DE3485974T3

DE3485974T3 - Molekularkloniertes diagnostisches Produkt und Verfahren zur Verwendung.

Info

Publication number: DE3485974T3
Application number: DE3485974T
Authority: DE
Inventors: Phillip Wayne Burlingame Berman; Laurence Allan San Francisco Lasky
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1983-08-30
Filing date: 1984-08-29
Publication date: 2004-07-22
Anticipated expiration: 2004-08-30
Also published as: DE3485974T2; JPH0658372B2; AU3006189A; DK412184A; GR80219B; AU583478B2; DK171976B1; NZ209307A; DE3485974D1; EP0139416A3; DK412184D0; IL72784A0; EP0139416A2; ES535553A0; ES8604693A1; EP0139416B2; IE58973B1; JPS60155974A; AU623375B2; AU3242484A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft immunologische diagnostische Produkte, die aus rekombinanter DNA-Technologie hervorgegangen sind, und die Methoden zu deren Verwendung.
Die Analyse der Immunreaktion auf eine Vielzahl von infektiösen Agenzien ist durch die Tatsache beschränkt gewesen, daß es sich oft als schwierig erwiesen hat, Pathogene in Mengen zu kultivieren, die ausreichen, um die Isolierung wichtiger Zelloberflächenantigene zu ermöglichen.
Der Nachweis von HSV-1 IgG und IgM Antikörpern ist mit enzymgekoppeltem Immunsorptions-Assay (ELISA) (A, B) durchgeführt worden. Bei beiden dieser Techniken werden Extrakte von HSV-infizierten Zellen zur Verwendung als Antigene geoffenbart. Die Nachteile der Verwendung lebenden Antigens in einer Laborumgebung sind wohlbekannt, einschließlich der Notwendigkeit, die infektiösen Agenzien zu kultivieren und einzuschließen.
Durch die Einführung des molekularen Klonens sind einige dieser Einschränkungen überwunden worden, indem eine Einrichtung geschaffen wurde, mit der Genprodukte von pathogenen Agenzien in praktisch unbegrenzten Mengen in einer nicht-pathogenen Form exprimiert werden können. Oberflächenantigene von derartigen Viren wie Influenza (1), Maul- und Klauenseuche (2), Hepatitis (3), Bläschenstomatitisvirus (4), Tollwut- (5) und Herpessimplexviren (6) sind nun in E. coli und S.cerevisiae exprimiert worden und versprechen, in der Zukunft verbesserte Subeinheitsimpfstoffe zu schaffen. Die Expression von Oberflächenantigenen in niederen Organismen ist insofern nicht vollkommen zufriedenstellend, als potentiell bedeutsame antigene Determinanten aufgrund unvollständiger Verarbeitung (z.B. Proteolyse, Glykosylierung) oder durch Denaturierung während der Reinigung des geklonten Genprodukts verloren gehen können.
Das trifft insbesondere im Fall von Membranproteinen zu, die aufgrund hydrophober Transmembranbereiche zum Aggregieren neigen und unlöslich werden, wenn sie in E.coli exprimiert werden. Geklonte Gene, die für Membranproteine kodieren, sind bei Säugetierzellen bekannt, wo die Wirtszelle die Faktoren schafft, die für richtige Verarbeitung, Polypeptidfaltung und Einbindung in die Zellmembran (7,8) notwendig sind. Während diese Untersuchungen zeigen, daß Membranproteine auf der Oberfläche einer rekombinanten Wirtszelle exprimiert werden können, und zum Beispiel (8), daß ein abgestumpftes Membranprotein, dem der hydrophobe carboxyterminale Bereich fehlt, langsam von der Wirtszelle ausgeschieden werden kann, statt daran gebunden zu sein, beschreiben sie die vorübergehende Expression des geklonten Gens für membrangebundene Proteine und den Nachweis eines derartigen Proteins durch Färben mit seinem komplementären markierten Antikörper. Es gibt in diesen Veröffentlichungen keinen Hinweis darauf, daß das membrangebundene Protein als ein immunologisches diagnostisches Reagens verwendet werden könnte. Des weiteren macht die Instabilität der Zellinien, auch wenn es einen derartigen Hinweis gäbe, die beschriebenen membrangebundenen Proteine zu einer wissenschaftlichen Kuriosität und nicht zu einem nützlichen, praktisch anwendbaren diagnostischen Produkt.
Herpes Simplex Virus (HSV) ist ein großes DNA-Virus, das in zwei verwandten, aber unterscheidbaren Formen bei Infektionen beim Menschen auftritt. Bei zumindest vier der großen Anzahl an Virus-kodierten Proteinen ist festgestellt worden, daß sie glykosyliert und auf der Oberfläche sowohl des Virions als auch der infizierten Zellen (9) sind. Diese Glykoproteine, die als gA/B, gC, gD und gE bezeichnet werden, sind sowohl in HSV Typ 1 (HSV-1) als auch HSV Typ 2 (HSV-2) zu finden, während im Fall von HSV-2 berichtet wurde, daß ein zusätzliches Glykoprotein (gF) gefunden wurde. Obwohl ihre Funktionen nicht völlig erforscht sind, scheinen diese Glykoproteine an der Virusanlagerung an Zellen, Zellfusion und einer Vielzahl von immunologischen Wirtsreaktionen auf Virusinfektion (11) beteiligt zu sein. Obwohl HSV-1 und HSV-2 nur etwa 50%ige DNA-Sequenzhomologie aufweisen (12), scheinen die Glykoproteine größtenteils typengemeinsam zu sein. So weisen gA/B, gD und gE eine große Anzahl an typengemeinsamen antigenen Determinanten auf (13–16), während bei gC, von dem zuvor gedacht wurde, daß es vollständig typenspezifisch sei (17,18) ebenfalls herausgefunden wurde, daß es einige typengemeinsame Determinanten besitzt. Typenspezifische antigene Determinanten können jedoch unter Verwendung monoklonaler Antikörper für einige der Glykoproteine (10, 19) nachgewiesen werden, was zeigt, daß seit dem Divergieren von HSV-1 und HSV-2 einige Aminosäureveränderungen aufgetreten sind.
Eines der wichtigsten Glykoproteine bezogen auf die Virusneutralisierung ist gD (11). Watson et al (Science 218, (1982), 381) und Weis et al (Nature, 302, (1983), 72) offenbaren die Nukleotidsequenz und Expression des gD-Gens in E.coli und erbringen den Nachweis des Expressionsprodukts durch Immunausfällung. Es sind wesentliche Hinweise erbracht worden, die den Schluß nahelegen, daß die jeweiligen gD-Proteine von HSV-1 und HSV-2 verwandt sind. Zum Beispiel sind durch Rekombinationsmapping die jeweiligen Gene auf kolineare Bereiche in beiden Virusgenomen lokalisiert worden. Aminosäureanalyse zeigte starke Homologie zwischen den beiden Proteinen. Die gD-Proteine induzieren Neutralisierungsantikörper sowohl zu Typ 1 als auch zu Typ 2 Viren in einer typengemeinsamen Weise (19-21). Zusätzlich sind die meisten zu diesen Glykoproteinen erzeugten monoklonalen Antikörper typengemeinsam, was auch ein hohes Maß an struktureller Verwandtschaft zwischen den beiden Typen von Glykoproteinen (20) nahelegt. Bei einigen monoklonalen Antikörpern jedoch wurde herausgefunden, daß sie typenspezifisch reagieren, was auf beträchtliche Unterschiede zwischen den Proteinen hindeutet (19). Peptidpläne der Proteine zeigten ebenfalls unzweideutig derartige Unterschiede (22). Diese Ergebnisse reichen, obwohl sie darauf hindeuten, daß diese Polypeptide verwandt sind, nicht aus, um genau anzugeben, wie nah die Verwandtschaft ist.
Um das Wesen der Typengemeinsamkeit von HSV-1 und HSV-2 gD-Proteinen zu untersuchen, wurden die DNA-Sequenzen der gD-Gene von HSV1 und HSV2 bestimmt. Die abgeleiteten Aminosäuresequenzen zeigten Ähnlichkeit. Die resultierenden abgeleiteten Proteinsequenzen wurden ebenfalls unter Verwendung eines Programms, das zum Bestimmen der hydrophoben und hydrophilen Bereiche des Proteins entworfen worden war, auf strukturelle Unterschiede analysiert. Diese Analyse zeigte ein hohes Maß an Konservierung auf einem umfassenden strukturellen Niveau. Obwohl zwischen den beiden Glykoproteinen einige Aminosäuresubstitutionen gefunden wurden, war die große Mehrzahl dieser Substitutionen konservierend, was darauf hindeutet, daß diese Glykoproteine für das Virus ein wichtiges strukturelles Erfordernis darstellen.
Im Lichte dieser Information über die Struktur des gD-Proteins, wie hierin detaillierter beschrieben, wurde beschlossen, die gD-Protein-DNA in Säugetierzellen zu exprimieren, um herauszufinden, ob derartiges möglich ist, und, wenn es möglich ist, ob sich das exprimierte Protein an die Wirtszellenmembran binden würde und ob eine abgestumpfte Proteinform, der der membranbindende Bereich fehlt, von der Wirtszelle ausgeschieden würde, und, in beiden der letzteren Fälle, ob die Expressionsproduktproteine sich mit Antikörpern verbinden könnten, die gegen HSV-1 und/oder HSV-2 wirksam sind. Dieser Vorgang ist im Europapatent Nr. 139417 vollständig beschrieben.
Wie in dieser Anmeldung gezeigt, sind derartige Expressionsproduktproteine fähig, Antikörper zu ziehen, die gegen HSV-1 und/oder HSV-2 wirksam und daher als ein Impfstoff nützlich sind. Wie die Ergebnisse gemäß vorliegender Erfindung zeigen werden, sind derartige exprimierte Proteine, die durch rekombinante DNA-Prozesse erhalten werden und zur Erkennung durch Antikörper gegen HSV-1 und/oder HSV-2 fähig sind, auch nützliche diagnostische Produkte zum Nachweisen und/oder Messen der Gegenwart von Antikörpern, die für diese Viren charakteristisch sind. Mappinguntersuchungen (22a) deuten darauf hin, dass die Proteinsequenz, die vom HSV-2-Genom abgeleitet ist, gF, dem HSV-2-Homolog von HSV-1 gC, entspricht.
HSV-1 gC ist ohne Homologie in HSV-2 als typenspezifisch betrachtet worden, da herausgefunden wurde, daß Antikörper gegen dieses Glykoprotein fast ausschließlich mit HSV-1 gC reagieren (17). Zusätzlich konnten keine nachweisbaren immunologischen Reaktionen zwischen HSV-1 gC und Antiseren, die gegen HSV-2 Virus hergestellt wurden, gezeigt werden (18). Ein Protein mit der gleichen elektrophoretischen Mobilität wie HSV-1 gC wurde in HSV-2 nachgewiesen, jedoch wies es keine kolineare Mapping mit HSV-1 gC auf (35).
Im Gegensatz zu HSV-1 scheint HSV-2 für wieder ein anderes Glykoprotein zu kodieren, das als gF bezeichnet wird (22b, 10, 22c, 22d). Obwohl das HSV-2 gF eine elektrophoretische Mobilität aufwies, die viel schneller war als die von HSV-1 gC, zeigten Mappinguntersuchungen mit rekombinanten Viren, daß für dieses Protein ein Bereich des HSV-2-Genoms kodierte, der in etwa kolinear mit dem Gen für HSV-1 gC war (22c, 22d). Zusätzlich ist vor kurzem gezeigt worden, daß ein monoklonaler Antikörper gegen HSV-2 gF schwach mit HSV-1 gC kreuzreagiert (22f) und daß ein gegen HSV-1 Virion-Hüllproteine erzeugtes polyklonales Antiserum gF ausfällte (22d), was auf eine mögliche strukturelle Homologie zwischen den beiden Glykoproteinen hindeutet. So schien es, daß ein mögliches Homolog zu HSV-1 gC das HSV-2 gF-Protein war. Diese Beziehung wurde gemäß vorliegender Erfindung untersucht.
Norrild et al. (J.Virol. 1982, 43(2), 395–402) meinen, daß bei einigen der HSV-Glykoproteine die Epitope hauptsächlich im Polypeptidkern vorliegen und nicht im Kohlenhydratanteil. Glorioso et al. (Virology; 1983, 126(1), 1–18) zeigt, daß die teilweise glykosylierten Proteine (in Gegenwart von Glykosylierungshemmer erzeugt) antigenisch mit den entsprechenden reifen Formen verwandt sind. EP 1365A offenbart die Trennung der natürlich erzeugten HSV-Glykoproteine von den virusinfizierten Zellen mit Hilfe eines grenzflächenaktiven Stoffes, mit dem Ziel einen Impfstoff zu erzeugen. Middleton et al. (J.Virol. 1982, 43(3), 1091–101) offenbart die rekombinante Expression von HSV-DNA-Segmenten in Maulzellen, die früh und unmittelbar früh infizierte Zellpolypeptide erzeugen, die den HSV-Kernproteinen entsprechen. Goodenow et al. (Science, 1982, 215, 677–679) gibt an, daß das HSV-TK8-Gen funktionell in einer rekombinanten Mauszellinie exprimiert werden kann.
Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren bereitgestellt, das das Erzeugen eines Typ-spezifischen Fragments eines gC-Glykoprotein-Polypeptids eines Herpes-simpulex-Virus vom Typ 2 in einer rekombinanten, stabilen, kontinuierlichen Säugetier-Zellinie umfaßt, wodurch das Glykoprotein freiliegende Antigen-Determinanten aufweist, so daß das Fragment fähig ist, komplementäre Antikörper eines Herpes-simplex-Virus vom Typ 2, nicht aber Herpes-simplex-Virus vom Typ 1, spezifisch zu binden, und dadurch fähig ist, zwischen HSV-1 und HSV-2 zu unterscheiden.
Gemäß einer Ausführungsform wird zu Beginn ein trunkiertes Derivat eines membrangebundenen gC-Glykoprotein-Polypeptids ohne die membranbindende Domäne produziert, wodurch das Polypeptid-Derivat frei von der Membran ist und die freiliegenden Antigen-Determinanten aufweist.
Die Erfindung stellt auch ein Diagnose-Testset bereit, umfassend:

(a) trunkiertes, membranfreies Polypeptid, das nach dem obigen Verfahren erhältlich ist; und
(b) einen zweiten Bestandteil, der entweder komplementären Antikörper des Herpes-simplex-Virus vom Typ 2 oder Anti-Antikörper umfasst, der fähig ist, den komplementären Antikörper spezifisch zu binden.

Die Erfindung stellt weiters ein Verfahren zum Nachweis von Antikörper bereit, der in einer biologisch erhaltenen Fluid-Probe enthalten ist, folgende Schritte umfassend:

(a) In-Kontakt-Bringen der Fluid-Probe mit einem trunkierten Polypeptid-Derivat, wie nach dem obigen Verfahren erhalten, um das Polypeptid mit komplementärem Antikörper in der Fluid-Probe zu binden; sowie
(b) den Nachweis der Bindung von Schritt (a).

Gemäß wieder einem anderen Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis von Antigen bereit, das in einer biologisch erhaltenen Fluid-Probe enthalten ist, folgende Schritte umfassend:

(a) das In-Kontakt-Bringen der Fluid-Probe mit einem trunkierten Polypeptid-Derivat, wie nach dem obigen Verfahren erhalten, wobei das Polypeptid Antigen-Determinanten mit dem Probenantigen gemeinsam hat; und
(b) das Nachweisen des Probenantigens unter Anwendung eines kompetitiven Tests.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die 1A und 1B zeigen die DNA und abgeleitete Aminosäurensequenzen der HSV-1 und HSV-2 gD-Gene und umgebene Flankierungsbereiche;
2 zeigt eine Hydropathieanalyse der gD-Proteine von HSV-1- und HSV-2-Proteinen;
3 ist ein Diagramm des Plasmids pgD-dhfr, das zur Expression einer membrangebundenen Form von HSV-1-Glykoprotein D konstruiert ist;
4 zeigt das Ergebnis des Markierens von gD12-Zellen mit humanen Antikörpern gegen HSV, wobei (A) eine Sichtbarmachung mit Phasenkontrastoptik und (B) ein Fluoreszenzbild derselben Zellen ist;
5 zeigt Radioimmunausfällung von geklontem gD von der gD12-Zellinie hievon und natives gD von HSV-1-infizierten menschlichen Zellen;
6 zeigt die Bindung von humanen anti-HSV-Antikörpern an gD12-Zellen und die parentale CHO-Zellinie.
7 ist eine schematische Darstellung von HSV-1-gD-Protein und veranschaulicht die Positionen von Signalsequenz und membranbindendem Bereich.
8 ist ein Diagramm des Expressionsplasmids pgDtrunc-dhfr für eine ausgeschiedene Form von HSV-1 gD-Protein.
9 zeigt Radioimmunausfällungen von der gD10.2-Zellinie hievon.
10 zeigt Radioimmunausfällungen von vorverstärkten und verstärkten gD10.2-Zellinien.
11 zeigt das Maß an Verstärkung, das mit der MTx-verstärkten gD10.2-Zellinie erzielt wurde.
12 zeigt die Fragmente von pgC₂Sa12.9, die der DNA-Sequenzanalyse unterworfen wurden.
13 zeigt die DNA-Sequenz, die von pgC₂SA12.9 abgeleitet wurde, verglichen mit der DNA-Sequenz des HSV-1 gC-Bereiches.
14 veranschaulicht die Southernblot-Analyse von HSV-2 genomer DNA und pgC₂Sa12.9 DNA.
15 veranschaulicht die Translation des HSV-2 großen offenen Leserasters und Vergleich mit der HSV-1 gC-Aminosäuresequenz.
16 veranschaulicht die Hydropathieanalyse des HSV-1 gC-Proteins und des HSV-2 offenen Leseraster-Hauptproteins.
