KR100249294B1

KR100249294B1 - 사람 mdr1 다중약물 내성 유전자 생성물에 대한 단클론성 항체, 및 그것의 사용방법

Info

Publication number: KR100249294B1
Application number: KR1019940703296A
Authority: KR
Inventors: 매쉬트너 유진; 비. 로닌슨 이고르
Original assignee: 질 에이.타르지안; 더 보오드 오브 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 일리노이즈
Priority date: 1992-03-20
Filing date: 1993-03-17
Publication date: 2000-03-15
Also published as: JPH07507202A; AU677221B2; ATE242807T1; AU4808893A; EP0644900A4; CA2132540C; EP0644900A1; DE69333039D1; US5773280A; WO1993019094A1; DE69333039T2; EP0644900B1; KR950700938A; ES2201056T3; CA2132540A1; JP3631750B2

Abstract

본 발명에서는 영장류 세포에서 다중약물내성과 관련된 세포 표면 P-당단백질 항원의 세포외재성 도메인에 대해 특정된 단클론성항체(UIC2 mAb)를 생성하는 하이브리도마들(ATCC 승인번호 HB11207인 UIC2 하이브리도마와 ATCC 승인번호 HB11287인 UIC2/A 하이브리도마)이, 사전에 분리된 사람 mdr1 DNA로 형질전환된 동계 3T3 섬유아세포로 면역된 Balb/c 마우스로부터 유도된 비장 세포와 사람 골수종 세포를 융합시킴에 의해 생성되었다. 그로써 생성된 UIC2 mAb 및 그것의 단편들 및 재조합 유도체들은 다중약물 내성 영장류 세포 및 사람 mdr1 유전자 생성물의 검출 및 분리, 및 다중약물 사람 종양 세포를 포함한 영장류 세포의 다중약물 내성의 역전에 사용될 수 있다.

Description

[발명의 명칭]

사람 MDR1 다중 약물 내성 유전자 생성물에 대한 단클론성 항체, 및 그것의 사용 방법

[배경]

[발명의 분야]

본 발명은 사람 세포에서 다중 약물 내성과 관련된 세포표면 항원에 특이적인 단클론성 항체를 생산하는 하이브리도마에 관한 것이고, 또한 그러한 항체 및 그것의 단편 또는 재조합 유도체들의 사용 방법에 관한 것이다.

[관련기술의 설명]

많은 사람 암들은 상이한 구조 및 상이한 작용 메카니즘을 가지고 있는, 여러 부류의 항암 약물들에 대한 내성을 고유하게 나타내거나 자연스럽게 발생시킨다. 콜히친, 빈블라스틴 및 독소루비신(이전의 일반명은 아드리아마이신임)과 같은 특정 식물의 알카로이드류 또는 항종양 항생물질에 대한 내성을 위해 선택된 배양된 포유동물 세포에서 모방될 수 있는 이 현상은 일반적으로 다중 약물 내성 ("MDR")으로서 언급된다. 이 MDR 표현형은 사람 환자에서 성공적인 암 화학 요법에 대한 주된 장애물이다.

MDR은 대부분의 경우에 원형질막 메카니즘의 변경에 관련된 증가된 약물 유출의 결과로서 감소된 세포내 약물 축적의 결과인 것으로 여겨진다. MDR을 발현하는 돌연변이 세포주가 분리되는 경우, 그것들은 항암 약물의 세포내 축적 수준을 낮게 유지시키는 원형질막에 위치한 ATP-의존성 펌프 메카니즘을 발현하는 것으로 나타난다. 이 메카니즘은 약물의 능동 분출로 구성되는데, 이 약물은 원래 원형질막을 통하여 들어간 것이었다.

이 펌프 시스템을 코드화하는 유전자(때로 다중 약물 운반자로서 언급됨)는 로닌슨(Roninson)등에 의해 배양된 사람 세포로부터 클로닝되었고 (하기 참고문헌 12 참조), 일반적으로 mdr1 또는 MDR1으로 불리운다.¹이 유전자는 여러 부류의 정상 조직에서 발현되지만¹, 이들 조직에서 mdr1 유전자 생성물을 위해 운반되는 생리적 기질은 확인되어 있지 않다.

일반적으로 P-당단백질("P-170", "Pgp")로서 알려져 있는 mdr1 유전자의 단백질 생성물은 상기 언급한 에너지-의존성 유출 펌프를 구성하는 170kDa의 트랜스-원형질막(원형질막-통과) 단백질이다. 세포 표면상에서 Pgp의 발현은 많은 항암제를 포함한 다중 세포독성 약물에 대해 세포가 내성을 띄게 하기에 충분하다. Pgp-중재된 MDR은 상이한 유형의 종양에서 종양 내성의 중요한 임상적 성분인 것으로 여겨지며, mdr1 유전자 발현은 상이한 유형의 암의 화학요법에 대한 내성과 상관관계가 있다.

mdr1 유전자의 서열 분석은 Pgp가 2개의 상동성(43%의 동일성)등분 사이에 분포된 1280개의 아미노산으로 구성됨을 보여준다.¹분자의 각 등분은 6개의 소수성 경막성 도메인을 가지며, 각각은 커다란 세포질 루프내에 ATP 결합 부위를 갖는다. 단지 8% 정도의 분자만이 세포외재성이며, 탄수화물 부분(대략 30kDa)은 이 영역내 부위들에 결합되어 있다.

Pgp에 의한 MDR에서의 중심 역할에 대한 정보가 밝혀짐에 따라, MDR을 역전시키기 위한 잠재력을 가진 제제들은 Pgp를 표적으로 하게 되었다. 칼슘 채널 차단제, 예컨대 베라파밀, 면역억제제, 예컨대 시클로스포린과 스테로이드 호르몬류, 칼모듈린 억제제 및 여러가지 다른 화합물들을 포함한 여러 부류의 약물이 Pgp-운반되는 약물의 세포내 축적과 세포독성작용을 증강시키는 것으로 밝혀 졌다.²이들 제제중 많은 제제가 Pgp에 의한 약물 결합 또는 운반을 억제하는 것으로 밝혀 졌다.³이들 제제중 일부는 그 자체가 Pgp에 결합하여 Pgp에 의해 유출되는 것으로 밝혀졌으며,⁴이러한 사실은 Pgp 기질의 세포독성에 미치는 그것들의 증강 효과가 최소한 부분적으로는, 이 단백질의 기능에 미치는 효과보다는 이 단백질의 약물 결합 부위에 대한 경합에 기인하는 것임을 시사한다.

이들 제제중 어떤 것은 Pgp의 유출 펌프 작용의 특이적 억제제로서의 적용성을 제한할 수 있는, MDR 세포에서 부가적인 세포내 다면발현성(pleiotropic) 효과를 가질 수 있다. 나아가, 임상 시험에서 사용된 공지된 MDR-역전 약물의 대부분은, 그것들의 임상적으로 달성가능한 용량을 제한하는 칼슘 채널 차단(베라파밀) 또는 면역억제(시클로스포린 및 스테로이드)와 같은 Pgp의 억제와 무관한 주요한 부작용을 가진다.

Pgp-MDR을 피하기 위해 항-Pgp 항체들을 사용하는 방법은 항체가 단지 Pgp만을 표적으로 하기 때문에 특이성이 예상되고, 유일한 독성은 혹시 단백질의 투여에 의해 발명할 수 있는 것이다. 나아가, 항체 결합은 경합 억제제의 일시적인 결합보다 더 지속된 억제 효과를 가질 것 같다.

Pgp의 세포외재성 에피토프와 반응하는 항체들만이 무상 세포의 원형질막의 유출 펌프 단백질과 반응하여, MDR에 잠재적으로 영향을 미칠 수 있을 것이다. 즉, MDR을 역전시킬 수 있을 것이다. Pgp의 세포질 부분에 대한 항체들, 예컨대 C219⁵는 MDR의 역전에 유용할 것 같지 않다.

MRK-16 및 MRK-17로 명명된 단클론성 항체들("mAb")은 마우스를 독소루비신-내성 K-562 사람 백혈병 세포로 면역시킴으로써 생성되었고, 두 항체 모두 Pgp를 인식하였다.⁶MRK-16 mAb는 내성 세포에서 빈크리스틴과 악티노마이신 D 운반을 조절하였고, MRK-17 mAb는 내성 세포의 성장을 특이적으로 억제하였다. MRK-16 mAb는 무모 마우스에서 이종 이식편으로서 성장한 사람 MDR 세포주(결장암)에 대한 빈크리스틴의 생체내 독성을 증가시켰다.⁷그러나, MRK-16 mAb에 의한 약물 세포독성의 시험관내 상승작용은 Pgp 작용의 공지된 화학적 억제제에 비하여 약하였고, 독소루비신에 의한 세포 독성에는 영향을 미치지 않고, 단지 2개의 Pgp 기질(빈크리스틴과 악티노마이신 D)만으로 명백히 제한되었다.⁶약물 내성 사람 난소암 세포 2780^AD로 미리 접종된 무흉선증 마우스들을 MRK-16 mAb로 처리함으로써 피하 종양의 퇴행이 유발되었다.⁸MRK-16의 가변 영역을 사람 항체의 Fc부분과 조합시킨 재조합 키메라 항체는 시험관내에서 세포독성을 증가시킴에 있어서 모MRK-16 mAb보다 더 효과적인 것으로 보고되었다.⁹

Pgp의 외부 에피토프를 인식하는 단클론성 항체 HYB-241 및 HYB-612는, 종양 세포에서 빈크리스틴과 악티노마이신 D의 축적을 증가시키고, 베러퍼밀과 이들 약물의 조합물의 세포독성을 증가시키는 것으로 보고 되었다.¹⁰

MAb657로 불리는 마우스 lgG_2amAb는 mdr1 유전자-발현세포 및 MDR 사람 세포와 반응하는 것으로 보고되었다.¹¹비록 이 mAb가 사람 말초혈 림프구에 의해 중재되는 세포독성에 대한 MDR 세포의 감수성을 증가시키는 것으로 알려져 있지만, Pgp의 약물 유출 펌프 기능에 억제 효과를 미치는지에 대해서는 알려져 있지 않다.

하기의 발명의 상세한 설명에서 상세하게 설명되는 바와 같이, MDR 세포로부터 로다민 123 유출의 억제에 미치는 효과, 세포 성장 및 콜로니 형성에 미치는 빈블라스틴의 효과의 강화, 독소루비신의 세포독성 효과의 강화, 에피토프 특이성 및 세제 감수성을 포함한 본 발명의 mAb의 효과는, MRK-16, HYB-241 및 HYB-612 mAb의 효과와 많은 면에서 구별될 수 있다.

무상 세포의 표면상에 있는 사람 Pgp의 세포외재성 도메인을 인지하고, 사람 종양세포로부터 항암 약물의 Pgp-중재된 유출에 강력한 억제 효과를 나타내며, 사람 Pgp 시스템에 의해 운반되는 광범위한 세포독성 약물에 대한 내성을 역전시키고, 최소한 통상 사용되는 Pgp의 화학적 억제제 만큼 효과가 있지만 바람직하지 않은 부작용이 없는 신규한 단클론성 항체에 대한 중요한 요구가 여전히 존재한다. 본 발명에서는 그러한 특이적 mAb를 생성하는 하이브리도마가 제조되었으며, 이 항체 뿐만 아니라 그것의 단편 및 재조합 유도체의 성질 및 용도를 하기에서 설명한다.

