DE3750339T2

DE3750339T2 - HTLV-III umhüllende Peptiden.

Info

Publication number: DE3750339T2
Application number: DE3750339T
Authority: DE
Inventors: Robert Charles Gallo; Edgar Philip Heimer; Premkumar Eragam Reddy; Flossie Wong-Staal
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG; US Department of Health and Human Services
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG; US Department of Health and Human Services
Priority date: 1986-02-03
Filing date: 1987-02-02
Publication date: 1994-12-08
Anticipated expiration: 2007-02-03
Also published as: DE3750339D1; NO169844C; NO870412L; ES2062971T3; AU6818987A; NZ219113A; EP0231914A2; NO169844B; FI870447A0; CA1340735C; DK53687D0; NO870412D0; FI870447L; FI870447A7; JPS62277400A; EP0231914B1; AU600466B2; US4772547A; JPH07121959B2; ATE109795T1

Description

Die Erfindung betrifft als HTLV-III env bezeichnete synthetische Peptide, deren Sequenz eine konservierte Region des viralen Hüllproteins des ethiologischen Agens für das Erworbene-Immunschwächesyndrom (AIDS) darstellt, Derivate solcher Peptide und die Verwendung solcher Peptide und/oder Derivate in Methoden zur Detektion der Anwesenheit von AIDS Antikörpern in humanem Blut. Weiterhin können solche Peptide in immunogenen Zusammensetzungen genutzt werden, die als Vakzine oder zur Erzeugung von Antikörpern in Wirtstieren verwendbar sind, und diese Antikörper wiederum können zur Detektion des HTLV-III Virus in biologischen flüssigen Proben verwendet werden.
Die hierin offenbarten Resultate basieren zum Teil auf Techniken und Konzepten aus dem Gebiet der Immunologie. Zur Erleichterung werden einige der im Stand der Technik verwendeten allgemeinen Begriffe näher definiert. Der Begriff "immunchemische Reaktion" wird verwendet, um die spezifische Interaktion zwischen einem Antigen und seinem korrespondierenden Antikörper zu bezeichnen, unabhängig von der Meßmethode. Solch eine Reaktion ist durch eine nicht-kovalente Bindung von einem oder mehreren Antikörpermolekülen an ein oder mehrere Antigenmoleküle gekennzeichnet. Die immunchemische Reaktion kann durch eine Vielzahl im Stand der Technik bekannter Immunoassays detektiert werden. Die Begriffe "immunogen" oder "antigenisch" werden hier verwendet, um die Fähigkeit einer gegebenen Substanz zur Stimulierung der Produktion von Antikörpern zu beschreiben, die spezifisch immunreaktiv mit der Substanz sind, wenn diese Substanz einem geeigneten Testtier unter bekannten Bedingungen zur Auslösung einer Antikörperproduktion verabreicht wird. Der Begriff "schützendes Antigen" bezieht sich auf die Fähigkeit eines gegebenen Immunogens, in einer geeigneten Wirtszelle eine Resistenz gegen ein gegebenes Pathogen zu verleihen. Der Begriff "Epitop" bezieht sich auf eine spezifische Antikörper-Bindestelle auf einem Antigen. Makromolekulare Antigene wie etwa Proteine haben typischerweise verschiedene Epitope mit unterschiedlichen Antikörperbindungsspezifitäten. Verschiedene Epitope des gleichen Antigens sind mit der Hilfe von monoklonalen Antikörpern unterscheidbar die, bedingt durch ihren hohen Grad an Spezifität, gegen einzelne Epitope gerichtet sind. Zwei verschiedene monoklonale Antikörper, die gegen verschiedene Epitope des gleichen Antigens gerichtet sind, können jeder für sich das Antigen ohne gegenseitige Beeinflussung binden, solange nicht die Epitope so dicht beieinander sind, daß die Bindung des einen die Bindung des anderen verhindert. Der Begriff "immunodominante Region" bezeichnet ein Gebiet auf dem Antigenmolekül, das hauptsächlich für seine Antigenität verantwortlich ist.
Von 1981 bis heute sind über achtzehntausend (18,000) Menschen diagnostiziert worden, die das Erworbene-Immunschwächesyndrom (AIDS) haben. AIDS ist durch das Auftreten von schweren opportunistischen Infektion charakterisiert worden, die sekundär zu dem Effekt auf das Immunsystem des Körpers auftreten. [Gottlieb, M.S. et al., "Pneumocystis Carini; Pneumonia and Mucosal Candidiasis in previously healthy homosexual men: evidence of a new acquired cellular immuno-deficiency", N. Eng. J. Med. 305. 1425-1431 (1981)]. Die Krankheit ist bei männlichen Homosexuellen, Patienten die Blutprodukte erhalten, intravenösen Drogenabhängigen und Individuen, die von Haiti oder Zentralafrika abstammen, gefunden worden [Piot, P. et al., "Acquired immuno-deficiency syndrome in a heterosexual population in Zaire", Lancet 11, 65-69 (1984)]. Vom verursachenden Agens wurde vermutet, daß es viralen Ursprungs ist, da die epidemiologischen Daten von AIDS mit einer übertragbaren Krankheit übereinstimmten. Mindestens drei (3) Retroviren sind aus kultivierten T-Zellen von verschiedenen Patienten mit AIDS, oder aus weißen Blutzellen von Personen mit einem Risiko für die Krankheit, isoliert worden. Ein neues, humanes Retrovinis, genannt Lymphoadenopathie- Assoziiertes-Virus (LAV), wurde entdeckt und seine Eigenschaften waren in Übereinstimmung mit seiner ethiologischen Rolle bei AIDS. Das Virus wurde von einem Patienten mit Lymphoadenopathie isoliert und hat daher seinen Namen [Montagnier, L. et al., "A New Human T-lymphotropic retrovirus: Characterization and possible role in lymphadenopathy and acquired immune deficiency syndromes", in Human T-Cell Leukemia/Lymphoma Virus; R.C. Gallo, M. Essex and L. Gross, eds. (Cold spring Harbor, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory 1984) 363-370]. Andere humane Retroviren, insbesondere zwei Subgruppen des humanen T-Zell Leukämie/Lymphoma/Lymphotropischen Virus, Typ I [HTLV-I: Poiesz, B.J. et al. PNAS (USA) 77, 7415-7419 (1980)] und III lPopovic, M. et al., "Detection, isolation and continuous production of cytopathic retroviruses (HTLV-III) from patients with AIDS and pre-AIDS", Science 224, 497-500 (1984)] sind ebenfalls isoliert worden. Noch ein anderes Virus, das AIDS- assoziierte Retrovirus (ARV), wurde als verursachendes Agens vorgeschlagen [Levy, J.A. et al., "Isolation of lymphocytopathic retroviruses from San Francisco patients with AIDS", Science 225, 840-842 (1984)]. Die beiden Retroviren HTLV-III und ARV zeigen die gleichen biologischen und sero-epidemiologischen Eigenschaften wie LAV [Levy et al., supra, Popovic et al. supra]. Aus dem obigen zeigt sich, daß mindestens drei (3) Retroviren als das ethiologische Agens von AIDS postuliert worden sind: LAV; ARV; und die HTLV Subtypen I und III.
LAV, HTLV-III und ARV-II Genome sind molekular kloniert worden [Schüpbach, J. et al., "Serological analysis of a subgroup of human T-lymphotropic retroviruses (HTLV-III) associated with AIDS", Science 224, 503-505 (1984); Mizon, M. et al., "Molecular Cloning of lymphadenopathyassociated virus", Nature 312. 757-760 (1984)]. Die vollständige Nukleotidsequenz des proviralen Genoms von LAV, ARV und HTLV-III ist bestimmt worden [Ratner, L. et al., "Complete nucleotide sequence of the AIDS virus, HTLV III", Nature 313, 277-284 (1985); Sanchez-Pescador, R. et al., "Nucleotide sequence and expression of an AIDS-associated retrovirus (ARV-2)", Science 227, 484-492 (1985); Wain-Hobson, S. et al., "Nucleotide sequence of the AIDS virus, LAV", Cell 40, 9-17 (1985)].
Ein Grund für die Schwierigkeit bei der Bestimmung des ethiologischen Agens von AIDS war durch die Reaktivität von verschiedenen retroviralen Antigenen mit Serumproben von AIDS-Patienten bedingt. So wurde zum Beispiel gezeigt, daß Serumproben von AIDS-Patienten mit Antigenen von HTLV-I [Essex, M., et al., "Antibodies to Cell Membrane Antigens Associated with Human T-Cell Leukemia Virus in Patients with AIDS", Science 220, 859-862 (1983)] und HTLV-III [Sarngadharan, M.G. et al., "Antibodies Reactive With Human T-Lymphotropic Retroviruses (HTLV-III) in the Serum of Patients With MDS", Science 224, 506-508 (1984)] reagierten. Hullgenprodukte von HTLV zeigten kreuzreaktive Antigenität mit Antikörpern in Seren von erwachsenen T-Zell Leukämie Patienten [Kiyokawa, T. et al., "Envelope proteins of human T-cell leukemia virus: Expression in Escherichia coli and its application to studies of env gene fiinctions", PNAS (USA) 81, 6202-6206 (1984)]. T-Zell Leukämien von Erwachsenen unterscheiden sich vom Erworbenen-Immunschwächesyndrom (AIDS) dadurch, daß HTLV-I T-Zell Malignitäten verursacht, die durch unkontrolliertes Wachstum von T-Zellen charakterisiert sind. Bei AIDS ist es Zelltod statt Zellwachstum. Diese zytopathische Charakteristik von HTLV-III war kritisch bei der endgültigen Bestimmung des spezifisch retroviralen Ursprungs dieser Krankheit. Daher wurde das ethiologische Agens von MDS durch die Verwendung von immortalisierten humanen neoplastischen T-Zellinien (HT) isoliert, die mit dem für AIDS charakteristischen zytopathischen Retrovirus infiziert waren, das aus AIDS-kranken Patienten isoliert worden war. Die Verwendung dieses Virus in sero-epidemiologischen Assays zeigte eine vollständige Korrelation zwischen AIDS und der Anwesenheit von Antikörpern gegen HTLV-III Antigene [Sarngadharan et al., supra; Schüpbach et al., supra]. Außerdem wurde bei fast 85% der Patienten mit Lymphoadenopathie-Syndrom und bei einem bedeutenden Anteil von asymptomatischen homosexuellen Männern in AIDS-endemischen Gebieten gefunden, daß sie zirkulierende Antikörper für HTLV-III tragen. Zusammengenommen zeigen alle diese Daten, daß HTLV-III das ethiologische Agens für AIDS ist.
Bis zur erfolgreichen Kultivierung des AIDS Virus unter Verwendung der H-9 Zellinie, war das env AIDS Protein des AIDS Virus nicht isoliert, charakterisiert oder synthetisiert worden. Dies ist zu einem großen Teil dadurch bedingt, daß das Virus zytopathisch ist und daher die Isolierung des Virus nicht möglich war [Popovic, M. et al., supra]. Als die für den zytopathischen Effekt des Virus resistente humane T-Zellinie entdeckt war, konnte ein molekularer Klon von proviraler DNA erhalten werden.
Die Notwendigkeit für eine sensitive und schnelle Methode für die Diagnose von AIDS in humanem Blut und dessen Prävention durch Impfung ist sehr groß. Nahezu alle derzeit erhältlichen Assays/Tests sind mit Fehlern behaftet. In der Tat hat das Center for Disease Control (CDC) angezeigt, daß derzeitig erhältliche Tests einzig zum Screenen von Bluteinheiten auf Antikörper gegen HTLV-III verwendet werden. Das CDC ging weiter mit der Mitteilung, daß die derzeit erhältlichen ELISA Tests nicht für das generelle Screening von Hochrisikopopulationen oder als ein diagnostischer Test für AIDS verwendet werden können [Federal Register 50 (48), 9909, 12. März 1985). Die Fehler sind dem Versäumnis, ein spezifisch antigenes Protein des ethiologischen Agens für AIDS zu benutzen, zugeschrieben worden. Die vorher verwendeten Proteine wurden aus viralen Lysaten erhalten. Da die Lysate aus mit dem Virus infizierten humanen Zellen gemacht werden, d. h. die Zellen werden zum Wachstum des Virus verwendet, enthält das Lysat humane wie auch virale Proteine. Daher ist die Präparation eines reinen Antigens eines viralen Proteins sehr schwierig. Das verwendete Antigen produziert sowohl falsch-positive wie falsch-negative Resultate [Budiansky, S., AIDS Screening, False Test Results Raise Doubts, Nature 313, 583 (1984)].
Die durch-die Verwendung von solchen Lysatproteinen/-peptiden verursachten Fehler können durch die Verwendung einer Zusammensetzung zum Binden von AIDS-Antikörpern vermieden werden, die weitestgehend frei von nicht-AIDS-spezifischen Proteinen ist. Zusammensetzungen, die weitestgehend reine HTLV-III env Peptidfragmente der vorliegenden Erfindung sind, können als Antigene verwendet werden. Die HTLV-III env Peptide der vorliegenden Erfindung umfassen eine als HTLV-III env (500-511) bezeichnete hochkonservierte Epitopsequenz, die ihre Verwendung zum Screenen, Diagnostizieren und/oder Abwehren des AIDS-Virus durch Impfung erlauben.