Zusammenfassung der Erfindung
Gemäß vorliegender Erfindung wird rekombinante DNA-Technologie eingesetzt, um Genprodukte in großen Mengen in einer nicht-pathogenen Form zur Verwendung als Diagnosemittel zu schaffen. Die Vorteile derartiger Genprodukte werden unter Bezugnahme auf die Diagnose bestimmter Infektionen wie HSV veranschaulicht. Zur Zeit verwendete Verfahren zur Diagnose von HSV umfassen (c) die Kultivierung klinischer Isolate, (b) die Verwendung von Reagenzien, die aus lebenden Viren hergestellt werden, oder (c) die Verwendung monoklonaler Antikörper, die an eine Markierung wie Fluoreszenz oder Enzym gekoppelt sind. Das erste Verfahren ist arbeitsaufwendig und erfordert typischerweise mehrere Tage, um ein Ergebnis zu erzielen. Der zweite Ansatz ist oft nicht durchführbar, weil er biochemische Verfahren erforderlich macht, die über den Rahmen der meisten klinischen Laboratorien hinausgehen. Das dritte Verfahren hängt vom Nachweis einer offenen Läsion und der Verfügbarkeit von Nachweiseinrichtungen, z.B. einem Fluoreszenzmikroskop oder einer Fluoreszenzmarkierung ab. Aus diesen Gründen kommt die Laborbestätigung klinischer Diagnose üblicherweise nicht zum Einsatz.
Das vorliegende System verwendet ein diagnostisches Produkt (wie unten definiert), das ein Polypeptid mit antigenen Determinanten umfaßt, die fähig sind, komplementären Antikörper spezifisch zu binden. In einer Ausführungsform ist das Polypeptid funktionell mit der Oberflächenmembran einer rekombinanten Wirtszelle assoziiert, die zu seiner Produktion fähig ist. In einem typischen Fall umfaßt eine derartige funktionelle Assoziation eine Bindung des Polypeptids an die Oberflächenmembran, sodaß das Polypeptid durch die Membran ragt. Die rekombinante Zellinie ist von einer stabilen kontinuierlichen Linie abgeleitet, damit das diagnostische Produkt in einer kommerziell verwertbaren Menge geliefert wird.
In einer anderen Ausführungsform umfaßt das diagnostische Produkt ein Polypeptid mit den gleichen antigenen Determinanten, das aber nicht mit der Oberflächenmembran funktionell assoziiert ist. Wie unten detaillierter beschrieben, ist ein derartiges Polypeptid ein abgestumpftes, membranfreies Derivat eines membrangebundenen Polypeptids. Das Derivat wird durch Auslassung eines membranbindenden Bereichs vom Polypeptid gebildet, was. es möglich macht, daß es vom rekombinanten Wirtszellsystem ausgeschieden wird, in dem es erzeugt worden ist.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird das Polypeptid zunächst in funktioneller Assoziation mit einer Oberflächenmembran gebildet, und dann wird das Polypeptid vorzugsweise in einem nicht-ionischen Tensid gelöst, um das Polypeptid von der Membran zu befreien.
Das diagnostische Produkt gemäß vorliegender Erfindung wird anstelle des Gegenstücks verwendet, das von einem lebenden Pathogen in analogen Immunbestimmungen abgeleitet ist. In diesem Zusammenhang umfaßt ein im Handel erhältlicher Diagnose-Testset die obigen diagnostischen Produkte mit einer Vielzahl anderer immunologischer Produkte, von denen zumindest eines markiert ist, für den Nachweis seines komplementären Antikörpers oder anderen Antigens. Das System ist unter Bezugnahme auf das Molekülklonieren der gD-Proteine von HSV-1 und HSV-2 beschrieben worden, das ausreichend antigene Determinanten besitzt, um es zu befähigen, sich spezifisch an komplementären Antikörper zu binden, nämlich Antikörper zu HSV-1 und HSV-2. Wie oben angeführt, betrifft die Erfindung wie beansprucht jedoch die Expression und Verwendung typspezifischer Fragmente von HSV gC-2. Die spezifischen Techniken zum Klonieren, Sequenzieren und Exprimieren des HSV-1-gD-Proteins sind im nachstehenden Beispiel 1 dargelegt. Wie darin dargelegt, zeigte der Hydropathieplot von 2 einen hydrophilen carboxyterminalen Bereich, dem ein hydrophober Bereich vorangeht. Diese Struktur ist für ein membrangebundenes Glykoprotein charakteristisch. Ihre Funktion besteht darin, das Protein in den Zell- und Virusmembranen zu verankern.
Um die Verwandtschaft zwischen HSV-1 und HSV-2 zu untersuchen, ist bestimmt worden, daß eine DNA-Sequenz eines 2,29 kb Bereiches des HSV-2-Genoms mit dem HSV-1 gC-Gen kolinear ist. Translation eines großen offenen Leserasters in diesem Bereich zeigt, daß ein Protein, das beträchtliche Homologie zu HSV-1 gC aufweist, in diesem Bereich kodiert wird. Es wird vermutet, daß dieser Bereich für das HSV-2 gF-Gen kodiert und daß das gF-Protein das HSV-2 Homolog von HSV-1 Glykoprotein C ist.
Wie hierin dargelegt, wird ein Glykoprotein in HSV-2, das früher als gF bezeichnet wurde, besser ein gC genannt. (Die Begriffe "HSV-2 gF", "HSV-2 gC" und "gC-2" werden für dieses Produkt alternativ verwendet.) Es ist herausgefunden worden, daß ein Segment von gC-2 typengemeinsam für HSV-1 gC (oder gC-1) ist, während ein anderes Segment typenspezifisch ist.
Ein diagnostisches Produkt, das aus einem Fragment von gC-2 gebildet ist, das das typenspezifische Segment enthält aber das typengemeinsame. Segment ausschließt, ermöglicht den Nachweis von HSV-2 im Gegensatz zu HSV-1. Wenn der Diagnosetest positiv ist, weist der Proband HSV-2 auf. Die Verwendung dieses Tests in Kombination mit einem anderen Test, der HSV-1 und HSV-2 gemeinsam ist, würde die Diagnose von HSV-1 erlauben. Zum Beispiel entspricht eine positive Ablesung unter Verwendung von gD in einem Diagnosetest der Gegenwart von HSV-1 und/oder HSV-2-Virus. Wenn typenspezifischer gC-2-Test ebenfalls positiv ist, zeigt der Proband HSV-1 und HSV-2; wenn negativ, hat der Proband nur HSV-2. So ist zum ersten Mal ein Diagnosetest entwickelt worden, der fähig ist, HSV-1 von HSV-2 zu unterscheiden.
Obwohl nicht spezifisch hierin beansprucht, können andere bekannte Glykoproteine von HSV-1 oder HSV-2, z.B. gA, gB oder gE, oder andere noch nicht identifizierte, für diagnostische Produkte für HSV-1 oder HSV-2 verwendet werden. Wenn derartige Glykoproteine typenspezifische Determinanten für HSV-1 oder HSV-2 umfassen, können analoge rekombinante Techniken zu den hierin unter Bezugnahme auf gC und gD dargelegten verwendet werden, um derartige Glykoproteine in diagnostische Produkte zu formen, die fähig sind, HSV-1 von HSV-2 zu unterscheiden. Wenn die Glykoproteine auch typengemeinsame Determinanten umfassen, können die gleichen hierin unter Bezugnahme auf gC-2 Produktion dargelegten rekombinanten Techniken verwendet werden, um die typenspezifische Fraktion zu isolieren, die von der typengemeinsamen Fraktion für die spezifische Diagnose von HSV-1 und HSV-2 isoliert ist. Wenn das Glykoprotein nur typengemeinsame Fraktionen einschließt, kann es mit rekombinanten Techniken auf eine zu gC analoge Weise produziert werden.
Es wird angenommen, daß nur bestimmte Techniken des Molekularklonens ein Polypeptid mit geeigneten spezifischen antigenen Determinanten zum Nachweis durch seinen komplementären Antikörper erzeugen. Deshalb muß das Polypeptid während der Bildung auf eine solche Weise gebildet werden, daß es richtig faltet, glykosyliert wird und korrekt verarbeitet wird. Wie in Beispiel 1 veranschaulicht, besteht eine Technik zum Erreichen der Produktion einer Zelle mit diesen gewünschten Eigenschaften darin, daß das Polypeptid auf eine Art molekular geklont wird, daß es funktionell mit der Oberflächenmembran einer rekombinanten Wirtszelle assoziiert ist. Zu diesem Zweck wird es für notwendig befunden, ein eukaryotisches Wirtszellensystem und vorzugsweise ein Säugetierwirtszellensystem zu verwenden. So erzeugt zum Beispiel das in Chinese Hamster Ovary-Zellen (CHO) exprimierte HSV-1 Glykoprotein D ein membrangebundenes gD-Protein mit geeigneten Antigeneigenschaften. Andere geeignete rekombinante Wirtszellsysteme umfassen Maus-L-Zellen etc.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff "rekombinant" auf Zellen, die mit Vektoren transfiziert worden sind, die unter Verwendung rekombinanter DNA-Technologie konstruiert wurden und daher mit der Fähigkeit zum Produzieren des Polypeptids davon transformiert wurden. Mit "funktionelle Assoziation" ist das Gebundensein an die Membran gemeint, typischerweise durch Hinausragen an beiden Seiten der Membran, auf ein solche Art, daß antigene Determinanten exponiert werden, die in einer nativen Konformation gefaltet sind, die durch Antikörper erkennbar ist, der gegen das native Pathogen aufgetreten ist. "Membrangebunden" unter Bezugnahme auf Polypeptide hievon bezieht sich auf eine Klasse von Polypeptiden, die üblicherweise in eukaryotischen Zellen erzeugt werden und dadurch gekennzeichnet sind, daß sie eine Signalsequenz aufweisen, von der angenommen wird, daß sie zu ihrer Ausscheidung durch verschiedene Zellmembranen beiträgt, sowie einen membranbindenden Bereich (üblicherweise von hydrophober Beschaffenheit und am C-terminalen Ende auftretend), von dem angenommen wird, daß er seine vollständige Sekretion durch die Zellmembran verhindert. Als solcher bleibt er mit der Membran funktionell assoziiert oder an die Membran gebunden. Diese Erfindung richtet sich insbesondere auf die Ausnutzung derjenigen membrangebundenen Polypeptide, die mit pathogenen Organismen, z.B. Herpesvirus, assoziiert sind.
Sobald die antigenen Determinanten der Polypeptide gemäß vorliegender Erfindung durch funktionelle Assoziation mit der Oberflächenmembran geschaffen sind, kann die Membran danach von den Polypeptiden entfernt werden, ohne die antigenischen Eigenschaften zu zerstören. So kann das membrangebundene Polypeptid von der Membran entfernt werden, zum Beispiel durch Solubilisierung mit einer geeigneten Lösung, vorzugsweise einer, die einen nicht-ionischen grenzflächenaktiven Stoff enthält, um das Polypeptid von der Membran zu entfernen. Ein Vorteil einer derartigen Vorgangsweise besteht darin, daß das Polypeptid von äußerem zellularen Material isoliert wird, was die potentielle Wirkung bei seiner Verwendung als Impfstoff erhöht. Eine Technik zum Entfernen der Membran vom Polypeptid wird unten beschrieben.
In einer anderen Ausführungsform können membranfreie Präparate durch Schaffung eines Ausscheidungssystems erhalten werden. Wie unten detaillierter beschrieben, besitzt ein derartiges ausgeschiedenes Polypeptid zumindest einige der antigenen Stellen, die zur Antikörperstimulierung notwendig sind.
In einer anderen Ausführungsform kann die Membran durch Ausscheiden der Polypeptide von ihrer membrangebundenen Umgebung entfernt werden.
Es ist herausgefunden worden, daß derartiges ausgeschiedenes Polypeptid zumindest einige der antigenen Stellen besitzt, die für antigenen Nachweis notwendig sind. Eine geeignete Technik, um das zu erreichen, wird in Beispiel 3 unten beschrieben.
Es gibt eine Anzahl bekannter Techniken zum Bestimmen unbekannter Mengen an Antigen oder Antikörper im biologischen Fluid wie Serum, Urin, oder von Hautproben oder ähnlichem. Im Prinzip verwendet die vorliegende Erfindung derartige bekannte Techniken, ersetzt aber bestimmte molekular geklonte diagnostische Reagenzien eines oben dargelegten Typs in den ansonsten bekannten Verfahren. Demgemäß werden die Verfahren selbst nur allgemein unter Bezugnahme auf herkömmliche Publikationen auf dem Gebiet der Immunologie für Details der Verfahren beschrieben. Fachleute werden damit vertraut sein, wie die neuen diagnostischen Produkte gemäß vorliegender Erfindung für herkömmliche immunologische Techniken einzusetzen sind.
Zwecks Einfachheit der Beschreibung wird der allgemeine Ausdruck "diagnostisches Produkt" verwendet, um das antigenfunktionelle Produkt gemäß vorliegender Erfindung zu beschreiben. Der Ausdruck "diagnostisches Produkt" ist als ein Polypeptid mit antigenen Determinanten definiert, die fähig sind, entsprechenden Antikörper spezifisch zu binden, der durch den pathogenen Organismus induziert wird, und in einer rekombinanten Wirtszelle gebildet wird, die zu seiner Produktion fähig ist und von einer stabilen, kontinuierlichen rekombinanten Zellinie abgeleitet ist. Das Polypeptid kann entweder mit einer Oberflächenmembran der rekombinanten Wirtszelle funktionell assoziiert sein oder nicht.
Im letzteren Fall liegt das Polypeptid typischerweise in abgestumpfter Form vor und wird durch eine Sekretion vom rekombinanten Wirtszellsystem gebildet, oder wird durch Auflösen der Membran in einer Lösung wie einem nichtionischen, grenzflächenaktiven Stoff oder einer Lösung davon von der Membran befreit.
Im allgemeinen können die diagnostischen Produkte zum Nachweis entweder von Antikörper oder Antigen in einer biologisch abgeleiteten Fluidprobe verwendet werden. Zum Nachweis von Antikörper wird die Fluidprobe mit dem diagnostischen Produkt in Kontakt gebracht, um das diagnostische Produkt mit komplementärem Antikörper in der Fluidprobe zu binden, und eine derartige Bindung wird nachgewiesen und, vorzugsweise, auch gemessen. Zum Nachweis des Antigens wird die Fluidprobe mit dem diagnostischen Produkt in Kontakt gebracht, das die gleichen antigenen Determinanten wie das Probenantigen aufweist. Dann wird das Probenantigen nachgewiesen und, vorzugsweise, gemessen, wobei ein Kompetitivassay eingesetzt wird.
Wie oben dargelegt, werden bei einer bekannten Vorgangsweise Extrakte von HSV-infizierten Zellen als Antigen in einer ELISA-Sandwichtyp-Technik eingesetzt. Das allgemeine Verfahren derartiger Techniken kann für die vorliegende Erfindung verwendet werden.
Auf das System zum Nachweis von Antikörper bezugnehmend, wird ein diagnostisches Reagens typischerweise dadurch gebildet, daß es an eine feste Oberfläche gebunden wird (z.B. durch Adsorption oder kovalente Bindung), typischerweise an die Oberfläche eines Näpfchens oder Teströhrchens.
Andere geeignete feste Oberflächen können eine Oberfläche umfassen, die fähig ist, das diagnostische Reagens zu immobilisieren, wie ein körniges Material.
Die mit dem diagnostischen Produkt zu beschichtende feste Oberfläche sollte für Flüssigkeit hinreichend undurchlässig sein, damit wirksames Entfernen von ungebundenem Reagens durch Waschen ermöglicht wird. Sie sollte auch das Binden des diagnostischen Reagens zulassen. Wenn kovalente Bindung gewünscht wird, umfassen geeignete Oberflächen Kunststoff wie Polystyrol. Geeignete Kopplungstechniken zwischen der Oberfläche und diagnostischen Bereich werden in Bennich et al., US-PS 3,720,760 dargelegt.
Bei der Sandwichtechnik zur Bestimmung eines unbekannten Antikörpers in einer Probe wird das gebundene diagnostische Produkt mit dem Antikörper und mit löslichem markiertem anti-Antikörper umgesetzt, der fähig ist, den komplementären Antikörper in der Probe spezifisch zu binden. Auf diese Weise wird der Proben-Antikörper an der festen Oberfläche sowohl an das diagnostische Produkt als auch an den markierten anti-Antikörper in Sandwichweise gebunden. Dann wird die feste Oberfläche gewaschen, um nicht umgesetzten markierten anti-Antikörper zu entfernen. Danach wird der markierte anti-Antikörper auf der festen Oberfläche oder in der Waschlösung als Indikator für die Antikörpermenge in der Probe nachgewiesen. Die Reaktion an der festen Oberfläche bildet ein Reaktionsprodukt, das der Reihe nach umfaßt: feste Oberfläche*diagnostische Produkte*Proben-Antikörper*markierten anti-Antikörper. Das "*" steht für eine Bindung. Zum Beispiel kann die Bindung zwischen der Oberfläche und dem diagnostischen Produkt eine kovalente Bindung oder eine adsorptive Bindung sein. Bindungen zwischen dem diagnostischen Produkt und dem Proben-Antikörper und zwischen dem Proben-Antikörper und dem markierten anti-Antikörper umfassen immunologische Bindungen.
Wie wohlbekannt ist, ist die Markierung beim ELISA-Verfahren ein Enzym, das nach der Umsetzung mit seinem komplementären Substrat zu einer farbigen Form kolorimetrisch nachgewiesen wird. Ein derartiger kolorimetrischer Nachweis hat den Vorteil, daß keine Instrumente erforderlich sind. Andere bekannte Markierungen umfassen radioaktive oder fluorimetrische Markierungen, die mit Instrumenten nachgewiesen werden.
Das Markieren des anti-Antikörpers mit Enzym wird vorzugsweise mit herkömmlichen Bindungstechniken mit einer oder mehreren kovalenten Bindungen durchgeführt. Derartige kovalente Bindungen können durch das Hinzufügen externer Kupplungs- oder Überbrückungsmoleküle erreicht werden, oder durch direkte Kondensation vorhandener Seitenketten. Funktionelle Überbrückungsagenzien zum Erreichen dieses Zwecks sind aus dem Stand der Technik wohlbekannt.
