ES2229218T3 - Proteina celular de superficie expresada en timocitos corticales humanos y su uso. - Google Patents

Abstract

SE PRESENTA UNA NUEVA PROTEINA QUE ES UNA GLICOPROTEINA CON UN PESO MOLECULAR DE 120000 Y QUE SE EXPRESA SOBRE CELULAS DEL LINFOMA LINFOBLASTICO T Y DE LEUCEMIA, QUE ES UTIL DE LA DIAGNOSIS DE LINFOMA LINFOBLASTICO T Y DE LA LEUCEMIA.

Description

Proteína celular de superficie expresada en timocitos corticales humanos y su uso.

La presente invención se refiere a una proteína celular de superficie expresada en timocitos corticales humanos y en células tumorales originadas a partir del sistema hematopoyético y a su utilización. Más particularmente, la presente invención se refiere a una glicoproteína nueva con un polipéptido de cadena única (denominada "JL1" de ahora en adelante en la presente memoria) que tiene un peso molecular de aproximadamente 120.000 dalton y la secuencia parcial: V (Valina) - L (Leucina) - P (Prolina) - S (Serina) - V (Valina) - F (Fenilalanina) - C (Cisteína) - A (Alanina) - I (Isoleucina) - T (Treonina) que se expresa exclusivamente en timocitos corticales y en células malignas de leucemia linfoblástica T, linfoma linfoblástico T originado a partir de timocitos corticales y en aproximadamente el 50% de todos los tipos de leucemia, que se identifican mediante análisis inmunohistoquímico y de citometría de flujo, y a su aplicación en diagnóstico y clínica en leucemia y en linfoma linfoblástico T.

El cuerpo humano muestra las respuestas específicas a sustancias extrañas a las que se expone después del nacimiento, y los linfocitos T y B y las células presentadoras de antígeno están implicadas en las respuestas inmunes para proteger el cuerpo humano. Los linfocitos son los componentes principales de las células de los órganos linfáticos y tienen un papel importante en la respuesta inmune específica durante la circulación en la sangre y la linfa. El papel principal de los linfocitos B es producir anticuerpos frente a sustancias extrañas. Los linfocitos T se clasifican en dos tipos, uno de los cuales tiene la función de apoyar la respuesta inmune específica y el otro tiene la función de matar las células infectadas por los patógenos. Y el papel de las células presentadoras de antígenos es engullir de manera no específica antígenos, y procesarlos degradándolos en péptidos pequeños y proporcionar su información a los linfocitos T.

El desarrollo de las células T dentro del timo comprende series complejas de etapas de proliferación, diferenciación, y selección. Las células T se originan a partir de células madre hematopoyéticas producidas en el hígado embrionario y en la médula ósea postnatal. Se trasladan al timo, se diferencian y maduran, y después de esto, se mueven a través de las venas sanguíneas y se convierten en células T maduras. Después de una reordenación del gen de la línea germinal del receptor de las células T en el timo, los timocitos expresa complejos del receptor de las células T en su superficie celular. El proceso de reordenación génica requiere el sistema enzimático que incluye RAG-1, RAG-2. Como resultado, se puede producir una gran diversidad de receptores de células T en el transcurso del proceso complejo. Sin embargo, todos los receptores producidos de las células T no pueden llevar a cabo sus funciones apropiadas en la periferia. Las células que no pueden reconocer los antígenos proporcionados por el complejo principal de histocompatibilidad (MHC) clase I y clase II, y las células que muestran una respuesta fuerte frente a los antígenos propios se eliminan. Estos procesos se denominan selección positiva y negativa, respectivamente. Los receptores de las células T pueden conseguir su función apropiada cuando reconocen antígenos extraños unidos a su molécula MHC propia en la superficie celular. Este proceso educacional tiene lugar en el timo.

Las células T no sólo expresan receptores de células T sino también diferentes proteínas en la superficie celular. Estas proteínas también son importantes en la función de las células T. La mayoría de estas proteínas de superficie de las células T se expresan en un amplio rango de subtipos de células T. Sin embargo, algunas de ellas se expresan sólo en una etapa específica y estas proteínas pueden utilizarse como marcadoras de la superficie celular de las células T para la determinación de la etapa de maduración de las células T. De manera general, el sistema de clasificación por Renherz et al., que utiliza moléculas de la superficie celular de las células T como marcadores, se ha utilizado para determinar las etapas de diferenciación de los timocitos. De acuerdo con esta clasificación, los timocitos se clasifican en (a) timocito temprano, CD4^{-}/CD8^{-} doble negativo, (b) timocito común, CD4^{+}/CD8^{+} doble positivo, y (c) timocito maduro, CD4^{+} o CD8^{+} único positivo. Los timocitos tempranos expresan las proteínas CD7, CD38 y CD71. Son las células que llegan al timo desde la médula ósea y que se dividen activamente. La reordenación del gen del receptor de las células T -TCR\beta- se produce en esta etapa. Los timocitos comunes ocupan la mayor parte del timo y expresan CD1, CD2, CD3, CD4, CD5, CD8 y semejantes en las superficies celulares, y los genes TCR\alpha están reordenados. Posteriormente, los timocitos maduros expresan los receptores de las células T en las superficies celulares. Sólo algunos de ellos pueden sobrevivir y pasar a la siguiente etapa, y la mayoría de ellos mueren (Nikolis-Zugic, 1991, Immunol. Today, 12, 65-70). Las moléculas de la superficie celular de las células T y de los timocitos pueden utilizarse para determinar la etapa de diferenciación y la clasificación de los subtipos. Además, pueden utilizarse para el diagnóstico y el tratamiento de tumores originados a partir de las células T. Estas proteínas de la superficie celular tienen un importante papel en la función y el desarrollo de las células T.