Beschreibung der Erfindung

Die Peptide der vorliegenden Erfindung können durch die folgende Formel dargestellt werden:
W-X-Lys-Ala-Lys-Arg-Arg-Val-Val-Gln-Arg-Glu-Lys-Arg-Y-Z (I)
worin W H-, Cys-, oder Tyr- ist; X eine Bindung oder eine Subsequenz aus einer oder mehreren Aminosäuren ist, die am Carboxyl-Terminus von HTLV-III env (460-499) beginnt; Y eine Bindung oder eine Subsequenz aus einer oder mehreren Aminosäuren ist, die am Amino-Terminus von HTLV- III env (512-550) beginnt; und Z -OH, -NH&sub2; oder -Cys-NH&sub2; ist, unter der Voraussetzung, daß eines von X oder Y eine Bindung ist.
Eine andere Patentanmeldung (WO 86/06 414) ist nach dem Anmeldetag der vorliegenden Anmeldung unter Benennung der gleichen europaischen Staaten außer Spanien publiziert worden. Diese Anmeldung offenbart ebenfalls aus HTLV-III Proteinen abgeleitete Peptide. Eines von diesen Peptiden [Peptid (VIIIb) (50)] überlappt mit den Peptiden der vorliegenden Erfindung und ist in dem entsprechenden Anspruchssatz ausgenommen worden.
Die Derivate des Peptids der Formel I, die Cysteine entweder am Amino- oder Carboxy-Terminus haben, werden dazu verwendet, eine verbesserte Kopplung des Peptids an immunogene Trägermaterialien zu ermöglichen, wenn das Peptid als ein Immunogen zur Erzeugung von Antikörpern verwendet wird. Die Derivate der Formel I worin W Tyrosin ist, stellen ein bevorzugtes Substrat zur Radiojodierung dar und erlauben dadurch, daß diese Verbindungen als radiomarkierte Liganden in einem Radio-Immunoassay für HTLV-III Antikörper in Testflüssigkeiten eingesetzt werden können.
Ein bevorzugter Aspekt unter den Verbindungen der vorliegenden Erfindung wird durch Verbindungen der Formel I dargestellt, worin X eine Subsequenz aus einer oder mehrerer Aminosäuren beginnend vom Carboxyl Ende von HTLV-III env (460-499) und Y eine Bindung ist. Eine bevorzugte Ausführungsform dieses Gegenstandes der Erfindung wird erhalten, wenn die genannte Subsequenz aus HTLV-III env (487-499) besteht. Ferner bestehen besonders bevorzugte Spezien dieser Erfindung aus HTLV-III env (487-511) Cys-NH&sub2; und HTLV-III env (Tyr (487-511) Cys-NH&sub2;.
In einem anderen bevorzugten Gegenstand der Verbindungen der vorliegenden Erfindung werden Verbindungen der Formel I bereitgestellt, worin sowohl X und Y Bindungen sind. Bevorzugte Ausführungsformen dieses Gegenstandes der Erfindung beinhalten HTLV-III env (500-511) Cys- NH&sub2;, HTLV-III env Cys-(500-511) NH&sub2; und HTLV-Ill env Tyr (500-511) NH&sub2;.
Verbindungen der vorliegenden Erfindung von Formel I können in geeigneter Weise durch die Verwendung von im Stand der Technik bekannten konventionellen Peptidsyntheaemethoden hergestellt werden. Solche Verfahren schließen die Flüssigphasensynthese und Festphasensynthese ein, unter Anwendung der Methodologie wie sie von R.B. Merrifield entwickelt wurde [J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2154 (1963)]. Bei der Festphasensynthesemethode, die die bevorzugte Methode zum Herstellen der Verbindungen der vorliegenden Erfindung gemäß Formel I darstellt, wird ein polymerer Festphasenträger verwendet, an den die in der Synthese verwendeten Aminosäuren, beginnend vom Carboxy Terminus, in Sequenz kovalent gebunden werden. Automatische Festphasen-Peptidsynthesizer, die für die Ausführung dieser Methodologie geeignet sind, sind kommerziell erhältlich und die Synthese wird gemäß den Instruktionen der Hersteller ausgeführt. Für den Fall, daß eine Amidgruppe am Carboxylterminus der Verbindungen der Formel I gewünscht wird, wird als Harz ein Benzylhydrylamin-Harz verwendet, das ein kommerzieller Artikel ist. Abspaltung der Peptidkette von solch einem Harz resultiert in der Bildung einer Amidgruppe, wie sie am Carboxylterminus gewünscht ist.
Nach Vervollständigung der automatischen Peptidsynthese werden die gewünschten Peptide vom Harz mittels im Stand der Technik bekannter Methoden, wie z. B. wasserfreiem flüssigem Wasserstofffluorid (HF), entfernt. Diese Behandlung spaltet ebenfalls jegliche Seitenkettenschutzgruppen ab. Die Peptide können dann in konventioneller Weise, wie z. B. durch die Verwendung von Hochauflösender-Flüssigkeitschromatographie, bevorzugt mit einer Umkehrphasensäule vom C&sub1;&sub8;-Typ, gereinigt werden.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung, hat die Suche nach dem env Protein des ethiologischen Agens für das Erworbene-Immunschwächesyndrom (AIDS) zur Isolierung und Sequenzierung und Expression des proviralen Gens des AIDS Virus geführt. Es ist nun entdeckt worden, daß die postulierten ethiologischen Agentien von AIDS, Lymphoadnopathie-assoziiertes Virus (LAV), AIDS-assoziiertes-Retrovirus (ARV) und humanes T-Zell Leukämie/Lymphoma/Lymphotropisches Virus, HTLV-III, tatsächlich Varianten des gleichen Virus sind. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung und Ansprüche wird im folgenden das AIDS verursachende Virus als AIDS Virus bezeichnet. Unter AIDS Virus wird auch der Einschluß der Varianten, die als verursachendes Agens von AIDS postuliert worden sind, nämlich LAV, ARV und HTLV-III, verstanden. Das env Protein des AIDS Virus (env AIDS) ist ein 97,200 Dalton Protein mit 32 potentiellen N-Glykosylierungsstellen. Die Nukleotidsequenzanalyse des AIDS env Gens des mutmaßlichen ethiologischen Agens von AIDS demonstriert, daß alle Viren Varianten des gleichen Virus sind. Eine um ungefähr 1-20% abweichende Variation der Sequenz des env Gens von HTLV-III von den Sequenzen der env Gene der anderen Viren LAV und ARV-II ist gefunden worden.
Das integrierte provirale Genom von HTLV-III wurde aus der genomischen DNA von mit HTLV-III infizierten H9 Zellen kloniert [siehe Shaw et al., Science 226, 1165-1171 (1984)]. Die vergleichenden Nukleotisequenzen von LAV, ARV-II und HTLV-III sind durch Ratner, Nature 313, 277-284 (1985); Sanchez-Pescador et al., Science 221, 484-492 (1985); und Wain-Hobson et al.Cell 40, 9-17 (1985) bestimmt worden.
Eine der konservierten Regionen in diesen verschiedenen viralen env Gensequenzen ist die den Aminosäuren 460-550 entsprechende Region, die die wichtige Epitopstelle um 500-511 enthält. Es wird daher angenommen, daß diese Region eine bevorzugte antigene Stelle zur Verwendung in der Detektion der Anwesenheit von AIDS Viren oder dagegen gerichteten Antikörpern darstellt, die in den Seren von humanen Subjekten enthalten sind. Von besonderer Bedeutung sind die zwischen Aminosäuren 500-511 lokalisierten Prozessierungsstellen, die proteolytischer Spaltung in der viralen Hülle ausgesetzt sind. Die resultierenden zwei Peptide haben Anteile von den in Aminosäuren 460-550 eingeschlossenen generell konservierten Region in ihren Carboxyl- bzw. Aminoenden, und erlauben daher, daß Antikörper, die spezifisch für dieses epitopische Gebiet durch die Peptide der Erfindung erzeugt worden sind, beide prozesierte Proteine erkennen. Weiterhin haben die mit solchen Sequenzen hergestellten Peptide eine größere Chance, Vaccine zu ergeben, die Populationen gegen alle drei viralen AIDS Formen immunisieren könnten.