Das System der vorliegenden Erfindung ist auch auf die sogenannte kompetitive Bindungstechnik für das Immunassay von Antikörpern anwendbar, die in einem biologisch abgeleiteten Fluid nachzuweisen sind. In diesem Fall ist das diagnostische Produkt auch in einer Schicht an eine feste Oberfläche wie oben dargelegt gebunden. Diese Festphase wird mit dem biologisch abgeleiteten Fluid in Kontakt gebracht, das den nachzuweisenden Antikörper enthält, sowie mit freiem löslichen markierten Antikörper des gleichen immunologischen Typs wie der nachzuweisende Antikörper. Das Auftreten kompetitiver immunologischer Reaktion zwischen dem gebundenen diagnostischen Produkt und sowohl (a) dem Antikörper in der zu bestimmenden Probe und (b) dem enzymmarkierten Antikörper wird veranlaßt. Somit ist die Konzentration von nachzuweisendem Antikörper im biologisch abgeleiteten Fluid umgekehrt proportional zum enzymmarkierten Antikörper, der an die feste Oberfläche gebunden ist.
Nach der obigen kompetitiven Reaktion wird die feste Oberfläche von der Flüssigphase entfernt. Wenn ein Teströhrchen oder Näpfchen verwendet wird, besteht das im Waschen des Teströhrchens oder Näpfchens. Dieses Waschen entfernt ungebundenen markierten Antikörper von der Oberfläche.
Dann wird der markierte Antikörper in der Fest- oder Flüssigphase als ein Maß für den Proben-Antikörper nachgewiesen. Geeigneterweise wird das durch In-Kontakt-bringen der abgetrennten Festphase mit einer Lösung erreicht, die lösliches Substrat für das Enzym enthält, um das Umwandeln des Substrats in eine farbige Form zu verursachen.
Die obigen Sandwich- oder kompetitiven Techniken sind besonders wirksam zum Messen von Antikörpern zu Pathogen in einer biologisch abgeleiteten Probe bei Diagnosen, worin die Gegenwart der Antikörper in der Probe ein Hinweis dafür ist, daß der Patient mit dem Pathogen infiziert wurde. So ist zum Beispiel ein Nachweis von Antikörper gegen HSV eine Indikation dafür, daß der Patient infiziert worden ist.
Andere pathogene Antikörper, auf die die Erfindung nach einer Virusinfektion anwendbar ist, sind Adenovirus, Coxsackie, Cytomegalovirus, Epsteiin-Barr, Katzenleukämievirus, Hepatitis, Schweinepest, Influenza, Masern, Newcastle-Krankheit-Virus, Parainfluenza, Tollwut, Atemwegs-Synzytialvirus, Rotavirus, Röteln, Sendai, Varicella. Parasitische Infektionen umfassen Amebiase, Babesie, Cysticercose, Echinococcose, Leishmaniase, Onchocerciase, Malaria, Vicerallarvenwanderung, Toxoplasmose, Trypanosomiase, Trichinose und Schistosomiase. Andere Anwendungen der vorliegenden Erfindung erstrecken sich auf das Gebiet der Autoimmunerkrankungen, bei denen das Produkt ein membrangebundenes Protein vom Wirt umfaßt und verwendet wird, um Antikörper zu messen, die gegen das Protein gerichtet sind, z.B. das Acetylcholinrezeptorprotein.
Die diagnostischen Produkte gemäß vorliegender Erfindung sind auch auf die Bestimmung irgendeines Polypeptids oder Proteins, pathogen oder nicht, in der biologisch abgeleiteten Probe mit den gleichen antigenen Determinanten wie das molekular geklonte diagnostische Produkt anwendbar. Zum Beispiel ist das System für die Bestimmung von menschlichen Hormonen in einer Serumprobe einsetzbar, wie zum Beispiel humanes Wachstumshormon und insulinähnliche Wachstumsfaktoren, Blutprotein wie humaner Gewebsplasminogenaktivator (tPA); Interferone und ähnliche.
Eine Technik, die zum Nachweis derartiger Proteine, die als Antigene bezeichnet werden, verwendet werden kann, ist zur oben beschriebenen kompetitiven Technik direkt analog. Anstelle des diagnostischen Produkts gemäß vorliegender Erfindung werden Antikörper an die feste Oberfläche gebunden. Bei der kompetitiven Technik wird das diagnostische Produkt wie oben beschrieben markiert, wie etwa mit Enzym, und mit dem feststoffgebundenen Antikörper und der Serumprobe, die das Protein mit zu messenden antigenen Determinanten enthält, gemischt. Eine kompetitive immunologische Reaktion tritt zwischen dem immobilisierten Antikörper und sowohl dem nachzuweisenden Antigen als auch dem enzym-markierten diagnostischen Produkt auf. Die Konzentration des nachzuweisenden Antigens ist umgekehrt proportional zum enzymmarkierten diagnostischen Produkt, das an eine feste Oberfläche gebunden ist.
Nach der kompetitiven Reaktion wird die Festphase von der Flüssigphase abgetrennt, und das markierte diagnostische Produkt gemessen.
Die Bindung der Markierung an das diagnostische Produkt kann mit den zuvor genannten herkömmlichen Techniken erreicht werden. Zum Beispiel kann eine Enzymmarkierung an das gD-Protein gebunden werden, indem Glutaraldehyd-Vernetzungsagens verwendet wird.
Bei einer anderen Technik zum Messen von Antigen in einer Probe folgt einem ersten Bindungsschritt vom kompetitiven Typ ein zweiter Bindungsschritt vom Sandwichtyp. Beim ersten Schritt wird das diagnostische Produkt wie oben dargelegt an eine feste Oberfläche gebunden. Es wird mit einer flüssigen Probe gemischt, die das zu bestimmende unbekannte Antigen enthält, sowie mit einer bekannten Menge ein es komplementären Antikörpers. Eine kompetitive Reaktion wird zwischen dem freien Proben-Antigen und dem diagnostischen Produkt auf der Oberfläche durchgeführt. Dann wird die feste Oberfläche gewaschen, und markierter anti-Antikörper, der mit dem Antikörper auf der festen Oberfläche reaktionsfähig ist, wird dem System hinzugefügt. Dieser Schritt umfaßt eine Sandwichtechnik, bei der ein Reaktionsprodukt gebildet wird, das in folgender Anordnung umfaßt:
Feste Oberfläche*diagnostische Produkte*Antikörper*markierter anti-Antikörper. Die Menge an markiertem anti-Antikörper, der an den Antikörper gebunden ist, ist ein Maß für das unbekannte Antigen in der flüssigen Probe.
Testsätze, bei denen das obengenannte diagnostische Produkt eingesetzt wird, sind nützlich für die Diagnose von Antigenen oder Antikörpern durch die obigen Techniken. Ein derartiger Satz umfaßt das diagnostische Produkt und markierten anti-Antikörper, der fähig ist, Antikörper spezifisch zu binden, der zu den antigenen Determinanten des Polypeptids des diagnostischen Produkts komplementär ist. Dieser Testsatz ist für eine Sandwichtyp-ELISA für Proben-Antikörper geeignet.
Ein anderer Testsatz kann das diagnostische Produkt, markierten anti-Antikörper und unmarkierten Antikörper einschließen, der zu den antigenischen Determinanten des Polypeptids komplementär ist. Dieser Testsatz ist wirksam für die sogenannte kompetitive Sandwichtechnik zur Bestimmung von Proben-Antigen. Ein weiterer Testsatz umfaßt das diagnostische Produkt gemeinsam mit markiertem Antikörper, der zu den antigenen Determinanten des Polypeptids des diagnostischen Produkts komplementär ist. Dieser Testsatz ist für die Bestimmung von Antikörper in der Probe durch eine kompetitive Technik geeignet.
Das diagnostische Produkt im Testsatz kann in Lösung oder an die feste Oberfläche gebunden in der Form vorliegen, in der er zu verwenden ist. Zum Beispiel kann das diagnostische Produkt auf die innere Oberfläche eines Teströhrchens oder Näpfchens einer Platte mit mehreren Näpfchen zur direkten Verwendung im letztendlichen Immunassay geschichtet werden. Diese Form zeigt besonders gut die Vorteile der Stabilität des molekular geklonten diagnostischen Produkts im Vergleich zur Verwendung des lebenden Virus. Natürlich erleichtert es das Testen in einem Labor oder einer Arztpraxis wesentlich, weil das molekular geklonte Produkt nicht infektiös ist, wie es das lebende Pathogen wäre, das bei Immunoassays nach dem Stand der Technik verwendet wird.
Die folgenden Beispiele liefern Informationen und veranschaulichen Techniken, die für die vorliegende Erfindung nützlich sind.
Beispiel 1
Dieses Beispiel veranschaulicht das Verfahren zur Bildung und Charakterisierung der gD-Proteine von HSV-1 und HSV-2-Proteinen.
Detaillierte Beschreibung (Beispiele)
Viruswachstum und virale DNA-Isolierung
HSV1 (Stamm Hzt) und HSV2 (Stamm G) wurden in Hep 2-Zellen bei 37°C bzw. 33°C gezogen. Die virale DNA wurde von infizierten Zellkulturen durch Proteinase-K-Digestion und CsCl-Banding isoliert (23).
Klonen der gD-Gene von HSV1 und HSV2
Vorherige Mapping- und Klonungsuntersuchungen hatten das HSV1 gD-Gen bei –6,6 kb BamHI-Fragment lokalisiert (6,24). HSV1-DNA wurde mit BamHI gespalten, und der 6–7 kb-Bereich wurde durch Agarosegelelektrophorese isoliert. Dieses Fragment wurde in BamHI-digeriertes pBR322 ligiert, und die resultierende Mischung wurde verwendet, um E.coli Stamm 294 (ATCC Nr. 31446) zu transformieren. Die ampicillinresistenten, tetrazyklinempfindlichen Plasmide wurden durch Restriktionsenzymdigestion auf das richtige HSV1-Fragment gescreent. Das richtige gD-hältige Sst1-Fragment wurde in Sst1-digeriertes Plasmid pFM3 subgeklont (EP-A Veröffentlichungsnummer 0068693; 5. Januar 1983).
Obwohl das gD-Gen von HSV2 zuvor durch Rekombination mit HSV1 gemappt wurde, war die genau Position dieses Gens unbekannt. Deshalb wurde ein ∼ 10 kb HindIII-Fragment vom kleinen einzelnen Bereich des HSV2-Genoms (4) in die HindIII-Stelle des Bakteriophag-Lambda-Klonungsvektors 590 (25) ligiert. In vitro-bepackte Phagen wurden bei geringer Dichte plattiert und mit dem Benton-Davis-Verfahren mit einem ³²P-markierten Subklon des gD-Gens von HSV1 gescreent (26). Positiv hybridisierende Plaques wurden gezogen, die DNA isoliert und das gD-Gen durch Southern-blotting und Hybridisierung mit dem ³²P-markierten HSV1-gD-Gen lokalisiert (27). Die positiv hybridisierenden, HSV2-gD-hältigen Fragmente wurden in das Plasmid pUC9 subgeklont (28).
DNA-Sequenzbestimmung und Computeranalyse
Verschiedene Fragmente von den HSV1 und HSV2 gD-Genen wurden in den m13 Phagevektor mp 9 subgeklont(29) und wurden nach dem Didesoxynukleotidverfahren von Sanger (30) sequenziert.
Die Nukleotidsequenzen wurden unter Verwendung des HOM-Programms analysiert (31). Die Hydropathie der abgeleiteten Proteinsequenz wurde analysiert, wobei eine Breite von 12 und ein Sprung von 1 verwendet wurde (31a).
Klonen der gD-Bereiche von HSV1 und HSV2
Andere Untersuchungen hatten das HSV1-gD-Gen zum 6,6 kb BamHI J-Fragment nach der Nomenklatur von Roizman lokalisiert (6, 12, 24). Isolierung und Sequenzieren von Teil dieses Fragments zeigte, daß dieses Fragment das HSV1-gD-Gen enthielt. Da erwartet werden kann, daß die DNA-Sequenzen des HSV1-gD-Gens relativ homolog zum HSV2-gD-Gen sein würden, wurde dieses Fragment als eine Sonde für die Isolierung des gD-Gens vom HSV2-Genom verwendet.
Da die meisten der Gene von den HSV1 und HSV2-Genomen kolinear zu mappen scheinen (35), wurde der Bereich vom kleinen einzelnen Bereich des HSV2-Genoms, der dem HSV1-gD-Bereich entspricht (dem HindIII L Fragment (12)), in einem Lambdaphagevektor geklont. Screenen der resultierenden Plaques mit einem ³²P-markierten HSV1-gD-Gensubklon zeigte positiv hybridisierende Plaques, was darauf hindeutet, daß es tatsächlich Nukleinsäuresequenzhomologie zwischen den beiden Virusgenomen in diesem Bereich gab. Isolierung der Phage-DNA und darauffolgende Southernblotanalyse zeigten den Bereich dieses Fragments auf, der dem gD-Gen entspricht. Dieser Bereich wurde für DNA-Sequenzanalyse subgeklont.
Die Kodierungsbereiche
1 veranschaulicht die beiden mit dem HOM-Programm (31) verglichenen gD-DNA-Sequenzen. Nukleotid Nummer 1 wird als das A des ATG-Initiatormethionins ausgewählt. Vom HOM-Computerprogramm wurden Zwischenräume eingefügt, um die Sequenzhomologien zu maximieren (31). Nukleotidunterschiede werden durch das Symbol (*) angezeigt, während Aminosäureunterschiede umrandet gezeigt werden. Aminosäureunterschiede zwischen der hierin berichteten HSV1-gD-Sequenz, die für den Hzt-Stamm von HSV1 bestimmt wurden, und der von Watson et al. (6) für den Patton-Stamm berichteten werden durch das Symbol (+) angezeigt. Der Beginn der HSV1-gD-Gentranskription, der durch einen Pfeil markiert ist, stammt von Watson et al. (32). Mögliche N-verbundene Glykosylierungsstellen werden schraffiert gezeigt. Zwei mögliche "TATA"Sequenzen werden 5' zum Beginn von gD-Transkription gezeigt, während eine dritte mögliche "TATA"-Sequenz 5' bis zu einem zweiten offenen Leseraster am 3'-Ende der HSV2-Sequenz gezeigt wird. Zwei Bereiche von nicht-Kodierungssequenzhomologie sollten 5' zu den gD-Genen und 5' zum zweiten offenen Leseraster von der HSV2-Sequenz beachtet werden.
Die Hydropathie von gD-Proteinen
Die Hydropathie eines jeden Glykoproteins wurde unter Verwendung eines von Hopp et al (31a) entwickelten Programms analysiert. Wie in 2 gezeigt, ist ein hydrophober Transmembranbereich am 3'-Ende des Gens vorhanden. Zwölf Aminosäuren lange Abschnitte wurden analysiert, und die durchschnittliche Hydrophatie wurde berechnet. Unterschiede in den Resten zwischen den beiden Glykoproteinen werden gezeigt, wobei konservierende Veränderungen mit (*) und nicht konservierende Veränderungen mit (+) markiert sind. A) HSV1 gD-Proteinhydropathie, B) HSV2 gD-Proteinhydropathie.
Die DNA-Sequenzanalyse zeigt, daß die HSV1 und HSV2 gD-Proteine zu 80 % homolog sind. Die Mehrzahl der Unterschiede, die zwischen diesen beiden Proteinen festgestellt wurden, lagen in den Amino- und Carboxy-terminalen Bereichen. Der aminoterminale Bereich dieser Proteine enthält einen im hohen Maße hydrophoben Bereich, der einen Argininrest nahe zum aminoterminalen Methionin enthält. Dieser hydrophobe Bereich ist die Signalsequenz, die für ausgeschiedene und membrangebundene Proteine charakteristisch ist und die vermutlich so funktioniert, daß sie zumindest einen Teil des Proteins in das Lumen des endoplasmatischen Retikulums leitet (33). Ein Vergleich der ersten zwanzig aminoterminalen Aminosäuren zeigte, daß es insgesamt 12 Unterschiede zwischen den Typ 1 und Typ 2 Genen gab. Praktisch alle der Unterschiede sind jedoch konservierend, da sie für andere hydrophobe Aminosäuren kodieren. Die Ausnahmen sind der gly-arg Ersatz an Rest 3 und der arg-gly Ersatz bei Rest 7. Obwohl diese Ersätze nicht konservierend sind, verändern sie die Reinstruktur des Signalbereichs nicht. Beide Gene behalten einen positiv geladenen Rest innerhalb der ersten 10 Aminosäuren bei.
Das Hydropathieplot in 2 zeigte einen hydrophilen carboxyterminalen Bereich, dem ein hydrophober Bereich voranging. Diese Struktur ist für membrangebundene Glykoproteine charakteristisch und ist zuvor in anderen viralen Oberflächenantigenen festgestellt worden (5, 34). Ihre Funktion besteht darin, das Protein in den zellularen und viralen Membranen zu verankern und als solche spielt sie eine wichtige Rolle bei der Virusinfektion. Zwölf Aminosäureveränderungen in diesem Bereich der gD-Proteine wurden von den Resten 333 bis 362 gefunden, von denen die meisten konservierend waren. Das deutet darauf hin, daß das einzige Kriterium für die Aminosäuren in diesem Bereich darin besteht, daß sie überwiegend apolar sind, um die Lipiddoppelschicht zu überspannen. Zusätzlich zeigt der Bereich nach dem Membranbereich (Reste 363–375), der vermutlich dazu dient, das Protein in der Membran zu verankern (33), 5 Veränderungen in seinen ersten 13 Resten gefolgt von einem langen homologen Abschnitt. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, daß die anfänglichen 10–15 Reste im carboxyterminalen hydrophilen Bereich nur einer Verankerungsfunktion dienen und deshalb nur geladen werden müssen, während die darauffolgenden 23 Reste einigen anderen Funktionen dienen können, die für das gD-Protein im speziellen wichtig sind.
