JPH08510730A

JPH08510730A - ヒト胸腺皮質細胞上に発現する細胞表面タンパク質及びその利用

Info

Publication number: JPH08510730A
Application number: JP7500486A
Authority: JP
Inventors: パーク、ソン・ホエ; バエ、ヤング・ミー
Original assignee: パーク、ソン・ホエ
Priority date: 1993-05-21
Filing date: 1994-05-21
Publication date: 1996-11-12
Anticipated expiration: 2013-12-02
Also published as: US5942404A; US6225286B1; AU6761294A; EP0726914B1; KR0149048B1; JP2831852B2; ES2229218T3; US5879911A; WO1994028023A1; DE69434024T2; DE69434024D1; IL109717A0; US5641860A; ZA943549B; EP0726914A1

Abstract

(57)【要約】分子量１２０，０００の糖タンパク質であり、且つＴリンパ芽球性リンパ腫細胞および白血病細胞に発現する新規のタンパク質は、Ｔリンパ芽球性リンパ腫および白血病の診断に有益である。

Description

【発明の詳細な説明】ヒト胸腺皮質細胞上に発現する細胞表面タンパク質及びその利用〔発明の背景〕発明の分野本発明は、ヒト胸腺皮質細胞上に発現する細胞表面タンパク質及びその利用に関する。より詳細には、本発明は、胸腺皮質細胞上、並びにＴリンパ芽球白血病、胸腺皮質細胞を起源とするＴリンパ芽球性リンパ腫、および全種類の白血病の約５０％における悪性細胞上にのみ専ら発現される、分子量約１２０，０００ダルトンの新規なタンパク質（本明細書中、以後「ＪＬ１」と称する）と、白血病およびＴリンパ芽球性リンパ腫における該タンパク質の診断及び臨床上の応用に関する。なお上記の細胞は、免疫組織化学的分析及びフローサイトメトリー分析により同定される。従来技術の説明ヒトの体は、誕生後に晒される体外の物質に対して特異的な応答を示し、ヒトの体を防御する免疫応答にはＴリンパ球、Ｂリンパ球および抗原提示細胞が関与している。リンパ球は、リンパ系器官細胞の主要構成体であり、血液及びリンパを介して循環している間に、特異的免疫応答において重要な役割を果たす。Ｂリンパ球の主要な役割は、体外の物質に対する抗体を産生することである。Ｔリンパ球は２つのタイプに分類され、その一つは特異的免疫応答を補助する機能を有するものであり、もう一つは病原に感染した細胞を殺傷する機能を有するものである。抗原提示細胞の役割は、感染した抗原を非特異的に取り込み、それらを小さなペプチドに分解処理してＴリンパ球にそれらの抗原情報を提供することである。胸腺内Ｔ細胞の発生には、複雑な一連の分裂、分化及び選択の段階を伴なう。Ｔ細胞の起源は、胎児の肝臓及び出生後の骨髄で産生される造血幹細胞である。それらは胸腺に移動し、分化し、および成熟し、その後に血管を通って胸腺から出ていき、成熟Ｔ細胞になる。胸腺におけるＴ細胞レセプターの生殖系列遺伝子の再構成の後、胸腺細胞は、その表面にＴ細胞レセプター複合体を発現する。この遺伝子再構成過程は、ＲＡＧ−１とＲＡＧ−２を含む酵素系を必要とする。その結果、複雑な過程を経て、Ｔ細胞レセプターの極端な多様性の創出が可能となる。しかしながら、産生されたＴ細胞レセプターのすべてが、その機能を末梢部位において適切に発揮できるのではない。主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）のクラスＩ及びクラスＩＩにより作られた抗原を認識できない細胞、および自己抗原に強く応答する細胞は除かれる。これらの過程をそれぞれ、正の選択及び負の選択と称する。Ｔ細胞レセプターは、細胞表面に存在する自分のＭＨＣ分子に結合した外来抗原を認識するときに、その適切な機能を果たすことができる。この学習過程は、胸腺でなされる。Ｔ細胞は、Ｔ細胞レセプターだけでなく、様々な細胞表面タンパク質をも発現する。これらのタンパク質もまたＴ細胞の機能にとって重要である。これらのＴ細胞表面タンパク質のほとんどは、広範囲のＴ細胞サブセットにわたって発現される。しかしながら、それらの中には特定の段階においてのみ発現されるものも幾つかあり、これらのタンパク質はＴ細胞の成熟段階を決定するためのＴ細胞表面マーカーとして用いることができる。一般的には、マーカーとしてＴ細胞表面分子を用いる、レンハーツ（Renherz）らによる分類体系が胸腺細胞の分化段階の決定に用いられてきた。この分類法に従って、胸腺細胞は、（ａ）ＣＤ４^-／ＣＤ８^-の重複陰性（ double negative）である未成熟胸腺細胞（early thymocyte）、（ｂ）ＣＤ４⁺ ／ＣＤ８⁺の重複陽性（double positive）である中間胸腺細胞（common thymocy te）、および（ｃ）ＣＤ４⁺またはＣＤ８⁺の単独陽性（single positive）である成熟胸腺細胞（mature thymocyte）に分類される。未成熟胸腺細胞は、ＣＤ７、ＣＤ３８およびＣＤ７１のタンパク質を発現する。これらは、骨髄から胸腺に到着して間もない細胞であり、盛んに分裂する。Ｔ細胞レセプター遺伝子のＴＣＲβの再構成がこの段階で起こる。中間胸腺細胞は、胸腺の最大部分を占め、細胞表面上にＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８などを新たに発現し、かつＴＣＲα遺伝子が再構成される。