[발명의 요약]

본 발명은 "UIC2"로 언급되는 신규한 하이브리드 연속 세포주 (ATCC 수탁번호 HB11027) 및 서브세포주 UIC2/A (ATCC 수탁번호 HB11287)와, 이들 하이브리도마에 의해 생성되며, Pgp 약물 유출 기능을 강력히 억제하여 사람 MDR 세포에서 항암 약물의 가능한 세포독성을 증가시키는 사람 MDR 트랜스-원형질막 Pgp의 세포외재성 에피토프에 대한 신규한 mAb("UIC2 mAb"라 칭함)를 포함한다.

본 발명의 한 측면에 있어서는, UIC2 하이브리도마가 제조된다.

본 발명의 다른 측면에 있어서는, UIC2/A로 칭해지며 단백질 비함유 성장 배지에서 성장하는 UIC2 하이브리도마의 서브세포주가 제조된다.

본 발명의 또 다른 측면에 있어서, UIC2 mAb가 제조되며, 이 mAb는 표적 항원이 사람 mdr1 유전자에 의해 코드화된 사람 세포 표면 Pgp인 전술한 특성을 가진다.

본 발명의 또 다른 측면에 있어서는, UIC2 mAb의 단편들이 개시되는데, 이것들은 상보성-결정 중쇄 및 경쇄 그리고 그것의 가변 및 불변 영역을 포함한다.

본 발명의 또 다른 측면에 있어서, UIC2 mAb의 재조합 유도체가 개시되는데, 이것들로는 UIC2 mAb의 특이성을 가지는 재조합 항체들, 예컨대 인간화된 mAb, 이중기능성 mAb, 분리된 V_H및 V_L항체 영역들, V_H및 V_L항체 영역들을 함유한 선형 mAb 사슬, 이들 분자들의 단편들, 및 그러한 재조합 유도체를 코드화하는 cDNA가 있다.

본 발명의 또 다른 측면에 있어서는, UIC2 mAb가 결합하는 Pgp의 에피토프 부위에 상보적인 UIC2 mAb상의 부위에 대한 항-이디오타입 항체를 제조하기 위해서 뿐만 아니라, 항-항-이디오타입 항체를 제조하기 위해 UIC2 mAb가 사용된다.

본 발명의 또 다른 측면에 있어서는, UIC2 mAb가 결합하는 Pgp의 세포외재성 에피토프 부위(들)을 확인하기 위한 방법들이 제공되며, 그런 에피토프 부위들로부터의 아미노산 서열은 UIC2 mAb의 결합 특성 및 기능적 특이성을 가지는 항체를 생성시키기 위해 사용된다.

본 발명의 또 다른 측면에 있어서는, UIC2 mAb, 또는 그것의 단편 또는 재조합 유도체를, 다중 약물 내성 영장류 종양세포를 진단하거나 분리하기 위해, 및 생체분자들의 혼합물로부터 사람 mdr1 유전자의 유전자 생성물을 분리하기 위하여 사용하는 방법들이 제공된다.

본 발명의 또 다른 측면에 있어서는, 본 발명의 UIC2 mAb, 그것의 단편 또는 재조합 유도체를, 다중 약물 내성 종양을 가진 환자의 면역치료요법 및 Pgp의 약물-유출 효과를 역전시키기에 유용한 약학 조성물에서 포함하는 시약들이 제공된다.

이들 및 다른 측면들은 발명의 상세한 설명 및 첨부되는 특허청구의 범위를 참조로 명백해질 것이다.

[도면의 간단한 설명]

제1도는 UIC2 mAb로 P-당단백질을 면역침전시킨 결과를 나타낸다. 다중 약물-내성 BALB/c 3T3-1000 세포로부터의 P-당단백질을 UIC2 mAb, MRK-16 mAb 또는 UPC10(lgG_2a대조군)으로 면역침전시키는 것은 실시예 7에서 설명되는 대로 수행하였다. UIC2 mAb와 MRK-16 mAb에 특이적인 170-180kDa 밴드는 화살표로 표시한다.

제2도는 CEM/VLB₁₀₀(A) 및 K562/inf(B) 다중 약물-내성 세포로부터의 형광성 P-당단백질 기질 로다민 123의 유출에 미치는 mAb UIC2의 효과, 및 로다민 123 유출에 미치는 항-lgG 또는 항-lgM 항혈청과 UIC2 mAb의 선흡착의 효과(c)를 나타낸다.

제3도는 UIC2 mAb에 의한 빈블라스틴 세포독성의 강화작용을 도시한다.

제4도는 UIC2 mAb에 의한 상이한 약물의 세포독성 효과의 강화작용을 도시한다.

제5도는 UIC2 및 UIC2/A 세포 배양물로부터의 배양 상층 유체에 존재하는 미정제된 mAb 및 정제된 mAb의 SDS-PAGE 분석 결과를 도시한다.

[발명의 상세한 설명]

공동 계류중인 로닌슨 등(Roninson et al.)의 미국특허출원 일련번호 제622,836호는 사람 mdr1 유전자로부터 전사된 사람의 성숙한 mRNA와 특이적으로 혼성화하는 분리된 사람 mdr1 유전자의 서열을 개시하고 있으며, 이를 본원에 참조로서 편입한다.¹²상기 논의된 바와 같이, 이 사람 mdr1 유전자에 의해 코드화된 폴리펩티드는 P-당단백질로, Pgp 또는 P-170으로도 언급된다. 모두 30kDa의 탄수화물을 포함한, 이 단백질의 단지 작은 부분(약 8%)만이 세포외재성인 것으로 여겨진다.¹

공동계류중인 USSN 제622,836호에서, 사람 mdr1 유전자에 의해 코드화된 Pgp에 대한 다클론성 및 단클론성 항체들은 유전자 서열로부터 추론된 화학적으로 합성된 Pgp 단편들로, 또는 원핵 또는 진핵 발현시스템에 의해 생성된 Pgp로 동물을 면역화시킴으로써 생성된다. 본 발명에서는, 다중 약물 내성 사람 세포의 특이적으로 트랜스펙션되고 과잉발현되는 세포주가, 사람 다중 약물 내성 세포상의 특이적 세포외재성 Pgp 에피토프에 대한 mAb를 생성하는 하이브리도마를 제조하기 위한 면역원으로서 사용된다.

본 발명에 있어서, 다중 약물 내성은 하기의 세포독성 약물들 : 빈블라스틴, 빈크리스틴, 독소루비신, 콜히친, 악티노마이신 D, 에토포시드, 탁솔, 푸로마이신, 및 그라미시딘 D에 대한 교차-내성으로서 규정된다.

상기한 바와 같이, 사람 mdr1 유전자 생성물 Pgp의 세포외재성 도메인 내의 에피토프에 대한 UIC2 mAb는, 마우스를 면역시키기 위한 1차 면역원으로서, 상기 언급된 공동계류중인 USSN 제622,836호의 분리된 사람 mdr1 cDNA로 트랜스펙션시킴으로써 MDR로 만들어진 세포를 사용하는 방법에 의해 제조된다.¹²BALB/c 마우스들의 면역화를 위한 면역원 세포는 바람직하게는 트랜스펙션된 동질유전자 마우스 섬유아세포, 즉 트랜스펙션된 BALB/c 마우스 3T3 섬유아세포이다. 마우스 BALB/c 3T3 섬유아세포들의 MDR 유도체들은 포유동물 발현 벡터, 바람직하게는 본 발명자들 중 한 사람에 의해 개발된 pUCFVXMDR1 플라스미드를 사용하여 사람 mdr1 cDNA로 생성된다. MDR 표현형은 대부분의 고도의 내성 세포에서 불안정하기 때문에, 약물의 부재하에 성장하는 세포들은 감소된 내성을 나타낼 것이다. 그러므로, 선택을 위해 사용될 약물의 유지농도, 예컨대 20㎍/㎖의 빈블라스틴을 함유하는 성장 배지중에서 트랜스펙션된 세포를 유지시키는 것이 바람직하다.

트랜스펙션 후에, 트랜스펙션된 mdr1 유전자가 증폭되어 있는 3T3 BALB/c 섬유아세포 유도체가, 트랜스펙션된 세포들이 내성을 보이는 약물의 점진적으로 더 높은 농도에서 연속적인 선택 단계에 의해 제조된다. 이 과정은 다량의 Pgp를 발현하는 고도로 다중 약물 내성인 3T3 BALB/c 섬유아세포의 선택과 세포의 원형질막 안으로의 이러한 분자의 삽입을 가능하게 한다. 세포들은 250ng/㎖, 500ng/㎖ 및 1000ng/㎖의 약물중에서 섬유아세포 배양물의 연속적인 인큐베이션에 의해 빈블라스틴에 대한 바람직한 내성에 대해 선택될 수 있다. 편리를 위해, 그러한 세포들은 각각 BALB/c 3T3-250, BALB/c 3T3-500 및 BALB/c 3T3-1000으로 표시된다. 가장 높은 수준의 mdr1 유전자 생성물을 발현하는 BALB/c 3T3-1000 선택 세포가 숙주 BALB/c 마우스들의 면역화에 매우 바람직하다.

사람 mdr1 cDAN로 트랜스펙션된 마우스 세포들(예컨대 BALB/c 3T3 세포들)은 동질유전자(예컨대 BALB/c ) 마우스들의 면역화를 위해 사용된다. 적정수의 세포가 당해 기술분야에 인지되어 있는 면역화 프로토콜에 의해 피하로 (s.c.) 또는 복강내로 (i.p.) 주입된다. 전형적으로 10⁵내지 10⁸의 트랜스펙션된 세포들이 2주 간격으로 5회 또는 6회 주입되며, 최종 추가면역은 예를 들면 10⁶세포의 피하 및/또는 정맥내 주입으로 이루어진다. 추가면역 주입 후 적절한 시간 경과 후에, 전형적으로는 3일 내지 5일 후에 과면역 마으스로부터 비장을 취하고, 사람 골수종 세포, P3-X63-Ag 8.653(ATCC, Rockville, MD, USA)을 사용하여 표준 방법에 의해 하이브리도마를 생성시킨다.

각각의 하이브리도마 배양물로부터의 세포외재성 유체를 종래 방법들, 예컨대 사람 Pgp를 발현하지 않는 대조 세포(즉, 비-트랜스펙션된 BALB/c 3T3 섬유아세포) 및 유리 슬라이드에 고정된 사람 Pgp-발현 세포(즉, BALB/c 3T3-1000), 및 2차 리포터 항체로서 FITC-표지된 염소 항-마우스 다가 면역글로불린(Sigma Chem. Co., St. Louis, MO, USA)을 사용하는 간접 면역형광법으로 스크리닝하여 특이적 mAb를 제조한다. 특정 스크리닝 방법이 항-사람 mdr1 Pgp mab를 검출할 수 있는 한 중요하지 않다. 그러나, 세포가 스크리닝 동안에 투과성이 되지 않아서 세포외재성 단백질 도메인과 반응하는 항체들만이 검출되는 것이 중요하다.

안정한 하이브리도마는 종래 방법에 의해, 예컨대 종점 희석에 의한 서브클로닝의 계속적인 반복 및 단클론성 항체에 대한 배양 배지의 스크리닝에 의해 확립될 수 있다. 하이브리도마는 예컨대 동질유전자 동물에서 생체내 복수액에서의 성장에 의해 증식되고, 분비 항체는 lgG 이소타입에 대해 특이적인 세파로오스-단백질 A 매트릭스를 이용한 친화성 크로마토그래피에 의해 복수액으로부터 분리되고 정제된다. 당해 기술분야에 잘 알려져 있는 면역글로불린 정제에 관한 다른 방법들, 예를 들면 제2항체에 대한 mAb의 최대 흡착의 조건(예컨대 얼음-조 온도)하에서 친화성-정제된 염소 항-마우스 lgG에 대한 흡착에 의한 방법이 또한 사용가능하다.