Obwohl in diesen beiden ganzen Proteinen viele Aminosäureveränderungen zu finden sind, ist die überwiegende Mehrheit dieser Veränderungen konservierend. Diese Tatsache wird von der Struktur unterstrichen, die durch das Hydropathieprogramm wie in 2 gezeigt aufgedeckt wird. Wie aus diesem Vergleich zu erkennen ist, zeigen die beiden Glykoproteine sehr ähnliche Plots. Die Aminosäureveränderungen, die nicht konservierend sind, scheinen die Hydropathie des Proteins nicht zu verändern.
Expression des HSV-1 gD
Um eine permanente membrangebundene gD-erzeugende Zellinie zu erreichen, wurde das gD-hältige Fragment in einen Säugetierexpressionsvektor (36) ligiert (3), der den wählbaren Marker, Dihydrofolatreduktase (dhfr) enthielt. 3 zeigt ein Diagramm des Plasmids, pgD-dhfr, das zur Expression von HSV-1 Glykoprotein D konstruiert ist. Das Expressionsplasmid bestand aus dem Replikationsursprung und dem β-Laktamasegen (amp^r), das vom E.coli Plasmid pBR322 abgeleitet war (31), einer cDNA-Einfügung, die für Maus dhfr kodierte unter der Steuerung des SV-40 Frühpromotors und einem 4,6 kb HindIII bis BamHI-Fragment, das das gD-Gen enthielt, ebenfalls unter der Steuerung des SV-40 Frühpromotors. Das HindIII-Ende dieses Fragments liegt 74 by zur 5'-Seite des Einleitungsmethioninkodons und umfaßt die mRNA-Kappenstelle. Die HindIII-Stelle liegt 250 by zur 3'-Seite der Goldberg-Hogness-Box des SV-40 Promotors. Der Kodierungsbereich des gD-hältigen Fragments ist 1179 by lang und grenzt an einen großen (1,9 kb) 3'-Bereich an, der zumindest einen Teil des Glykoprotein-E-Gens (24, 32), ein Translations-Stopkodon und eine Polyadenylierungsstelle enthält.
Das Plasmid pgD.dhfr wurde folgendermaßen konstruiert: Das 4,6 kb HindIII-BamHI-Fragment, das die gesamte gD-Kodierungssequenz enthielt, wurde vom BamHI-Fragment isoliert, das vom HSV1-Genom geklont wurde (siehe oben). Das 2,8 kb HindIII-Sal 1-Fragment, das einen SV40 Ursprungs-Frühpromotor enthielt, und das pBR322 Ampicillinresistenzgen und Ursprung der DNA-Replikation wurden vom Plasmid pEHBaI 14 isoliert. Das 2.1 kb Sal 1-Bam H1 Fragment, das ein Mäuse-Dihydrofolat-Reduktase cDNA-Klon unter der Steuerung eines zweiten SV40 Ursprungs-Frühpromotors enthielt, wurde aus dem Plasmid pE348NBV E400D22 isoliert (36). Diese drei Fragmente wurden in einer Dreifachligierung unter Verwendung von T4 DNA-Ligase aneinanderligiert, und die resultierende Mischung wurde verwendet, um E.coli Stamm 294 umzuwandeln. Die resultierenden Kolonien wurden gezogen und die Plasmid-DNA durch Digestion mit Sac 2 gescreent. Die korrekte DNA-Konstruktion pgd-dhfr (3) wurde für weitere Transfizierungsuntersuchungen verwendet.
Das Plasmid wurde in Chinese Hamster Ovary Zellen (CHO) eingebracht, die einen Mangel an Produktion von dhfr aufwiesen (39), wobei ein Kalziumphosphatausfällungsverfahren verwendet wurde (40). Kolonien, die zum Wachstum in Medium, das einen Mangel an Hypoxanthin, Glyzin und Thymidin aufweist, fähig waren, wurden erhalten, und neun dhfr⁺ Klone wurden analysiert. Von diesen konnte in fünf Kolonien unter Verwendung von anti-HSV-1-Antikörpern in Radioimmunoausfällung und indirekten Immunofluoreszenzassays gD nachgewiesen werden. Eine der fünf Linien (gD12) wurde zur weiteren Untersuchung bestimmt. Um das geklonte gD-Genprodukt zu charakterisieren, wurden gD12-Zellen mit ³⁵S-Methionin oder ³H-Glukosamin metabolisch markiert und durch Radioimmunausfällung analysiert. Das verwendete Verfahren war folgendermaßen: Zellen wurden in Ham's F12-Medium (Gibco) gezogen, dem 7% handelsüblich dialysiertes fötales Rinderserum (Gibco), Penicillin (10 E/ml) und Streptomycin (100 E/ml) zugesetzt worden war. Wenn die Kulturen zu etwa 80 % konfluent waren, wurde das Medium entfernt, die Zellen wurden zweimal mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen, und Markierungsmedium (Dulbecco's modifiziertes Eagle's Medium, das ein Zehntel der normalen Konzentration entweder an Methionin oder Glukose enthielt) wurde bis zu einer Endkonzentration von 0,064 ml/cm² hinzugefügt. Entweder ³⁵S-Methionin (SJ.204, Amersham Int.) (50–75 μCi/ml) oder ³H-Glukosamin (100 μCi/ml) wurde hinzugefügt, und die Zellen wurden für weitere 18–20 Stunden gezogen. Nach dem Markieren wurde das Medium geerntet und die Zellen wurden zweimal in PBS gewaschen und durch Behandlung mit PBS, das 0,02 EDTA enthielt, von der Kulturplatte entfernt. Die Zellen wurden dann in Lyse-Puffer solubilisiert, bestehend aus: PBS, 3 % NP-40, 0,1 Rinderserumalbumin, 5 × 10^–5 M Phenylmethylsulfonylfluorid und 0,017 TIU/ml Apoprotinin, und das resultierende Lysat wurde durch Zentrifugation mit 12.000 × g geklärt. Für Immunausfällungsreaktionen wurden Zell-Lysate 3fach mit PBS verdünnt, und Aliquote (typischerweise 180 μl) wurden mit 2–5 μl Antiseren gemischt und bei 4°C 30 min lang inkubiert. Immunkomplexe wurden dann nach dem Verfahren von Kessler (40a) an fixierte S.aureus-Zellen adsorbiert und durch Zentrifugation mit 12000 × g 30 Sekunden lang ausgefällt. Die S.aureus-Zellen wurden dann dreimal mit Waschpuffer (PBS, 1 % NP-40, 0,3 % Natriumdodecylsulfat) gewaschen, und die Immunkomplexe wurden mit 20 μl Polyacrylamidgelprobepuffer (62,5 mM Tris-HCl-Puffer, pH 6,8, der 10 % Glycerin, 5 % 2-Mercaptoäthanol, 0,01 % Bromphenolblau enthielt) bei 90°C 3 Minuten lang eluiert. Nach 30 Sekunden Zentrifugation wurden die Überstände auf 10% Polyacrylamidplattengels gemäß dem Verfahren von Laemmli (45) aufgebracht.
5A vergleicht Autoradiographe, die mit der gD12-Zell-Linie erhalten wurden, und HSV-1 infizierte Zellen: Kontrollimmunausfällung vom gD12-Zell-Lysat mit normalem Kaninchenserum (Bahn 1); Immunausfällung von in HEL-Zellen (Bahn 2) und A549-Zellen (Bahn 3) gezogenem nativen gD mit dem monoklonalen anti-gD-Antikörper, 55S (41); Immunausfällung von geklontem gD vom gD12-Zell-Lysat mit polyklonalen Kaninchenantikörpern (Dako Corp.) gegen HSV-1 (Bahn 4), und dem monoklonalen Antikörper, 55-S (Bahn 5); Immunausfällung von geklontem gD von den mit ³H-Glukosamin metabolisch markierten gD12-Zellen mit polyklonalen Kaninchen anti-HSV-1 Antikörpern (Bahn 6).
Es ist zu erkennen (Bahnen 4 und 5), daß ein diffuses Band mit 59–60 kd speziell von der gD12-Zellinie ausgefällt wurde, wobei entweder Kaninchen anti-HSV-1 Antikörper oder der monoklonale anti-gD Antikörper 55-5 verwendet wurde, der für das HSV-1 Protein spezifisch ist (41). Dieses Molekulargewicht ist in guter Übereinstimmung mit dem, das für von HSV-1 infizierten KB-Zellen isoliertes gD berichtet wurde (42). Es ist zu erkennen, daß der gleiche monoklonale Antikörper Proteine mit ähnlichen, aber verschiedenen Molekulargewichten von HSV1 infizierten Zellinien vom Menschen ausfällte. Das von der A549 humanen Lungenkarzinom-Zellinie (Bahn 2) ausgefällte Hauptprodukt betrug 53 kd, und das von der humanen Embryonal-Lungenzellinie (HEL) ausgefällte betrug 56 kd (Bahn 3). Vorherige Untersuchungen (43) haben gezeigt, daß das Molekulargewicht von HSV-Glykoproteinen in Abhängigkeit von der Wirtszelle variiert und daß dieser Unterschied auf Unterschiede in der Glykosylierung zurückzuführen ist. Um zu bestimmen, ob das in CHO-Zellen erzeugte gD-Protein tatsächlich glykosyliert war, wurden die Zellen mit ³H-Glukosamin metabolisch markiert. Weil Bänder mit identem Molekulargewicht (Bahnen 5 und 6) nach dem metabolischen Markieren mit ³⁵S-Methionin oder ³H-Glukosamin ausgefällt wurden, wurde daraus geschlossen, daß das in CHO-Zellen erzeugte gD-Protein glykosyliert ist.
Die humanen Zellinien A549 (ATCC CCL 185) und HEL 299 (ATCC CCL 137) wurden zu Konfluenz in 3,5 cm Gewebskulturplatten gezogen und mit HSV-1 bei einer Multiplizität von 10 pfu pro Zelle infiziert. Virusinfizierte Zellen wurden nach einem Verfahren markiert, das dem von Cohen et al. (44) beschriebenen ähnlich ist. 4 Stunden nach der Infektion wurde das Medium entfernt, und die Zellen wurden einmal mit frischem Medium (Dulbecco's modifiziertes Eagle's Medium) und einmal mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen. Frisches Medium, das ein Zehntel der normalen Konzentration an Methionin enthielt, wurde dann den Zellen gemeinsam mit ³⁵S-Methionin (Amersham, International) bis zu einer Endkonzentration von 75 μCi pro ml Medium hinzugefügt. Die Zellen wurden weitere 20 Stunden gezogen und dann durch Behandlung gewaschener Zellen mit PBS, das EDTA enthielt (0,02 %) geerntet. Virale Proteine wurden in Lysepuffer solubilisiert, der aus PBS, 3 % NP-40, 1 % Rinderserumalbumin, 5 × 10^–5 M Phenylmethylsulfonylfluorid und 0,017 TIU/ml Apoprotinin bestand. Das resultierende Lysat wurde durch Zentrifugation bei 12 000 × g in einer Mikrozentrifuge geklärt. Für Immunausfällungsreaktionen wurden die Zell- oder Viruslysate 3-fach mit phosphatgepufferter Salzlösung verdünnt, mit 2–5 μl des passenden Antiserums gemischt und 30 min lang bei 4°C inkubiert. Antikörper-Antigen-Komplexe wurden vom Reaktionsmedium durch Hinzufügen von 25 μl einer 10-%igen Lösung fixierten S.aureus (Kessler (40a)) entfernt und wurden durch Zentrifugation mit 12000 × g 30 Sekunden lang ausgefällt. Die S.aureus-Zellen wurden dann 3mal mit Waschpuffer (PBS, 1 % NP-40, 0,3 Natriumdodecylsulfat) gewaschen, und die Zellen wurden in 20 μl Polyacrylamidgelprobepuffer (10 % Glycerin, 5 % 2-Merkaptoäthanol, 0,0625 M in pH 6,8 Tris-Puffer, 0,01 % Bromphenolblau) suspendiert und 3 Minuten lang bei 90°C inkubiert. Nach der Zentrifugation (12000 × g) 30 Sekunden lang wurden die Überstände auf 10% Polyacrylamidplattengels aufgebracht (45).
Um die posttranslationale Verarbeitung von geklonten gD weiter zu erforschen, wurden Impuls-Chase-Untersuchungen durchgeführt. 5B zeigt Immunausfällung von geklontem gD von gD-12-Zellen mit Kaninchen anti-HSV-1 Antikörpern (Dako, Corp.) zu verschiedenen Zeiten nach Impulsmarkierung mit ³⁵S-Methionin. 5B zeigt ein Impulsmarkieren der gD12-Zellen. In diesen Untersuchungen wurden Zeilen zu Konfluenz in 10 cm Gewebskulturplatten gezogen und mit ³⁵S-Methionin wie oben beschrieben markiert, mit der Ausnahme, daß die Markierungsreaktion 15 min lang auf Eis durchgeführt wurde, die Zellen 3mal mit frischem Medium gewaschen und dann zum Inkubator zurückgeführt und bei 37°C für unterschiedliche Zeiträume inkubiert wurden. Die Reaktionen wurden durch Waschen der Zellen in kalter phosphatgepufferter Salzlösung und Solubilisieren der Zellen wie oben beschrieben beendet. Proteine wurden über die folgenden Zeiten nach dem Impulsmarkieren immunausgefällt: Bahn 1, 5 min; Bahn 2, 15 min; Bahn 3, 30 min; Bahn 4, 60 min; Bahn 5, 120 min. Die Vorläuferform von gD mit einem Molekulargewicht von 51 kd wurde im speziellen von der gD12 Zellinie 5 Minuten nach einem Impuls mit ³⁵S-Methionin ausgefällt, und dieser Vorläufer nach etwa 60 Minuten in die höhere Molekulargewichtsform (59 kd) getrieben. Aufgrund dieser Untersuchungen wird geschätzt, daß die Halbwertszeit dieses posttranslationalen Vorgangs etwa 45 min beträgt. Die Vorläufer-Produkt-Beziehung zwischen dem 51 kd-Band und dem 59 kd-Band ähnelt stark der für viruserzeugtes gD berichteten (14, 42, 46, 47), und die Kinetik dieses Verfahrens ist ähnlich der von Cohen et al. (42) beschriebenen. In virusinfizierten Zellen ist der Unterschied im Molekulargewicht zwischen dem Vorläufer und dem Produkt sowohl N-verbundenen als auch O-verbundenen Oligosacchariden zugeschrieben worden (48).
Um zu bestimmen, ob gD an die Zelloberfläche transportiert wurde, wurden indirekte Immunofluoreszenzuntersuchungen durchgeführt. Bei diesen Untersuchungen wurden Kaninchen-, Maus-, und humane anti-HSV-Antikörper mit nichtfixierten Zellen unter Bedingungen umgesetzt, welche die Zellmembran nicht durchlässig machen (49). gD12-Zellen und parentale CHO-Zellen (1:1-Verhältnis) wurden auf Deckgläser (2,2 × 2,2 cm) plattiert und gezogen, bis die Zellen zu etwa 60 % konfluent waren. Humanes Serum, von dem bekannt war, daß es Antikörper gegen HSV-1 enthielt (50), wurde vierzigfach mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) verdünnt, und 100 μl wurden mittels Pipette auf gewaschene Zellen aufgebracht und 30 min lang bei Raumtemperatur in einer befeuchteten Kammer inkubiert. Die Zellen wurden dreimal in PBS getaucht, um ungebundenen Antikörper wegzuwaschen, und wurden dann mit 100 μl 20fach verdünnten Tetramethylrhodaminisothiocyanat-markierten Ziegen-antihuman-IgG-Antikörpern (Cappel Laboratories) für weitere 30 Minuten inkubiert. Der ungebundene markierte Antikörper wurde mit PBS weggewaschen, und die Zellen wurden in eiskaltem 50%igem Äthanol und 100%igem Äthanol dehydratisiert und mit Glycerin auf einem Mikroskop-Plättchen rehydratisiert (49). Die Zellen wurden dann unter Phasenkontrast- und Fluoreszenzoptik im Fluoreszenzmikroskop (Zeiss) betrachtet. 4 zeigt: A, gD12 und CHO Zellen, mit Phasenkontrastoptik sichtbar gemacht betrachtet; B, Fluoreszenzbild derselben Zellen wie in A. Vergleich der Phasenkontrastbilder mit den Fluoreszenzbildern (4) zeigte, daß die gD12-Zellen stark markiert waren, während die parentalen CHO-Zellen wenig oder keinen markierten Antikörper banden. In Kontrollversuchen mit normalen Maus-Seren, normalen Kaninchen-Seren oder humanen Seren, von denen bekannt war, daß sie bezüglich HSV-Antikörpern negativ waren, konnte kein spezifisches Markieren der Zellen nachgewiesen werden. Diese Untersuchungen deuteten darauf hin, daß das gD zur Zelloberfläche transportiert wurde. Versuche mit CHO- und gD12-Zellen, die vor dem Markieren mit Agenzien fixiert wurden, von denen bekannt ist, daß sie die Zellmembran durchlässig machen (Methanol oder Aceton) ergaben ein unterschiedliches Markierungsmuster. In diesen Untersuchungen wurde starkes perinukleares Markieren der gD12-Zellen mit anti-HSV-1 Antikörpern und kein spezifisches Markieren der CHO-Zellen beobachtet.