その後、成熟胸腺細胞において、細胞表面上にＴ細胞レセプターが発現する。その中の少数だけが生き残って次の段階に移行することができ、ほとんどは死んでしまう（Nikolis-Zugic,1991,Immunol .Today ，12,65-70）。Ｔ細胞および胸腺細胞における細胞表面分子は、分化の段階およびサブセットの分類を決定するために用いることができる。加えて、それらはＴ細胞を起源とする腫瘍の診断及び治療のために用いることもできる。これらの細胞表面タンパク質は、Ｔ細胞の機能及び発生において重要な役割を有している。Ｔ細胞レセプターが不適切であれば、胸腺細胞は死ぬ。しかも、その死は単に受動的なものではなく、ある種のタンパク質またはある種の代謝産物の合成を要求する能動的なものである（Rothenberg,1990，Immunol.Today，11,116-119）。この細胞死は、外部からの特定の刺激信号を必要とするものらしい。且つ、その細胞表面タンパク質は、該信号の経路に含まれているかもしれない。しかしながら、細胞表面分子の同定は現在まで不可能であった。もし、中間胸腺細胞が特定のタンパク質を発現して、Ｔ細胞レセプターの選択および予定された（programm ed）細胞死のための信号を伝達するのであれば、このタンパク質はその段階に固有のものであろう。ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂおよびＣＤ１ｃのような少数の胸腺皮質細胞の抗原が、胸腺皮質で発現されることが知られてはいるが、それらは樹枝状細胞、脳の星状膠細胞およびＢリンパ球のような様々な細胞型においてもまた発現する。〔発明の概要〕本発明の目的は、胸腺皮質細胞の発生段階の類別に用い得る、該細胞に発現する新規のタンパク質を提供することである。本発明のもう一つの目的は、胸腺細胞および造血系を起源とする腫瘍細胞に発現が限定されるタンパク質を提供することである。本発明の第３の目的は、胸腺細胞の発生段階を決定し、また造血系を起源とする腫瘍を診断するための物質を提供することである。本発明の第４の目的は、造血系を起源とする腫瘍細胞を殺傷することができる治療用物質を提供することである。加えて、本発明は、本発明の治療用物質の使用による治療方法を提供しようとするものである。本発明は、ヒト胸腺皮質細胞上に発現される細胞表面タンパク質の「ＪＬ−１」を提供する。上記の細胞表面タンパク質は、分子量が約１２０，０００ダルトンの単鎖の糖タンパク質である。本発明のタンパク質はヒト胸腺皮質細胞上に発現され、またＴリンパ芽球性白血病細胞、ヒト胸腺皮質細胞を起源とするＴリンパ芽球性リンパ腫細胞、並びに様々な種類の白血病の約５０％の細胞上にも発現される。また、本発明は上記のタンパク質ＪＬ−１を認識する物質をも提供する。その物質は抗体及びリガンドからなる群より選択され、その抗体は、好ましくはモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体からなる群より選択され、さらに好ましくはヒトまたは動物起源である。上記の抗体は、抗原認識領域（Ｖ_HおよびＶ_L ）を含む抗体諸部分を具備しており、それ故、抗原を特異的に認識する能力を有する。また、抗体には、Ｆ（ａｂ´）２、ＦａｂおよびＦｖのような抗体の断片も包含される。好ましくは、この抗体断片（Ｆｖ）は、抗原の単鎖ポリペプチド断片の、いわゆるＦｖ単鎖を具備するものであり、それは、２つのポリペプチド、Ｖ_HおよびＶ_Lの間に連結ペプチドを挿入することにより調製され、その結果、熱安定性が向上する。上記の物質は、放射性同位体、蛍光物質および染色物質からなる群より選択される標識物質を含んでもよい。本発明は上記の物質の製造方法をも提供するものであり、且つ、上記の物質を産生する細胞および該細胞の製造方法も提供する。さらに本発明は、上記の物質を用いてＴ細胞白血病およびＴリンパ芽球性リンパ腫を診断する方法を提供する。加えて本発明は、抗体、抗体断片、単鎖ポリペプチド抗体断片およびリガンドからなる群より選択される上記の物質を用いて、白血病およびＴリンパ芽球性リンパ腫を治療する方法を提供する。その抗体または抗体断片は、好ましくはモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体からなる群より選択され、さらに好ましくはヒトまたは動物起源である。好ましくは、この抗原認識物質は、放射性同位体、毒性化合物、有毒タンパク質及び抗腫瘍剤からなる群より選択される有毒物質を含む。本発明は、標的物質としてＪＬ−１タンパク質を用い、且つ標的追跡物質（案内物質（guiding material））としてＪＬ−１認識物質を用いる遺伝子療法により、白血病および造血系を起源とするＴリンパ芽球性リンパ腫を治療する方法を提供する。加えて、本発明は、新規タンパク質であって、（ａ）ヒト胸腺細胞をマウスに投与して抗体を産生させ、得られた抗体を精製する工程；（ｂ）前記の（ａ）工程の精製抗体を用いた胸腺の免疫組織化学的染色により、胸腺皮質細胞にのみ反応する抗体を採集する工程；（ｃ）前記の（ｂ）工程で採集された抗体を用いたヒト正常組織の免疫組織化学的染色により、胸腺にのみ反応する抗体を採集する工程；および（ｄ）前記の（ｃ）工程で採集された抗体を用いた免疫組織化学的染色により、白血病細胞およびＴリンパ芽球性リンパ腫にのみ反応するタンパク質を採集する工程とを具備する方法により同定される新規タンパク質を提供する。