단백질 비함유 배양 배지에서 성장하는 UIC2 하이브리도마의 서브세포주들은, 그 이외의 단백질 완전 비함유 세포 성장 배지에서 우태아 혈청의 농도를 점차적으로 0%로 감소시킴에 의해 제조될 수 있다. 단백질 비함유 성장 배지에서 적절한 시간동안 인큐베이션한 후, 세포들은 예컨대 미소적정 플레이트 웰에서, 단백질 비함유 배지중에서 웰당 세포 하나로 연속 희석시킴으로써 클로닝된다. 클론들은 항체 생성에 대해, 예컨대 BAlb/C-3T3-1000 또는 K562/inf 세포들의 간접 면역형광 표지화에 의해 시험된다. mAb 생성을 가장 강력히 나타내는 클론들을 배양 플라스크에 옮겨서 HEPES 완충액이 첨가된 지브코(Gibco) HPFW 배지와 같은 단백질 비함유 세포 성장배지에서 증식시킨다. 그러한 선택된 클론들은 또한 회전병에서 배양될 수 있고, 그 결과 UIC2 mAb의 산업적 규모 제조에 유용한 정제된 mAb의 고항체 역가가 유발된다.

상기 언급한 하이브리도마에 의해 제조되는 mAb 뿐만 아니라, 후술하는 그것의 단편 및 재조합 유도체들은 당해 기술분야에 인지되어 있는 이중 면역확산 오크털로니법(Ouchterlony) 및 마우스 lgG 서브부류-특이적 항혈청을 사용하는 면역블롯팅 시험에 의해 면역글로불린 이소타입인 것으로 특정지어질 수 있다.

MAb, 그것의 단편들 및 재조합 유도체들은 어떠한 편리한 기술, 예컨대 간접 면역형광 면역표지화와 그후의 항체-세포 상호작용의 검출에 적당한 어떠한 기술, 예컨대 유동 세포계산 분석법 또는 현미경법에 의해서 상이한 Pgp-발현 세포주와의 반응성에 대해 특성확인될 수 있다. 다른 면역 세포화학 기술도 또한 사용될 수 있다.

MAb, 그것의 단편들 및 재조합 유도체들은 면역침전 방법에 의해 MDR 세포에서 Pgp와의 결합에 대해 시험될 수 있다. 예를 들어, MDR 세포들(예컨대 5-10×10⁶세포들)은 방사성 필수 아미노산, 예컨대³⁵S-메티오닌 등과 함께 인큐베이션되어 (예컨대 37℃에서 10-18시간동안) Pgp 단백질을 방사성으로 표지화할 수 있다, 그런 다음 표지된 세포들은 세포상의 결합 부위가 포화될 때까지 정제된 항체 제제와 함께 인큐베이션된다. 그런 다음 세포들은 원형질막 밖으로 Pgp를 용해시키지만, Pgp로부터 mAb를 분리시키지 않는 세정제로 용해된다. 내인성 세포성 프로테아제에 의한 단백질 가수분해를 억제하기 위하여, 0.1mM 페닐메틸술포닐 플루오라이드 ("PMSF")와 같은 프로테아제 억제제가 세정제에 첨가될 수 있다. 다양한 세정제들이 세포의 원형질막 밖으로 Pgp를 용해시키는데 사용될 수 있지만, UIC2 mAb에 대해 매우 바람직한 것은 데옥시콜산(0.2-1%)인데, 왜냐 하면 이것은 mAb-Pgp 복합체를 분리시키지 않기 때문이다. MAb-Pgp 복합체는 어떠한 편리한 흡착법, 예컨대 이(lgG-타입) mAb의 고정된 단백질 A와의 면역흡착법에 의해 용해물로부터 분리될 수 있다; 고정된 단백질 A는 lgG 면역단백질에 대한 특이적 흡착제이다. 그런 다음 MAb-Pgp 복합체들은 SDS-PAGE에 의해 분리될 수 있으며, mAb-함유 부위들은 예컨대 알칼리성 포스파타아제등(Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA)과 같은 리포터 분자에 컨쥬게이션된 표지 염소 항-마우스 lgG 항체를 사용하는 웨스턴 블롯팅에 의해 검출될 수 있다. 사람 mdr1 유전자 생성물의 제조적 분리는 유전자 생성물에 대한 흡착제가 본 발명의 고정된 항체인 유사한 기술에 의해 수행될 수 있다.

Pgp 기능에 미치는 항-Pgp mAb, 그것의 단편 또는 재조합 유도체의 효과는, mAb의 존재 또는 부재하에 MDR 세포로부터 형광성 또는 방사성 표지된 약물의 유출을 연구함으로써 검정될 수 있다. 바람직한 검정법¹⁵에서, Pgp를 발현하는 포유동물 세포들의 현탁액(예컨대 10⁵내지 10⁷세포)은, 얼음조 온도에서 혈청 비함유 완충 배지중의 시험 항체 제제와 함께 인큐베이션된다.

그런 다음 처리된 세포들은 얼음-조 온도에서 염료와의 인큐베이션에 의해 마아커 염료, 예컨대 로다민-123("Rh123")(0.1-10.0㎍/㎖) 또는 독소루비신(1-10uM)으로 로딩된다. 그런 다음 염료-로딩된 세포들은 37℃에서, 바람직하게는 세포 표면 Pgp의 항체로의 포화를 유지시키기 위하여 상기 언급한 배지중의 항체 제제와 함께 인큐베이션되고, 염료의 유출은 유동 세포 계산-형광법에 의해 세포에 의한 염료 보유를 검정함으로써 측정한다.

약물 세포독성에 미치는 본 발명의 항체 제제의 효과는 항체 제제와 함께 MDR 및 대조 세포의 현탁액을 인큐베이션한 후, 빈카(vinca) 알카로이드류중 하나와 같은 항암 약물의 부재 및 존재하에 콜로니 형성, 평판 효율, 및/또는 MTT 성장 억제 검정으로 세포 성장 억제에 대해 시험함으로써 평가될 수 있다.^13,16BALB/c 3T3-1000 섬유아세포들은 평판 효율 검정에 특히 적당하고 MDR 세포주 K562/inf는 성장 억제 검정에 대하여 특히 적당하다. 약물 세포독성에 미치는 항체 제제의 효과는 세포 현탁액을 정제된 항체 제제와 함께 인큐베이션하고, 미소적정 플레이트 웰에서 세포를 평판배양시켜 항체 제제의 존재하의 콜로니 또는 성장 억제 검정함으로써 검정될 수 있다.

보체 중재된 세포독성을 유도하는 본 발명의 항체 제제의 능력은 예컨대 토끼 혈청으로부터 얻어지는 보체를 사용하여 당해 기술분애에 인지된 검정법에 의해 시험될 수 있다.¹⁷

본 발명에 따르면, 사람 mdr1 Pap 면역원에 대한 mAb가, UIC2 하이브리도마의 제조와 관련하여 상기 논의된 마우스 생체내 면역화-비장 세포-사람 골수종 방법에 대체하는 다른 방법들에 의해 제조될 수 있다. 한 구체예에서, 사람 mdr1 유전자를 발현하는 세포를 사용한 비장내 면역화가 하이브리도마의 제조를 위해 면역된 비장세포를 제조하기 위해 사용될 수 있다(참조 : 예컨대 참고문헌 18, 이를 본원에 참조로서 편입함).

다른 구체예에서, 시험관내 면역화는 사람 mdr1 유전자를 발현하는 세포를 비장세포 배양물에 넣고, 적당한 기간, 전형적으로는 1주일이 지난후, 마우스 또는 사람 골수종 세포와의 세포 융합을 수행하여 하이브리도마를 제조하는 방식으로 수행될 수 있다(참조 : 예컨대 참고문헌 19, 이를 본원에 참조로서 편입함).

본 발명의 UIC2 하이브리도마에 의해 생성된 mAb (하기 실시예 3 참조)외에, 이들 세포로부터 유도된 유전 정보는 진단 및 치료적 이용 둘다에 유용한 재조합 유도체 항체를 제조하기 위해 사용될 수 있다. 그러한 재조합 유도체들은 참고문헌 20(이를 본원에 참조로서 편입함)에 개설된 바와 같이 유전공학 기술분야에 공지된 방법들을 통해 쉽게 제조될 수 있다.

바람직한 방법에서, UIC2 mAb의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역들을 코드화하는 폴리누클레오티드 서열들은, 해당하는 사슬들의 불변 영역으로부터 유도된 프라이머들을 사용한 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 제조된다.²¹

UIC2 하이브리도마 세포주로부터 추룰된 게논 DNA는 PCR에 대한 주형으로서 사용된다. 또는 달리, 표준방법²²에 의해 UIC2 하이브리도마의 mRNA로부터 합성된 cDNA가 PCR에 대한 주형으로서 사용될 수도 있다. PCR에 의해 증폭된 UIC2 mAb의 V_H및 V_L영역들은 직접 또는 적당한 벡터에 클로닝된 후에 서열화된다. 유도된 서열 정보는 V_H및 V_L영역들이 항체 특이성의 모든 결정기를 포함하고 있기 때문에 매우 중요하며, 그것은 표준 유전공학 기술들에 의해 다른 항체 또는 다른 재조합 분자들로 전달될 수 있다. UIC2 mAb의 중쇄 및 경쇄를 코드화하는 cDNA는 또한 cDNA 라이브러리를 제조하고, 그 라이브러리를 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 불변영역에 해당하는 통상적으로 입수가능한 프로브로 스크리닝함으로써 분리될 수 있다.

UIC2 mAb의 특이성을 가지는 재조합 항체를 얻기 위하여, 상기 언급한 분리된 V_H및 V_LcDNA 서열들이 발현 벡터안에 삽입되고, 그 벡터안에서 서열들은 사람 또는 마우스 면역글로불린 사슬들의 해당하는 불변 영역에 대한 cDNA 서열들과 프레임적으로 결합된다. 예를 들어, M13 파지 벡터 M13-VHPCR1 및 M13-VKPCR1²¹은 키메라 사람-마우스 중쇄 및 경쇄 항체 사슬을 제조하기 위해 사용될 수 있다. 그러한 키메라 항체들은 진단 또는 치료 목적으로 환자에게 생체내 투여하기 위한 항체로서 완전히 마우스에서 유도된 항체들보다 바람직하다. UIC2 mAb의 가변 영역과 스플라이싱될 불변 영역들의 선택은 재조합 항체의 의도된 용도에 의해 특정된다. 따라서, 사람 감마 1 이소타입은 표적 세포의 보체-중재되고 세포-중재된 사멸에서 효과적인 항체를 유도할 것이다.^17,23대조적으로, 감마 4 이소타입의 불변 영역은 항체가 진단 용도(생체내 영상화와 같은)에 사용되거나 다른 유형의 세포독성을 유도하지 않으면서 P-당단백질 운반 약물의 세포독성 효과를 증가시키기 위해 사용되는 경우에 바람직하다. 또한 항체 "재성형"²⁰즉, UIC2 mAb의 V 도메인의 항원-결합 루프를 클로닝된 사람 항체의 V 영역에 이식하는 것^17,23-26에 의해 UIC2의 특이성을 가지는 "인간화된" 항체를 제조하는 것이 가능하다.

