KR100244579B1 - 인간 인터로이킨-6 수용체에 대한 항체, 이를 생산하는 히브리도마 및 이들의 제조방법 - Google Patents

인간 인터로이킨-6 수용체에 대한 항체, 이를 생산하는 히브리도마 및 이들의 제조방법 Download PDF

Info

Publication number
KR100244579B1
KR100244579B1 KR1019990001145A KR19990001145A KR100244579B1 KR 100244579 B1 KR100244579 B1 KR 100244579B1 KR 1019990001145 A KR1019990001145 A KR 1019990001145A KR 19990001145 A KR19990001145 A KR 19990001145A KR 100244579 B1 KR100244579 B1 KR 100244579B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
receptor
human interleukin
antibody
hybridoma
cells
Prior art date
Application number
KR1019990001145A
Other languages
English (en)
Inventor
다다미쓰 기시모토
Original Assignee
다다미쓰 기시모토
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from KR1019900011023A external-priority patent/KR100214759B1/ko
Application filed by 다다미쓰 기시모토 filed Critical 다다미쓰 기시모토
Application granted granted Critical
Publication of KR100244579B1 publication Critical patent/KR100244579B1/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
    • C12N5/16—Animal cells
    • C12N5/163—Animal cells one of the fusion partners being a B or a T lymphocyte
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/244—Interleukins [IL]
    • C07K16/248—IL-6
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C12N2510/02—Cells for production

Abstract

본 발명에 따르면, 인간 인터로이킨-6 수용체에 특이적으로 결합할 수 있고,인간 인터로이킨-6 수용체에 결합하기 위하여 인간 인터로이킨-6와 경쟁하는 모노클로날 항체를 생산하는, 생쥐(mouse)의 비장 세포와 생쥐의 골수종 세포 P3U1 유래의 히브리도마 PM1(FERM BP-2998)가 제공된다.

