DE69738312T2

DE69738312T2 - Hepatitis b monoklonale antikörper

Info

Publication number: DE69738312T2
Application number: DE69738312T
Authority: DE
Inventors: Richard Seton Tedder; Samreen UCL Medical IJAZ; Ruth Bridget Ferns
Original assignee: Murex Diagnostics Corp
Current assignee: Murex Diagnostics Corp
Priority date: 1996-04-25
Filing date: 1997-04-25
Publication date: 2008-10-02
Anticipated expiration: 2017-04-26
Also published as: DE69738312D1; WO1997040164A1; ZA973664B; JP2000509269A; EP0904378B1; ES2297855T3; AU2645297A; EP0904378A1; CA2252466C; GB9608626D0; US7393933B1; CA2252466A1; JP4118955B2

Description

Global gesehen ist das Hepatitis B-Virus (HBV), was die Zahl der chronisch infizierten Menschen und die Schwere der Komplikationen bei einer Infektion angeht, das bedeutendste hepatotrophe Virus.
Nach Einführung von parenteraler Therapie, Massenimmunisierungskampagnen und der ausgedehnten Transfusion von Blut und gepoolten Blutprodukten wurde Hepatitis B zu einem Hauptproblem. Lange Inkubationszeiten, die große Häufigkeit asymptomatischer Infektionen und das Auftreten eines infektiösen Überträgers machen HBV für eine Übertragung durch Blut gut geeignet. Zahlreiche Forscher lieferten auch einen Beweis für eine sexuelle Übertragung des HBV und während der Zeit um die Geburt herum kann eine Übertragung des Hepatitis B-Virus von infizierten Müttern auf ihre Babys auftreten.
Das HBV, ein DNA-Virus, ist ein Mitglied der Hepadnaviren. Elektronenmikroskopische Aufnahmen des HBV zeigen ein als "Dane-Partikel" bezeichnetes sphärisches Teilchen mit Doppelhülle mit einem Durchmesser von 42 nm. Diese Virusteilchen verfügen über einen elektronendichten sphärischen inneren Kern mit einem Durchmesser von etwa 22–25 nm und eine äußere Hülle von 7 nm Dicke. Die äußere Hülle trägt das Oberflächenantigen (hier als (HBs" oder "HBsAg) bezeichnet), gegen welches der das Virus neutralisierende Antikörper gerichtet ist. Die sphärischen Innenkern-Teilchen mit einem Durchmesser von 20 nm tragen das virale Kern-Antigen (HBcAg) und das e-Antigen (HBeAg), die virale DNA, eine DNA-Polymerase-Aktivität sowie eine Protein-Kinase-Aktivität.
Das HBsAg enthält das als "a"-Determinante bezeichnete neutralisierende Hauptepitop des HBV, das sich von der Aminosäure 124 bis zur Aminosäure 147 erstreckt und allen HBV-Isolaten gemeinsam ist, siehe z. B. Pugh et al. (1986). Die Entwicklung eines Anti-HBs nach einer akuten oder chronischen HBV-Infektion geht gewöhnlich mit einer Erholung und guten Prognose einher. Das Anti-HBs ist auch mit der von einer Impfung herrührenden Produktion von neutralisierenden Antikörpern assoziiert. Die Mehrzahl der in genesenden und sich nach einer Impfung befindlichen Seren gefundenen Anti-HBs bindet sich in der Region der "a"-Determinante, welche eine bis jetzt noch nicht definierte Struktur aufweist. Es ist klar, dass die "a"-Determinante hoch konformationell ist, da eine Denaturierung dieses Bereichs durch Alkylierung oder Reduktion zu HBsAg-Teichen mit äußerst eingeschränkter Antigenizität führt. Man glaubt, dass Disulfid-Brücken zwischen Cystein-Resten für die korrekte Konformation verantwortlich sind. In einer möglichen Struktur der "a"-Determinante ist eine Disulfid-Brücke zwischen den Aminosäuren 124 und 137 beteiligt, welche eine erste Schleife bildet, sowie eine weitere Disulfid-Brücke zwischen den Aminosäuren 139 und 147, welche eine zweite Schleife bildet.
Man glaubt, dass sich das Anti-HBs vorwiegend an die zweite Schleife bindet, aber man glaubt auch, dass die Epitope nicht auf eine Schleife allein beschränkt sind. Die gesamte Sequenz der "a"-Determinante trägt wahrscheinlich zu der antigenen Struktur bei. Die "a"-Determinante ist konserviert, obwohl es in normalen Isolaten des HBV einen gewissen Grad an Aminsäurevariation gibt. Eine größere Variation wird für die erste Schleife des vermeintlichen Epitops angenommen, was vielleicht impliziert, dass diese Region nicht signifikant zur Neutralisation des Epitops beiträgt.
Die "a"-Determinante ist in allen Subtypen des HBV aufzufinden und es ist die Variation der Aminosäuren in und um die "a"-Determinante, welche zu den Subtypen führt. Das HBsAg lässt sich in die vier immunologische Haupt-Subtypen adw, ayw, adr und ayr unterteilen, jeder mit einer zugehörigen geographischen Verteilung. Die d/y- und w/r-Subtypen werden durch Substitutionen des Lysins durch Arginin an den Aminosäuren 122 bzw. 160 bestimmt.
Kürzlich wurde das Vorkommen des HBsAg in Anti-HBs-Serumproben bestimmter Patienten beobachtet. Das HBsAg in diesen Patienten lässt sich nicht durch das vorhandene Anti-HBs neutralisieren, was das Vorkommen von HBsAg-Varianten impliziert. Signifikante Variationen (Mutanten) sind mit einer Impfung, einer Therapie mit monoklonalen Antikörpern, einer Therapie mit polyklonalen Antikörpern und mit Fällen einer in klinischen Laboratorien schwer zu diagnostizierenden HBV-Infektion einhergegangen, siehe z. B. Carmen et al. (1992, 1993), Harrison et al. (1993), Hawkins et al. (1994), Howard et al. (1993), MacMahon et al. (1992), Okamoto et al. (1992) und Wallace et al. (1994).
Nach einer Analyse schien es, dass die Mutanten aus einer Mischpopulation selektiert worden sind und dass sie Punktmutationen aufweisen, welche Aminosäure-Substitutionen in der "a"-Determinante verursachen. Man glaubt, dass die Mutanten durch zufällige Mutationen im Gen entstehen, was zu einem Pool von Genotypen führt. Man glaubt, dass in den bis heute beschriebenen Mutanten die Immunantwort der vorwiegende Faktor bei der Selektion der Mutanten ist.
Im Allgemeinen führt die Zugabe von monoklonalen Antikörpern zu von einem Virus infizierten Zellen in vitro zu einer Selektion der Isolate, die von diesem Antikörper nicht neutralisiert werden. Es ist somit nicht überraschend, dass monoklonale Antikörper, die Patienten mit aktiver viraler Replikation verabreicht wurden, zu einer Selektion der so genannten "Escape"-Mutanten führen können.
Es sind einige separate Escape-Mutanten mit klinischer Bedeutung bei geimpften Individuen beschrieben worden. In drei Fällen wurde gefunden, dass im Codon für die Aminosäure 145 in der "a"-Determinante des HBsAg eine Punktmutation stattgefunden hat, was zu einem Austausch der Aminosäure Glycin durch Arginin führte. Die Verabreichung eines ein derartiges mutantes Virus enthaltenden Serums an einen Chimpansen zeigte, dass die Agenzien ansteckend sind.
In einem mutanten Virus, welches in eine Durchbruch-Infektion in einer geimpften Population verwickelt war, wurde eine Mutation von Lysin zu Glutaminsäure an der Aminosäureposition 141 der "a"-Determinante gefunden. Seitdem ist über diese und andere Punktmutationen, die in geimpften Individuen zu einer oder mehreren Aminosäuresubstitutionen in der "a"-Determinante führen, berichtet worden.
Aus einigen Gründen bilden Escape-Mutanten einen Grund für Sorge. Erstens lassen sich derartige Mutanten mit Immunassays nicht nachweisen. Diagnostische Assays sind so konzipiert, dass sie eine hohe Empfindlichkeit und Spezifität erzielen. Assays für einen Nachweis von HBsAg hängen von der Wechselwirkung zwischen einem Anti-HBs-Reagens und dem HBsAg in der zu untersuchenden Probe ab. Es wird dann ein erhaltener Anti-HBs/HBsAg-Komplex nachgewiesen. Gibt es eine signifikante Mutation im HBsAg-Epitop und wird diese nicht vom Anti-HBs erkannt, dann wird das HBsAg entweder nicht nachgewiesen oder der Assay ist sehr unempfindlich.
Eine nicht nachgewiesene Escape-Mutante kann nicht nur die Person beeinträchtigen, welche die Mutante beherbergt, sondern sie kann auch zu einer Übertragung einer Infektion durch das Blut, durch Blutprodukte oder Organe eines Spenders führen. Zweitens kann das HBV mit mutantem HBsAg Individuen infizieren, obwohl diese sogar vorher immunisiert worden waren und über eine Anti-Hbs-Antwort verfügen.
In der WO 94/26904 ist ein monoklonaler Antikörper gegen eine Escape-Mutante an Position 122 beschrieben worden. Dieser Antikörper ist in der Lage, zwischen dem Wildtyp-HBsAg und der mutanten Form zu unterscheiden und ermöglicht somit die Identifizierung der mutanten Form.
In der WO 95/21189 wird ein Hepatitis B-Oberflächenantigen-Protein mit einer antigenisch modifizierten Hüllregion beschrieben, in welcher zumindest zwei Aminosäuren downstream von Position 122 insertiert sind.
In der WO 94/21812 werden Antikörper zur Verwendung beim Nachweis von spezifischen Varianten des Hepatitis B-Oberflächenantigen-Proteins mit einer Substitution von Glycin zu Arginin an Position 145 beschrieben.
Waters et al., (1992) J. Clin. Invest. 90: 2543–2547 beschreiben eine Mutation des Hepatitis B-Oberflächenantigens an der Aminosäure 145, was zu einer Vermeidung einer schützenden Anti-HBs-Antwort führt, und sie spekulieren, dass die Mutation als Ergebnis eines Immundrucks entstand.
Die vorliegende Erfindung betrifft einen monoklonalen Antikörper, der in der Lage ist, sich spezifisch an ein Wildtyp-HBsAg und an mindestens zwei, vorzugsweise mehr als zwei, mutante Formen des HBsAg zu binden. Die vorliegende Erfindung stellt den monoklonalen Antikörper P2D3, hergestellt durch das als P2D3 bezeichnete und bei der ECACC unter der Zugangsnummer 97042331 hinterlegte Hybridom zur Verfügung, sowie monoklonale Antikörper, die mit dem monoklonalen Antikörper P2D3 um die Bindung an ein Wildtyp-HBsAg (Hepatitis-B-Oberflächenantigen) und an zumindest zwei mutante Formen des HBsAg kreuzkonkurrieren, wobei die mutanten Formen des HBsAg relativ zu dem Wildtyp-HBsAg eine Aminosäuresubstitution in der Sequenz aufweisen, welche die Aminosäuren 133 bis 145 des HBsAg codiert.
Wenn nicht anders angegeben, umfasst der Ausdruck "ein monoklonaler Antikörper der vorliegenden Erfindung" den monoklonalen Antikörper P2D3 sowie monoklonale Antikörper, welche mit dem wie oben definierten monoklonalen Antikörper P2D3 kreuzkonkurrieren.
Die Fähigkeit eines monoklonalen Antikörpers der vorliegenden Erfindung, sich spezifisch sowohl an ein Wildtyp- als auch an ein mutantes HBsAg zu binden, legt nahe, dass es die Bindung an eine Region des Oberflächenantigens ist, welche zwischen dem Wildtyp-Protein und den mutanten Formen konserviert ist. Die konservierte Region und somit die Antigendeterminante (oder das Epitop) kann sich in der "a"-Determinante selbst, in der Region der "a"-Determinante oder sogar in einer Nicht-"a"-Region befinden.
Wegen seiner Fähigkeit, sich spezifisch sowohl an mutante Formen des HBsAg als auch an ein Wildtyp-Protein zu binden und daher Escape-Mutanten nachzuweisen, ist ein monoklonaler Antikörper der vorliegenden Erfindung besonders bei der Verbesserung der Wirksamkeit von Immunassays zum Nachweis von HBsAg, für die klinische Diagnose von HBV-Infektionen und auch für das Screening von Blut von Nutzen. Durch die Verwendung eines erfindungsgemäßen monokionalen Antikörpers in einem HBsAg-Assay, entweder allein, d. h. als einzigem Anti-HBsAg-Antikörper, oder speziell zusätzlich zu einem oder mehreren anderen Anti-HBs-Antikörpern lässt sich die Sicherheit der Zufuhr von Blut oder von Blutprodukten steigern.
Die 1a und 1b der anhängenden Zeichnungen geben die Aminosäure- und Nucleinsäuresequenz eines Teils der HBV-Oberflächenregion wieder, welche die "a"-Determinante umfasst. 1b der eingereichten Zeichnungen ist eine maschinengeschriebene Version der 1a. In jeder der 1a und 1b: gibt Zeile 1 die erkannten Aminosäure-Varianten des Subtypsn adyw wieder; Zeile 2 gibt die Konsensus-Sequenz der Aminosäuren des Subtyps adyw wieder; Zeile 3 gibt die Konsensus-Sequenz der Nucleinsäuren des Subtyps adyw wieder; Zeile 4 gibt die erkannten Nucleinsäure-Varianten wieder; Zeile 5 gibt die Nucleinsäure-Varianten wieder, welche die Mutante HBsAg II (MAM HBsAg) codieren und Zeile 6 gibt die Nucleinsäure-Varianten wieder, welche die MutanteHBsAg I (NP HBsAg) codieren.
Eine weitere erkannte Nucleotid-Variante an Position 143 ist ACG für TCG, was an dieser Position zu einem Threonin an Stelle von Serin führt.