UIC2 mAb의 재조합 유도체들은, 당해 기술분야에서 잘 알려져 있는 원핵(예컨대 박테리아) 또는 진핵(효모, 포유류 또는 곤충) 세포 발현 시스템에서 해당하는 단백질을 다량으로 제조하기 위하여 적절한 발현 벡터내에서 사용될 수 있다.²²

완전한 항체의 항원 특이성을 유지하고 있는 UIC2 mAb의 단편들은 효소적, 화학적 또는 유전공학적 기술에 의해 유도될 수 있다. 예를 들면, 정제된 UIC2 mAb는, 단백질 가수분해 효소들, 예컨대 파파인 또는 트립신으로 부분적으로 소화시킴으로써 단편화될 수 있다.²⁷파파인 소화는 2개의 Fab 단편과 하나의 Fc 단편을 생성시킨다. 정제된 UIC2 mAb는 또한 펩신으로 절단되어 F(ab)₂(함께 결합된 2개의항원-결합 도메인들)가 생성될 수 있다. 그 결과 생성된 UIC2 mAb의 Fab 또는 F(ab)₂단편들은 단백질 A상에서의 크로마토그래피 또는 어떠한 다른 면역화학적 방법(상기 동일)에 의해 잔존 무상 항체 및 Fc 단편들로부터 정제될 수 있다.

UIC2 mAb의 단편들은 또한 UIC2 mAb의 가변(V) 영역들을 코드화하는 분리된 cDNA 서열들을 사용하여, 유전공학 기법에 의해 유도될 수 있다. 따라서, 가변 중쇄(V_H) 영역에 해당하는 단편이 단독으로 P-당단백질에 대한 특이적 고-친화성 결합의 단일-도메인 항체²⁸로서 사용될 수 있다. V_H도메인의 서브 단편들은 또한 항원에 대한 특이적 결합을 위해 사용될 수 있다.²⁰V_H및 가변 경쇄(V_L) 도메인들은 또한 화학적으로 이황화 결합을 통해서²⁹또는 아마도 단일-사슬 F_V단편을 생성하는 소수성 가요성 펩티드를 경유하여 V_H및 V_L도메인들을 유전적으로 연결시킴으로써³⁰, F_V단편들을 제조하기 위해 사용될 수 있다.

불변(Fc) 부분이 없는 UIC2 mAb의 단편들은, 그런 단편들이 개선된 조직 투과성을 가지는 것 같은 한, 완전한 항체보다 생체내 적용에 유리할 수 있다. 나아가, 체내의 많은 세포 및 조직들은 항체의 Fc 부분에 결합할 수 있는 수용체를 발현시켜, 완전한 항체의 바람직하지 않은 비-특이적 결합을 유도한다.

UIC2 mAb, 그것의 상보성-결정 단편 또는 재조합 유도체는 참고문헌 20 및 31(이들을 본원에 참조로서 편입함)에서 개설되는 바와 같이 화학적 또는 유전공학적 기술을 사용하여, 화학요법 약물, 동물 또는 식물 독소, 방사성 동위원소 등과 결합될 수 있다.

UIC2의 특이성 결정 도메인들(예컨대 단일 사슬의 F_V단편)은 또한 특이적으로 Pgp에 결합할 수 있는 재조합 바이러스 입자들을 생성시키기 위해 사용될 수 있다. 그러므로, 상술한 UIC2 mAb의 단일 사슬 F_V단편은 참고문헌 32(이를 본원에 참조로서 편입함)에 기재된 바와 같이, fd 박테리오파지 또는 다른 섬유상 파지의 유전자 III 단백질의 N-말단 영역에 삽입되어, "파지 항체"가 생성될 수 있다. fd 박테리오파지의 유전자 III 단백질은 외래펩티드가 스플라이싱될 수 있는 4개의 부위를 가지는 때문에, 2-기능성 파지 항체가, UIC2 mAb의 이러한 단백질 단편들 및 목적하는 제2특이성을 가지는 다른 몇 개의 단백질의 단편들(항체 단편 또는 효소)을 동시에 삽입시킴으로써 개발될 수 있다. UIC2 mAb의 특이성-결정 도메인들은 또한 몇개의 다른 원핵 또는 진핵 바이러스의 외부 표면성에 발현되는 단백질내로 삽입될 수 있다. 또한 그러한 도메인을 Pgp로 수용체 세포를 표적화시킬 목적으로, 예컨대 대장균의 LamB 단백질³³과 같은, 원핵 또는 진핵 세포의 표면상에서 정상적으로 발현되는 단백질에 삽입시키는 것도 가능하다.

UIC2 하이브리도마는 또한 잡종 2중특이성 항체를 분비할 수 있는 잡종 하이브리도마를 구성하는 데 사용될 수 있다.^20,34한 구체예에서, UIC2 하이브리도마 세포는 종래의 세포 융합 기술을 사용하여, UIC2 mAb와 조합하여 진단 및/또는 치료 목적에 유용할 수 있는 항원에 대한 mAb를 생성하는 다른 하이브리도마 세포주와 융합된다 (상기 항원은 면역화학적 검정법에 사용되는 효소들, 세포독소, 형광 염료등이다). UIC2 하이브리도마 세포는 또한 제2항원으로, 또는 시험관내 활성화된 림프구 또는 림프구성 세포주로 면역된 동물의 비장 세포와 잡종화될 수 있다.³⁵동물(예컨대 마우스, 래트 또는 햄스터) 또는 사람 세포가 잡종 하이브리도마 제조를 위한 융합 파트너로서 사용될 수 있다. 원하는 2-기능성 항체들은 UIC2 mAb 및 파트너 항체로부터 종래 방법들에 의하여 분리될 수 있다.²⁷

본 발명은 기탁된 UIC2 및 UIC2/A 하이브리도마에 제한되는 것은 아니며, 이들 하이브리도마들은 단지 UIC2 mAb와 같이 동일한 에피토프와 경합적으로 상호작용하며 기능이 상기 규정되고 하기 실시예에서 설명되는 UIC2 mAb의 기능적 동등물인 Pgp 세포외재성 에피토프-특이적 mAb를 생성하는 하이브리도마를 예시하고자 하는 것이다.

UIC2 mAb는 또한 당해 기술분야에 잘 알려져 있는 방법들을 사용하여, 특이적 항-이디오타입 항체를 얻기 위한 면역원으로서 사용될 수 있다.³⁶그러한 항-이디오타입 항체들은 UIC2 mAb 항원-결합 부위에 대해 특정될 것이다. 그러나 결합 부위들은 그것들의 구조에서 UIC2 mAb와 반응성인, 즉 UIC2 mAb와 상보성인 Pgp의 에피토프와 흡사할 수 있다. UIC2 mAb의 항-이디오타입 항체들 또는 그것의 유도체 또는 단편들은 MDR 종양에 대한 숙주 반응을 자극하는 방법과 같이, Pgp에 대한 면역 반응을 유도하는 백신 제제로서 유용할 것이다. 나아가, 항-이디오타입 항체들은 또한 항-항-이디오타입 항체들을 얻기 위한 면역원으로서 사용될 수 있다. 그러한 항-항-이디오타입 항체들은 원래의 UIC2 mAb와 동일한 에피토프 특이성 및 기능적 효과를 갖을 것 같으며, 따라서 그 항체의 유도체로서 간주될 수 있다. 특히, UIC2 mAb의 특이성을 갖는 항-항-이디오타입 항체를 생성하는 사람 세포주들은 확립된 기술을 사용하여 UIC2 mAb에 대한 항-이디오타입 항체로 말초 β-림프구를 시험관내 면역시킴으로써 생성될 수 있다.³⁶이 방법은 UIC2 mAb의 특이성 및 생물학적 효력을 가지는 완전한 사람("인간화된"것이 아닌) mAb를 생성시킨다. 백신으로서의 항-이디오타입 항체들의 유용성, 및 원래의 항체의 항원 특이성과 흡수한 항-항-이디오타입 항체들의 능력은 당해 기술분야에 잘 알려져 있다.³⁷

UIC2 mAb는 그 mAb와는 달리, MDR을 억제 또는 역전시키지 못하는 mAb에 의해 인식되는 에피토프와는 구별되는, Pgp의 특이적 에피토프를 인식한다. UIC2 mAb 에피토프를 포함하는 Pgp의 특정 영역(들)은 사람 Pgp, 특히 Pgp의 세포외재성 도메인 내에 함유된 일련의 짧은 합성 펩티드들과 이 mAb의 반응성을 시험함으로써 확인될 수 있다. 이것에 의해, MRK-16 mAb의 에피토프가 Pgp의 6개의 예상 세포외재성 펩티드 루프의 첫번째 및 네번째 루프에 위치하는 것으로 밝혀졌다.³⁸또는 달리, UIC2 에피토프를 포함하는 단백질 서열들은 적절한 발현 벡터, 예컨대 λgtl1³⁹또는 대장균의 표면 단백질의 LamB와의 융합 단백질의 일부로서 삽입된 펩티드를 발현하는 벡터³³중의 mdr1 cDNA의 짧은 무작위 단편들의 라이브러리를 스크린하기 위한 프로브로서 UIC2 mAb를 사용함에 의해 결정될 수 있다.

또 다른 구체예에서, UIC2 mAb에 대한 에피토프 부위들은, 일련의 트랜스펙턴트 MDR 세포주와 이 mAb의 결합을 시험함으로써 확인될 수 있다. 이때, 트랜스펙턴트 MDR 세포주 각각은 세포외재성 루프에 공지 결실을 함유하는 변이 mdr1 Pgp를 가지고 있다. mAb가 특정 Pgp 변이체와 반응하지 못하는 것은, 결실된 펩티드 단편이 UIC2 mAb의 인식 부위의 일부를 구성하거나 형성하는 것을 의미하거나, 그 결실된 펩티드 단편이 인식에 필수적인 구조에 영향을 미치는 것을 의미한다. 일단 에피토프(들)이 상기 언급된 방법에 의해 확인되면, 그러한 부위들로부터의 아미노산 서열들이 UIC2 mAb의 특이성을 가지는 추가의 항체들, 바람직하게는 단클론성 항체들을 생성시키기 위해 사용될 수 있다.

본 발명의 UIC2 mAb 또는 그것의 상보성-결정 단편들 또는 재조합 유도체들은 특히 하기 설명되는 바와 같이, MDR 종양을 가진 환자들의 면역진단 및 면역치료에 사용될 수 있다.

면역 진단

UIC2 mAb, 그것의 상보성-결정 단편들 또는 재조합 유도체들은 생체외 또는 생체내 2가지 경우에 MDR 세포의 검출을 위한 특이적이고 민감한 시약으로서 사용될 수 있다.

MDR 세포의 확인 및/또는 정량을 위한 직접 면역 검정 방법에서, 현탁되거나 고정된(배양 플레이트) 세포들, 또는 조직 단편 또는 다른 세포학적 또는 조직학적 제제들은 리포터 분자로 공유결합적으로 표지된 UIC2 mAb, 그것의 단편 또는 재조합 유도체와 함께 인큐베이션된다. 광범위한 리포터 분자들이 면역학 분야에 공지되어 있으며, 예로는 플루오로포어, 크로마겐, 화학발광제, 효소, 아비딘-비오틴 시스템, 및 방사성 원자 등이 있다. 결합을 최대화하기 위한 인큐베이션 조건은 과도한 실험을 수행하지 않아도 선택될 수 있다. 전형적으로 완충약중의 세포들은 저온(예컨대 4℃)에서 표지된 항체와 함께 30 내지 60분 동안 인큐베이션된다. 세포-표지된 항체 복합체의 분리 및 세척 후에, 표지는 당해 기술분야에 인지된 기술들에 의해 검출되거나 정량된다. 또는 달리, 1차 항체(즉, UIC2 mAb, 단편 또는 유도체)는 표지되지 않고, 검출은 표지된 2차 시약, 예컨대 리포터 분자와 컨쥬게이션된 항-면역글로불린 항체 또는 F(ab)₂단편에 의하여 수행된다.

