で洗った。モノクローナル抗体は
ｐＦＩ３．０のＯ，１Ｍクエン酸ナトリウムを用いて溶
離しそして５ＭＱずつのフラクションを集めた。２８０
ｎｍでの吸収により判定される、タンパク質を含有す
るフラクションを果め、ｌ’ＯｍＭ燐酸ナトリウム、３
００ ｍＭ塩化ナトリウム（ｐＨ７，０）で透析しそし
て０．２μｍフィルターでが過した。精製したモノクロ
ーナル抗体をもとの量の６倍に濃縮してそのタンパク、
関度、純度および免疫学的反応性について評価した。
Ｆ、精製されたモノクローナル抗体の接合酵素標識され
た接合体は精１２１ｇＧモノクローナル抗体をセイヨウ
ワサビペルオキ／ターナに結合させることにより調製さ
れろ。ＩｇＧ］Ｏｚ９をｐ＋＋ｓ、ｏの１０ｍ！Ｊ炭酸
塩−重炭酸塩１４１１１液中に溶解させそして同じ溶液
で４°Ｃで一夜透析した。
た接合体は精１２１ｇＧモノクローナル抗体をセイヨウ
ワサビペルオキ／ターナに結合させることにより調製さ
れろ。ＩｇＧ］Ｏｚ９をｐ＋＋ｓ、ｏの１０ｍ！Ｊ炭酸
塩−重炭酸塩１４１１１液中に溶解させそして同じ溶液
で４°Ｃで一夜透析した。
酵素等級のセイヨウワサビペルオキシダーゼＨＲＰ （
Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ ＧＭＢＨ！
２、西ドイツ）１０ｉｙを蒸留水５！ＩＱ中に溶解させ
、次に新たに調製した０、 ２Ｍ過沃素酸ナトリウム水
溶液１１と混合しそして室温で２０分間撹拌した。この
溶液をｐＨ４，５の１ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液で一夜
透析した。透析後、溶液のｐＨを９．５に調整しそして
１ｇＧ２０ｘｙを直ちに添加した。ＰＨを検査してそれ
が９．５であるよう確保し、そして反応混合物を室温で
２時間撹拌した。水素化硼素ナトリウムの新たに調製し
た溶ｉ＆ （５０ｍｙｌ ＩＩ＆）を最終濃度０．２！
Ｍｇ／ ｚＱとなるまで加え、混合物を４°Ｃで２時間
撹拌した。次にこの反応混合物を１））１７．５のＰＢ
Ｓで４℃で４時間透析した。この接合体をＳ−４００カ
ラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）上溶離緩衝液としてｐＨ
７，５のＰＢＳを用い、流速毎時３．６ｘＱで精製した
。すべてのフラクションの吸光度を２８０ ｎｍおよび
３６８ ｎｍで読みとって、どのフラクションかタンパ
ク質およびＨＲＰをそれぞれ含有するか判定した。これ
らの両方の波長で吸収を有するフラクションがＨＲＰ−
接合したモノクローナル抗体を含有している。
Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ ＧＭＢＨ！
２、西ドイツ）１０ｉｙを蒸留水５！ＩＱ中に溶解させ
、次に新たに調製した０、 ２Ｍ過沃素酸ナトリウム水
溶液１１と混合しそして室温で２０分間撹拌した。この
溶液をｐＨ４，５の１ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液で一夜
透析した。透析後、溶液のｐＨを９．５に調整しそして
１ｇＧ２０ｘｙを直ちに添加した。ＰＨを検査してそれ
が９．５であるよう確保し、そして反応混合物を室温で
２時間撹拌した。水素化硼素ナトリウムの新たに調製し
た溶ｉ＆ （５０ｍｙｌ ＩＩ＆）を最終濃度０．２！
Ｍｇ／ ｚＱとなるまで加え、混合物を４°Ｃで２時間
撹拌した。次にこの反応混合物を１））１７．５のＰＢ
Ｓで４℃で４時間透析した。この接合体をＳ−４００カ
ラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）上溶離緩衝液としてｐＨ
７，５のＰＢＳを用い、流速毎時３．６ｘＱで精製した
。すべてのフラクションの吸光度を２８０ ｎｍおよび
３６８ ｎｍで読みとって、どのフラクションかタンパ
ク質およびＨＲＰをそれぞれ含有するか判定した。これ
らの両方の波長で吸収を有するフラクションがＨＲＰ−
接合したモノクローナル抗体を含有している。
これらフラクションをＥＬＩＳＡにより免疫学的活性に
