ES2201056T3 - Anticuerpo monoclonal para un producto genetico humano con resistencia al multifarmaco mdr1 y sus utilizaciones. - Google Patents
Anticuerpo monoclonal para un producto genetico humano con resistencia al multifarmaco mdr1 y sus utilizaciones.Info
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Abstract
LOS HIBRIDOMAS (LLAMADO HIBRIDOMA UIC2, N ACCESO ATCC HB11207 Y HIBRIDOMA UIC2/A, N EL ANTICUERPO MONOCLONAL (LLAMADO UIC2 MAB) DIRIGIDO CONTRA UN DOMINIO EXTRACELULAR DE UN ANTIGENO DE GLICOPROTEINA-P DE SUPERFICIE DE CELULA ASOCIADO CON LA RESISTENCIA DE MULTIDROGA EN CELULAS DE PRIMATE ERAN PRODUCIDAS POR FUNDIR UNA CELULA DE MIELOMA HUMANO CON UNA CELULA DE BAZO DERIVADA DE UN RATON BALB/C INMUNIZADO CON LOS FIBROBLASTOS 3T3 SINGENEICOS PREVIAMENTE TRANSFECTADOS CON EL CDNA MDR1 HUMANA AISLADA. LA UIC2 MAB, ASI PRODUCIDA, COMO TAMBIEN LOS FRAGMENTOS Y SUS DERIVADOS RECOMBINANTES, DEBEN SER USADOS PARA DETECTAR Y AISLAR LAS CELULAS DE PRIMATE RESISTENTES DE MULTIDROGA Y LOS PRODUCTOS DEL GEN MDR1 HUMANO, Y PARA INVERTIR LA RESISTENCIA DE MULTIDROGA EN LAS CELULAS DE PRIMATE, INCLUYENDO LAS CELULAS DE LOS TUMORES HUMANOS RESISTENTES DE MULTIDROGA.
Description
Anticuerpo monoclonal para un producto génico
humano con resistencia al multifármaco MDR1 y sus
utilizaciones.
La presente invención se realizó con la ayuda del
gobierno bajo la beca de investigación CA40333 concedida por los
National Institutes of Health. El gobierno posee determinados
derechos en esta invención. Esta es, en parte, una continuación del
documento U.S. nº de serie 854.881, presentado el 20 de marzo de
1992.
La presente invención se refiere a un hibridoma
que produce anticuerpos monoclonales específicos para un antígeno de
superficie celular relacionado con la resistencia a multifármacos
en células humanas y a las utilizaciones de dichos anticuerpos y
sus fragmentos o derivados recombinantes.
Muchos cánceres humanos expresan intrínsecamente
o desarrollan espontáneamente resistencia a varias clases de
fármacos anticancerosos, cada uno con una estructura diferente y
diferente mecanismo de acción. Este fenómeno, que se puede simular
en células de mamífero cultivadas seleccionadas para resistir
determinados alcaloides vegetales o antibióticos antitumorales,
tales como colchicina, vinblastina y doxorrubicina (la denominación
farmacológica del anterior es adriamicina), está relacionado
generalmente con una resistencia al multifármaco ("MDR"). Este
fenotipo con MDR presenta un obstáculo principal a la quimioterapia
del cáncer con éxito en pacientes humanos.
La MDR, en la mayoría de los casos, parece
proceder de la disminución de la acumulación intracelular del
fármaco como resultado del aumento de efluente del fármaco
relacionado con alteraciones en un mecanismo de la membrana
plasmática. Cuando las líneas celulares del mutante que expresan
MDR están aisladas, se observa que expresan un mecanismo de bombeo
dependiente de ATP situado en la membrana plasmática que mantiene
baja la acumulación intracelular de un fármaco anticanceroso. Este
mecanismo consiste en la extrusión activa del fármaco que había
penetrado originalmente a través de la membrana plasmática.
El gen que codifica este sistema de bombeo,
denominado a veces transportador de multifármaco, ha sido clonado
por Roninson et al. a partir de células humanas cultivadas (véase
referencia 12 más adelante) y se denomina generalmente mdr1 ó
mdr1^{1}. Este gen se expresa en varias clases de tejidos
normales^{1}, pero no se han identificado en estos tejidos los
sustratos fisiológicos transportados por el producto del gen
mdr1.
El producto de la proteína del gen mdr1,
conocido generalmente como P-glucoproteína
("P-170", "Pgp"), es una proteína 170 kDa
de membrana transplasmática que constituye la bomba del efluente
dependiente de la energía mencionada anteriormente. La expresión de
Pgp en la superficie celular es suficiente para hacer resistentes
las células a múltiples fármacos citotóxicos, incluyendo muchos
agentes anticancerosos. La MDR mediada por Pgp parece ser una
componente clínica importante de la resistencia tumoral en tumores
de diferentes tipos y la expresión del gen mdr1 se
correlaciona con la resistencia a la quimioterapia en diferentes
tipos de cáncer.
El análisis de la secuencia del gen mdr1
indica que Pgp consta de 1280 aminoácidos distribuidos entre dos
mitades homólogas^{1} (43% de identidad). Cada mitad de la
molécula tiene seis dominios de transmembrana hidrófobos y cada uno
tiene un punto de unión al ATP dentro de los grandes bucles
citoplásmicos. Solamente el 8% de la molécula es extracelular y el
grupo carbohidrato (aproximadamente 30 kDa) está unido a puntos en
esta zona.
Al conocerse el papel central desempeñado por Pgp
en MDR, se han direccionado a Pgp agentes con un potencial para
invertir la MDR. Varias clases de fármacos, incluyendo los
bloqueantes del canal del calcio, p. ej.: verapamilo,
inmunosupresores, tales como ciclosporinas y hormonas esteroideas,
inhibidores de calmodulina y varios otros compuestos, se observó
que aumentan la acumulación intracelular y la acción citotóxica de
los fármacos transportados por Pgp^{2}. Se observó que muchos de
estos agentes inhiben la unión al fármaco o el transporte por
Pgp^{3}. Se observó que algunos de estos propios agentes se unen
a y son vertidos por Pgp^{4}, lo que sugiere que sus efectos de
aumento de la citotoxicidad de los sustratos de Pgp se deben, por
lo menos en parte, a la competencia por los puntos de unión al
fármaco en esta proteína, en lugar de a los efectos de su
función.
Determinados de estos agentes pueden presentar
efectos pleótropos en las células con MDR que pueden limitar su
aplicación como inhibidores específicos de la acción de la bomba
del efluente de Pgp. Además, la mayoría de los fármacos conocidos
que invierten la MDR utilizados en pruebas clínicas presentan
efectos secundarios principales no relacionados con la inhibición
de Pgp, tales como el bloqueo del canal del calcio (verapamilo) o
la inmunosupresión (ciclosporinas y esteroides), que limitan su
dosificación clínicamente obtenible.
La utilización de anticuerpos
anti-Pgp para salvar la MDR de Pgp ofrece la
perspectiva de especificidad, ya que los anticuerpos se dirigirían
solamente a Pgp y la única toxicidad sería la que surgiera
potencialmente de la administración de una proteína. Además, la
unión del anticuerpo consiste probablemente en que presenta un
efecto inhibidor más prolongado que el de la unión transitoria de
un inhibidor competitivo.
Únicamente los anticuerpos que reaccionan con un
epítopo extracelular de Pgp serían capaces de reaccionar con la
proteína de bombeo del efluente en la membrana plasmática de las
células intactas e influyen potencialmente, es decir invierten, la
MDR. Los anticuerpos dirigidos a la porción citoplásmica de Pgp,
tal como C219^{5}, es improbable que sean útiles para la
inversión de la MDR.
Los anticuerpos monoclonales ("mAb"),
denominados MRK-16 y MRK-17, se
produjeron inmunizando ratones con células de leucemia humana
K-562 resistentes a la doxorrubicina; ambos
anticuerpos fueron reconocidos por Pgp^{6}. El transporte de
vincristina y actinomicina modulado por el mAb
MRK-16 en células resistentes y el mAb
MRK-17 inhibió específicamente el desarrollo de
células resistentes. El mAb MRK-16 aumentó la
toxicidad in vivo de vincristina en una línea celular humana
con MDR (cáncer de colon) desarrollada como xenotrasplante en
ratones atímicos^{7}. La potenciación in vitro de la
citotoxicidad del fármaco por mAb MRK-16 fue, sin
embargo, relativamente débil para inhibidores químicos conocidos de
la acción de Pgp y se limitó aparentemente a sólo dos sustratos de
Pgp (vincristina y actinomicina D), que no presentan efecto sobre la
citotoxicidad por doxirubicina^{6}. El tratamiento con mAb
MRK-16 de ratones atímicos previamente inoculados
con células 2780^{AD} de cáncer de ovario humano resistente al
fármaco produjo la remisión de tumores subcutáneos probados^{8}.
Se describió un anticuerpo híbrido recombinante que combina la zona
variable de MRK-16 con la porción Fc de anticuerpos
humanos por ser más eficaz que el mAb MRK-16 en la
citotoxicidad creciente in vitro^{9}.
Se ha descrito que los anticuerpos monoclonales
HYB-241 y HYB-612, que reconocen un
epítopo externo de Pgp, aumentan la acumulación de vincristina y
actinomicina D en células tumorales y aumentan la citotoxicidad de
las combinaciones de estos fármacos con verapamilo^{10}.
Se ha publicado que el mAb de IgG_{2a} de
ratón, denominado mAb 657, reacciona con las células que expresan
el gen mdr1 y con las células humanas con MDR^{11}1.
Aunque este mAb demostró que aumenta la susceptibilidad de las
células con MDR a la citotoxicidad mediada por linfofitos de la
sangre periférica humana, no se conoce que presenten un efecto
inhibidor sobre la función de Pgp de bombeo del efluente del
fármaco.
Un resumen de los procedimientos de la American
Association for Cancer Research, volumen 31, 1990, página 376
(resumen número 2232) expone anticuerpos monoclonales contra P170
natural que reconocen los restos 78 a 90 de aminoácidos y la
molécula natural expresada en las células A2780AD. El anticuerpo se
manifestó capaz de la inversión parcial de la resistencia del
fármaco.
Tal como se detalla más adelante en la
descripción de la invención, se pueden distinguir los efectos del
mAb de la presente invención de los de los mAb
MRK-16, HYB-241 y
HYB-612 en muchos niveles, incluyendo los efectos en
la inhibición del efluente con rodamina 123 de las células con MDR,
la potenciación de los efectos de vinblastina sobre el crecimiento
celular y la formación de la colonia, la potenciación del efecto
citotóxico de doxorrubicina, la especificidad epitópica y la
sensibilidad del detergente.
Queda una necesidad importante de nuevos
anticuerpos monoclonales que reconozcan dominios extracelulares de
Pgp humana en la superficie de las células intactas, que presentan
fuertes efectos inhibidores sobre el efluente de fármacos
anticancerosos mediado por Pgp procedente de células tumorales
humanas, que invierten la resistencia a una gran variedad de
fármacos citotóxicos que son transportados por el sistema de Pgp
humana y que, por lo menos, son tan potentes como los inhibidores
químicos de Pgp utilizados habitualmente pero sin efectos
secundarios indeseables. Se ha producido un hibridoma que produce
dicho mAb específico y se describen a continuación las propiedades
y utilizaciones de este anticuerpo, además de sus fragmentos y
derivados recombinantes.