또는 달리, MDR 세포들은 면역형광 현미경법에 의해 검출된다. MDR 세포를 함유하거나 MDR 세포를 함유하는 것으로 추정되는 세포 현탁액을 환자로부터 얻어서 플라스틱 배양 접시에서 성장시킨다. 그런 다음 세포들을 최대 결합 조건하에서 본 발명의 UIC2 mAb, 단편 또는 재조합 유도체와 접촉시킨다. 그런 조건은 과도한 실험없이 쉽고 통상적으로 결정가능하다. 고정된 세포-항체 컨쥬게이트를 완충액으로 세척하여 결합되지 않은 물질을 제거한 후, 컨쥬게이트를 플루오로포어-표지된 제2항체 (예컨대 로다민-표지된 염소 항-마우스 lgG)와 접촉시킨다. 그런 다음 세포를 세척하고, 포르말린 또는 다른 적절한 고정제에서 고정시킨 후, 형광 현미경법으로 조사한다.¹⁵형광의 양 및 결론적으로 샘플에 존재하는 MDR 세포의 수는 표준 영상-분석 기기를 사용하여 정량될 수 있다. UIC2 mAb의 단편 또는 재조합 유도체가 사용되는 경우에는, 적절한 제2항체가 사용되어야만 할 수도 있다.

본 발명의 UIC2 mAb, 상보성-결정 단편들 및 재조합 유도체들은 또한 MDR 세포를 함유하는 것으로 추정되는 종양 단편의 면역세포화학적 염색을 위해 당해 기술 분야에 인지되어 있는 방법들에서 사용될 수 있으며, 상기 방법은 동일 슬라이드 상에서 mdr1 폴리누클레오티드 프로브와의 인사이투(in situ) 혼성화와 조합될 수 있다 (참조 : 예컨대 참고문헌 40, 면역세포화학적 방법을 본원에 참조로서 편입함).

면역 치료

본 발명의 한 구체예에서, UIC2 mAb, 또는 그것의 상보성-결정 단편 또는 재조합 유도체는 약제학적으로 허용가능한 부형제(그러한 부형제류는 참고문헌 41에 기재되어 있으며, 이를 본원에 참조로서 편입함)에 담겨서 적절한 경로, 예컨대 비경구 경로에 의하여 대상 영장류에게 투여될 수 있다. 치료 효과는 그러한 항체 제제의 MDR 종양 세포를 표적화하는 능력, 그런 세포의 표면 Pgp 분자의 세포외재성 도메인에 강력하게 결합하는 능력, 및 그로써 이 경막 단백질에 의해 유도되는 약물 유출 메카니즘을 억제하는 능력을 토대로 한다. 이런 치료 방식에서, 항암 약물은 본 발명의 항체 또는 항체-세포독소 복합체와 동시에 또는 연속적으로 투여될 수 있다.

다른 구체예에서, 항체 또는 그것의 단편 또는 재조합 유도체는 약제학적으로 허용되는 부형제내에 담겨서 MDR 종양을 가지고 있는 환자에 투여되어, 보체-중재되거나 항체-중재된 세포독성을 항체 분자의 이펙터 부분을 통하여 종양에 유도한다.

제3구체예에서, 항체 제제는 먼저 독소루비신와 같은 세포독성제 또는 방사성 동위원소, 또는 둘다와 공유결합적으로 컨쥬게이션된 후, 컨쥬게이트는 약제학적으로 허용되는 부형제내에 담겨서 MDR 종양을 가진 대상 영장류에 투여된다. 이 구체예는 항체가 MDR 세포를 표적화하고, 항체가 약물의 Pgp-중재된 유출을 억제하며, 세포독소가 표적화된 세포를 파괴하는 조합된 치료 효과를 나타낸다.

UIC2 mAb 또는 그것의 유도체를 사용하여 MDR 종양 세포를 선택적으로 파괴하는 상기 기술된 방식은 생체내 투여에 대해서 뿐만 아니라, 생체외 화학요법에 대해서도 사용될 수 있다. 생체외 화학요법은 예를 들어 자가 골수 이식을 포함하는 암 치료 프로토콜에서 환자의 골수로부터 종양 세포를 제거할 수 있는 수단으로서 사용될 수 있다. 즉, 환자의 골수의 샘플을 신체로부터 취해서, 그 현탁액을 MDR 세포를 파괴하기 위하여 UIC2 mAb 또는 상기 언급한 세폭독성 유도체 중 하나로 처리한 후, 처리된 골수를 환자에게 되돌린다.

사용자의 편리를 위해서, 상업적 키트가 조립될 수 있다. 그러한 키트들은 별도의 용기에 UIC2 mAb; 표지되지 않았거나 리포터 분자로 표지된 UIC2 mAb 단편들; 표지되지 않았거나 리포터 분자로 표지된 UIC2 mAb의 재조합 유도체들; 및 UIC2 mAb 항-이디오타입 항체들을 포함할 수 있다.

하기 실시예는 본 발명의 바람직한 구체예들을 제공하나, 첨부되는 특허청구의 범위에 기재된 본 발명의 범위를 어떤 방식으로든 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.

[실시예 1]

다중 약물 내성 세포주

mdr1 경막 Pgp를 발현하는 마우스 섬유아세포 BALB/c 3T3 세포들을 진핵 발현 벡터 pUCFVXMDR1¹³중의 분리된 사람 mdr1 cDNA¹²로 섬유아세포를 트랜스펙션시키고, 20ng/㎖의 빈블라스틴에서 다중 약물 내성 세포를 분리하고, 계속해서 250ng/㎖, 500ng/㎖ 및 1000ng/㎖의 빈블라스틴에서 연속적인 단계로 선택하여 트랜스펙션된 유전자를 증폭시킴으로써 유도하였다. 그 결과 생성된 다중 약물-내성 섬유아세포를 각각 BALB/c 3T3-250, BALB/c 3T3-500 및 BALB/c 3T3-1000으로 명명하였다.

K562/inf 세포주를, 사람 mdr1 cDNA⁴²를 가지는 재조합 레트로바이러스 pLMDR1L6으로 사람 K562 백혈병 세포를 감염시키고, 계속해서 세포독성 선택없이 서브클로닝함으로써 유도하였다.

LRMN1 세포주를 사람 mdr1 cDNA 및 neo(G418 내성) 유전자를 발현하는 플라스미드 pUCFVXMDR1/neo 로 CHO LR73 섬유아세포 세포주를 트랜스펙션시킨 후, G418로 선택하고 증가된 Rh123 의 유출에 대해 트랜스펙턴트들을 개별적으로 시험함에 의해 얻었다.

콜히친 또는 빈블라스틴으로 다단계 선택함에 의해 사람 KB-3-1 암종 세포로부터 분리된 MDR 세포주 KB-8, KB-8-5, KB-8-5-11 및 KB-V1을 미국 메릴랜드주 베데스다에 소재한 내셔날 인스티튜티스 오브 헬쓰(National Institute of Health)의 마이클 엠. 고츠맨(Michael M. Gottesman) 박사로부터 얻었다.

KB-GRC1 세포들은 pUCFVXMDR1¹³에 의한 트랜스펙션 및 콜히친을 이용한 선택에 의해 KB-3-1로부터 유도하였다.

빈블라스틴을 사용한 다단계 선택에 의해 사람 CEM 백혈병 세포로 부터 유도되는 CEM/VLB₁₀₀세포들은 미국 테네시주 멤피스에 소재한 세인트 쥬디스 칠드런스 호스피탈(St. Jude's Children's Hospital)의 더블유. 티. 벡크(W.T.Back) 박사로부터 얻었다.

마우스 J774.2 대식세포 세포주의 빈블라스틴- 또는 콜히친-선택된 MDR 유도체들인 J7-V2-1, J7-V3-1 및 J7-C1-100을 미국 뉴욕주 브롱크스에 소재한 알버트 아인슈타인 컬리지 오브 메디신(Albert Einstein College of Medicine)의 에스. 비. 호르비츠(S.B.Horwitz) 박사로부터 얻었다. 이들 세포주들은 조합하여 세개의 모든 마우스 mdr 유전자들, 즉 mdr1a, mdr1b 및 mdr2를 과잉 발현한다.⁴³

[실시예 2]

단클론성 항체들

MRK-16 mAb(lgG_2a)를 일본 도쿄 대학의 티.쯔루오(T.Tsuruo) 박사로부터 얻었다. HYB-241 및 HYB-612 mAb(lgG₁)은 엘. 리트맨-그라우어(L.Rittmann-Grauer) 박사(Hybritech Corp., San Diego, CA)로부터 얻고, mAb C219(lgG_2a)는 미국 펜실바니아주 멜버른에 소재한 센토코어(Centocor)로부터 얻었다.

모든 mAb 샘플들은 SDS-PAGE에 따르면 최소한 95%로 순수하였다. mAb의 농도를 정량적 마우스 lg 방사 면역확산 키트(ICN, Costa Mesa, CA)에 의해 측정하였다. 필요에 따라 mAb를 추가로 농축하고 인산염-완충 염수(PBS) 또는 둘베코 변형 이글스 배지(DMEM)에 대해 투석하였다.

[실시예 3]

UIC2 하이브리도마의 유도

BALB/c 마우스들을 실시예 1로부터 얻은 1-2×10⁷의 BALB/c 3T3-1000 세포로 s.c. 및/또는 i.p. 로 2주 간격으로 6회 주입함으로써 면역시켰다. 최종 추가 면역은 2×10⁷세포로 i.p. 로 및 5×10⁶세포로 i.v.로 수행하였다. 섬유아세포를 마지막으로 투여하고 4일 후에, 한 동물로부터 비장을 취하고, 당해 기술분야에 공지된 기술들에 의해 P3-X63-Ag8.653 사람 골수종 세포들과의 하이브리도마를 생성시켰다. FITC-표지된 염소 항-마우스 다가 면역글로불린들(Sigma Chem. Co., St. Louis, MO)을 1 : 100 희석으로 제2항체 시약으로서 사용하였다.

개별적인 하이브리도마로부터의 조직 배양 상층 유체를, 유리 슬라이드에 부착된 살아있는 BALB/c 3T3 및 BALB/c 3T3-1000 세포의 간접 면역 형광 표지화에 의해 mAb 생성에 대해 스크리닝하였다. 시험된 556개의 하이브리도마중에서, 단지 2개의 하이브리도마에 의해 생성된 mAb만이 BALB/c 3T3-1000 세포와 반응하였고, 이들 2개의 하이브리도마중에서 한개(UIC 2로 명명함)만이 BALB/c 3T3-1000 세포와 반응하나 대조 BALB/c 3T3 세포와는 반응하지 않는 항체를 생성하였다.

UIC2 mAb를 분비하는 안정한 하이브리도마 세포주를, 종말점 희석에 의한 서브클로닝과 상층 유체의 스크리닝을 3회 연속 실시함으로써 확립하였다.

UIC2 하이브리도마를 동질유전자 BALB/c 마우스들에서 복수액으로서 증식시키고, 면역글로불린을 세파로오스-단백질 A(Bio-Rad, Richmond, CA) 친화성 크로마토그래피에 의해 복수액으로부터 정제하였다. SDS-PAGE에 의해 시험한 UIC2 mAb는 최소한 95%로 순수한 lgG이었다. UIC2 하이브리도마는 미국 메릴랜드주 록빌에 소재한 아메리칸 타입 컬춰콜렉션(ATCC)에 기탁되어 있고(수탁번호 HB11027), 본 특허가 허여된 후에는 취소할 수 없으며 제한이나 조건없이 일반인이 이용할 수 있을 것이다.

항-마우스 lg 항체의 표준 세트를 사용한 오크털로니 및 면역블롯팅 시험의 적용으로, UIC2 mAb가 lgG_2a하위부류에 속하는 것을 알 수 있다.