〔図面の簡単な説明〕図１は、抗ＪＬ−１抗体を産生するハイブリドーマクローンの上清による、胸腺の免疫組織化学的染色の写真である。図２は、抗ＪＬ−１抗体の精製工程の下での最終生成物および各工程での中間生成物の１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の写真である。図３は、二色ＦＡＣＳを用いた、ＪＬ−１陽性の胸腺細胞表面上でのＣＤ４分子およびＣＤ８分子の発現を示す写真である。図４は、ｐＨ３．５およびｐＨ３．８において、ペプシンにより様々な反応時間で消化された抗ＪＬ−１抗体の１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の写真である。図５は、パパインにより消化された抗ＪＬ−１抗体の１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の写真である。図６は、胸腺細胞の放射線同位体によるラベリングの後に、抗ＪＬ−１抗体結合ビーズにより免疫沈降されたＪＬ−１タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の写真である。〔発明の詳細な説明〕生物学的活性を有するポリペプチドについての以下の具体例を以て本発明を例証するが、それらはいかなる意味においても本発明を限定するものではない。例１中間胸腺細胞上の特定の細胞表面タンパク質を発見するために、ヒト胸腺細胞をＢａｌｂ／ｃマウスに投与し、以下の例に従って、ヒト胸腺細胞に対する抗体を産生させた。１０⁷のヒト胸腺細胞が、２週間の間隔で６週間にわたってＢａｌｂ／ｃマウスに腹腔内投与され、免疫付与された。Ｂａｌｂ／ｃマウスの脾臓が最終投与の３日後に摘出され、脾臓細胞懸濁液が調製された。ヒト胸腺細胞により免疫付与されたＢａｌｂ／ｃマウスの脾臓細胞に、９−アザグアニンに耐性を有するＳＰ２／０−Ａｇ１４マウスのミエローマ（骨髄腫）細胞を融合することにより、モノクローナル抗体が調製された。細胞融合の方法は、ケーラーとミルシュタインの方法（Koeler and Milstein,1975，Nature,256,495-497）に準拠した。５０％ポリエチレングリコール４０００を用いて、１０⁸の脾臓細胞を１０⁷のミエローマ細胞と融合した。その細胞を洗浄し、２０％のウシ血清アルブミン、１００μＭのヒポキサンチン、０．４４μＭのアミノプテリンおよび１６μＭのチミジンを含有するＤＥＡＥ培地（ＨＡＴ培地）に再懸濁させた。細胞は、４枚の９６ウエル（well）のプレートに接種し、５％ＣＯ₂を供給しながらインキュベーター内で３７℃で培養した。２週間後、コロニーが形成されたときに、上清が調製され、並びに抗体の反応活性が、酵素結合免疫吸着体測定法（ＥＬＩＳＡ）およびフローサイトメトリーを用いて測定された。１０⁵より多くの細胞を含むウエルは、陽性群と評価された。反応性の高い抗体を含むウエルから細胞を採取し、限界希釈法によりウエル当り０．５細胞にサブクローン化して、反応性の高い抗体を有する安定なハイブリドーマクローンを得た。このハイブリドーマクローンは培地に抗体を分泌し、その上清は次の工程のために貯蔵された。例２例１において調製されたハイブリドーマクローンの中から、胸腺皮質細胞上の特定の細胞表面抗原を認識する抗体を分泌するクローンを発見するために、アビジンにビオチンを結合させることによるアビジン−ビオチン複合体（ＡＢＣ）染色法に従って、例１において調製されたハイブリドーマクローンの上清を用いて、厚さが４μｍの新鮮な組織とパラフィン包埋された組織の免疫ペルオキシダーゼ染色がスライドグラス上で行われた。モノクローナル細胞の上清が１次抗体として用いられた。パラフィン包埋された組織は、パラフィン除去後の非特異的バックグラウンド染色を回避するために、正常マウス血清で処理され、且つ１時間そのまま放置された。第１抗体を添加した後に１夜放置し、ＰＢＳで３回洗浄した。２次抗体として用いるビオチン化されたヤギ抗マウスイムノグロブリンが添加された。この後室温で１時間放置し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄した。次いで、ストレプトアビジンと西洋ワサビペルオキシダーゼとの結合体が添加された。バーリンガーム（Burlingame）製のＡＥＣキットが染色に用いられた。Ｈ₂Ｏ₂−アミノエチルカルバゾール溶液を添加して２０分間処理し、ＰＢＳで３回洗浄した。８０％グリセロールゼラチンをカバーガラスで封入した後、光学顕微鏡下で観察を行った。ヒト胸腺皮質細胞に対して特異的な抗体を産生するハイブリドーマクローン系列が選択された。産生される抗体が胸腺皮質細胞のみを認識するクローンの一つを、Ｈ−ＪＬ１と命名した。抗ＪＬ１抗体により認識される抗原をＪＬ１と命名し、モノクローナル抗体を抗ＪＬ１抗体と命名した。図１は、抗ＪＬ−１抗体を産生するハイブリドーマクローンの上清で胸腺を染色することによる、免疫組織化学的分析の結果を示す写真である。図１に示すように、胸腺皮質のみが陽性であり、ほとんどの胸腺皮質細胞が陽性として染色された。胸腺皮質細胞の表面が強く染色されたので、抗ＪＬ１抗体により認識される抗原は細胞表面抗原である。胸腺髄質細胞は、抗ＪＬ−１抗体により染色されなかった。このことから、ＪＬ１が胸腺皮質細胞に特有の抗原であることが明らかである。例３抗ＪＬ−１抗体分泌ハイブリドーマクローンにより分泌される抗体を高濃度で得るために、腹水が調製された。Ｂａｌｂ／ｃマウスの腹腔内に０．５ｍｌのプリスタンを投与した３週間後に、１０％ウシ血清を含有するＤＭＥＭで培養された１０⁷のＨ−ＪＬ−１のハイブリドーマクローンが投与された。