ES2252764T3 - Anticuerpo monoclonal anti-factor de crecimiento fibroblastico 8. - Google Patents
Anticuerpo monoclonal anti-factor de crecimiento fibroblastico 8.Info
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Abstract
SE DESCRIBE UN ANTICUERPO MONOCLONAL CAPAZ DE UNIRSE ESPECIFICAMENTE A UN FACTOR-8 DE CRECIMIENTO DE FIBROBLASTOS (FGF-8) RELACIONADO CON FACTORES DE CRECIMIENTO DE CELULAS TUMORALES DEPENDIENTES DE HORMONAS COMO CANCER DE PROSTATA Y DE MAMA, E INHIBE LA ACTIVIDAD FGF-8. EL ANTICUERPO MONOCLONAL ES UTIL EN EL ANALISIS DEL PAPEL Y DE LA FUNCION BIOLOGICA DE FGF-8 EN CELULAS TUMORALES DEPENDIENTES DE HORMONAS COMO CANCER DE PROSTATA Y DE MAMA Y PUEDE SER BENEFICIOSO EN EL TRATAMIENTO DE ESTOS CANCERES.
Description
Anticuerpo monoclonal anti-factor
de crecimiento fibroblástico 8.
La presente invención se refiere a un anticuerpo
monoclonal que se une específicamente al factor de crecimiento
fibroblástico 8, presenta una actividad de neutralización, es decir
inhibe la actividad del factor de crecimiento fibroblástico 8, y
por lo tanto resulta útil para el análisis y tratamiento del estado
mórbido de células tumorales humanas cultivadas a través de la
inducción del factor de crecimiento fibroblástico 8.
El factor de crecimiento inducido por andrógeno
(AIGF) es un factor aislado en 1992 a partir de un sobrenadante de
cultivo de la línea celular SC-3 de tumor mamario de
ratón (carcinoma Shionogi 3: J. Steroid Biochem. 27:459,
1987) que muestra un crecimiento dependiente de hormona sexual. El
AIGF es un factor de crecimiento inducido y producido mediante
estimulación con andrógenos y que activa el crecimiento de las
células SC-3 de manera autocrina (Proc. Natl.
Acad. Sci. 89:8928-8932, 1992). Los resultados
de los estudios de clonado génico han revelado que presenta una
homología de entre el 30 y el 40% con la familia FGF a nivel de
aminoácidos y se ha denominado factor de crecimiento fibroblástico 8
(en lo sucesivo, "FGF-8"). Posteriormente, se
clonó el FGF-8 humano a partir de una biblioteca
genómica de placenta humana utilizando el FGF-8 de
ratón como sonda, que coincidía con el FGF-8 de
ratón al 85% a nivel de nucleótidos y al 100% a nivel de
aminoácidos (FEBS Letters 363:226, 1995). Además, Lorenzi y
colaboradores (Oncogene 10:2051, 1995) han descrito la expresión de
ARNm y la localización cromosómica del factor de crecimiento
fibroblástico 8 y dan a conocer su secuencia aminoácida predicha.
Se ha supuesto que los factores de crecimiento inducidos por
hormona sexual mostrarían un papel autocrino en tumores tales como
el cáncer prostático y el cáncer de mama, que muestran crecimiento
dependiente de hormona sexual, y el aislamiento y clonado del
FGF-8, aunque en un sistema de ratón, constituye la
primera evidencia de que existe dicho mecanismo. Es probable que
FGF-8 también desempeñe un papel en la
carcinogénesis y el crecimiento tumoral en el ser humano a través
de un mecanismo similar, aunque todavía no se ha obtenido evidencia
clara de ello. Sin embargo, debido a que la expresión del ARNm de
FGF-8 puede encontrarse en varias líneas celulares
tumorales humanas de cáncer prostático y de cáncer de mama y a que
puede observarse la aceleración del crecimiento celular cuando se
añade FGF-8 expresado en células CHO al sistema de
cultivo de estas líneas celulares o a una línea celular de
fibroblastos (FEBS Letters 363:226, 1995), resulta muy
posible que el FGF-8 sea uno de los factores de
crecimiento que actúa sobre los tumores dependientes de hormona
sexual de manera autocrina o paracrina.