In einer diagnostischen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können die Peptide der Formel I in einem Sandwichtyp Enzym-Immunoassay verwendet werden, um direkt die Gegenwart von Antikörpern für das AIDS Virus in Serumproben zu bestimmen. Solch ein Assay kann sehr einfach durch Belegen von Mikrotiterplatten mit einer verdünnten Lösung eines Peptids der Formel I, bevorzugt worin W gleich H und Z gleich -NH&sub2; oder Cys-NH&sub2; ist, ausgeführt werden. Die mit Peptid überzogenen Mikrotiterplatten können dann mit der Testprobe für eine ausreichend lange Zeit inkubiert werden, um jeglichen anwesenden Antikörpern die Komplexierung mit dem Peptid zu ermöglichen. Nachdem die Inkubationsperiode abgeschlossen ist, wird die Serumprobe entfernt, die Platten gewaschen und dann mit anti-human IgG behandelt, das an ein Enzym wie etwa Meerettichperoxidase gekoppelt ist. Solche Reagenzien sind kommerziell erhältlich. Falls ein Antikörper gegen das AIDS Virus in der Serumprobe vorhanden ist, wird es durch das Peptid gebunden und von dem das Enzymlabel tragenden anti-human IgG komplexiert. Nach Entfernung des Reagenzes, wird das Substrat für das Enzym hinzugegeben und die Inkubation in der Mikrotiterplatte erlaubt. Wenn Antikörper in der Probe anwesend sind, wird eine Farbreaktion in der Mikrotiterplatte beobachtet.
In einer alternativen diagnostischen Ausführungsform werden Verbindungen der Formel I, worin W Tyrosin ist, in konventioneller Weise, wie etwa z. B. durch die Verwendung von Chloramin-T mit ¹²&sup5;I als radioaktivem Liganden, radiojodiert. Spezifische Antikörper für das AIDS Virus können durch die Verwendung von Verbindungen der Formel I als Hapten erhalten werden, worin entweder W oder Z Cystein bei der Herstellung einer immunogenen Zusammensetzung ist. Solch eine immunogene Zusammensetzung wird durch die Bindung der vorgenannten Haptene mittels der angegebenen Cysteineinheit an ein konventionelles immunogenes Trägermaterial hergestellt. Wie hierin verwendet, bedeutet der Begriff "immunogenes Trägermaterial" den Einschluß solcher Materialien, die die Eigenschaft haben, unabhängig eine immunogene Antwort in einem Wirtstier hervorzurufen, und die kovalent an die oben beschriebenen Haptene, bevorzugt durch die besagte Cysteineinheit, gekoppelt werden können. Geeignete Trägermaterialien beinhalten z. B. Proteine; natürliche oder synthetische polymere Verbindungen wie etwa Polypeptide, z. B. Polylysine oder Copolyniere von Aminosäuren, Polysaccharide; und dergleichen. Besonders bevorzugte Trägermaterialien sind Proteine und Polypeptide, insbesondere Proteine.
Die Identität des Proteinmaterials, das in der Herstellung für ein in der vorliegenden Erfindung geeignetes Immunogen verwendet wird, ist nicht kritisch. Beispiele für geeignete Proteine, die für die Anwendung der Erfindung geeignet sind, beinhalten Säugerserumproteine wie z. B. Thyroglobulin, humanes gamma-Globulin, humanes Serumalbumin, Rinder-Serumalbumin, methyliertes Rinder-Serumalbumin, Hasen-Serumalbumin und Rinder gamma-Globulin. Ein besonders bevorzugtes Protein für diesen Zweck ist Keyhole Limpet Hemocyanin.
Die kovalente Kopplung des Peptidhaptens an das immunogene Trägermaterial kann mittels im Stand der Technik bekannter Methoden ausgeführt werden. Geeignete Reagenzien für diesen Zweck umfassen N-Succinimidester, Carbodiimide, EEDQ (N-Ethoxycarbonyl-2-ethoxy-1,2-dihydroquinolin) und dergleichen. Ein besonders bevorzugtes Reagenz zur Verwendung in der Kupplung des Peptidhaptens an das Keyhole Limpet Hemocyanin ist in der bevorzugten Ausführungsform m- Maleinimidobenzoyl-N-succinimidester.
Das vorgenannte Immunogen kann zum Induzieren einer Bildung von AIDS-Virus-spezifischen Antikörpern in Wirtszellen durch Injizierung des Immunogens in solch einen Wirt, bevorzugt unter Verwendung eines im Stand der Technik bekannten Adjuvants, wie z. B. des vollständigen oder unvollständigen Freund's Adjuvants, benutzt werden. Erhöhte Titer können durch wiederholte Injektionen über eine Zeitperiode erhalten werden. Geeignete Wirtstiere für diese Zwecke umfassen Säuger wie etwa Hasen, Pferde, Ziegen, Meerschweinchen, Ratten, Kühe, Schafe etc. Das resultierende Antiserum wird Antikörper enthalten, die selektiv mit dem AIDS Virus, z. B. mit HTLV-III Präparationen, die das env (460-550) Epitop enthalten, komplexieren. Das Antiserum kann in bekannter Weise affinitätsgereinigt werden indem dieses Antiserum über eine Affinitätssäule gegeben wird, die aus einem Peptid der Formel I, worin W bevorzugterweise Cys ist, hergestellt ist, das an eine feste Trägermatrix wie etwa Sepharose gekoppelt ist.
In einem weiteren Aspekt dieser Erfindung ist es möglich monoklonale Antikörper spezifisch für das vorgenannte 460-550 Epitop des env Gens von HTLV-III zu produzieren. Die Herstellung von monoklonalen Antikörpern kann gemäß des von Köhler und Milstein [Nature 256) 495-597 (1975)] allgemein beschriebenen Verfahrens ausgeführt werden. Die durch diese Methode resultierenden Hybridzellen haben die Eigenschaft, einen Antikörper von vordefinierter Spezifität zu sekretieren. Die Spezifität der produzierten Antikörper ist die von den in der Fusion involvierten Lymphozyten. Die Hybridzellen können kloniert und stabil in Kultur gehalten werden, um in dem Kulturüberstand Antikörper für eine spezifische Determinante oder Epitop zu produzieren.
Die generelle Methode zur Produktion von Hybrid-Zellinien des oben beschriebenen Typs umfaßt die Schritte der Immunisierung eines Tieres (gewöhnlich einer Ratte oder Maus, aber nicht nötigerweise eine von diesen) mit dem beschriebenen Immunogen, d. h. eines Peptides der Formel I worin W oder Z Cystein ist, das kovalent an ein immunogenes Trägermaterial gebunden ist. Nachdem dem Immunsystem Zeit gegeben worden ist, Lymphozyten zu erzeugen, die den Antikörper gegen das Immunogen sekretieren, wird das Tier getötet und eine Suspension der Milz hergestellt. Fusion zwischen diesen Zellen und Myelomazellen wird durch in Kontaktbringen in Gegenwart eines Fusionspromotors (z. B. Polyethylenglykol) erreicht. Ein kleiner Prozentsatz der Zellen fusioniert und produziert Hybrid-Myelomazellen. Die Immunisierung resultiert in einer Vielzahl von verschiedenen Lymphozyten, die jeder für sich Antikörper gegen eine unterschiedliche antigene Determinante sekretieren, und diese Charakteristik wird auch genetisch auf die Hybridzelle übertragen. Es ist bei vorsichtigem Screenen möglich, aus einer Kultur von Hybridzellen eine Zelle zu isolieren, die die gewünschte Spezifität für das 460-550 Epitop der env Region des HTLV-III Virus hat. Solche Zellen können durch im Stand der Technik bekannte Methoden kloniert und kultiviert werden, so daß sie eine kontinuierliche Quelle des gewünschten monoklonalen Antikörpers darstellen.