ついて評価した。ｐＨ７，２のＰＢＳ中に希釈され′た
ｒＨＢｃＡｇタンパク質５０ｎ９を含有する液体２００
μＱでミクロ滴定プレートを被覆した。
ついて評価した。ｐＨ７，２のＰＢＳ中に希釈され′た
ｒＨＢｃＡｇタンパク質５０ｎ９を含有する液体２００
μＱでミクロ滴定プレートを被覆した。
４°Ｃで一夜吸収させたのち、プレートを周囲温度で１
時間１％ＢＳＡ−ＰＢＳで遮蔽した。接合体フラクショ
ンを０．１％ＢＳＡ −ＰＢＳ中に１ ： ｔｏｏｏに
希釈シて各フラクションの１００μｇをウェルに加え、
次にＨＢｃＡｇに対して反応性を有しない正常なヒト血
清１００μａを添加した。室温で９０分間インキュベー
ションしたのちプレートを洗いそしてＯＰＤ溶液２００
μＱを加え、室温で１５分間反応せしめた。ＩＮ Ｈ
！５０− ５０μｇを添加することにより反応を停止さ
せ、そして４９２ｎｍで吸光度を測定した。吸光度≧０
．５を生ずるフラクションを集めた。
時間１％ＢＳＡ−ＰＢＳで遮蔽した。接合体フラクショ
ンを０．１％ＢＳＡ −ＰＢＳ中に１ ： ｔｏｏｏに
希釈シて各フラクションの１００μｇをウェルに加え、
次にＨＢｃＡｇに対して反応性を有しない正常なヒト血
清１００μａを添加した。室温で９０分間インキュベー
ションしたのちプレートを洗いそしてＯＰＤ溶液２００
μＱを加え、室温で１５分間反応せしめた。ＩＮ Ｈ
！５０− ５０μｇを添加することにより反応を停止さ
せ、そして４９２ｎｍで吸光度を測定した。吸光度≧０
．５を生ずるフラクションを集めた。
この方法で精製および標識した３種類の抗体（７Ａ６．
４．７Ａ７および？ＡＩ３．１）を１ ： １０００に
希釈し、そして異なる抗体の結合部位が同一であるか否
か判定するために５種の未標識モノクローナル抗体（７
Ａ６．４．７Ａ７．７Ａ１３．ｌ、 ７Ａ１４．１およ
び７Ａ１５．２）の連続希釈物との競合についてＣ（ｉ
）（ａ）項記載の競合的ＥＬＩＳＡアッセイで検査した
。
４．７Ａ７および？ＡＩ３．１）を１ ： １０００に
希釈し、そして異なる抗体の結合部位が同一であるか否
か判定するために５種の未標識モノクローナル抗体（７
Ａ６．４．７Ａ７．７Ａ１３．ｌ、 ７Ａ１４．１およ
び７Ａ１５．２）の連続希釈物との競合についてＣ（ｉ
）（ａ）項記載の競合的ＥＬＩＳＡアッセイで検査した
。
その結果を第５表に示す。
０００ エ ＝−＝； 号 上筒
８ 次
これらの結果は、７Ａ／ １４．１を除くすべてのモノ
クローナル抗体が同じエピトープに結合すること、およ
びそれゆえそのエピトープが免疫優性エピトープである
ことを示している。７Ａ／１４．１は７Ａ７を部分的に
阻害しそしてヒトポリクローナル抗ＨＢｃＡｇと効果的
に競合するので、７Ａ／１４１が結合するのは免疫優性
部位であるがしかし近接するかまたは重なり合うエピト
ープであることか示唆されうる。
クローナル抗体が同じエピトープに結合すること、およ
びそれゆえそのエピトープが免疫優性エピトープである
ことを示している。７Ａ／１４．１は７Ａ７を部分的に
阻害しそしてヒトポリクローナル抗ＨＢｃＡｇと効果的
に競合するので、７Ａ／１４１が結合するのは免疫優性
部位であるがしかし近接するかまたは重なり合うエピト
ープであることか示唆されうる。
Ｇ１診断用アッセイにおけるＨＲＰ−モノクローナル抗
体の使用 セイヨウワサビペルオキシダーゼに接合されたモノクロ
ーナル抗体７＾６４を、ヒト血清または血漿中のＨＢｃ
Ａｇに対する抗体を検出するための競合的ＥＬＩＳＡを
開発するのに使用した。ミクロ滴定プレートのウェルを
ｐｌ＋７．５のＰＢＳ中に希釈した１ＩＢｃ、Ａｇ ２
００μＣで被覆してｌウェル当たりのｉｆＪ ［ｆを５
０ｎｇとなした。−（ｌ吸収させたのち、ウェルをＰＢ
Ｓ中の１％ウシ血清アルブミン２５０μＱを用いて室温
で１時間遮蔽した。
体の使用 セイヨウワサビペルオキシダーゼに接合されたモノクロ
ーナル抗体７＾６４を、ヒト血清または血漿中のＨＢｃ
Ａｇに対する抗体を検出するための競合的ＥＬＩＳＡを
開発するのに使用した。ミクロ滴定プレートのウェルを
ｐｌ＋７．５のＰＢＳ中に希釈した１ＩＢｃ、Ａｇ ２