Los timocitos deben morir a no ser que el receptor de las células T sea el apropiado. Y la muerte no es un muerte pasiva sino una muerte activa que requiere determinadas proteínas o la síntesis de determinados productos metabólicos (Rothenberg, 1990, Immunol. Today, 11, 116-119). Esta muerte celular puede requerir señales específicas que estimulan desde el exterior. Y las proteínas celulares de superficie pueden estar implicadas en el proceso de la señal. Sin embargo, la identificación de moléculas de la superficie celular no ha sido posible hasta ahora. Si los timocitos comunes expresan las proteínas específicas para transmitir las señales para la selección del receptor de las células T y para la muerte celular programada, estas proteínas serán las proteínas intrínsecas en esa etapa. Aunque se sabe que unos pocos antígenos de los timocitos corticales como CD1a, b y c se expresan en la corteza del timo, también se expresan en diferentes tipos de células como células dendríticas, astrocitos del cerebro y linfocitos B.

Un objetivo de la presente invención es proporcionar una proteína celular de superficie expresada en timocitos corticales humanos y en células tumorales originadas a partir del sistema hematopoyético que es una glicoproteína con un polipéptido de cadena única con un peso molecular de aproximadamente 120.000 dalton, cuya secuencia parcial es: V (Valina) - L (Leucina) - P (Prolina) - S (Serina) - V (Valina) - F (Fenilalanina) - C (Cisteína) - A (Alanina) - I (Isoleucina) - T (Treonina).

Un segundo objetivo de la presente invención es proporcionar un anticuerpo monoclonal que reconoce esta proteína o un fragmento de ésta que comprende su sitio de reconocimiento del antígeno.

Un tercer objetivo de la presente invención es proporcionar un anticuerpo monoclonal que reconoce esta proteína o un fragmento de ésta que comprende su sitio de reconocimiento del antígeno para determinar la etapa de desarrollo de los timocitos corticales y para diagnosticar los tumores originados a partir del sistema hematopoyético.

Un cuarto objetivo de la presente invención es proporcionar un anticuerpo monoclonal que reconoce esta proteína o un fragmento de ésta que comprende su sitio de reconocimiento del antígeno que puede eliminar las células tumorales originadas a partir del sistema hematopoyético.

La presente invención proporciona una proteína celular de superficie expresada en timocitos corticales humanos, "JL-1". La proteína celular de superficie anterior es una glicoproteína de cadena única con un peso molecular de aproximadamente 120.000 dalton.

La proteína de la presente invención se expresa en timocitos corticales humanos, y también se expresa en células de leucemia linfoblástica T y linfoma originadas a partir de los timocitos corticales humanos, y en células de aproximadamente el 50% de los diferentes tipos de leucemia.

También, la presente invención proporciona un anticuerpo monoclonal que reconoce la proteína, JL-1. Preferiblemente, se origina a partir del cuerpo de seres humanos o de animales. La presente invención también comprende partes del anticuerpo que incluyen su región de reconocimiento del antígeno (V_{H} y V_{L}), y tiene por lo tanto la capacidad de reconocer el antígeno de manera específica. También puede incluir un fragmento del anticuerpo, como F(ab')2, Fab y Fv. Preferiblemente, el fragmento del anticuerpo (Fv) comprende un fragmento del antígeno que es un polipéptido de cadena única, denominado Fv de cadena única, que se prepara mediante la inserción de un péptido de unión entre dos polipéptidos, V_{H} y V_{L}, para incrementar su estabilidad frente al calor. El anticuerpo o el fragmento de éste mencionado anteriormente puede comprender material marcado que se selecciona del grupo que consiste en radioisótopo, material fluorescente y material teñido.

La presente invención también proporciona un método para producir el anticuerpo o el fragmento de éste como se ha mencionado y proporciona una célula que produce el anticuerpo o el fragmento de éste y un método para producir la célula.

Es más, la presente invención proporciona un método in vitro para el diagnóstico de leucemia T y de linfoma linfoblástico T utilizando el anticuerpo o el fragmento de éste como se ha mencionado.

Además, la presente invención proporciona una composición farmacéutica para el tratamiento de la leucemia y del linfoma linfoblástico T utilizando el anticuerpo o el fragmento de éste como se ha mencionado. Preferiblemente, el material que reconoce el antígeno incluye una proteína tóxica que se selecciona del grupo que consiste en radioisótopos, compuestos químicos tóxicos, proteínas tóxicas y agentes antitumorales.

La presente invención proporciona una composición farmacéutica para el tratamiento de la leucemia y del linfoma linfoblástico T originados a partir del sistema hematopoyético mediante terapia génica utilizando la proteína JL-1 como material diana, y un anticuerpo o fragmento de éste que reconoce JL-1 como material diana a perseguir (material guía).