보체-중재된 세포독성을 유도하는 UIC2 mAb의 능력은 BALB/c, BALB/c 3T3-1000, CEM, CEM/VLB₁₀₀, K562 및 K562/inf 세포주들에 대하여 Low-Tox-M 토끼 보체 (Cedarlane Labs, Hornby, Ontario, Canada)로 시험하였다.

[실시예 4]

사람 mdr1 유전자 생성물과 UIC2 mAb의 반응성

간접 면역형광 표지화

UIC2 mAb를 먼저 면역형광 염색법에 의해 다양한 Pgp-발현 세포주와의 반응성에 대해 시험하였다. 시험한 세포주들 및 그 결과를 하기 표 1에 나타냈다.

[표 1]

UIC2 mAb는 사람 mdr1 cDNA로 트랜스펙션되고 세포독성 선택으로 분리되거나 세포독성 선택없이 분리된 사람 또는 설치류 세포를 포함한, 사람 mdr1 유전자를 발현하는 모든 시험된 사람 세포주 뿐만 아니라, Pgp를 발현하는 것으로 알려져 있는 CV1-COS 그린 원숭이 세포와 반응하였으나, 그들의 약물-감수성 모세포주 또는 어떠한 Pgp-네가티브 세포주와도 반응하지 않았다. UIC2 mAb 면역염색의 세기는 상이한 세포주에서 약물 내성의 공지 수준과 상관관계가 있었다. UIC2 mAb는 3개의 마우스 mdr 유전자 각각에 의해 코드화된 Pgp들을 발현하는 마우스 J774.2 세포의 MDR 유도체들과 반응하지 않았고, 이러한 결과는 UIC2 mAb 반응성이 영장류-특이적임을 의미한다.

상기한 바와 같이, K562/inf 세포들은 세포독성 선택의 부재하에 mdr1 유전자의 레트로바이러스 전달 및 서브클로닝에 의해 제조되었다. 이 세포주와 UIC2 mAb의 반응성은, UIC2 mAb가 mdr1 유전자 생성물과 반응하지만, 세포독성 스트레스에 의해 생성된 일부의 다른 세포 마아커와는 반응하지 않는다는 강력한 증거를 제공한다.

[실시예 5]

면역침전법에 의한 Pgp의 분리

트랜스펙션된 MDR 세포들(5-10×10⁶)을 10% FCS가 첨가된 메티오닌 비함유 DMEM중의³⁵S-메티오닌(ICN) 50μCi/㎖로, 10 내지 18시간 동안 37℃에서 7% CO₂중에서 대사적으로 표지하였다. 세포를 PBS로 세척한 후, 1시간 동안 실온에서 PBS 2.6㎖ 중의 UIC2 mAb와 인큐베이션하였다. 그런 다음 세포를 세척하고 용해시켰다(PBS 중의 0.2% 데옥시콜산 및 0.2mM PMSF로 2~4분 동안). 용해물을 마이크로퓨즈에서 15분 동안 4℃에서 원심분리함으로써 맑게하였다. 상층 유체를 고정된 단백질 A 비드(Repligen Cambridge, MA)와 1시간 동안 4℃에서 일정하게 회전시키면서 인큐베이션하였다. 단백질 A는 lgG 항체에 대한 일반적인 흡착제이다. 침강된 비드를 용해 용액으로 5회 세척한 후에, 비드들을 40㎕의 SDS-PAGE 샘플 완충액에 넣고, SDS-PAGE 중의 면역침전된 단백질을 방사성 및 분자량에 대하여 SDS-PAGE (7.5%)로 검정하였다.

이들 실험은 UIC2 mAb가 MDR 세포에서 발현된 170-180KDa의 단백질을 인식하였음을 보여주었다. 이 단백질은 동일 조건하에서 Pgp-특이적 MRK-16 mAb에 의해 면역침전된 단백질과 SDS-PAGE 상에서 동시 이동하였고, 이는 UIC2 mAb에 의해 인식된 항원이 사람 Pgp 임을 입증한다(제1도).

UIC2 mAb와의 면역침전은 Pgp-함유 원형질막이 데옥시콜산염으로 용해되는 경우 가장 성공적이었다; 세정제 CHAPS에 의해 용해는, MRK-16 mAb에 의한 효과적인 Pgp의 면역침강을 가능하게 하긴 하지만, Pgp의 UIC2 mAb 와의 반응성을 효과적으로 소멸시켰다. 이러한 결과는 UIC2 mAb 및 MRK-16 mAb가 세정제에 대해 상이한 감수성을 가지는 Pgp 상의 상이한 에피토프들을 인식한다는 것을 시사한다. UIC2 mAb는 MRK-16 mAb와 같이, Pgp가 이 단백질의 세포내이지만 막에 위치하지 않은 에피토프를 인식하는 C219 mAb에 의해 검출될 수 있는 조건하에서 웨스턴 블롯상의 변성된 Pgp와 반응하지 않았다. N-옥틸글루코시드(1%, 뵈링거-만하임)는 UIC2 mAb를 사용한 면역침전에 대해서 효과적이긴 하였지만, 데옥시콜산염보다 효과가 적었다.

상술한 분리 과정은 융통성이 있다. 예를 들면, 당업자는 용해전에 Pgp-발현 표적 세포를 트립신으로 처리하고, 그것을 세정제 용액으로 용해시킨후, 항체 및 단백질-A 비드로 처리할 수 있다. 상기한 바와 같이, 단백질 A는 lgG 항체들에 대한 일반적인 흡착제이다. 또는 달리, 항체로 예비코팅된 단백질-A 비드를 사용하는 것도 가능하다. 시간 및 농도 파라미터들도 또한 융통성이 있다. 동물 또는 사람 기원의 세포주를 포함하여 어떤 세포주이든지 사람 Pgp를 발현하면, 표적 세포주로서 사용될 수 있다.

[실시예 6]

UIC2 단클론성 항체에 의한 보체 중재된 세포독성의 강화

UIC2 mAb를 다중 약물-내성 BALB/c 3T3-1000 세포를 파괴하는 능력에 대하여 당해 기술분야에서 공지된 보체-중재된 세포독성 검정법에 의해 시험하였다. 반복된 실험에서, 그런 세포들의 70 내지 80%가 UIC2 mAb에 의해 죽었다.

[실시예 7]

UIC2 mAb에 의한 형광 화합물의 Pgp-중재된 유출의 억제

MDR 세포들로부터 형광 화합물의 유출에 미치는 mAb의 효과를 유동 세포계산 검정법에 의해 연구하였다.^15,44이 검정법에서는, 10⁶의 현탁세포를 혈청 비함유 배지 3~5㎖ 중에 20㎍/㎖로 존재하는 상이한 mAb 제제들과 30분 동안 0℃에서 인큐베이션한 후에, 2회 세척하고 0.5~1.0㎍/㎖의 Rh123으로 10분 동안 또는 5μM의 독소루비신으로 1시간 동안 냉각시키면서 로딩하였다. 로다민 123(Rh123)은 미토콘드리아 형광 염료이다. MAb(20㎍/㎖)를 또한 37℃에서 유출 기간중에 염료 비함유 배지에 첨가하였다; 이 온도에서 Pgp는 세포밖으로 Rh123을 유출시킨다. 유출후 염료 보유는 형광 유동-세포계산법에 의해 측정하였다.

MDR 세포로부터 Pgp-운반 염료의 유출에 미치는 UIC2 mAb의 효과를 측정하였다. 제2a도의 실험에서는, CEM/VLB₁₀₀세포에 10㎍/㎖의 Rh123을 로딩하고 염료 비함유 배지중에서 30분 동안 37℃에서, UIC2 mAb, MRK-16 mAb 또는 UPC10(대조 lgG_2a)의 존재하에 인큐베이션한 후, 세포들을 유동 세포계산법에 의해 분석하였다; 세포 형광은 로그 규모로 도표화한다. 제2b도의 실험에서는, K562/inf 세포들을 1㎍/㎖의 Rh123으로 얼음상에서 로딩하고, 제2a도의 실험에서와 같이 인큐베이션하되, 단 유출시간은 40분으로 하였다. 제2c도의 실험에서는, K562/inf 세포로부터 Rh123 유출을 제2b도의 실험에서 처럼(유출시간은 절반으로 하였다), 대조 lgG_2amAb(UPC10), UIC2 mAb, 또는 항-마우스 lgG 또는 항-마우스 lgM 흡착제로 예비흡착된 UIC2 mAb의 존재하에 분석하였다.

흡착 실험에서는, 20㎍/㎖의 UIC2 mAb를 친화성-정제된 염소 항-마우스 lgG 또는 항-마우스 lgM과 공유결합된 0.3㎖의 아가로오스 비드(Sigma)와 함께 1시간 동안 인큐베이션한 후, 흡착된 물질을 원심분리에 의해 제거하였다. UPC10 항체 (대조 lgG_2a)를 UIC2 및 MRK-16 mAb에 대한 이소타입 대조군으로서 사용하였다; 정제된 전 마우스 lgG를 HYB-241 및 HYB-612 mAb에 대한 대조군으로 사용하였다.

UIC2 mAb는 0℃에서 MDR 세포에서 Pgp-운반 염료 Rh123의 축적을 변경시키지 못하였다. 그러나, 20㎍/㎖의 농도에서, 이 mAb는 UPC10 lgG_2amAb로 처리된 대조 표준에 비해, CEM/VLB₁₀₀및 K562/inf 세포주로부터 37℃에서 Rh123의 결과적인 유출을 상당히 억제하였다 (제2a도, 제2b도).

아주 대조적으로, 동일한 조건하에서, MRK-16 mAb는 Rh123의 유출을 억제하지 못하였다 (제2a도, 제2b도). 세포표면 사람 Pgp를 인식하는 것으로 알려져 있는 2개의 다른 mAb 제제들, 즉 HYB-612 및 HYB-241은 또한, UIC2, MRK-16, HYB-241 및 HYB-612 항체에 의해 시험된 모든 세포주들의 면역형광 염색의 세기가 본질적으로 동일할지라도, Rh123 유출에 대해 효과를 나타내지 못하였다. 20㎍/㎖의 UIC2 mAb의 농도는 모든 시험된 세포주에 대해 포화농도인 것으로 밝혀졌다.

K562/inf 세포(제2c도) 및 CEM/VLB₁₀₀세포로부터의 Rh123 유출에 미치는 UIC2의 억제 효과는, 항-마우스 lgG로 예비-흡착시킨 후에 소멸되었지만, 대조 항-마우스 lgM 흡착제를 사용하여서는 그렇지 않았다. 이러한 결과는 Rh123 유출의 억제의 원인이 되는 물질이 항체였고, 비-lgG 오염물이 아니었음을 증명한다.

동일 유형의 검정법은 UIC2 mAb가 K562/inf 세포로부터 형광 항암약물, 예컨대 독소루비신의 유출을 감소시킴을 보여주었다.

[실시예 8]

UIC2 단클론성 항체에 의한 다중 약물 내성의 역전

모든 약물을 시그마사로부터 얻었다. 단, G418은 깁코(Gibco) 사에서, 그리고 탁솔(taxol)은 에스. 비. 호르비츠(S. B. Horwitz) 박사로부터 얻었다. 세포 성장 억제에 대한 콜로니 형성 및 MTT 검정은 당해 기술분야에 공지되어 있는 과정에 의해 수행하였다. 약물 세포독성에 미치는 mAb의 효과는 현탁액중에서 성장하는 세포들 또는 트립신 처리된 단층 세포들을 DMEM에 대해 사전에 투석하여 놓은 정제된 mAb와 함께 30분 동안 실온에서 인큐베이션함으로써 검정하였다. 세포들을 mAb의 존재하에 6-웰 조직배양 플레이트(Falcon Plastics, 콜로니 검정용으로 200-250 세로/휄, MTT 검정용으로는 400-450 세포/웰)에서 3중으로 평판배양하였다. K562/inf 세포의 MTT 검정을 위해서는, 96-웰 플레이트를 4중으로 사용하였다. 10%의 열-비활성화 FCS가 첨가된 DMEM을 모든 검정에 사용하였다.