Jede im Stand der Technik bekannte konventionelle Inimunoassay-Methode kann unter Anwendung der Antikörper der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Eine geeignete Radio-Immunoassay Methode unter Verwendung der oben beschriebenen Reagenzien kann z. B. ausgeführt werden indem man eine Probe, die das HTLV-III Virus enthält, mit einer bekannten Menge des markierten Thyrosinanalogs von Formel I und dem HTLV- III (460-550) env Protein spezifischen monoklonalen oder polyklonalen Antikörper mischt, den Bindungsgrad des markierten Analogs mißt und die Menge von MDS Viren, die in der Probe anwesend ist, durch Vergleich dieses Bindungsgrades mit einer Standardkurve bestimmt, die durch Mischen bekannter Mengen von AIDS Viren mit festen Mengen von markiertem Analog und besagtem Antikörper und Bestimmen des Bindungsgrades für jede bekannte Menge von Virus oder viralem Protein erhalten wurde.
Eine andere diagnostische Ausführungsform der Erfindung ermöglicht einen Radio-Immunoassay zur Detektion der Gegenwart von AIDS Antikörpern in Seren. In solch einem Assay werden Serumproben seriell in Puffer verdünnt und mit einem radiojodierten Analog eines Peptides der Formel I gemischt, worin W Tyr ist. Nach Inkubation wird antihuman IgG hinzugegeben und die Mischung erneut inkubiert. Nach Zentrifugation wird die an den präzipitierten Antikörperkomplex gebundene Radioaktivität gemessen. Die Gegenwart von AIDS Antikörpern wird durch die Zählwerte bestimmt, die als Überschuß über den Hintergrundwerten von normalen Patientenseren beobachtet werden.
In einem weiteren diagnostischen Aspekt der Erfindung kann ein immunometrisches Assayverfahren unter Verwendung der wie oben produzierten Antikörper der vorliegenden Erfindung durchgeführt werden. In einer repräsentativen Ausführungsform einer solchen Assaymethode werden duplizierte Proben gefahren. Das Verfahren benutzt 100 ul einer Suspension von an Agarosepartikeln immobilisierten Antikörpern gemischt mit 100 ul Serum und 100 ul löslichem ¹²&sup5;I-markiertem Antikörper. Diese Mischung wird für eine Zeitperiode inkubiert, die von einer viertel Stunde bis 24 Stunden reicht. Nachfolgend zu dieser Inkubation werden die Agarosepartikel durch Zugabe von Puffer gewaschen und dann zentrifugiert. Nach Entfernung der Waschflüssigkeit durch Absaugen wird das resultierende Pellet der Agarosepartikel dann auf gebundene ¹²&sup5;-I-markierte Antikörper gezählt. Die so für jeden der Komplexe erhaltenen Zahlen können dann mit Kontrollen verglichen werden.
Die oben beschriebenen Verfahren zur Bestimmung von AIDS Viren oder von Antikörpern gegen AIDS Viren können in geeigneten Test-Kits ausgeführt werden, die in einem Behälter ein Peptid der vorliegenden Erfindung oder gegen eine immunogene Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung erzeugte Antikörper umfassen.
In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung können Peptide der Formel I, insbesondere solche die als W oder Z Cystein haben, in Vakzine eingefügt werden, die in der Lage sind eine schützende Immunität gegen das AIDS Virus zu induzieren. Bekannte Techniken können zur Verstärkung der Antigenität von solchen Peptid-Vakzinpräparationen eingesetzt werden, wie z. B. durch Kopplung solcher Peptide durch die Cysteineinheit an ein Toxin wie etwa das Diphteriatoxin oder das Tetanustoxin. Es ist ebenfalls möglich solche Peptide an anorganische Trägermaterialien zu koppeln, die die Immunogenität verstärken indem solche Peptide dem Wirtssubjekt in einer Weise präsentiert werden, die dem normalen Antigen auf der viralen Oberfläche entspricht. Solche anorganischen Trägermaterialien beinhalten Muminiumhydroxid. Es ist innerhalb des Wissens der Technik, solche Vakzinzusammensetzungen in Kombination mit Adjuvantien oder anderen Verstärkern der Immunantwort, wie etwa Immuninterferon, Interleukin-2, Thymosin-alpha 1 und dergleichen, zu verwenden. Zusätzlich kann die Vakzinzusammensetzung auch andere Antigene wie z. B. Hepatitis Kern- oder Oberflächenantigen beinhalten, um eine Immunität für andere Krankheiten zusätzlich zu AIDS zu ergeben. Es ist ebenfalls innerhalb des Wissens der Technik Vakzinzusammensetzungen herzustellen, die die Peptide der vorliegenden Erfindung in Liposomen einfügen, als ein Mittel, um die Peptide in einer gewünschten Orientierung zum Induzieren der Immunität in einem Wirt zu erhalten.
Wegen der Darreichung, der Antigendosierung, der Anzahl und Häufigkeit von Injektionen sind alle Gegenstand der Optimierung innerhalb des Umfangs der gewöhnlichen Fachkenntnisse, insbesondere im Hinblick auf die Tatsache, daß es Erfahrungen in der Technik gibt, durch Injektion von anderen ähnlichen Antigenen, Immunität gegen andere virale Infektionen zu erhalten. Es wird erwartet, daß eine zur Verfügung gestellte Immunität gegen AIDS Infektionen für solche Individuen von besonderer Bedeutung ist, die noch nicht vorher AIDS ausgesetzt waren, wie z. B. Individuen die in einer Hochrisikopopulation sind, wie etwa Homosexuelle, Drogenabhängige, Haitianer und Zentralamerikaner und Individuen, die Bluttransfusionen erhalten könnten. Es wird ebenfalls erwartet, daß durch Immunisierung der Mütter während der Schwangerschaft eine einstweilige Immunität für Säuglinge erhalten wird.
Weil Anti-HTLV-III Antikörper in mehr als 90% der AIDS-Patieten gefunden wurden, war es interessant zu sehen, ob die synthetisch hergestellten Peptide der vorliegenden Erfindung auch immunreaktiv mit diesen Antikörpern sind. Für diese Analyse wurden gereinigte Peptide der Formel I, worin W H und Z Cys-NH&sub2; ist auf Nitrozellulosefilter durch Verwendung der Westernblot Technik transferiert. Streifen der Filter, die die transferierten Peptide enthielten, wurden mit 1000fach verdünnten humanen Seren reagiert und die gebildeten Antigen-Antikörperkomplexe wurden durch Inkubation der Streifen mit ¹²&sup5;I-markierten Staphylococus aureus Protein A gefolgt von Autoradiographie detektiert. Banden entsprechend dem Peptid wurden gleichmäßig beobachtet, wenn das verwendete Serum aus Patienten mit AIDS-Syndrom war. Die verwendeten negativen Kontrollen waren normale humane Seren und Seren von einem Patienten mit HTLV-I Infektion. Keine Reaktion wurde mit Seren von gesunden Individuen oder von HTLV-I infizierten Individuen beobachtet. Patientenseren wurden aus allen Teilen der Vereinigten Staaten einschließlich Kalifornien erhalten und alle bisher getesteten AIDS-Patientenseren wurden als positiv gefunden. Diese Resultate zeigen, daß die den Positionen 460-450 entsprechende Epitopregion des Hüllproteins durch in AIDS- Patienten gefundene Antikörper erkannt wird.
In weiteren Experimenten wurde gefunden, daß polyklonale Antikörper, die in Hasen durch die gleichen an Keyhole Limpet Hemocyanin gekoppelten Peptide erzeugt wurden, mit rekombinantem HTLV-III env Protein immunoblotten.
Die obigen Resultate zeigen, daß Peptide der Formel I, wie oben beschrieben, für die Verwendung in den beschriebenen diagnostischen Assays und Vakzinzusammensetzungen geeignet sind.
Die vorliegende Erfindung ist durch die folgenden Beispiele weiter illustriert. In diesen Beispielen bedeutet die Abkürzung Tos Tosylat, 2-Clz bedeutet 2-Chlorocarbobenzoxy, OBzl bedeutet O-Benzyl und Dmb bedeutet Dimethylbenzyl, Boc bedeutet Benzoxycarbonyl, Dcb bedeutet 2,6- Dichlorobenzyl.

