CN1121357A - 乙型肝炎逃逸突变体特异性结合分子 - Google Patents

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Abstract

能够特异性地与乙肝逃逸变异抗原决定簇相结合的分子，包括SMH HBs 145/G/R/I(ECACC92122312)，SMH HBs 145/R/I(ECACC93052626)，SMH HBs 145/G/R/II(ECACC93033109)或SMH HBs 145/R/II(ECACC93033110)细胞系分泌的单克隆抗体及与它们进行交叉竞争的其他特异性结合分子。由SMH HBs 145/G/R/I和SMH HBs 145/G/R/II细胞系分泌的抗体既与变异的(逃逸突变的)HBsAg结合，又与野生型HBsAg结合。由SMH HBs 145/R/I及SMH HBs 145/R/II细胞系分泌的抗体只与变异型而不与野生型HBsAg结合。

Description

乙型肝炎逃逸突变体特异性结合分子
本发明涉及特定的乙型肝炎病毒抗原的特异性抗体及其他结合分子，也涉及这些分子在诊断及治疗中的应用。
乙型肝炎病毒感染在世界上许多地方都是一个严重问题，但现在已有可用的疫苗。有商业供应的抗乙肝病毒疫苗通常都以天然或重组形式含有乙肝病毒表面抗原(HBsAG)。Smithkline Beecham的产品ENGERIX—BTM是后者的一个例子。乙肝病毒抗原亚型通过血清学方法来确定并已证明是由于编码乙肝病毒表面抗原的基因组区域内单个碱基的改变造成的。但是，直到最近所有已知的抗原亚型均含有由乙肝病毒表面抗原氨基酸124到147所构成的α—决定簇。α—决定簇的抗体对所有已知的亚型具有保护作用。最近，报道了一种疫苗介导的乙肝病毒逃逸突变体(Carman等，TheLancet 336325—329(1990))。已证明这一逃逸突变体含有—HBsAG变异蛋白，它在α决定簇区域内的145位点上发生了甘氨酸被精氨酸替代的突变。WO—A—9114703涉及一种基于这种变异的乙肝病毒表面抗原的疫苗并公开了含有抗变异HBsAG的抗体制剂。
但WO—A—9114703并没有指出如何获取只结合到变异的α决定簇区域或既与野生型结合，又与变异的α决定簇区域结合所需的特性。而这两个问题是本发明所要论述的。
本发明的首要方面是提供一种能特异性地与乙肝抗原决定簇结合的分子并且这种分子本身是由SMH HBs145/G/R/I(ECACC 92122312)、SMH HBs 145/R/I(ECACC93052626)、SMH HBs145/G/R/II(ECACC93033109)或SMH HBs 145/R/II(ECACC93033110)细胞系分泌的单克隆抗体或与由这些细胞系分泌的单克隆抗体产生交叉竞争。
一种特异性结合分子例如一种抗体如果与另一分子结合到相同位点上或构象连接的位点上时将发生交叉竞争。构象连接的位点可以是抗原多肽链上的相邻位点，也可由于多肽链的二级结构连接在一起，这可以使非相邻区域发生相邻折迭。交叉竞争实验相对来说较易进行(Water等，Virus Research 221—12(1991))，因此测定一种给定的抗体或其他特异性结合分子是否与上面特别提到的单克隆抗体发生交叉竞争是一件直截了当的事。
至少部分地与所述单克隆抗体发生交叉竞争(即其交叉竞争显著大于0％)的特异性结合分子在本发明中是有用的。至少在某些情况下，发生完全交叉竞争的特异性结合分子(即其交叉竞争力不显著地低于100％)是优选的。