００μＣで被覆してｌウェル当たりのｉｆＪ ［ｆを５
０ｎｇとなした。−（ｌ吸収させたのち、ウェルをＰＢ
Ｓ中の１％ウシ血清アルブミン２５０μＱを用いて室温
で１時間遮蔽した。
プレートをＰＢＳで３回洗いそして風乾した。
正常な供血者集団から得られる２０６個の血清および血
定の検体をＦ（ＲＰ−モノクローナル抗体アッセイによ
り検査した。セイヨウワサビペルオキシダーゼと接合し
たモノクローナル抗体、およびヒト血漿または血清の同
ｆｆｉ （ｌ ＯＯμＱ）ラミクロ滴定ウェル中に加え
、室温で９０分間インキユヘートした。ＨＢ ｃ Ａｇ
に対して反応性であることか知ら、れている陽性対照検
体、および陰性対！ｌ仇検体も二重に検査した。ウェル
をＰＢＳで６回洗いそして吸収紙に吸取らせて乾燥した
。○ＰＤ溶液の２００μσを各ウェルに加えて３０分間
インキユヘートした。各ウェルにＩＮ硫酸５０μＱを添
加することにより反応を停止させそして４９２ｎｍての
吸光度を読みとった。
定の検体をＦ（ＲＰ−モノクローナル抗体アッセイによ
り検査した。セイヨウワサビペルオキシダーゼと接合し
たモノクローナル抗体、およびヒト血漿または血清の同
ｆｆｉ （ｌ ＯＯμＱ）ラミクロ滴定ウェル中に加え
、室温で９０分間インキユヘートした。ＨＢ ｃ Ａｇ
に対して反応性であることか知ら、れている陽性対照検
体、および陰性対！ｌ仇検体も二重に検査した。ウェル
をＰＢＳで６回洗いそして吸収紙に吸取らせて乾燥した
。○ＰＤ溶液の２００μσを各ウェルに加えて３０分間
インキユヘートした。各ウェルにＩＮ硫酸５０μＱを添
加することにより反応を停止させそして４９２ｎｍての
吸光度を読みとった。
ＨＢｃＡｇに対する抗体の存在または非存在は検体の吸
光度をカットオフ値と比較することにより判定した。こ
のカットオフ値は陰性および陽性対照の吸光度平均から
下記等式を用いて計算された。
光度をカットオフ値と比較することにより判定した。こ
のカットオフ値は陰性および陽性対照の吸光度平均から
下記等式を用いて計算された。
０．４（陰性対照平均）＋０．６（陽性対照平均）カッ
トオフ値に等しいかまたはそれより低い吸光度を有する
検体はＨＢｃＡｇに対する抗体に関して反応性であると
見なされる。カットオフ値より高い吸収値を有する検体
は陰性であると見なされる。カットオフ値は０．４６７
であると計算された。１５個の検体がＨＲＰ−モノクロ
ーナル抗体と競合し、それゆえＨＢｃＡｇに対する抗体
が反応性を有していた。このアッセイをＨＲＰ−ヒト抗
ＨＢＣＡｇを用いて再び実施し、そしてこれら同じ検体
はＨＢｃＡｇに対する抗体がやはり反応性を有すること
が見出された。この調査の結果を第６表にまとめる。
トオフ値に等しいかまたはそれより低い吸光度を有する
検体はＨＢｃＡｇに対する抗体に関して反応性であると
見なされる。カットオフ値より高い吸収値を有する検体
は陰性であると見なされる。カットオフ値は０．４６７
であると計算された。１５個の検体がＨＲＰ−モノクロ
ーナル抗体と競合し、それゆえＨＢｃＡｇに対する抗体
が反応性を有していた。このアッセイをＨＲＰ−ヒト抗
ＨＢＣＡｇを用いて再び実施し、そしてこれら同じ検体
はＨＢｃＡｇに対する抗体がやはり反応性を有すること
が見出された。この調査の結果を第６表にまとめる。
第６表
０．０−０．１ １４ １４
０、１−０．２ ０ ０
０、２−０．３ １ １
０、３−０．４ ０ ０
０、４−０．５ ０ ０
０．５−０．６ ２ ５
０、６−０．７ １ ５
０．７−０．８ ３ ２１０．８−
０．９ ２ ５１ ０．９−１．０ ６ ５３ ＞１．０ １７７ ５，６ 実施例 ２ 代替診断アッセイ操作 Ａ、抗体産生および精製 ハイブリドーマ細胞系統７Ａ６．４を選択してさらにア
ッセイ開発に用いた。この細胞系統を限界希釈により再
クローンし、そしてサブクローン７＾６．４．３を選択
して腹水を産生させた。このサブクローンは実施例ＩＣ
に記載されるアッセイで予想されるように反応性である
ことが示された。腹水は実施例ＩＤに記載されるように
して産生され、モノクローナル抗体は実施例ＩＥに記載
されるようにして精製された。