Um zu bestimmen, ob gD12-Zellen antigene Determinanten exprimierten, die für HSV-1 und HSV-2 Infektionen beim Menschen relevant sind, wurde die Bindung von Antikörpern von Individuen, von denen bekannt war, daß sie anti-HSV-1 oder anti-HSV-2 Antikörper besaßen (50), untersucht. Radioimmunausfällung von Lysaten von metabolisch markierten gD12-Zellen ergab Ergebnisse, die mit denen vergleichbar waren, die mit Nagetier anti-HSV Seren erhalten wurden (5). Auf ähnliche Weise ergaben humane anti-HSV-1-Seren spezifische Markierung von gD12-Zellen in einem indirekten Immunfluoreszenzassay (4) und markierten die parentale CHO-Zellinie nicht. Zusammengenommen bieten die mit verschiedenen Nagetier-anti-HSV-1 und HSV-2-Antiseren, monoklonalen anti-gD-Antikörpern und humanen anti-HSV-Antiseren erzielten Ergebnisse Beweis dafür, daß auf der Oberfläche von gD12Zellen exprimiertes gD eine Anzahl von antigenen Determinanten besitzt, die es mit dem nativen Virus gemeinsam hat, und daß die Struktur dieser Determinanten nicht von Wechselwirkungen mit anderen HSV-1-Proteinen abhängt. Die Tatsache, daß von einem der getesteten monoklonalen Antikörper (1-S) bekannt ist, daß er HSV-1 in vitro (41) und in vivo (51) neutralisiert, zeigt, daß das in CHO-Zellen erzeugte gD zumindest eine der neutralisierenden antigenen Determinanten gemeinsam mit dem nativen Virus besitzt.
Beispiel 2
Dieses Beispiel veranschaulicht die Verwendung von in Beispiel 1 gebildeten gD12-Zellen in einem Immunoassay vom Sandwichtyp zum quantitativen Messen der Bindung von anti-HSV-Antikörpern an gD12-Zellen in einem enzymgekoppelten Immunosorptionsassay (ELISA) (52). Bei diesen Untersuchungen wurden gD12-Zellen und CHO-Zellen abwechselnd in Näpfchen von Mikrotitergewebskulturplatten mit 96 Näpfchen plattiert und chemisch fixiert. Verschiedene Antiseren, von denen bekannt war, daß sie Antikörper zu HSV enthielten, wurden dann reihenverdünnt und mit den fixierten Zellen umsetzen gelassen (siehe Verweis 52). Am Ende des Assays wurde die dekadische Extinktion in jedem Näpfchen gemessen und normale Bindungskurven wurden konstruiert. Die spezifische Bindung von Antikörpern an die gD12-Zellen wurde durch Subtrahieren der mit den parentalen CHO-Zellen erhaltenen Werte von den von den gD12Zellen erhaltenen bestimmt. Spezifische Bindung durch Hochtiterseren konnte bei Verdünnungen von 1:10.000 nachgewiesen werden.
Serumtiter, die unter Verwendung des gD12-Zell-ELISA-Assays bestimmt wurden, wurden mit anti-HSV-1 und anti-HSV-2 Titern verglichen, die nach herkömmlichen Verfahren bestimmt wurden. Humane Seren, die zuvor durch herkömmliche Assays, z.B. Hemmung von Hämagglutination (IHA) oder Komplementfixierung (CF) gegen HSV titriert worden waren (50), wurden in Näpfchen von Mikrotiterplatten reihenverdünnt, die entweder gD12-Zellen oder die parentale CHO-Zellinie enthielten, und die Bindung von anti-gD-Antikörpern wurde in einem ELISA-Assay überwacht. gD12-Zellen und die parentalen CHO-Zellen wurden abwechselnd in Näpfchen von Mikrotiter-Gewebskulturplatten mit 96 Näpfchen (Falcon Labware) eingepflanzt und wurden zu Konfluenz in F12-Medium (GIBCO) gezogen, das 10 % fötales Rinderserum enthielt. Die Zellen wurden dreimal mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen und wurden dann mit 0,0625 % Glutaraldehyd in PBS chemisch fixiert. Die Zellen wurden wieder dreimal mit PBS gewaschen und, bis sie gebraucht wurden, bei 4° in PBS gelagert, das 1 % Rinderserumalbumin, 100 mM Glycin 1 mM NaN₃ enthielt. Um anti-gD-Antikörper-Titer zu messen, wurden die Zellen mit PBS gewaschen, und reihenverdünnte Antiseren ließ man mit den fixierten Zellen (50 μl Endvolumen) 1 Stunde lang bei Raumtemperatur reagieren. Ungebundener Antikörper wurde weggewaschen und die Zellen wurden mit 50 μl 1:2000 verdünntem Ziegen anti-human IgG gekoppelt mit Meerrettichperoxidase (Tago, Inc.) inkubiert. Der enzymgekoppelte Antikörper wurde eine Stunde lang bei Raumtemperatur reagieren gelassen, und die Zellen wurden dann dreimal mit PBS gewaschen. Nach der Inkubation wurde das Peroxidasesubstrat, o-Phenylendiamin, hinzugefügt (200 μl), und man ließ die Reaktion 10 Minuten lang weiter andauern. Die Reaktion wurde durch Hinzufügen von 2,5 M H₂SO₄ (50 μl) beendet, und die dekadische Extinktion des Reaktionsmediums von jedem Näpfchen wurde mit einem automatisierten Plattenlese-Spektralphotometer (Titertek) bestimmt. In 6 wies das durch die offenen und geschlossenen Kreise dargestellte Serum einen HSV-1 CF Titer von 128 und HSV-1 und HSV-2 IHA Titer von 4096 auf. Das durch offene und geschlossene Quadrate dargestellte Serum wies einen HSV-1 CF-Titer von < 8 und HSV-1 und HSV-2 IHA Titer von < 8 auf. A, geschlossener Kreis und geschlossenes Quadrat zeigen Bindung an gD12-Zellen an; offener Kreis und offenes Quadrat zeigt Bindung an CHO-Zellen an. B, geschlossener Kreis und geschlossenes Quadrat stellt die spezifische Bindung an gD12-Zellen, berechnet durch Subtraktion der Werte in A, dar. In 6 ist zu sehen, daß ein Serum mit hohem anti-HSV-Titer, bestimmt durch herkömmliche Assays, einen hohen ELISA-Titer ergab, während ein anderes Serum mit niedrigen anti-HSV-Titern keine nachweisbare Bindung in der gD12 ELISA ergab.
Die beschriebenen Untersuchungen zeigen, daß stabile Zellinien an ihrer Oberfläche ein transfiziertes Genprodukt konstitutiv exprimieren, das sich an Antikörper bindet, die durch Herpesvirusinfektion erzeugt wurden.
Eine Vielzahl von Transfektionsschemata ist selbstverständlich möglich, wobei eine Vielzahl auswählbarer Marker verwendet wird. Zum Beispiel können Maus-L-Zellen nützlich unter Verwendung eines mutanten dhfr-Gens als ein auswählbarer Marker transfiziert werden. Das gDGen wurde in derartige Zellen über einen Vektor transfiziert, dem ein derartiger Marker innewohnte.
Eine Zellinie wie gD12 kann inter alia bei der klinischen Diagnose von HSV-1 und HSV-2-Infektionen verwendet werden. Die Möglichkeit der Entwicklung diagnostischer Reagenzien auf der Basis von klonalen Zellinien ist attraktiv, weil sie die Notwendigkeit zur Kultivierung und dem Unter-Verschluß-halten infektiöser Agenzien beseitigt und gleichzeitig eine stabile, gut definierte reproduzierbare Quelle für Antigen schafft. Wenn ein Diagnosesystem auf Zellbasis in Form einer ELISA aufgebaut ist, kann die Antikörper-Bestimmung in 2 Stunden oder weniger durchgeführt werden und erfordert weniger als 50 μl Serum.
Beispiel 3
Dieses Beispiel veranschaulicht die Entfernung der Membran vom exprimierten membrangebundenen Protein.
Die vorangehende Beschreibung betrifft die Herstellung von membrangebundenem gD-Protein. Jedoch identifizierte, wie oben in Zusammenhang mit 2 besprochen, die Analyse der Aminosäuresequenzen des gD Proteins von HSV-1 und HSV-2 in jedem Fall einen hydrophoben/hydrophilen carboxyterminalen Membranbindungsbereich.
Ein schematisches Diagramm des HSV 1 Glykoproteins D (gD) (7) Hydrophobe (schraffierte) und hydrophile (mit + markierte) Bereiche des Proteins wurden von der Hydropathieanalyse (31a) der von der Gensequenz abgeleiteten gD-Proteinsequenz bestimmt. Nur die für Membranlokalisierung und -bindung für wichtig gehaltenen Bereiche werden gezeigt. Die funktionellen Bereiche sind: a) die Signalsequenz (33), b) der hydrophobe Transmembranbereich und c) der geladene Membrananker. Die drei mutmaßlichen N-gebundenen Glykosylierungsstellen werden durch den Buchstaben G angezeigt. Das Expressionsplasmid besteht aus dem pBR322 bakteriellen Replikationsursprung und Ampicillinresistenzgen, einer cDNA-Einfügung, die für Maus-Dihydrofolatreduktasegen unter der transkriptionellen Steuerung des SV40 Frühpromotors kodiert (53), und einem HindIII-Hinfl-Fragment, das für die ersten 300 Aminosäuren von gD unter der transkriptionellen Steuerung eines zweiten SV40 Frühpromotors kodiert. Die HindIII-Stelle dieses Fragments liegt 74 by zur 5'Seite des Einleitungs-Methionins des gD-Gens. Die HindIII-Stelle des SV40 Frühbereichsvektors (36) liegt 250 by zur 3'-Seite der Goldberg-Hogness-Box des SV40-Promotors. Die Hinfl-Stelle (abgestumpft mit Klenow DNA-Polymerase und 4-Desoxynukleotidtriphosphaten) ist an die Hpal-Stelle des 3'-nichttranslatierten Bereichs des Hepatitis-BVirusoberflächenantigengens ligiert (36). Dieses Verfahren ist auch für die Herstellung eines abgestumpften HSV-2-Gens nützlich.
Das Plasmid pgD-Stumpf.dhfr wurde folgendermaßen konstruiert: Das 2,9 kb gD-hältige Sac 1-Fragment wurde vom Bam H1-Fragment isoliert, das vom HSV 1-Genom (siehe oben) im Plasmid pFM3 (siehe oben), geschnitten mit Sac 1, geklont war. Ein 1,6 kb HindIII-Bst N1-Fragment, das das gesamte gD-Gen enthielt, wurde in HindIII-Bst N1 digeriertes pFM42 (EP-A-68693) subgeklont. Dieses Plasmid wurde dann mit Hinf 1 geschnitten, mit Klenow DNA-Polymerase und vier Desoxynukleotidtriphosphaten abgestumpft und daraufhin mit HindIII geschnitten. Das 960 Basenpaar HindIII-Stumpf Hinf 1-Fragment, das das abgestumpfte gD-Gen enthielt, wurde isoliert und zu HindIII-Hpal digeriertem pEHBal14 ligiert. Die resultierende Konstruktion (pgDCos-Stumpf) enthielt das abgestumpfte gD-Gen mit dem Hepatitis-B-Oberflächenantigengen an seinem 3-Primeende. Ein 2,3 kb HindIII-BamHI-Fragment, das das abgestumpfte gD-Gen enthielt, wurde vom pgDCos-Stumpf isoliert. Das 2,8 kb-Fragment, welches den SV 40 Ursprungs-Frühpromotor und das pBR322 Ampicillinresistenzgen und bakteriellen Replikationsursprung enthielt, wurde vom Plasmid pEHBal 14 isoliert. Das 2,1 kb Fragment, welches den Maus Dihydrofolatreduktase cDNA-Klon unter der transkriptionellen Steuerung eines zweiten SV 40 Frühpromotors enthielt, wurde vom Plasmid pE348HBVE400D22 isoliert (36). Diese drei Fragmente wurden mit T4 DNA-Ligase zusammenligiert, und die resultierende Mischung wurde verwendet, um E.coli Stamm 294 zu transformieren. Plasmid-DNA von den resultierenden Kolonien wurde mit Sac 2 gescreent, und die korrekte Konstruktion pgD-Stumpf.dhfr (8) wurde für weitere Transfektionsuntersuchungen verwendet.
Plasmid.pEHBal 14 wurde durch Spalten von pE342 Δ R1 (unten beschrieben), einer SV40-Hepatitis-Chimäre, mit XbaI, das einmal im Kodierungsbereich des HBV-Oberflächenantigens spaltet, und sequentielles Entfernen von Sequenzen, die diese Xba I Stelle umgeben, unter Verwendung von Nuklease Bal31 konstruiert. Das Plasmid wurde in Gegenwart des synthetischen Oligonukleotids 5'-AGCTGAATTC ligiert, das sich der HBV-DNA mit einer HindIII Restriktionsstelle anschließt.
Resultierende Plasmide wurden nach einem Eco RI-Hind III Fragment mit ∼ 150 b.p. gescreent. pEHBal 14 wurde sequenziert, was die Richtigkeit nachwies, daß eine HindIII-Stelle an einem Punkt gerade stromaufwärts von der Stelle, an der das HBsAg-Einleitungskodon normalerweise zu finden ist, plaziert worden war. Diese Konstruktion plaziert somit eine einzelne HindIII-Stelle, die zum Klonen geeignet ist, an eine Position, wo ein in hohem Maße exprimiertes Protein (HBsAg) Translation einleitet. Jegliche mutmaßlichen Signale, die für starke Expression eines Proteins notwendig sind, sollten an dieser 5'-Leadersequenz vorhanden sein.
Plasmid pE342, das HBV-Oberflächenantigen exprimiert (auch als pHBs348-E bezeichnet) ist von Levinson et al., EPO Veröffentlichung Nr. 0073656, 9. März, 1983, beschrieben worden. (Kurz gesagt wurde der Ursprung des Affen Virus SV40 durch Digerieren von SV40-DNA mit HindIII und Umwandeln der HindIII-Enden zu EcoRI-Enden durch das Hinzufügen eines Umwandlers/Konverters (AGCTGAATTC) isoliert). Diese DNA wurde mit PvuII geschnitten und RI-Linker wurden hinzugefügt. Nach der Digestion mit EcoRI wurde das 348 Basenpaarfragment, das den Ursprung überspannte, durch Polyacrylamidgelelektrophorese und Elektroeluierung isoliert und in pBR322 geklont. Expressionsplasmid pHBs348-E wurde durch Klonen des 1986 Basenpaarfragments konstruiert, das aus EcoRIund BglII-Digestion von HBV (Animal Virus Genetics, (Ch.5) Acad.Press, N.Y. (1980)) (welches das für HBsAg kodierende Gen umspannt) in das Plasmid pML (Lusky et al., Nature, 293: 79 (1981)) an den EcoRI und BamHI-Stellen resultierte. (pML ist ein Derivat von pBR322, das eine löschungseliminierende Sequenz aufweist, die in Affenzellen für Plasmidreplikation hemmend ist). Das resultierende Plasmid (pRI-Bgl) wurde dann mit EcoRI linearisiert, und das den SV40 Ursprungsbereich darstellende 348 Basenpaarfragment wurde in die EcoRI-Stelle von pRI-Bgl eingebracht. Das Ursprungsfragment kann in jeder Ausrichtung eingefügt werden. Da dieses Fragment sowohl für die Früh- als auch die Spät-SV40-Promotoren zusätzlich zum Replikationsursprung kodiert, könnten HBV-Gene gesteuert von jedem Promotor je nach seiner Ausrichtung exprimiert werden (pHBS348-E, das HBs darstellte, exprimiert unter Steuerung des Frühpromotors). pE342 wird durch teilweises Digerieren mit EcoRI, Einfüllen in die gespaltene Stelle unter Verwendung von Klenow DNA-Polymerase I und Zurückzusammenligieren des Plasmids modifiziert, wodurch die EcoRI-Stelle entfernt wird, die dem SV40-Ursprung in pE342 vorangeht. Das resultierende Plasmid wird als pE342ΔR1 bezeichnet.
Die resultierende Sequenz schafft ein Stopcodon (TAA) unmittelbar nach Aminosäure 300 des gD-Gens. Für die Transkriptionsterminations- und Polyadenylierungsstellen für das abgestumpfte gD-Gen-Transkript kodiert der 3' nicht-translatierte Bereich des Hepatitis B Oberflächenantigengens (36).
Der resultierende Vektor wurde in eine dhfr CHO-Zellinie (39) transfiziert (40), und ein geeigneter Klon gG10.2 ausgewählt, der das abgestumpfte gD-Protein erzeugte und es in das umgebende Medium ausschied. Das Protein wurde aus dem Medium extrahiert, und die Zellen wurden auf immunogene Aktivität getestet. 9 zeigt die Ergebnisse von Immunausfällungen von intra- und extrazellularen ³⁵S-Methioninmarkierten Extrakten.
Radioimmunausfällung von zellassoziierten und -ausgeschiedenen Formen von gD:
Zellen wurden in Ham's F12 Medium (Gibco) gezogen, das mit 7 % handelsüblich dialysiertem fötalem Rinderserum (Gibco), Penicillin (100 E/ml) und Streptomycin (100 E/ml) ergänzt war. Als die Kulturen zu etwa 80 % konfluent waren, wurde das Medium entfernt, die Zellen wurden zweimal mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen und Markierungsmedium (Dulbecco's modifiziertes Eagle's Medium, das ein Zehntel der normalen Konzentration an Methionin enthielt) wurde bis zu einer Endkonzentration von 0,05 ml/cm² hinzugefügt. ³⁵S-Methionin (SJ.204, Amersham Int.) wurde bis zu einer Endkonzentration von 50–75 ECi/ml hinzugefügt, und die Zellen wurden weitere 18–20 h gezogen. Nach dem Markieren wurde das Medium geerntet, und die Zellen wurden zweimal in PBS gewaschen und durch Behandlung mit PBS, das 0,02 % EDTA enthielt, von der Kulturplatte entfernt. Die Zellen wurden dann in Lysepuffer solubilisiert, der bestand aus: PBS, 3% NP-40, 0,1 % Rinderserumalbumin, 5 × 10^–5 M Phenylmethylsulfonylfluorid und 0,017 TIU/ml Apoprotinin, und das resultierende Lysat wurde durch Zentrifugation mit 12000 × g geklärt. Für Immunausfällungsreaktionen wurden ZellLysate 3-fach mit PBS verdünnt, und Aliquote (typischerweise 180 μl) wurden mit 2–5 μl Antiseren gemischt und bei 4°C 30 min lang inkubiert. Um die ausgeschiedene Form von gD immunauszufällen, wurden 500 μl konditioniertes Medium mit 2 μl Antiseren 30 min lang bei 4°C inkubiert. Immunkomplexe wurden dann nach dem Verfahren von Kessler (40a) an fixierte S.aureus-Zellen adsorbiert und durch Zentrifugation mit 12000 × g 30 s lang ausgefällt. Die S.aureus-Zellen wurden dann dreimal mit Waschpuffer (PBS, 1% NP-40, 0,3 % Natriumdodecylsulfat) gewaschen, und die Immunkomplexe wurden mit 20 μl Polyacrylamidgelprobepuffer (62,5 mM Tris-HCl-Puffer, pH 6,8, der 10 % Glycerin, 5 % 2-Mercaptoäthanol, 0,01 % Bromphenolblau enthielt) bei 90°C 3 Minuten lang eluiert. Nach dem Zentrifugieren für 30 Sekunden wurden die Überstände nach dem Verfahren von Laemmli (45) auf 10% Polyacrylamidplattengels aufgebracht. A, Immunausfällung von über die gesamte Länge membrangebundenem gD von der gD12-Zellinie. B, Immunausfällung der zellassoziierten Form des abgestumpften gD von Lysaten zweier unabhängig abgeleiteter Zellinien (1 und 2). C, Immunausfällung des abgestumpften gD von den Kulturüberständen der beiden in B gezeigten Zellinien. (–) zeigt Kontroll-Kaninchenantiserum an; (+) zeigt Kaninchen-anti-HSV-1-Antiserum (Dako Corp.) an.