Description

인간 인터로이킨-6 수용체에 대한 항체, 이를 생산하는 히브리도마 및 이들의 제조방법{ANTIBODY TO HUMAN INTERLEUKIN-6 RECEPTOR,HYBRIDOMA PRODUCING THE ANTlBODY, AND PROCESS FOR THE PREPARATION THEREOF}
본 발명은 인간 IL-6 수용체에 특이적으로 결합하는 항체들과 이들의 제조방법에 관한 것이다.
인터로이킨-6(이하, 'IL-6'라 약칭함)는 여러가지 중요한 생리학적 활성을 가지며 그리고 세포의 증식 및 변이에 광범위하게 관여하는 단백질이다. 또한, IL-6이 비정상적으로 생산이 되는 경우, 여러가지 자기면역 질병을 야기시키는 요인이 될 수 있다는 것이 보고되어 있다(참조; Kishimoto and Hirano, Ann. Rev.Immunol., 6, page 485, 1988).
IL-6에 특이적으로 결합하는, 세포막상의 IL-6 수용체는 타가 등에 의해 분석되어, 각 세포상의 수효와 IL-6에 대한 결합상수가 이미 보고되어 있다(참조; J.Exp. Med., 196, page 967, 1987). 또한 야마자키등은 인간 IL-6 수용체의 cDNA를 분리하여, 이들의 일차 구조를 보고하였다(참조; Science, 241, page 825, 1988). 이들 결과를 토대로하여 유전공학 방법으로 제조된 IL-6 수용체는 여러가지 면역질병의 치료 및 진단시약이 될 수 있을 것으로 기대되고 있다.
이러한 IL-6 수용체의 대량생산과 균질한 정제를 하기위해 IL-6 수용체를 신속하게 인식하는 수단으로서 IL-6 수용체에 대한 항체를 개발하는 것이 요망되고있으나, IL-6 수용체를 인식할 수 있는 모노클로날 항체는 알려져 있지 않다.
따라서, 본 발명의 주 목적은 IL-6 수용체에 대한 여러가지 형태의 항체를 제공하는 것에 있다.
제 1도는 IL-6 수용체가 발현되지 않은 T-세포주 Jurkat[곡선 (a) 및 (c)],또는 IL-6 수용체 cDNA를 함유하는 벡터가 도입되고, MT18의 배양 상등액[곡선 (a) 및 (b)중 실선] 또는 PM1의 배양 상등액[곡선 (c) 및 (d)중 실선]으로 IL-6 수용체가 영속적으로 발현된[곡선 (b) 및 (d)] Jurkat의 반응성을 나타낸 것이며, 도면중, 점선은 배양상등액으로 처리되지 않은 세포에 대한 결과들을 나타낸 것이고,
제 2도는 내부적으로 표지된 U266 세포를 용해시키고, MT18 모노클로날항체(레인 1), PM1 모노클로날 항체(레인 2), 토끼 면역글로블린(레인 3), 또는 실시예 3의 항-펩티드 폴리클로날 항체(레인 4)로 면역침전시킨 다음, 이것을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동과 자동 라디오그라피로 얻은 결과를 나타낸 것이고,
제 3도는 실시예 4에 기술한 방법에 따라 IL-6의 IL-수용체의 결합에 미치는 PM1과 MT18 항체의 억제효과를 나타낸 것이고,
제 4도는 IL-6의 존재(점선) 또는 부재(실선)하에서, U266 세포에의 MT18항체[곡선 (a)]와 PM1항체[곡선(b)]의 결합을 비교한 결과를 나타낸 것이며, 점선은IL-6만으로 처리된 U266 세포에 대한 결과를 나타낸 것이고,
제 5도는 MT18 또는 PM1의 배양 상등액 존재 또는 부재하에서 IL-6를 여러농도로 배양된 KT3 세포에 의한 트리티움 표지된 티미딘의 혼입량을 나타낸 것이고,
제 6도는 MT18 항체가 오직 IL-6 수용체 생산 세포에만 결합하는 것을 나타내는 세포 분포 곡선이다.
이러한 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 인간 인터로이킨-6 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 인간 인터로이킨-6 수용체의 항체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상술한 특성을 가지는 모노클로날 항체를 생산하는 히브리도마를 제공한다.
본 발명은 또한, 인간 인터로이킨-6 수용체 항원으로 포유류를 면역시키고,상기 포유류로부터 면역체 세포를 얻고, 상기 면역세포를 골수종 세포와 융합하고,그리고 융합된 세포로부터 인간 인터로이킨-6 수용체를 인식할 수 있는 히브리도마세포 주를 클로닝하는 것으로 이루어지는 히브리도마의 생산방법도 제공한다.