０．９ ２ ５１ ０．９−１．０ ６ ５３ ＞１．０ １７７ ５，６ 実施例 ２ 代替診断アッセイ操作 Ａ、抗体産生および精製 ハイブリドーマ細胞系統７Ａ６．４を選択してさらにア
ッセイ開発に用いた。この細胞系統を限界希釈により再
クローンし、そしてサブクローン７＾６．４．３を選択
して腹水を産生させた。このサブクローンは実施例ＩＣ
に記載されるアッセイで予想されるように反応性である
ことが示された。腹水は実施例ＩＤに記載されるように
して産生され、モノクローナル抗体は実施例ＩＥに記載
されるようにして精製された。
Ｂ、抗体−ＨＲＰ接合体の生成およ゛び精製精製された
モノクローナル抗体を実施例ＩＦに記載されるようにし
てＨ’ＲＰに接合させるが、但しその接合体はＳ−４０
０カラムでなく Ｚｏｒｂａｘ■Ｂｉｏｓｅｒｉｅｓ
ＧＦ−４５０ＸＬ調製用ＩＩ Ｐ Ｌ Ｃカラムを用い
て精製した。接合体はＰＨ７，０の０．Ｏ１％チメロサ
ール含有０．１５Ｍ燐酸塩緩衝液を用いてＨＰＬＣカラ
ムから溶離した。接合体はカラムのほぼボイド量で未反
応の酵素および抗体を何ら含有しない巾広いピークとし
て溶出する。全ピ°−りを集め、そして２８０ｎｍでの
吸収がほぼ０．０２５となるように０．１３５ Ｎａ
ＣＱ、２０％ウシ胎児血清および０、Ｏ１％チメロサー
ルを含有するｐＨ’／、 ５ノ０．０９Ｍトリス（ヒド
ロキシメチル）アミノメタン（安定化緩衝液）を用いて
希釈する。こあ接合体は使用に先立ち安定化緩衝液を用
いてさらに希釈する。最終希釈度は実施例ＩＦ記載のＥ
ＬＩＳＡ操作を用いて決定される。
モノクローナル抗体を実施例ＩＦに記載されるようにし
てＨ’ＲＰに接合させるが、但しその接合体はＳ−４０
０カラムでなく Ｚｏｒｂａｘ■Ｂｉｏｓｅｒｉｅｓ
ＧＦ−４５０ＸＬ調製用ＩＩ Ｐ Ｌ Ｃカラムを用い
て精製した。接合体はＰＨ７，０の０．Ｏ１％チメロサ
ール含有０．１５Ｍ燐酸塩緩衝液を用いてＨＰＬＣカラ
ムから溶離した。接合体はカラムのほぼボイド量で未反
応の酵素および抗体を何ら含有しない巾広いピークとし
て溶出する。全ピ°−りを集め、そして２８０ｎｍでの
吸収がほぼ０．０２５となるように０．１３５ Ｎａ
ＣＱ、２０％ウシ胎児血清および０、Ｏ１％チメロサー
ルを含有するｐＨ’／、 ５ノ０．０９Ｍトリス（ヒド
ロキシメチル）アミノメタン（安定化緩衝液）を用いて
希釈する。こあ接合体は使用に先立ち安定化緩衝液を用
いてさらに希釈する。最終希釈度は実施例ＩＦ記載のＥ
ＬＩＳＡ操作を用いて決定される。
Ｃ０診断上のアッセイ操作
ミクロ滴定プレートを実施例ＩＧ記載のようにしてｒ
ＩＩ Ｂ ｃ Ａ ｇで被覆した。検体１００μＱをプ
レートの表示されたウェルに加えた。前記Ｂ項で調製さ
れた接合体１００μｇを３０分以内に加え、プレートを
被覆して約３７°Ｃで約１時間インキュベートした。次
に、ツイーン２０界面活性剤および防腐剤としてクロロ
アセトアミドを含有するＰＢＳでプレートを６回洗った
。残留する洗浄用緩衝液滴はプレートを吸収剤表面上に
２回しっかりと吸い取らせることによりとり除いた。次
に２５ｍＭの○ＰＤ、２５ｍＭのクエン酸塩および００
３％の過酸化水素を含有する基質溶液１００μＱをプレ
ートの各ウェルに加えて、プレートを暗中約３０分間イ
ンキュベートした。ｌＮ ＩＩ、Ｓｏ、 １００μＱの
添加により酵素反応を停止させそして４９２％ｍでの吸
光度を測定した。Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、抗
ＨＢ ｓ Ａ ｇおよび抗ＨＢｃＡｇに対して非反応性
であるカルシウム再添加されたヒト血漿からなる陰性対
照は三重に検査した。
ＩＩ Ｂ ｃ Ａ ｇで被覆した。検体１００μＱをプ
レートの表示されたウェルに加えた。前記Ｂ項で調製さ
れた接合体１００μｇを３０分以内に加え、プレートを
被覆して約３７°Ｃで約１時間インキュベートした。次
に、ツイーン２０界面活性剤および防腐剤としてクロロ
アセトアミドを含有するＰＢＳでプレートを６回洗った
。残留する洗浄用緩衝液滴はプレートを吸収剤表面上に
２回しっかりと吸い取らせることによりとり除いた。次