Beispiel 1

Herstellung von Boc-Cvs(Dmb)-Benzhydrylamin-Harz (1)

Benzhyldrylamin-Harz (BHA) (20 g, 0,25 mmol/g) wurde mit Boc- Cys(Dmb)-OH (13,24 g, 40,7 mmol) in CH&sub2;Cl&sub2; (250 ml) mit Dicyclohexyl- Carbodiimid (DCC) (8 g) für 4 Stunden gekoppelt. Das resultierende Boc- Cys(Dmb)-BHA-Harz wurde mit CH&sub2;Cl&sub2; (3 · 300 ml), N,N- Dimethylformamid (DMF) (2 · 300 ml), MeOH (3 · 300 ml), CH&sub2;Cl&sub2; (3 · 300 ml) gewaschen und getrocknet. Ein Anteil wurde hydrolysiert (1 ml 6M propionische HCl bei 130ºC für 2 Stunden). Aminosäureanalytik zeigte eine Substitution von 0,52 mmol Cys per Gramm Harz. Die verbleibenden Aminogruppen wurden mit AC&sub2;O-Pyridin azetyliert. Ausbeute: 28,75 g.

Beispiel 2

Herstellung von HTLV-III env (500-511)-Cys-NH&sub2; (2)

Boc-Cys(Dmb)-BHA-Harz (2,0 g, 1,0 mmol) von Beispiel 1 wurde in ein Reaktionsgefäß des Vega 250 Peptidsynthesizers gegeben und die Festphasensynthese wurde nach dem symetrischen Anhydridverfahren (Merrifield, R.B., supra) für insgesamt 12 Zyklen mit den folgenden N-Boc Aminosäuren durchgeführt:
Arg(Tos), Lys(2-CIZ), Glu(OBzl), Arg(Tos), Gln, Val, Val
Arg(Tos), Arg(Tos), Lys(2-ClZ), Ala and Lys(2-ClZ)
und ergab 3,9 g geschütztes Peptidharz. Das geschützte Peptidharz (1,5 g) wurde mit wasserfreier flüssiger HF, die 10% Dithioethan enthält, für 1 Stunde bei 0ºC behandelt. Die HF wurde bei 0ºC verdampft (Hoch-Vac, CaO-Falle) und das rohe Peptid- und Harzgemisch wurde mit EtOAC pulverisiert, mit TFA extrahiert, abgezogen und der Rückstand mit Äther pulverisiert und getrocknet. Ausbeute: 700 mg. Ein Teil des Rehmaterials (350 mg) wurde in 10 ml Wasser, welches 0,5% Trifluoressigsäure (TFA) enthält, verdünnt, filtriert (0,45 u Typ HA Milliporfilter) und auf eine Nucleosil C 18 (5 u) Säule (1 · 50 cm) geladen.
Die Säule wurde mit einem Lösungsmittelsystem eluiert (2 ml/min.), bestehend aus (A) H&sub2;O (enthaltend 0,1% TFA) und (B) CH&sub3;CN (enthaltend 0,1% TFA), mit einem linearen Gradienten von 5-25% (B) in 180 Minuten mit einer Flußrate von 2 ml/min. Fraktionen wurden gesammelt (2 Minuten- Fraktion) und Anteile durch das analytische HPLC System analysiert. Das Produkt, welches in Fraktionen 54-55 erschien, wurde vereinigt, verdampft und lyophilisiert und gab reines HTLV-III env (500-511)-Cys-NH&sub2;. Ausbeute: 8,5 mg. Durch analytische HPLC wurde gezeigt, daß das Produkt homogen war und es ergab die erwartete Aminosäurezusammensetzung (Hydrolyse in 6N HCl, 1% Thioglykolsäure (TGA): 110ºC; 72 Stunden): Glu, 2,04; Ma, 1,00; Val, 1,10*; Lys, 2,94; Arg, 3,98. Sequenzanalyse bestätigte die Aminosäuresequenz von HTLV-III env (500-511 )-Cys-NH&sub2;.
* Niedriger Wert bedingt durch schwierige Val-Val-Spaltung.