Además, la presente invención proporciona un método para identificar la proteína JL-1 que comprende las etapas de (a) producir un anticuerpo mediante el cultivo de una célula como se ha mencionado arriba y purificarlo posteriormente; (b) recoger el anticuerpo que reacciona exclusivamente con los timocitos corticales mediante una tinción inmunohistoquímica in vitro del timo con el mencionado anticuerpo purificado en la etapa (a); (c) recoger el anticuerpo que reacciona sólo con el timo mediante una tinción inmunohistoquímica in vitro de tejidos humanos normales con el mencionado anticuerpo recogido en la etapa (b); y (d) identificar la proteína que se expresa en la célula de leucemia y en el linfoma linfoblástico T mediante una tinción inmunohistoquímica con el mencionado anticuerpo recogido en la etapa (c).

La Fig. 1 es una fotografía de la tinción inmunohistoquímica del timo mediante el sobrenadante de un clon de hibridoma que produce el anticuerpo anti JL-1;

La Fig. 2 es una fotografía del análisis por SDS-PAGE 10% del producto resultante y del material intermedio en cada etapa de acuerdo con la etapa de purificación del anticuerpo anti JL-1;

La Fig. 3 es una fotografía de la expresión de las moléculas CD4 y CD8 en la superficie celular de timocitos positivos para JL-1 utilizando FACS de dos colores;

La Fig. 4 es una fotografía del análisis por SDS-PAGE 15% del anticuerpo anti JL-1 digerido con pepsina a pH 3,5 y a pH 3,8 durante distintos tiempos;

La Fig. 5 es una fotografía del análisis por SDS-PAGE 15% del anticuerpo anti JL-1 digerido con papaína; y

La Fig. 6 es una fotografía del análisis por SDS-PAGE de la proteína JL-1 inmunoprecipitada con el lecho conjugado con el anticuerpo anti JL-1 después del marcaje con radioisótopos de los timocitos.

Los ejemplos siguientes específicos de polipéptidos activos desde un punto de vista biológico son ilustrativos de la presente invención, pero no pueden considerarse de ninguna manera limitantes de la presente invención.

Ejemplo 1

Con el fin de descubrir una proteína celular de superficie específica en timocitos comunes, se administraron timocitos humanos a ratones Balb/c para producir anticuerpos frente a los timocitos humanos mediante los ejemplos siguientes.

Se administraron 10^{7} timocitos humanos por vía intraperitoneal a ratones Balb/c en intervalos de dos semanas durante seis semanas. Se extrajo el bazo de los ratones Balb/c 3 días después de la última administración para preparar la suspensión de células del bazo. Se produjeron anticuerpos monoclonales mediante la fusión de células del bazo de ratones Balb/c inmunizados con timocitos humanos con células de mieloma de ratón SP2/0-Ag14 resistentes a 9-azaguanina. El método de fusión celular siguió el método de Köhler y Milstein (Köhler y Milstein, 1975, Nature, 256, 495-497). Se fusionaron 10^{8} células del bazo con 10^{7} células de mieloma utilizando 50% polietilenglicol 4000. Las células se lavaron y se resuspendieron en medio DEAE que contenía 20% albúmina de suero bovino, 100 \muM hipoxantina, 0,44 \muM aminopterina y 16 \muM timidina (medio HAT). Las células se inocularon en cuatro placas de 96 pocillos y se cultivaron a 37ºC en un incubador con 5% CO_{2}. Cuando se formaron las colonias después de dos semanas, se preparó el sobrenadante y se observó la reactividad del anticuerpo utilizando un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA) y citometría de flujo.

El pocillo que contenía más de 10^{5} células por pocillo se consideró como grupo positivo. Se cogieron las células del pocillo que contenía anticuerpo muy reactivo y se subclonaron 0,5 células por pocillo mediante el ensayo de dilución limitante para producir un clon de hibridoma estable con una reactividad alta del anticuerpo. Este clon de hibridoma secretó anticuerpo en el medio y el sobrenadante se almacenó para las siguientes etapas.

Ejemplo 2

Con el fin de descubrir un clon que secreta el anticuerpo que reconoce el antígeno específico de la superficie celular en los timocitos corticales, entre los clones de hibridoma producidos en el Ejemplo 1, se llevó a cabo una tinción con inmunoperoxidasa en un portaobjetos con un capa de 4 \mum de espesor de tejido fresco y de tejido embebido en parafina utilizando el sobrenadante del clon de hibridoma producido en el Ejemplo 1 de acuerdo con el método de tinción del complejo avidina-biotina (ABC) mediante la unión de avidina con biotina. Como primer anticuerpo se utilizó el sobrenadante de las células monoclonales. El tejido embebido en parafina se trató con suero normal de ratón y se mantuvo durante 1 hora para evitar la tinción de fondo no específica después de la eliminación de la parafina. Después de añadir un anticuerpo primario, se mantuvo durante toda la noche y se lavó tres veces con PBS. Se añadió inmunoglobulina antiratón de cabra biotinilada como un anticuerpo secundario. Se mantuvo a temperatura ambiente durante 1 hora, y se lavó tres veces con disolución salina tamponada con fosfato (PBS). Después se añadieron estreptavidina y conjugado de peroxidasa de rábano. Para la tinción se utilizó el kit ABC fabricado por Burlingame. Se añadió una disolución H_{2}O_{2}-aminoetil carbazol, se dejó reaccionar durante 20 minutos y después se lavó tres veces con PBS. Se observó en microscopio óptico después de cubrir con un cubreobjetos y con 80% gelatina de glicerol.