本发明所用的特异性结合分子本身通常是抗体。尽管多克隆抗体不被排除在外，单克隆抗体由于更加精确的专一性通常是优选的。从Kihler和Milstein(Nature 256495(1975))的工作开始，单克隆抗体技术已完好地建立起来，今天已有许多用于单克隆抗体常规生产的适用方案。例如，适用的技术有Gefter等(Somatic CellGenetics 3231(1977))，Kohler等(Euro.J.Immuvirol.292—295(1976))及Goding(“Monoclonal Antibodies：Principleand Practice”(第二版，1986)Adeademic Press，New York)中的论述。
所用的典型方案如下：
(a)实验动物(例如鼠)用所要产生抗体的抗原进行免疫攻击(在本例中用145位甘氨酸被精氨酸替代的突变HbsAg)；
(b)然后动物的脾细胞与骨髓瘤细胞系的细胞融合，把得到的杂交瘤融合细胞铺在选择性培养基上；
(c)采用任何适用技术筛选特异性抗体如使用来自另一种动物的抗免疫球蛋白抗体。
尽管在特定情况下使用人单克隆抗体在原则上是更优选的，尤其是在人的治疗及体内诊断上，但技术上的困难使常规杂交瘤技术不适用于大量生产人单克隆抗体。因而非人类的单克隆抗体，如鼠源性单克隆抗体在实践中经常使用。
嵌合抗体，尤其是嵌合单克隆抗体也包括在本发明范围内。这些嵌合抗体包括SMH HBs 145/G/R/I、SMH HBs 145/R/I、SMH HBs 145/G/R/II或SMH HBs 145/R/II的足够氨基酸序列以体现它们的特征性能。至少，要具有足以维持其特性程度的特异抗体的互补决定簇区域。可存在整个VH和VL功能区，甚至整个抗体结合片断如酶解的Fab或F(ab)2片断。
有不同的制备嵌合抗体的技术。例如，有人报道了由人C区和啮齿类V区融合而形成的嵌合抗体(Morrison等，PNAS 816851—6855，(1984)，Boulianne等，Nature 312 643—646(1984)和Neuberger等，Nature 314268—270(1985))。另外，嵌合抗体技术也是WO—A—9004413和WO—A—9116354的主题，它涉及到有两个或更多个共价连接的Fc区的抗体偶联物。
完全的人源化抗体，特别是单克隆抗体，也在本发明范围内。目前，有三种分离人源化非人(尤其是鼠)抗体的方法。Reichmann等(Nature 332，323—327(1988))使用了单链DNA上的定点突变。在另一方法中Jones等(Nature 321522—525(1980))及Queen等(PNAS 86 10029—10033(1989))在人框架上使用重叠寡核苷酸掺入啮齿类互补决定簇区域(CDRs)的方法构建了完整V区。最近，Lewis区Crowe(Gene101297—302(1991)采用PCR技术将啮齿类CDRs移植到人免疫球蛋白框架上。WO—A—9316192涉及抗肝炎的人源化抗体，此文件的方法可用于产生本发明的人源化抗体。
单克隆抗体的重链和轻链可变区的氨基酸序列可从克隆的互补DNA和根据Kabat等(见“Sequences of Proteins of Im-muinological Interest”美国卫生与人类服务部，美国政府出版社，1987)的方法测定的高变区(或互补决定簇区—DRs)来确定。使用上述任何一种方法可将这些互补决定簇区域移植到人的框架中。
Ward等(Nature 341544—546(1989))的单功能区抗体(dAbs)代表另一类特异性结合分子(不论它们是否适于被当作抗体)，它们都可用于本发明。在这一方法中，PCR或其他适宜技术可用于克隆VH和VL基因并使它表达在异源性宿主(如大肠杆菌)中。重链和轻链可变区可通过PCR方法用杂交瘤细胞扩增并克隆在表达载体中。分离出来的可变区可通过与抗原结合来筛选并测定它们的亲和性。其他单功能区抗体可通过扩增重排的免疫鼠脾细胞DNA可变区基因而直接获得。扩增的DNA可以克隆到载体中并根据其抗原结合活性进行筛选。一种使用噬菌体作为载体的精巧方法允许带有可变区基团的噬菌体直接用抗原选择，因为它们表达在细胞表面(McCafferty等，Nature348 552—554(1990))。