La invención comprende nuevas líneas celulares
continuas híbridas denominadas "UIC2" (nº de registro de ATCC
HB11027) y la sublínea UIC2/A (nº de registro de ATCC HB11287) y el
nuevo mAb producido por estos hibridomas (denominado "mAb de
UIC2") que se dirige a un epítopo extracelular del Pgp de la
membrana transplasmática humana con MDR, de tal manera que inhibe
fuertemente la función efluente del fármaco Pgp y de este modo
aumenta la citotoxicidad potencial de los fármacos anticancerosos en
las células humanas con MDR.
En un aspecto de la invención, se produce el
hibridoma UIC2.
En otro aspecto de la invención, se produce una
sublínea del hibridoma UIC2, denominada UIC2/A, que se
desarrolla en el medio de cultivo exento de proteínas.
desarrolla en el medio de cultivo exento de proteínas.
En otro aspecto de la invención se produce MAb de
UIC2, teniendo dicho mAb las características mencionadas
anteriormente, en las que el antígeno objetivo es la Pgp humana de
la superficie celular codificada por el gen mdr1 humano.
\newpage
Todavía en otro aspecto de la invención, se dan a
conocer fragmentos de MAb de UIC2, incluyendo cadenas pesadas y
ligeras determinantes de complementariedad y sus zonas variables y
constantes.
Todavía en otro aspecto de la invención, se dan a
conocer derivados recombinantes de mAb de UIC2, incluyendo
anticuerpos recombinantes con la especificidad del mAb de UIC2,
tales como mAb humanizado, mAb bifuncional, zonas V_{H} y V_{L}
aisladas del anticuerpo, cadenas lineales de mAb que contienen zonas
V_{H} y V_{L}, fragmentos de estas moléculas y ADNc que
codifica dichos derivados recombinantes.
Todavía en otro aspecto de al invención, se
utiliza mAb de UIC2 para producir anticuerpos
anti-idiotipo dirigidos contra el punto en MAb de
UIC2 que es complementario del punto epitópico de Pgp al cual se
une mAb de UIC2, además de producir anticuerpos
anti-anti-idiotipo.
En otro aspecto de la invención, se proporcionan
procedimientos para identificar el/los punto(s)
epitópico(s) extracelular(es) de Pgp al(a los)
que se une mAb de UIC2 y se utilizan las secuencias de aminoácidos
de dichos puntos para aumentar los anticuerpos con las propiedades
de unión y las especificidades funcionales de mAb de UIC2.
Todavía en otro aspecto de la invención, se
proporcionan procedimientos para utilizar el mAb de UIC2 o un
fragmento o su derivado recombinante para diagnosticar o aislar
células tumorales de primate resistentes al multifármaco, además de
aislar productos génicos del gen mdr1 humano a partir de
mezclas de biomoléculas.
En otro aspecto de la invención, se proporcionan
reactivos que incorporan mAb de UIC2, fragmentos o derivados
recombinantes de los mismos de la invención en composiciones
farmacéuticas que son útiles en inmunoterapia de pacientes que
padecen tumores resistentes al multifármaco y para anular los
efectos de Pgp efluentes del fármaco.
Estos y otros aspectos se pondrán de manifiesto
por referencia a la descripción de la invención y a las
reivindicaciones adjuntas.
La Figura 1 presenta los resultados de la
inmunoprecipitación de la P-glucoproteína con mAb
de UIC2. La inmunoprecipitación de la
P-glucoproteína de células 3T3-1000
de BALB/c resistentes al multifármaco con mAb de UIC2, mAb
MRK-16 ó UPC10 (referencia de IgG_{2a}) se
realizó tal como se describe en el Ejemplo 7. La banda específica
de 170 a 180 kDa en mAb de UIC2 y mAb MRK-16 está
indicada por una flecha.
La Figura 2 presenta el efecto de mAb de UIC2
sobre el efluente de una Rodamina 123 con sustrato fluorescente de
P-glucoproteína procedente de células
CEM/VLB_{100} (A) y K562/Inf (B) resistentes al multifármaco y el
efecto de la preadsorción de mAb de UIC2 con antisueros
anti-IgG o anti-IgM en el efluente
de Rodamina 123 (C).
La Figura 3 presenta la potenciación de la
citotoxicidad de vinblastina por mAb de UIC2.
La Figura 4 presenta la potenciación de los
efectos citotóxicos de diferentes fármacos por mAb de UIC2.
La Figura 5 presenta el análisis
SDS-PAGE de los mAb impurificados presentes en el
fluido sobrenadante del cultivo, de los cultivos de células de UIC2
y UIC2/A y de las contrapartidas purificadas.
El documento U.S. nº 5.206.352 (solicitud de
patente U.S. nº 622.836), perteneciente con el presente a Roninson
et al., da a conocer la secuencia del gen mdr1
humano aislado que se hibrida específicamente con ARNm humano maduro
transcrito de un gen mdr1 humano^{12}. Tal como se expuso
anteriormente, el polipéptido codificado por este gen mdr1
es la P-glucoproteína, denominada también Pgp ó
P-170. Sólo una pequeña parte (aproximadamente 8%)
de esta proteína, incluyendo los 30 kDa de carbohidrato, se cree
que es extracelular^{1}.
En el documento U.S. nº 5.206.352 (U.S.S.N. nº
622.836) perteneciente con el presente, se producen anticuerpos
policlonales y monoclonales contra Pgp codificados por el gen
mdr1 humano por inmunización de animales con fragmentos de
Pgp sintetizados químicamente, predichos a partir de la secuencia
del gen o con Pgp producida por sistemas de expresión procariótica
o eucariótica. En la presente invención, se utiliza como inmunógeno
una línea de sobreexpresión, transfectada específica de células
humanas resistentes al multifármaco, para producir un hibridoma que
produce un mAb dirigido a un epítopo de Pgp extracelular específico
en células resistentes a multifármacos humanos.
Para los fines de la presente invención, la
resistencia al multifármaco se define como la resistencia cruzada a
los siguientes fármacos citotóxicos: vinblastina, vincristina,
doxorrubicina, colchicina, actinomicina D, etoposido, taxol,
puromicina y gramicidina D.
El mAb de UIC2, que como se indicó anteriormente,
se dirige a un epítopo en un dominio extracelular de la Pgp producto
del gen mdr1 humano, se produce mediante un proceso que
utiliza, como inmunógeno primario para inmunizar ratones, células
que han producido MDR por transfección con el ADNc aislado del
mdr1 humano antes mencionado del documento U.S. nº 5.206.352
(U.S.S.N. 622.386)^{12} en trámite con la presente. Los
inmunógenos para la inmunización de ratones BALB/c son
preferentemente fibroblastos transfectados de ratón
isotrasplantado, es decir, fibroblastos 3T3 transfectados de ratón
BALB/c. Los derivados con MDR de fibroblastos 3T3 de ratón BALB/c se
generan con ADNc de mdr1 humano utilizando un vector de
expresión de mamífero, preferentemente el plásmido pUCFVXMDR1
desarrollado por uno de los presentes inventores^{13}. Ya que el
fenotipo con MDR es inestable en la mayoría de las células muy
resistentes, las células desarrolladas en ausencia de fármaco
presentan una disminución de la resistencia. Por consiguiente, es
preferible mantener las células transfectadas en medio de cultivo
que contenga también una concentración de mantenimiento del fármaco
que se ha de utilizar para la selección, p. ej.: 20 \mug/ml de
vinblastina.
Después de la transfección, se producen de
fibroblastos 3T3 de BALB/c, en los que se ha amplificado el gen
mdr1 transfectado, mediante etapas consecutivas de selección
en concentraciones cada vez mayores de un fármaco al que son
resistentes las células transfectadas. Este procedimiento permite
la selección de fibroblastos 3T3 de BALB/c muy resistentes al
multifármaco que expresan grandes cantidades de Pgp y la inserción
de esta molécula en la membrana plasmática de las células. Se pueden
seleccionar células para la resistencia deseable a la vinblastina
por incubación consecutiva de cultivos de fibroblasto en 250 ng/ml,
500 ng/ml y 1.000 ng/ml de fármaco. Por comodidad, dichas células se
designan BALB/c 3T3-250, BALB/c
3T3-500 y BALB/c 3T3-1000,
respectivamente. BALB/c 3T3-1000 que selecciona las
células que expresa el mayor nivel del producto del gen mdr1
son muy preferidas para la inmunización de ratones huésped
BALB/c.
Se utilizaron células de ratón (p. ej.: células
3T3 de BALB/c) transfectadas con ADNc humano de mdr1 para
inmunizar ratones isotrasplantados (p. ej.: BALB/c). Se inyectan
por vía subcutánea (s.c.) números apropiados de células o por vía
intraperitoneal (i.p.) mediante protocolos de inmunización
reconocidos en la técnica. Típicamente, se inyectan 10^{5} a
10^{8} células transfectadas 5 ó 6 veces en intervalos de dos
semanas y se realiza un refuerzo final, por ejemplo, con 10^{6}
células por vía subcutánea y/o por vía intravenosa. En un periodo
apropiado después de la inyección de refuerzo, típicamente de 3 a 5
días después de ésta, se extrae el bazo de un ratón hiperinmune y
se generan hibridomas por procedimientos estándar^{14},
utilizando células murinas de mieloma,
P3-X63-Ag 8.653 (ATCC, Rockville,
MD).
Se identifica la producción específica de mAb en
fluidos extracelulares de cultivos de hibridoma individuales por
procedimientos convencionales, tal como por inmunofluorescencia
indirecta utilizando células de control que no expresan la Pgp
humana (es decir, fibroblastos 3T3 de BALB/c no transfectados) y
células que expresan Pgp humano (es decir, 3T3-1000
de BALB/c) fijadas en portaobjetos de vidrio e inmunoglobulinas
polivalentes anti-ratón de cabra denominadas FITC
(Sigma Chem. Co., San Luis, MO) como anticuerpo indicador
secundario. El procedimiento particular de identificación no es
crítico siempre que sea capaz de detectar mab de mdr1 de Pgp
anti-humano. Es importante, sin embargo, que las
células no se permeabilicen durante la identificación, de modo que
únicamente se detecte el reactivo de anticuerpos con dominios de
proteína extracelulares.
Se puede crear un hibridoma estable por
procedimientos convencionales, tal como mediante rondas consecutivas
de subclonación mediante, p. ej.: dilución de punto final e
identificación de anticuerpos monoclonales en el medio de cultivo.
El hibridoma se propaga mediante, por ejemplo, cultivo en fluido de
ascitis in vivo en animales isotrasplantados y se aísla el
anticuerpo segregado y se purifica en fluido de ascitis mediante
cromatografía de afinidad con una matriz de
Sefarosa-proteína A específica para el isotipo de
IgG. Son también utilizables otros procedimientos para la
purificación de inmunoglobulina que son bien conocidos en la
técnica, tal como por adsorción de IgG anti-ratón de
cabra purificada por afinidad en condiciones (p. ej.: temperaturas
de baño de hielo) de máxima adsorción de mAb en los anticuerpos
segundos.
Se pueden producir sublíneas de hibridoma UIC2
que se cultivan en medios de cultivo exentos de proteína
disminuyendo gradualmente hasta 0% la concentración del suero de
ternero fetal en el medio de cultivo de células exento de proteínas
completo de otra forma. Después de un periodo apropiado de
incubación en el medio de cultivo exento de proteínas, se clonan
las células por dilución en serie en el medio exento de proteínas,
por ejemplo, en pocillos de placas de microvaloración, a una célula
por pocillo. Se determina la producción de anticuerpos en los
clones, por ejemplo mediante marcado por inmunofluorescencia
indirecta de células 3T3-1000 de Balb/C ó K562/Inf.