Beispiel 3

Konjugation von HTLV-III env (500-511)-Cvs-NH&sub2; mit Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH) (3)

Keyhole Limpet Hemocyanin (Calbiochem, 4 mg in 50% Glyzerin) wurde zu einer Lösung von m-Maleimidobenzoyl-N-Succinimid-Ester (0,7 mg) in DMF (0,1 ml) bei 25ºC gegeben und für 30 Minuten gerührt (magnetisch). Die Reaktionsmischung wurde auf eine Sepadex G-25 Säule (1,2 · 25 cm) gegeben, die vorher mit 0,05M NaH&sub2;PO&sub4; (pH 6,0) equilibriert worden war. Fraktionen (1 ml/min.) wurden gesammelt und der erste große Peak (280 nm Detektion) wurde gesammelt [MB-KLH Komplex].
Das HTLV-III env (500-511)-Cys-NH&sub2; Peptid (5,0 mg, 3,0 mmol) in 1 ml 0,05M NaH&sub2;PO&sub4; (pH 6,0) wurde zu einer Lösung gegeben, die den MB-KLH Komplex enthielt. Der pH wurde durch Addition von 1,0 N NaOH (ul Mengen) auf 7-7,5 eingestellt und das Rühren bei 25ºC für 3 Stunden weitergeführt. Die Reaktionsmischung wurde mit wiederholten Wechseln gegen Dulbecco's Phosphat gepufferte Salzlösung bei 4ºC über eine 60 Stunden Periode dialysiert (MW Ausschluß 3500). Die dialysierte Lösung (8,9 ml) wurde direkt für die Antikörperherstellung verwendet.

Beispiel 4

Herstellung von Boc-Arg(Tos)-Benzhydrylamin-Harz (4)

Benzhydrylamin-Harz (40,44 g, 0,5 mmol/g, 20,22 mmol) wurde mit Boc Arg (Tos)-OH (34,6 g, 80,7 mmol) in 25% DMF-CH&sub2;Cl&sub2; (250 ml) mit Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) (16,78 g, 81,4 mmol) für 2 Stunden gekoppelt, gefolgt von einer Zugabe von 1% Düsopropylethylamin, und für 0,5 Stunden weiterreagiert. Das resultierende Boc-Arg (Tos)-BHA-Harz wurde mit CH&sub2;Cl&sub2; (3 · 250 ml), MeOH (3 · 250 ml), CH&sub2;Cl&sub2; (3 · 250 ml) gewaschen und getrocknet. Die Kopplungs- und Waschprozeduren wurden wiederholt und ein Anteil wurde hydrolysiert (1 ml 6M Propionsäure/HCL bei 130ºC für 2 Stunden). Aminosäureanalyse zeigte eine Substitution von 0,35 mmol Arg pro Gramm Harz. Die verbleibenden Aminogruppen wurden mit AC&sub2;O- Pyridin azetyliert. Ausbeute: 48,88 g (Boc-Arg(Tos)-BHA-Harz, 4).

Beispiel 5

Herstellung von HTLV-III env Cys-(500-511)-BHA-Harz (5)

Boc-Arg(Tos)-BHA-Harz (4, 2,0 g, 0,7 mmol) wurde in ein Reaktionsgefäß eines Vega 250 Peptidsytnesizers gegeben und 12 Zyklen der Festphasensynthese wurden wie in Beispiel 2 beschrieben durchgeführt. Am Ende der Synthese wurde die BOC-Gruppe an der N-terminalen Aminosäure entfernt (TFA) und getrocknet und ergab 2,8 g geschütztes HTLV-III env Cys-(500-511)-BHA-Harz, 5.

Beispiel 6

Herstellung von HTLV-III env Cvs-(500-511)-NH9 (6)

Eine 1,5 g Portion von geschützten Peptidharz 5 wurde mit wasserfreier flüssiger HF wie in Beispiel 2 behandelt. Ausbeute: 741 mg. Eine Portion dieses Materials (350 mg) wurde auf zwei Nukleosil C-18 (5 u) Säulen (1 · 50 cm) geladen, und die Säulen wurden mit einem Lösungsmittelsystem bestehend aus (A) H&sub2;O (enthaltend 0,1% TFA) und (B) CH&sub3;CN (enthaltend 0,1% TFA) in einem linearen Gradienten von 5-25% (B) in 180 min eluiert (2 ml/min.). Fraktionen wurden gesammelt (2 min/Fraktion) und die Anteile durch das analytische HPLC System analysiert. Das Produkt erschien in Fraktion 48, welche verdunstet und lyophylisiert wurde. Ausbeute: 46,1 mg (13%). Durch analytische HPLC wurde gezeigt, daß das Produkt homogen ist und es ergab die erwartete Aminosäurezusammensetzung (Hydrolyse in 6NHCl-1% TGA; 110ºC; 72h): Glu, 2,00; Ala, 1,04; Val, 1,36*; Lys, 2,97; Arg 3,98.
* Niedriger Wert durch die erwartete unvollständige Val-Val-Spaltung.

Beispiel 7

Herstellung von HTLV-III env Tyr (500-511-NH&sub2; (7)

Boc-Arg(Tos)-BHA-Harz (2,0 g, 0,7 mmol) wurde 12 Zyklen der Peptidsynthese gemäß Beispiel 2 unterzogen und ergab 2,5 g geschütztes HTLV-III env Tyr (500-511)-BHA-Harz. Eine Portion von diesem Material (1,5 g) wurde mit HF gespalten (so wie in Beispiel 2) und ergab 781 mg rohes Peptid, welches durch HPLC wie in Beispiel 6 gereinigt wurde. Das in Fraktionen 66-68 erscheinende Produkt wurde gesammelt, verdunstet und lyophylisiert. Ausbeute: 42-5 mg (12%). Durch analytische HPLC wurde gezeigt, daß das Produkt homogen ist und es ergab die erwartete Aminosäureszusammensetzung (Hydrolyse in 6NHCl-1% TGA; 110ºC; 24 Stunden): Glu, 2,10; Ma, 1,04; Val, *0,90; Tyr, 0,86; Lys, 2,89; Arg, 4,10.
* Geringer Wert bedingt durch die erwartete unvollständige Val-Val- Spaltung.

Beispiel 8

Herstellung von HTLV-III env (487-511)Cvs-BHA-Harz (8)

Eine 2,2 g Portion geschütztes HTLV-III env (500-511)-Cys-BHA-Harz aus Beispiel 2 wurde 13 Zyklen der Festphasensynthese unterzogen, mit TFA behandelt und ergab 1,8 g Seitenkettengeschütztes HTLV-III env (487- 511)-BHA-Harz, 8.

Beispiel 9

Herstellung von HTLV-III env (487-511)-Cys-NH9 (9)

Eine 1,0 g Portion von 8 wurde, wie in Beispiel 2, mit wasserfreier flüssiger HF behandelt. Ausbeute: 435 mg. Das Rohprodukt wurde (in Serie) auf zwei Synchropals Säulen (RP-8, 1 · 25 cm) geladen. Die Säulen wurden mit einem Lösungsmittelsystem bestehend aus (A) H&sub2;O (enthaltend 0,025% TFA und (B) CH&sub3;CN (enthaltend 0,025% TFA) mit einem linearen Gradienten von 5-25% (B) in 120 Minuten eluiert (2 ml/min.). Fraktionen wurden gesammelt (2 Min/Fraktion) und Anteile durch das analytische HPLC-System analysiert. Das Produkt erschien in Fraktionen 77-82, die vereinigt, verdunstet und lyophylisiert wurden. Ausbeute: 31,1 mg (12%). Durch analytische HPLC wurde gezeigt, daß das Produkt homogen ist und die Sequenzanalyse bestätigte die Aminosäuresequenz von HTLV env (487- 511)-Cys-NH&sub2;.

Beispiel 10

Konjugation von HTLV-III env (487-511)-Cys NH&sub2; mit Keyhole Limpet Hemocyanin (10)

Konjugation von 5 mg 9 an Keyhole Limpet Hemocyanin-MB Komplex (4 mg) wurde exakt wie in Beispiel 3 ausgeführt. Die letzte dialysierte Lösung (8 ml) wurde direkt für die Antikörpererzeugung und für die Detektion von HTLV-III env Protein-Antikörpern verwendet.

Beispiel 11

Synthese von HTLV-III env Tyr-(487-511)-Cys-NH&sub9; (11)

Eine 0,5 g Portion von seitenkettengeschützten HTLV-III env (487-511)- Cys-BHA-Harz, 8, wurde einem Zyklus der Festphasensynthese unter Verwendung von Boc-Tyr(Dcb) unterzogen, mit HF wie in Beispiel 2 behandelt und durch HPLC gereinigt (wie in Beispiel 9). Ausbeute: 15 mg. Das Produkt, 11, war mit analytischer HPLC homogen.