２週間から３週間後に腹水が採集された。そのときの抗体の濃度は５ｍｇ／ｍｌから１０ｍｇ／ｍｌである。腹水中にはアルブミンのようなタンパク質のコンタミネーション（汚染物質）が数多く存在するので、ヒト胸腺細胞に反応するイムノグロブリンのみを精製した。抗ＨＪＬ−１モノクローナルハイブリドーマ細胞をＢａｌｂ／ｃマウスに腹腔内投与し、該マウスから得られた多量の抗体を含有する腹水から抗体を精製するために、Ｑ−セファロースクロマトグラフィーおよびヒドロキシアパタイト（ファーマシア（Pharmacia）社製Bio-gel HTP Gel）クロマトグラフィーが行われた。水腫腹水１０ｍｌ当り３．１４ｇの硫酸アンモニウムが、氷上で徐々に加えられた（５０％の（NH₄）₂SO₄により沈殿した）。混合液を１５，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、イオン交換水中に再懸濁し、且つ、１リットルの緩衝溶液（２０ｍＭリン酸塩、ｐＨ７．４）中で透析した。この溶液を、前もって緩衝溶液（２０ｍＭリン酸塩、ｐＨ７．４）により平衡化されたＱ−セファロースカラムに通して吸着させ、次いで、緩衝溶液を再度カラムに通して、カラム内の未吸着のタンパク質を除いた。その後、カラム内に吸着されているタンパク質を、緩衝溶液Ｉ（２０ｍＭリン酸塩、ｐＨ７．４）および緩衝溶液ＩＩ（２０ｍＭリン酸塩および０．５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）を用いた、０Ｍから０．８ＭのＮａＣｌの線形濃度勾配により溶出した。それぞれの画分はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより電気泳動され、抗ＪＬ−１抗体を含有する画分が採集された。次いで、画分は透析され、前もって緩衝溶液（２０ｍＭリン酸塩、ｐＨ６．８）により平衡化されたヒドロキシアパタイトカラムに通された。遊離のタンパク質を除くためにカラムに通された画分（２０ｍＭリン酸塩、ｐＨ６．８）は、緩衝溶液ＩＩＩ（２０ｍＭリン酸塩、ｐＨ６．８）および緩衝溶液ＩＶ（３００ｍＭリン酸塩、ｐＨ６．８）を用いた、０Ｍから０．３Ｍのリン酸塩の線形濃度勾配により溶出された。それぞれの画分はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより電気泳動され、抗ＪＬ−１抗体を９５％より多く含有する画分が採集された。採集された抗ＪＬ −１抗体は、適当な緩衝溶液中で透析され、保存された。５ｍｇから１０ｍｇの抗ＪＬ−１抗体が、実験を反復することにより１ｍｇの腹水から調製された。中間生成物および最終生成物の１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの電気泳動の結果を図２に示した。第１のレーンは腹水であり、第２のレーンはＱ−セファロースクロマトグラフィーに掛ける前の５０％硫安による沈殿である。並びに、第３及び第４のレーンは、Ｑ−セファロースカラムに吸着されたタンパク質からの溶出画分である。第５のレーンは、ヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィーを行う前の、Ｑ−セファロースクロマトグラフィーの分画のうち、多くの抗ＪＬ−１抗体を含有する画分から回収したものである。また、第６、第７、第８、第９、第１０及び第１１のレーンは、ヒドロキシアパタイトカラムに吸着されたタンパク質の溶出画分である。例４この例は、ＪＬ−１抗原が胸腺以外の正常組織において発現されているかどうかを確認するために、例３で精製された抗ＪＬ−１抗体を１次抗体として用いて、例２の組織化学的分析に従って行われた。下記の表Ｉは、それぞれの組織におけるＪＬ−１抗原の分布を表すものである。末梢リンパ系組織、小脳、膵臓組織、卵巣及び精巣、皮膚、副腎並びに腎臓を含む、胸腺細胞以外の他の全ての組織は、染色に関して陽性ではなかった。この発見により、ＪＬ−１が胸腺皮質細胞に特有の抗原であることが確認される。例５例２及び例４は、ＪＬ−１抗原が胸腺皮質細胞上にのみ発現されたことを示す。この例においては、正常細胞及び悪性造血細胞上のＪＬ−１抗原が、フローサイトメトリー分析により検討された。１×１０⁶個の細胞をファルコンチューブに加え、１，５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、１００μｌ当り１×１０⁶個の細胞の細胞ペレットをＰＢＳ中に再懸濁した。１００μｌの懸濁液を試験管に分配し、１μｇの精製抗ＪＬ−１抗体を含有する１００μｌの抗ＪＬ−１抗体溶液を加えて撹拌した。この溶液を４℃で３０分間反応させ、１，５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、ペレットをＰＢＳで２回洗浄して未反応抗体を除いた。そのペレットを５０μｌの希釈２次抗体（ザイムド（Zymed）社製ＦＩＴＣ結合ヤギ抗マウスＩｇ）を含有する溶液に懸濁し、暗室内において４℃で３０分間反応させた。１５０μｌのＰＢＳを添加し、遠心分離し、細胞をＰＢＳで２回洗浄した。最終的に、遠心分離後に２００μｌのＰＢＳを細胞ペレットに添加した。陽性細胞の割合及び染色の強度をフローサイトメトリー（ベクトム・ディッキンソン（ Bectom-Dickinson）社製造販売のＦＡＣＳスキャン）により分析した。ＦＩＴＣ（蛍光イソチオシアネート）またはＰＥ（フィコエリトリン）と直接結合した抗体が、抗ＪＬ−１抗体として用いられた。この場合は、蛍光のための２次抗体を用いなくとも良い。結果を表ＩＩに示す。