dAbs技术表明重组DNA方法完全改变了具有特异性结合能力之分子的产生。因此如果没有其他原因，本发明不能按传统意义上那样被看成仅限于抗体(无论是多克隆还是单克隆)。回顾一下生物工程和人工抗体，它们一般可以在本发明中应用，见Winter和Milstein，Nature349 293—299(1991)和Marks等J.Biol.Chem.267 16007—16010(1992)，也见Dr.Greg Winter在1994年3月7—8日伦敦举行的医学研究委员会讨论会上关于生物化学研究的成功开发中的描述(在讨论会期间出版)。
根据变异乙肝病毒表面抗原结合能力，本发明范围内的特异性结合分子大致分为两类。首先是只与变异的乙肝病毒表面抗原结合，而不与野生株结合的分子。由SMH HBs 145/R/I及SMHHBs 145/R/III分泌的单克隆抗体属于这一类，与其交叉竞争的特异性结合分子也属这一类。第二类是既与变异型HBsAg结合，又与野生型HBsAg结合的特异性结合分子。在某些情况下，这些特异性结合分子是优选的。这类的例子中包括由SMH HBs 145/G/R/I和SMH HBs 145/G/R/II分泌的单克隆抗体及能与它们交叉竞争的特异性结合分子。
根据本发明的第二个方面，提供了一种能够表达，优选能分泌上面所描述的特异性结合分子的细胞系或细胞培养物。
与本发明的这一方面有关的是上面特别提到过的杂交瘤细胞系。这些细胞系已保藏在European Collection of Animal CellCulture(ECACC)(应用微生物学及研究PHLS中心，生物学部，Porton Down，Salisbury，Wiltshire SP4 OJG，UK)保藏号及保藏日期如下表所示：
细胞系 保藏日期 保藏号
 SMH HBs 145/G/R/I 1992年12月23日 92122312
 SMH HBs 145/G/R/II 1993年3月31日 93033109
 SMH HBs 145/R/I 1993年5月26日 93052626
 SMH HBs 145/R/II 1993年3月31日 93033110
这些保藏是按布达佩斯条约进行的。
前面已描述过制造其他单克隆抗体的一般性方法。为保证它们属于本发明的范围，可将它们与所保藏的细胞系分泌的抗体反应进行简单的交叉竞争实验。本发明范围内的其他特异性结合分子可根据早些时候提到过的论文和/或专利出版物中方法制造。
本发明的特异性结合分子在诊断和治疗中均非常有用。
在诊断应用方面，本发明的一个具体应用是用于相对于普通乙肝发生变异的乙肝的区别性诊断。在这种情况下可以使用SMHHBs 145/R/I或SMH HBs 145/R/II或具有其特异性的特异性结合分子，因为这些特异性结合分子只与变异型结合。为此目的，本发明的特异性结合分子可与只与野生的乙型肝炎病毒抗原结合而不与野生型结合的抗体或其他特异性结合分子联合使用；一种适用的单克隆抗体是RF HBs 1，在EP—A—0038642中对其做了描述。
在另一个具体的应用中，本发明可用于一步检测野生型或变异型乙肝病毒抗原的存在。在这种情况下，由于要与野生型及变异型都结合，因而可使用SMH HBs 145/G/R/I或SMH HBs145/G/R/II或具有其特异性的特异性结合分子。
本发明的诊断方法可在体外进行。根据本发明的第三个方面，可提供一种乙肝诊断方法，这个方法包括将怀疑含有乙肝病毒颗粒或抗原的样品与上述的特异性结合分子相接触。