に２５ｍＭの○ＰＤ、２５ｍＭのクエン酸塩および００
３％の過酸化水素を含有する基質溶液１００μＱをプレ
ートの各ウェルに加えて、プレートを暗中約３０分間イ
ンキュベートした。ｌＮ ＩＩ、Ｓｏ、 １００μＱの
添加により酵素反応を停止させそして４９２％ｍでの吸
光度を測定した。Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、抗
ＨＢ ｓ Ａ ｇおよび抗ＨＢｃＡｇに対して非反応性
であるカルシウム再添加されたヒト血漿からなる陰性対
照は三重に検査した。
抗Ｉｔ Ｂ ｃ Ａ ｇに対して反応性であるカル／ラ
ム再添加されたヒト血漿からなる陽性対照は二重に検査
した。カットオフ値は陰性対照の平均応答に０．２５を
乗することにより計算した。カットオフ値より低い値は
抗ＨＢ ｃ 、１ ｇに対して反応性であると見なされ
、カットオフ値より大きいものは非反応性と見なされる
。知られた反応性血漿２検体および知られた非反応性血
漿６検体をこの操作に従い検査した。代表的なデータを
第７表に示す。
ム再添加されたヒト血漿からなる陽性対照は二重に検査
した。カットオフ値は陰性対照の平均応答に０．２５を
乗することにより計算した。カットオフ値より低い値は
抗ＨＢ ｃ 、１ ｇに対して反応性であると見なされ
、カットオフ値より大きいものは非反応性と見なされる
。知られた反応性血漿２検体および知られた非反応性血
漿６検体をこの操作に従い検査した。代表的なデータを
第７表に示す。
第７表
検体＃ 吸光度（４９２％ｍ） 結果（＋／
−）陽性対照 ０．１８０（２回の平均）、−−−陰
性対照 １．４２１（３回の平均）１ ０、１
８４ ＋２ ２、０３８
−３ ０、６３８
−４ ２．７５９ −５
１、６８８ −６ ０、
６０２ −７ ０、１４７
＋８ ２、４８２
−特許出願人 イー・アイ・デュポン・ド・ネ
モアースｅアンド・コンパニー 外２名
−）陽性対照 ０．１８０（２回の平均）、−−−陰
性対照 １．４２１（３回の平均）１ ０、１
８４ ＋２ ２、０３８
−３ ０、６３８
−４ ２．７５９ −５
１、６８８ −６ ０、
６０２ −７ ０、１４７
＋８ ２、４８２
−特許出願人 イー・アイ・デュポン・ド・ネ
モアースｅアンド・コンパニー 外２名
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １）（１）患者の検体とＢ型肝炎コア抗原（ＨＢｃＡｇ
）に対する標識された抗体とを、固形支持体 に結合されたＨＢｃＡｇと一緒にインキュベートし、 （２）支持体を洗浄して標識された抗体の結合しなかっ
た部分を除去し、そして （３）ＨＢｃＡｇに結合するかまたはＨＢｃＡｇに結合
しなかった標識された抗体により生成される シグナルを測定する、 ことからなる患者検体中におけるＨＢｃＡｇに対する抗
体を検出するための単一の抗体阻害アツセイにおいて、
前記標識された抗体が競合的ＥＬＩＳＡ法においてヒト
抗ＨＢｃＡｇポリクローナル抗体と有効に競合するモノ
クローナル抗体であることを特徴とする検定方法。 ２）標識された抗体がＨＢｃＡｇ上の免疫優性部位に対
する抗体であることを特徴とする特許請求の範囲第１項
記載の方法。 ３）標識が酵素であることを特徴とする特許請求の範囲
第２項記載の方法。 ４）検体および標識された抗体を同時にＨＢｃＡｇとイ
ンキュベートすることを特徴とする特許請求の範囲第３
項記載の方法。 ５）抗体がＡＴＣＣ受託番号ＨＢ−９２６５、ＨＢ−９
２６２、ＨＢ−９２６４、ＨＢ−９２６３またはＨＢ−
９２６１を有する細胞系統により産生される抗体である
ことを特徴とする特許請求の範囲第４項記載の方 法。 ６）抗体がＡＴＣＣ受託番号ＨＢ−９２６５を有する細
胞系統により産生される抗体であることを特徴とする特
許請求の範囲第５項記載の方法。 ７）標識された抗体の添加に先立ち検体を ＨＢｃＡｇとインキュベートすることを特徴とする特許
請求の範囲第３項記載の方法。 ８）抗体がＡＴＣＣ受託番号ＨＢ−９２６５、ＨＢ−９
２６２、ＨＢ−９２６４、ＨＢ−９２６３またはＨＢ−