Se seleccionaron las líneas de clones de hibridoma que producían anticuerpo específico frente a timocitos corticales humanos. Uno de los clones cuyo anticuerpo reconocía sólo timocitos corticales se denominó H-JL1. El antígeno reconocido por el anticuerpo anti-JL1 se denominó JL1 y el anticuerpo monoclonal como un anticuerpo anti-JL1. La Fig. 1 es una fotografía del análisis de tinción inmunohistoquímica del timo con el sobrenadante del clon de hibridoma que producía el anticuerpo anti JL-1. Como se muestra en la Fig.1, sólo el timo cortical es positivo y la mayoría de los timocitos corticales se tiñen positivamente. La superficie celular de los timocitos corticales se tiñó intensamente lo que indica que el antígeno reconocido por el anticuerpo anti-JL1 es un antígeno de la superficie celular. Los timocitos medulares no se tiñeron con el anticuerpo anti-JL1. Esto prueba que JL1 es un antígeno específico de los timocitos corticales.

Ejemplo 3

Con el fin de obtener una concentración alta del anticuerpo secretado por el clon de hibridoma que secreta anticuerpo anti Jl-1, se prepararon ascites. Tres semanas después de que se administraran 0,5 ml de pristano por vía intraperitoneal en ratones Balb/c, se administraron 10^{7} clones de hibridoma H-JL-1 cultivados en DMEM que contenía 10% de suero bovino. Después de 2 a 3 semanas, se recogieron los ascites. Entonces la concentración de anticuerpo es 5 a 10 mg/ml. Sólo se purificaron las inmunoglobulinas que respondían a los timocitos humanos porque existen numerosas proteínas contaminantes como la albúmina en los ascites. Para purificar anticuerpo de los ascites que contienen una gran cantidad de anticuerpos obtenidos de ratones Balb/c a los que se administraron por vía intraperitoneal células de hibridoma monoclonal HJL-1, se llevaron a cabo cromatografía Q-sefarosa y cromatografía con hidroxiapatito (Bio-gel HTP Gel fabricado por Pharmacia).

Se añadieron lentamente 3,14 g de sulfato amónico por 10 ml de ascites en hielo (precipitado con 50% de (NH_{4})_{2}
SO_{4}). La mezcla se centrifugó a 15.000 rpm durante 30 minutos, se resuspendió en agua desionizada y se dializó en 1 litro de disolución tampón (20 mM fosfato, pH 7,4). La disolución se pasó y se adsorbió en la columna Q-sefarosa equilibrada previamente con disolución tampón (20 mM fosfato, pH 7,4), y después la disolución tampón se pasó de nuevo a través de la columna para eliminar las proteínas libres de la columna. Posteriormente, la proteína adsorbida en la columna se eluyó con un gradiente linear de 0 M a 0,8 M NaCl utilizando la disolución tampón I (20 mM fosfato, pH 7,4) y la disolución tampón II (20 mM fosfato y 0,5 M NaCl, pH 7,4). Cada fracción se analizó por electroforesis en SDS-PAGE y se recogieron las fracciones que contenían anticuerpo anti JL-1.

Después, las fracciones se dializaron y se pasaron a través de una columna de hidroxiapatito equilibrada previamente con disolución tampón (20 mM fosfato, pH 6,8). La fracción (20 mM fosfato, pH 6,8) que se pasó a través de la columna para eliminar las proteínas libres se eluyó con un gradiente linear de 0 a 0,3 M fosfato utilizando la disolución tampón III (20 mM fosfato, pH 6,8) y la disolución tampón IV (300 mM fosfato, pH 6,8). Cada fracción se analizó por electroforesis en SDS-PAGE y se recogieron las fracciones que contenían más del 95% de anticuerpo anti JL-1. El anticuerpo anti JL-1 recogido se dializó en la disolución de tampón apropiada y se almacenó. Se prepararon de 5 a 10 mg de anticuerpo anti JL-1 a partir de 1 mg de ascites mediante experimentos repetidos.

Las electroforesis del producto intermedio y del producto final en 10% SDS-PAGE se muestran en la Fig. 2. El primer carril es ascites, el segundo carril los precipitados mediante 50% sulfato amónico antes de la cromatografía Q-sefarosa y el tercer y cuarto carriles son algunas de las fracciones eluidas de las proteínas adsorbidas en la columna Q-sefarosa, el quinto carril es las fracciones recogidas de las fracciones que contenían muchos anticuerpos anti JL-1 de entre las fracciones de la cromatografía Q-sefarosa antes de la cromatografía con la columna de hidroxiapatito, y el sexto, el séptimo, el octavo, el noveno, el décimo y el undécimo son algunas de las fracciones eluidas de las proteínas adsorbidas por la columna de hidroxiapatito.

Ejemplo 4

El ejemplo presente se llevó a cabo de acuerdo con el ensayo inmunoquímico del Ejemplo 2 para confirmar si el antígeno JL-1 se expresa en tejidos normales excepto el timo utilizando anticuerpo anti JL-1 purificado en el Ejemplo 3 como anticuerpo primario. La Tabla I, más abajo, es la distribución del antígeno JL-1 en cada tejido. A excepción de los timocitos, todos los demás tejidos incluyendo tejido linfoide periférico, cerebelo, tejido pancreático, ovario y testículos, piel, pulmón, tejido adrenal, y riñón no fueron positivos después de la tinción. Este descubrimiento confirma que JL-1 es un antígeno específico del timo cortical.