Ein mutmaßlicher monoklonaler Antikörper der vorliegenden Erfindung kann auf seine Fähigkeit hin gescreent werden, mit dem monoklonalen Antikörper P2D3 in Kreuzkonkurrenz zu treten, um sich an drei oder mehr Referenz-Antigene, nämlich ein Wildtyp-HBsAg und zwei oder mehr mutante Formen des HBsAg zu binden. Ein Fachmann kann eine spezifische Bindung zwischen einem Antikörper und einem Antigen leicht von einer unspezifischen Bindung unterscheiden. Jeder Antikörper, der in eine derartige Kreuzkonkurrenz zur Bindung an drei oder mehr derartige Referenz-Antigene treten kann, ist ein monoklonaler Antikörper der vorliegenden Erfindung. Ein solches Verfahren zum Screening ist selbst Teil der vorliegenden Erfindung. Es ist zu bemerken, dass der Ausdruck "Bindung" in der vorliegenden Erfindung durchgehend verwendet wird, um eine spezifische Bindung zu bezeichnen.
Ein zum Screening und/oder als Antigen bei der Herstellung von Hybridomen und monoklonalen Antikörpern der Erfindung verwendetes HBsAg kann ein Protein mit voller Länge oder ein geeignetes Antigen-Fragment oder -Derivat eines Wildtyp-HBsAg oder mutanten HBsAg sein.
Ein monoklonaler Antikörper der vorliegenden Erfindung kann von jeder Immunglobulin-Klasse sein, z. B. ein IgG, IgM, oder IgA, und von jedem Isotyp.
Mutante Formen eines HBsAg können in mutanten Viren mit einer Mutation gefunden werden, die relativ zum Wildtyp-HBsAg zumindest zu einem Aminosäure-Austausch führt, wie er z. B. in so genannten "Escape-Mutanten" anzutreffen ist. Ein mutantes HBsAg kann eine Substitution in der "a"-Determinante oder in der Region der "a"-Determinante aufweisen, z. B. kann die Mutation eine Punktmutation sein. Eine Mutation, z. B. eine Punktmutation, kann sich innerhalb der die Aminosäuren 133 bis 145 des HBsAg codierenden Sequenz befinden. Die Mutation kann zu einer Aminosäure-Substitution an Position 133 und/oder an Position 145 führen. Es können weitere und/oder unterschiedliche Substitutionen vorkommen, z. B. an jeder oder an mehreren der Positionen 134, 141, 142, 143 und 144. Ein mutantes HBsAg kann z. B. relativ zum Wildtyp Aminosäure-Substitutionen an jeder oder an mehreren der Positionen 143, 144 und 145 aufweisen. Solche Mutationen können zusätzlich zu anderen Mutationen entweder in der "a"-Determinante oder in einer anderen Region vorkommen.
Ein monoklonaler Antikörper der vorliegenden Erfindung ist in der Lage, mit dem monoklonalen Antikörper P2D3, wie oben beschrieben, in Kreuzkonkurrenz um die Bindung an z. B. ein Wildtyp-HBsAg oder zwei oder mehr unterschiedliche mutante HBsAg zu treten, wobei z. B. jedes eine Mutation an jeder oder mehreren der Positionen 133, 134, 141, 142, 143, 144 und 145 aufweist. Alternativ kann die Bindung an ein oben beschriebenes mutantes HBsAg und an ein mutantes HBsAg mit einer Mutation in einer anderen Region erfolgen.
Beispiele für mutante Formen des HBsAg sind solche mit den relativ zum Wildtyp auftretenden folgenden Substitutionen in der Region der "a"-Determante:
Mutantes HBsAg I ("NP"-HBsAg): met zu ile an Aminosäureposition 133; phe zu his an Aminosäureposition 134 und asp zu val an Aminosäureposition 144;
Mutantes HBsAg II ("MAM"-HBsAg): met zu ile an Aminosäureposition133; phe zu asn an Aminosäureposition134; pro zu ser an Aminosäureposition 142; ser zu leu an
Aminosäureposition 143 und gly zu lys an Aminosäureposition 145;
Mutantes HBsAg III ("SZ"-HBsAg): gly zu arg an Aminosäureposition 145;
Mutantes HBsAg IV ("SP"-HBsAg): ser zu met an Aminosäureposition 143.
Ein mutmaßlicher Antikörper kann gescreent werden z. B. gegen ein Wildtyp-HBsAg und gegen jede der oben beschriebenen zwei oder mehrere mutanten Formen. Ein mutmaßlicher monoklonaler Antikörper der vorliegenden Erfindung kann z. B. gegen ein Wildtyp-HBsAg und zwei oder mehrere unterschiedliche mutante HBsAg gescreent werden, wobei jedes eine Mutation (Mutationen) an jeder einzelnen oder mehreren der Positionen 133, 134, 141, 142, 143, 144 und 145 aufweist. insbesondere an den Positionen 143, 144 und 145. Alternativ kann eine derartige Mutante mit einem mutanten HBsAg verwendet werden, welches eine Mutation in einer anderen Region aufweist. Die oben beschriebenen mutanten Formen I und IV können zum Screening eingesetzt werden.
Ein monoklonaler Antikörper der Erfindung kann in der Lage sein, sich spezifisch an ein Wildtyp-HBsAg oder an mindestens ein mutantes HBsAg zu binden, welches eine "a"-Determinante trägt, die von einer Sequenz mit Punktmutationen an jedem einzelnen oder mehreren der die Aminosäuren 143, 144 und 145 codierenden Codons codiert wurde. Der monoklonale Antikörper kann sich an zwei oder mehr derartige mutante HBsAg oder an ein derartiges mutantes HBsAg und an ein anderes unterschiedliches mutantes HBsAg binden.
Beispiele für monoklonale Antikörper der vorliegenden Erfindung sind solche, die von den Hybridomen mit der Bezeichnung P2D3, M3A10 und M4F5 produziert wurden, welche Hybridome bei der European Collection of Cell Cultures (ECACC), Virus Reasearch and Production Laboratory, Public Health Laboratory Service, Centre for Applied Microbiology & Research, Porton Down, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, England unter den Bestimmungen des Budapester Vertrags über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren 1977 hinterlegt wurden. Die Accession-Numbers und Daten der hinterlegten Hybridome sind wie folgt: Hybridom P2D3: Accession Number ECACC 97042331, Accession-Datum 23. April 1997; Hybridom M3A10: Accession Number ECACC 97042330, Accession-Datum 23. April 1997; Hybridom M4F5: Accession Number ECACC 97042519, Accession-Datum 25. April 1997.
In dieser Beschreibung kann auf einen monoklonalen Antikörper unter derselben Bezeichnung wie das ihn produzierende Hybridom Bezug genommen sein, beispielsweise wird der mit P2D3 bezeichnete monoklonale Antikörper von dem Hybridom P2D3 (ECACC 97042331) produziert. Die Hybridome P2D3 (ECACC 97042331), M3A10 (ECACC 97042330) und M4F5 (ECACC 97042519) sowie die monoklonalen Antikörper, die sie produzieren, werden in dem Beispiel unten genau beschrieben.
Jeder der monoklonalen Antikörper P2D3, M3A10 und M4F5 ist in der Lage, sich spezifisch an (i) ein Wildtyp-HBsAg, (ii) an mutantes HBsAg I (NP-HBsAg) und (iii) an mutantes HBsAg II (MAM-HBsAg) zu binden. Ferner ist jeder auch in der Lage, sich spezifisch an mutantes HBsAg III (SZ-HBsAg) und mutantes HBsAg IV (SP-HBsAg) zu binden. Die monoklonalen Antikörper P2D3 und M4F5 sind IgG-Antikörper. Der monoklonale Antikörper M3A10 ist ein IgA-Antikörper.
Es ist bekannt, dass das Wildtyp-HBsAg eine Anzahl unterschiedlicher Serotypen aufweist und dass es auch erkannte Mutanten gibt (siehe z. B. Pugh et al. 1980). Der in der vorliegenden Beschreibung benutzte Ausdruck "Wildtyp-HBsAg" umfasst alle HBsAg, die im Stand der Technik als Wildtyp anerkannt sind oder als Wildtyp anerkannt würden. Der Ausdruck umfasst daher Wildtyp-HBsAg von allen Serotypen und von allen anerkannten Varianten. Der hier benutzte Ausdruck (mutantes HBsAg" umfasst keine anerkannten Wildtyp-Varianten.
Geeignete Screening-Tests sind dem Fachmann gut bekannt und umfassen Kreuz-Konkurrenz-Assays und Assays, die z. B. einen radioaktiv markierten Antikörper benutzen, um Bindungsspezifitäten zu bestimmen.
Wie oben angegeben, legt die Fähigkeit eines monoklonalen Antikörpers der vorliegenden Erfindung, sich sowohl an Wildtyp- als auch mutante HBsAg zu binden, nahe, dass es die Bindung an eine Region des Oberflächenantigens ist, welche zwischen dem Wildtyp-Protein und den mutanten Formen konserviert ist. (Siehe auch die allgemeine Diskussion weiter unten). Die Lage und Sequenz einer solchen konservierten Region und daher ein konserviertes Epitop lassen sich nach bekannten Verfahren ermitteln, z. B. mittels Epitop-Kartierung unter wahlweisem Einsatz eines monoklonalen Antikörpers der Erfindung. Die Epitop-Peptide und -Polypeptide lassen sich dann z. B. rekombinant, mittels chemischer Synthese oder mit einer Kombination von unterschiedlichen Verfahren herstellen. Ein erhaltenes antigenes Peptid oder Polypeptid kann auch immunogen sein. Ein Epitop, gegen welches ein monoklonaler Antikörper der Erfindung gerichtet ist, ist selbst ein Teil der vorliegenden Erfindung
Die vorliegende Erfindung umfasst Fragmente und Derivate eines monoklonalen Antikörpers der vorliegenden Erfindung, z. B. Fab- und Fab₂-Fragmente und Konjugate. Die Derivate umfassen humanisierte Derivate. Verfahren zur Herstellung der Fragmente und Derivate, einschließlich der humanisierten Derivate, sind gut bekannt. Beispielsweise lassen sich Fragmente und Derivate rekombinant herstellen. Fragmente und Derivate von Antikörpern und ihre Verwendung sind dem Fachmann gut bekannt. Der hier benutzte Ausdruck "monoklonaler Antikörper" umfasst Fragmente und Derivate desselben.
Die vorliegende Erfindung stellt auch einen anti-idiotypischen Antikörper gegen einen monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung zur Verfügung. Derartige Antikörper, die ein "internes Bild" des ursprünglichen Epitops umfassen, können als Epitop-Ersatz verwendet werden und sind besonders im Falle von konformationellen Epitopen von Nutzen, da es schwierig ist, solche Epitope zu kartieren und es nicht möglich sein kann, in diesen Fällen synthetische Epitop-Peptide herzustellen.
Ein monoklonaler Antikörper der vorliegenden Erfindung kann in einem Immunassay zum Nachweis eines HBsAg ("HBV-Assay") und daher von Hepatitis B-Infektionen zum Einsatz kommen, entweder als Ersatz für oder insbesondere zusätzlich zu den Anti-HBs-Antikörpern, die derzeit in HBV-Assays verwendet werden. Solche Assays können für die klinische Diagnose oder für das Screening von Blut verwendet werden und die vorliegende Erfindung umfasst sowohl Verfahren der Diagnose als auch Verfahren für das Blut-Screening, indem ein Immunassay zum Einsatz kommt, der einen monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung umfasst.
Ein monoklonaler Antikörper der vorliegenden Erfindung kann auch therapeutisch oder prophylaktisch als Antiserum für eine passive Immunisierung und/oder zur Festlegung eines Epitop für den Einsatz als Impfstoff in einer aktiven Immunisierung verwendet werden. Die vorliegende Erfindung umfasst solche Antiseren und Verfahren der Immunisierung und auch Epitope, die durch die Verwendung derartiger Antiseren festgelegt wurden.
Eine weitere Anwendung eines monoklonalen Antikörpers der vorliegenden Erfindung findet in der Affinitätschromatographie statt, um z. B. Wildtypen oder mutante Typen von HBsAg, dessen Antigenfragmenten, von Antigen-Peptiden oder von anti-idiotypischen Antikörpern zu reinigen.
Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung einen Immunassay zum Nachweis von HBsAG zur Verfügung welcher das in Kontakt Bringen einer zu untersuchenden Probe mit einem monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung, einem Fragment oder Derivat desselben oder einer Kombination aus zwei oder mehreren derselben sowie die Bestimmung irgendeines daraus resultierenden Antigen-Antikörper-Komplexes umfasst.
Der Ausdruck "Nachweis" wird hier benutzt, um einen Nachweis und/oder eine Bestimmung zu bezeichnen und umfasst qualitative, quantitative und halbquantitative Verfahren.
Der erfindungsgemäße monoklonale Antikörper, das Fragment, Derivat oder eine Kombination derselben kann mit einem oder mehreren anderen Antikörpern eingesetzt werden, die ausgewählt sind aus polyklonalen Anti-HBs-Antikörpern und anderen monoklonalen Anti-HBs-Antikörpern.
Ein Immunassay der vorliegenden Erfindung kann in einem homogenen oder heterogenen Format sein. Das Format kann ein Capture-Format oder ein kompetitives Format sein.