항암 약물인 빈블라스틴에 대한 2개의 다중 약물 내성 세포주의 내성에 미치는 UIC2 mAb의 효과를 2가지의 상이한 검정 시스템, 즉 세포 성장 및 콜로니 형성으로 시험하였다.

제3a도에 기술된 시스템에서는, 상이한 농도의 빈블라스틴에 의한 BALB/c 3T3-1000 섬유아세포의 세포 성장의 억제를 20㎍/㎖의 UIC2 mAb의 존재(--)하에 또는 대조 lgG_2a(UIC10)의 존재(ο--ο)하에 시험하였다. 모든 값을 약물의 부재하에 성장한 UIC10 mAb-처리 BALB/c 3T3-1000 세포에 비교하여 나타냈다. 모든 검정을 3중으로 수행하였다.

제3b도에 설명된 시스템에서, 본 발명자들은 빈블라스틴의 존재하에 BALB/c 3T3-1000 섬유아세포에 의한 콜로니 형성에 미치는 상이한 mAb의 효과를 조사하였다. 세포들(웰당 200)을 350ng/㎖의 빈블라스틴(ID₉₀) 및 20㎍/㎖의 표시된 mAb의 존재하에 6-웰 팔콘 디쉬에서 평판배양하였다. 콜로니들을 메탄올 또는 에탄올로 고정시키고, 제11일째 되는 날 크리스탈 바이올렛으로 염색한 후, 평판 효율에 대해 기록하였다.

제3c도에 기술된 시스템에서, 본 발명자들은 빈블라스틴의 부재(ο--ο)하에 또는 350ng/㎖의 빈블라스틴(ID₉₀)의 존재(--)하에 BALB/c 3T3-1000 세포 성장에 미치는 UIC2 mAb의 상이한 농도의 효과를 조사하였다. 모든 값을 빈블라스틴 없이 성장한 대조 UPC10 lgG_2a처리 세포에 비교하여 나타냈다.

제3d도에 기술된 시스템에서, 본 발명자들은 빈블라스틴의 부재(ο--ο)하에 또는 350ng/㎖의 빈블라스틴의 존재(--)하에 BALB/c 3T3-1000 세포 성장에 미치는 베라파밀의 상이한 농도의 효과를 조사하였다.

UIC2 mAb와 UIC10 lgG_2a는 모두 사용전에 혈청 비함유 DMEM 배지로 평형화된 ECCNO-PAC10DG 컬럼(Bio-Rad)을 사용하여 탈염시키고, 큰 부피의 배지 또는 PBS에 대해 투석한 다음, Low Protein Binding 0.2㎛ ACRODISC필터(Gelman Sci. Co)를 통해 여과시켰다.

또 다른 시험 시스템에서는, 현탁 배양물 중에서 성장하는 K562/inf 세포 (실시예 1에서와 같이 다중 약물 내성화)의 빈블라스틴 내성을 세포 생존성 검정으로 시험하였다. 세포들(5×10³/웰)을 4중으로 96-웰 플라스틱 플레이트(Falcon)에서, 증가하는 농도의 빈블라스틴과 20㎍/㎖의 정제된 UIC2 mAb 또는 UIC10 lgG_2a단백질의 존재하에 평판배양하였다. 37℃에서 5% CO₂중에서 6일동안 인큐베이션한 후에 세포 생존성을 MTT 검정을 사용하여 측정하였다.

제3a도에 도시된 바와 같이, UIC2 mAb의 첨가는 빈블라스틴에 의한 BALB/c 3T3-1000 세포의 세포 성장의 억제를 강력하게 강화시켰고, ID₅₀값을 650ng/㎖로부터 150ng/㎖로 감소시켰다. 빈블라스틴의 부재하에 UIC2 mAb는 세포 성장에 영향을 나타내지 않았다.

제3b도는 데이타는 UIC2 mAb가 20㎍/㎖에서 350ng/㎖의 빈블라스틴(하기 세포주에 대한 ID₉₀에 해당함)의 존재하에 BALB/c 3T3-1000 세포에 의한 콜로니 형성을 완전히 억제하였음을 예시하고 있다. 대조적으로, 3개의 다른 공지된 항-Pgp mAb들 (MRK-16, HYB-241 및 HYB-612)은 동일 농도에서 세포 성장 또는 콜로니 형성에 전혀 유의적인 효과를 나타내지 않았다(제3c도).

3T3-1000 세포에서 350ng/㎖ 의 빈블라스틴의 세포독성에 미치는 UIC2 mAb의 강화 효과는 약 1㎍/㎖ 정도의 낮은 농도에서도 검출가능한 것이 되었고, UIC2 mAb는 10㎍/㎖에서 모든 세포 성장을 완전히 억제하였다(제3c도). 특성이 잘 알려져 있는 Pgp의 화학적 억제제인 베라파밀은 3×10^-6M 정도의 높은 농도에서만 빈블라스틴 독성을 동일하게 강화시켰다(제3d도).

UIC2 mAb는 또한 K562/lnf, KB-GRC1 및 KB-V1을 포함한 다른 모든 시험된 세포주들에서 약물 내성의 수준을 상당히 감소시켰다.

이들 발견은 UIC2 V_H및/또는 V_L영역을 함유하고 있는 UIC2 mAb, 이의 단편 또는 재조합 유도체들이 다중 약물 내성의 극복에 사용될 수 있음을 나타낸다.

[실시예 9]

MDR에 미치는 UIC2 mAb의 다면발현성 효과

실시예 8에서 관찰된 세포독성에 미치는 UIC2 mAb의 강화 효과가 빈블라스틴으로 예시되는 Pgp-운반 약물의 특정 서브세트에 제한되는지를 결정하기 위하여, 본 발명자들은 MDR 세포가 내성인 것으로 알려져 있고 상이한 세포독성 메카니즘을 가지고 있는 것으로 알려져 있는 9개의 약물을 이러한 시스템에서 비교하였다.

제4도의 막대들은 20㎍/㎖ 의 UIC2 mAb (중실(solid) 막대) 또는 UIC10 lgG_2a대조군(사선 막대)의 존재하에 BALB/c 3T3-1000 세포의 생존성(MTT 검정에 의해 측정됨)을 나타낸다. 3중 검정의 평균값이 도시되어 있다; 각 평균값에 대한 SD_mean은 20% 보다 작았다. 세포 생존성을 약물의 부재하에 성장한 대조 세포의 세포 생존성과 비교하여 나타내었다. 예비 측정된 ID₅₀값에 해당하는 약물 농도는 다음과 같았다; 빈블라스틴, 0.73μM; 빈크리스틴, 3.2μM; 콜히친, 1μM; 탁솔, 1.6μM; 독소루비신, 0.4μM; 에토포시드, 2.23μM; 악티노마이신 D, 0.06μM; 푸로마이신, 37.5μM; 그라미시딘 D, 4.1μM; 메토트렉세이트, 0.04μM; G418, 96μM; 겐타마아신, 24μM.

BALB/c 3T3-1000 세포에 대한 ID₅₀에 해당하는 약물 농도에서, 20㎍/㎖의 UIC2 mAb는 MDR세포가 교차내성인 것으로 알려져 있는 약물들; 빈블라스틴, 빈크리스틴, 콜히친, 탁솔, 독소루비신, 에토포시드, 악티노마이신 D, 푸로마이신 및 그라미시딘 D중 어느 하나의 존재하에 세포 성장을 크게 감소 시켰다(제4도). UPC10 대조군과 비교하여 UIC2 mAb에 의한 세포 성장의 억제는 콜히친의 경우 68%로부터 빈블라스틴, 독소루비신, 악티노마이신 D, 및 탁솔에 대해서는 100%까지의 범위였다. 유사한 실험을 ID₂₀값에 해당하는 약물 농도에서 수행하였을 때, UIC2 mAb는 모든 시험된 약물에 대해 97% 내지 100%로 세포 성장을 억제하였다 (데이타는 비도시). UIC2 mAb는 MDR 세포가 교차-내성을 보이지 않는 5개의 세포독성 약물, 즉 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실, 시스-플라티눔, G418 및 겐타마아신의 ID₅₀용량에 대한 세포 반응에 아무런 효과도 나타내지 않았다 (제4도).

그러므로, UIC2 mAb의 세포독성-강화 효과는 Pgp 기질에 특이적이라고 결론지을 수 있다.

[실시예 10]

UIC2 mAb 에피토프

상기 실시예 5에서 UIC2 mAb 및 MRK-16 mAb는 동일한 세정제에 대한 각각의 에피토프 복합체의 반응의 차이에 의해 서로 구별될 수 있는 것으로 증명되었다.

상기 실시예 7 및 8에서는 UIC2 mAb가 Pgp의 약물 유출 기능을 효과적으로 억제하는 반면, MRK-16, HYB-241 및 HYB-612와 같은, Pgp상의 세포외재성 에피토프에 대한 다른 공지의 단클론성 항체들은 이러한 특성을 나타내지 않는 것으로 증명되었다.

UIC2 mAb의 에피토프 영역을 다른 상기 언급한 단클론성 항체의 에피트프 영역과 더욱 구별하기 위하여, 네덜란드 암스텔담에 소재한 네덜란드 암 연구소의 에이. 쉰켈 및 피. 보스트(A. Schinkel and P. Borst) 박사는 본 발명자들과의 공동연구에서, 쉰켈 및 보스트 박사에 의해 정상 mdr1 cDNA, 결실을 함유하고 있는 mdr1 cDNA, 또는 mdr1 cDNA와 밀접하게 관련되어 있지만 세포에 약물 내성을 부여하지 않는 mdr2/mdr3 유전자의 cDNA로 트랜스펙션된 세포주와 UIC2 mAb, MRK-16 mAb, HYB-241 mAb, 및 HYB-612 mAb의 반응성을 비교하였다.

트랜스펙션된 세포와 단클론성 항체의 반응성은 표준 면역세포화학 방법으로 상기 두 박사들에 의해 시험되었다. 부착 세포를 트립신 처리에 의해 배양 접시로부터 제거하고, PBS로 1회 세척하여, 유리 슬라이드 위에 점적한 후에, 공기중에서 건조시켰다. 포름알데히드중에서 세포를 고정시키기 위해, 세포를 1분동안 PBS에 의해 실온(RT)에서 재수화시킨 후에, 20분동안 PBS(pH7.2, 7℃)중의 10% 포름알데히드중에서 고정시켰다. 슬라이드를 RT에서 5-10분동안 PBS를 여러번 교환해 주면서 헹구고, 공기중에서 건조시킨 후, -20℃에서 보관하였다. 고정된 세포를 염색하기 위하여, 세포들을 PBS(RT, 10분)에서 재수화시키고, 20분동안 RT에서 1%(w/v)의 BSA와 정상 염소 혈청(1 : 1000)이 첨가된 PBS중에서 인큐베이션한 후, 과잉 유체를 블롯팅에 의해 제거한 다음, 세포를 PBS중의 8㎍/㎖의 mAb와 접촉 (2시간, RT)시켰다. PBS로 2회 세척한 후, 세포들을 30분동안 RT에서 PBS/BSA중에 1 : 50 으로 희석된 FITC-표시된 염소-항-마우스 lgG(Tago, Burlingame, CA)와 인큐베이션하고, PBS로 2회 세척한 후에, 트리스(TRIS) 염기를 사용하여 pH를 8.0으로 한 80%(v/v) 글리세린 /20%(v/v)PBS(글리세린은 약 87% 글리세롤이다)에 넣었다. 그런 다음 염색된 세포들을 형광 현미경으로 검사하였다.