또한, 본 발명은 상술한 히브리도마를 배양하고, 상기 배양물로부터 인간 인터로이킨-6 수용체를 인식할 수 있는 모노클로날 항체를 회수하는 것으로 이루어지는 인간 인터로이킨-6 수용체에 대한 항체를 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 인간 인터로이킨-6 수용체 항원으로 포유류를 면역시키고, 면역된 포유류로부터 인간 인터로이킨-6 수용체를 인식할 수 있는 폴리클로날 항체를 회수하는 것으로 이루어지는 인간 인터로이킨-6 수용체에 대한 폴리클로날 항체의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 항체는 인간 IL-6 수용체를 특이적으로 인식하며, 그리고, 모노클로날 또는 폴리클로날 항체를 포함한다. 모노클로날 항체는 인간 IL-6이 인간 IL-6 수용체에 결합하는 것을 경쟁적으로 억제하는 항체와 이 결합을 경쟁적으로 억제하지 않는 항체를 포함한다. 전자의 항체는 예를 들면, 본 발명의 히브리도마 PM1에 의해 생산되는 PM1 모노클로날 항체를 포함하며, 그리고 후자의 항체는 예를 들면 히브리도마 MT18에 의해 생산되는 MT18 모노클로날 항체를 포함한다.
본 발명의 항체 제조에 사용되는 면역원으로서는 세포의 표면에 발현된 인간IL-6 수용체를 가지는 동물세포를 언급할 수 있다. 이러한 동물세포는 예를 들면,인간 골수종 세포주 U266과 같은 인간 IL-6 수용체를 생산하는 인간에서 유도된 세포주, 그리고 인간 IL-6 수용체를 코딩하는 DNA로 형질전환된 숙주세포, 예를 들면, 인간 IL-6수용체를 코딩하는 cDNA로 이루어지는 플라스미드로 형질전환된, 생쥐 T-세포와 같은 동물세포주가 포함된다. 그럼에도, 이들 세포주는 세포 표면상에 발현된 IL-6 수용체의 양이 적으므로, 효과적인 항원이라고 할 수는 없다.
그러나, 이러한 면역원을 사용하여 항체를 생산할 수 있으나, 일단 인간 IL-6 수용체에 대한 항체가 얻어지면, 이 항체를 사용하여 더욱 효과적인 면역원을 제조할 수 있으며, 그리고 이 면역원을 사용하여 여러 종류의 항체를 제조할 수 있다. 예를 들면, 면역원은 적합한 고체 담체에 인간 IL-6 수용체에 대한 항체를 결합시키고, 인간 IL-6 수용체를 생산하는 세포, 예를 들면, 상술한 세포를 배양한 다음, 이 세포를 용해하고 이 세포용해물을 상술한 인간 IL-6 수용체 항체가 결합된 고체 담체와 접촉시켜서 세포 용균물중의 인간 IL-6 수용체가 담체에 흡착되어 농축되게 한다. 고체 담체의 종류는 고체 담체가 항체를 결합할 수 있고 그리고 바람직하기로는 면역시킬 동물의 성장에 중대한 영향을 끼치지 않는한, 특별히 문제가 되지는 않는다. 예를 들면, 이후에 기술되는 실시예에서 언급되는 바와 같은, 세파로스계 고체 담체를 본 발명의 고체 담체로서 사용하는 것이 바람직한데,이는 이 담체에 항체를 결합시키는 것을 간단한 조작으로 할 수 있고 면역시킬 동물의 성장에 영향을 끼치지 않기 때문이다. 대안으로서, 인간 IL-6 수용체는 유전공학 방법, 예를 들면, 일본국 특허출원 제89-9776호에 기술된 방법으로 제조할 수 있으며, 제조된 이 수용체를 면역원으로 사용할 수 있다. 또한 인간 IL-6 수용체의 일부를 구성하는 펩티드를 형성시키고, 이 펩티드를 중합체 담체, 예를 들면 오발부민과 같은 단백질에 연결시켜 만든 면역원을 사용할 수 있다. 감염후에, 인간IL-6 수용체가 발현될 수 있도록 배열된 왁지니아 바이러스를 면역원으로서 사용할 수도 있다. 이들 면역원중의 어느 것이나 폴리클로날 항체 및 히브리도마 제조용면역원으로서 사용할 수 있다.
상기 폴리클로날 항체는 통상의 방법에 따라 생쥐, 토끼, 양, 염소 등과 같은 포유류를 상술한 항원중의 어느 하나로 면역시켜서 제조한다.
또한 히브리도마는 통상의 방법에 따라, 예를 들면, 생쥐와 같은 포유류를 상술한 항원중의 어느 하나로 면역시키고, 이 동물로부터 비장 세포를 얻고, 이 세포를 확립된 골수종 세포와 융합한 후, 소망하는 반응성을 가지는 모노클로날 항체를 생산하는 히브리도마를 클로닝하여 제조할 수 있다.
모노클로날 항체는 클로운된 히브리도마를 배양하고, 이 배양 상등액으로부터 모노클로날 항체를 회수하여 제조한다. 이와 달리, 모노클로날 항체는 동물을 상술한 히브리도마로 복강내 감염시키고, 이 동물로부터 복수를 수집하고, 그리고 모노클로날 항체를 분리하여 제조할 수 있다.