Los clones que dan la indicación más fuerte de producción de mAb se
transfieren a matraces de cultivo y se expanden en un medio de
cultivo de células exento de proteínas, tal como un medio HPFW de
Gibco complementado con tampón HEPES. Dichos clones seleccionados
se pueden también cultivar en frascos rotativos, que producen
grandes valores anticuerpo de mAb purificado, útiles para
producción a escala industrial del mAb de UIC2.
El mAb producido por el hibridoma mencionado
anteriormente, además sus fragmentos y derivados recombinantes que
se describen a continuación, pueden estar caracterizados como
isótopos de inmunoglobulina mediante pruebas dobles de
inmunodifusión de Ouchterlony y de inmunotransfrencia reconocidas en
la técnica utilizando antisueros específicos de subclase IgG de
ratón.
El mAb, sus fragmentos y derivados recombinantes
se pueden caracterizar por la reactividad con diferentes líneas
celulares que expresan Pgp mediante cualquier técnica conveniente,
por ejemplo, mediante inmunomarcado por inmunofluorescencia
indirecta seguido de cualquier técnica adecuada para detectar
interacciones anticuerpo- célula, tal como por análisis citométrico
de flujo o microscopía. También se pueden utilizar otras técnicas
inmunocitoquímicas.
Se puede determinar la unión a Pgp de mAb, sus
fragmentos y derivados recombinantes en células con MDR por
procedimientos de inmunoprecipitación. Por ejemplo, se pueden
incubar células con MDR (p. ej.: 5-10 \times
10^{6} células) (p. ej.: 10 a 18 horas a 37ºC) con un aminoácido
esencial radioactivo, tal como ^{35}S-metionina y
similares, con el fin de marcar radioactivamente la proteína Pgp. Se
incuban a continuación las células marcadas con una preparación de
anticuerpo purificado hasta que se saturan los puntos de unión en
las células. Se lisan las células a continuación con un detergente
que solubiliza la Pgp fuera de las membranas plasmáticas pero no se
disocia mAb de Pgp. Para inhibir la proteolisis mediante proteasas
celulares endógenas, se puede añadir al detergente un inhibidor de
proteasa tal como fluoruro de fenilmetilsulfonilo ("PMSF") 0,1
mM. Aunque se puede emplear una variedad de detergentes para
solubilizar Pgp fuera de la membrama plasmática de la célula, para
mAb de UIC2 se prefiere en gran medida ácido desoxicólico (0,2 a
1%) ya que no disocia el complejo mAb-Pgp. Los
complejos mAb-Pgp se pueden aislar del lisado
mediante cualquier procedimiento de adsorción conveniente, tal como
inmunoadsorción de este mAb (tipo IgG) con proteína A inmovilizada;
esta última proteína es un absorbente específico para
inmunoproteínas IgG. Los complejos mAb-Pgp se pueden
separar a continuación mediante SDS-PAGE y las zonas
que contienen mAb, por ejemplo, mediante transferencia de Western
utilizando conjugados de anticuerpo de IgG
anti-ratón de cabra marcado para una molécula
indicadora tal como fosfatasa alcalina y similares (Fisher
Scientific, Pittsburg, PA). El aislamiento preparativo de los
productos del gen mdr1 humano se realizó por técnicas
similares en las que el absorbente para los productos del gen es un
anticuerpo inmovilizado de la invención.
Se puede evaluar el efecto de un fragmento de mAb
anti-Pgp o su derivado recombinante sobre la función
de Pgp estudiando el efluente de fármacos marcados por
fluorescencia o radioactividad procedentes de células con MDR en
presencia o ausencia de mAb. En un análisis^{15} preferido, se
incuban suspensiones de células de mamífero (p. ej.: 10^{5} a
10^{7} células) que expresan a Pgp a temperaturas del baño de
hielo con la preparación del anticuerpo de la prueba en medio de
tampón exento de suero. Se cargan a continuación células tratadas
con un colorante marcador, p. ej.: Rodamina-123
("Rh123") (0,1 a 10,0 \mug/ml) o doxorrubicina (1 a 10
\muM) por incubación con el colorante a temperaturas de baño de
hielo. Se incuban a continuación a 37ºC células cargadas con
colorante, preferentemente con la preparación del anticuerpo
mencionado anteriormente en el medio para mantener la saturación
con anticuerpo de Pgp de la superficie celular y se mide el
efluente de colorante evaluando la retención del colorante por las
células por un procedimiento citométrico de fluorescencia de
flujo.
Los efectos de las preparaciones de anticuerpos
de la invención sobre la citotoxicidad del fármaco se puede evaluar
incubando suspensiones con MDR y las células de referencia con la
preparación de anticuerpo, determinando a continuación la inhibición
del crecimiento celular por la formación de colonias, la eficacia
en las placas y/o el ensayo de inhibición del crecimiento de
MTT^{13,16} en ausencia y presencia de un fármaco anticanceroso,
tal como uno de los alcaloides vinca. Los fibroblastos
3T3-1000 de BALB/c son particularmente adecuados
para ensayos de eficacia en placas y la línea celular K562/inferior
con MDR para el ensayo de inhibición del crecimiento. Los efectos
de las preparaciones de anticuerpos sobre la citotoxicidad del
fármaco se pueden determinar incubando suspensiones celulares con
una preparación purificada de anticuerpos y colocando las células en
pocillos de placas de microvaloración para colonias o ensayos de
inhibición de crecimiento en presencia de la preparación de
anticuerpos.
La capacidad de las preparaciones de anticuerpos
de la invención para provocar citotoxicidad mediada por el
complemento se puede probar mediante ensayos reconocidos en la
técnica utilizando, p. ej.: complemento de sueros de
conejo^{17}.
Según esta invención, se pueden producir
inmunógenos con Pgp de mdr1 humano contra mAb por
procedimientos alternativos a los procedimientos de mieloma humano
de las células de bazo por inmunización in vivo de ratón
expuestos anteriormente en relación con la producción del hibridoma
de UIC2. En una forma de realización, se puede utilizar la
inmunización intraesplénica en células que expresan el gen
mdr1 humano para producir esplenocitos inmunizados para la
producción de hibridomas. Véase, p. ej.: la referencia 18, que se
incorpora en la presente memoria como referencia.
En otra forma de realización, se puede realizar
la inmunización in vitro en la que las células que expresan
el gen mdr1 humano se presentan a un cultivo celular de bazo
y después de un periodo adecuado, típicamente una semana, se realiza
la fusión celular con células de mieloma de ratón o humano para
producir hibridomas. Véase, p. ej.: la referencia 19.
Además del mAb producido por el hibridoma de UIC2
de la invención (véase el Ejemplo 3 más adelante), se puede utilizar
la información genética procedente de estas células para producir
anticuerpos recombinantes derivados útiles, tanto para el
diagnóstico como para aplicaciones terapéuticas. Dichos derivados
recombinantes se pueden producir fácilmente por procedimientos
reconocidos en la técnica de la ingeniería genética, tal como los
indicados en la referencia 20.
En un procedimiento preferido, las secuencias de
polinucleótido que codifican las zonas variables de las cadenas
pesada y ligera de mAb de UIC2 se preparan mediante reacción en
cadena de polimerasa (PCR) utilizando cebadores derivados de zonas
constantes de las correspondientes cadenas^{21}. Se utiliza, ADN
genómico extraído de la línea celular de hibridoma de mAb de UIC2,
como plantilla para PCR. Como alternativa, se puede utilizar ADNc,
sintetizado a partir de ARNm de hibridoma de UIC2 por procedimientos
estándar^{22}, como plantilla de PCR. Las zonas V_{H} y V_{L}
de mAb de UIC2, amplificadas por PCR, se secuencian bien
directamente o después de la clonación en un vector adecuado. La
información de la secuencia derivada es muy valiosa, ya que las
zonas V_{H} y V_{L} llevan todos los determinantes de
especificidad del anticuerpo, que se pueden transferir a
continuación a otros anticuerpos o a otras moléculas recombinantes
por técnicas estándar de ingeniería genética. El ADNc que codifica
las cadenas pesada y ligera de mAb de UIC2 se pueden aislar también
preparando una biblioteca de ADNc y cribando dicha biblioteca con
sondas disponibles habitualmente que corresponden a zonas constantes
de las cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina.
Para obtener anticuerpos recombinantes con la
especificidad de mAb de UIC2, se insertaron las secuencias de ADNc
de V_{H} y V_{L} aisladas mencionadas anteriormente en un
vector de expresión, en el que se reunieron en el marco con las
secuencias de ADNc para las zonas constantes correspondientes de
las cadenas de inmunoglobulina humana o de ratón. Por ejemplo, se
pueden utilizar los vectores VHPCR1 de M13 y VKPCR1^{21} de M13
del fago M13 para generar cadenas de anticuerpo pesadas y ligeras
híbridas de hombre-ratón. Dichos anticuerpos
híbridos se prefieren sobre los anticuerpos derivados completamente
de ratón para la administración in vivo a un paciente con
fines de diagnóstico o terapéuticos. La selección de las zonas
constantes que se han de cortar y empalmar con las zonas variables
de mAb de UIC2 está dirigida por la utilización deseada del
anticuerpo recombinante. Por lo tanto, el isotipo gamma 1 humano
daría lugar a un anticuerpo eficaz en la destrucción mediada por el
complemento y mediada por las células de las células
objetivo^{17,23}. En cambio, se prefiere la zona constante del
isotipo gamma 4 si el anticuerpo está destinado para utilización de
diagnóstico (tal como diagnóstico por imagen in vivo) o para
potenciar el efecto citotóxico de los fármacos transportados por
P-glucoproteína, sin provocar otros tipos de
citotoxicidad. También es posible generar anticuerpos
"humanizados" con la especificidad de UIC2
"reformando"^{20} el anticuerpo, es decir injertando los
bucles de unión al antígeno de los dominios V del mAb de UIC2 en
las zonas V de un anticuerpo humano
clonado^{17,23-26}.
Se pueden utilizar derivados recombinantes de mAb
de UIC2 dentro de un vector de expresión adecuado para producir
grandes cantidades de proteínas correspondientes en sistemas de
expresión de células procarióticas (p. ej.: bacterianas) o
eucarióticas (levaduras, mamíferos o insectos) bien conocidos en la
materia^{22}.
Los fragmentos del mAb de UIC2, que mantienen la
especificidad antigénica del anticuerpo completo, pueden derivarse
por técnicas enzimáticas, químicas o de ingeniería genética. Por
ejemplo, se puede fragmentar mAb de UIC2 purificado mediante
digestión parcial con enzimas proteolíticas, tales como papaína o
tripsina^{27}. La digestión con papaína produce dos fragmentos de
Fab y un fragmento de Fc. El mAb de UIC2 purificado se puede
también escindir con pepsina que libera F(ab)_{2}
(dos dominios de unión del antígeno unidos). Los fragmentos Fab ó
F(ab)_{2} resultantes de mAb de UIC2 se pueden
purificar aparte de cualquier anticuerpo intacto restante y de los
fragmentos Fc por cromatografía sobre proteína A o por cualquier
otro procedimiento inmunoquímico (ibid.).