Ein Immunassay zum Nachweis von Antikörpern gegen das Hepatitis B-Kernantigen (Anti-HBc) kann gleichzeitig mit dem Assay für das HBsAg durchgeführt werden. HBV-Anti-Core/Oberflächenantigen-Kombinationsassays sind bekannt und in Gebrauch.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner einen Immunassay-Kit zur Verfügung, der einen monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung oder ein Fragment oder Derivat desselben oder eine Kombination von zwei oder mehreren derselben sowie andere Reagenzien, die für das Ausführen eines Immunassays für HBsAg erforderlich sind und wahlweise auch Reagenzien für die Bestimmung von Anti-HBc-Antikörpern umfasst. Es können auch ein anderer oder mehrere andere Anti-HBs-Antikörper vorkommen, die ausgewählt sind aus polyklonalen Anti-HBs-Antikörpern und monoklonalen Anti-HBs-Antikörpern und die anderen Reagenzien können ausgewählt sein aus Waschlösungen, Verdünnungsmitteln, Standardlösungen, Kontrollreagenzien und markierten Anti-HBs-Antikörpern.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner eine Festphase zur Verfügung, die für die Verwendung in einem Immunassay geeignet ist, auf welcher ein monoklonaler Antikörper der vorliegenden Erfindung, ein Fragment oder Derivat desselben oder eine Kombination aus einem oder mehreren derselben immobilisiert sind. Ein oder mehrere weitere Anti- HBs-Antikörper, ausgewählt aus polyklonalen Anti-HBs-Antikörpern und anderen monoklonalen Anti-HBs-Antikörpern können ebenfalls auf der Festphase immobilisiert sein. Darüber hinaus kann auf der Festphase zusätzlich zu den Anti-HBs-Antikörpern ein Mittel immobilisiert sein, das Anti-HBc-Antikörper einfängt.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Antiserum zur Verfügung, das für eine therapeutische oder prophylaktische Verwendung zur passiven Immunisierung geeignet ist, welches einen monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung, ein Fragment oder Derivat desselben oder eine Kombination von zwei oder mehreren derselben umfasst.
Die vorliegende Erfindung stellt auch eine Zusammensetzung zur Verfügung, die für die therapeutische oder prophylaktische Verwendung für die passive Immunisierung gegen HBV geeignet ist, welche einen monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung, ein Fragment oder Derivat desselben oder eine Kombination von zwei oder mehreren derselben in einer Mischung mit einem pharmazeutisch geeigneten Träger umfasst.
Ein Antiserum oder eine Zusammensetzung der Erfindung können auch einen oder mehrere andere Antikörper umfassen, die ausgewählt sind aus polyklonalen Anti-HBs-Antikörpern und anderen monoklonalen Anti-HBs-Antikörpern.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur therapeutischen oder prophylaktischen passiven Immunisierung gegen das HBV zur Verfügung, welches die Verabreichung einer therapeutisch oder prophylaktisch wirksamen Menge eines monoklonalen Antikörpers der Erfindung, eines Fragments oder Derivats desselben oder eine Kombination von zwei oder mehr derselben an einen Menschen umfasst. Ein oder mehrere andere Antikörper, ausgewählt aus monoklonalen und polyklonalen Anti-HBs-Antikörpern, können ebenfalls verabreicht werden.
Für jede der erfindungsgemäßen Anwendungen und Verwendungen kann der monoklonale Antikörper der vorliegenden Erfindung der monoklonale Antikörper P2D3, der monoklonale Antikörper M3A10, der monoklonale Antikörper M4F5 oder eine Kombination aus zwei oder mehreren derselben sein. Jeder oder mehrere der monoklonalen Antikörper P2D3, M3A10 und M4F5 kann (können) zusammen mit irgend einem anderen monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung und/oder mit irgend einem anderen der Anti-HBV-Antikörper, insbesonder Anti-HBs-Antikörpern, eingesetzt werden. Es können ein Fragment oder ein Derivat eines monoklonalen Antikörpers der Erfindung eingesetzt werden.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Hybridom zur Verfügung, das in der Lage ist, einen monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung zu produzieren, z. B. das Hybridom P2D3 (Zugangsnummer ECACC 97042331), das Hybridom M3A10 (Zugangsnummer ECACC 97042330) und das Hybridom M4F5 (Zugangsnummer ECACC 97042519).
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Produktion eines Hybridoms zur Verfügung, das in der Lage ist, einen monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung zu produzieren, welches Verfahren die Schritte umfasst: Immunisierung eines Tieres mit einem Wildtyp-HBsAg oder einer mutanten Form des HBsAg, Immortalisierung von Antikörper produzierenden Zellen zur Bildung von Hybridomen, Screening der erhaltenen Hybridom-Kultur auf Wildtyp-HBsAg und zwei oder mehr mutante Formen des HBsAg sowie die Auswahl von solchen Hybridomen, welche einen monoklonalen Antikörper produzieren, der in der Lage ist, sich spezifisch an das Wildtyp-HBsAg und zwei oder mehr mutante Formen des HBsAg zu binden.
Ein monoklonaler Antikörper der Erfindung lässt sich erhalten, indem ein Hybridom der Erfindung in vitro oder in vivo in Kultur gehalten wird und die monoklonalen Antikörper aus dem Kulturmedium erhalten werden. Im Falle einer in vivo-Produktion ist das Kulturmedium die Aszites-Flüssigkeit.
Verfahren zur Anzucht und zum Screening von Hybridomen und monoklonalen Antikörpern sind dem Fachmann gut bekannt. Die allgemeine Methodik ist bei Köhler und Milstein (1975) beschrieben und seitdem hat es zahlreiche Veröffentlichungen über dieses Thema gegeben. Jede derartige Methode lässt sich einsetzen, um Hybridome und monoklonale Antikörper gemäß einem Verfahren der vorliegenden Erfindung anzuzüchten und zu screenen. Das zum Anzüchten der Antikörper eingesetzte Antigen kann ein Wildtyp-HBsAg oder eine mutante Form des HBsAg sein, z. B. wie oben beschrieben, beispielsweise eine oder mehrere der oben beschriebenen mutanten Formen I bis IV.
Das Screening der erhaltenen Hybridome und monoklonalen Antikörper auf ihre Fähigkeit hin, sich spezifisch an unterschiedliche Formen des HBsAg zu binden, kann nach jedem herkömmlichen Verfahren erfolgen, in welchem das Wildtyp-HBsAg und die ausgewählten mutanten Formen verwendet werden. Wie oben beschrieben lässt sich das Screening durchführen, indem als Referenzantigene das Wildtyp-HBsAg und zwei oder mehr mutante Formen des HBsAg eingesetzt werden, z. B. wie oben beschrieben, beispielsweise eine oder mehrere der mutanten Formen I bis IV.
Für das Screening ist es besonders bequem, einen reversen IgG-Capture-Radioimmunassay einzusetzen, der für einen sehr niedrigen Background und einen großen dynamischen Bereich befähigt ist und den weiteren Vorteil einer einfachen Anordnung bietet.
In einem reversen IgG-Capture-Assay für einen in Frage stehenden Antikörper wird ein passendes Anti-Spezies-IgG auf einer Festphase, z. B. Mikrowells, immobilisiert. Falls z. B. die zu untersuchenden Antikörper in Mäusen erzeugt wurden, wird die Festphase mit Anti-Maus-IgG beschichtet. Die zu untersuchende Probe wird dann mit dem immobilisierten Anti-Spezies-IgG inkubiert, worauf ein repräsentativer Anteil der gesamten in der Probe vorkommenden IgGs eingefangen wird. Die Festphase wird dann mit einem passenden markierten Antigen inkubiert, welches nur mit dem in Frage kommenden eingefangenen Antikörper einen Komplex bildet. Alle gebildeten Komplexe lassen sich dann nachweisen.
Im vorliegenden Fall wird eine zu untersuchende Probe, z. B. der flüssige Gewebskultur-Überstand aus einer Hybridom-Kultur oder Aszites. Flüssigkeit, mit dem immobilisierten Anti-IgG inkubiert. Die eingefangenen Antikörper werden getrennt mit einem markierten Wildtyp-HBsAg und mit zwei oder mehr markierten mutanten HBsAg inkubiert, die z. B. wie oben beschrieben, beispielsweise aus den mutanten Formen I bis IV, selektiert wurden. Jede Probe, die in der Lage ist, sich spezifisch an ein Wildtyp-HBsAg und zwei oder mehr mutante Oberflächenantigene zu binden, enthält einen monoklonalen Antikörper, der in den Geltungsbereich der vorliegenden Erfindung fällt.
Analog kann ein Umkehrphasen-IgM- oder -IgA-Assay eingesetzt werden, um einen monoklonalen IgM- oder IgA-Antikörper zu erhalten.
Die im Handel erhältlichen Immunassays für HBsAg sind im Allgemeinen Assays in heterogener Phase oder "Capture"-Assays, in welchen das HBsAg auf einer festen Phase, gewöhnlich Mikrowells, kleine Teilchen oder Kügelchen, immobilisiert ist. Wenn eine zu untersuchende Probe, im Allgemeinen ein Serum, mit dem immobilisierten Anti-HBsAg in Kontakt gebracht wird, sollte das in der Probe enthaltene HBsAg sich an den immobilisierten Antikörper binden. Das eingefangene Antigen wird dann, im Allgemeinen unter Einsatz eines markierten Anti-HBsAg, nachgewiesen. In herkömmlichen Assays kann der für das Einfangen oder den Nachweis eingesetzte Antikörper monoklonal oder polyklonal sein.
Wegen ihrer Natur weisen polyklonale Antikörper einen Spezifitäts- und Selektivitätsbereich auf. Im Falle des HBV kann dies dazu führen, dass im Antiserum ein Antikörper vorkommt, der sich an eine Escape-Mutante binden kann. Dies kann jedoch nicht garantiert werden und es besteht das inhärente Problem, von Batch zu Batch ein einheitliches Produkt zu erhalten. Monoklonale Antikörper verfügen über eine definierte Spezifität und Selektivität und können daher Escape-Mutanten nicht aufspüren.
Die Verwendung eines monoklonalen Antikörpers der vorliegenden Erfindung, welcher in der Lage ist, sich spezifisch sowohl an ein Wildtyp-HBsAg als auch an mutantes HBsAg oder an eine Kombination von zwei oder mehreren solcher Antikörper, einschließlich an deren Fragmente und Derivate, zu binden, in einem Immunassay für HBsAg verbessert die Leistung des Assays und verringert die Möglichkeit, dass mutantes HBsAg nicht nachgewiesen wird. Ein monoklonaler Antikörper der vorliegenden Erfindung oder eine Kombination von zwei oder mehreren solcher Antikörper kann entweder als einziges Anti-HBs-Antikörper-Reagens oder vorzugsweise zusätzlich zu polyklonalen Anti-HBs oder anderen monoklonalen HBs zum Antigen-Einfang und/oder zum Nachweis für jeden erhaltenen Antigen-Antikörper-Komplex eingesetzt werden. Ein monoklonaler Antikörper der vorliegenden Erfindung oder eine Kombination von zwei oder mehreren desselben können analog gegen herkömmliche Anti-HBs in einem Assay für das HBsAg in homogener Phase eingesetzt werden. Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung einen Immunassay zum Nachweis von HBsAg zur Verfügung, welcher das in Kontakt Bringen einer Probe, von der vermutet wird, dass sie HBsAg enthält, mit einem monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung, einem Fragment oder Derivat desselben oder einer Kombination von zwei oder mehreren derselben sowie den Nachweis von jedem erhaltenen Antigen-Antikörper-Komplex umfasst. Der monoklonale Antikörper, ein Fragment, Derivat oder eine Kombination davon können als einziges Anti-HBs-Reagens eingesetzt werden oder sie können mit einem oder mehreren anderen Anti-HBs-Antikörpern eingesetzt werden, die ausgewählt sind aus polyklonalem Anti-HBs und anderen monoklonalen Anti-HBs-Antikörpern.
Immunassays mit mehreren unterschiedlichen Formaten, Verfahren zu ihrer Durchführung und geeignete Reagenzien sind gut bekannt und werden in verschiedenen Fachbüchern und Übersichtsartikeln beschrieben, z. B. bei Kemeny & Challacome 1988 und Tsu & Herzenberg 1980. Jedes Verfahren zum Nachweis eines Antigens kann in der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Ein erfindungsgemäßer Assay kann ein so genannter "Sandwich"-Assay, ein Kompetitions-Assay oder eine direkte Reaktion sein. Der monoklonale Antikörper, das Fragment, Derivat oder die Kombination derselben kann auf einer festen Oberfläche allein oder zusammen mit einem polyklonalen Anti-HBs-Antiserum und/oder mit einem oder mehreren anderen monoklonalen Anti-HBs-Antikörpern immobilisiert sein. Alternativ können der monoklonale Antikörper der Erfindung oder die Kombination davon und alle weiteren Antikörper in homogener Phase vorliegen. Jeder erhaltene Antigen-Antikörper-Komplex lässt sich mit Hilfe markierter Anti-HBs nachweisen. Im Falle eines Assays in heterogener Phase kann das zum Nachweis eingesetzte Anti-HBs das gleiche sein, wie das zur Beschichtung der festen Oberfläche verwendete oder es kann sich davon unterscheiden.