Wie zu sehen ist, sind eine intrazellulare Form mit 35000 Dalton und ein ausgeschiedenes und offensichtlich glykosyliertes extrazellulares gD-Protein evident.
Herstellung von für Immunisierung verwendetes abgestumpftes gD:
gD10.2-Zellen wurden zu Konfluenz in Polystyrolgewebe-Kulturrollenflaschen (Corning 25140) in F12-Medium gezogen, das mit 71 handelsüblich dialysiertem fötalem Kalbserum, 50 μg/ml Streptomycin und 0,3 μg Glutamin ergänzt war. Nach dem Erreichen von Konfluenz wurde das Medium entfernt, und die Zellen wurden dreimal im gleichen Medium gewaschen, das kein fötales Kalbserum aufwies und mit 2 mg/ml Hepespuffer (serumfreies Medium) ergänzt war. Die Zellen wurden dann 3–4 Tage in serumfreiem Medium gezogen, und das konditionierte Medium wurde dann geerntet und bei –20°C gelagert. Das Medium wurde bei 37°C aufgetaut und mit 5000 UpM 20 min lang in einem Sorvall GS-3-Rotor zentrifugiert. Nach dem Zentrifugieren wurde das Pellet verworfen, und der überstand wurde in einer Ultrafiltrationsvorrichtung (Amicon) eingeengt, die mit einer YM-5-Ultrafiltrationsmembran ausgestattet war. Das resultierende Präparat wurde etwa 150-fach bezogen auf das Ausgangsmaterial eingeengt und enthielt etwa 8 mg Protein pro Liter. Das Präparat wurde dann umfassend gegen phosphatgepufferte Salzlösung (PBS) dialysiert und ohne weitere Reinigung zur Immunisierung verwendet.
Die Vorteile der Verwendung des abgestumpften Proteins für diagnostische Anwendungen liegen darin, daß es, weil es in das extrazellulare Medium ausgeschieden wird, mit weitaus weniger Proteinen verunreinigt ist, als sie in einem Ganzzellenpräparat zu finden wären.
Wie zu sehen ist, wird gemäß vorliegender Erfindung eine permanente Zellinie verwendet, um das Protein zu erzeugen. Nach der Transfektion wird der Vektor in das Genom der Zellinie eingebunden und kann das Protein ohne Zell-Lyse erzeugen. Die Zellinie kann so zur kontinuierlichen Erzeugung des Proteins verwendet werden, besonders in der abgestumpften Form, die von der Zelle ausgeschieden wird. Zum Beispiel können die Zellen, die abgestumpftes Protein exprimieren, kontinuierlich in einem Perfusionssystem verwendet werden, indem ständig Antigen-reiches Medium von den Zellen entfernt und durch frisches Medium ersetzt wird.
Die spezielle hierin verwendete Zellinie war eine CHO-Linie, die einen Mangel an dhfr-Produktion aufwies, transfiziert mit einem Vektor,, der einen dhfr-Marker enthielt. Indem man die Zellinie unter geeigneten Bedingungen Methotrexat (Mtx) aussetzt (54), kann die dhfr-Produktion und somit die gekoppelte gD-Proteinproduktion verstärkt werden. Drei durch Transfektion des abgestumpften gD-Gens in dhfr -CHO-Zellen abgeleitete Zellinien wurden parallel plattiert, mit ³⁵S-Methionin markiert und wie in 10 beschrieben immunausgefällt. Die Bahnen 1 und 2 geben die Menge an ausgeschiedenem gD an, das von 500 μl Kulturmedium immunausgefällt ist, das durch zwei unabhängig isolierte Zellinien vor der Selektion mit Methotrexat konditioniert ist. Bahn 3 gibt die Menge an abgestumpften gD an, das von einem gleichen Volumen an Kulturmedium von einer Zellinie (gD10.2.2) immun ausgefällt ist, die zum Wachstum in 250 mM Methotrexat ausgewählt wurde. Kaninchen-anti-HSV1-Antikörper (Dako Corp.) wurden für die in Bahnen 1–3 gezeigten Immunausfällungen verwendet. Bahn 4 stellt eine Kontrollimmunausfällung von 500 μl Medium dar, das durch die gD10.2.2 Zellinie mit normalem Kaninchenserum konditioniert ist.
Um die relativen Mengen an abgestumpften gD zu quantifizieren, die durch Zellinien vor und nach der Selektion in Methotrexat in Kulturmedium ausgeschieden werden, wurde ein kompetitiver ELISA-Assay durchgeführt. gD12-Zellen, die eine membrangebundene Form von gD exprimieren, wurden ausplattiert und mit Glutaraldehyd an der Oberfläche von Mikrotiterplatten mit 96 Näpfchen wie zuvor beschrieben fixiert. Konditioniertes Medium von verschiedenen Zellinien, von denen bekannt war, daß sie abgestumpftes gD produzieren, wurde über die Mikrotiterplatten reihenverdünnt und wurde mit einer festgelegten Menge (2 μl) Kaninchen-anti-HSV-1-Antikörper (Dako Corp) 1 Stunde lang bei 20°C inkubiert. Ungebundener Antikörper und lösliche abgestumpfte gD-Antikörperkomplexe wurden durch dreimaliges Waschen eines jeden Näpfchens mit PBS entfernt. An Ziegen-anti-Kaninchen-IgG gekoppelte Meerrettichperoxidase wurde dann mit den fixierten Zellen 1 Stunde lang bei 20°C umgesetzt, und ungebundener Antikörper wurde durch dreimaliges Waschen mit PBS entfernt. Das kolorimetrische Substrat, OPD (o-Phenylendiamin) wurde dann einem jeden Näpfchen hinzugefügt und mit den gebundenen Meerrettichperoxidase-Antikörperkomplexen 15 min lang reagieren gelassen. Die Reaktion wurde durch Hinzufügen von Schwefelsäure bis zu einer Endkonzentration von 0,25 N beendet. Die dekadische Extinktion des OPD in jedem Näpfchen wurde unter Verwendung eines automatischen Mikrotiterplatten-Scanners (Titertek multiskan) bestimmt, und Verdünnungskurven wurden gezeichnet. Die Bindung von anti-HSV1-Antikörpern an die parentale CHO-Zelllinie wurde verwendet, um das Ausmaß der nichtspezifischen Bindung bei jeder Verdünnung zu messen. Die Menge an abgestumpften gD in jedem Kulturüberstand war umgekehrt proportional zum Wert an dekadischer Extinktion in jedem Näpfchen. Offener Kreis, Bindung von anti-HSV-1-Antikörpern an gD12-Zellen in Gegenwart von Medium, das durch Zellen konditioniert ist, die vor dem Verstärken mit Methotrexat abgestumpftes gD ausscheiden. Geschlossener Kreis, Bindung von anti-HSV-1-Antikörpern an gD12-Zellen in der Gegenwart von Medium von gD10.2.2 Zellen, die zum Wachstum in 250 nM Methotrexat ausgewählt wurden. Offenes Quadrat, Bindung von anti-HSV-1-Antikörpern an gD12-Zellen in der Gegenwart von 100-fach konzentriertem Medium von unverstärkten Zellen, die abgestumpftes gD ausscheiden. Dieses Verfahren wurde an der gD10.2 Zellinie durchgeführt, um eine verstärkte Zellinie gD10.2.2 zu erzeugen, die zum Wachstum in 250 nM Mtx fähig war und die etwa 20mal mehr abgestumpftes gD in das Kulturmedium ausschied, als die parentale gD10.2 Zellinie (siehe 10 und 11).
Das dhfr-Marker/Verstärkungssystem kann mit anderen Zellen verwendet werden, die fähig sind, sich fremde DNA anzueignen und stabil einzubinden.
Der Erfolg dieser Arbeit, wenn es darum geht, zu zeigen, daß eine abgestumpfte Form eines membrangebundenen Proteins, welcher der Teil des hydrophoben-hydrophilen carboxyterminalen Bereichs fehlt, der für sein Binden an die Membran verantwortlich ist, dennoch immunogen sein kann, läßt erkennen, daß ähnliche Ergebnisse mit anderen immunogenen membrangebundenen Proteinen erwartet werden können, wodurch eine verbesserte Quelle für Impfstoff gegen Viren, Parasiten und andere pathogene Organismen geschaffen wird.
Im vorangehenden Beispiel wurde die DNA von gD-Protein an Rest 300 abgestumpft, weil es dort eine zweckmäßige Restriktionsstelle gab. Das führte zu dem Ergebnis, daß der carboxyterminale hydrophobe/hydrophile Bereich vollständig entfernt wurde, wie aus dem Hydropathieplot von 2 zu ersehen ist; tatsächlich wurde ein zusätzlicher vorhergehender Bereich von Rest 301 bis 332 entfernt, offensichtlich ohne daß der immunogene Charakter des Proteins zerstört wurde. Daraus scheint deshalb zu folgen, daß bei diesem Protein, und wahrscheinlich bei anderen immunogenen membrangebundenen Proteinen, das Ausmaß an Abstumpfung gewünschtenfalls beträchtlich geringer sein könnte, solange es die Wirkung hat, den Membranbindungscharakter zu entfernen, sodaß das Protein in das umgebende Medium ausgeschieden wird.
Beispiel 4
Beispiel 4 betrifft ein HSV-2 gC Protein (zuvor als ein gF-Protein bezeichnet).
Zellen, Virus und DNA-Isolierung:
HSV-2 (Stamm G) wurde auf HEp 2-Zellen nach Infizieren der Zellkultur mit einer Input-Multiplizität von 0,1 3 Tage lang bei 33°C in Dulbecco's Modified Eagles Medium gezogen, das 10 % fötales Rinderserum und Antibiotika enthielt. HSV-2 DNA wurde durch Proteinase K-Digestion, gefolgt von CsCl-Ultrazentrifugation wie beschrieben (23) isoliert.
DNA-Manipulationen:
Restriktionsenzyme, DNA-Polymerase-Klenow-Fragment, T4-DNA-Ligase und T4-Polynukleotidkinase wurden von Bethesda Research Labs gekauft und nach den Anweisungen des Lieferanten verwendet.
Molekulares Klonen von HSV-2 DNA-Restriktionsfragmenten:
Das EcoRI "P"-Fragment, das der ungefähren Planposition ∼ 0,650 des HSV-2-Genoms entspricht, wurde von EcoRI-digerierter HSV-2 DNA auf 5 % Acrylamidgels isoliert. Das isolierte Fragment wurde in EcoRIdigeriertes pUC9 geklont (28). Dieses Plasmid wurde pUC-R1P genannt.
Das pUC-R1P-Subklon wurde dann verwendet, um ein Sac1-Fragment des HSV-2-Genoms zu lokalisieren, welches das EcoR1 "P" Fragment enthielt. Southernblot-Versuche (27) zeigten, daß ein 4,9 kb Sac1-Fragment von HSV-2 das EcoR1 "P"-Fragment enthielt. Dieses Fragment wurde auf 0,7 Agarosegels isoliert und in ein pBR322-abgeleitetes Plasmid geklont, das eine einzelne Sac1-Stelle enthielt (55). Dieses Plasmid wurde pBRSac1-"E" genannt. Weitere Restriktionsenzymanalyse von pBRSac1-"E" zeigte ein 2,9 kb Sal1-Fragment mit Sequenzen, die zum EcoR1 "P" Fragment homolog waren, das in Sal1-digeriertes pUC9 wie oben beschrieben subgeklont wurde. Dieses Plasmid wurde pgC₂Sa12.9 genannt.
DNA-Sequenzanalyse von geklonter HSV-2 DNA:
Die Mehrzahl der DNA-Sequenzen wurde unter Verwendung der Didesoxynukleotidkettenterminationstechnik bestimmt. Verschiedene Fragmente wurden in die replikative Form der m13-Phagenvektoren mp7, mp8 und mp9 subgeklont, und die DNA-Sequenz wurde wie zuvor beschrieben bestimmt (29). In einigen Fällen wurden Fragmente an ihren 5'-Enden mit γ³²P-ATP und T4-Polynukleotidkinase ³²P-markiert, und die DNA-Sequenz des Fragments wurde unter Verwendung des chemischen Degradationsverfahrens (56) bestimmt. Computerunterstützte Analyse der DNA und Proteinsequenzdaten wurden unter Verwendung des HOM-Programms (57) erbracht. Die Hydropathie der abgeleiteten Aminosäuresequenzen wurde unter Verwendung einer Breite von 12 Aminosäuren und eines Sprungs von 1 analysiert (31a).
Southernblot-Analyse von HSV-2 DNA:
Restriktionsendonuklease-digerierte HSV-2 DNA und Plasmid-DNA wurden auf 1,5 % Agarosegels fraktioniert und auf Nitrozellulose geblottet, wobei herkömmliche Verfahren angewendet wurden. Die einstrangigen Enden des Sac2-Fragments, mit einem Stern in 12 markiert, wurden mit dem Klenowfragment von DNA-Polymerase 1 aufgefüllt, und das resultierende Fragment mit stumpfen Enden wurde an Sma1-digeriertes m13mp7 replikative Form (29) mit T4 DNA-Ligase ligiert. Die aus dieser Ligierung und Transfektion hergestellte einstrangige DNA wurde als eine Schablone für die Synthese von ³²P-markierter einstrangiger SondenDNA mit hoher spezifischer Aktivität (1 × 10⁹ cpm/μg) hergestellt, wobei das Klenow-Fragment von DNA Polymerase 1 verwendet wurde. Hybridisierungen wurden unter Anwendung herkömmlicher Verfahren durchgeführt (27).
Ergebnisse
Molekularklonen des gF-Kodierungsbereiches des HSV-2-Genoms: Die zur Isolierung des gF-Gens von HSV-2 gewählte Strategie basierte auf der Annahme, daß dieses Gen mit dem HSV-1 gC Gen kolinear ist. Diese Annahme wurde durch die kürzlich gemachte Entdeckung unterstützt, daß ein 75.000 Dalton Glykoprotein, gF, mit antigener Verwandtschaft zu HSV-1 Glykoprotein C in HSV-2 zu finden ist und daß das Gen für dieses Protein in etwa kolinear mit dem HSV-1 gC-Gen ist (22d, 59). Zusätzlich ließ die Isolierung eines monoklonalen Antikörpers, der sich sowohl an HSV-1 gC als auch an HSV-2 gF bindet, des weiteren darauf schließen, daß diese beiden Proteine zueinander homolog sein können (22f). So wurde gefolgert, daß DNA-Sequenzanalyse des HSV-2 genomen Bereiches, der mit dem HSV-1 gC-Gen kolinear ist, zur Ableitung von Proteinsequenzinformation führen würde, die das HSV2 gF-Gen lokalisieren würde.
Es ist gezeigt worden, daß das 600 Basenpaar EcoR1 "P"-Fragment des HSV-2 Genoms an Position ∼ 0,650 mappt (12). Dieser Bereich ist in etwa kolinear mit dem bekannten Kodierungsbereich des HSV-1 gC-Gens, das zwischen etwa 0,630 und 0,640 des HSV-1 Genoms mappt (59). Dieses Fragment wurde von einem EcoR1-Digest von HSV-2 DNA isoliert, in das Plasmid pUC9 geklont (28), und seine DNA-Sequenz wurde bestimmt (29,56). Vergleich der resultierenden Sequenz mit der HSV-1 gC Sequenz (59) zeigte ein bemerkenswertes Maß an Sequenzhomologie zwischen dem EcoR1 "P"-Fragment und dem 3'-Ende des HSV-1 gC Kodierungsbereiches. So wurde das EcoR1 "P" Fragment in der Folge als eine Sonde zum Isolieren eines Sac1 Restriktionsendonukleasefragments von HSV-2 genomer DNA verwendet, die mit dem EcoR1 "P" Fragment hinreichend überlappte, um den verbleibenden Teil des HSV-2 Gens einzuschließen, der mit dem HSV-1 gC Gen homolog war. 12 veranschaulicht die Schritte, die durchgeführt wurden, um ein 2,9 kb Sal1-Fragment vom HSV-2 Genom zu isolieren, das das EcoR1 "P" Fragment enthielt und das zur folgenden DNA-Sequenzanalyse verwendet wurde.
DNA-Sequenzanalyse des EcoR1 "P" Bereiches des HSV-2 Genoms:
Das 4,3 kb Sac1 "E" Fragment, das vom HSV-2 Genom auf Basis seiner Sequenzhomologie zum EcoR1 "P" Fragment isoliert wurde, wurde weiter digeriert, um ein 2,9 kb Sal1 Fragment zu ergeben, das pgC₂Sal2.9 genannt wurde. 12 veranschaulicht die Fragmente von pgC₂Sal2.9, die der DNA Sequenzanalyse unterworfen wurden, wobei entweder das Didesoxynukleotidsequenzierungsverfahren (29) oder das chemische Degradationsverfahren (56) verwendet wurde. Zusätzlich zeigt diese Figur die Position des EcoR1 "P" Fragments innerhalb von pgC₂Sal2.9 sowie die Position einer BglII-Stelle, die dem Ende von BglII "N" Fragment zu rechter Hand an Position ∼ 0,628 des HSV-2 Genoms (12) entspricht.