Los fragmentos del mAb de UIC2 pueden también
derivarse por técnicas de ingeniería genética utilizando las
secuencias de ADNc aisladas que codifican las zonas variables (V)
de mAb de UIC2. por lo tanto, se puede utilizar un fragmento
correspondiente a la zona de la cadena pesada variable (V_{H})
sola como anticuerpo con dominio único^{28}, para la unión
específica de alta afinidad a la P-glucoproteína. Se
pueden también utilizar subfragmentos del dominio V_{H} para la
unión específica al antígeno^{20}: Se pueden utilizar también los
dominios V_{H} y de cadena ligera variable (V_{L}) para generar
fragmentos de Fv, bien químicamente mediante enlaces
bisulfuro^{29} o uniendo genéticamente los dominios V_{H} y
V_{L}, posiblemente mediante un péptido hidrófobo flexible para
generar un fragmento Fv de una sola cadena^{30}.
Los fragmentos de mAb de UIC2, que carecen de la
porción constante (Fc), pueden presentar ventajas sobre el
anticuerpo completo para aplicaciones in vivo, fragmentos
tales como los que poseen la permeabilidad del tejido. Además,
muchas células y tejidos en el cuerpo expresan receptores capaces
de unirse a la parte Fc de los anticuerpos, produciendo la unión no
específica indeseable del anticuerpo completo.
El mAb de UIC2, un fragmento determinante
complementario o su derivado recombinante se pueden acoplar a un
fármaco quimioterapéutico, a una toxina animal o vegetal, a un
isótopo radioactivo, etc. utilizando técnicas químicas o de
ingeniería genética, como se indica en las referencias 20 y 31.
Se pueden utilizar los dominios determinantes de
especificidad de UIC2 (tal como un fragmento Fv de una sola cadena)
para generar partículas de virus recombinantes que se unirían
específicamente a Pgp. De este modo, se puede insertar un fragmento
Fv de una sola cadena de mAb de UIC2 descrito anteriormente, por
ejemplo, en la zona N-terminal de la proteína del
gen III del bacteriófago fd o de otro fago filamentoso y se genera
el "anticuerpo del fago", como se describe en la referencia 32.
Como la proteína del gen III del bacteriófago fd presenta cuatro
zonas en las que se pueden cortar y empalmar péptidos extraños, se
pueden desarrollar anticuerpos de fago bifucional insertando
simultáneamente en esta proteína fragmentos de mAb de UIC2 y de
alguna otra proteína con una segunda especificidad deseada
(fragmento de anticuerpo o enzima). Los dominios determinantes de
la especificidad de mAb de UIC2 se pueden insertar también en una
proteína expresada sobre la superficie externa de algunos otros
virus procarióticos o eucarióticos. También es posible insertar
dicho dominio en una proteína expresada normalmente sobre la
superficie de una célula procariótica o eucariótica, tal como la
proteína LamB de Escherichia coli^{33}, con el fin de
direccionar las células receptoras a Pgp.
El hibridoma de UIC2 se puede también utilizar
para construir hibridoma híbridos capaces de segregar anticuerpos
biespecíficos híbridos^{20,34}. En una forma de realización, se
fusionan las células de hibridoma de UIC2, utilizando la tecnología
de fusión celular convencional, con otra línea celular de hibridoma
produciendo mAb contra un antígeno que puede ser útil con fines de
diagnóstico y/o terapéuticos en combinación con mAb de UIC2 (siendo
dichos antígenos los enzimas utilizados en análisis inmunoquímico,
citotoxinas, colorantes fluorescentes, etc.). Las células de
hibridoma de UIC2 se pueden también hibridar con células del bazo
con un animal inmunizado con el segundo antígeno, o con linfocitos
activados in vitro o líneas celulares linfocíticas^{35}. Se
pueden utilizar células animales (por ejemplo, ratón, rata o
hámster) o humanas como parejas de fusión para la producción de
hibridoma híbrido. Los anticuerpos bifuncionales deseados se pueden
separar de mAb de UIC2 y el anticuerpo de la pareja por
procedimientos convencionales^{27}.
Los hibridomas de UIC2 y UIC2/A depositados se
destinan únicamente como ilustraciones de hibridomas que producen un
mAb específico con epítopo extracelular que interactúa en
competencia con el mismo epítopo que produce el mAb de UIC2 y éste
es el equivalente funcional de mAb de UIC2 como función se definió
anteriormente en los ejemplos siguientes.
Se puede utilizar también mAb de UIC2 como
antígeno para obtener anticuerpos específicos
anti-idiotipo, utilizando procedimientos bien
conocidos en la materia^{36}. Dichos anticuerpos
anti-idiotipo se direccionarán contra la zona de
unión al antígeno de mAb de UIC2. Dichas zonas de unión pueden
simular en su estructura complementaria a mAb de UIC2. Los
anticuerpos anti-idiotipo de mAb de UIC2, sus
derivados o fragmentos serán útiles como preparaciones de vacuna
para producir una respuesta inmunitaria contra Pgp, como un
planteamiento para estimular una respuesta del huésped contra
tumores con MDR. Además, se pueden utilizar también anticuerpos
anti-idiotipo como inmunógenos para obtener
anticuerpos anti-anti-idiotipo.
Dichos anticuerpos
anti-anti-idiotipo son
probablemente los que poseen la misma especificidad y los efectos
funcionales del epítopo que el mAb de UIC2 original y por
consiguiente se pueden observar como derivados de este anticuerpo.
En particular, las líneas celulares humanas que producen anticuerpos
anti-anti-idiotipo con la
especificidad del mAb de UIC2 se pueden generar por inmunización
in vitro de linfocitos \beta periféricos con un anticuerpo
anti-idiotipo contra mAb de UIC2 utilizando
técnicas establecidas^{36}. Este procedimiento produce los mAb
completamente humanos (en lugar de humanizados) con la
especificidad y la eficacia biológica de mAb de UIC2. La utilidad
de anticuerpos de anti-idiotipo como vacunas y la
capacidad de los anticuerpos
anti-anti-idiotipo para simular la
especificidad del antígeno del anticuerpo original, son bien
conocidos en la técnica^{37}.
El mAb de UIC2 reconoce un epítopo específico de
Pgp, distinto de los reconocidos por los mAb que, a diferencia del
presente mAb, son incapaces de inhibir o invertir la MDR.
La(s) zona(s) particular(es) de Pgp que
comprenden el epítopo mAb de UIC2 se pueden identificar
determinando la reactividad de este mAb con una serie de péptidos
sintéticos cortos contenidos dentro de la Pgp humana,
particularmente los dominios extracelulares de Pgp. Por este medio,
se ha cartografiado el epítopo de mAb de MRK-16
hasta el primer y cuarto de los seis bucles de péptido extracelular
predichos de Pgp{38}. Como alternativa, se pueden determinar las
secuencias de proteínas que comprenden el epítopo de UIC2 utilizando
como sonda el mAb de UIC2 para cribar una biblioteca de fragmentos
aleatorios cortos del ADNc de mdr1 en un vector de expresión
apropiado tal como \lambda g11^{39} o un vector que expresa los
péptidos insertados como partes de una proteína de fusión con LamB,
proteína de superficie de E. Coli^{33}. En todavía otra
forma de realización, se pueden identificar las zonas epitópicas
para mAb de UIC2 determinando la unión de este mAb a una serie de
líneas celulares con MDR transfectantes que tiene cada una variante
Pgp de mdr1 que contienen una conocida deleción de un bucle
extracelular. El fallo del mAb al reaccionar con una variante Pgp
particular indica que el fragmento de péptido eliminado constituye
o forma parte de la zona de reconocimiento del mAb de UIC2 o que
afecta a la conformación esencial para reconocimiento. Una vez
el/los epítopo(s) está(n) identificado(s) por los
procedimientos mencionados anteriormente, se pueden utilizar
secuencias de aminoácidos de dichas zonas para aumentar los
anticuerpos adicionales, preferentemente anticuerpos monoclonales
con la especificidad de mAb de UIC2.
El mAb de UIC2 de la invención o sus fragmentos
determinantes de complementariedad o los derivados recombinantes se
pueden utilizar en inmunodiagnóstico e inmunoterapia de pacientes
que padecen de tumores con MDR, particularmente como los descritos
a continuación.
Se pueden utilizar mAb de UIC2, los fragmentos
determinantes de complementariedad o sus derivados recombinantes
como reactivos sensibles y específicos para la detección de células
MDR ex vivo o in vivo.
En los procedimientos de inmunoanálisis directo
para la identificación y/o cuantificación de células con MDR, en
suspensión o inmovilizadas (placa de cultivo), o de secciones de
tejido u otras preparaciones citológicas e histológicas, se incuban
con el mAb de UIC2, un fragmento o su derivado recombinante, marcado
covalentemente con una molécula indicadora. Se conocen una gran
variedad de moléculas indicadoras en las técnicas de inmunología e
incluyen fluoróforos, cromágenos, quimioliminiscentes, enzimas,
sistemas avidina-biotina, átomos radioactivos y
similares. Las condiciones de incubación para la unión máxima se
pueden seleccionar sin experimentación indebida. Típicamente, las
células se incuban en tampón con el anticuerpo marcado en frío (p.
ej.: 4ºC) durante 30 a 60 minutos. Después de aislar y lavar el
complejo del anticuerpo marcado con células, se detecta la marca o
se cuantifica mediante técnicas reconocidas en la materia. Como
alternativa, el anticuerpo primario (es decir, mAb de UIC2,
fragmento o derivado) no está marcado y la detección se realiza por
medio de un segundo reactivo marcado, tal como el anticuerpo
anti-inmunoglobulina del fragmento de
F(ab)_{2} conjugado con una molécula
indicadora.
Como alternativa, se detectan células con MDR por
microscopía de inmunofluorescencia. Las suspensiones celulares,
sospechosas de ser o contener células con MDR, se obtienen de
pacientes y se cultivan en placas de cultivo de plástico. Las
células se ponen en contacto con el fragmento o derivado
recombinante de mAb de UIC2 de la invención en condiciones de
máxima unión. Dichas condiciones se determinan fácilmente y como
rutina sin experimentación indebida. Después de lavar el conjugado
de anticuerpo-célula inmovilizado con un tampón para
eliminar los materiales no unidos, el conjugado se pone a
continuación en contacto con un segundo anticuerpo marcado con un
fluoróforo (p. ej.: IgG anti-ratón de cabra marcado
con rodamina) se lavan las células a continuación, se fijan en
formalina u otro fijador apropiado y se examinan al microscopio de
fluorescencia^{15}. La cantidad de fluorescencia y, por
consiguiente, el número de células MDR que se expresan en la
muestra, puede ser cuantificado utilizando un instrumento estándar
de análisis por imagen. Cuando se utiliza un fragmento o derivado
recombinante de mAb de UIC2, se debe haber utilizado un segundo
anticuerpo apropiado.
Se pueden también utilizar el mAb de UIC2, los
fragmentos determinantes de la complementariedad y los derivados
recombinantes de la invención en los procedimientos de tinción
inmunocitoquímica reconocidos en la técnica de las secciones
tumorales sospechosas de contener células que expresan MDR, técnica
que se puede combinar con la hibridación in situ con una
sonda de polinucleótido de mdr1 en el mismo portaobjetos
(véase, p. ej.: la referencia 40).
En una forma de realización de la invención, mAb
de UIC2, un fragmento determinante de complementariedad o su
derivado recombinante, en un vehículo farmacéuticamente aceptable
(dichos vehículos se describen en la referencia 41), se puede
administrar a un primate paciente por una vía apropiada, tal como la
parenteral. Los efectos terapéuticos se basan en la capacidad de
dichas preparaciones de anticuerpo para direccionar las células
tumorales con MDR, unirse fuertemente a un dominio extracelular de
la superficie de la molécula Pgp de dichas células y de este modo
inhibir el mecanismo del efluente del fármaco provocado por esta
proteína de transmembrana. En esta modalidad terapéutica, se puede
administrar el fármaco anticanceroso simultáneamente o sucesivamente
con un anticuerpo o un complejo
anticuerpo-citotoxina de la invención.