下記の表ＩＩに、正常細胞、正常脾臓細胞、骨髄細胞、ＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）、並びに１０μｇ／ｍｌのＰＨＡ（フィトヘマグルチニン）を含有する培地、３μｇ／ｍｌのＰＷＭ（パイクウィード分裂促進剤（Pikeweed mitogen））を含有する培地および０．５μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体を含有する培地においてそれぞれ培養された活性化ＰＢＭＣの表面におけるＪＬ−１抗原の発現を示す。それらはすべて、ＪＬ−１抗体について陰性であった。陽性応答は胸腺細胞上にのみ現れ、且つ出生前および出生後の細胞の８０−９０％がＪＬ−１抗原を発現した。すなわち、ＪＬ−１抗原は、先に例４において示したように胸腺細胞に固有の抗原であることが明らかとなった。例６胸腺の発生の際にＪＬ−１抗原が何時発現するかを確認するために、抗ＪＬ− １抗体を用いてＪＬ−１陽性細胞を精製し、抗ＣＤ４抗体および抗ＣＤ８抗体を用いて２色ＦＡＣＳ分析が行われた。分析方法は上記の記載に従って行い、ＦＩＴＣ結合抗ＣＤ４抗体が抗ＣＤ４抗体に用いられ、ＰＥ結合抗ＣＤ８抗体が抗ＣＤ８抗体に用いられた。図３は、流水による選別処理（pann ing procedure）により精製されたＪＬ−１陽性胸腺細胞上のＣＤ４およびＣＤ８の発現を示す２色ＦＡＣＳ分析の結果である。ＪＬ−１陽性細胞の９９％超がＣＤ４およびＣＤ８の両者について陽性であることが明らかとなった。すなわち、ＪＬ−１陽性細胞は、中間胸腺細胞であった。フローサイトメーターによる、抗ＪＬ−１抗体を用いたマーカー分析は、白血病細胞の細胞表面におけるＪＬ−１抗原の発現を示している。Ｂリンパ球、単核球および骨髄球を起源とする腫瘍細胞は、ＪＬ−１抗原について陰性であった。中間胸腺細胞を起源とするＴリンパ球はＪＬ−１抗原について陽性であり、それ以外のＴリンパ球腫瘍細胞は陰性であった。しかしながら、表ＩＩＩにみられるように、様々なタイプの白血病患者の５０−６０％の白血病細胞は、ＪＬ−１抗原について陽性であった（表３）。それ故、ＪＬ−１抗原および抗ＪＬ−１抗体は、様々なタイプの白血病およびＴリンパ芽球性リンパ腫に対する強力な診断上及び治療上の手段となるであろう。例７この例は、例４における胸腺の特異的な免疫組織化学的染色と、例５における胸腺細胞を起源とする腫瘍細胞および例６における造血系の特異的な蛍光染色とが、抗ＪＬ−１抗体の抗原認識領域（Ｖ_H＋Ｖ_L）による特異的結合の結果であって、胸腺皮質細胞を起源とする腫瘍細胞表面上のＦｃレセプターによる結合の結果ではないことを示すために行われた。この例の上記目的を達成するために、抗体のＦｃ領域をプロテアーゼで除去し、Ｆ（ａｂ´）₂断片及びＦａｂ断片を精製して、胸腺の免疫組織化学的染色及び胸腺細胞のフローサイトメトリーを行った。一般的に、Ｂａｌｂ／ｃマウスの抗体がＩｇＧ１タイプであるとき、それがパパイン処理された場合には、約５０ＫＤａのＦａｂ断片およびＦｃ断片が生成し、それがペプシン処理された場合には、約１０２ＫＤａのＦ（ａｂ´）₂断片が生成し、且つＦｃ断片は小断片に消化された。抗ＪＬ−１抗体のＦ（ａｂ´）₂を調製するために、１０ｍｇの抗ＪＬ−１抗体をイオン交換水に溶解し、且つ、１リットルの緩衝溶液（０．１Ｍクエン酸塩、ｐＨ３．５）中で透析した。その溶液に、シグマ（Sigma）社より製造販売されるペプシンを０．１ｍｇから０．２ｍｇ加え、３７℃で反応させ、消化の程度を観察した。十分な反応が起こると同時に、該溶液に１／１０容の緩衝溶液を加えて中和し、ペプシンによるタンパク質の消化を完結させた。その溶液を緩衝溶液（２０ｍＭリン酸塩、ｐＨ８）中で透析し、予め緩衝溶液（２０ｍＭリン酸塩、ｐＨ８．０）で平衡化されたＱ−セファロースカラムに通し、次いで、緩衝溶液（２０ｍＭリン酸塩、ｐＨ８．０）をそのカラムに通して遊離のタンパク質を除き、その後、緩衝溶液Ｉ（２０ｍＭリン酸塩、ｐＨ８．０）および緩衝溶液ＩＩ（２０ｍＭリン酸塩および０．５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０）を用いた、０Ｍから０．５ＭのＮａＣｌの濃度勾配により溶出した。それぞれの画分はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより電気泳動され、Ｆ（ａｂ´）₂断片を含有する画分が採集された。採集されたＦ（ａｂ´）₂断片を適当な緩衝溶液中で透析し、保存した。図４は、様々な反応時間で、ｐＨ３．５およびｐＨ３．８の緩衝溶液（０．１Ｍクエン酸塩）中において３７℃でペプシンにより消化された、抗ＪＬ−１抗体の電気泳動の結果である。第１から第５のレーンは、ｐＨ３．５で０時間、０．５時間、１時間、２時間および４時間反応させた試料であり、第６から第１０のレーンは、ｐＨ３．８で０時間、０．５時間、１時間、２時間および４時間反応させた試料であり、第１１レーンは、既知の分子量の標準タンパク質である。第１および第６のレーンにおいて、上方側にある厚いバンドは抗ＪＬ−１抗体であり、第２から第５のレーンおよび第７から第１０のレーンにおいて、抗ＪＬ−１抗体のバンドの下方側にある厚いバンドは１０２ＫＤａの分子量を有するＦ（ａｂ´）₂断片であった。抗ＪＬ−１抗体のＦａｂを調製するために、１０ｍｇの抗ＪＬ−１抗体を５ｍｌの緩衝溶液（２０ｍＭリン酸塩、ｐＨ７から８）に溶解し、１リットルの緩衝溶液（２０ｍＭリン酸塩、ｐＨ７から８）中で透析した。該溶液に、システィンおよびＥＤＴＡを、システィンが１５ｍＭでＤＴＡが１ｍＭの溶液となるように添加し、ベーリンガー・マンハイム社から製造販売されている０．