Geeignete feste Oberflächen, auf denen das Anti-HBs immobilisiert sein kann, sind gut bekannt und umfassen die Innenwände der Wells von Mikrotiterplatten, Kügelchen, Teilchen und so genanntes "Latex". Beispielsweise können Membranen und Streifen aus Nitrocellulose oder Papier Verwendung finden. In eine Assay-Vorrichtung kann eine Membran oder ein Streifen eingebaut sein Derartige Vorrichtungen sind gut bekannt. Die Erfindung umfasst solche Festphasen, auf denen ein monoklonaler Antikörper oder ein Fragment oder Derivat desselben oder eine Kombination aus zwei oder mehreren derselben immobilisiert sind.
Die zum Nachweis von jedem Antigen-Antikörper-Komplex eingesetzten Anti-HBs können mit jedem Mittel markiert werden, das in der Lage ist, direkt oder indirekt ein Signal zu erzeugen. Derartige Mittel sind gut bekannt. Mittel, die in der Lage sind, ein direktes Signal zu erzeugen sind Radiomarker, Farbmarker und Fluoreszenzmarker. Mittel, die in der Lage sind, ein Signal indirekt zu erzeugen sind Enzyme, die in der Lage sind, eine Reaktion, die eine Änderung der Farbe hervorruft, zu katalysieren.
Die vorliegende Erfindung stellt auch einen Kit zur Verfügung, welcher die Komponenten umfasst, die zur Ausführung eines Immunassays der vorliegenden Erfindung benötigt werden. Ein derartiger Kit umfasst z. B. einen monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung oder eine Kombination aus zwei oder mehreren davon, die auf einer festen Oberfläche immobilisiert sind, zusammen mit einem Behälter (Behältern), der (die) ein anderes (andere) benötigtes (benötigte) Reagens (Reagenzien) umfasst (umfassen), welche z. B. ausgewählt sind aus Waschlösungen und Verdünnungsmitteln, Standardlösungen und Kontroll-Reagenzien, markierten Anti-HBs-Antikörpern und, im Falle von Enzymmarkierten Anti-HBs, Farbreagenzien.
Oft wird ein Immunassay für Antikörper gegen das Hepatitis B-Kernprotein (HBc) zur gleichen Zeit mit dem Assay für HBs ausgeführt, z. B. im selben Mikrowell. Die vorliegende Erfindung umfasst die Verwendung eines monoklonalen Antikörpers der vorliegenden Erfindung in derartigen Assays sowie Kits und beschichtete Festphasen zur Benutzung in solchen Assays.
Wie oben angegeben, kann ein monoklonaler Antikörper der vorliegenden Erfindung für eine passive Immunisierung eingesetzt werden, z. B. während einer Lebertransplantation eines mit dem HBV infizierten Patienten. Für eine passive Immunisierung wird der Antikörper zur Verwendung als Antiserum für eine parenterale Verabreichung in eine geeignete Form gebracht, z. B. in eine Form, welche eine Derivatisierung einschließlich einer Humanisierung gestattet. Die Dosis für den zu verwendenden Antikörper hängt von dem besonderen Befinden eines jeden Patienten ab und wird von Fall zu Fall ermittelt.
Ein monoklonaler Antikörper der vorliegenden Erfindung einschließlich Kombinationen von zwei weiteren derartigen Antikörpern, Fragmenten und Derivaten desselben können allein oder zusätzlich zu anderen entweder polyklonalen oder monoklonalen Anti-HBs- Antikörpern verwendet werden. Es können auch andere Anti-HBV-Antikörper mit umfasst sein.
Eine mutante Form des HBsAg, an welche sich ein monoklonaler Antikörper der vorliegenden Erfindung bindet, kann bei der Produktion von monoklonalen Antikörpern und zum Screening nach vermeintlichen erfindungsgemäßen Antikikpern selbst als Antigen eingesetzt werden. Ein derartiges mutantes HBsAg lässt sich aus einem Subjekt erhalten, von dem angenommen wird, dass es eine HBV-Escape-Mutante beherbergt. Ein solches Subjekt ist im Allgemeinen sowohl Anti-HBs-positiv als auch HBsAg-positiv. Geeignete Subjekte lassen sich unter Patienten finden, die für eine HBV-Infektion eine Therapie mit monoklonalen Antikörpern erhielten, bei geimpften Subjekten, insbesondere wo eine Durchbruch-Infektion gefunden wird sowie in Fällen einer HBV-Infektion, die in klinischen Labors mit Hilfe derzeitiger Standardtests scher zu diagnostizieren sind.
Eine mutante Form des HBsAg, z. B. eine der oben beschriebenen mutanten Formen, z. B. die mutanten Formen I bis IV, lassen sich mittels rekombinanter DNA.Technologie gewinnen. Eine natürlich vorkommende DNA, welche die mutante Form codiert, kann zur Expression des mutanten HBsAg in einen passenden Wirt insertiert werden. Alternativ kann Wildtyp-DNA modifiziert werden, z. B. mittels einer ortsgerichteten Mutagenese, und dann eingesetzt werden, um die Expression der mutanten Form zu erreichen.
Aus natürlichen Quellen, im Allgemeinen aus dem Blut eines ausgesuchten Subjekts erhaltenes HBsAg weist eine natürliche Glykosylierung auf und es ist im Allgemeinen bevorzugt, derartiges HBsAg als Antigen einzusetzen. Verfahren zur Reinigung des HBsAg aus Blut sind gut bekannt, siehe z. B. Cameron et al. 1980. Es kann ein Vorzug sein, ein rekombinantes mutantes HBsAg zu produzieren, welches teilweise oder vollständig glykosyliert ist.
Das HBsAg kann in voller Länge vorliegen oder es kann ein passendes antigenes Fragment verwendet werden. Ein derartiges Fragment lässt sich mit Hilfe der rekombinanten Technologie gewinnen. Alternativ kann ein Fragment eingesetzt werden, welches ein antigenes Peptid ist, das z. B. mittels chemischer Synthese hergestellt wurde. Zur Verwendung als Impfstoff sollte ein Antigen immunogen sein, d. h. in der Lage, eine protektive Antwort zu erzeugen.
Verfahren zur Produktion anti-idiotypischer Antikörper sind gut bekannt. Im vorliegenden Fall wird ein monoklonaler Antikörper der vorliegenden Erfindung als Antigen bei der Produktion eines anti-idiotypischen Antikörpers eingesetzt und die erhaltenen Antikörper können gegen einen monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung gescreent werden. Ein anti-idiotypischer Antikörper der vorliegenden Erfindung kann selbst auf bekannte Art und Weise als Impfstoff eingesetzt werden.
Das folgende nicht einschränkende Beispiel veranschaulicht die vorliegende Erfindung.
BEISPIEL
I. MATERIAL UND METHODEN
1: Patienten
Die unten beschriebenen monoklonalen Antikörper wurden gegen das mutante HBsAg von zwei Patienten erzeugt. Diese Patienten wurden als das Ergebnis unbeständiger serologischer Marker identifiziert.
Der MAM-Patient war ein HBV-Träger. Das Serum war anfangs im Jahre 1986 mit dem auf polyklonalen Antikörpern basierenden reversen passiven Hämagglutinations-Assay (RPH) HBsAg-positiv, aber mit einem monoklonalen Enzym-Assay (EIA) negativ. Als es wieder getestet wurde, wurde das HBsAg mit sowohl auf polyklonalen als auch monoklonalen Antikörpern beruhenden Assays nachweisbar, wurde aber nur bei einem polyklonalen Antikörper-Assay wieder nicht nachweisbar. Während des gesamten Zeitraums der Nachbehandlung war das Serum der Patienten anti-HBc und HBsAg-positiv.
Der Patient NP erhielt im Jahre 1985 eine Nierentransplantation. 1990 war der Patient Anti-HBc-seropositiv aber das HBsAg und das Anti-HBs wurden nicht nachgewiesen. Mit der Hämodialyse wurde 1993 begonnen und später im Jahr wurde nur mit auf polyklonalen Antikörpern basierenden Assays HBsAg nachgewiesen.
Keiner der Patienten war zuvor geimpft worden.
Die Sequenzen der HBsAg-Gene um die "a"-Determinante herum wurden mittels einer einzelsträngigen Sequenzierung ermittelt, welche direkt an den PCR-Produkten erfolgte, wie dies bei Hawkins et al., 1994 beschrieben ist.
2: Produktion von monoklonalen Antikörpern
2.1: Tiere
Verwendete weibliche Balb/c-Mäuse.
Die für eine Immunisierung der Mäuse benötigte Reinigung des HBsAg basierte auf dem von Cameron et al., 1980 beschriebenen Verfahren.
Ein hoher Titer eines HBsAg-positiven Serums wurde fraktioniert, indem Volumina von 20 ml über eine Sepharose 6B-Säule (Pharmacia) mit einem Durchmesser von 100 × 5 cm geschickt wurden, welche Säule mit 0,9% NaCl pH 7,6, welches mit 0,1% Natriumazid enthaltendem Tris (Tris/Sal/Az) gepuffert worden war, äquilibriert wurde. Die HBsAg-reichen Fraktionen, die nun frei von Albumin und IgG waren, wurden mittels Ultrafiltration in einer mit einer XM 100 A-Membran (Amicon Ltd.) ausgestatteten gerührten Ultrafiltrationszelle von 200 ml auf ein Volumen von 9 ml aufkonzentriert. Zu diesem Volumen wurden 2,69 g festes CsCl gegeben und das Volumen auf 10 ml eingestellt, um eine Dichte von 1,2 g/cm³ zu erhalten. Das Material wurde dann 3 Tage lang bei 124000 g in zwei Röhrchen von 5 ml in einem SW50-L-Ausschwing-Rotor (Beckman RIIC Ltd.) bei 20°C ultrazentrifugiert, um in dem sich selbst ausbildenden Dichtegradienten eine isopyknische Bandenbildung zu erreichen.
Aus beiden Röhrchen wurde die HBsAg-Hauptbande, welche die 22 nm kleinen Teilchen enthält, entfernt, gepoolt und mit einer Lösung von CsCl in Tris/Sal/AZ (2,885 g plus 10 ml) auf 5 ml aufgefüllt, was eine Enddichte von 1,2 g/cm³ ergab. Unter den gleichen Bedingungen wie zuvor wurde das Material in einem Röhrchen von 5 ml ultrazentrifugiert, um die zweite isopyknische Bandenbildung zu erzielen. Die HBsAg-Endbande wurde entnommen und zur Entfernung des CsCl in PBS dialysiert.
3: Immunisierung der Tiere
50 μl gereinigtes mit einem gleichen Volumen Titermax-Adjuvans (Vaxdel, Inc.) vermischtes NP-HBsAg wurden subkutan in eine weibliche Balb/c-Maus injiziert. Ungefähr 2 Monate später wurde eine Dosis von 30 μl intraperitonel (i.p.) verabreicht, 3 Monate später gefolgt von einer ebenfalls i.p. verabreichten Dosis von 75 μl. Die letzten 25 μl HBsAg in Saline wurden 3 Tage vor der Fusion intraperitoneal verabreicht.
Die gleiche Vorschrift wurde angewandt, wenn die Maus mit dem MAM-HBsAg immunisiert wurde.
4: Kultur von Myelom-Zellen
Von P3-X63-Ag8653 (Kearney et al., 1979) stammende JK-Zellen wurden in Komplett-Medium (siehe Reagenzien) bei 37°C unter einer 5% CO₂-in-Luft-Atmosphäre bei 100% Feuchtigkeit kultiviert.
Die Zellen wurden ungeführ 3 Mal wöchentlich 1:2 aufgeteilt und bei einer Konzentration zwischen 2 × 10⁵ und 2 × 10⁶ Zellen pro ml gehalten. Zur Fusion mit Splenozyten wurden nur Zellen in der log-Phase des Wachstums eingesetzt.
Für die Fusion wurden die Myelom-Zellen bei 1500 g über einen Zeitraum von 10 Minuten zentrifugiert und 3 Mal mit demselben Volumen Mangelmedium (siehe Reagenzien) gewaschen. Die resuspendierten JK-Zellen wurden mit dem Mangelmedium 1:10 verdünnt und durch Auszählen der Zellen mit Hilfe einer Neubauer-Kammer die Lebensfähigkeit und Konzentration der Zellen ermittelt. Es wurde gefunden, dass die Konzentration der JK-Zellen ungefähr 5,87 × 10⁷ Zellen/ml betrug.
4.1: Gewinnung von Feeder-Zellen
Zellen des peritonealen Exsudats der Maus wurden als Feeder-Zellschicht für Hybridzellen verwendet. Diese wurden am Tag bevor die Fusion erfolgte gewonnen. Zur Gewinnung der Feeder-Zellen wurde Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin enthaltendes Komplett-Medium (HAT-Medium – siehe Reagenzien) eingesetzt. Fünf Milliliter des Mediums wurden in die Bauchfellhöhle einer frisch getöteten Balb/c-Maus injiziert und nach sorgfältigem Schütteln das nun das Zell-Exsudat enthaltende Medium aseptisch entfernt. Zu jedem Well einer 96 Well-Platte wurden 100 μl der Zellen gegeben (pro zu fusionierender Milz wurden 4 bis 5 Platten benötigt). Alle Platten wurden am Tag der Fusion begutachtet, um sicher zu gehen, dass sie frei von jeglicher sichtbaren Kontamination durch Bakterien oder Pilze waren.
4.2: Gewinnung von Milz-Zellen
Die Gewinnung von Milz-Zellen aus sowohl mit dem MAM-HBsAg als auch mit dem NP-HBsAg immunisierten Mäusen wurde mit einem ähnlichen Verfahren durchgeführt.