En otra forma de realización, el anticuerpo, el
fragmento o su derivado recombinante se administra a un paciente
que padece un tumor con MDR en un vehículo farmacéuticamente
aceptable para provocar citotoxicidad en el tumor mediada por el
complemento o mediada por el anticuerpo a través de la porción
efectora de la molécula anticuerpo.
En una tercera forma de realización, la
preparación del anticuerpo se conjuga en primer lugar covalentemente
con un agente citotóxico tal como doxorrubicina, un radioisótopo, o
ambos, y el conjugado se administra a continuación, en un vehículo
farmacéuticamente aceptable, a un primate paciente que padece un
tumor con MDR. Esta forma de realización produce efectos
terapéuticos combinados en los el anticuerpo se dirige a las
células con MDR, el anticuerpo inhibe el efluente de fármacos
mediado por Pgp y la citotoxina destruye las células objetivo.
Se pueden utilizar modalidades descritas
anteriormente para la destrucción selectiva de las células
tumorales con MDR utilizando mAb de UIC2 o sus derivados, no
solamente para administración in vivo, sino también para
quimioterapia ex vivo. Se puede utilizar quimioterapia ex
vivo, por ejemplo, como medio por el cual se puede purgar la
médula ósea del paciente de células tumorales en los protocolos
terapéuticos del cáncer que implican el trasplante autólogo de
médula ósea. Es decir, una muestra de médula ósea de un paciente se
extrae del cuerpo, se trata la suspensión con mAb de UIC2 o uno de
los derivados citotóxicos mencionados anteriormente para destruir
las células con MDR y la médula ósea tratada se devuelve a
continuación al paciente.
Para comodidad del usuario, se pueden montar
equipos comerciales. Dichos equipos pueden contener, en recipientes
separados: mAb de UIC2; fragmentos de mAb de UIC2 sin marcar o
marcados con una molécula indicadora; derivados recombinantes de mAb
de UIC2 sin marcar o marcados con una molécula indicadora y
anticuerpos anti-idiotipo de mAb de UIC2.
Los siguientes ejemplos proporcionan formas de
realización preferidas de la invención.
Se derivaron células 3T3 de BALB/c de fibroblasto
de ratón que expresan la Pgp de transmembrana de mdr1 por
transfección de fibroblastos con ADNc de mdr1 humano
aislado^{12} en un vector pUCFVXMDR1^{13} con expresión
eucariótica, aislando células resistentes al multifármaco en 20
ng/ml de vinblastina y amplificando posteriormente el gen
transfectado en etapas consecutivas de selección en 250 ng/ml, 500
ng/ml y 1000 ng/ml de vinblastina. Los fibroblastos resistentes al
multifármaco resultantes se denominaron 3T3-250 de
BALB/c, 3T3-500 de BALB/c y
\hbox{3T3-1000} de BALB/c,
respectivamente.
La línea celular K562/Inf se derivó por inyección
de células de leucemia K562 humana con un retrovirus
pLMDR1L6 recombinante que lleva ADNc mdr1 humano^{42} y subclonando posteriormente sin selección citotóxica.
pLMDR1L6 recombinante que lleva ADNc mdr1 humano^{42} y subclonando posteriormente sin selección citotóxica.
Se obtuvo la línea celular LRMN1 por transfección
de la línea celular del fibroblasto LR73 de CHO con el plásmido
pUCFVXMDR1/neo que expresa el ADNc del mdr1 humano y el gen
neo (resistencia G418), seguido de la selección con G418 y
determinando los transfectantes individuales para aumentar el
efluente de Rh123.
\newpage
Las líneas celulares con MDR,
KB-8, KB-8-5,
KB-8-5-11 y
KB-V1, aisladas de las células del carcinoma
\hbox{KB-3-1} humano,
mediante selección multietapa con colchicina o vinblastina, se
adquirieron al Dr. Michael M. Gottesman, National Institutes of
Health, Bethesda, MD.
Se derivaron células GRCI de KB procedentes de
KB-3-1 por transfección con
pUCFVXMDR1^{13} y selección utilizando colchicina.
Las células CEM/VLD_{100}, procedentes de
células CEM de leucemia humana por selección multietapa con
vinblastina, se adquirieron al Dr. W.T. Beck, St. Jude's Children's
Hospital, Memphis, TN.
Los derivados con MDR seleccionados de
vinblastina o cochicina de la línea celular del macrófago J774.2 de
ratón, J7-V2-1,
J7-V3-1 y
J7-C1-100, se adquirieron al Dr. S.
B. Horwitz, Albert Einstein College of Medicine, Bronx, N.Y. estás
líneas celulares en su combinación sobreexpresan los tres genes
mdr de ratón, mdr1a, mdr1b y
mdr2^{43}.
mAb de MRK-16 (IgG_{2a}) se
adquirieron al Dr. T. Tsuruo, Universidad de Tokio, Japón. MAb de
HYB-241 y HYB-612 (IgG_{1}) se
adquirieron al Dr. L. Rittmann-Grauer (Hybritech
Corp., San Diego, CA) y C219 de mAb (IgG_{2a}) de Centocor,
Malvern, PA.
Todas las muestras de mAb tuvieron por lo menos
el 95% de pureza según SDS-PAGE. Se determinaron
las concentraciones de mAb utilizando el equipo cuantitativo de
inmunodifusión radial de Ig para ratón (ICN, Costa Mesa, CA). Cuando
fue necesario se concentraron más los mAb y se dializaron frente a
solución salina tamponada con fosfato (PBS) o medio de Eagle
modificado con Dulbecco (DMEM).
Se inmunizaron ratones BALB/c con
1-2\times10^{7} células 3T3-1000
de BALB/c del Ejemplo 1, inyectadas por vía s.c. y/o por vía i.p.
seis veces en intervalos de dos semanas. Se hizo el refuerzo final
con 2\times10^{7} células i.p. y 5\times10^{6} células i.v.
Cuatro días después de la última alimentación de fibroblastos, se
extrajo el bazo de un animal y se generaron hibridomas con células
P3-X63-Ag8.653 de mieloma humano por
técnicas reconocidas en la materia. Se utilizaron inmunoglobulinas
polivalentes anti-ratón de cabra marcadas con FITC
(Sigma Chem. Co., San Luis, MO) como reactivo secundario de
anticuerpo a una dilución 1:100.
Se cribaron fluidos sobrenadantes del cultivo de
tejido de hibridomas individuales para la producción de mAb
mediante marcado por inmunofluorescencia indirecta de células vivas
3T3 de BALB/c y 3T3-1000 de BALB/c fijadas al
portaobjetos de vidrio. De 556 hibridomas probados, los mAb
producidos solamente por dos hibridomas reaccionaron con las
células 3T3-1000 de BALB/c y de estos dos solamente
un hibridoma (denominado UIC2) produjo un anticuerpo reactivo con
células 3T3-1000 de BALB/c, pero no con las células
3T3 de BALB/c de referencia.
Se creó una línea de hibridoma estable que
segrega mAb de UIC2 mediante tres rondas consecutivas de
subclonación por dilución de punto final y cribado de los fluidos
sobrenadantes.
El hibridoma UIC2 se propagó como ascitis en
ratones BALB/c isotrasplantados y se purificó la inmunoglobulina de
fluido de ascitis por cromatografía de afinidad en
sefarosa-proteína A (Bio-Rad,
Richmond, CA). El mAb de UIC2, analizado por
SDS-PAGE, fue IgG de por lo menos el 95% de pureza.
El hibridoma UIC2 está en depósito en la American Type Culture
Collection, Rockville, MD (U.S.A.) (nº de registro HB11027) y
estarán disponibles irrevocablemente y sin limitación o condición
al público después de la publicación de esta patente.
La aplicación de Ouchterlony y los análisis de
inmunotransferencia utilizando una serie patrón de anticuerpos Ig
de anti-ratón dieron a conocer que mAb de UIC2
pertenece a la subclase IgG_{2a}.
La capacidad de mAb de UIC2 para provocar
citotoxicidad mediada por el complemento se determinó por el
complemento de conejo Low-Tox-M
(Cedarlane Labs, Hornby, Ontario) en las líneas celulares BALB/c,
3T3-1000 de BALB/c, CEM, CEM/VLB_{100}, K562 y
K562/Inf.
Se analizó inicialmente la reactividad de mAb de
UIC2 con varias líneas celulares que expresan Pgp por tinción de
inmunofluorescencia. Se analizaron las líneas celulares y los
resultados se presentan en la Tabla 1.
| Línea celular | Descripción | Reactividad de |
| mAb de UIC2 | ||
| (i) Hombre, seleccionado para MDR | ||
| KB-3-1 (materna) | Carcinoma epidermoide humano | - |
| KB-8 | KB-3-1 seleccionado de colchicina | +/- |
| KB-8-5 | KB-3-1, seleccionado de colchicina | + |
| KB-8-5-11 | KB-3-1, seleccionado de colchicina | ++ |
| KB-V1 | KB-3-1, seleccionado de vinblastina | +++ |
| CEM (materna) | Leucemia de linfocitos T humanos | - |
| CEM-VLB-100 | CEM, seleccionado de vinblastina | ++ |
| (ii) Transfectada con ADNc de mdr1 humano | ||
| K562 (receptor) | Leucemia mielógena crónica humana | |
| K562/Inferior | K562, infectado con retrovirus | |
| recombinante con expresión mdr1 | + | |
| 3T3 de BALB/c (receptor) | Fibroblastos de ratón | - |
| 3T3-1000 de BALB/c | 3T3 de Balb/c transfectadas con mdr1, | +++ |
| seleccionados por vinblastina | ||
| LR73 (receptor) | Ovario de hámster chino | - |
| LRMN1 | LR73, transfectadas con mdr1 humano y | + |
| genes neo, seleccionados por G418 | ||
| (iii) Riñón de mono verde | ||
| CV1-COS | Células de riñón de mono verde | |
| (iv) Ratón, seleccionado de MDR | ||
| J774.2 (materna) | Células de macrófago de ratón | - |
| J7-V2-1 | J774.2, seleccionada de vinblastina | - |
| J7-V3-1 | J774.2, seleccionada de vinblastina | - |
| J7-C1-1000 | J774.2, seleccionada de colchicina | - |
MAb de UIC2 reaccionó con todas las líneas
celulares humanas analizadas que expresan el gen mdr1 humano,
incluyendo las células de roedor o humanas transfectadas con ADNc
de mdr1 humano y aisladas con o sin selección citotóxica,
además de células CV1-COS de mono verde conocidas
por expresar Pgp, pero no con sus precursores sensibles al fármaco
o cualquier línea celular negativa de Pgp. La intensidad de la
inmunotinción de mAb de UIC2 correlacionada con los niveles
conocidos de resistencia al fármaco en diferentes líneas celulares.
MAb de UIC2 no reacciona con derivados con MDR de células J774.2 de
ratón que expresa las Pgp codificadas por cada uno de los tres genes
mdr de ratón, indicando que la reactividad de mAb de UIC2 es
específica del primate.
Como se indicó anteriormente, se produjeron
células K562/Inf por transferencia retrovírica del gen mdr1 y
subclonación, sin selección citotóxica. La reactividad de mAb de
UIC2 con esta línea celular proporciona pruebas fuertes de que mAb
de UIC2 reacciona con el producto del gen mdr1 y no con
algún otro marcador celular producido por agresión citotóxica.