TABLA I

1

\newpage

Ejemplo 5

El Ejemplo 2 y el Ejemplo 4 muestran que el antígeno JL-1 se expresó sólo en los timocitos corticales. En este ejemplo, se investigó el antígeno JL-1 en células normales y en células hematopoyéticas malignas mediante análisis de citometría de flujo. Se añadieron 1 x 10^{6} células en un tubo Falcon, se centrifugaron a 1.500 rpm durante 5 minutos, y el sedimento celular de 1 x 10^{6} células por 100 \mul se suspendió en PBS. Se distribuyeron 100 \mul de la suspensión en tubos de ensayo y se añadieron 100 \mul de disolución de anticuerpo anti JL-1 que contenía 1 \mug de anticuerpo purificado anti JL-1 y se agitó. La disolución se hizo reaccionar a 4ºC durante 30 minutos, se centrifugó a 1.500 rpm durante 5 minutos, y el sedimento se lavó dos veces con PBS para eliminar el anticuerpo que no había reaccionado. El sedimento se suspendió en 50 \mul de la disolución que contenía el anticuerpo secundario diluido (Ig anti-ratón de cabra conjugada con FITC, fabricada por Zymed) y se hizo reaccionar a 4ºC durante 30 minutos en una habitación oscura. Se añadieron 150 \mul PBS, se centrifugó y las células se lavaron dos veces con PBS. Finalmente, se añadieron 200 \mul PBS a las células sedimentadas después de la centrifugación. La proporción de células positivas y la intensidad de la tinción se analizaron mediante citometría de flujo (FACSscan fabricado y vendido por Becton-Dickinson). Los anticuerpos combinados directamente con FITC (Isotiocianato de Fluoresceína) o con PE (Ficoeritrina) se utilizaron como anticuerpos anti JL-1. En este caso, no es necesario utilizar el anticuerpo secundario para la fluorescencia. El resultado se muestra en la Tabla II.

La Tabla II, más abajo, muestra la expresión del antígeno JL-1 en la superficie celular de células normales, células de bazo normales, células de médula ósea, PBMC (Célula Mononuclear de Sangre Periférica), PBMC activadas cultivadas en el medio que contiene 10 \mug/ml de PHA (Fitohematoglutinina), 3 \mug/ml de PWM (Mitógeno de fitolaca), y 0,5 \mug/ml de anticuerpo anti CD3. Todas ellas fueron negativas para el anticuerpo JL-1. La respuesta positiva sólo apareció en los timocitos y el 80-90% de las células antes y después del nacimiento expresaron el antígeno JL-1. Es decir, se probó que el antígeno JL-1 es un antígeno específico de los timocitos como se ha mostrado previamente en el Ejemplo 4.

TABLA II

2

Ejemplo 6

Con el fin de determinar cuando se expresa el antígeno JL-1 durante la ontogenia del timo, se purificaron células positivas para JL-1 utilizando anticuerpo anti JL-1, y se llevó a cabo un análisis FACS de dos colores utilizando anticuerpo anti-CD4 y anticuerpo anti-CD8. El método del análisis siguió el método descrito más arriba, se utilizó anticuerpo anti-CD4 conjugado con FITC como anticuerpo anti-CD4 y el anticuerpo anti-CD8 conjugado con PE como anticuerpo anti-CD8. La Fig. 3 es el resultado del análisis FACS de dos colores que muestra la expresión de CD4 y de CD8 en timocitos positivos para JL-1 purificados mediante el procedimiento panning. Se probó que más del 99% de las células positivas para JL-1 eran células doblemente positivas para CD4 y CD8. Es decir, las células positivas para JL-1 eran timocitos comunes.

El análisis de marcadores mediante citometría de flujo utilizando el anticuerpo anti JL-1 muestra una expresión en la superficie celular del antígeno JL-1 en las células de leucemia. Los linfocitos B, los monocitos y las células tumorales originados a partir de mielocitos fueron negativos para el antígeno JL-1. Los linfocitos T originados a partir de linfocitos comunes fueron positivos para el antígeno JL-1 y otras células T tumorales fueron negativas. Sin embargo, como se puede ver en la Tabla III, las células de leucemia del 50-60% de pacientes con diferentes tipos de leucemia fueron positivas para el antígeno JL-1 (Tabla 3). Por lo tanto, el antígeno JL-1 y el anticuerpo anti-JL-1 pueden ser unas herramientas de diagnóstico y terapéuticas muy útiles para diferentes tipos de leucemia y de linfoma linfoblástico T.

TABLA III

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Ejemplo 7

El presente ejemplo se llevó a cabo para mostrar que la tinción inmunohostoquímica específica del timo en el Ejemplo 4, y la tinción de fluorescencia específica de las células tumorales originadas a partir de los timocitos en el Ejemplo 5 y el sistema hematopoyético en el Ejemplo 6 son el resultado de la unión específica del anticuerpo anti JL-1 por la región de reconocimiento del antígeno (V_{H} + V_{L}), y no de la unión por el receptor Fc en la superficie de las células tumorales originadas a partir de timocitos corticales. Para lograr el propósito del ejemplo, se eliminó la región Fc del anticuerpo mediante proteasas, se purificó el fragmento F(ab')_{2} y el fragmento Fab, y se llevó a cabo una tinción inmunohistoquímica del timo y citometría de flujo de los timocitos. Generalmente, cuando el anticuerpo de los ratones Balb/c era del tipo IgG1 y se trata con papaína, se produjeron aproximadamente 50 KDa del fragmento Fab y del fragmento Fc, y cuando se trató con pepsina, se produjo aproximadamente 102 KDa de F(ab')_{2} y el fragmento Fc se digirió en fragmentos pequeños.