９２６１を有する細胞系統により産生される抗体である
ことを特徴とする特許請求の範囲第７項記載の方 法。 ９）抗体がＡＴＣＣ受託番号ＨＢ−９２６５を有する細
胞系統により産生される抗体であることを特徴とする特
許請求の範囲第８項記載の方法。 １０）それ自体が検出可能に標識されている他の物質が
結合することによって抗体に標識が結合していることを
特徴とする特許請求の範囲第１項記載の方法。 １１）標識が酵素であることを特徴とする特許請求の範
囲第１０項記載の方法。 １２）固形支持体に結合されたＨＢｃＡｇ、および競合
的ＥＬＩＳＡ法においてヒト抗ＨＢｃＡｇポリクローナ
ル抗体と有効に競合するものである標識されたモノクロ
ーナル抗体を含有することからなる特許請求の範囲第１
項記載の検定方法を実施するための試薬キット。 １３）標識が酵素でありそして抗体がＡＴＣＣ受託番号
ＨＢ−９２６５、ＨＢ−９２６２、ＨＢ−９２６４、Ｈ
Ｂ−９２６３またはＨＢ−９２６１を有する細胞系統に
より産生される抗体であることからなる特許請求の範囲
第１２項記載のキット。 １４）標識がセイヨウワサビペルオキシダーゼまたはア
ルカリホスファターゼでありそして抗体がＡＴＣＣ受託
番号ＨＢ−９２６５を有する細胞系統により産生される
抗体であることからなる特許請求の範囲第１３項記載の
キット。 １５）（１）上澄み検体、および酵素標識されたヒト抗
ＨＢｃＡｇポリクローナル抗体を、支持体に結合された
ＨＢｃＡｇと一緒にインキュベートし、 （２）支持体を洗浄して標識された抗体の結合しなかっ
た部分を除去し、そして （３）酵素基質の溶液を添加して混合物の吸光度を測定
する、 ことからなる、ＨＢｃＡｇに対するモノクローナル抗体
についてハイブリドーマ上澄み液を競合的ＥＬＩＳＡに
よりスクリーニングする方法。 １６）（１）上澄み検体と抗原に対する標識されたポリ
クローナル抗体とを、支持体に結合され た抗原と一緒にインキュベートし、 （２）支持体を洗浄して標識された抗体で結合しなかっ
た部分を除去し、そして （３）結合された標識された抗体を検出する、ことから
なる多重エピトープ抗原の免疫優性エピトープに対する
モノクローナル抗体についてハイブリドーマ上澄み液を
競合的ＥＬＩＳＡによりスクリーニングする方法。 １７）合計で１００μｇ未満のｒＨＢｃＡｇを３週間よ
り少ない期間腹腔内および静脈注射することによりマウ
スを免疫し、その免疫されたマウスからの脾臓細胞をマ
ウスミエローマ細胞と融合させ、融合した細胞を選択培
地中で培養して連続的なハイブリッド細胞系統を生成さ
せそしてこの細胞をクローンさせて抗体を産生させるこ
とからなる、ｒＨＢｃＡｇに対する親和性の高いモノク
ローナル抗体の製法。 １８）ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ−９２６５、ＨＢ−９２６
２、ＨＢ−９２６４、ＨＢ−９２６３またはＨＢ−９２
６１を有するハイブリッド細胞系統。 １９）特許請求の範囲第１８項記載の細胞系統により産
生される、ＨＢｃＡｇに対するモノクローナル抗体。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US933,617 | 1986-11-21 | ||
| US06/933,617 US4818688A (en) | 1986-11-21 | 1986-11-21 | Assays for antibody to hepatitis B core antigen |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63157060A true JPS63157060A (ja) | 1988-06-30 |
Family
ID=25464239
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62292227A Pending JPS63157060A (ja) | 1986-11-21 | 1987-11-20 | Ｂ型肝炎コア抗原に対する抗体の検定 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4818688A (ja) |