Las células con MDR transfectadas
(5-10\times10^{6}) se marcaron metabólicamente
con 50 \muCi/ml de ^{35}S-metionina (ICN) en
DMEM exento de metionina con FCS al 10%, durante 10 a 18 horas a
37ºC en CO_{2} al 7%. Después de lavar las células con PBS, se
incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con mAb de UIC2 en
2,6 ml de PBS. Se lavaron a continuación las células y se lisaron
(ácido desoxicólico al 0,2% y PMSF 0,2 mM en PBS durante 2 a 4
minutos). Se clarificaron los lisados por centrifugación en una
microcentrífuga durante 15 minutos a 4ºC. Se incubaron los fluidos
sobrenadantes en lechos de proteína A inmovilizados (Repligen,
Cambridge, MA) durante 1 hora a 4ºC en agitación constante. La
proteína A es un absorbente general para anticuerpos IgG. Después de
5 lavados de los lechos sedimentados con la solución de lisis, se
transfirieron los lechos a 40 \mul de tampón de muestra de
SDS-PAGE y se determinó por SDS-PAGE
(7,5%) la reactividad y el peso molecular en la proteína
inmunoprecipitada en SDS-PAGE.
Estos experimentos demostraron que mAb de UIC2
reconoció una proteína de 170 a 180 kDa expresada en células con
MDR. Esta proteína migró conjuntamente en SDS- PAGE con un
inmunoprecipitado por mAb de MRK-16 específico de
Pgp en las mismas condiciones, confirmando que el antígeno
reconocido por mAb de UIC2 es Pgp humana (Fig. 1).
La inmunoprecipitación con mAb de UIC2 fue la más
exitosa cuando se solubilizaron membranas plasmáticas conteniendo
Pgp con desoxicolato; aunque la solubilización con detergente
CHAPS, permitió la inmunosedimentación eficaz de Pgp por mAb
MRK-16, abolió eficazmente la reactividad de Pgp
con mAb de UIC2. Este resultado sugiere que mAb de UIC2 y mAb
MRK-16 reconocen diferentes epítopos en Pgp, con
diferente sensibilidad a los detergentes. MAb de UIC2, como mAb
MRK-16, no reaccionó con Pgp desnaturalizado en
transferencias de Western en condiciones en las que Pgp fue
detectable por la mAb C219 que reconoce un epítopo intracelular, no
situado en la membrana, de esta proteína.
N-octilglucosido (1%,
Boehringer-Mannheim), aunque eficaz, fue menos que
el desoxicolato para la inmunoprecipitación utilizando mAb de
UIC2.
El procedimiento de aislamiento descrito
anteriormente es flexible. Por ejemplo, se puede hacer reaccionar
con tripsina células objetivo que expresan Pgp antes de la
solubilización, lisarlas con solución detergente y tratarlas a
continuación con el anticuerpo y lechos de proteína A. Como se
indicó anteriormente, la proteína A es un adsorbente general para
anticuerpos de IgG. Como alternativa, es posible utilizar lechos de
proteína A recubiertos previamente con el anticuerpo. Los parámetros
de tiempo y concentración son también flexibles. Cualquier línea
celular, incluyendo las de origen animal o humano, que expresan Pgp
humana se pueden utilizar como línea celular objetivo.
Se determinó la capacidad de mAb de UIC2 para
destruir las células 3T3-1000 de BALB/c resistentes
al multifármaco mediante una prueba de citotoxicidad mediada por el
complemento reconocida en la técnica. En experimentos repetidos, del
70 al 80% de dichas células fueron destruidas por mAb de UIC2.
Se estudió el efecto de mAb sobre el efluente de
compuestos fluorescentes de células con MDR, mediante un ensayo
citométrico de flujo^{15,44}. En este ensayo, se incubaron
10^{6} células en suspensión con diferentes preparaciones de mAb a
20 \mug/ml en 3 a 5 ml de medio exento de suero durante 30
minutos a 0ºC y a continuación se lavaron dos veces y se cargaron
mientras se enfriaba con 0,5 a 1,0 \mug/ml de Rh123 durante 10
minutos o con doxorrubicina 5 \muM durante 1 hora. Rodamina 123
(Rh123) es un colorante fluorescente mitocondrial. Se añadió
también mAb (20 \mug/ml) al medio exento de colorante durante el
periodo de salida a 37ºC; a esta temperatura, Pgp bombea Rh123 fuera
de las células. Se midió la retención del colorante después del
efluente por citometría de fluorescencia de flujo.
Se determinaron los efectos de mAb de UIC2 sobre
el efluente del colorante transportado por Pgp procedente de las
células con MDR. En el experimento de la Fig. 2A, se cargaron
células CEM/VLB_{100} con 10 \mug/ml de Rh123 y se incubaron en
medio exento de colorante durante 30 minutos a 37ºC, en presencia de
mAb de UIC2, mAb MRK-16 ó UPC10 (IgG_{2a} de
referencia) y se analizaron las células por citometría de flujo; la
fluorescencia celular se representa en escala logarítmica. En el
experimento de la Fig. 2B, se cargaron células K562/Inf en hielo
con Rh123 a 1 \mug/ml y se incubaron como en 2A, excepto que el
periodo de salida fue de 40 minutos. En el experimento de la Fig.
2C, se analizó el efluente con Rh123 de las células K562/Inf como en
B (excepto que el periodo de salida se dividió por la mitad), en
presencia de mAb de IgG_{2a} de referencia (UPC10), mAb de UIC2 o
mAb de UIC2 preabsorbido con absorbentes de IgG
anti-ratón o de IgM anti-ratón.
En experimentos de absorción, se incubó mAb de
UIC2 a 20 \mug/ml con 0,3 ml de bolas de agarosa (Sigma) acopladas
covalentemente con IgG anti-ratón de cabra
purificada por afinidad o IgM anti-ratón durante 1
hora y se separó el material absorbido por centrifugación. Se
utilizó anticuerpo UPC10 (IgG_{2a} de referencia) como isótopo
referencia para UIC2 y mAb MRK-16; se utilizó IgG de
ratón completa purificada como referencia para
HYB-241 y mAb HYB-612.
El mAb de UIC2 no altera la acumulación de un
colorante Rh123 transportado por Pgp a 0ºC en células con MDR. Sin
embargo, a 20 \mug/ml este mAb inhibió significativamente el
efluente posterior con Rh123 a 37ºC de las líneas celulares
CEM/VLB_{100} y K562/Inf, en comparación con las referencias
tratadas con mAb UPC10 de IgG_{2a} (Fig. 2A, B). En marcado
contraste, en las mismas condiciones, el mAb MRK-16
no inhibió el efluente con Rh123 (Fig. 2A, B). Otras dos
preparaciones de mAb conocidas porque reconocen la Pgp humana en la
superficie celular, a saber, HYB-612 y
HYB-241, tampoco presentaron ningún efecto en el
efluente con Rh123, aún cuando la intensidad de la tinción
inmunofluorescente de todas las líneas celulares probadas por los
anticuerpos UIC2, MRK-16, HYB-241 y
HYB-612 sea esencialmente la misma. Se observó que
concentraciones de mAb de UIC2 de 20 \mug/ml estaban saturando
todas las líneas celulares analizadas.
El efecto inhibidor de UIC2 en el efluente con
Rh123 de las células K562/Inf (Fig. 2C) y de las células
CEM/VLB_{100} se abolió después de la preabsorción con IgG anti-ratón, pero no con absorbente IgM anti-ratón de referencia. Esto demuestra que el material responsable de la inhibición del efluente con Rh123 fue el anticuerpo y no los contaminantes sin IgG.
CEM/VLB_{100} se abolió después de la preabsorción con IgG anti-ratón, pero no con absorbente IgM anti-ratón de referencia. Esto demuestra que el material responsable de la inhibición del efluente con Rh123 fue el anticuerpo y no los contaminantes sin IgG.
El mismo tipo de análisis demostró que mAb de
UIC2 disminuyó el efluente de un fármaco fluorescente anticanceroso,
doxorrubicina, de las células K562/Inf.
Todos los fármacos se adquirieron en Sigma,
excepto G418 (Gibco) y taxol (donación del Dr. S.B. Horwitz). La
formación de colonias y los análisis de MTT para la inhibición del
cultivo celular se realizaron por procedimientos conocidos en la
técnica. Los efectos de mAb sobre la cititoxicidad del fármaco se
determinaron incubando células que se desarrollan en suspensión o
células monocapa tratadas con tripsina con los mAb purificados,
dializados previamente frente a DMEM, durante 30 minutos a
temperatura ambiente. Se colocaron las células por triplicado en
placas de cultivo de tejido de 6 pocillos (Falcon Plastics, 200 a
250 células/pocillo para las determinaciones de colonias y 400 a 450
células/pocillo para las determinaciones de MTT) en presencia de
mAb. Para las determinaciones de MTT de las células K562/Inf, se
utilizaron placas de 96 pocillos por cuadruplicado. Se utilizó DMEM
con FCS al 10% inactivado por calor en todas las
determinaciones.
Se determinó el efecto del mAb de UIC2 sobre la
resistencia de dos líneas celulares resistentes al multifármaco en
el fármaco anticanceroso vinblastina en dos sistemas de prueba
diferentes, cultivo celular y formación de colonia.
En el sistema descrito en la Fig. 3A, se
determinó la inhibición del crecimiento de los fibroblastos
3T3-1000 de BALB/c por diferentes concentraciones de
vinblastina en presencia de 20 \mug/ml de mAb de UIC2
(\multimapdotboth) o IgG_{2a} de referencia (UPC10
(\multimapboth). Todos los valores están expresados en relación
con las células 3T3-1000 de BALB/c tratadas con mab
con UPC10 cultivadas en ausencia de fármaco. Todas las
determinaciones se realizaron por triplicado.
En el sistema descrito en la Fig. 3B, se examinan
los efectos de diferentes mAb sobre la formación de colonias por
fibroblastos 3T3-1000 de BALB/c en presencia de
vinblastina. Se colocaron células (200 por pocillo) en placas Falcon
de 6 pocillos en presencia de 350 ng/ml de vinblastina (ID_{90})
y 20 \mug/ml del mAb indicado. Se fijaron las colonias con
metanol o etanol, se tiñeron con violeta cristal el día 11 y se
puntuó la eficacia del cultivo en la placa.
En el sistema descrito en la Fig. 3C, se examinó
el efecto de diferentes concentraciones de mAb de UIC2 sobre el
cultivo de células 3T3-1000 de BALB/c en ausencia de
vinblastina (\multimapboth) o en presencia de 350 ng/ml de
vinblastina (ID_{90}) (\multimapdotboth). Todos los valores se
expresan en comparación con el crecimiento de las células tratadas
con IgG_{2a} con UPC10 de referencia sin vinblastina.
En el sistema descrito en la Fig. 3D, se examinó
el efecto de diferentes concentraciones de verapamilo sobre el
cultivo de las células 3T3-1000 de BALB/3 en
ausencia de vinblastina (\multimapboth) o en presencia de 350
ng/ml de vinblastina (ID_{90}) (\multimapdotboth).
Tanto mAb de UIC2 como IgG_{2a} con UPC10 se
desalaron antes de su utilización empleando columnas
ECONO-PAC® 10DG (Bio-Rad)
equilibradas con medio DMEM exento de suero, dializado frente a un
gran volumen de medio o PBS y filtrado a través de filtros
ACRODISC® Low Protein Binding de 0,2 \mum (Gelman Sci. Co.).