Die Milz wurde sorgfältig aus der frisch getöteten Maus entnommen und in eine 5 ml kaltes Komplett-Medium enthaltende Petrischale gelegt. Die Milz wurde sorgfältig mit der stumpfen Seite einer Skalpell-Klinge zerlegt, wodurch die Zellen vom Bindegewebe der Milz abgelöst wurden. Die Zellsuspension wurde dann in einen sterilen Universalbehälter überführt und die Zelltrümmer sich auf den Boden absetzen gelassen. Der Überstand wurde sorgfältig entfernt und die Zellen bei 150 g 10 Minuten lang pelletiert. Die Zellen wurden 3 Mal in 10 ml Mangelmedium gewaschen und das am Ende anfallende Zellpellet in 10 ml Mangelmedium resuspendiert. Die Ausbeute und Lebensfähigkeit der Milzzellen wurde mit Hilfe einer Neubauer-Kammer ermittelt. Aus der NP-Milz wurden ungefähr 7 × 10⁷ Zellen gewonnen während 10 × 10⁷ Zellen aus der ersten MAM-Milz und 2,5 × 10⁷ Zellen aus der zweiten MAM-Milz erhalten wurden.
4.3: Zellfusion
Die Splenozyten wurden mit den Myelomzellen im Verhältnis 4:1 vermischt und das Gemisch bei 1500 g 10 Minuten lang zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt und am Boden des Behälters blieb ein trockenes Zellpellet zurück. Dieses wurde in ein Wasserbad von 37°C gegeben. Im Wasserbad von 37°C wurde auch Polyethylenglykol 1540 (PEG) erwärmt, welches zuvor durch Autoklavieren sterilisiert worden war. Das Zellpellet am Boden des Behälters wurde aufgelockert und unter leichtem Rühren 1 ml der PEG-Lösung tropfenweise zugegeben. Das Gemisch aus Zellen/PEG wurde eine Minute lang bei 37°C belassen und dann wurden zusätzliche 2 ml des warmen Mangelmediums zugegeben. Langsam wurde weiteres Mangelmedium zugegeben, so dass sich das Volumen jede Minute verdoppelte bis 25 ml Mangelmedium zugegeben worden waren. Die fusionierten Zellen wurden sodann bei 1500 g 10 Minuten lang zentrifugiert und das Pellet in 10 ml HAT-Medium resuspendiert. Die Zellsuspension wurde gleichmäßig über 5 Platten von Feeder-Zellen verteilt und dann in einen CO₂-Inkubator gegeben.
4.4: Kultur der Hybridzellen
Nach etwa einer Woche erschienen Cluster von wachsenden fusionierten Zellen. Auf dieser Stufe wurden den Zellen wieder Nährstoffe zugeführt, indem 100 μl des alten Mediums durch frisches HAT-Medium ersetzt wurden. Ungefähr 14 Tage nach der Fusion wurden 100 μl der überstehenden Flüssigkeit aus jedem Well, wo erfolgreich fusionierte Zellcluster gefunden wurden, entfernt und auf das Vorkommen von Anti-HBs hin untersucht. Der Überstand wurde durch Hypoxanthin und Thymidin enthaltendes Komplettmedium (HAT-Medium – siehe Reagenzien) ersetzt.
4.5: Reverser Capture-RIA zum Nachweis von Anti-HBs ausscheidenden Hybridomen
Der Überstand von lebensfähigen Hybridom-Kulturen wurde auf Grundlage eines reversen Capture-RIA auf Anti-HBs hin getestet.
Rundboden-Nunc-Wells wurden mit 100 μl der in Tris-Puffer 1:1000 verdünnten IgG-Fraktion von Kaninchen-Anti-Maus-IgG beschichtet. Nach zwei Tagen bei Raumtemperatur wurden die Wells mit Tween-Saline gewaschen und 1 Stunde mit Rinderserum-Albumin in Tris-Puffer (Tris-BSA-Puffer – siehe Reagenzien) gequencht. Die Wells wurden dann verschlossen und feucht bei 4°C aufbewahrt.
Vor Ausführung des Assays wurde der Tris-Puffer entfernt. 100 μl des in Phosphatgepufferter Saline 1:10 verdünnten Überstands aus jedem Well, wo erfolgreich fusionierte Cluster gefunden wurden, wurden zu den Assay-Wells gegeben und bei 37°C 1 Stunde lang inkubiert. Nach dem Waschen wurden 100 μl gereinigtes ¹²⁵I-Wildtyp-HBsAg zugegeben und in einer feuchten Box über Nacht bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Assay-Wells wurden sodann gewaschen und die gebundene Aktivität in einem Gammazähler mit 16 Kanälen gemessen. Der das Anti-HBs enthaltende Überstand zeigte eine vermehrte Bindung des Markers. Die Hybridome wurden danach erneut mit demselben Assay unter Einsatz eines ¹²⁵I-MAM- und ¹²⁵I-NP-Markers an Strelle des ¹²⁵I-Wildtyp-HBsAg getestet. In jedem durchgeführten Assay waren positive und negative Kontrollen enthalten. Die eingesetzten positiven Kontrollen waren die gegen das Wildtyp-HBsAg erzeugten monokionale D2H5 und H3F5. Als negative Kontrollen wurden ein monoklonales Anti-HIV-Gag-3C3F2 und Phosphat-gepufferte Saline benutzt.
Aus den Ergebnissen des Assays wurden für ein weiteres Screening und Klonieren elterliche Wells ausgewählt, welche Anti-HBs ausscheidende Kolonien enthielten.
Wenn die Zellen gut wuchsen wurden sie mit Hilfe einer Pasteur-Pipette aus Glas abgesaugt und aseptisch auf sterile 24 Well-Platten übertragen, welche eine Schicht aus peritonealen Exsudat-Zellen (PEC) der Maus in HAT-Medium enthielten.
4.6: Klonieren mittels eingeschränkter Verdünnung
Die als Anti-HBs-positiv identifizierten Hybridome wurden mittels eingeschränkter Verdünnung kloniert. Dies geschieht, um sicher zu gehen, dass der sekretierte Antikörper homogen und monospezifisch ist. Für jede Hybridkultur wurde das Volumen einer 100 Zellen enthaltenden Zellsuspension berechnet und dieses Volumen zu 10 ml Komplettmedium gegeben. Zu jedem der 48 Wells einer 96 Well-Platte, welche Feeder-Zellen in Komplettmedium enthielten, wurden 100 μl dieser Zellsuspension gegeben. 100 weitere Zellen wurden den restlichen 5 ml Komplettmedium zugesetzt und 100 μl dieser konzentrierteren Zellsuspension wurden zu 24 Wells der Platte gegeben. Schließlich wurden 100 weitere Zellen der restlichen Zellsuspension zugesetzt und diese über die letzten 24 Wells verteilt. Eine Variation in der Konzentration der Zellen auf jeder Platte berücksichtigte ungenaue Zellzählungen und eine geringe Lebensfähigkeit von einigen Kulturen. Dieser Vorgang wurde für jedes ausgesuchte elterliche Hybridom wiederholt.
Ungefähr 5 Tage nach dem Klonieren wurden die Platten auf Wells hin untersucht, wo nur eine einzige Kolonie zu erkennen war. Aus diesen Wells wurden 100 μl Überstand entfernt und unter Einsatz des zuvor beschriebenen reversen Capture-Assays erneut auf Anti-HBs hin getestet.
Die Anti-HBs sekretierenden Klone wurden dann wie zuvor expandiert und nach Bedarf erneut mit Nährstoffen versehen, indem 100 μl des Überstands der Gewebekultur entfernt und durch frisches Komplettmedium ersetzt wurden.
4.7: Kultur der Hybrid-Klone
Waren die Kolonien erst einmal groß genug, um das Well zu bedecken, werden sie in Feeder-Zellen enthaltende Gewebekulturkolben von 12 cm² expandiert und dann weiter in Kolben von 25 cm² und 75 cm². Die Zellen wurden ungefähr alle 2 bis 3 Tage mit frischem Komplettmedium 1:2 aufgeteilt.
Hatte sich erst einmal gutes Wachstum eingestellt, wurden einige der Zellen eingefroren und unter flüssigem Stickstoff in mit 10% Dimethylsulfoxid und 50% fötalem Kalbsserum supplementiertem Mangelmedium aufbewahrt.
4.8: Produktion von Aszites-Flüssigkeit
12 bis 20 Wochen alte weibliche Balb/c-Mäuse wurden mit 0,5 ml Pristan geprimt. 1 bis 4 Wochen nach dem Priming wurde 1 ml von in Mangelmedium resuspendierten geklonten Hybridomzellen intraperitoneal injiziert. 1 bis 3 Wochen später wurde die Aszites-Flüssigkeit abgesaugt und mittels Zentrifugation bei 3000 g über einen Zeitraum von 10 Minuten von den Zellen abgetrennt. Die Aszites-Flüssigkeit wurde dann bei –20°C aufbewahrt.
II. CHARAKTERISIERUNG DER GEGEN WILDTYP- UND MUTANTES HBsAg ERZEUGTEN MONOKLONALEN ANTIKÖRPER
1: Isotypisierung der monoklonalen Antikörper
Das Isotypisieren der monoklonalen Antikörper erfolgte mit Hilfe eines Kits von Serotec (Serotech Limited, 22 Bankside Station Approach, Kiskington, Oxford OX5 1BR), welcher speziell konzipiert wurde, um die Klasse und Subklasse von monoklonalen Antikörpern in Gewebekultur-Überständen zu identifizieren. Wurde er nach den Empfehlungen des Herstellers eingesetzt, charakterisierte er leicht den monoklonalen Antikörper der Maus.
2: Elektrophorese des Serumproteins
Die Aszites-Flüssigkeit von jedem Klon wurde mittels der Serumprotein-Elektrophorese (SPE, Paragon Elektrophoresis System, Beckman Ltd.) auf das Vorkommen einer moniklonalen Proteinbande hin getestet. Der zur Verfügung gestellten Vorschrift folgend identifizierte der Kit gewöhnlich solche Aszites-Flüssigkeiten, die hohe Titer an monokklonalem Immunprotein aufwiesen.
Der Paragon-Serumprotein-Elektrophorese-Kit soll die elektophoretische Auftrennung von Proteinen in einem gepufferten Agarosegel durchführen. Nach der Elektrophorese waren die Proteine in dem Gel in einer Fixierlösung immobilisiert und das Gel trocknete zu einem Film. Durch Anfärben des Films mit einem Protein-spezifischen Färbemittel wurde das Protein-Muster sichtbar gemacht und visuell interpretiert.
3: Gewinnung von Immunglobulin G
Immunglobulin G wurde aus den verschiedenen Aszites-Flüssigkeiten mittels Ionenaustauscherchromatographie gewonnen.
Vorgequollen geliefertes DE52-Gel (Whatman Ltd.) wurde in einem 0,2 M Phosphatpuffer pH 8,0 resuspendiert. Das Gel wurde dann in destilliertem Wasser dispergiert, um eine Pufferstärke von 10 mM zu erhalten.
Eine K9-Säule (Pharmacia) wurde mit dem DE52-Gel gepackt, so dass sich ein Volumenverhältnis Gel/Probe von 5:1 einstellte. Alle Säulen wurden mit einem gleichen Volumen von 10 mM Phosphatpuffer (PB – siehe Reagenzien) äquilibriert. Nach einer Dialyse über Nacht bei 4°C in 10 mM PB wurde die Probe oben auf die Säulen aufgetragen und 30 Minuten lang absorbieren gelassen.
Das Immunglobulin G aus der Aszites-Flüssigkeit wurde mittels schrittweiser Elution mit 10 mM, 30 mM und 60 mM PB wieder gewonnen. Jeder Puffer wurde über die Säule laufen gelassen und die optische Dichte des Elutionsmittels bei 280 nm angezeigt und aufgezeichnet (Ultra Violet Spectrophotmetre, LKB Ltd.). Die drei verschiedenen Elutionsmittel wurden getrennt gesammelt und in einem reversen Capture-RIA auf Anti-HBs Aktivität hin untersucht. Das Elutionsmittel, das die meiste Anti-HBs-Raktivität enthielt, konnte identifiziet werden.
Die Proteinkonzentrationen des IgG der Aszites-Flüssigkeit wurden berechnet, indem unter Verwendung eines E 1% 1 cm-Werts von 1,4 in einem Spektralphotometer ihre Extinktion bei 280 nm bestimmt wurde.
3: Gewinnung von Immunglobulin A
Wie IgG wurde Immunglobulin A mit Hilfe der Ionenaustauscherchromatographie gewonnen. Die Auftrennung erfolgte jedoch auf einem Sephacryl-Gel. Wie bei DE52 wurde das Gel mit einem 10 mM Phosphatpuffer äquilibriert. Die Probe wurde oben auf die Säule aufgetragen und 30 Minuten lang absorbieren gelassen. Wie zuvor wurde die Aszites-Flüssigkeit durch schrittweise Elution aufgetrennt. Das Elutionsmittel wurde angezeigt und dann auf Anti-HBs-Reaktivität hin getestet.
5; Verfahren der radioaktiven Markierung
Das Markieren der Immunglobulin-Fraktionen erfolgte mit der Indogen-Methode (Salacinski et al., 1979).
Saubere Glasröhrchen von 7,5 × 10 cm wurden am Anfang mit 5 μg Chloroform beschichtet. Zu den Indogen-Röhrchen wurden 15 μg Protein in PBS gegeben. Schließlich wurde Na ¹²⁵I (0,5 mCi, Amersham International PIc) zugesetzt und die Reaktion in dem Röhrchen 10 Minuten lang auf Eis fortschreiten gelassen. Das Indogen wirkt für das Na ¹²⁵I als mildes oxidierendes Agens, das dieses auf dem Protein an einen Tyrosinrest bindet.
Eine K9-Säule wurde dann mit Sephadex G-25 gepackt und in Tris-BSA-Puffer äquilibriert. Zu der G-25-Säule wurde nicht radioaktives Iodid (KI/NaI) in PBS gegeben, da dieses die Neigung von freiem ¹²⁵I verringerte, auf der Säule hängen zu bleiben. Das Reaktionsgemisch wurde sodann aus dem Röhrchen entnommen und auf die Säule übertragen. Der Tris-BSA-Puffer wurde dann zum Eluieren verwendet und das Elutionsmittel auf Radioaktivität hin überprüft. Die mit ¹²⁵I markierte Proteinfraktion aus dem ersten Peak wurde gesammelt und gestoppt, als der Peak abzunehmen begann. Das markierte Protein wurde dann bei 4°C in 5% BSA enthaltendem Tris-Saline-Puffer aufbewahrt.
Mit der Elution wurde fortgefahren, bis freies ¹²⁵I austrat (d. h. der zweite Peak). Die Höhe dieses Peaks ergab im Vergleich mit der Höhe des ersten Peaks eine Abschätzung des Prozentgehalts an gebundenem ¹²⁵I.
III. ERGEBNISSE
1: Patienten
Die Seren aus den beiden Patienten MAM und NP wurden in einer Reihe von Assays auf HBsAg getestet. Die Ergebnisse des Vergleichs der auf monoklonalen und polyklonalen Antikörpern basierenden Verfahren sind unten in Tabelle 1 wiedergegeben. Tabelle 1: HBsAg-Assay-Nachweis: ein Vergleich