２ｍｇのパパインを添加し、３７℃で反応させ、消化の程度を観察した。十分な反応が起こると同時に、溶液に１／１０容の１Ｍヨードアセトアミド溶液を加えて中和し、パパインによるタンパク質の消化を完結させる。Ｆａｂ断片は、Ｆ（ａｂ´）₂を調製するための処理に従って精製された。こうして採集された断片を適当な緩衝溶液中で透析し、保存した。図５は、様々な反応時間で、緩衝溶液（２０ｍＭリン酸塩、ｐＨ７．０）中において３７℃でパパインにより消化された抗ＪＬ−１抗体の電気泳動の結果である。第１から第５のレーンは、０時間、０．５時間、１時間、２時間および６時間反応させた標品である。第６のレーンは標準タンパク質であり、その分子量は最上方からそれぞれ１１６、８５、５３、３９、２７および１４Ｋｄａである。第１のレーンの上方側にある厚いバンドは抗ＪＬ−１抗体であり、５３ＫＤａの標準タンパク質と３９ＫＤａの標準タンパク質との間にある厚いバンドは、５０ＫＤａの分子量を有するＦａｂ断片であった。この様にして精製されたＦ（ａｂ´）₂断片およびＦａｂ断片は、例４の記載に従って胸腺の免疫組織化学的染色に用いられ、陽性反応を示した。胸腺細胞を起源とする腫瘍細胞及び胸腺皮質細胞のＪＬ−１抗原は、例５及び例６の手順にしたがってフローサイトメーターにより観察され、例５及び例６のように陽性反応を示した。このことは、細胞表面にＪＬ−１を発現している細胞の抗ＪＬ−１抗体による認識が、抗ＪＬ−１抗体の抗原認識領域による特異的認識によるものであり、胸腺皮質細胞を起源とする腫瘍細胞表面上のＦｃレセプターによる、Ｆｃ領域を媒介とした抗ＪＬ−１抗体の非特異的結合によるものではないことを意味する。抗原認識領域を有する抗ＪＬ−１抗体断片は、抗ＪＬ−１抗体と同様に、ＪＬ−１抗原の認識に有益である。例８白血病及びリンパ腫の治療を目的として、ＪＬ−１タンパク質に対する抗体を使用する可能性を研究するために、次のような、試験管レベルでの試験が行われた。補体が不活性化していない、ＡＢ型のヒト血液・プール血清を３０％含有するＲＰＭＩ培地中の抗ＪＬ−１抗体を、ｍｌ当り５×１０⁵個のＴリンパ芽球性白血病細胞に加え、１２時間培養し、トリパンブルー染色を用いて腫瘍細胞の生存を観察した。この所見から、ＪＬ−１タンパク質に対する抗体を白血病細胞に投与すると、腫瘍細胞を殺傷し得ることが強く示唆される。この抗ＪＬ−１抗体による腫瘍細胞の殺傷は、補体系及び抗体のＦｃ部分の少なくとも一方に依存する細胞溶解によって媒介される。この過程は、補体の媒介による細胞溶解の結果であろうと考察される。例９ＪＬ−１タンパク質の生化学的特徴を観察するために、免疫沈降試験及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ試験を行った。ＰＢＳ（リン酸緩衝溶液）洗浄された１×１０⁷のヒト胸腺細胞またはモルト（Molt）−４腫瘍細胞を、１００ｍｌのＰＢＳに懸濁した。５μｇのラクトペルオキシダーゼおよび２５０μＣｉのＮａ¹²⁵Ｉを加え、Ｈ₂Ｏ₂を加えて３分間反応させ、ＰＢＳ洗浄した。細胞表面を¹²⁵Ｉでラベルされた細胞を、１ｍｌ当り１×１０⁷細胞となるように細胞溶解緩衝溶液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４，１５０ｍＭのＮａＣｌ，０．５％（w/v ）ノニデット（Nonidet）Ｐ−４０および１ｍＭのＰＭＳＦ）中に懸濁し、４℃ で３０分間振盪した。細胞溶解物を３０００ｒｐｍで７分間遠心分離し、その上清を採取し、ペレットは廃棄した。細胞溶解物の上清をバイオラッド社製のプロテインＡ−セファロースＣＬ−４Ｂビーズ２０μｌと２時間反応させ、次いで、ウサギ抗マウスＩｇが結合したプロテインＡ−セファロースビーズと反応させて、非特異的な物質を前もって除去した。残留細胞溶解物を、２０μｌの抗Ｊｌ− １抗体が結合したウサギ抗マウスＩｇ結合プロテインＡ−セファロースビーズと１２時間以上反応させた。沈殿を、抗原溶出のために１０分間、電気泳動用緩衝溶液（０．１２５ＭのＴｒｉｓＨＣｌ，ｐＨ６．８，４％ＳＤＳ，２０％グリセロールおよび１％のβ−メルカプトエタノール）中で煮沸し、求められているタンパク質のバンドを見つけるためにＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動した。８％アクリルアミドゲルが電気泳動に用いられ、ゲルを乾燥した後に、オートラジオグラフィーのために７０℃で１日間、アマーシャム社製のハイパーフィルムＭＰ（Hy per film-MP）に暴露させた。図６は、胸腺細胞を放射性同位体でラベルした後に免疫沈降されたＪＬ−１タンパク質の、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析結果を示す。第１のレーンは、胸腺細胞の溶解物の免疫沈降により調製されたＪＬ−１タンパク質の、非還元条件の下での電気泳動の結果を示し、第２のレーンは、還元条件の下での電気泳動の結果を示す。１２０，０００ダルトンの分子量のバンドが、還元条件および非還元条件の両方に現れた。このことは、ＪＬ−１タンパク質が単一のポリペプチド鎖を有することを意味する。また、還元条件の下でのバンドはゆっくりと移動するように思われ、このことはタンパク質中にジスルフィド結合が存在することを示唆する。エンドグリコシダーゼＦでＪＬ−１タンパク質を処理した後の電気泳動分析では、タンパク質がより速やかに移動するという結果が得られ、これによってＪＬ− １は糖タンパク質であることが示唆される。