En otro sistema de prueba todavía, se probó la
resistencia a la vinblastina de las células K562/inf (se hizo
resistente al multifármaco como se describió en el Ejemplo 1) que
se desarrollan en un cultivo en suspensión en un ensayo de
viabilidad de células. Se cultivaron en placas células
(5\times10^{3} por pocillo), por cuadriplicado, en placas de
plástico de 96 pocillos (Falcon) en presencia de concentraciones
crecientes de vinblastina más 20 \mug/ml de mAb de UIC2
purificado o proteína IgG_{2a} con UPC10. Después de 6 días de
incubación a 37ºC en CO_{2} al 5%, se determinó la viabilidad de
las células utilizando el ensayo MTT.
Como se demuestra en la Fig. 3A, la adición de
mAb de UIC2 potenció fuertemente la inhibición del cultivo celular
de células 3T3-1000 de BALB/c, disminuyendo el
índice ID_{50} desde 650 ng/ml hasta 150 ng/ml. En ausencia de
vinblastina, mAb de UIC2 no presentó efecto en el cultivo
celular.
Los datos de la Fig. 3B ilustran que mAb de UIC2
a 20 \mug/ml inhibió completamente la formación de colonias por
las células 3T3-1000 de BALB/c en presencia de 350
ng/ml de vinblastina (correspondiente al ID_{90} para esta línea
celular). En cambio, otros 3 mAb con anti-Pgp
conocidos (MRK-16, HYB-241 y
HYB-612) no ejercieron ningún efecto significativo
en el cultivo celular o en la formación de colonias a la misma
concentración (Fig. 3C).
El efecto potenciador de mAb de UIC2 sobre la
citotoxicidad de 350 ng/ml de vinblastina en las células
3T3-1000 llegó a ser detectable a una concentración
de mAb tan baja como aproximadamente 1 \mug/ml y mAb de UIC2
suprimió completamente todo el crecimiento celular a 10 \mug/ml
(Fig. 3C). Verapamilo, inhibidor químico de Pgp bien caracterizado,
consiguió la misma potenciación de la toxicidad de vinblastina
solamente a concentraciones tan grandes como 3\times10^{-6} M
(Fig. 3D).
mAb de UIC2 disminuyó además significativamente
el nivel de resistencia al fármaco en todas las demás líneas
celulares probadas incluyendo K562/Inf, KB-GRC1 y
KB-V1.
Estos descubrimientos indican que mAb de UIC2,
los fragmentos o los derivados recombinantes que contienen zonas
V_{H} y/o V_{L} de UIC2 se pueden utilizar para superar la
resistencia al multifármaco.
Para determinar si el efecto potenciador de mAb
de UIC2 sobre la cititoxicidad observada en el Ejemplo 8 estaba
limitado a un subconjunto específico de fármacos transportados por
Pgp ejemplificados por vinblastina, se compararon en este sistema
nueve fármacos a los que se sabe que son resistentes las células con
MDR y que se sabe que poseen diferentes mecanismos de
citotoxicidad.
En la Fig. 4 las barras representan la viabilidad
de las células 3T3-1000 de BALB/c (tal como se
determina por el ensayo MTT) en presencia de 20 \mug/ml de mAb de
UIC2 (barra negra) o referencia IgG_{2a} con UPC10 (barra
tramada). Se muestran los medios de ensayos por triplicado;
SD_{media} fue < 20% para cada media. La viabilidad celular se
expresa en comparación con las de las células de referencia
cultivadas en ausencia de fármaco. Las concentraciones de fármaco,
correspondientes a los índices ID_{50} predeterminados fueron:
vinblastina, 0,73 \muM; vincristina, 3,2 \muM; colchicina, 1
\muM; taxol, 1,6 \muM; doxorrubicina, 0,4 \muM; etoposido,
2,23 \muM; actinomicina D, 0,06 \muM; puromicina, 37,5 \muM;
gramicidina D, 4,1 \muM; metotrexato, 0,04 \muM; G418, 96
\muM; gentamicina, 24 \muM.
A las concentraciones de fármaco correspondientes
a ID_{50} para las células 3T3-1000 de BALB/c, 20
\mug/ml de mAb de UIC2 disminuyó en gran medida el crecimiento
celular en presencia de cualquiera de los fármacos a los que las
células con MDR se sabe que son resistentes cruzados, incluyendo
vinblastina, vincristina, colchicina, taxol, doxorrubicina,
etoposido, actinomicina D, puromicina y gramicidina D (Fig. 4). La
inhibición del crecimiento celular por mAb de UIC2 comparada con la
referencia UPC10 osciló desde el 68% para colchicina al 100% para
vinblastina, doxorrubicina, actinomicina D y taxol. Cuando se
realizó un experimento similar a concentraciones de fármaco
correspondientes a índices de ID_{20}, mAb de UIC2 inhibió el
crecimiento celular del 97% al 100% para todos los fármacos
probados (datos no mostrados). mAb de UIC2 no presentó ningún efecto
sobre la respuesta celular a las dosis de ID_{50} en cinco
fármacos citotóxicos a los que las células con MDR no son
resistentes cruzados, incluyendo metotrexato,
5-fluorouracilo, cis-platino,
G-418 y gentamicina (Fig. 4).
Por lo tanto, se puede sacar la conclusión que el
efecto potenciador decitotoxicidad de mAb de UIC2 es específico
para los sustratos de Pgp.
Se demostró en el Ejemplo 5 anterior que mAb de
UIC2 y mAb MRK-16 se pueden distinguir entre sí por
diferenciaciones en la respuesta de sus respectivos complejos de
epítopo para el mismo detergente.
En los Ejemplos 7 y 8 anteriores se demostró que
mAb de UIC2 inhibe eficazmente la función de salida del fármaco de
Pgp, mientras que otros anticuerpos monoclonales conocidos
dirigidos contra epítopos extracelulares en Pgp, tales como
MRK-16, HYB-241 y
HYB-612, no presentan esta propiedad.
Para distinguir además la zona epitópica del mAb
de UIC2 de las de otros anticuerpos monoclonales mencionados
anteriormente, los Drs. Schinkel y P. Borst del Netherlands Cancer
Institute, Amsterdam, en colaboración con los inventores, compararon
las reactividades de mAb de UIC2, mAb MRK-16, mAb
HYB-241 y mAb HYB-612 con líneas
celulares transfectadas por los Drs. Schinkel y Borst con ambos ADNc
con mdr1 normal y ADNc con mdr1 conteniendo una
delección o un ADNc del gen mdr2/mdr3 que está
íntimamente relacionado con ADNc con mdr1 pero que no
confiere resistencia al fármaco en las células.
Nuestros colaboradores determinaron la
reactividad de los anticuerpos monoclonales con células
transfectadas en un procedimiento estándar de inmunocitoquímica. Se
eliminaron las células adherentes de las placas de cultivo mediante
tratamiento con tripsina, se lavó una vez en PBS, se colocaron
manchas en portaobjetos de vidrio y a continuación se secaron con
aire. Para fijar las células en formaldehído, se rehidrataron las
células durante 1 minuto con PBS a temperatura ambiente (RT) y a
continuación se fijaron durante 20 minutos en formaldehído al 10%
en PBS (pH 7,2, 7ºC). Se enjuagaron los portaobjetos con varios
cambios de PBS a temperatura ambiente durante 5 a 10 minutos, se
secaron con aire y se almacenaron a -20ºC. Para teñir las células
fijadas, se rehidrataron las células en PBS (temperatura ambiente,
10 minutos), se incubaron durante 20 minutos a temperatura ambiente
en PBS más 1% (p/v) de BSA más suero normal de cabra (1:1000);
después de retirar el fluido en exceso por transferencia, se
pusieron en contacto las células con 8 \mug/ml de mAb en PBS (2
horas, temperatura ambiente). Después de 2 lavados con PBS, se
incubaron las células durante 30 minutos a temperatura ambiente con
IgG anti-ratón de cabra marcada con FITC (Tago,
Burlingame, CA) diluida a 1:50 en PBS/BSA, se lavó dos veces con
PBS y se montó en glicerina al 80% (v/v)/PBS al 20% (v/v), se llevó
a pH 8,0 con base TRIS (glicerina es glicerol de aproximadamente
87%). Las células teñidas se examinaron a continuación al
microscopio.
Se observó que mAb de UIC2 reaccionaba con
células que estaban transfectadas con ADNc con mdr1 humano
completo, pero no con células tMDR3.35 transfectadas con ADNc con
mdr2/mdr3^{45}. Además, mAb de UIC2 no reaccionó con
las células transfectantes que expresan una forma eliminada de ADNc
humano con mdr1. Esta forma eliminada codifica una Pgp con
una delección en el primer bucle extracelular del según intervalo de
aminoácidos: IFANAGNLEDLMSNITNRSD. En cambio, los mAb
MRK-16 y HYB-241 reaccionaron con
dicho transfectante de delección.
Los resultados indican que el epítopo reconocido
por mAb de UIC2 es distinto de los reconocidos por los anticuerpos
monoclonales anti-Pgp conocidos anteriormente que
no poseen la misma actividad funcional biológica y la reactividad
del detergente de mAb de UIC2.
Se prevé, sin embargo, que otros anticuerpos
monoclonales que reconocen al epítopo de mAb de UIC2 serían capaces
también de inhibir el bombeo de Pgp. Dichos anticuerpos
monoclonales se pueden identificar fácilmente por su capacidad para
hacer reaccionar las células transfectadas con el ADNc con
mdr1 humano completo, acoplado con una incapacidad paralela
para hacer reaccionar las células transfectadas con un ADNc con
mdr1 que codifica Pgp que contiene una delección dentro del
intervalo de aminoácidos mostrado anteriormente.
Se desarrolló una sublínea del hibridoma UIC2,
denominada UIC/A (nºATC HB11287), a partir del cultivo madre
sustituyendo poco a poco el medio de cultivo original (DMEM
complementado con suero de ternero fetal (FCS) al 10% y
penicilina-estreptomicina) con medio HPFW (Gibco)
exento de proteína.
Se cultivaron inicialmente células UIC2 en
matraces de 25 ml (Falcon) en medio HPFW complementado con FCS al
10%. La concentración de FCS se redujo gradualmente a 0%. Después
de un mes de cultivo en el medio exento de proteína, casi todas las
células habían perdido su capacidad para crecer, mientras estaban
unidas a la superficie del matraz y fueron cultivadas como un
cultivo en suspensión en grupos que constan de 8 a 20 células. En
este momento, se clonaron las células por dilución en serie en el
medio exento de proteína en placas de 96 pocillos, a una célula por
pocillo. Se analizó la producción de anticuerpos en los fluidos
sobrenadantes de cada pocillo mediante marcado por
inmunofluorescencia indirecta (véase el Ejemplo 3 anterior) de
células 3T3-1000 de Balb/c ó K562/Inf. Se
transfirió un clon que dio la señal de inmunofluorescencia más
fuerte a un matraz de 25 ml y se expandió la línea celular. Es esta
línea celular (UIC2/A) se pasó a un cultivo en suspensión en medio
HPFW en matraces de 25 ml, 75 ml y 175 ml. Cuando UIC2/A se
complementó con HEPES 25 mM, se pudo cultivar en botellas
giratorias, que produjeron grandes valores de anticuerpos.
La especificidad del mAb producida por UIC2/A fue
idéntica a la producida por la UIC2 materna. Esto se comprobó por
análisis de inmunofluorescencia indirecta en varias líneas
celulares positivas y negativas de P-glucoproteína,
incluyendo K562, K562/Inf, 3T3 de Balb/c, 3T3-1000
de Balb/c, KB-3-1,
KB-8, KB-8-5 y
KB-V-1. El isótopo para el mAb de
UIC2/A fue IgG_{2a}, exactamente como el mAb materno.