UIC2 mAb는 전길이의 사람 mdr1 cDNA로 트랜스펙션된 세포와 반응하였지만, mdr2/mdr3 cDNA로 트랜스펙션된 tMDR 3.35 세포와는 반응하지 않은 것으로 관찰되었다. 나아가, UIC2 mAb는 사람 mdr1 cDNA의 결실형태를 발현하는 트랜스펙턴트 세포와 반응하지 않았다. 이 결실 형태는 다음의 아미노산 : IFANAGNLEDLMSNITNRSD의 첫번째 세포외재성 루프에 결실이 있는 Pgp를 코드화한다. 대조적으로, MRK-16과 HYB-241 mAb들은 그러한 결실 트랜스펙턴트들과 반응하였다.

이 결과는 UIC2 mAb에 의해 인식되는 에피토프가 UIC2 mAb와 동일한 생물학적 기능 및 세정제 반응성을 소유하지 않은, 이미 공지되어 있는 항-Pgp 단클론성 항체들에 의해 인식되는 에피토프들과 구별된다는 것을 가리킨다.

그러므로, UIC2 mAb 에피토프를 인식하는 다른 단클론성 항체들도 또한 Pgp 펌프를 억제할 수 있을 것이라고 예상된다. 그러한 단클론성 항체들은 상기 제시한 아미노산 내에 결실을 함유하는 Pgp를 코드화하는 mdr1 cDNA로 트랜스펙션된 세포와 반응하지 않는 능력과 결합된, 전길이의 사람 mdr1 cDNA로 트랜스펙션된 세포와 반응하는 능력에 의해 쉽게 확인될 수 있다.

[실시예 11]

UIC2/A 하이브리도마의 유도

UIC2/A (ATCC No. HB11287)로 명명된 UIC2 하이브리도마의 서브세포주를 원래의 성장 배지(10% 우태아 혈청(FCS) 및 페니실린-스트렙토마이신이 첨가된 DMEM)를 HPFW(Gibco) 단백질 비함유 배지로 점차적으로 교체시킴으로써 모배양물로부터 개발하였다.

UIC2 세포를 먼저 10% FCS가 첨가된 HPFW 배지상에서 25㎖ 플라스크(Falcon) 내에서 배양하였다. FCS의 농도를 점점 0%로 감소시켰다. 단백질 비함유 배지에서 1달동안 배양한 후에, 거의 모든 세포는 플라스크 표면에 부착되면서 성장 능력을 상실하였고, 8-20 세포로 구성되는 클러스터의 형태로 현탁 배양물로서 성장하고 있었다. 그 시점에서, 세포들을 96-웰 플레이트에서 단백질 비함유 배지로 웰당 세포 1개로 연속 희석함으로써 클로닝하였다. 각 웰로부터의 상층 유체를, Balb/c 3T3-1000 또는 K562/lnf 세포의 간접 면역형광 표지화(상기 실시예 3 참조)에 의해 항체 생성에 대해 시험하였다. 가장 강력한 면역형광 신호를 제공한 클론을 25㎖ 플라스크에 옮기고, 세포주를 증식시켰다. 이 세포주(UIC2/A)를 현탁 배양물로서 25㎖, 75㎖ 및 175㎖ 플라스크내의 HPFW 배지에서 계대시켰다. 25mM의 HEPES를 첨가하는 경우, UIC2/A는 회전병에서 배양될 수 있었고, 그 결과 고항체 역가가 발생하였다.

UIC2/A에 의해 생성된 mAb의 특이성은 모UIC2에 의해 생성된 mAb의 특이성과 동일하였다. 이것을 K562, K562/lnf, Balb/c-3T3, Balb/c 3T3-1000, KB-3-1, KB-8, KB-8-5, 및 KB-V-1을 포함한 여러개의 P-당단백질 포지티브 및 네가키브 세포주들에 대한 간접 면역형광 시험에 의해 증명하였다. UIC2/A mAb에 대한 이소타입은 lgG_2a였고, 이것은 모 mAb와 같다.

제5도는 UIC2 또는 UIC2/A 하이브리도마 세포주에 의해 분비된 단백질의 SDS-PAGE 분리를 도시한다. 도면의 레인 M은 분자량 마아커들로 구성된다 (200,116,97,66 및 45 kDa, BioRad). 레인 1-4는 단백질 A 친화성 컬럼상에서 정제된 면역글로불린을 함유하는데 (레인 1-3에서는 1.2㎍의 단백질, 레인 4에서는 0.4㎍), 이러한 면역글로불린은 UIC2 하이브리도마의 복수액으로부터 회수한 후(레인1), 10% 우태아 혈청(FCS)을 함유한 배지에서 성장한 UIC2 세포의 조직 배양 상층 유체로부터 회수한 후(레인 2), 및 단백질 비함유 배지에서 성장한 UIC2/A 하이브라도마 세포의 조직 배양 상층 유체로부터 회수한 후(레인 3 및 4)의 것들이다. 레인 5-8은 UIC2/A 세포의 조직 배양 배지 상층 유체로부터의 분획화되지 않은 단백질을 보여 주는데, 이것은 AMICON Centriprep 100 농축 장치를 사용한 원심분리에 의해 농축되고 다음 양으로 전기영동되었다 : 레인 5, 50㎍; 레인 6, 25㎍; 레인 7, 12.5㎍; 레인 8, 6.25㎍. 레인 9는 UIC2/A 하이브리도마 배양물의 상층 유체로부터의 미정제 및 미농축 단백질 4㎍을 함유한다.

제5도의 데이타는 UIC2/A 세포 배양 배지에 존재하는 mAb가 정제하지 않아도 약 80% 순수한 lgG 였음을 보여준다 (레인 5-8). 단백질- A 친화성 칼럼상에서의 1단계 정제후에, UIC2/A mAb의 순도는 약 100% (레인 3 및 4)였는데, 이것은 모UIC2 세포에 의해 생성된 유사하게 정제된 mAb의 순도(레인 1 및 2)와 유사하다. UIC2/A 배양물로부터의 상층 유체중의 항체의 농도는, 친화성 정제 및 SDS-PAGE 후 측정된 수율을 토대로 하여 200에서 350㎍/㎖사이였다.

현탁액(회전병에서의 영구적인 회전 포함)중에서 성장하는 UIC2/A 세포주의 능력, 생성된 mAb의 고역가, 및 생성되는 소량의 외래 세포외재성 단백질은 이 세포주를 UIC2 mAb의 산업적 규모 제조에 특히 유용하도록 한다. 많은 적용(예컨대 진단, 세포 및 조직의 면역형광 염색, 세포 분리, 면역침전등)에 대해, UIC2/A로부터의 조직 배양 상층 유체들을 정제 또는 농축 없이 사용할 수 있다.

본 발명을 바람직한 구체예에 의해 설명하였지만, 본 발명을 고려할 때 당업자에게는 변형 및 수정이 본 발명에 대해 이루어질 것임이 이해된다. 그러므로, 모든 그러한 균등한 변형 및 수정이 청구되는 본 발명의 범주내에 포함되어야 하는 것으로 의도된다.

참고문헌

Claims

UIC2 하이브리도마(ATCC 수탁번호 HB11027)로 표시되는 잡종 세포주.
제1항에 있어서, 단백질 비함유 배양 배지에서 성장할 수 있는 서브 세포주를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포주.
UIC2/A 하이브리도마(ATCC 수탁번호 HB11287)로 표시되는 잡종 서브 세포주.
UIC2 mAb로 표시되는 제1항의 UIC2 하이브리도마에 의해 생성된 단클론성 항체, 또는 그것의 Fab, F(ab')₂, Fab' 또는 Fv 단편.
UIC2 mAb 및 그것의 Fab, F(ab')₂, Fab' 또는 Fv 단편으로 구성된 군으로부터 선택되며, 리포터 분자에 연결된 항체를 포함하는, 포유류 종양 세포의 다중 약물 내성을 검출하기 위한 시약.
UIC2 mAb 및 그것의 Fab, F(ab')₂, Fab' 또는 Fv 단편으로 구성된 군으로부터 선택된 항체를 약제학적으로 허용되는 부형제중에 포함하는, 포유류 다중 약물 내성 종양 세포의 치료용 약제학적 조성물.
제6항에 있어서, UIC2 mAb 또는 그것의 Fab, F(ab')₂, Fab' 또는 Fv 단편에 공유결합적으로 컨쥬게이션된, 세포독소, 방사성 동위원소 또는 이것들 둘다를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제6항에 있어서, 포유류 종양 세포의 성장을 억제하는데 효과적인 혼합량의 세포독성 약물을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
UIC2 mAb 및 그것의 Fab, F(ab')₂, Fab' 또는 Fv 단편으로 구성된 군으로 부터 선택되며, 고체 지지체에 고정된 항체를 포함하는 면역친화성 장치.
a) 다중 약물 내성 포유류 세포를 제9항의 장치와 접촉시켜, 고정된 세포-항체 복합체를 형성시키는 단계; 및 b) 상기 복합체로부터 흡착된 세포를 회수하는 단계를 포함하는, 다중 약물 내성 포유류 세포를 분리하는 방법.
a) 제9항의 장치를 생체 분자들의 혼합물과 접촉시켜, 고정된 항체-사람 mdr1 유전자 생성물 복합체를 형성시키는 단계; 및 b) 상기 고정된 복합체로부터 상기 사람 mdr1 유전자 생성물을 회수하는 단계를 포함하는, 생체 분자의 혼합물로부터 사람 mdr1 유전자 생성물을 분리하는 방법.
사람 MDR P-당단백질을 운반하는 세포막으로부터 사람 MDR P-당단백질을 분리하는 방법으로서, a) 상기 세포막을 세정제로 용해시키기 전 또는 후에, 상기 세포 P-당단백질을 UIC2 mAb 및 그것의 Fab, F(ab')₂, Fab' 또는 Fv 단편으로 구성된 군으로부터 선택된 항체의 효과적인 복합체-형성량과 접촉시켜서, P-당단백질-항체 복합체를 형성시키는 단계; b) 용해된 세포 물질의 나머지로부터 용해된 P-당단밸질-항체 복합체를 분리하는 단계; 및 c) 상기 용해된 복합체로부터 상기 P-당단백질을 회수하는 단계를 포함하는 방법.
제12항에 있어서, 세정제가 데옥시콜레이트 또는 N-옥틸글루코시드인 것을 특징으로 하는 방법.
제12항에 있어서, 용해된 복합체가 단계 b)에서 고정된 단백질 A에 대한 흡착에 의해 분리되는 것을 특징으로 하는 방법.
제12항에 있어서, 항체가 세포 P-당단백질과 접촉하기 전에 단백질 A-코팅된 비드에 예비 흡착되는 것을 특징으로 하는 방법.
a) UIC2 mAb; 및 b) 표시되지 않은 UIC2 mAb의 Fab, F(ab')₂, Fab' 또는 Fv 단편들과 표지된 UIC2 mAb의 Fab, F(ab')₂, Fab' 또는 Fv 단편들을 별도의 용기에 포함하는 어셈블리지(assemblage)를 포함하는 상업적 키트.
시험관내에서 다중 약물 내성 포유류 종양 세포 또는 그것의 용해물을 제5항의 시약과 접촉시키는 단계; 및 리포터 분자를 검출하는 단계를 포함하는 다중 약물 내성 포유류 종양 세포를 시험관내에서 검출하는 방법.