体外检测可采取多种形式。一些取决于所使用的标记特异性结合分子如抗体(其使用属于本发明的范围)，而另一些通过观察反应性沉淀来检测抗体(或其他特异性结合分子)和抗原的相互作用。不依赖标记抗体的定性和定量体外检测的实例包括凝胶沉淀(包括Ouchterlony的双扩散法)，单向免疫扩散(SRID)，免疫电泳，包括火箭电泳，二维免疫电泳，及通过对入射光源的散射来定量(比浊法)。
实践中更常见的是一些标记方法用于检测抗原抗体的相互作用。标记物可以是放射性的或非放射性的。根据分析的方式，既可以是本发明范围内的特异性结合分子被标记，也可以是与其相结合的其他特异性结合分子被标记。可以使用免疫测定法(包括放射免疫测定)和免疫测量分析(包括免疫测量放射分析及酶联免疫吸附分析)及免疫印迹技术。化学发光及荧光标记也值得考虑。
体外分析通常要使用试剂盒。根据本发明的第四个方面，提供一种来检测乙肝病毒颗粒或抗原的检测试剂盒。此试剂盒中包括以上提到的特异性结合分子及检测这种特异性结合分子是否与乙肝病毒颗粒或抗原结合的工具。
分析方法可是上面提到过的任何一种。竞争性的，尤其是夹心免疫测定试剂盒是优选的。特异性结合分子及检测工具可置于试剂盒中分离的单元。特异性结合分子可以以结合到固体支持物上的方式提供。在实际选择中检测工具包含可检测的经过标记的另一种特异性结合分子(它本身可以是一种抗体)，它与抗体或上面提到过的其他特异性结合分子结合。
本发明也可用于体内诊断。根据本发明的第五个方面，提供了上面提到过的特异性结合分子(通常是标记的)在制备乙肝体内诊断试剂的用途。因此，本发明涉及一种将上述的任选标记的特异性结合分子通过非肠道途径给与一个受者进行乙肝体内诊断的方法。体内用标记物包括放射性标记和顺磁标记，两者均可用适宜的外部设备来检测。
除用于诊断外，本发明在治疗，尤其是乙肝病毒感染的治疗及抗乙肝病毒感染的被动免疫方面也可使用。根据本发明的第六个方面，提供了上述的特异性结合分子在制备治疗或预防乙肝病毒感染的药物中的用途。因而本发明可用于治疗及预防乙肝感染的方法中，这一方面中包括一般通过非肠道途径将上述的特异性结合分子给与受者。
根据本发明的第七个方面，提供了包括一种上述特异性结合分子及一种药理上可接受的载体的制剂。
通过非肠道途径给与人的制剂通常是无菌的。将使用载体如注射用水或磷酸缓冲生理盐水。用药剂量及时间由临床医生及内科医生指导，且不仅只决定于特异性结合分子的特性和亲和力，也决定于它们的抗原性或其他不利的特性。但作为一般原则，典型的预防性给药方案是每周1—10mg(如5mg)，而典型的治疗方案是每天给0.5—5mg(如1mg)，持续1周，然后每周给0.5—5mg(如1mg)。
本发明的各个方面的优选特征由本发明的各个方面经过细节上相互调整而来。
本发明将用下面的实施例加以描述。
实施例1—杂交瘤的制备
抗原：
用质粒pRT13557的DNA转化酵母菌株DC5 Cir°，以建立Y1648菌株，如WO—A—9114703中的实施例2中描述的那样。Y1648菌株表达变异的乙肝病毒表面抗原，其带有145位点上甘氨酸→精氨酸突变。变异的乙肝病毒表面抗原用AEROSIL吸附/解吸附、超滤、离子交换柱层析、CsCl密度梯度离心及对CsCl梯度成分进行透析等方法从Y1648菌株培养液(被称为C1334)中分离出来。这批纯化的抗原被称为31M5。
免疫接种
将40μg从31MS中得到的重组变异乙肝表面抗原用100μl完全福氏佐剂乳化后免疫接种给纯系Balb/c小鼠(Harlan OlacLtd，Bicester，Oxon，UK)，皮下给药，4周后，钭20μg 31M5用100μl不完全福氏佐剂乳化后皮下给与小鼠。两周后静脉给10μg31M5，4天后处死小鼠进行细胞融合。
细胞融合