히브리도마 세포 상등액내의 항체 또는 복수중의 항체는 통상의 방법으로,예를 들면, 황산암모늄으로 염석하여 농축할 수 있으며, 그리고 친화성 크로마토그라피에 의해, 예를 들면, IL-6 수용체-부동화된 담체상에서 친화성 크로마토그라피에 의해 정제할 수 있다.
모노클로날 항체의 제조, 히브리도마의 제조, 모노클로날 항체의 제조와 항체의 회수 및 정제는 모두 이 분야에서 공지된 방법으로 수행할 수 있다.
본 발명을 하기 실시예에 따라 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 이들 실시예로 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 (인간 IL-6 수용체에 대한 생쥐 모노클로날 항체의 제조):
인간 IL-6 수용체에 대한 생쥐 모노클로날 항체를 제조하기 위해, 다음 방법에 따라 세포막 표면상에 발현된 인간 IL-6 수용체를 가지는 생쥐 T-세포주를 면역원으로서 제조하였다. 즉, 일본국 특허출원 제89-9774호에 기술된 pBSF2R.236 및 pSV2neo를 통상의 방법에 따라, 생쥐 T-세포 CTLL-2(ATCC, TIB214)에 도입하고, G-418을 사용하여 통상의 방법으로 스크리닝을 실시하였다. 끝으로, 세포 1개당 약 30,000의 IL-6 수용체가 발현된 세포주를 확립하고, 이것을 'CTBC3'으로 명명하였다.
다음 방법으로 면역화반응을 실시하였다. 즉, CTBC3을 PRMI1640을 사용하여, 통상의 방법으로 배양하고, PBS 완충액으로 4회 씻고, 그리고 C57BL6 생쥐에 일주일에 한번씩 생쥐 1마리당 1×107세포의 양으로 도합 6회 복강내 주입하였다.
면역된 생쥐로부터 얻은 비장 세포를 폴리에틸렌글리콜을 사용하여 통상의 방법으로 모세포 주로서 골수종 세포 P3U1과 융합시켰다.
다음 방법으로 스크리닝을 실시하였다. 즉, pBSF25R.236·및 pSV2neo를 IL-6수용체에 대해 음성인 인간 T-세포 JURKAT(ATCC, CRL8163)에 도입하고, 스크리닝한후에, 세포 1개당 약 100,000의 IL-6 수용체가 발현된 세포주를 확립하고, 이것을 'NJBC8'로 명명하였다. NP40으로 용해된 NJBC8을 인식하고 NP40으로 용해된 JURKAT를 인식하지 못하는 항체를 생산하는 히브리도마의 클론하나를 분리하고 이 히브리도마를 'MT18'이라고 명명하였다. 이어서, 이 히브리도마에 의해 생산된 모노클로날 항체를 'MT18 항체'라고 명명하였다. 상기한 히브리도마 MT18은 통산성공업기술원 미생물 공업기술연구소(FRI)에 (일본국 이바라기껭 쯔꾸바시 히가시 1죠메 1-3) 1989년 7월 12일 FERM P-10840하에 기탁되었고, 그리고 부다페스트 협약에 따라 1990년 7월 10일에 FERM BP-2999하에 국제기탁되었다.
제 6도의 데이터는 MT18 항체가 IL-6 수용체를 특이적으로 인식하는 것을 보여주고 있다. 제 6도에서, 곡선 A는 JURKAT 세포를 플루오레스세인 이소시아네이트로 표지된 MT18 항체로 염색한 경우, 플루오레스세인으로 염색된 세포의 분포를 나타낸 것이고, 곡선 B는 상술한 NJBC8 세포를 유사하게 처리했을 때의 결과를 나타낸 것이다.
실시예 2 (IL-6 수용체에 대한 모노클로날 항체의 제조):
IL-6 수용체의 생쥐 모노클로날 항체를 제조하기 위해, 다음 방법으로, 인간IL-6 수용체를 면역원으로서 추출하였다.
즉, 세포주 U266(IL-6 수용체-생산세포)의 인간 골수종 세포 3×109을 1% 디기토닌(와코 준야쿠 제품) 1㎖,1OmM 트리에탄올아민 완충액(pH7.4) 0.15M NaC1 그리고 1mM PMSF(와코 준야쿠 제품)로 용해하였다. 한편으로, MT18 항체(실시예 1),즉,IL-6 수용체에 대한 항체를 통상의 방법에 따라, 세파로스 4B(Pharmacia 제품)에 부착시켰다. 항체-결합된 담체를 용해된 세포의 상등액과 혼합하여 담체상의 MT18 항체에 가용화된 IL-6 수용체를 결합시켰다. 비특이적으로 결합된 생성물은 상술한 1% 디기토닌 용액으로 세척해내고, MT18 항체를 통해 세파로스 4B에 결합된 IL-6 수용체를 하나의 면역화 반응용 면역원으로서 사용하였다.
히브리도마의 면역화 및 제조는 다음 방법으로 수행하였다.