Por lo tanto, un anticuerpo específico para
FGF-8 resulta útil en el análisis del papel y
función biológicos del FGF-8 en las células
tumorales anteriormente indicadas y también en el diagnóstico del
cáncer prostático, del cáncer de mama y similares mediante
detección inmunológica. Además, aparentemente el anticuerpo que
presente actividad de neutrali-
zación resultaría útil en el estudio de las actividades biológicas del FGF-8 y efectivo en el tratamiento de los cánceres.
zación resultaría útil en el estudio de las actividades biológicas del FGF-8 y efectivo en el tratamiento de los cánceres.
Hasta el momento no se ha dado a conocer el
aislamiento de un anticuerpo monoclonal específico para
FGF-8.
Un objetivo de la presente invención es
proporcionar un anticuerpo monoclonal que se una específicamente a
FGF-8 e inhiba la actividad del mismo y que
posiblemente sea un factor de crecimiento dependiente de hormona de
tumores tales como el cáncer prostático y el cáncer de mama.
Los inventores de la presente invención han
obtenido un anticuerpo monoclonal mediante la preparación de
hibridomas con un péptido parcial de FGF-8 como
inmunógeno, estableciendo una cepa hibridoma capaz de producir un
anticuerpo monoclonal que se une específicamente al péptido,
cultivando el hibridoma en un medio o administrándoselo a un animal
con el fin de inducir un tumor ascites y después recoger el
sobrenadante del cultivo resultante o el líquido ascítico. Un
ensayo de transferencia Western con el anticuerpo monoclonal ha
confirmado que el anticuerpo puede unirse a la proteína
FGF-8 al añadirlo a un caldo de cultivo de línea
celular SC-3 de tumor mamario de ratón capaz de
mostrar crecimiento dependiente de hormona sexual y ha confirmado
que el anticuerpo monoclonal puede inhibir la actividad de
FGF-8, es decir, neutraliza a
FGF-8.
Éste y otros objetivos de la presente invención
se han conseguido con un anticuerpo monoclonal que se une
específicamente a FGF-8 e inhibe la actividad del
FGF-8.
De esta manera, de acuerdo con una forma de
realización, la presente invención se refiere a un anticuerpo
monoclonal que reconoce específicamente el péptido que presenta la
secuencia aminoácida SEC ID nº 1 como epítopo e inhibe la actividad
del factor de crecimiento fibroblástico 8. El anticuerpo monoclonal
de la invención se une específicamente al factor de crecimiento
fibroblástico 8.
Dicho anticuerpo puede obtenerse mediante
inmunización de un animal con un inmunógeno que comprende el péptido
que presenta la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 1.
De acuerdo con una forma de realización
particular, el anticuerpo monoclonal de la invención es KM1334 de
la subclase IgG1 producido por el hibridoma FERM
BP-5451.
De esta manera, la presente invención también se
refiere a un hibridoma, en particular a FERM
BP-5451, que produce el anticuerpo monoclonal de la
invención.
La presente invención se refiere además a un
procedimiento para producir un anticuerpo monoclonal de la
invención, procedimiento que comprende cultivar dicho hibridoma y
recuperar el anticuerpo monoclonal producido de esta manera.
Además, la presente invención también se refiere
al anticuerpo monoclonal de la invención para la utilización en el
diagnóstico o la terapia, en particular a su utilización para la
preparación de un agente diagnóstico para detectar
inmunológicamente el factor de crecimiento fibroblástico 8, para la
preparación de un agente para diagnosticar el cáncer o para la
preparación de un agente para tratar el cáncer, especialmente el
cáncer prostático o el cáncer de mama.
La figura 1 muestra la capacidad de unión del
anticuerpo monoclonal anti-FGF-8 KM
1334 con los antígenos en un inmunoensayo enzimático (el término
"anticuerpo monoclonal
anti-FGF-8" tal como se utiliza
en la presente memoria se refiere al anticuerpo monoclonal que se
une específicamente a FGF-8). En el dibujo, la
columna negra representa la capacidad de unión al péptido antígeno
THY-FGF-8 (en lo sucesivo denominado
"THY"), mientras que la columna blanca representa la capacidad
de unión al péptido antígeno THY-15639.