Patient Assay 1 Assay 2 Assay 3 Assay 4 Assay 5

NP + – + + +

MAM + – + nb nb
Schlüssel zu Tabelle 1:

Assay I Reverser passiver Hämagglutinations-Assay.
Assay II Auf monoklonalen Antikörpern basierender Assay.
Assay III Mischung von auf monoklonalen/polyklonalen Antikörpern basierenden Assays.
Assay IV Mischung von auf monoklonalen/polyklonalen Antikörpern basierenden Assays.
Assay V Auf monoklonalen Antikörpern basierender Assay.

Die Ergebnisse aus der Sequenzierung ergaben einige Punktmutationen in der "a"-Determinante von beiden Patienten. Mutationen wurden in der aus Patient NP amplifizierten HBV-DNA (Subtyp ayw) an Oberflächen-Antigen-Codons gefunden, welche die Aminosäuren 133, 134 und 144 codieren. Mutationen wurden an Codons gefunden, welche die Aminosäuren 133, 134, 142, 144 und 145 in aus Patient MAM amplifizierter HBV-DNA codieren (Subtyp adr). Solche Mutationen wurden sowohl vor als auch nach der Transplantation nachgewiesen. Die Sequenzen unterschieden sich nicht zwischen der Zeitspanne, wenn HBsAg mit auf polyklonalen Antikörpern basierenden Assays allein nachweisbar war im Vergleich mit der Zeit, wenn HBsAg mit sowohl auf monoklonalen Antikörpern als auch auf polyklonalen Antikörpern basierenden Assays nachweisbar war. Die Mutationen sind in Tabelle 2 wiedergegeben.

MAM-HBsAg ist die Mutante HBsAg I und NP-HBsAg ist die Mutante HBsAg II. Die vollständige Aminosäuresequenz von HBsAg und die das HBsAg codierende vollständige Nucleinsäuresequenz sind bei Valenzuela et al. (1979) angegeben. Tabelle 2: In der "a"-Determinante des HBsAg von Patient MAM und NP nachgewiesene Mutanten

Patient	Codon	Wildtyp-Codon	Wildtyp-Aminosäure	mutantes Codon	Mutante Aminosäure
NP	133	ATG	Methionin	ATT	Isoleucin
	134	TAT	Phenylalanin	CAT	Histidin
	144	GAT	Asparagisäure	GTC	Valin
MAM	133	ATG	Methionin	ATC	Isoleucin
	134	TAT	Phenylalanin	AAT	Asparagin
	142	CCT	Prolin	AGT	Serin
	143	TCG	Serin	TTG	Leucin
	145	GGA	Glycin	AAA	Lysin

2: Identifizierung und Verteilung der Ausscheidung von monoklonalen Anti-HBs-Antikörpern
Die Anti-HBs ausscheidenden Hybridome wurden am Anfang mit Hilfe des reversen Capture-Assays identifiziert (siehe Abschnitt II, 4.5). Ungefähr eine Woche nach der Fusion wurden alle Wells, die Cluster von wachsenden Zellen enthielten, auf Anti-HBs-Aktivität hin untersucht. Jeder durchgeführte Assay umfasste sowohl negative als auch positive Kontrollen.
Die aus der MAM-Fusion hervorgehenden Zellen wurden in dem RIA im ersten Fall mit dem ¹²⁵I-MAM-HBsAg getestet, während diejenigen aus der NP-Fusion mit dem ¹²⁵I-NP-HBsAg getestet wurden. Die Ergebnisse des Assays würden einen Hinweis auf solche Klone geben, die Antikörper gegen ihre entsprechenden Oberflächenantigene produzierten.
Hybridome mit Counts über 700 Cpm wurden als positiv angesehen. Es wurde gezeigt, dass von den 320 getesteten MAM-Klonen 10% positiv waren, während gefunden wurde, dass 8% der 200 NP-Klone positiv waren.
Um auf irgendeine Reaktivität gegen das Wildtyp (WT)-HBsAg hin zu überprüfen, wurden Klone aus sowohl den NP- als auch den MAM-Fusionen, unbeachtet ihrer positiven Ergebnisse in dem früheren Assay, in dem reversen Capture-RIA unter Verwendung eines ¹²⁵I-WT-HBsAg-Markers getestet. Wie zuvor wurde ein positives Ergebnis durch eine vermehrte Bindung des Markers angezeigt. Hybridome mit Counts über 650 Cpm wurden als positiv angesehen. Von den 320 untersuchten MAM-Klonen lieferten 6% positive Ergebnisse, während gefunden wurde, dass 4% der NP-Klone sich an das ¹²⁵I-WT-HBsAg banden.
Mit den bis dahin erhaltenen Ergebnissen war es möglich, solche Klone zu identifizieren, die Anti-HBs ausschieden, das spezifisch entweder das MAM-, NP- oder WT-Hepatitis B-Oberflächenantigen erkannte und sich daher an diese band.
Um zu ermitteln, ob es irgendwelche Kreuzreaktivität innerhalb dieser Hybridome gab, wurden die NP-Klone mit dem ¹²⁵I-MAM-HBsAg und die MAM-Klone mit dem ¹²⁵I-NP-HBsAg getestet. Es wurde gefunden, dass 4 der MAM-Klone den NP-Marker erkannten, während 5 der NP-Klone vom MAM-Marker erkannt wurden.
Die Klone waren dann mit allen Kombinationen von Markern getestet worden. Es war daher möglich, solche Hybridome zu identifizieren, die ständig starke positive Ergebnisse lieferten, sei es mit ¹²⁵I-MAM-, ¹²⁵I-NP oder ¹²⁵I-WT-HBsAg. Die monoklonalen Antikörper ließen sich nun in die folgenden Kategorien einteilen: 1) MAM-spezifisch; 2) NP-spezifisch; 3) MAM/NP-spezifisch; 4) MAM/WT-spezifisch; 5) NP/WT-spezifisch; 6) NP/WT/MAM-spezifisch.
Es wurden 8 NP- und 10 MAM-Elternhybridome ausgewählt, von denen jedes unter eine der oben angeführten Kategorien fiel. Diese Hybridome wurden ausgewählt, weil sie sowohl gutes Zellwachstum zeigten als auch wiederholt positiv waren, wenn sie auf ihre Anti-HBs-Aktivität hin getestet wurden.
Die 18 ausgesuchten Hybridome wurden dann mittels der eingeschränkten Verdünnung kloniert. Ungefähr 14 Tage nach dem Klonieren wurden die Wells, welche einzelne Kolonien enthielten, im reversen Capture-Assay mit allen drei Markern getestet. 6 der 8 NP-Hybridome wurden erfolgreich kloniert und es wurde gefunden, dass sie für eine Anti-HBs-Aktivität noch positiv waren.
Bei den MAM-Klonen wurde jedoch gefunden, dass sich nur 6 der 19 ausgewählten Hybridome klonieren ließen. Versuche, die Hybridome von ihren jeweiligen Elternkolonien erneut zu klonieren, erwiesen sich trotz einer Erhöhung der zu jeder Platte gegebenen Zell-Konzentration als erfolglos. Die 6 erfolgreich klonierten Hybridome, welche einzelne Kolonien enthielten, wurden auf ihre Anti-HBs-Aktivität hin getestet. Von den 6 Hybridomen wurde gefunden, dass zwei Hybridome, M3C9 und M3A10, beide Dreifachkreuzungen, für Anti-HBs noch positiv waren. Die von der MAM-Fusion abstammenden Hybridome erwiesen sich bei ihrer Passage als äußerst instabil.
Aus jedem Hybridom wurden für eine Expansion mindestens drei positive Klone ausgewählt. Die Klone wurden in Kultur vermehrt und zwei Wochen später erneut getestet. Alle NP-Klone waren für eine Sekretion von Anti-HBs immer noch positiv. Unter den MAM-Klonen hatte sich M3C9 jedoch auch als äußerst instabil erwiesen und zeigte im RIA negative Ergebnisse.

Die am Ende positiv sekretierenden Hybridome von jeder Fusion sind unten in Tabelle 3 wiedergegeben. Die Tabelle zeigt auch die monoklonale Antikörper-Spezifität und ihre auf die am nächsten liegenden 500 Cpm aufgerundeten RIA-Werte. Tabelle 3: Aus einer NP- und einer MAM-Fusion stammende Klone mit ihrer jeweiligen Spezifität und ihren RIA-Werten

Klon	Bindung des WT	¹²⁵I-MAM	HBsAg (Cpm) NP	Spezifität des Klons
*P2D3	4000	6000	3500	WT/NP/MAM-Kreuzung
P2C6	neg.	5000	3000	NP/MAM-Kreuzung
P2H6	2000	neg.	11000	NP/WT-Kreuzung
P2H9	neg.	neg.	1000	nur NP
P4C11	neg.	neg.	10000	nur NP
P3E4	1000	neg.	10000	NP/WT-Kreuzung
*M3A10	3000	5000	2500	WT/NP/MAM-Kreuzung
Kontrolle D2H5	7000	neg.	2000	WT/NP-Kreuzung
Kontrolle H3F5	6000	1000	neg.	WT/MAM-Kreuzung

Wobei P die von der NP-Fusion stammenden Hybridome und M die von der MAM-Fusion stammenden Hybridome bezeichnen.

* bedeutet Dreifachkreuzungen.

Es wurde eine zweite MAM-Fusion durchgeführt. Die Fusion wurde wie oben beschrieben durchgeführt. Die Ausbeute an Milzzellen betrug jedoch nur 25% von der bei der ursprünglichen MAM-Fusion aufgezeichneten. Ungefähr eine Woche später wurden alle Wells, die Cluster von wachsenden Zellen enthielten, mittels des reversen Capture-RIA auf Anti-HBs_Aktivität hin getestet. Wie zuvor enthielt jeder durchgeführte Assay eine negative und positive Kontrolle. Alle aus der Fusion hervorgegangenen Zellen wurden mit jedem der Marker ¹²⁵I-MAM-HBsAg, ¹²⁵I-NP-HBsAg und ¹²⁵I-WT-HBsAg getestet.

Von den 68 getesteten Klonen lieferten nur drei positive Ergebnisse. Es wurde gefunden, dass ein Klon MAM-spezifisch war, während gefunden wurde, dass die anderen beiden, M4H2 und M4F5, WT/NP/MAM-Kreuzungen waren (Tabelle 4). Wie unten genauer beschrieben, erwies sich M4H2 wie einige der Hybridome aus der ersten MAM-Fusion als instabil. Es stabilisierte sich eventuell als ein MAM-spezifischer Klon. Tabelle 4: Von der zweiten MAN-Fusion stammende Klone mit ihrer jeweiligen Spezifität und ihren RIA-Werten

Klon	Bindung des WT	¹²⁵I-MAM	HBsAg (Cpm) NP	Spezifität des Klons
M4B12	neg.	7000	neg.	nur MAM
**M4H2	9000	8000	1500	WT/NP/MAM-Kreuzung
*M4F5	10000	9000	10000	WT/NP/MAM-Kreuzung
Kontrolle D2H5	10000	neg.	2000	WT/NP-Kreuzung
KontrolleH3H5	10000	7000	neg.	WT/MAM-Kreuzung

** Anfangs gefunden, dass es sich um eine Dreifachkreuzung handelt, später wurde jedoch gefunden, dass er instabil ist und sich in einen MAM-spezifischen Klon verwandelte, siehe weiter unten.

Alle drei Hybridome zeigten gutes Zellwachstum und wurden mittels eingeschränkter Verdünnung geklont. Das bei dieser Gelegenheit durchgeführte Klonen erwies sich als erfolgreich und alle einzelne Kolonien enthaltende Wells wurden mittels eines reversen Capture-RIA mit allen drei Markern untersucht. Es wurde gefunden, dass die Klone für Anti-HBs-Aktivität noch positiv waren.
Es wurden fünf positive Klone für die Expansion ausgesucht. Nach weiterem Wachstum in Kultur wurden die Klone gescreent und es wurde gefunden, dass sie für eine Anti-HBs-Aktivität noch positiv waren.

Die am Ende erhaltene Zahl an positiven Elternhybridomen und ihre aus der NP-Fusion und den beiden MAM-Fusionen erhaltene Antikörper-Spezifität und Kreuzreaktivität sind in Tabelle 5 wiedergegeben. Tabelle 5: Am Ende erhaltene Anzahl der Klone mit ihren jeweiligen Spezifitäten und RIA-Werten.

Klon	Bindung des WT	¹²⁵I-MAM	HBsAg (Cpm) NP	Spezifität des Klons
*P2D3	4000	6000	3500	WT/NP/MAM-Kreuzung
P2C6	neg.	5000	3000	NP/MAM-Kreuzung
P2H6	2000	neg.	11000	NP/WT-Kreuzung
P2H9	neg.	neg.	1000	nur NP
P4C11	neg.	neg.	10000	nur NP
P3E4	1000	neg.	10000	NP/WT-Kreuzung
*M3A10	3000	5000	2500	WT/NP/MAM-Kreuzung
M4B12	neg.	7000	neg.	nur MAM
*M4F5	10000	9000	10000	WT/NP/MAM-Kreuzung
Kontrolle D2H5	10000	neg.	2000	WT/NP-Kreuzung
Kontrolle H3F5	10000	7000	neg.	WT/MAM-Kreuzung

* bedeutet Dreifachkreuzung.
** Anfangs gefunden, dass es sich um eine Dreifachkreuzung handelt, später wurde jedoch gefunden, dass er instabil ist und sich in einen MAM-spezifischen Klon verwandelte, siehe weiter unten.