Balb/c 생쥐는 상술한 면역원으로 일주일에 한번씩 4회 복강내 면역시켰다. 상기 생쥐로부터 얻은 비장 세포를 폴리에틸렌글리콜을 사용하여 통상의 방법으로 모세포 주로서 골수종 세포 P3U1과 융합시켰다.
스크리닝은 다음 방법으로 실시하였다. 먼저, 히브리도마의 배양 상등액을 단백질 G-세파로스 수지(Pharmacia 제품)와 혼합하여 상등액중의 면역글로블린을 수지에 흡착시켰다. 한편으로,35S-메티오닌으로 내부적으로 표지된 U266 세포 107을 용해시킨 다음, 상술한 MT18 항체-결합된 세파로스 4B상에 IL-6 수용체를 친화성 정제시키고, 상술한 단백질 G-세파로스로 면역 침전시킨 후, SDS/PAGE로 분석하였다. 이 결과,IL-6수용체에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하는 히브리도마 클론하나를 분리하여 'PM1'으로 명명하였다. 이 히브리도마에 의해 생산된 모노클로날 항체는 'PM1항체'라고 명명하였다.
히브리도마 PM1은 통산성 공업기술원 미생물공업기술연구소(FRI)에 1989년 7월 12일에 FERM-P 10839하에 기탁되고, 그후 부다페스트 협약에 따라 1990년 7월10일에 FERM BP-2998하에 국제기탁되었다.
모노클로날 항체 PM1 및 MT18과 IL-6 수용체와의 반응성을 제 1도에 나타내었다. 즉, IL-6 수용체가 발현되지 않은 T-세포주 Jurkat[제 1도에서, 곡선 (a)및 (c)] 그리고 IL-6 수용체의 cDNA가 도입되고 IL-6 수용체가 영속적으로 발현된 세포주 Jurkat[곡선 (b) 및 (d)]는 MT18의 배양 상등액[제 1도의 곡선 (a) 및 (b)에서의 실선] 또는 PM1의 배양상등액[곡선 (c) 및 (d)에서의 실선]과 각각 반응시켰다. 반응 생성물을 형광염료에 공액 결합된 양의 항-생쥐 항체와 반응시킨 다음, 플루오레스세인 강도에 대한 플루오레스세인 염색된 세포의 분포를 조사하였다. 비교하기 위해서, MT18 또는 PM1 배양상등액 어느 것으로도 처리하지 않은 대응되는 세포로부터 얻은 시험결과를 제 1도의 (a),(b),(c) 및 (d) 박스내의 점선으로 표시하였다.
이들 결과로부터, PM1 및 MT18 항체 각각은 IL-6 수용체에 결합될 수 있다는것이 확인되었다.
실시예 3 (IL-6 수용체에 대한 폴리클로날 항체의 제조) :
IL-6 수용체에 대한 폴리클로날 항체를 제조하기 위해서, 펩티드: KTSMHPPYSLGQLVPC(여기서, K는 라이신을 나타내고, T는 트레오닌을 나타내고, S는 세린을 나타내고, M은 메티오닌을 나타내고, H는 히스티딘을 나타내고, F는 페닐알라닌을 나타내고, P는 프롤린을 나타내고, Y는 티로신을 나타내고, L은 로이신을 나타내고, G는 글리신을 나타내고, Q는 글루타민을 나타내고, V는 발린을 나타내고, 그리고 C는 시스테인 잔기를 나타낸다)에서, 시스테인 잔기가 IL-6 수용체의 세포내 영역의 일부에 대응하는 펩티드에 첨가된 것을 통상의 방법으로 합성하였다.
이러한 합성 펩티드는 히라노등(T. Hirano et al., Proc. Nat1. Acad. Sci.USA, 84, Page 228, 1987)의 방법으로 오발부민에 부착시켰다. 상기에서 제조된 생성물 0.2mg으로 토끼를 일주일에 한번씩 5회 면역시켰다. 토끼로부터 전체 혈청을 수집하고 합성 펩티드-결합된 세파로스 4B상에서 친화성 정제를 행하였다.
제 2도에 표시된 데이터는 제조된 폴리클로날 항체가 IL-6 수용체를 특이적으로 인식한다는 것을 나타내고 있다. 즉, 내부적으로 표지된 U266 세포(IL-6 수용체-생산 세포)를 세제로 용해시키고, 그리고 수득한 세포 용균물을 MT18 항체(레인 1), PM1 항체(레인 2), 토끼 면역글로블린(레인 3) 또는 실시예 3에서 제조된 항-펩티드 폴리클로날 항체(레인 4)로 면역 침전시키고, 이어서 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 및 오토레디오그라피를 실시하였다. 이 결과, MT18 모노클로날항체, PM1 모노클로날 항체 및 항-펩티드 폴리클로날 항체 각각은 IL-6 수용체를 특이적으로 인식한다는 것이 확인되었다.
실시예 4 (PM1 항체에 의해 IL-6가 IL-6 수용체에의 결합을 경쟁적으로 억제):