Para preparar F(ab')_{2} del anticuerpo anti JL-1, se disolvieron 10 mg del anticuerpo anti JL-1 en agua desionizada y se dializó en 1 litro de disolución tampón (0,1 M citrato, pH 3,5). A la disolución se añadieron 0,1 a 0,2 mg de pepsina fabricada y vendida por Sigma, se dejó reaccionar a 37ºC y se observó el grado de digestión, después de un tiempo de reacción suficiente, la disolución se neutralizó mediante la adición de 1/10 volúmenes de disolución tampón para parar la digestión de la proteína por la pepsina. La disolución se dializó en disolución tampón (20 mM fosfato, pH 8), se aplicó en una columna Q-sefarosa equilibrada previamente con disolución tampón (20 mM fosfato, pH 8,0), y después la disolución tampón (20 mM fosfato, pH 8,0) se pasó a través de la columna para eliminar las proteínas libres, y después se eluyó con un gradiente de 0 M a 0,5 M de NaCl utilizando la disolución tampón I (20 mM fosfato, pH 8,0) y la disolución tampón II (20 mM fosfato y 0,5 M NaCl, pH 8,0). Cada fracción se analizó por electroforesis en SDS-PAGE para recoger las fracciones que contenían el fragmento F(ab')_{2}. El fragmento F(ab')_{2} recogido se dializó en una disolución tampón apropiada y se almacenó.

La Fig. 4 es el resultado de la electroforesis del anticuerpo anti JL-1 digerido con pepsina a 37ºC en disoluciones tampón (0,1 M citrato) a pH 3,5 y pH 3,8 durante diferentes periodos de tiempo. Del primer al quinto carril el pH fue 3,5 durante 0, 0,5, 1, 2, y 4 horas, del sexto al décimo carril el pH fue 3,8 durante 0, 0,5, 1, 2, y 4 horas, y el undécimo carril es proteínas estándar con pesos moleculares conocidos. Las bandas anchas superiores del primer y el sexto carril son el anticuerpo anti JL-1, y la banda ancha por debajo de la banda del anticuerpo anti JL-1 del segundo al quinto carril y del séptimo al décimo carril es el fragmento F(ab')_{2} que tiene un peso molecular de 102 KDa.

Para preparar Fab del anticuerpo anti JL-1, se disolvieron 10 mg de anticuerpo anti JL-1 en 5 ml de disolución tampón (20 mM fosfato, pH 7 a 8) y se dializó en 1 litro de disolución tampón (20 mM fosfato, pH 7 a 8). A la disolución, se añadieron cisteína y EDTA para conseguir unas disoluciones resultantes 15 mM y 1 mM, se añadieron 0,2 mg de papaína fabricada y vendida por Boehringer Mannheim, se dejo reaccionar a 37ºC y se observó el grado de la digestión. Después de un tiempo de reacción suficiente, la disolución se neutralizó mediante la adición de 1/10 volúmenes de disolución de yodoacetamida 1 M para parar la digestión de la proteína por la papaína. Se purificó el fragmento Fab de acuerdo con el procedimiento para preparar F(ab')_{2}. El fragmento recogido de esta manera se dializó en una disolución tampón apropiada y se almacenó.

La Fig. 5 es el resultado de la electroforesis del anticuerpo anti JL-1 digerido con papaína a 37ºC en disolución tampón (20 mM fosfato, pH 7,0) durante diferentes tiempos. Del primer al quinto carril son durante 0, 0,5, 1, 2, y 6 horas, el sexto carril es proteínas estándar con pesos moleculares de 116, 85, 53, 39, 27 y 14 KDa, respectivamente, desde la parte superior. La banda ancha superior del primer carril era anticuerpo anti JL-1, y la banda ancha entre 53 KDa y 39 KDa de las proteínas estándar era el fragmento Fab que tiene un peso molecular de 50 KDa.

El fragmento F(ab')_{2} y el fragmento Fab purificados de esta manera se tiñeron inmunohistoquímicamente en el timo de acuerdo con el Ejemplo 4 y se observó una respuesta positiva. El antígeno JL-1 de las células tumorales originadas a partir de timocitos y de timocitos de la corteza se observó mediante citometría de flujo de acuerdo con los procedimientos del Ejemplo 5 y del Ejemplo 6 y mostró una respuesta positiva como en el Ejemplo 5 y el Ejemplo 6. Esto significa que el reconocimiento por el anticuerpo anti JL-1 de las células que expresan JL-1 en la superficie celular se debe al reconocimiento específico por la región de reconocimiento del antígeno del anticuerpo anti-JL-1, y no a la unión no específica del anticuerpo anti-JL-1 al receptor Fc en la superficie de las células tumorales originadas a partir de timocitos de la corteza a través de la región Fc. El fragmento del anticuerpo anti-JL-1 que tiene la región de reconocimiento del antígeno es útil para el reconocimiento del antígeno JL-1 como el anticuerpo anti-JL-1.