従って、ＪＬ−１タンパク質は、分子量１２０，０００ダルトンの単一のポリペプチドの特徴を有する糖タンパク質である。ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂおよびＣＤ１ｃは、Ｔ細胞の発生の際に、胸腺皮質細胞上にのみ発現されるタンパク質として知られている。しかしながら、ＣＤ１ａは、分子量４９，０００のポリペプチド及びβ２ｍと称する分子量１２，０００ダルトンのポリペプチドからなるヘテロダイマー（異種２量体）である。ＣＤ１ｂは、分子量４５，０００ダルトンのポリペプチドおよびβ２ｍからなるタンパク質であり、ＣＤ１ｃは、分子量４３，０００ダルトンのポリペプチドおよびβ２ｍからなるタンパク質である。しかしながら、これらのタンパク質は、本発明のタンパク質とは異なるものである。更に、ＣＤ１ａは、皮膚の樹枝状細胞、ランゲルハンス細胞および脳神経星状膠細胞の細胞表面上に現れ、ＣＤ１ｂは、皮膚の樹枝状細胞、脳神経星状膠細胞およびＢリンパ球の細胞表面上にあり、並びにＣＤ１ｃは、皮膚の樹枝状細胞およびＢリンパ球上にある。ＪＬ−１分子の精製は、セファロースビーズに、精製された抗ＪＬ−１抗体１００ μｇを結合させて得られたアフィニティカラムを用いてなされた。およそ２０μ ｇの抗原が、ＰＡＧＥ試料緩衝液でビーズを煮沸することにより採集された。このタンパク質はトリプシン消化され、ＨＰＬＣを用いて代表的な画分が選別された。配列決定をエドマン分解法で行ったところ、配列は次の通りであった。Ｖ（バリン）−Ｌ（ロイシン）−Ｐ（プロリン）−Ｓ（セリン）−Ｖ（バリン）−Ｆ（フェニルアラニン）−Ｃ（システィン）−Ａ（アラニン）−Ｉ（イソロイシン）−Ｔ（トレオニン）。以上より、ＪＬ−１タンパク質および抗ＪＬ−１抗体は、白血病細胞及びＴリンパ芽球性リンパ腫細胞の診断及び治療に極めて有益である。胸腺細胞に特異的なタンパク質であるＪＬ−１は、胸腺細胞を除く正常組織または活性化された末梢血には見られないので、本発明のＪＬ−１タンパク質は、組織検査または末梢血検査によりＪＬ−１タンパク質が発現しているか否かを決定することにより、Ｔ細胞リンパ芽球性リンパ腫および白血病を診断するために有益である。パラフィン包埋組織が腫瘍診断に用いられる。しかしながら、そのようなパラフィン包埋組織に対して反応性を有する未成熟Ｔ細胞抗体はこれまで発見されなかった。ＪＬ−１はパラフィン包埋組織においても安定であるので、腫瘍の診断に有益である。本発明の抗体またはリガンドは、ＪＬ−１抗原を発現するＴ細胞リンパ芽球性リンパ腫および白血病の治療に有益である。本発明の抗原は、正常組織では発現されないため、遺伝子治療のための標的物質として用いることができる。生物学的に活性なポリペプチドについての典型的な実施態様に関する上記の記載は、本発明の例証となるものである。しかしながら、当業者にとって自明な変形が存在することからも、本発明は上記記載の特定の態様に限定されるものではない。本発明の範囲は、次に示す請求の範囲において定義される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｎ 15/02 8310−2ＪＧ０１Ｎ 33/574 ＡＣ１２Ｐ 21/08 9281−4ＢＣ１２Ｎ 5/00 ＢＧ０１Ｎ 33/574 9162−4Ｂ 15/00 Ｃ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＦＩ，ＨＵ，ＪＰ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＫ (72)発明者バエ、ヤング・ミー大韓民国、ソウル 139―050、ナウオン ― ク、ウォルケイ ― ドン、ドン ― シン５―1004、アパートメントナンバー436

Claims

【特許請求の範囲】１．「ＪＬ−１」と称する、ヒト胸腺皮質細胞上に発現する細胞表面タンパク質。２．前記のタンパク質が単鎖ポリペプチドである、請求項１記載の細胞表面タンパク質。３．前記のタンパク質が１２０，０００ダルトンの分子量を有する、請求項１記載の細胞表面タンパク質。４．前記のタンパク質が糖タンパク質である、請求項１記載の細胞表面タンパク質。５．前記のタンパク質がヒト胸腺の胸腺皮質細胞上に発現する、請求項１記載の細胞表面タンパク質。６．前記のタンパク質が白血病患者の５０％の白血病細胞上に発現する、請求項１記載の細胞表面タンパク質。７．前記のタンパク質が部分的配列として、Ｖ（バリン）−Ｌ（ロイシン）− Ｐ（プロリン）−Ｓ（セリン）−Ｖ（バリン）−Ｆ（フェニルアラニン）−Ｃ（システィン）−Ａ（アラニン）−Ｉ（イソロイシン）−Ｔ（トレオニン）を有する、請求項１記載の細胞表面タンパク質。８．前記のタンパク質がヒト胸腺皮質細胞を起源とするＴリンパ芽球性リンパ腫細胞上に発現する、請求項１記載の細胞表面タンパク質。９．ヒト胸腺皮質細胞上、並びにヒト造血系を起源とするＴリンパ芽球性リンパ腫細胞上及び白血病細胞上に発現する、「ＪＬ−１」と称するタンパク質。１０．前記のタンパク質が前記の細胞上にのみ発現する、請求項９記載のタンパク質。１１．前記のタンパク質が単一のポリペプチドである、請求項９記載のタンパク質。１２．前記のタンパク質が１２０，０００ダルトンの分子量を有する、請求項９記載のタンパク質。１３．前記のタンパク質が糖タンパク質である、請求項９記載のタンパク質。１４．前記のタンパク質が配列として、Ｖ（バリン）−Ｌ（ロイシン）−Ｐ（プロリン）−Ｓ（セリン）−Ｖ（バリン）−Ｆ（フェニルアラニン）−Ｃ（システィン）−Ａ（アラニン）−Ｉ（イソロイシン）−Ｔ（トレオニン）を有する、請求項９記載のタンパク質。