IL-6의 표지화 및 IL-6가 IL-6 수용체에 결합하는 것을 확인하는 작업을 타가 등(Taga et al., J. Exp. Med., 166, Page 967, 1987 참조)의 방법으로 실시하였다.125I-IL-6(14,OOOcpm)을 U266 세포(IL-6 수용체 생산 세포) 4×105과 실온에서 60분간 반응시켰다. 이 반응은 분자 수의 100배 과잉의 비표지된 IL-6, MT18의 배양 상등액(70용적%) 또는 PM1의 배양 상등액(70용적%) 존재하에 실시하였다. 세포들은 FCS상에 오버레이하고, 원심 분리한 후, 세포의 방사능을 측정하였다. 비교하기 위해서, 세포를 접종하지 않은 배지를 유사하게 처리하였다.
제 3도의 데이터는 MT18 항체가 IL-6 수용체에 IL-6가 결합하는 것을 경쟁적으로 억제하지 않으나, PM1 항체는 이 결합을 경쟁적으로 억제한다는 것을 나타내고 있다.
유사한 결과가 제 4도에서도 나타나 있다. 제 4도에서, 곡선 (a)는 형광 강도에 대한 세포주의 분포를 나타낸 것으로, 여기서 U266 세포는 MT18의 배양상등액과 IL-6 존재하에(점선) 또는 부재하에(실선) 반응되고, 이어서 형광 표지된 항-생쥐 면역글로블린으로 염색되었다. 그리고 곡선 (b)는 U266 세포를 PM1의 상등액과 IL-6 존재하에(점선) 또는 부재하에(실선) 반응시키고, 곡선 (a)와 같은 방법으로 처리한 결과를 나타내는 것이다. MT18 항체는 IL-6의 존재여부에 상관없이, U266세포에 결합하지만, PM1 항체는 IL-6가 부재하는 경우, U266 세포에 결합하고, IL-6가 과잉으로 존재하면 U266 세포에 결합하지 않는다는 것을 알 수 있다. 따라서, PM1 항체는 IL-6와 경쟁적이라는 것이 확인되었다.
실시예 5 (PM1 항체에 의한 IL-6의 생물학적 활성의 억제 확인):
IL-6 의존 인간 T-세포주 백혈병 KT3는 시미즈 등의 방법(S. Shimizu et al., Blood, 72, page 1826, 1988)에 의해 배양한 다음, IL-6를 다양한 농도로 하여 25용적%의 히브리도마 PM1의 배양 상등액 존재 또는 부재하에 첨가하였다. 배양은 시판품인 96-웰 판에서 실시하였다. 세포 수는 각 웰에 100㎕당 5×103이었다. 60시간 후에, 각 웰당 0.75μCi 트리티움으로 표지된 티미딘을 첨가하고, 6시간 후에, 세포를 수집하여, 유입된 방사능을 측정하였다.
제 5도의 데이타는 MT18 항체가 IL-6의 생물학적 활성을 억제하지 않으나, PM1 항체는 IL-6의 생물학적 활성을 억제한다는 것을 나타내고 있다.
본 발명에 의하여 제공된, 특이적으로 IL-6 수용체를 인식하는 폴리클로날및 모노클로날 항체는 진단시약 또는 치료제로서 기대되는 IL-6 수용체 활성을 가지는 각종 단백질을 다량으로 생산 및 정제하는데 유용하다.
또한, 본 발명에 의해 제공되는 항체는 자연 상태에서는 단지 매우 소량으로만 생산되는, IL-6 수용체의 여러 특성의 분석을 가능하게 한다. 이것은 온토게네시스와 면역기구의 연구에, 그리고 이들의 결과를 기초로 한 치료제 및 진단시약의 개발에 매우 중요하다.
더욱이, 본 발명에 의해 제공된, IL-6의 생물학적 활성을 억제하는 항체는IL-6의 비정상적 생산으로 야기되는 여러가지 자기면역 질병의 치료제의 개발에 적용될 수 있을 것으로 기대된다.
실시예 6 (IL-6 수용체 일부분에 대한 모노클로날 항체의 제조):
Balb/c 생쥐를 실시예 3에서 사용한 항원, 즉 오발부민으로 공액된 합성 펩티드 KTSMHPPYSLGQLVPC로 일주일에 한번씩 4회 복강내 면역을 실시하였다. 다음에 생쥐로부터 얻은 비장 세포를 통상의 방법으로 폴리에틸렌글리콜을 사용하여 골수종 세포와 융합시켰다.
스크리닝은 다음 방법으로 실시하였다. 먼저, 히브리도마의 배양 상등액을 단백질 G-세파로스 수지(Pharmacia 제품)와 혼합하여, 이로써 상기 상등액중의 면역글로블린이 수지에 흡착되게 하였다. 한편,35S-메티오닌으로 내부적으로 표지된 107U266 세포를 용해시키고, 상기한 단백질 G-세파로스로 면역 침전시킨 다음, SDS/PAGE에 의해 분석하였다. 이 결과, IL-6 수용체의 밴드가 검출되었다. 한편, 면역 침전이 되는 동안 항원 펩티드(KTSMHPPYSLGQLVPC)를 첨가한 결과, 밴드는 검출되지 않았다. 이 결과, IL-6 수용체의 세포내 영역의 일부분을 특이적으로 인식하는 모노클로날 항체를 생산하는 히브리도마 클론 하나가 분리되었다.
본 발명에 의하면 IL-6 수용체에 대한 여러가지 형태의 항체를 제공된다.