脾细胞经分离，洗净并计数后，与小鼠骨髓瘤细胞系P3—NS—1/1—Ag4—1(Flow Labooatories Limited，Irvine，Scotland)以10∶1的比例进行融合。融合剂为乙二醇1500。37℃下融合7分钟。融合细胞以2×106/2ml孔铺板，并用HAT培养基选择杂交瘤细胞。
实施例2—特异性抗体的筛选
从实施例1中获得的含杂交瘤细胞孔的上清液与用重组的野生型ay亚型HBsAg或31M5(变异HBsAg)包被的聚苯乙烯珠共同孵育。结合到珠子上的抗体用辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠免疫球蛋白(Sigma化学有限公司)来检测。
实施例3—克隆及保藏
通过有限稀释三次克隆所选择的孔或直到所有的孔被检测特异性抗体为阳性而且细胞系为单克隆。在European Colleetion ofAnimal Cell Cultures(Porton  Down，Salisbury，Wiltshire)保藏了两种分泌对变异型和野生型HBsAg都有特异性的单克隆抗体的细胞系。保藏日期及保藏号如下表所示：
细胞系 保藏日期 保藏号
SMH HBs 145/G/R/I 1993年12月23日92 92122312
SMH HBs 145/G/R/II 1993年3月31日 93033109
S MH HBs 145/G/R/I与变异的或野生型抗原的结合用下述酶联免疫吸附法测定。用突变抗原或野生型抗原包被的固相在室温下孵育16小时。将固相洗净并与1∶1000稀释的辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠抗体(DaKo)在37℃下孵育2小时。再次将固相洗净并在干净试管中向固相加入酶底物，计30分钟。这一液体的OD值用多孔板读数计在495nm处测定。这一读数与培养基空白对照及不相干的IgG单克隆抗体对照相比较。结果如下表所示。两种抗原的OD值显著大于对照组的读数(资料未列出)。
    O D值
突变抗原     0.693
野生型抗原     0.204
用类似方法测量SMH HBs 145/G/R/II与突变的或野生型抗原的结合。
在European Colleotion of Animal Cell Cultrues(Porton Down，Salisbury，Wiltshire)保藏了两种分泌只对变异的HBsAg有特异性的单克隆抗体的细胞系，保藏日期及保藏号如下表所示：
细胞系 保藏日期 保藏号
 SMH HBs 145/R/I 1993年5月26日 93052626
 SMH HBs 145/R/II 1993年3月31日 93033110
SMH HBs 145/R/I及SMH HBs 145/R/II与变异型抗原的结合用与上述测量SMH HBs 145/G/R/I的方法相类似的方法来测量。同一方法表明它们与野生型抗原无显著结合。实施例4—单克隆抗体在检测突变型及野生型抗原中的应用
用SMH HBs 145/G/R/I或SMH HBs 145/G/R/II分泌的抗体检测血清样品中变异型或野生型抗原使用双位点免疫测定法(Goodall等，Med.Lab.Sci 38 349—354(1981))。抗体应包被到固体支持物上做为俘获相。将其与抗原样本孵育一段时间以发生最佳结合。然后从固体支持物上将样本洗去，结合的抗原量将用与标记的抗体孵育的方法来测量，从腹水中用蛋白A亲和层析法纯化的抗体用放射性核素酶或其他可检测的分子如生物素进行标记。调节实验中使用的标记抗体浓度、孵育的温度和时间以产生最佳结合。在这一阶段中可向抗体中加入一种阻断蛋白以防止非特异性结合如胎牛血清或牛血清白蛋白。洗去多余的标记抗体，用适宜方法检测结合的标记抗体。如生物素标记的抗体用抗生物素蛋白—辣根过氧化物酶复合物来检测。这种复合物的结合用邻苯二胺和过氧化氢来检测；颜色变化的光密度在492nm处测量。每次实验包括阳性及阴性对照。