Unter Einsatz der Antikörper P2D3, M4F5 und M3A10 mit WT-, NP- und MAM-HBsAg wurden weitere Kreuzkonkurrenz-Untersuchungen durchgeführt. Jeder dieser Antikörper trat in Kreuzkonkurrenz mit jedem anderen, trat aber nicht in Kreuzkonkurrenz mit irgendeinem der anderen erzeugten monoklonalen Antikörper. Zu diesem Zeitpunkt schien M4H2 immer noch eine Dreifachkreuzung zu sein.
Diese Ergebnisse zeigen ferner, dass sich die monoklonalen Antikörper der Erfindung an bestimmte Epitope binden.
Ein positiver Klon aus jedem Elternhybridom wurde ausgewählt und in eine zuvor mit Pristan geprimte Balb/c-Maus injiziert. Ein bis drei Wochen nach der intraperitonealen Inokulation wurde die Aszites-Flüssigkeit aus der Mäusen gesammelt. Alle Klone riefen in den Mäusen erfolgreich Aszites-Tumoren hervor. Die Menge der aus jeder Maus erhaltenen Aszites-Flüssigkeit variierte von 1 ml bis 5 ml.
Unter Einsatz mehrerer verschiedener Antikörper, jeweils mit WT-, MAM- und NP-HBsAg wurden ausgedehntere Kreuzkonkurrenz-Untersuchungen durchgeführt. Diese Tests wurden nach der oben beschriebenen Vorschrift für einen reversen Capture-RIA mit den folgenden Abwandlungen durchgeführt: Die Mikrowells wurden mit einem polyklonalen Anti-HBs-Antikörper der Ziege beschichtet. In jedem Falle wurden 100 μl des Antigens zugegeben und über Nacht inkubiert, sodann wurden jeweils 50 μl an ¹²⁵I-markiertem und unmarkiertem monoklonalen Antikörper zugegeben und ihre Bindung bestimmt. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 6a, 6b und 6c wiedergegeben. In diesen Tabellen sind die markierten Antikörper horizontal und die unmarkierten Antikörper vertikal aufgeführt.
Die in den Tabellen 6a, 6b und 6c gezeigten Ergebnisse bestätigen, dass die Antikörper M4F5 und P2D3 mit Dreifachkreuzung sich an ein gemeinsames Epitop binden.
Vorher wurde gefunden, dass M3A10 ein Antikörper mit Dreufachkreuzung ist (siehe Tabelle 4). Die Tatsache, dass er ein IgA-Antikörper ist (siehe Abschnitt III.4 unten) kann die in Tabelle 6a gezeigten schwachen Bindungsergebnisse erklären, da diese Klasse von Antikörpern (IgA) schwierig zu reinigen ist.
Wie oben gezeigt, wurde anfangs gefunden, dass das Hybridom M4H2, welches in der zweiten MAM-Fusion erzeugt worden war, eine Dreifachkreuzung ist (siehe Tabelle 4). Nach weiterem Wachstum in Kultur zeigte jedoch dieses Hybridom eine schwacher werdende Bindung an ¹²⁵I-WT-HBsAg und ¹²⁵I-NP-HBsAg. Erneute Tests auf Anti-HBs-Aktivität gegen das WT- und NP-HBsAg über einen Zeitraum ergaben negative Ergebnisse. M4H2 erkannte jedoch weiterhin das ¹²⁵I-MAM-HBsAg und hatten eine starke Bindung daran. Es scheint daher, dass die Klon-Spezifität anfangs instabil war und es sich mit der Zeit zu einem MAM-spezifische Antikörper ausscheidenden Hybridom entwickelt hat.

Die Bindung von ¹²⁵I-markierten Antikörpern an zahlreiche unterschiedliche HBsAgs wurde mit einem RIA gemessen, in welchem das HBsAg an die Festphase (Mikrowells) über ein Anti-HBs der Ziege immobilisiert war, mit welchem die Mikrowells beschichtet waren. Die eingesetzten HBsAgs waren WT-, MAM- und NP-HBsAg. SP-HBsAg, das vom Serotyp adw ist, weist in dem Codon für die Aminosäure 143 eine Mutation auf, die einen Austausch des Ser durch Met zur Folge hat. Im SZ-HBsAg vom Serotyp adr führt eine Mutation zu einem Austausch von gly durch arg an der Position 145 (SP-HBsAg ist die Mutante HBsAg IV und SZ-HBsAg ist die Mutante HBsAg III). Als Kontrolle wurde ein Pool von normalem menschlichem Serum eingesetzt, der getestet worden ist und bei dem gefunden wurde, dass er keinen Hepatitis B-Marker (NHS) aufweist. Dies ist ein Beispiel für einen erfindungsgemäßen Immunassay. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 unten wiedergegeben. Tabelle 7

HBsAg	P2D3 (Dreifachkreuzungen)	% Bindung von M4F5	¹²⁵I-Anti-mutante mAb M4H2 (MAM-spezifisch)	P4C11 (NP-spezifisch)
WT	12	15	0,6	0,1
MAM	13	20	31	0,2
NP	10	12	0,2	10
SP	23	26	0,5	0,4
SZ	25	30	0,4	0,5
NHS	0,3	0,2	0,4	0,3

nt = nicht getestet

Diese Ergebnisse zeigen, dass die Antikörper aus Dreifachkreuzungen Wildtyp-HBsAg und auch HBsAg aus zahlreichen unterschiedlichen Mutanten nachweisen, einschließlich von mutantem HBsAg, das sich von dem zum Screening der Antikörper verwendeten unterscheidet. Diese Ergebnisse bestätigen ferner, dass die Antikörper aus Dreifachkreuzungen sich an ein Epitop binden, das dem Wiltyp-Protein und den mutanten Formen gemeinsam ist, und sie zeigen die Nützlichkeit der Antikörper in HBsAg-Assays.
Bei Verwendung solcher Antikörper ist es möglich, das Vorkommen von Escape-Mutanten nachzuweisen.
3: Isotypisierung von monoklonalen Antikörpern
Die Isotypisierung der monoklonalen Antikörper wurde mit Hilfe eines Kits von Serotec durchgeführt. Jedes Isotypisierungsmittel bestand aus einem gereinigten monoklonalen Antikörper der Ratte, der spezifisch war für eine einzige Klasse-Subklasse eines Immunglobulins und an rote Blutzellen des Schafes gekoppelt war. Die gekoppelten Antikörper der Ratte erkannten den Abschnitt mit der schweren Kette des Immunglobulins der Maus. Das Prinzip des Testsystems basierte auf der Agglutination von roten Zellen, wobei ein positives Ergebnis einer Agglutination erzielt wurde, wenn ein hoch spezifischer Antikörper den besonderen Isotyp erkannte und sich an ihn band, gegen den er gerichtet ist. Die Bindung bildete eine Gitteranordnung am Boden des Wells einer Mikrotiterplatte.
Ein negatives Ergebnis wurde erzielt, wenn die Reagenz-Zellen in einen Überstand gerieten, der eine Klasse von Antikörpern enthielt, welche sie nicht erkannten. Die Reagenz-Zellen fielen auf den Boden des Wells und bildeten einen kleinen "Knopf".
Der Isotyp der monoklonalen Antikörper ist in Tabelle 8 angegeben. Tabelle 8: Immunglobulin-Klassen der monoklonalen Antikörper

Monoklonaler Antikörper Immunglobulin-Klasse

P4C11 IgG1

P3E4 IgG1

*P2D3 IgG1

P2H6 IgG1

P2H9 IgG2

P2C6 IgGl

*M3A10 IgA

**M4H2 IgG1

M4B12 IgG1

*M4F5 IgG1

* Bezeichnet Dreifachkreuzungen
** Anfangs wurde gefunden, dass es eine Dreifachkreuzung war, aber später wurde gefunden, dass er instabil war und sich in einen MAM-spezifischen Klon verwandelte, siehe unten.

4: SPE-Analyse und Reinigung des Anti-HBs aus Aszites-Flüssigkeit
Das monoklonale Protein wurde in der Aszites-Flüssigkeit für alle Klone mittels Serumprotein-Elektrophorese nachgewiesen. Die elektophoretische Beweglichkeit der monoklonalen Proteinbande variierte leicht für jede unterschiedliche Aszites-Flüssigkeit, war aber für unterschiedliche Batches der aus demselben Klon erhaltenen Klon erhaltenen Aszites-Flüssigkeit identisch. Die Verschiedenheit im Migrationsabstand zwischen den Klonen war auf die unterschiedlichen Ionenladungen auf den monoklonalen Proteinen zurückzuführen. Die für die monoklonale SPE-Bande zu beobachtende Intensität der Färbung gab einen Hinweis auf die Menge an vorhandenem monoklonalen Protein. Diese variierte zwischen den von unterschiedlichen Klonen geernteten Aszites-Flüssigkeiten. Bei M4B12, dem MAM-spezifischen monoklonalen Antikörper, wurde jedoch keine SPE-Bande beobachtet. Wurde die wieder gewonnene Aszites-Flüssigkeit in dem RIA für Anti-HBs-Aktivität getestet, wurde ein negatives Ergebnis erhalten; alle anderen Aszites-Flüssigkeiten ergaben die erwarteten positiven Ergebnisse. Wie zuvor erwies sich der MAM-spezifische monoklonale Antikörper als instabil und wandelte sich von einem positiv zu einem negativ sekretierenden Hybridom. (Das M4B12 Elternhybridom ist seitdem erneut geklont worden und wird erneut getestet).
Die Gewinnung von Immunglobulin aus den Aszites-Flüssigkeiten wurde wie oben in den Abschnitten III,3 und III,4 beschrieben ausgeführt. Immunglobulin G wurde mittels Ionenaustauscherchromatographie auf DE52 gewonnen, während IgA auf einer Sephacryl-Säule abgetrennt wurde. Es wurden drei separate Proteinpeaks erhalten, wenn die Ionenstärke von 10 mM bis zu 30 mM und schließlich 60 mM PB für jede monoklonale Aszites-Flüssigkeit anstieg. Die Größe der Peaks variierte von eine monoklonalen Flüssigkeit zur anderen. Das Eluat wurde bei jedem Peak gesammelt. Die Anti-HBs-IgG/IgA in den unterschiedlichen Pufferkonzentrationen wurden sodann in dem reversen Capture-Assay mit ¹²⁵I-MAM-HBsAg, ¹²⁵I-NP-HBsAg und ¹²⁵I-WT-HBsAg gemessen. Der Assay gestattete die Durchführung eines direkten Vergleichs der Ergebnisse zwischen den unterschiedlichen Pufferfraktionen. Mit dem Assay war es möglich, die Fraktion auszuwählen, welche die höchste Anti-HBs-Aktivität aufwies. Die Proteinkonzentrationen der ausgewählten Fraktionen wurden ermittelt (Tabelle 9). Die aus jedem monoklonalen Antikörper erhaltene Menge an IgG/IgA variierte zwischen jedem Batch der geernteten Aszites-Flüssigkeit. Tabelle 9: Menge von aus 1 ml jeder monoklonalen Aszites-Flüssigkeit gewonnenem IgG/IgA

Monoklonaler Antikörper Menge an IgG/IgA aus 1 ml Aszites-Flüssigkeit (mg/ml)

P4C11 4,00

P3E4 4,40

*P2D3 1,14

P2H6 2,40

P2H9 0,90

P2C6 3,00

*M4F5 1,00

**M4H2 1,70

*M3A10 2,00

Die Intensität der Färbung der monoklonalen Bande in der SPE zeigte eine starke positive Korrelation mit den Ergebnissen für die Proteinkonzentration in Tabelle 7. P4C11 zeigte z. B. in der SPE eine sehr dunkel gefärbte Bande und wies eine hohe Proteinkonzentration auf, während P2H9 eine schwach gefärbte Bande zeigte und eine niedrige Proteinkonzentration hatte.
ALLGEMEINE DISKUSSION
Die Ergebnisse der Assays zum Nachweis von HBsAg haben bestätigt, dass sich in Folge von Mutationen das HBsAg im Serum von einigen Systemen auf Basis monoklonaler Antikörper nicht nachweisen lässt. Derartige Mutationen können dafür sorgen, dass entweder der Capture-Antikörper fehlt oder sich der konjugierte Antikörper für den Nachweis nicht bindet. Diese Ergebnisse zeigen wie wichtig es ist, bei vermuteten Fällen von HBV-Infektionen einen zweiten Marker zu testen, wenn der anfängliche Screening-Test auf HBsAg negativ ist. Sowohl NP als auch MAM hätten lediglich ein Anti-HBc-Profil gezeigt, falls sie mit einem auf monoklonalen Antikörpern basierenden Assay auf HBsAg hin getestet worden wären. Das Vorliegen des HBsAg in den Proben wurde beim Testen mit auf polyklonalen Antikörpern basierenden Systemen entdeckt.
Im Patienten MAM wurde eine Mutation an der Aminosäure-Position 145 (Glycin zu Lysin) nachgewiesen. Obwohl sich diese Mutation von der zuvor bei Impfstoff-Escape-Mutanten beschriebenen unterschied (Glycin zu Arginin), war die Substitution der Aminosäure so, dass die vorausgesagte Wirkung auf die Antigenstruktur ähnlich war.
Patient NP wies am Codon 145 keine Mutation auf, aber wie Patient MAM Mehrfachmutationen. Welche der Mutationen für den Verlust der Nachweisbarkeit verantwortlich ist, ist nicht ermittelt worden. Interessanterweise variierten im Patienten MAM die Nucleotidsequenzen nicht mit einer Änderung der HBsAg-Spezifität in den HBsAg-Assays. Dies kann auf das Auftauchen von Wildtyp-Viren zurückzuführen sein, die mit weniger als 15–20% des gesamten Virusbefalls vorkommen, der Nachweisgrenze mit einer direkten Sequenzanalyse.
Die Produktion von monoklonalen Antikörpern gegen die mutanten Hepatitis B-Oberflächenantigene war erfolgreich. Die Anzahl der in NP und der anfänglichen MAM-Fusion produzierten Klone sowie die relative Verteilung der Spezifitäten der erhaltenen Antikörper waren befriedigend. Um Anti-HBs ausscheidende Hybridome zu identifizieren war ein empfindlicher aber schneller Screening-Assay nötig. Es wurde ein reverser Capture-Radioimmunassay gewählt. Obwohl der Assay einfach einzusetzen ist, ist er für einen sehr niedrigen Background und einen großen dynamischen Bereich befähigt. Die relativen Bindungen der markierten Wildtyp-HBsAg und der mutanten HBsAg durch positive Klone waren eindeutig hoch und beständig und ergaben verlässliche Ergebnisse.
Das Screening der Hybridome wurde anfangs ausgeführt, indem die von der MAM-Fusion stammenden Klone mit ¹²⁵I-MAM.HBsAg und die NP-Klone mit ¹²⁵I-NP-HBsAg getestet wurden. Die Ergebnisse dieses Assays ergaben einen Hinweis auf spezifisch Anti-HBs produzierende Klone, welche das MAM-HBsAg oder das NP-HBsAg erkannten und sich somit an diese banden. Alle als Ergebnis dieser beiden Fusionen produzierten Klone wurden sodann mit ¹²⁵I-WT-HBsAg getestet. Kein einziger Klon reagierte positiv auf das WT-HBsAg allein. Es wurden entweder MAM/WT-Kreuzungen oder NP/WT-Kreuzungen gefunden.
Es war daher möglich, solche Klone zu identifizieren, welche das MAM-HBsAg oder das NP-HBsAg erkannten. Solche Klone, die sich auch an das NP- und WT-HBsAg banden, wurden ebenfalls identifiziert. Um auf irgendeine Kreuzreaktivität zwischen den Hybridomen zu testen, wurden die von der MAM-Fusion produzierten Klone mit ¹²⁵I-NP-HBsAg getestet und umgekehrt. Als Ergebnis der Screening-Assays war es möglich, die Klone, wie im Ergebnis-Abschnitt zusammengestellt, in Kategorien einzuteilen.
Die in dem Assay enthaltenen positiven Kontrollen waren zwei bekannte monoklonale WT-HBsAg-Antikörper. H3F5 und D2H5, während die negativen Kontrollen PBS und 3D3F2, ein monoklonaler Anti-HIV-Gag-Antikörper, waren. Wie erwartet lieferten sowohl H3F5 als auch D2H5, wenn sie im ¹²⁵I-WT-HBsAg-RIA eingesetzt wurden, stark positive Ergebnisse. Wurden sie jedoch gegen ¹²⁵I-MAM-HBsAg getestet, lieferte nur H3F5 ein positives Ergebnis und war negativ, wenn es mit ¹²⁵I-NP-HBsAg getesetet wurde. Dennoch produzierte D2H5 ein positives Signal mit ¹²⁵I-NP-HBsAg, war aber sehr schwach, wenn es gegen ¹²⁵I-MAM-HBsAg getestet wurde. Die Mutationen im MAM-HBsAg eliminierten das Epitop für D2H5, während solche im NP-HBsAg das H3F5-Epitop eliminierten.
Die beim Testen mit den mutanten SP- und SZ-HBsAg erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass die aus Dreifachkreuzungen stammenden Antikörper in der Lage sind, andere mutante Formen des HBsAg zusätzlich zu den im Screening-Verfahren verwendeten nachzuweisen. Dies bestätigt, dass die Antikörper sich an ein Epitop binden, das zwischen dem Wildtyp-Protein und den mutanten Formen konserviert ist, und es bestätigt dadurch, wie wertvoll es ist, solche Antikörper in einen HBsAg-Assay mit einzubeziehen.
Obwohl sich einige der Hybridome aus den MAM-Fusionen als instabil erwiesen, wurden erfolgreiche Dreifachkreuzungen leicht sowohl aus den MAM-Fusionen als auch den NP-Fusionen erhalten. Mutante Formen von anderen HBsAg als den MAM- und NP-Formen können eingesetzt werden, um monoklonale Antikörper nach den oben beschriebenen Vorschriften zu produzieren und/oder zu screenen.