Claims (8)

  1. 인간 인터로이킨-6 수용체에 특이적으로 결합할 수 있고, 인간 인터로이킨-6수용체에 결합하기 위하여 인간 인터로이킨-6와 경쟁하는 모노클로날 항체를 생산하는, 생쥐(mouse)의 비장 세포와 생쥐의 골수종 세포 P3U1 유래의 히브리도마 PM1(FERM BP-2998).
  2. 제1항의 히브리도마에 의하여 생산되고, 인간 인터로이킨-6 수용체에 특이적으로 결합할 수 있으며, 인간 인터로이킨-6 수용체에 결합하기 위하여 인간 인터로이킨-6와 경쟁하는 모노클로날 항체.
  3. 제1항에 따른 히브리도마를 배양하고, 상기 배양물로부터 인간 인터로이킨-6수용체를 인식할 수 있는 모노클로날 항체를 회수하는 것을 특징으로 하는 항-인간인터로이킨-6 수용체 항체의 제조방법.
  4. (1) 표면에 인터로이킨-6 수용체를 발현하고 있는 가용화된 세포로 생쥐를면역시키는 단계;
    (2) 면역화된 생쥐로부터 비장세포를 얻는 단계;
    (3) 단계 (2)에서 얻은 비장세포와 골수종 세포 P3U1를 융합하는 단계;
    (4) 단계 (3)에서 얻은 융합 세포를 선별하여, 인간 인터로이킨-6 수용체에특이적으로 결합할 수 있고, 인간 인터로이킨-6 수용체에 결합하기 위하여 인간 인터로이킨-6와 경쟁하는 모노클로날 항체를 생산하는 히브리도마를 클로닝하는 단계를 포함하여 이루어지는 히브리도마 PMl(FERM BP-2998)의 제조 방법.
  5. 인간 인터로이킨-6 수용체에 특이적으로 결합할 수 있고, 인간 인터로이킨-6수용체에 결합하기 위하여 인간 인터로이킨-6와 경쟁하지 않는 모노클로날 항체를생산하는, 생쥐 비장세포와 생쥐 골수종 세포 P3U1 유래의 히브리도마 MT18(FERM BP-2999) .
  6. 제5항의 히브리도마에 의하여 생산되고, 인간 인터로이킨-6 수용체에 특이적으로 결합할 수 있으며, 인간 인터로이킨-6 수용체에 결합하기 위하여 인간 인터로이킨-6와 경쟁하지 않는 모노클로날 항체.
  7. 제5항에 따른 히브리도마를 배양하고, 상기 배양물로부터 인간 인터로이킨-6수용체를 인식할 수 있는 모노클로날 항체를 회수하는 것을 특징으로 하는 항-인간인터로이킨-6 수용체 항체의 제조방법.
  8. (1) 인간 인터로이킨-6 수용체로 생쥐를 면역시키는 단계;
    (2) 면역화된 생쥐로부터 비장세포를 얻는 단계;
    (3) 단계 (2)에서 얻은 비장세포와 골수종 세포 P3U1를 융합하는 단계;
    (4) 단계 (3)에서 얻은 융합 세포를 선별하여, 인간 인터로이킨-6 수용체에특이적으로 결합할 수 있고, 인간 인터로이킨-6 수용체에 결합하기 위하여 인간 인터로이킨-6와 경쟁하지 않는 모노클로날 항체를 생산하는 히브리도마를 클로닝하는단계를 포함하여 이루어지는 히브리도마 MT18(FERM BP-2999)의 제조 방법.
KR1019990001145A 1989-07-20 1999-01-15 인간 인터로이킨-6 수용체에 대한 항체, 이를 생산하는 히브리도마 및 이들의 제조방법 KR100244579B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP89-186016 1989-07-20
JP18601689 1989-07-20
KR1019900011023A KR100214759B1 (ko) 1989-07-20 1990-07-20 인간 인터로이킨-6 수용체에 대한 항체