Beispiel 12

ELISA (Enzyme-Linked Immonosorbance Assay)

Humanseren und Hasenseren wurden auf Anti-Peptid Antikörper durch einen ELISA-Essay abgesucht. Peptide aus den Beispielen 2, 6 und 9 wurden in Bikarbonat-Karbonat-Salzlösung (0,05 M Bikarbonat-Karbonat, pH 9,6; 0,15 NaCl) in einer Konzentration von 1 ug/ml gelöst. 100 Microliter dieser Lösung wurden in Microtitervertiefungen pipetiert und die Platten über Nacht bei 37ºC getrocknet. Jede Vertiefung wurde dann 3 Mal mit PBS/Tween-Puffer gewaschen (0.02 M Natriumphosphatpuffer, pH 6,5; 0,15 M NaCl; 0,05% Tween-20). Die leeren Microtitervertiefungen wurden dann mit Blockierungspuffer gefüllt (10% Kälberserum; 1% BSA; 0,3% Gelatine; 0,5 M NaCl; 20 mM Natriumphosphat, pH 7,5; 0,02% Natriumazid) um unreagierte Stellen zu blockieren. Nach Inkubation fuhr 1 Stunde bei 37ºC wurden die Platten mit PBS/Tween Puffer gewaschen und 100 Microliter verschiedener Verdünnungen (100 bis 10 000) der Testseren wurden in die Vertiefungen gegeben. Nach erfolgter Inkubation bei Raumtemperatur für 2 Stunden wurden die Platten mit PBS/Tween Puffer gewaschen. Farbreaktionen wurden durch Inkubieren jeder Vertiefung mit 100 ul von einem 1 zu 2000 verdünnten Ziegen-anti-human Antikörperkonjugat mit Meerrettich Peroxidase durchgeführt. Inkubationen wurden für 1 Stunde durchgeführt, die Platten mit PBS/Tween-Puffer gewaschen und 100 ul einer Substratlösung zugegeben. Die Substratlösung wurde durch Auflösung von o-Phenylendiamin-Dihydrochlorid in 0,1 M Zitratpuffer (pH 4,5) in einer Konzentration von 400 ug/ml hergestellt und 4 ul Wasserstoffperoxyd wurden zu 10 ml dieser Lösung dazugegeben. Die Farbentwicklung erfolgte während ungefähr 30 Minuten bei 37ºC. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von 50 ul von 2,5 M H&sub2;SO&sub4; und 50 mM Na&sub2;S&sub2;O&sub5; pro Vertiefung gestoppt und die Absorption bei 488 nm auf einem Mikroplattenleser gemessen.

Beispiel 13

Radioimmuno-Assay

Für den Radioimmuno-Assay wurden die Peptide mit Tyrosin am Aminoterminus aus Beispielen 7 und 11 mit ¹²&sup5;J unter Verwendung von Chloramin T als Katalysator markiert (Greenwood et al., Biochemichal Journal, Vol. 89, pp. 114-123, 1963). Für dieses Verfahren wurden ungefähr 100 ng des Peptides in 50 ul 0,01 M Tris-HCl Puffer, pH 7,5, enthaltend 10 mM NaCl, aufgelöst. 1 mC von radioaktiven Jod (¹²&sup5;J) wurde zu der Lösung zugegeben, gefolgt von 10 ul Chloramin T-Lösung (2,5 mg/ml). Die Reaktion wurde für 1 Minute ausgeführt und die Reaktion durch die Zugabe von 25 ul von Natrium-Meta-Bisulfit (2,5 mg/ml) Lösung gestoppt. Das freie ¹²&sup5;J wurde dann durch Säulenchromatographie an einer Biogel P-10 Säule entfernt.
Für den Radioimmuno-Assay wurden die Aidspatientenseren seriell in Puffer I verdünnt (10 mM Tris-HCl Puffer, pH 7,8 enthaltend 2% BSA, 0,6 mg/ml NaCl, 1% EDTA und 0,5% Triton X100). 100 ul von jeder Verdünnung wurden in ein Teströhrchen pipetiert und mit 10 000 cpm von ¹²&sup5;J-markierten Peptid gemischt. Die Mischung wurde für 3 Stunden bei 37ºC inkubiert. 50 ul Ziegen-Antihunian Antikörper wurden dann zu der Reaktionsmischung gegeben, gefolgt von 1 ml Spülpuffer (0,01 M Tris-HCl Puffer pH 7,8, 0,1% Triton X100, 0,1 M NaCl und 1 mM EDTA). Die Mischung wurde dann für 1 Stunde bei 37ºC und für 2 Stunden bei 4ºC inkubiert. Die Röhrchen wurden dann bei 2500 rpm zentriftigiert und der Überstand verworfen. Die an die humanen Antikörper gebundene Radioaktivität wurde in einem Ganima-Zähler gemessen. Überschüssige Zähler über dem Niveau von normalen Seren zeigten die Gegenwart von AIDS-Antikörpern in den Testseren.

Beispiel 14

Herstellung von Hasen-Antiseren spezifisch für die HTLV-III Pepide

Für die Herstellung von Hasenantikörpern wurden die an KLH 10 konjugierten Peptide mit vollständigem Freund's Adjuvant oder unvollständigem Freund's Adjuvant im 1 : 1 Verhältnis gemischt. Am Tag 1 wurden 200 ug des konjugierten Peptides in vollständigem Freund's Adjuvant in die Hasen intradermal auf dem Rücken an verschiedenen Stellen injiziert. Am Tag 28 wurden 200 ug des Peptid-KLH Konjugates in unvollständigem Freund's Adjuvant intradermal in den Rücken an verschiedenen Stellen injiziert. Am Tag 42 wurde eine 40 ml Blutprobe entnommen und der Antikörpertiter durch ELISA Assay bestimmt. Den Hasen wurden erneut am Tag 56 mit Peptid-KLH Konjugat in unvollständigem Freund's Adjuvant nachgeholfen, gefolgt von Entblutung am Tag 70.

Beispiel 15

Affinitätsreinigung von Anti-Peptid Antiserum gegen Peptid env 500-511

1. 14 ml Hasenserum wurden auf einer Säule aus Protein A-Sepharose (0,7 cm · 20 cm) chromatographiert und nachfolgend mit 0,1 M Zitrat, pH 3,5, eluiert. Das Säureeluat wurde neutralisiert und gegen PBS dialysiert. Die Ausbeute an IgG, bestimmt durch Absorption bei 280 nm, war 88 mg. Dies ist ein typischer Wert. Die Reinheit der IgG Preparation wurde durch Immunoelektrophorese bestimmt. Im wesentlichen wurde alles IgG aus dem Serum durch die Protein A- Säule entfernt. Dieses IgG wurde in reiner Form in den Säureeluaten erhalten.
2. Eine Affinitätssäule wurde unter Verwendung von HTLV-III env Cys- (500-511)-NH&sub2; konstruieft. 8 mg des Peptids wurden mit 0,4 ml von Epoxy-Sepharose reagiert und nachfolgend mit Ethanolamin blockiert. Die Kopplungsausbeute war 4,2 mg Peptid 0,4 ml Sepharose gemäß Bestimmurig durch Aminosäureanalyse. Dies ist ungefähr 35% des theoretischen Maximums für dieses Harz.
3. 70 mg des IgG (80% der Probe) wurden an einer Peptid-Sepharosesäule chromatographiert und nachfolgend mit 0,2 M Glyzin, pH 2,5, eluiert und das Säureeluat neutralisiert. Das Serum wurde ein zweites Mal über die Säule gegeben und die vereinigten Säuleneluate wurden gegen PBS dialysiert. Die Totalausbeute an affinitätsgereinigten IgG war 1,8 mg (2,5%). Dies ist eine vernünftig gute Ausbeute an spezifischem Anti-Peptid Antikörper.
4. Das Ausmaß, mit dem das Affinitätsreinigungsverfahren die Anti- Peptid Aktivität anreichert, wurde durch ELISA bestimmt. Die angewendeten Kriterien waren die Erhaltung der Anti-Peptid Reaktivität zusammen mit der Erschöpfung der Anti-KLH Reaktivität. Die Resultate zeigten, daß sich die Reaktivität des affinitätsgereinigten IgG gegenüber dem synthetischen Peptid vergleichsweise vorteilhaft gegenüber dem gesamten IgG und Serum verhielt. Die Resultate zeigten auch, daß die Reaktivität des affinitätsgereinigten IgG gegenüber KLH auf nicht detektierbare Niveaus gefallen war. Die ganze Anti-KLH Aktivität wird in dem Durchbruch der Peptid-Säule gefunden.
5. Um zu testen, ob das affinitätsgereinigte Hasenserum mit dem HTLV- III Hüllgenprodukt reagiert, wurde Western Blot Analyse durchgeführt. Für diese Analyse wurden rekombinantes HTLV-III Hüllprotein enthaltende bakterielle Zellysate der Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterzogen und die Proteine auf einen Nitrozellulosefilter mittels Western Blot Technik transferiert. Streifen der Filter wurden mit 1000fach verdünntem Hasenserum (affinitätsgereinigt) reagiert und der gebildete Antigen-Antikörper Komplex wurde durch Inkubation der Streifen mit ¹²&sup5;J-markierten Staphylococcus aureus Protein A gefolgt von Autoradiographie detektiert. Die beobachteten Banden entsprachen dem Hüllprotein. Die verwendeten negativen Kontrollen waren normale Bakterienlysate die keine HTLV-III Expressionsplasmide enthielten. Keine Banden wurden im letzteren Fall beobachtet.