Im speziellen zeigt 12 das Klonen von pgC₂Sal2.9, des HSV-2 Bereiches, der kolinear mit HSV-1 gC mappt. Der Bereich des HSV-2 Genoms, der von ∼ 0,61–0,66 mappt, wurde als ein Sac1 Fragment (pBRSac "E") geklont, wobei das 600 Basenpaar EcoR1 "P" Fragment als eine Sonde verwendet wurde. Ein Sal1 Subklon von pBRSac "E", pgC₂sal2.9, wurde zur DNA-Sequenzanalyse verwendet. Pfeile bezeichnen die sequenzierten Bereiche, und die Position eines von der Sequenz abgeleiteten 479-Aminosäure offenen Hauptleserasters ist dargestellt. Verschiedene Restriktionsstellen sind veranschaulicht, einschließlich der EcoR1Stellen, die das EcoR1 "P" Fragment skizzieren, und der Bgl 2-Stelle, die am rechten Ende des Bgl2 "N" Fragments zu finden ist (Planposition ∼ 0,628) (26). Das mit einem Stern (*) markierte Sac2-Fragment wurde in Southernblotting-Versuchen verwendet, um die Löschung zu untersuchen, die in diesem Bereich auftritt (siehe Ergebnisse). Andere Stellen wurden für DNA-Sequenzierungsversuche verwendet. Sm, Smal, Sa; Sac2, Rs: Rsa1, Bg; Bgl2, Pv; Pvu2, R1; EcoR1.
13 veranschaulicht die DNA-Sequenz, die von pgC₂Sal2.9 erhalten wurde, im Vergleich zur DNA-Sequenz des HSV-1 gC-Bereiches (59). Der HSV-1 gC-Bereich (HSV-1) und die von pgC₂Sal2.9 (HSV-2) erhaltene Sequenz, wurden unter Verwendung des HOM-Programms verglichen (57). Da verschiedene Löschungen verwendet wurden, um Sequenzüberlappung zu maximieren, sind alle Positionen, einschließlich der Zwischenräume, zwecks Klarheit numeriert worden. Sterne stehen über nicht-passenden Nukleotiden. Der unterstrichene "A" Rest an Position 43 der HSV-1 Sequenz ist die ungefähre transkriptionelle Startstelle der gC mRNA (59). "TATA" 1 und "TATA" 2 sind die wahrscheinlichen transkriptionellen Steuerungsbereiche für die HSV-1 gC mRNA bzw. die 730 Basen m RNA (59,60). Der eingefügte T-Rest an Position 1728 der HSV-1-Sequenz wurde durch Resequenzieren dieses Bereiches entdeckt, und es wurde festgestellt, daß er ein in-Phasen-Stopcodon an den Positionen 1735-1737 einbrachte, das mit dem Stopcodon für den HSV-2 offenen Hauptleseraster homolog war. Die Position des 130 Basen mRNA Einleitungscodons von HSV-1 wird an Position 2032–2034 gezeigt, ebenso wie die Position eines zweiten HSV-2 Einleitungscodons an Position 1975–1977.
Wieder auf 13 bezugnehmend wurde die abgeleitete Sequenz von HSV-2 mit der DNA-Sequenz des gC-Gen-Bereiches von HSV-1 verglichen (59), die zeigte, daß eine Gesamtsequenzhomologie zwischen diesen beiden Fragmenten etwa 68 % betrug. Jedoch zeigten bestimmte Bereiche der Sequenz entweder ein viel höheres oder ein viel geringeres Maß an Sequenzhomologie als andere. Zum Beispiel zeigten die Sequenzen zwischen den Positionen 0 und 570 der HSV-1 und HSV-2 Sequenzen nur 51 % Homologie, während der Bereich zwischen Position 570 und 1740 ein viel höheres Maß an Sequenzhomologie aufwies (80 Prozent). Ein zusätzlicher in hohem Maße homologer Bereich (70 Prozent) wurde auch am Ende der beiden Sequenzen von Position 1975 zu Position 2419 gefunden. Zusätzlich zu den Nukleotidsequenzveränderungen zeigten die beiden Genome verschiedene Löschungen oder Einfügungen, wenn sie miteinander verglichen wurden. Am bemerkenswertesten war ein 81 Basenpaar-Bereich, der an Position 346–426 der HSV-1 gC Sequenz festgestellt wurde und der im HSV2 Genom fehlte. Von diesem Gesamtsequenzvergleich schien es, daß es ein hohes Maß an Sequenzhomologie zwischen dem HSV-1 gC-Bereich und dem HSV-2 Bereich, der hier sequenziert wurde, gab.
Frink et al. (59) haben herausgefunden, daß das 5'-Ende der 2.520 Basen-mRNA, die für HSV-1 gC kodiert, zum unterstrichenen A-Rest an Position 43 von 13 mappt. Zusätzlich wiesen sie auf eine AT-reiche "TATA"-Box (60) Sequenz etwa 22 Basenpaare 5' zu diesem Rest hin. Vergleich der beiden Sequenzen dargestellt in 13 zeigt, daß sowohl die HSV-1- als auch die HSV-2-Sequenz die identische Sequenz, CGGGTATAAA, in diesem Bereich enthielten. Diese Sequenz ist identisch mit der zuvor von Whitton et al (61) berichteten, von der festgestellt wird, daß sie an den "TATA"-Boxbereichen in vielen der bisher bestimmten HSV-1 und HSV-2 Sequenzen auftritt. Dieser konservierten Sequenz folgt auch ein G-reicher Bereich in beiden Virusgenomen. Zusätzlich zu diesem mutmaßlichen Transkriptionssteuerungs-Bereich wurde eine zweite "TATA"Box in beiden Sequenzen an Position 1845–1849 von 13 festgestellt. Was diese zweite "TATA"-Box betrifft, gibt es die Hypothese, daß sie die Transkription einer 730 Basen mRNA im HSV-1 Genom steuert (59). Sowohl HSV-1 als auch HSV-2 enthalten diese Sequenz umgeben von GCreichen Flankierungssequenzen, einschließlich einer CGGGCG-Sequenz, die der CGGG-Sequenz ähnlich ist, die der ersten "TATA"-Box vorangeht. Zusätzlich kodieren beide Genome für offene Leseraster 3' von diesen zweiten "TATA"-Boxen, was unten besprochen werden wird.
Um zu bestimmen, ob die oben beschriebene 81 Basenpaar-Löschung im HSV-2 Genom tatsächlich festgestellt wurde, oder ob sie ein Artefakt des Klonens oder Sequenzierens war, wurde eine Southernblot-Analyse der HSV-2 genomen DNA und der geklonten HSV-2 DNA durchgeführt. Eine ³²P-markierte Sonde wurde aus einem Sac2-Fragment (siehe Fragment in 12) hergestellt, das den Bereich umspannt, dem die 81 Nukleotide fehlen. Wenn der HSV-2 genomen DNA der 81 Basenpaarbereich fehlt, dann wird ein Smal-BglII-Fragment, das diesen Bereich umspannt, 576 Basenpaare sein, ein Smal-Fragment wird 662 Basenpaare sein und ein Sac2-Fragment wird 195 Basenpaare sein.
14 veranschaulicht die Southernblot-Analyse von HSV-2 genomer DNA und pgC₂Sal2.9 DNA. Der Bereich, welcher den 81 Basenpaar-Bereich umspannt, der in der in 13 gezeigten HSV-2 Sequenz fehlt (HSV-2-Positionen 346–426), wurde unter Verwendung des Sac2-Fragments analysiert, das in 12 mit einem Stern markiert ist und den gelöschten Bereich überlappt. Bahnen 1–3 sind Restriktionsdigeste von HSV-2 genomer DNA, und Bahnen 4–6 sind Restriktionsenzymdigeste von pgC₂Sal2.9. Die digerierten DNAs wurden der Elektrophorese auf 1,5 % Agarosegels unterzogen, denaturiert, auf Nitrozellulose geblottet und mit dem ³²P-markierten Sac2-Fragment sondiert. (Der Pfeil zeigt die Position des 564 Basenpaar HindIII-Fragments von Phage λ DNA.) Bahnen 1,6; Smal + Bgl2: Bahnen 2,5; Smal: Bahnen 3,4; Sac2.
Die in 14 dargestellten Ergebnisse zeigen, daß die vorausgesagten Restriktionsstellen den Bereich, dem die 81 Basenpaare fehlten, sowohl in der HSV-2 genomen DNA als auch in der geklonten HSV-2 DNA umgaben. Zusätzlich komigrierten die HSV-2 genomen Fragmente und die geklonten Fragmente genau, was zeigt, daß die Löschung kein Artefakt des Klonens oder Sequenzierens ist.
Analyse des Haupt-offenen Leserasters innerhalb des HSV-2 2,9 kb Sal1-Fragments:
Analyse der potentiellen Kodierungssequenzen innerhalb des 2,9 kb Sal1-DNA-Fragments von HSV-2 zeigte einen offenen Leseraster von 419 Aminosäuren, der mit dem Methionin-kodierten an Position 199–201 der HSV-2-Sequenz wie in 13 gezeigt begann, und am TAA-Terminationskodon an Position 1735–1731 der HSV-2-Sequenz in dieser Figur endete. Wie aus 13 ersichtlich, initiieren sowohl das HSV-1 gC-Protein und der HSV-2 offene Leseraster an etwa der gleichen Position in den beiden Sequenzen, bezogen auf die "TATA"-Box Homologien. Zusätzlich zeigte, während es anfänglich schien, daß der in diesem Bereich festgestellte offene Leseraster 12 Kodone vor dem HSV-1 gC-Gen endet, das Resequenzieren des carboxyterminalen Bereiches der gC-Gensequenz von HSV-1 Stamm F, daß der von Frink et al. (59) berichteten Sequenz ein Thymidinnukleotid nach Position 1727 fehlte und daß die Einfügung dieses Rests zu einem translatierten HSV-1 gC-Protein führte, das an derselben Stelle wie der HSV-2 offene Leseraster endete (17351737 von 13). Somit zeigen, wenn die verschiedenen Löschungen und Einfügungen berücksichtigt werden, wie in 13 veranschaulicht, das HSV-1 gC-Gen und der HSV-2 offene Leseraster ein sehr hohes Maß an Überlappung.
15 veranschaulicht die Translation von HSV-2 großem offenem Leseraster und den Vergleich mit der HSV-1 gC-Aminosäuresequenz. Die Einzelbuchstaben-Aminosäurensymbole wurden verwendet. HSV-1 gC bezieht sich auf die HSV-1 gC-Sequenz, und HSV-2 gF bezieht sich auf die HSV-2 offene Leserastersequenz. Die Proteine wurden unter Verwendung des HOM-Programms verglichen, das wo notwendig Homologien durch Einfügen von Zwischenräumen maximierte (57). über nicht-homologen Aminosäuren stehen Sterne. Vermutliche N-gebundene Glykosylierungsstellen (NXS oder NXT (62)) sind schraffiert, und Cysteinreste (C) sind umrandet. Nur Aminosäuren und keine Zwischenräume sind numeriert. Auch gezeigt werden die Translation des zweiten HSV-2 offenen Leserasters und der Vergleich mit dem HSV-1 730 Basen mRNA-Protein. 730 ORF HSV-2 ist die unvollständige Aminosäuresequenz des zweiten HSV-2 offenen Leserasters von Positionen 1975–2406 der HSV-2 Sequenz, wie in 13 gezeigt. 730 ORF HSV-1 ist die Aminosäuresequenz, die für das Protein abgeleitet ist, für das die 730 Basen mRNA von HSV-1 kodiert (59). In 15 sind konservierte Aminosäureveränderungen, bezogen auf die Ladung, mit (C) gekennzeichnet, und nichtkonservierte Veränderungen, was die Ladung betrifft, sind mit (N) gekennzeichnet.
15 veranschaulicht das hohe Maß an Sequenzhomologie zwischen dem HSV-1 gC-Gen und dem 479 Aminosäure HSV-2 offenen Leseraster. Die ersten 19 Aminosäuren enthalten etwa 80 % Sequenzhomologie, wobei die Veränderungen in den ersten 25 Aminosäuren, was die Ladung betrifft, alle konservierend sind. Von Rest 124 von HSV-1 gC (Rest 90 der HSV-2 Sequenz) bis zum Ende beider Proteine gibt es etwa 74 % Sequenzhomologie, wobei 75 % der Aminosäureveränderungen, was die Ladung betrifft konservierend sind. Fünf vermutliche N-gebundene Glykosylierungsstellen (NXS oder NXT (62)) sind zwischen den beiden Proteinen konserviert, und alle 7 Zysteinreste sind in homologen Positionen bezogen auf den C-Terminus positioniert. Zusätzlich zur Gesamtkounservierung von Sequenzen in den carboxyterminalen drei Vierteln der Proteine gibt es auch große Bereiche mit zusammenhängender Aminosäuresequenzhomologie mit einer Länge von bis zu 20 Resten (d.h. Position 385–405 der HSV-1 Sequenz und 352–372 der HSV-2 Sequenz). Aus diesem Sequenzvergleich kann geschlossen werden, daß der offene Leseraster in diesem Bereich des HSV-2 Genoms für ein Protein kodiert, das zu HSV-1 gC homolog ist.
Während das HSV-2 Protein, für das dieser Bereich kodiert, ein bemerkenswertes Maß an Sequenzhomologie zur HSV-1 gC-Sequenz zeigt, gibt es einige beachtenswerte Unterschiede zwischen den beiden Sequenzen. Der auffallendste Unterschied ist eine Löschung von 27 Aminosäuren in der HSV-2 Sequenz, die in der HSV-1 gC-Sequenz von den Resten 50–76 (15) zu finden ist, und die der oben beschriebenen 81 Basenpaar-Löschung entspricht. Zusätzlich zu dieser großen Löschung zeigen beide Sequenzen kleinere Löschungen von einer oder zwei Aminosäuren. Alle diese Löschungen werden in den aminoterminalen Bereichen der Proteine festgestellt. Zusätzlich zu diesen Löschungen gibt es eine große Anzahl an Aminosäureänderungen im aminoterminalen Bereich der Proteine, die sich zwischen den Resten 29–123 der HSV-1 gC Sequenz (Reste 31–90 der HSV-2-Sequenz) anhäufen. Nur 30 Prozent der Aminosäuren in diesem Bereich sind homolog, wobei ein Großteil dieser Homologie auf konservierte Prolinreste zurückzuführen ist. 43 Prozent der Aminosäuresubstitutionen, die in diesem Bereich zu finden sind, sind, was die Ladung betrifft nicht-konservierend. Die einzigen anderen Bereiche, die keine große Zahl an Veränderungen aufwiesen, sind ein carboxyterminaler hydrophober Bereich (Reste 476–496 der HSV-1-Sequenz und 443–463 der HSV-2 Sequenz), wo die Proteine zu 55 % homolog sind, wo aber alle Veränderungen konservierte, ungeladene hydrophobe Aminosäuren sind, und die Carboxytermini der Proteine, wo die Sequenzen zu nur 25 % homolog sind, wo aber die Aminosäurezusammensetzung insgesamt ähnlich ist (Reste 500–512 der HSV-1 Sequenz und 467–479 der HSV-2 Sequenz). Während fünf der vermutlichen N-gebundenen Glykosylierungsstellen zwischen den beiden Proteinen konserviert sind, enthält die HSV-1 gC Sequenz zwei Stellen mehr als die HSV-2 Sequenz (9 gegenüber 7 insgesamt). Die HSV-1 gC Sequenz enthält 2 N-gebundene Glykosylierungsstellen in den 27 Aminosäuren, die von der HSV-2 Sequenz gelöscht sind, und ein überlappendes Paar von Stellen zwischen den Resten 109 und 112 von 15. Die HSV-2 Sequenz enthält zwei N-gebundene Glykosylierungsstellen, die in der HSV-1 Sequenz nicht zu finden sind, von denen eine zum Aminoterminus proximal ist.
Um die möglichen strukturellen Homologien zwischen den HSV-1 und HSV-2 Sequenzen genauer zu untersuchen, wurde eine Hydropathieanalyse durchgeführt (31a). 16 veranschaulicht die Hydropathieanalyse des HSV-1 gC-Proteins und des HSV-2 Haupt-offenen Leseraster-Proteins. Die Hydropathie eines jeden Proteins wurde unter Verwendung des Programms von Hopp und Woods (31a) bestimmt. Hydrophobe Bereiche liegen oberhalb der Mittellinie und hydrophile Bereiche unterhalb der Mittellinie. Abschnitte von 12 Aminosäuren wurden analysiert, und die durchschnittliche Hydropathie wurde berechnet. Vermutliche asparagingebundene Glykosylierungsstellen (62) sind markiert (0). gC1:HSV-1 gC Proteinhydropathie. gC-2 (gF): HSV-2 Haupt-offener Leseraster-Proteinhydropathie.
16 zeigt, daß beide Proteine ein außergewöhnliches Maß an struktureller Homologie basierend auf den hydrophilen und hydrophoben Eigenschaften der Aminosäuresequenzen aufwiesen. Jedes zeigt einen N-terminalen hydrophoben Bereich gefolgt von einem Abschnitt aus hydrophilen Aminosäuren, die entweder 6 von insgesamt 9 (HSV-1) oder 3 von insgesamt 7 (HSV-2) vermutlichen N-gebundenen Glykosylierungsstellen enthalten. Die Peaks und Täler, die diesem hydrophilen Bereich folgen, sind in beiden Proteinen sehr ähnlich, einschließlich des hydrophilen Bereichs, der die letzte N-gebundene Glykosylierungsstelle enthält. Die Carboxytermini beider Proteine zeigen einen sehr hydrophoben 20 Reste Bereich gefolgt von einem hydrophilen Carboxyterminus. Die 27 anschließenden Aminosäuren, die ausschließlich im HSV-1 gC-Protein zu finden sind, scheinen für einen relativ hydrophilen Bereich zwischen den Resten 50–76 (16) zu kodieren. Als Schlußfolgerung kann gesagt werden, daß diese Analyse zeigt, daß die hydropathischen Merkmale sowohl des HSV-1 gC als auch des HSV-2 Proteins sehr ähnlich sind und daß die am wenigsten konservierten aminoterminalen Bereiche der Proteine in hydrophilen Bereichen zu finden sind, die das Potential haben, in hohem Maße glykosyliert zu werden.