１５．請求項１記載のタンパク質に対する抗体。１６．前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１５記載の抗体。１７．前記のモノクローナル抗体が、ヒトまたは動物のモノクローナル抗体である、請求項１６記載の抗体。１８．前記抗体がポリクローナル抗体である、請求項１５記載の抗体。１９．前記のポリクローナル抗体が、ヒトまたは動物のポリクローナル抗体である、請求項１８記載の抗体。２０．請求項１５の抗体を製造する方法。２１．請求項１５の抗体を産生する細胞。２２．請求項２１の細胞を製造する方法。２３．抗体の抗原認識部位を含む、請求項１５の抗体の断片。２４．請求項２３の断片を製造する方法。２５．請求項２３の断片を産生する細胞。２６．請求項２５の細胞を製造する方法。２７．請求項１５の抗体の重鎖（Ｖ_H）の可変領域および軽鎖（Ｖ_L）の可変領域を具備する抗原認識物質。２８．前記の重鎖（Ｖ_H）の可変領域および前記の軽鎖（Ｖ_L）の可変領域が、ポリペプチドを用いて結合されている、請求項２７記載の抗原認識物質。２９．前記の抗原認識物質が有毒タンパク質を含んでいる、請求項２７記載の抗原認識物質。３０．前記の抗原認識物質と有毒タンパク質とが結合して融合タンパク質となっている、請求項２９記載の抗原認識物質。３１．前記の融合タンパク質が安定な構造および抗原特異性を有する請求項３０記載の抗原認識物質。３２．請求項２７の抗原認識物質を製造する方法。３３．請求項２７の抗原認識物質を産生する細胞。３４．請求項３３の細胞を製造する方法。３５．請求項１のタンパク質を認識する物質。３６．前記の物質が抗体、抗体断片、抗体断片の単一のポリペプチドおよびリガンドからなる群より選択される、請求項３５記載の物質。３７．前記の抗体および前記の抗体断片がモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体からなる群より選択される、請求項３６記載の物質。３８．前記の物質が動物またはヒトの身体起源である、請求項３５記載の物質。３９．前記の物質がマーカーを含有する、請求項３５記載の物質。４０．前記のマーカーが放射性同位体、蛍光性物質および染色性物質からなる群より選択される、請求項３９記載の物質。４１．請求項３５の物質を製造する方法。４２．請求項３５の物質を産生する細胞。４３．請求項４２の細胞を製造する方法。４４．請求項３５の物質を用いた、胸腺皮質細胞の発生段階の測定方法。４５．請求項３５の物質を用いた、白血病細胞を診断する方法。４６．請求項３５の物質を用いた、リンパ腫細胞を診断する方法。４７．請求項３５の物質を用いた、Ｔリンパ芽球性白血病を治療する方法。４８．前記の物質が抗体、抗体断片、抗体断片の単一のポリペプチドおよびリガンドからなる群より選択される、請求項４７記載の方法。４９．前記の抗体および前記の抗体断片がモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体からなる群より選択される、請求項４８記載の方法。５０．前記の物質が動物またはヒトの身体起源である、請求項４９記載の方法。５１．前記の物質が細胞に対して有毒な物質を含んでいる、請求項４９記載の方法。５２．前記の有毒物質が、有毒化合物、有毒タンパク質、放射性同位体および抗腫瘍剤からなる群より選択される、請求項４９記載の方法。５３．請求項３５の物質を用いた、Ｔリンパ芽球性リンパ腫を治療する方法。５４．前記の物質が抗体、抗体断片、抗体断片の単一のポリペプチドおよびリガンドからなる群より選択される、請求項５３記載の方法。５５．前記の抗体および前記の抗体断片がモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体からなる群より選択される、請求項５４記載の方法。５６．前記の物質が動物またはヒトの身体起源である、請求項５５記載の方法。５７．前記の物質が細胞に対して有毒な物質を含んでいる、請求項５４記載の方法。５８．前記の有毒物質が、有毒化合物、有毒タンパク質、放射性同位体および抗腫瘍剤からなる群より選択される、請求項５７記載の方法。５９．白血病およびＴリンパ芽球性リンパ腫の治療方法であって、標的物質が請求項９記載のタンパク質であり、且つ標的認識物質が請求項３５記載のタンパク質を認識する物質である方法。６０．（ａ）ヒト胸腺細胞を投与して抗体を産生させ、抗体を精製する工程と、（ｂ）前記の（ａ）工程で産生された抗体を用いた胸腺の免疫化学的染色により、胸腺皮質細胞に反応する抗体を採集する工程と、（ｃ）前記の（ｂ）工程で採集された抗体を用いたヒト正常組織の免疫化学的染色により、胸腺にのみ反応する抗体を採集する工程と、（ｄ）前記の（ｃ）工程で採集された抗体を用いて、白血病細胞およびＴリンパ芽球性リンパ腫にのみ発現するタンパク質を採集する工程とを具備する方法により同定されるタンパク質。６１．前記のタンパク質が単一のポリペプチドである、請求項６０記載のタンパク質。６２．前記のタンパク質が約１２０，０００ダルトンの分子量を有する、請求項６０記載のタンパク質。６３．前記タンパク質が糖タンパク質である、請求項６０記載のタンパク質。６４．前記のタンパク質が部分的配列として、Ｖ（バリン）−Ｌ（ロイシン） −Ｐ（プロリン）−Ｓ（セリン）−Ｖ（バリン）−Ｆ（フェニルアラニン）−Ｃ（システィン）−Ａ（アラニン）−Ｉ（イソロイシン）−Ｔ（トレオニン）を有する、請求項６０記載のタンパク質。６５．前記のタンパク質が中間胸腺細胞（common thymocyt es）であるヒト胸腺の胸腺皮質細胞に発現する、請求項６０記載のタンパク質。