| EP (1) | EP0268987A3 (ja) |
| JP (1) | JPS63157060A (ja) |
| DK (1) | DK610587A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009288149A (ja) * | 2008-05-30 | 2009-12-10 | Tosoh Corp | Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原又はそれに対する抗体の測定方法 |
| JP2011106834A (ja) * | 2009-11-12 | 2011-06-02 | Tosoh Corp | 免疫測定方法 |
| JPWO2016143351A1 (ja) * | 2015-03-11 | 2017-12-21 | プリマハム株式会社 | カンナビノイド類の検出方法 |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5064755A (en) * | 1988-08-04 | 1991-11-12 | Abbott Laboratories | Two-site confirmatory assay |
| US5164299A (en) * | 1990-03-20 | 1992-11-17 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Use of a mixture of conjugated and unconjugated solid phase binding reagent to enhance the performance of assays |
| IT1241154B (it) * | 1990-05-18 | 1993-12-29 | Slavo | Metodo e composizione reagente per la determinazione dell'alanina amminotrasferasi e dell'antigene hbsag in uno stesso campione biologico |
| JPH05126829A (ja) * | 1991-04-03 | 1993-05-21 | Syntex Usa Inc | 免疫グロブリンのイムノアツセイ |
| US6319665B1 (en) | 1994-06-07 | 2001-11-20 | Inverness Medical Technology, Inc. | Home test kit and method with telephone verification of results |
| DE19505266C1 (de) * | 1995-02-16 | 1996-10-02 | Brahms Diagnostica Gmbh | Verwendung von polyklonalen humanen anti-hTg-Autoantikörpern als Reagenz für die klinische Diagnostik von Schilddrüsen-Autoimmunerkrankungen sowie Reagenziensatz für eine Bestimmung von anti-hTg-Autoantikörpern in Patientenseren |
| CN103412122B (zh) * | 2013-08-09 | 2015-06-24 | 安徽农业大学 | 同步检测金葡菌a型和g型肠毒素的基于多表位串联肽的间接竞争elisa方法 |
| CN107012127B (zh) * | 2017-04-01 | 2018-06-29 | 四川迈克生物新材料技术有限公司 | 抗b型肝炎病毒核心抗原的单克隆抗体、其用途以及分泌所述单克隆抗体的杂交瘤细胞 |