Analyse des zweiten HSV-2 offenen Leserasters:
Translation der letzten 431 Basenpaare der HSV-2 Sequenz wie in 13 gezeigt (Reste 1975–2406) zeigten einen zweiten offenen Leseraster von 105 Aminosäuren. Obwohl die hier berichtete Sequenzinformation unzureichend ist, um den gesamten HSV-2 zweiten offenen Leseraster zu enthalten, zeigte ein von Frink et al. (10) berichteter Vergleich dieser Sequenz mit dem offenen Leseraster, für den die 730 Basen mRNA von HSV-1 kodiert, auch ein hohes Maß an Sequenzhomologie. Wie in 15 zu sehen, zeigten die beiden Sequenzen 75% Sequenzhomologie in den Überlappungsbereichen, wobei etwa 90% der Aminosäureveränderungen konservativ in bezug auf die Ladung waren. Der Hauptunterschied zwischen den beiden Sequenzen war ein 19 Aminosäuren N-terminaler Bereich, der in der HSV-2-, nicht aber in der HSV-1-Sequenz zu finden war. Somit zeigen die Proteine von HSV-1 und HSV-2, obwohl die Funktion des Proteins, für das dieser Bereich kodiert, unbekannt ist, ein beträchtliches Maß an Sequenzhomologie.
Diskussion
Die obigen Ergebnisse zeigen, daß das HSV-2 Genom für ein kolinear mappendes Homolog des HSV-1 Glykoproteins C kodiert. Die hier zu findende Kolinearität der Sequenzen wird durch das Auffinden einer Sequenz 3' vom HSV-2 Haupt-offenen Leseraster verstärkt, der offensichtlich für ein Homolog der HSV-1 730 Basenpaar mRNA kodiert (10). Vorhergehendes Mapping des HSV-2 gF-Gens (33) gemeinsam mit den hier beschriebenen Eigenschaften für den Haupt-offenen Leseraster in diesem Bereich des HSV-2 Genoms einschließlich mehrerer potentieller N-gebundener Glykosylierungsstellen und einer offenbaren aminoterminalen Signalsequenz (5) sowie ein vermutlicher carboxyterminaler Transmembranbereich (28) erlauben den Schluß, daß das hier beschriebene HSV-2 Protein das Glykoprotein gF ist. Außerdem ist die Größe des translatierten HSV-2 Proteins (∼ 52000 Dalton) ähnlich der für die Endoglycosidase N-behandelten, nativen Größe für HSV-2 gF (54.000 Dalton) (22d). Schließlich deuten sowohl das große Ausmaß an Aminosäuresequenzhomologie als auch die Konservierung mehrerer potentieller N-gebundener Glykosylierungsstellen und alle 7 Cysteinreste auf strukturelle Homologie zwischen HSV-1 gC und HSV-2 gF hin. Diese Ergebnisse sind somit ein deutliches Anzeichen dafür, daß das HSV-1 gC-Protein und das HSV-2 gF-Protein zueinander homolog sind.
Diese Ergebnisse helfen beim Erklären der vorherigen Ergebnisse, die zeigten, daß die HSV-2 gF und HSV-1 gC-Proteine hauptsächlich typenspezifisch waren, jedoch typengemeinsame Determinanten aufwiesen (17, 22d, 22f, 43). Da mehrere vorhergehende Untersuchungen (17, 18, 43) zeigten, dass diese Proteine vorwiegend typenspezifische Antikörper induzierten, ist es vernünftig, dass die am meisten antigenen Bereiche der Proteine innerhalb der divergierenden N-terminalen Sequenzen zu finden sind, die den vermutlichen hydrophoben Signalsequenzen folgen. Die hydrophile Natur der divergierenden Bereiche, gemeinsam mit ihrem hohen Gehalt an potentiellen N-gebundenen Glykosylierungsstellen (62), deutet darauf hin, daß diese Bereiche auf der Oberfläche des Proteins positioniert wären. Ein Aussetzen dieser divergierenden Sequenzen der Außenseite der Proteine kann für die Erzeugung typenspezifischer Antikörper verantwortlich sein, die gegen diese divergierenden Epitope gerichtet sind. Jedoch können typengemeinsame Antikörper wahrscheinlich auch von den in höherem Maße konservierten carboxyterminalen drei Viertel der Proteine erzeugt werden, da zwischen gC und gF konservierte hydrophile Bereiche der Außenseite der Proteine ausgesetzt sein könnten und, in einem Fall, glykosyliert sein könnten (Reste 363–366 von HSV-1 gC und 330–332 von HSV-2 gF). So haben HSV-1 gC und HSV-2 gF sowohl typenspezifische als auch typengemeinsame Determinanten gemeinsam, es scheint aber, daß die typenspezifischen Determinanten in stärkerem Maße antigen sind.
Obwohl eine Erklärung für die typenspezifischen und typengemeinsamen Determinanten von gC und gF nicht bekannt ist, ist es möglich, daß die Proteine zumindest zwei Funktionen haben, von denen eine für die Lebensfähigkeit von beiden Viren wichtig ist, der typengemeinsame Bereich, und eine für jeden Virustyp spezifisch ist, der typenspezifische Bereich. Während die Funktion(en) von gC und gF zur Zeit nicht bekannt ist/sind, und während lebensfähige gC Minusmutanten von HSV-1 in vitro isoliert worden sind (65), ist es nicht klar, daß entweder gC oder gF für die Viren während der in vivo Infektion des menschlichen Wirts und der Erzielung von Latenz unabdingbar ist. Es ist möglich, daß zumindest einige der biologischen Unterschiede zwischen HSV-1 und HSV-2, einschließlich der Predilection für die Stelle der Infektion und Virulenz, auf die ausgeprägten strukturellen Unterschiede zwischen den aminoterminalen Bereichen von gC und gF zurückzuführen sind. Auch ohne jedes Wissen über die Funktion dieser Proteine kann geschlossen werden, daß unterschiedlicher selektiver Druck auf die divergierenden und konservierten Bereiche von gC und gF wirken muß.
Vorheriger Sequenzvergleich der gD-Gene von HSV-1 und HSV-2 (58) zeigte, daß die aminoterminale Signalsequenz (63) und der carboxyterminale Transmembranbereich (64) fähig waren, eine große Anzahl an Mutationen zu tolerieren, solange die substituierten Aminosäuren hydrophob waren. Der gC und gF Sequenzvergleich zeigt ein ähnliches Ergebnis im carboxyterminalen, vermutlichen Transmembranbereich (64) von den Resten 476–496 von gC und 443–463 von gF. Die große Anzahl an heterologen hydrophoben Substitutionen in diesem Bereich deutet darauf hin, daß, wie bei gD, jegliche Aminosäure, die lipidlöslich ist, in diesem Bereich toleriert werden kann. Im Gegensatz zu gD jedoch sind die aminoterminalen Signalsequenzen von gC und gF in den ersten 19 Resten in hohem Maße homolog. Somit hat entweder dieser Bereich eine andere wichtige konservierte Funktion als die Lenkung der Glykoproteine in das rohe endoplasmatische Retikulum (5), oder es kann ein überlappendes Gen oder andere funktionelle Sequenz in diesem Bereich des Genoms geben, das konserviert werden muß. (66).
Obwohl hier eine für einen vollständigen Vergleich unzureichende HSV2 Sequenz präsentiert wird, zeigt der Bereich 5' zum Beginn von HSV1 gC mRNA-Transkription eine identische CGGGTATAA-Sequenz sowohl im HSV-1 als auch im HSV-2 Genom. Zusätzlich folgt beiden Sequenzen ein G-reicher Bereich, der dem Beginn der Transkription unmittelbar vorangeht. Somit gibt es, wie zuvor für die gD-Gene von HSV-1 und HSV2 festgestellt, Sequenzhomologien stromaufwärts zwischen den beiden Virustypen, die auf die Möglichkeit hindeuten, daß diese Bereiche an transkriptioneller Regulierung dieser Gene beteiligt sind. Interessanterweise zeigt die zweite "TATA"-Box-Homologie, die in beiden Virusgenomen gefunden wurde und die wahrscheinlich die Transkription der 730 Basen mRNA steuert (59, 60) auch ein relativ hohes Maß an Sequenzhomologie in HSV-1 und HSV-2. Diesen "TATA"-Boxen gehen CG-reiche Sequenzen voraus, die ähnlich, aber nicht identisch mit denen sind, die den ersten "TATA" Bereichen, die in 13 gezeigt werden, vorangehen, und beiden folgt ein 14 Basenpaar Bereich, der ∼ 80 % Sequenzhomologie aufweist. Der gesamte Homologiebereich, der diesen Bereich umgibt, ist nur 33 Basenpaare mit einer Gesamtsequenzhomologie von ∼ 75 Prozent. Wenn dieser Bereich an der transkriptionellen Regulierung der 730 Basen mRNA beteiligt ist, dann scheint es, daß eine relativ kurze Sequenz für die Erkennung durch transkriptionelle regulatorische Elemente ausreichend sein kann.
Abschließend kann gesagt werden, daß die Ergebnisse zeigen, daß die HSV-1 gC und HSV-2 gF-Glykoproteine in hohem Maß homolog sind, und daß sie für typengemeinsame und typenspezifische Bereiche kodieren. Da die beiden Proteine beträchtliche Sequenzhomologie aufweisen, und da sie offensichtlich kolinear mappen, treten wir für den Vorschlag von Zezulak und Spear (22d) ein, HSV-2 gF auf HSV-2 gC oder gC-2 umzubenennen. Außerdem öffnen die hier berichteten Sequenzierungsdaten den Weg für eine funktionelle Analyse der gC-1 und gC-2 Proteine durch den Austausch verschiedener typenspezifischer Bereiche zwischen den beiden Proteinen in vitro und Expression der chimärischen Sequenzen in Säugetierzellen (67) oder durch Wiedereinfügen dieser Bereiche zurück in das Virus (68).
Die geklonten gC-2 Glykoproteine können auf eine zur Expression von gD, wie in Beispiel 1 dargelegt, analoge Art exprimiert werden. Ein Fragment von gC-2, das eine Sequenz einschließt, die für gC-1 typenspezifisch ist, aber die Sequenz ausschließt, die typengemeinsam für gC-1 und gC-2 ist, ist als Diagnosemittel, das HSV-1 von HSV-2 unterscheidet, in hohem Maße nützlich.
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Claims

Verfahren, welches das Produzieren eines typspezifischen Fragments von gC-Glykoprotein-Polypeptid von Herpes-simplex-Virus vom Typ 2 in einer rekombinanten, stabilen, kontinuierlichen Säugetier-Zelllinie umfasst, wodurch das Glykoprotein freiliegende Antigen-Determinanten aufweist, so dass das Fragment fähig ist, komplementäre Antikörper von Herpes-simplex-Virus vom Typ 2, nicht aber von Herpes-simplex-Virus vom Typ 1, spezifisch zu binden und dadurch fähig ist, zwischen HSV-1 und HSV-2 zu unterscheiden.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das Glykoprotein mit der Zellmembran funktionell assoziiert ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das Glykoprotein zu Beginn mit der Zellmembran assoziiert ist und dann zumindest ein Abschnitt des Polypeptids, der die freiliegenden Antigen-Determinanten aufweist, von der Membran weggelöst wird.
Verfahren nach Anspruch 1, worin zu Beginn ein trunkiertes Derivat eines membrangebundenen gC-Glykoprotein-Polypeptids ohne die membranbindende Domäne produziert wird, wodurch das Derivat-Polypeptid frei von der Membran ist und die freiliegenden Antigen-Determinanten aufweist.
Verfahren, welches nach der Herstellung eines Polypeptidprodukts durch ein Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche das Binden dieses Polypeptidprodukts an eine feste Oberfläche umfasst.
Verfahren, welches nach der Herstellung eines Polypeptidprodukts durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4 das Binden dieses Polypeptidprodukts an eine Markierung umfasst.
Verfahren nach Anspruch 6, worin die Markierung ein Enzym umfasst.
Verfahren, welches nach der Herstellung eines Polypeptidprodukts durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7 das Miteinbeziehen dieses Produkts in ein Diagnose-Testset umfasst, gemeinsam mit einem markierten Anti-Antikörper, der fähig ist, den komplementären Antikörper spezifisch zu binden.
Verfahren, welches nach der Herstellung eines Polypeptids durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7 das Miteinbeziehen dieses Polypeptids in ein Diagnose-Testset umfasst, gemeinsam mit einem unmarkierten komplementären Antikörper gegen Herpes-simplex-Virus vom Typ 1 und/oder vom Typ 2.
Verfahren, welches nach der Herstellung eines Polypeptids durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7 das Miteinbeziehen dieses Polypeptidsin ein Diagnose-Testset umfasst, gemeinsam mit einem markierten komplementären Antikörper.
Diagnose-Testset, umfassend: (a) trunkiertes, membranfreies Polypeptid, das nach einem Verfahren nach Anspruch 4 erhältlich ist; und (b) einen zweiten Bestandteil, der entweder komplementären Antikörper von Herpes-simplex-Virus vom Typ 2 oder Anti-Antikörper umfasst, der fähig ist, den komplementären Antikörper spezifisch zu binden.
Diagnose-Testset nach Anspruch 11, worin das Polypeptid (a) an eine feste Oberfläche gebunden ist.
Diagnose-Testset nach Anspruch 11, worin das Polypeptid (a) an eine Markierung gebunden ist.
Diagnose-Testset nach Anspruch 11, worin der zweite Bestandteil markierten Anti-Antikörper umfasst, der fähig ist, den komplementären Antikörper spezifisch zu binden.
Diagnose-Testset nach Anspruch 14, das weiters unmarkierten komplementären Antikörper umfasst.
Diagnose-Testset nach Anspruch 11, worin der zweite Bestandteil den komplementären Antikörper umfasst.
Verfahren zum Nachweis von Antikörper, der in einer biologisch erhaltenen flüssigen Probe enthalten ist, folgende Schritte umfassend: (a) In-Kontakt-Bringen der flüssigen Probe mit einem Polypeptid, das durch ein Verfahren nach Anspruch 4 erhalten wurde, um das Polypeptid mit komplementärem Antikörper in der flüssigen Probe zu binden; und (b) Nachweisen der Bindung aus Schritt (a).
Verfahren nach Anspruch 17, worin die Bindung aus Schritt (a) auch gemessen wird.
Verfahren nach Anspruch 18, worin in Schritt (a) das Polypeptid an eine feste Oberfläche gebunden ist und die Probe auch mit löslichem, markiertem Anti-Antikörper in Kontakt gebracht wird, der fähig ist, den komplementären Antikörper spezifisch zu binden, um den Probenantikörper dazu zu bringen, sich an der festen Oberfläche sowohl an das Polypeptid als auch an den markierten Anti-Antikörper zu binden; wobei das Verfahren weiters vor Schritt (b) das Abtrennen der festen Oberfläche von der Lösung umfasst, die nicht umgesetzten, löslichen, markierten Antikörper enthält; und worin in Schritt (b) der markierte Anti-Antikörper entweder in der festen Phase oder in der abgetrennten Lösung nachgewiesen wird.
Verfahren nach Anspruch 19, worin in Schritt (a) das Polypeptid an eine feste Oberfläche gebunden ist und die Probe auch mit löslichem, markiertem Antikörper in Kontakt gebracht wird, der auch fähig ist, das Polypeptid spezifisch zu binden, um den Probenantikörper und markierten Antikörper dazu zu bringen, sich kompetitiv an das Polypeptid an der festen Oberfläche zu binden; wobei das Verfahren vor Schritt (b) weiters das Abtrennen der festen Oberfläche von der Lösung umfasst, die nicht umgesetzten, löslichen, markierten Antikörper enthält, und worin in Schritt (b) der markierte Anti-Antikörper entweder in der festen Phase oder in der abgetrennten Lösung nachgewiesen wird.
Verfahren zum Nachweis von Antigen, das in einer biologisch erhaltenen flüssigen Probe enthalten ist, folgende Schritte umfassend: (a) das In-Kontakt-Bringen der flüssigen Probe mit einem Polypeptid, das durch ein Verfahren nach Anspruch 4 erhalten wurde; wobei das Polypeptid Antigen-Determinanten mit dem Probenantigen gemeinsam hat; und (b) das Nachweisen der Probenantigens unter Anwendung eines kompetitiven Tests.
Verfahren nach Anspruch 21, worin in Schritt (a) das Polypeptid an eine feste Oberfläche gebunden ist und die Probe auch mit löslichem, unmarkiertem, komplementärem Antikörper in Kontakt gebracht wird, um eine kompetitive Bindung für den komplementären Antikörper zwischen dem Polypeptid und dem Probenantigen herbeizuführen, wobei das Verfahren weiters vor Schritt (b) folgende Schritte umfasst: (c) das Abtrennen der festen Oberfläche von der Lösung; und (d) das In-Kontakt-Bringen der abgetrennten festen Oberfläche oder Lösung mit markiertem Anti-Antikörper, der fähig ist, den komplementären Antikörper spezifisch zu binden, worin in Schritt (b) der markierte Anti-Antikörper nachgewiesen wird.
Verfahren nach Anspruch 21, worin das Polypeptid markiert ist und in Schritt (a) die Probe auch mit immobilisiertem komplementären Antikörper in Kontakt gebracht wird, um eine kompetitive Bindung zwischen dem markiertem diagnostischen Produkt und dem Probenantigen herbeizuführen.