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1019900011023A Division KR100214759B1 (ko) 1989-07-20 1990-07-20 인간 인터로이킨-6 수용체에 대한 항체

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR100244579B1 true KR100244579B1 (ko) 2000-03-15

Family

ID=26503481

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1019990001145A KR100244579B1 (ko) 1989-07-20 1999-01-15 인간 인터로이킨-6 수용체에 대한 항체, 이를 생산하는 히브리도마 및 이들의 제조방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR100244579B1 (ko)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100214759B1 (ko) 인간 인터로이킨-6 수용체에 대한 항체
US5670373A (en) Antibody to human interleukin-6 receptor
Carrel et al. Subsets of human Ia-like molecules defined by monoclonal antibodies
Wong et al. Bi-specific monoclonal antibodies: selective binding and complement fixation to cells that express two different surface antigens.
EP0267611B1 (en) Antibody against interleukin-1
EP0604693A1 (en) Monoclonal antibodies against the human interleukin-4 receptor and hybridomas producing the same
JP2898040B2 (ja) ｇｐ１３０蛋白質に対する抗体
KR100301189B1 (ko) 당단백질피(p)에대한단일클론항체
US5084380A (en) Monoclonal antibodies reactive with activated and oncogenic ras p21 proteins
EP0330878A2 (en) Anti-ras protein-antibodies
GB2188941A (en) Monoclonal antibodies recognizing human interleukin-2-receptor
US5081230A (en) Monoclonal antibodies reactive with normal and oncogenic forms of the ras p21 protein
EP0265384A2 (en) Monoclonal antibodies to a colony stimulating factor
CN115947854B (zh) 抗人cd40蛋白单克隆抗体、制备方法及其应用
CN115785270B (zh) 一种针对人cd20蛋白的单克隆抗体、制备方法及其应用
Hellström et al. Monoclonal antibodies to tumor antigens
JPH10509948A (ja) Ｔ細胞受容体ペプチドに対するヒト抗体およびそれらの調製方法
JPH0967400A (ja) モノクローナル抗体、該抗体を産生するハイブリドーマ及びその利用
KR100244579B1 (ko) 인간 인터로이킨-6 수용체에 대한 항체, 이를 생산하는 히브리도마 및 이들의 제조방법
JPH08510730A (ja) ヒト胸腺皮質細胞上に発現する細胞表面タンパク質及びその利用
JP4059404B2 (ja) 甲状腺機能を刺激する活性を持つ抗体
EP0269728B1 (en) Monoclonal antibodies to human lymphocyte ige receptors, hybridomas producing such antibodies, and kits for using such antibodies
Dehghanpisheh et al. Retrovirally induced mouse anti‐TCR monoclonals can synergize the in vitro proliferative T cell response to bacterial superantigens
EP0265847B1 (en) Monoclonal antibody reacting with TRF (interleukin-5)
EP0259585A1 (en) Monoclonal antibodies specific to surface receptor for IgE and hybrid cell lines producing these antibodies and use thereof

Legal Events

Date Code Title Description
A107 Divisional application of patent
A201 Request for examination
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20121114

Year of fee payment: 14

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20131031

Year of fee payment: 15

EXPY Expiration of term