La Figura 5 muestra la separación por
SDS-PAGE de las proteínas excretadas por las líneas
celulares de los hibridomas UIC2 ó UIC2/A. La banda M en la figura
consiste en marcadores de masa molecular (200, 116, 97, 66 y 45 kDa,
BioRad). Las bandas 1 a 4 contienen inmunoglobulinas purificadas en
una columna de afinidad de proteína A (1,2 \mug de proteína en
las bandas 1 a 3, 0,4 \mug en la banda 4), después de recogerlas
del fluido de ascitis del hibridoma UIC2 (banda 1), fluido
sobrenadante del cultivo de tejido de las células UIC2 cultivadas
en un medio que contiene suero de ternero fetal (PCS) al 10% (banda
2) y fluido sobrenadante del cultivo de tejido de células de
hibridoma UIC2/A cultivadas en medio exento de proteína (bandas 3 y
4). Las bandas 5 a 8 presentan la proteína sin fraccionar del
fluido sobrenadante del medio de cultivo de tejido de células
UIC2/A, concentradas por centrifugación utilizando unidades de
concentración AMICON Centriprep 100 y electroforizadas en las
cantidades siguientes: 50 \mug, banda 5; 25 \mug, banda 6; 12,5
\mug, banda 7; y 6,25 \mug, banda 8. La banda 9 contiene 4
\mug de proteína sin purificar ni concentrar del fluido
sobrenadante del cultivo de hibridoma UIC2/A.
Los datos de la Figura 5 demuestran que el
presente mAb en el medio de cultivo celular UIC2/A fue IgG de
aproximadamente el 80% de pureza sin purificación (bandas 5 a 8).
Después de la purificación en una sola etapa en un columna de
afinidad con proteína A, la pureza del mAb de UIC2/A fue
aproximadamente el 100% (bandas 3 y 4), similar a la del mAb
purificado igualmente producido por células de la UIC2 materna
(bandas 1 y 2). La concentración de anticuerpo en los fluidos
sobrenadantes de los cultivos de UIC2/A osciló entre 200 y 350
\mug/ml, basada en el rendimiento determinado después de la
purificación por afinidad y SDS-PAGE.
La capacidad de la línea celular UIC2/A para
cultivarse en suspensión (incluyendo la rotación permanente en
frascos rotativos), los valores elevados del mAb producidos y la
pequeña cantidad de proteínas extracelulares extrañas producidas
hace a esta línea celular particularmente útil para la producción a
escala industrial del mAb de UIC2. Para muchas aplicaciones (p.
ej.: diagnóstico, tinción inmunofluorescente de células y tejidos,
separación de células, inmunoprecipitación, etc.) se pueden utilizar
fluidos sobrenadantes del cultivo del tejido de UIC2/A sin
purificación ni concentración.
Aunque la presente invención se ha descrito desde
el punto de vista de las formas de realización preferidas, se
entiende que tendrán lugar variaciones y modificaciones para los
expertos en la materia en consideración a la presente invención.
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Claims (25)
1. Línea celular híbrida denominada hibridoma
UIC2 y disponible en el nº de registro de ATCC HB11027.
2. Sublínea del hibridoma UIC2 según la
reivindicación 1, capaz de desarrollarse en un medio de cultivo
definido exento de proteína.
3. Sublínea celular híbrida según la
reivindicación 2, denominada hibridoma UIC2/A y disponible en el nº
de registro de ATCC HB11287.
4. Anticuerpo monoclonal obtenible a partir del
hibridoma de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, denominado
mAb de UIC2 o su fragmento determinante de complementariedad.
5. Fragmento determinante de complementariedad
del anticuerpo de la reivindicación 4, en el que dicho fragmento
determinante de complementariedad se expresa sobre la superficie de
un virus de célula procariótica, de un virus de célula eucariótica
o de una célula eucariótica.
6. Derivado recombinante del anticuerpo
monoclonal según la reivindicación 4, que supera la resistencia al
multifármaco en células que expresan a Pgp, en el que dicho
derivado recombinante comprende:
- a)
- una cadena pesada de dicho anticuerpo monoclonal de UIC2;
- b)
- una cadena ligera de dicho anticuerpo monoclonal de UIC2;
- c)
- una zona variable de la cadena pesada ("V_{H}") de dicho anticuerpo monoclonal de UIC2;
- d)
- una zona variable de la cadena ligera ("V_{L}") de dicho anticuerpo monoclonal de UIC2;
- e)
- una porción determinante de complementariedad de la zona V_{H} de dicho anticuerpo monoclonal de UIC2;
- f)
- una porción determinante de complementariedad de la zona V_{L} de dicho anticuerpo monoclonal de UIC2;
- g)
- un anticuerpo monoclonal humanizado, por ejemplo un anticuerpo monoclonal humanizado híbrido que contiene, en la estructura, una secuencia de ADNc que codifica una cadena de V_{H} ó V_{L} de dicho mAb de UIC2 o su fragmento y una zona constante de una inmunoglobulina humana;
- h)
- una inmunotoxina que comprende una zona determinante de complementariedad de dicho mAb de UIC2;
- i)
- un anticuerpo monoclonal de una sola cadena, que comprende la zona V_{H} y la zona V_{L} de dicho mAb de UIC2 unidas por un péptido flexible, sin unión;
- j)
- una proteína de fusión que comprende una zona determinante de complementariedad de dicho mAb de UIC2 fusionada con una proteína seleccionado de entre el grupo constituido por una proteína expresada sobre la superficie de un virus de célula procariótica, un virus de célula eucariótica y una célula eucariótica; o
- k)
- un anticuerpo monoclonal bifuncional.
7. Secuencia de ADNc que codifica un derivado
recombinante según la reivindicación 6.
8. Sistema de expresión procariótico o
eucariótico que contiene una secuencia de ADNc según la
reivindicación 7.
9. Hibridoma híbrido que comprende un producto de
fusión de una célula con hibridoma según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, con otra célula productora de mAb que no es
de la UIC2, seleccionado de entre el grupo constituido por una
segunda célula con hibridoma, una célula de bazo, un linfocito
activado de sangre periférica y un linfocito cultivado.
10. Proteína producida por una línea celular
híbrida, según la reivindicación 9.
11. Péptido que comprende el epítopo de un
anticuerpo según la reivindicación 4 y que presenta la secuencia
IFANAGNLEDLMSNITNRSD.
12. Anticuerpo dirigido contra un péptido según
la reivindicación 11, que supera la resistencia al multifármaco en
las células que expresan a Pgp.
13. Anticuerpo monoclonal que inhibe
competitivamente la unión inmunoespecífica de un anticuerpo según la
reivindicación 4, con su epítopo en la
P-glucoproteína codificada por el gen mdr1
humano, en el que dicho anticuerpo monoclonal supera la resistencia
al multifármaco en células tumorales de mamífero que expresan
Pgp.
14. Anticuerpo anti-idiotipo de
un anticuerpo según la reivindicación 4.
15. Anticuerpo dirigido contra un anticuerpo
anti-idiotipo según la reivindicación 14, cuyo
anticuerpo supera la resistencia al multifármaco en células que
expresan a Pgp.
16. Reactivo para detectar la resistencia al
multifármaco en células tumorales de mamífero, que comprende un
anticuerpo seleccionado de entre un anticuerpo o fragmento
determinante de complementariedad según la reivindicación 4 o un
derivado según la reivindicación 6, en el que dicho anticuerpo está
unido a una molécula informadora.
17. Utilización de un reactivo según la
reivindicación 16 en un procedimiento para detectar células
tumorales de mamífero resistentes al multifármaco, que comprende
poner en contacto dichas células tumorales o sus lisados con dicho
reactivo y detectar dicha molécula informadora.
18. Composición farmacéutica para tratar células
tumorales de mamífero resistentes al multifármaco, que comprende un
anticuerpo o fragmento determinante de complementariedad según la
reivindicación 4 o un derivado según la reivindicación 6, en un
vehículo farmacéuticamente aceptable; que comprende opcionalmente
además una citotoxina o radioisótopo o ambos, conjugados
covalentemente con dicho mAb de UIC2, fragmento o derivado y/o que
comprende además una cantidad mezclada de un fármaco citotóxico
eficaz para inhibir el crecimiento de células tumorales de
mamífero.
19. Utilización de un anticuerpo seleccionado de
entre un anticuerpo o fragmento determinante de complementariedad
según la reivindicación 4 o un derivado según la reivindicación 6,
para la preparación de un medicamento para su empleo en un
procedimiento para invertir la resistencia al multifármaco de
células tumorales que comprende poner en contacto dichas células
con una cantidad de dicha composición que invierte la resistencia
al multifármaco.
20. Dispositivo de inmunoafinidad que comprende
un anticuerpo seleccionado de entre el grupo constituido por un
anticuerpo o fragmento determinante de complementariedad según la
reivindicación 4 y un derivado según la reivindicación 6, en el que
dicho anticuerpo, fragmento o derivado está inmovilizado en un
soporte sólido.
21. Procedimiento para aislar células de mamífero
resistentes al multifármaco, que comprende las etapas de:
- a)
- puesta en contacto de dicho dispositivo según la reivindicación 20, con el fin de formar un complejo inmovilizado célula-anticuerpo; y
- b)
- recuperación de las células absorbidas de dicho complejo.
22. Procedimiento para aislar un producto del gen
humano mdr1 de una mezcla de biomoléculas, que comprende las
etapas de:
- a)
- poner en contacto dicho dispositivo, según la reivindicación 20, con dicha mezcla de biomoléculas, con el fin de formar un complejo inmovilizado anticuerpo- producto del gen humano mdr1; y
- b)
- recuperar dicho producto del gen humano mdr1 de dicho complejo inmovilizado.
23. Procedimiento de aislamiento de la
P-glucoproteína humana con MDR de una membrana
celular que lleva dicha P-glucoproteína, que
comprende las etapas de :
- a)
- poner en contacto dicha P-glucoproteína con una cantidad eficaz formadora de complejo de un anticuerpo seleccionado de entre un anticuerpo o fragmento determinante de complementariedad según la reivindicación 4 y un derivado según la reivindicación 6, con el fin de formar un complejo P-glucoproteína- anticuerpo, opcionalmente antes o después de solubilizar dicha membrana celular con un detergente, por ejemplo, desoxicolato o N-octilglucósido;
- b)
- separar opcionalmente el complejo P-glucoproteína-anticuerpo del restante material celular solubilizado, en el que dicho complejo solubilizado se separa por adsorción en la proteína A inmovilizada; y
- c)
- recuperar dicha P-glucoproteína de dicho complejo solubilizado; siendo preadsorbido dicho anticuerpo en bolas recubiertas de proteína A antes de ponerse en contacto con la P-glucoproteína celular.
24. Hibridoma que produce un mAb complementario
al epítopo extracelular de la P-glucoproteína, que
es reconocido también por mAb de UIC2 y que es capaz de superar la
resistencia al multifármaco en las células que expresan a Pgp.
25. Equipo comercial que comprende un montaje, en
recipientes independientes, que comprende:
- a)
- mAb de UIC2 según la reivindicación 4;
- b)
- fragmentos de mAb de UIC2 según la reivindicación 4, sin marcar y marcados;
- c)
- derivados de mAb de UIC2 según la reivindicación 6, sin marcar y marcados; y opcionalmente
- d)
- anticuerpos anti-idiotipo de mAb de UIC2 según la reivindicación 14.
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