Ejemplo 8

Con el fin de investigar la posibilidad de utilizar el anticuerpo frente a la proteína JL-1 para el tratamiento de leucemias y de linfomas, se llevó a cabo el ensayo in vitro siguiente. Se añadió anticuerpo anti JL-1 en medio RPMI que contenía suero humano 30% del tipo sanguíneo AB sin inactivación del complemento a 5 x 10^{5} células de leucemia linfoblástica T/ml, se cultivaron durante 12 horas, y se observó la viabilidad de las células tumorales utilizando tinción de azul de Tripán. Este descubrimiento sugiere que las células tumorales pueden eliminarse cuando se administra el anticuerpo frente a la proteína JL-1 a las células de leucemia. La eliminación de las células tumorales por el anticuerpo anti JL-1 está mediada por la lisis celular que es dependiente bien del sistema del complemento o de la parte Fc del anticuerpo. Este procedimiento se considera el resultado de lisis mediada por el complemento.

Ejemplo 9

Con el fin de ensayar las características bioquímicas de la proteína JL-1, se llevaron a cabo inmunoprecipitación y SDS-PAGE. Se suspendieron en 100 ml de PBS 1 x 10^{7} timocitos humanos o células tumorales Molt-4 lavados con PBS (disolución tampón fosfato). Se añadieron 5 \mug de lactoperoxidasa y 250 \muCi de Na^{125}I, se añadió H_{2}O_{2} y se dejo reaccionar durante 3 minutos, y se lavó con PBS. Las células con la superficie celular marcada con ^{125}I se suspendieron en disolución tampón de lisis (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,5% p/v Nonidet P-40 y 1 mM PMSF) a una concentración de 1 x 10^{7}células por 1 ml, y se agitaron a 4ºC durante 30 minutos. El lisado se centrifugó a 3.000 rpm durante 7 minutos, se recogió el sobrenadante y se eliminó el sedimento. El sobrenadante del lisado se hizo reaccionar con 20 \mul de lechos de proteína A-Sefarosa CL-4B fabricados por BioRad durante 2 horas, y después reaccionó con lechos de proteína A-Sefarosa conjugados con Ig anti-ratón de conejo para eliminar los materiales no específicos. El lisado remanente reaccionó con 20 \mul de lechos de A-sefarosa proteína Ig anti-ratón de conejo conjugados con anticuerpo anti JL-1 durante más de 12 horas. El precipitado se hirvió en disolución tampón para electroforesis (0,125 M Tris HCl, pH 6,8, 4% SDS, 20% glicerol y 1% \beta-mercaptoetanol) durante 10 minutos para eluir el antígeno y se analizó por electroforesis en SDS-PAGE para encontrar una banda de proteína deseada. Se utilizó un gel de acrialmida 8% para la electroforesis y, posteriormente, el gel se secó y se expuso a Hyper film-MP fabricado por Amersham a 70ºC durante 1 día para autorradiografía.

La Fig. 6 muestra un análisis de SDS-PAGE de la proteína JL-1 que se inmunoprecipitó después de que se marcaran los timocitos con radioisótopo. El primer carril fue una electroforesis en condiciones no reductoras de la proteína JL-1 preparada por inmunoprecipitación del lisado de los timocitos y el segundo carril fue una electroforesis en condiciones reductoras. Apareció una banda con un peso molecular de 120.000 dalton tanto en condiciones reductoras como no reductoras. Esto significa que la proteína JL-1 comprende una cadena polipeptídica única. Además, la banda en condiciones reductoras migró lentamente lo que sugiere que hay un puente disulfuro en la proteína. Un análisis por electroforesis después del tratamiento de la proteína JL-1 con endoglicosidasa-F resultó en una migración más rápida de la proteína lo que sugiere que JL-1 es una glicoproteína. Por lo tanto, la proteína JL-1 es una glicoproteína que tiene un único polipéptido con un peso molecular de 120.000 dalton. Se sabe que CD1a, CD1b, y CD1c son proteínas que se expresan sólo en timocitos corticales durante el desarrollo de las células T. CD1a es, sin embargo, un heterodímero que consiste en un polipéptido con un peso molecular de 49.000 dalton y en un polipéptido, llamado \beta2m, con un peso molecular de 12.000 dalton. CD1b es una proteína que consiste en polipéptidos con un peso molecular de 45.000 dalton y \beta2m, y CD1c es una proteína que consiste en polipéptidos con un peso molecular de 43.000 dalton y \beta2m. Sin embargo, estas proteínas son diferentes de la proteína de la presente invención. Es más, CD1a aparece en las superficies celulares de las células dendríticas de la dermis, de las células de Langerhans y de los astrositos del cerebro, y CD1b aparece en la superficie celular de las células dendríticas de la dermis, de los astrocitos del cerebro y de los linfocitos B, y CD1c aparece en las células dendríticas de la dermis y en los linfocitos B. La purificación de la molécula JL-1 se realizó utilizando una columna de afinidad que se fabricó mediante la conjugación de 100 \mug de anticuerpo anti-JL-1 purificado con lechos de sefarosa. Se recogieron aproximadamente 20 \mug de antígeno hirviendo los lechos con tampón de muestra de PAGE. Esta proteína se digirió con tripsina y se seleccionó una fracción representativa utilizando HPLC. Se realizó la secuenciación mediante el método de la degradación de Edman, y las secuencias son como sigue. V (Valina) - L (Leucina) - P (Prolina) - S (Serina) - V (Valina) - F (Fenilalanina) - C (Cisteína) - A (Alanina) - I (Isoleucina) - T (Treonina). Por lo tanto, la proteína JL-1 y el anticuerpo anti JL-1 resultan muy útiles para el diagnóstico y el tratamiento de células de leucemia y de células de linfoma linfoblástico T.