Claims

1. Ein Peptid mit der Formel

W-X-Lys-Ala-Lys-Arg-Arg-Val-Val-Gln-Arg-Glu-Lys-Arg-Y-Z (I)

worin W H-, Cys-, oder Tyr- ist; X eine Bindung oder eine Subsequenz aus einer oder mehreren Aminosäuren ist, die am Carboxyl-Terminus von HTLV-III env (460-499) beginnt; Y eine Bindung oder eine Subsequenz aus einer oder mehreren Aminosäuren ist, die am Amino-Terminus von HTLV- III env (512-550) beginnt; und Z -OH, -NH&sub2; oder -Cys-NH&sub2; ist, unter der Voraussetzung, daß eines von X oder Y eine Bindung ist und X verschieden von Pro-Thr ist.

2. Das Peptid gemäß Anspruch 1, worin sowohl X und Y Bindungen sind.

3. Das Peptid gemäß Anspruch 2, worin W H- und Z -Cys-NH&sub2; ist.

4. Das Peptid gemäß Anspruch 2, worin W Cys und Z -NH&sub2; ist.

5. Das Peptid gemäß Anspruch 2, worin W Tyr- ist.

6. Eine Verbindung gemäß Anspruch 5 markiert mit ¹²&sup5;I.

7. Das Peptid gemäß Anspruch 1, worin X eine Subsequenz aus einer oder mehreren Aminosäuren ist, die am Carboxyl-Terniinus von HTLV-III env (460-499) beginnt, und Y eine Bindung ist.

8. Das Peptid gemäß Anspruch 7, worin X HTLV-III env (487-499) ist.

9. Das Peptid gemäß Anspruch 8, welches HTLV-III env (487-511) -Cys-NH&sub2; ist.

10. Das Peptid gemäß Anspruch 8, welches HTLV-III env Tyr-(487- 511)-Cys-NH&sub2; ist.

11. Eine immunogene Zusammensetzung enthaltend ein Peptid gemäß Anspruch 1, worin eines von W oder Z Cys ist, das kovalent an ein immunogenes Trägermaterial gebunden ist.

12. Die Zusammensetzung gemäß Anspruch 11, worin W H- und Z -Cys-NH&sub2; ist.

13. Die Zusammensetzung gemäß Anspruch 11, worin das besagte immunogene Trägermaterial Keyhole-Limpet-Hämocyanin ist.

14. Ein Peptid gemäß Anspruch 1 als Bestandteil eines Vakzins.

15. Ein Peptid gemäß Anspruch 1 als Bestandteil einer immunogenen s Zusammensetzung.

16. Ein Verfahren für die Herstellung eines Peptides gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß konventionelle Peptidsynthesemethoden verwendet werden.

17. Ein Verfahren gemäß Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß Festphasen-Synthesemethoden verwendet werden.

18. Ein Verfahren für die Herstellung einer immunogenen Zusammensetzung gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß ein Peptid gemäß Anspruch 1, worin eines von W oder Z Cys ist, kovalent an ein immunogenes Trägermaterial gebunden ist.

19. Ein Verfahren gemäß Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß ein Peptid gemäß Anspruch 1, worin W H- und Z -Cys-NH&sub2; ist, verwendet wird.

20. Ein Verfahren gemäß Anspruch 18 oder 19, dadurch gekennzeichnet, daß als immunogenes Trägermaterial Schlüsselloch-Napfschnecken- Hemocyanin verwendet wird.

21. Ein Verfahren zum Testen von humanem Blut auf die Anwesenheit von Antikörpern für das virale ethiologische Agens von AIDS, umfassend Kontaktieren eines Peptides gemäß Anspruch 1, das an eine Festphase gebunden ist, mit einer Testprobe von humanem Blut, wobei jegliche Antikörper für das virale ethiologische Agens von AIDS, die in der besagten Testprobe vorhanden sind, an das besagte Peptid binden, Entfernen der besagten Testprobe, Waschen des besagten festen Trägers, um ungebundene Antikörper zu entfernen, und Untersuchen des besagten festen Trägers mit einem Reagenz, das in der Lage ist, selektiv humane Antikörper zu detektieren.

22. Das Verfahren gemäß Anspruch 21, worin der besagte feste Träger eine Plastik-Mikrotiterplatte ist und das zur Detektion von humanen Antikörpern fähige Reagenz mit Meerrettich-Peroxidase markiertes antihuman IgG ist, welches mit einem Substrat umgesetzt wird, das einen Farbwechselendpunkt in Gegenwart der besagten Peroxidase liefert.

23. Das Verfahren gemäß Anspruch 21, worin das besagte Peptid gemäß Anspruch 1 HTLV-III env (487-511)-Cys-NH&sub2; ist.

24. Das Verfahren gemäß Anspruch 21, worin das besagte Peptid gemäß Anspruch 1 HTLV-III env Cys-(500-511)-NH&sub2; ist.

25. Ein Verfahren zur Herstellung eines Vakzins, umfassend Mischen eines Peptides gemäß Anspruch 1 mit einem physiologisch akzeptablen Träger.

26. Ein Verfahren gemäß Anspruch 25, worin das besagte Peptid an ein Toxin gekoppelt ist, welches dazu benutzt wird, Immunität in Menschen zu verleihen.

27. Ein nicht-therapeutisches Verfahren zur Herstellung von Antikörpern gegen AIDS-Viren, umfassend injizieren einer ausreichenden Menge eines Immunogens gemäß einem der Ansprüche 11 bis 13 in einen Wirt und Rückgewinnen der besagten Antikörper aus dem Serum des besagten Wirts.

28. Ein Vakzin gegen AIDS enthaltend ein Peptid gemäß Anspruch 1 in einem physiologisch akzeptablem Medium.

29. Das Vakzin gemäß Anspruch 28, worin das besagte Peptid an ein Toxin gekoppelt ist, das zur Verleihung von Immunität in Menschen verwendet wird.

30. Ein Antikörper erzeugt durch Immunisieren eines Wirts mit einem Immunogen gemäß Ansprüchen 11 bis 13, der selektiv an eine Verbindung gemäß Anspruch 1, HTLV-III env Protein oder AIDS-Virus bindet.

31. Der Antikörper gemäß Anspruch 30, weicher ein polyklonaler Antikörper ist.

32. Der Antikörper gemäß Anspruch 30, welcher ein monoclonaler Antikörper ist, der spezifisch für das Epitop HTLV-III env (460-550) ist.

33. Die Verwendung eines Peptides gemäß Anspruch 1 zur Herstellung eines schützenden Immunisierungsvakzins.

34. Die Verwendung eines Peptides gemäß Anspruch 1 zum Testen von humanem Blut auf die Anwesenheit von Antikörpern für das AIDS- Virus.

35. Die Verwendung einer immunogenen Zusammensetzung gemäß Ansprüchen 11 bis 13 zur Herstellung von Antikörpern, die selektiv an eine Verbindung gemäß Anspruch 1, HTLV-III env Protein oder AIDS-Virus binden.

36. Ein wie in Anspruch 1 beanspruchtes Peptid, hergestellt durch ein wie in Anspruch 16 oder 17 beanspruchtes Verfahren.

37. Eine wie in einem der Ansprüche 11 bis 13 beanspruchte immunogene Zusammensetzung, hergestellt durch ein wie in einem der Ansprüche 18 bis 20 beanspruchtes Verfahren.

38. Ein Testkit zum Testen von humanen Blut auf die Anwesenheit von Antikörpern für das AIDS-Virus, enthaltend in einem Behälter ein Peptid gemäß Anspruch 1.