Anmerkung: 1b ist eine maschinengeschriebene Version von 1a. Im Falle irgendeines Widerspruchs zwischen 1a und 1b soll 1a als die authentische Version herangezogen werden. Reagenzien

Komplettmedium		Mangelmedium
RPMI supplementiert mit		RPMA supplementiert
5 mM	HEPES-Puffer	mit 5 mM HEPES-Puffer
2 mM	L-Glutamin	2 nM L-Glutamin
0,05 M	2-Mercaptoethanol
20% v/v	fötales Kalbsserum
25 μg ml^–1	Fungizon
102 Einheiten ml^–1	Penicillin
100 μg ml^–1	Streptomycin

HAT-Medium	HT-Medium
Komplettmedium plus	Komplettmedium plus
5 × 10^–5 M Hypoxanthin	5 × 10^–3 M Hypoxanthin
2 × 10^–3 M Aminopterin	8 × 10^–4 M Thymidin
8 × 10^–4 M Thymidin

0,02 M Tris-Puffer pH 7,6 (Tris-Puffer)

Natriumazid	1,00 g
Tris(hydroxymethyl)methylamine	2,42 g
Destilliertes Wasser	900 ml

Einstellung mit konzentrierter HCl auf pH 7,6 und Auffüllen des Puffers auf 1 Liter.
0,02 M Tris-BSA-Puffer

Zugabe von 0,5% BSA zu 0,02 M Tris-Puffer pH 7,6

0,2 M Phosphatpuffer (PB)

Lösung A = 0,2 M KH₂PO₄
Lösung B = 0,2 M Na₂HPO₄
200 ml Lösung B werden mit Lösung A auf pH 8,0 eingestellt.

10, 20, 30 und 60 mM PB

Für 10 mM PB: Verdünnen von 0,2 M PB mit destilliertem Wasser 1:20
Für 30 mM PB: Verdünnen von 0,2 M PB mit destilliertem Wasser 1:6,6
Für 50 mM PB: Verdünnen von 0,2 M PB mit destilliertem Wasser 1:3,3

LITERATURVERZEICHNIS

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VALENZUELA et al. Nature 280: 815 (1979).

Claims

Monoklonaler Antikörper P2D3, hergestellt durch das als P2D3 bezeichnete und bei der ECACC unter der Zugangsnummer 97042331 hinterlegte Hybridoma, oder ein monoklonaler Antikörper, der mit dem monoklonalen Antikörper P2D3 um die Bindung an ein Wildtyp-Hepatitis-B-Oberflächenantigen, auch HBsAg genannt, und an zumindest zwei mutierte Formen von HBsAg kreuzkonkurriert, wobei die mutierten Formen von HBsAg eine Aminosäuresubstitution innerhalb der Sequenz, welche die Aminosäuren 133 bis 145 von HBsAg kodiert, relativ zum Wildtyp-HBsAg haben.
Monoklonaler Antikörper wie in Anspruch 1 beansprucht, wobei eine mutierte Form von HBsAg die Sequenz von HBsAg enthält, die in einer HBV-Escapemutante vorhanden ist.
Monoklonaler Antikörper wie in Anspruch 1 oder Anspruch 2 beansprucht, wobei die Aminosäuresubstitution aus einer Punktmutation resultiert.
Monoklonaler Antikörper wie in einem der Ansprüche 1 bis 3 beansprucht, wobei eine HBsAg-Mutante eine Aminosäuresubstitution an mehr als einer der Positionen 133, 134, 141, 142, 143, 144 und 145 relativ zum Wildtyp-HBsAg hat.
Monoklonaler Antikörper wie in einem der Ansprüche 1 bis 3 beansprucht, wobei die Substitution an einer oder mehreren der Stellen 143, 144 und 145 ist.
Monoklonaler Antikörper wie in Anspruch 1 beansprucht, der mit dem monoklonalen Antikörper P2D3 um die Bindung an ein Wildtyp-HBsAg und an zumindest zwei der folgenden mutierten Formen von HBsAg kreuzkonkurriert: Mutante HBsAg I, auch „NP"-HBsAg genannt: Untertyp ayw, Mutationen met zu ile an Aminosäure 133, phe zu his an Aminosäure 134 und asp zu val an Aminosäure 144, Mutant HBsAg II („MAM"-HBsAg): Untertyp adr, Mutationen met zu ile an Aminosäure 133, phe zu asn an Aminosäure 134, pro zu ser an Aminosäure 142, ser zu leu an Aminosäure 143 und gly zu lys an Aminosäure 145, Mutant HBsAg III, auch „SZ"-HBsAg genannt: Untertyp adr, Mutation gly zu arg an Aminosäure 145, Mutant HBsAg IV, auch „SP”-HBsAg genannt: Untertyp adw, Mutation ser zu met an Aminosäure 143.
Monoklonaler Antikörper wie in Anspruch 1 beansprucht, welcher der monoklonale Antikörper M3A10 ist, hergestellt durch das als M3A10 bezeichnete und bei der ECACC unter der Zugangsnummer ECACC 97042330 hinterlegte Hybridoma.
Monoklonaler Antikörper wie in Anspruch 1 beansprucht, welcher der monoklonale Antikörper M4F5 ist, hergestellt durch das als M4F5 bezeichnete und bei der ECACC unter der Zugangsnummer ECACC 97042519 hinterlegte Hybridoma.
Monoklonaler Antikörper wie in einem der Ansprüche 1 bis 8 beansprucht in humanisierter Form.
Ein Fragment oder Derivat eines monoklonalen Antikörpers wie in einem der Ansprüche 1 bis 9 beansprucht, wobei das Fragment oder Derivat mit dem monoklonalen Antikörper P2D3 um die Bindung an Wildtyp-HBsAg und an zumindest zwei mutierte Formen von HBsAg kreuzkonkurriert.
Verfahren zur Herstellung eines Hybridomas, das zur Herstellung eines monoklonalen Antikörpers wie in einem der Ansprüche 1 bis 9 beansprucht fähig ist, aufweisend das Immunisieren eines Tieres mit einem Wildtyp-HBsAg- oder einer mutierten Form von HBsAg-Antigen, wahlweise in der Form eines geeigneten Antigen-Fragments oder Derivats davon, Immortalisieren der Antikörper erzeugenden Zellen um Hybridomas zu bilden, Screenen der Hybridomakulturen auf Kreuzkonkurrenz mit monoklonalem Antikörper P2D3 oder einem monoklonalen Antikörper, wie er in einem der Ansprüche 2 bis 4 für die Bindung an ein Wildtyp-HBsAg und zwei oder mehr mutierten Formen von HBsAg beansprucht ist, wahlweise in der Form eines geeigneten Antigen-Fragments oder Derivats davon und Auswählen von solchen Hybridomas, die Antikörper erzeugen, die kreuzkonkurrieren.
Hybridoma, das für die Herstellung eines monoklonalen Antikörpers wie in einem der Ansprüche 1 bis 9 beansprucht fähig ist.
Hybridoma, das als P2D3 bezeichnet und bei der ECACC unter der Zugangsnummer ECACC 97042331 hinterlegt ist.
Hybridoma, das als M3A10 bezeichnet und bei der ECACC unter der Zugangsnummer ECACC 97042330 hinterlegt ist.
Hybridoma, das als M4F5 bezeichnet und bei der ECACC unter der Zugangsnummer ECACC 97042519 hinterlegt ist.
Verfahren zur Herstellung eines monoklonalen Antikörpers wie in einem der Ansprüche 1 bis 9 beansprucht, aufweisend das Kultivieren eines Hybridomas wie in einem der Ansprüche 12 bis 15 beansprucht oder erhalten durch ein Verfahren wie in Anspruch 11 beansprucht, in vitro oder in vivo, und Erhalten des monoklonalen Antikörpers aus dem Kulturmedium.
Immunoassay für die Bestimmung von HBsAg, aufweisend das in Kontakt bringen einer zu untersuchenden Probe mit einem monoklonalen Antikörper wie in einem der Ansprüche 1 bis 9 beansprucht, einem Fragment oder Derivat davon wie in Anspruch 10 beansprucht, oder eine Kombination aus zwei oder mehreren davon und Bestimmen von irgendeinem resultierenden Antigen-Antikörper-Komplex.
Immunoassay wie in Anspruch 17 beansprucht, wobei der monoklonale Antikörper, das Fragment, Derivat oder Kombination davon, in Kombination mit einem oder mehreren anderen Antikörpern, ausgewählt aus polyklonalen Anti-HBs-Antikörpern und anderen monoklonalen Anti-HBs-Antikörpern verwendet wird.
Immunoassay wie in Anspruch 17 oder Anspruch 18 beansprucht, in einem homogenen oder heterogenen Format.
Immunoassay wie in Anspruch 19 beansprucht in einem Capture- oder kompetitiven Format.
Immunoassay wie in einem der Ansprüche 17 bis 20 beansprucht, wobei ein Immunoassay für die Bestimmung von Antikörpern für Hepatitis-B-Kernprotein (HBc) gleichzeitig mit dem Assay für HBsAg ausgeführt wird.
Immunoassaykit, aufweisend einen monoklonalen Antikörper wie in einem der Ansprüche 1 bis 9 beansprucht, ein Fragment oder Derivat davon, wie in Anspruch 10 beansprucht, oder eine Kombination aus zwei oder mehreren davon, sowie anderen Reagenzien, die für das Ausführen eines Immunoassays für HBsAg erforderlich sind und wahlweise auch Reagenzien für die Bestimmung von Anti-HBc-Antikörpern.
Kit wie in Anspruch 22 beansprucht, das auch Reagenzien für die Bestimmung von Anti-HBc-Antikörpern aufweist.
Kit wie in Anspruch 22 oder Anspruch 23 beansprucht, welches auch weitere Anti-HBs-Antikörper aufweist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus polyklonalen Anti-HBs-Antikörpern und monoklonalen Anti-HBs-Antikörpern.
Kit wie in einem der Ansprüche 22 bis 24 beansprucht, wobei die Reagenzien, die für das Ausführen eines Immunoassays für HBsAg erforderlich sind, ausgewählt werden aus Waschlösungen, Verdünnungsmitteln, Standardlösungen, Kontrollreagenzien und markierten Anti-HBs-Antikörpern.
Feste Phase, geeignet für die Verwendung in einem Immunoassay, auf welcher ein monoklonaler Antikörper wie in einem der Ansprüche 1 bis 9 beansprucht, ein Fragment oder Derivat davon, wie in Anspruch 10 beansprucht, oder eine Kombination aus zwei oder mehreren davon immobilisiert ist.
Feste Phase wie in Anspruch 26 beansprucht, wobei ein oder mehrere weitere Anti-HBs-Antikörper, ausgewählt aus polyklonalen Anti-HBs-Antikörpern und anderen monoklonalen Anti-HBs-Antikörpern, ebenfalls auf der festen Phase immobilisiert werden.
Feste Phase wie in Anspruch 26 oder Anspruch 27 beansprucht, auf welcher auch ein Mittel immobilisiert ist, das Anti-HBc-Antikörper einfängt.
Zusammensetzung, geeignet für die therapeutische oder prophylaktische Verwendung für die passive Immunisierung gegen HBV, aufweisend einen monoklonalen Antikörper wie in einem der Ansprüche 1 bis 9 beansprucht, ein Fragment oder Derivat wie in Anspruch 10 beansprucht, oder eine Kombination von zwei oder mehreren davon in einer Mischung mit einem pharmazeutisch geeigneten Träger.
Zusammensetzung wie in Anspruch 29 beansprucht, die auch weitere Antikörper aufweist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus polyklonalen Anti-HBs-Antikörpern und monoklonalen Anti-HBs-Antikörpern.
Anti-idiotypischer Antikörper zu einem monoklonalen Antikörper wie in einem der Ansprüche 1 bis 9 beansprucht oder einem Fragment oder Derivat davon, wie in Anspruch 10 beansprucht.