实施例5—单克隆抗体在只针对突变抗原的检测中的应用。
用抗体对血清样本中仅变异病毒的检测按实施例4中描述的方法进行，但使用SMH HBs 145/R/I或SMH HBs 145/R/II分泌的抗体代替SMH HBs 145/G/R/I或SMH HBs 145/G/R/II分泌的抗体。

Claims (24)

1.一种能特异性地与乙肝抗原决定簇结合的分子，其本身是由SMH HBs 145/G/R/I(ECACC 92122312)，SMHHBs 145/R/I(ECACC93052626)，SMH HBs 145/G/R/II(ECACC 93033109)或SMH HBs 145/R/II(ECACC93033110)细胞系分泌的单克隆抗体或与这些细胞系分泌的单克隆抗体交叉竞争。
2.权利要求1中所说的分子，它是一种抗体。
3.权利要求2中所说的分子，它是一种单克隆抗体。
4.权利要求3中所说的分子，它是人源的或至少是部分人源化的抗体。
5.权利要求4中所说分子，其中将非人类的CDR移植到人免疫球蛋白框架中。
6.权利要求1—5任一项中所说的分子，它是一种单功能区抗体。
7.权利要求1—6任一项中所说的分子，它与变异型HBsAg结合而不与野生型HBsAg结合。
8.由SMH HBs 145/R/I(ECACC 93052626)或SMHHBs 145/R/II(ECACC 93033110)分泌的单克隆抗体。
9.权利要求1—6中所说的分子，它既与变异型HBsAg结合又与野生型HBsAg结合。
10.由SMH HBs 145/G/R/I(ECACC 92122312)或SMH HBs 145/G/R/II(ECACC 93033109)分泌的单克隆抗体。
11.一种能够表达权利要求1—10任一项中所说的特异性结合分子的细胞系或细胞培养物。
12.权利要求9中所说的细胞系，它是一种杂交瘤。
13.SMH HBs 145/G/R/I(ECACC 92122312)细胞系。
14.SMH HBs 145/G/R/II(ECACC 93033109)细胞系。
15.SMH HBs 145/R/I(ECACC 93052626)细胞系。
16.SMH HBs 145/R/II(ECACC 93033110)细胞系。
17.权利要求1—10任何一项中所说的特异性结合分子，其用于诊断和/或治疗。
18.一种诊断乙型肝炎的方法，这一方法包括将怀疑含有乙型肝炎病毒颗粒或抗原的样品与权利要求1—10任一项中所说的特异性结合分子相接触。
19.一种用于检测乙型肝炎病毒颗粒或抗原的检测试剂盒，试剂盒中包括权利要求1—10任一项中所说的一种特异性结合分子及用于检测这种特异性结合分子是否与乙型肝炎病毒颗粒或抗原结合的工具。
20.权利要求1—10任一项中所说的特异性结合分子在制备乙型肝炎体内诊断试剂中的应用。
21.一种乙型肝炎体内诊断方法，包括将权利要求1—10任一项中所说的特异性结合分子给与接受者。
22.权利要求1—10任一项中所说的特异性结合分子在制备抗乙型肝炎病毒感染的治疗药物或预防性药物中的应用。
23.一种治疗或预防乙型肝炎病毒感染的方法，这一方法包括将权利要求1—10任一项中所说的特异性结合分子给与接受者。
24.一种包括权利要求1—10任一项中所说的特异性结合分子及药理学上可接受的载体的制剂。
CN94191829A 1993-03-24 1994-03-24 乙型肝炎逃逸突变体特异性结合分子 Pending CN1121357A (zh)

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