La proteína JL-1 de la presente invención es útil para el diagnóstico de linfoma linfoblástico de células T y de leucemia mediante la determinación de si la proteína JL-1 se expresa después del examen del tejido o del examen de la sangre periférica porque la proteína JL-1 específica de timocitos no se encuentra en los tejidos normales o en sangre periférica activada a excepción de los timocitos. El tejido embebido en parafina se utiliza para el diagnóstico de tumores. Sin embargo, hasta ahora no se ha encontrado el anticuerpo anti-células T inmaduras reactivo con el mencionado tejido embebido en parafina. JL-1 es estable en el tejido embebido en parafina por lo que es útil para el diagnóstico de tumores. El anticuerpo o el ligando de la presente invención es útil para el tratamiento de linfoma linfoblástico de células T y de leucemia que expresan el antígeno JL-1. El presente antígeno puede utilizarse como material diana en terapia génica porque no se expresa en los tejidos normales.

La descripción anterior de las realizaciones ejemplares de polipéptidos activos desde un punto de vista biológico es ilustrativa de la presente invención. Sin embargo, debido a la variación que será aparente para aquellos especializados en el tema, la presente invención no pretende limitarse a las realizaciones particulares descritas más arriba. El ámbito de la invención está definido en las reivindicaciones siguientes.

Claims (21)

1. Una proteína celular de superficie, expresada en los timocitos corticales humanos y en las células tumorales originadas a partir del sistema hematopoyético, que es una glicoproteína con un polipéptido de cadena única con un peso molecular de aproximadamente 120.000 dalton, cuya secuencia parcial es: V (Valina) - L (Leucina) - P (Prolina) - S (Serina) - V (Valina) - F (Fenilalanina) - C (Cisteína) - A (Alanina) - I (Isoleucina) - T (Treonina).

2. La proteína celular de superficie de la reivindicación 1, donde la mencionada proteína se expresa en células de leucemia del 50% de los pacientes con leucemia.

3. La proteína celular de superficie de cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, donde la mencionada proteína se expresa en células de linfoma linfoblástico T originadas a partir de timocitos corticales humanos.

4. Un anticuerpo monoclonal que reconoce la proteína de la reivindicación 1 o un fragmento de éste, que comprende su sitio de reconocimiento del antígeno.

5. El fragmento del anticuerpo de la reivindicación 4, que comprende la región variable de la cadena pesada (V_{H}) y la región variable de la cadena ligera (V_{L}) del anticuerpo de la reivindicación 4.

6. El fragmento del anticuerpo de la reivindicación 5, donde la mencionada región variable de la cadena pesada (V_{H}) y la mencionada región variable de la cadena ligera (V_{L}) están unidas a través de un péptido.

7. El fragmento del anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 5 ó 6, donde el mencionado fragmento incluye una proteína tóxica.

8. El fragmento del anticuerpo de la reivindicación 7, donde el mencionado fragmento y la mencionada proteína tóxica se combinan para formar una proteína de fusión.

9. El fragmento del anticuerpo de la reivindicación 8, donde la mencionada proteína de fusión posee la estructura y la especificidad antigénica del fragmento del anticuerpo de la reivindicación 5.

10. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 9, donde el mencionado anticuerpo o fragmento se origina del cuerpo humano o animal.

11. Una célula que produce el anticuerpo de la reivindicación 4 o el fragmento del anticuerpo de la reivindicación 5 ó 6.

12. El anticuerpo o el fragmento de una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6 ó 10, donde el mencionado anticuerpo o fragmento incluye un marcador.

13. El anticuerpo o fragmento de la reivindicación 12, donde el mencionado marcador es un radioisótopo, un material fluorescente o un material teñido.

14. Un método in vitro para determinar la etapa de desarrollo de los timocitos corticales utilizando el material de una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6 ó 10.

15. Un método in vitro para diagnosticar células de leucemia utilizando el material de una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6 ó 10.

16. Un método in vitro para diagnosticar células de linfoma utilizando el material de una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6 ó 10.

17. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o fragmento de una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6 ó 10.

18. La composición de la reivindicación 17, donde el mencionado anticuerpo o fragmento incluye material tóxico para las células.

19. La composición de la reivindicación 18, donde el mencionado material tóxico es un compuesto tóxico, una proteína tóxica, un radioisótopo o un agente antitumoral.

20. La composición farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19, para tratar leucemia y linfoma linfoblástico T.

21. Un método para identificar la proteína de la reivindicación 1, que comprende las etapas de:

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(a)

producir un anticuerpo mediante el cultivo de la línea celular de la reivindicación 11 y purificarlo a partir de ésta;

(b)

recoger el anticuerpo que reacciona con los timocitos corticales mediante tinción inmunoquímica in vitro del timo con el mencionado anticuerpo producido en la etapa (a);

(c)

recoger el anticuerpo que reacciona sólo con el timo mediante tinción inmunoquímica in vitro de tejidos humanos normales con el mencionado anticuerpo recogido en la etapa (b); y

(d)

identificar la proteína que se expresa en células de leucemia y en linfoma linfoblástico T con el mencionado anticuerpo recogido en la etapa (c).