| CN116693666B (zh) * | 2023-08-02 | 2023-10-03 | 南方医科大学南方医院 | 一种抗乙型肝炎核心抗原的单克隆抗体及其应用 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0003498B1 (en) * | 1978-01-06 | 1981-09-16 | Robert C. Trimble | Decorative safety member for spoked wheels |
| US4241175A (en) * | 1978-12-18 | 1980-12-23 | Merck & Co., Inc. | Assay for hepatitis B core antibody |
| JP2530801B2 (ja) * | 1978-12-22 | 1996-09-04 | バイオゲン インコーポレイテッド | 組換えｄｎａ分子 |
| US4271145A (en) * | 1979-10-22 | 1981-06-02 | The Massachusetts General Hospital | Process for producing antibodies to hepatitis virus and cell lines therefor |
| US4491632A (en) * | 1979-10-22 | 1985-01-01 | The Massachusetts General Hospital | Process for producing antibodies to hepatitis virus and cell lines therefor |
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| GB8431171D0 (en) * | 1984-12-11 | 1985-01-23 | Technology Licence Co Ltd | Monoclonal antibodies |
-
1986
- 1986-11-21 US US06/933,617 patent/US4818688A/en not_active Expired - Lifetime
-
1987
- 1987-11-18 EP EP19870117010 patent/EP0268987A3/en not_active Withdrawn
- 1987-11-20 JP JP62292227A patent/JPS63157060A/ja active Pending
- 1987-11-20 DK DK610587A patent/DK610587A/da not_active Application Discontinuation
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009288149A (ja) * | 2008-05-30 | 2009-12-10 | Tosoh Corp | Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原又はそれに対する抗体の測定方法 |
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| JPWO2016143351A1 (ja) * | 2015-03-11 | 2017-12-21 | プリマハム株式会社 | カンナビノイド類の検出方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US4818688A (en) | 1989-04-04 |
| EP0268987A2 (en) | 1988-06-01 |
| DK610587A (da) | 1988-05-22 |
| DK610587D0 (da) | 1987-11-20 |
| EP0268987A3 (en) | 1991-01-09 |
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