La figura 2 muestra en la transferencia Western
la reactividad del anticuerpo monoclonal
anti-FGF-8 KM 1334 con la proteína
FGF-8 purificada.
La figura 3 muestra el efecto del anticuerpo
monoclonal anti-FGF-8 KM 1334 de
inhibición de la actividad de FGF-8. En el dibujo,
la línea de crecimiento en el 0% indica el valor correspondiente a
la no adición de factor de crecimiento ni de anticuerpo. La línea
de puntos representa la inhibición de la actividad debida al IgG
purificado de ratón utilizado como anticuerpo de control, y la línea
continua, la debida al anticuerpo monoclonal
anti-FGF-8 KM 1334.
La figura 4 muestra el efecto del anticuerpo
monoclonal anti-FGF-8 KM 1334 de
inhibición de la actividad de bFGF. En el dibujo, la línea de
crecimiento en el 0% indica el valor correspondiente a la no adición
de factor de crecimiento ni de anticuerpo. La línea de puntos
representa la inhibición de la actividad debida al IgG purificado
de ratón utilizado como anticuerpo de control, y la línea continua,
la debida al anticuerpo monoclonal
anti-FGF-8 KM 1334.
La figura 5 muestra el efecto del anticuerpo
monoclonal anti-FGF-8 KM 1334 en la
inhibición de la actividad de la testosterona. En el dibujo, la
línea de crecimiento en el 0% indica el valor correspondiente a la
no adición de factor de crecimiento ni de anticuerpo. La línea de
puntos representa la inhibición de la actividad debida al IgG
purificado de ratón utilizado como anticuerpo de control, y la línea
continua, la debida al anticuerpo monoclonal
anti-FGF-8 KM 1334.
El anticuerpo monoclonal KM 1334 producido por
una línea celular hibridoma KM 1334 (FERM BP-5451),
un anticuerpo monoclonal de la presente invención, se une
específicamente a FGF-8.
Como antígeno necesario para la preparación del
anticuerpo monoclonal anti-FGF-8
pueden utilizarse células productoras de FGF-8 o
una fracción celular de las mismas, o células huésped transformadas
con un fragmento de ADN que codifique FGF-8,
preparadas utilizando técnicas conocidas mediante la integración de
ADNc completo o un fragmento parcial del mismo que codifique
FGF-8 en células procarióticas (por ejemplo
Escherichia coli o similar) o en células eucarióticas (por
ejemplo células de insecto, células de mamífero o similares), como
tales o como proteína expresada y purificada en forma de proteína de
fusión, así como un péptido parcial de FGF-8
sintetizado con un sintetizador de péptidos.
Con el fin de incrementar la inmunogenicidad, el
péptido a utilizar como antígeno se une a una proteína
transportadora utilizando un agente de reticulación. Entre los
ejemplos de proteína transportadora se incluyen la hemocianina de
lapa (en lo sucesivo denominada "KLH"), la albúmina de suero
bovino (en lo sucesivo denominada "BSA"), la cicloglobulina y
similares. Entre los ejemplos del agente de reticulación se incluyen
el glutaraldehído, la
N-(m-maleimidobenzoiloxi)-succinimida
(en lo sucesivo denominada "MBS") y similares.
No existe limitación a las especies de animales
inmunizados, con la condición de que pueda prepararse un hibridoma.
En lo sucesivo, se indican ratones y ratas como ejemplos específicos
en la presente invención.
Los ratones o ratas de 3 a 20 semanas de edad se
inmunizan con el antígeno preparado mediante el procedimiento (1) y
se recogen células productoras de anticuerpos del bazo, nódulo
linfático o sangre periférica del animal inmunizado. La
inmunización se lleva a cabo administrando al animal el antígeno
junto con un adyuvante apropiado (por ejemplo adyuvante completo de
Freund o una combinación de gel de hidróxido de aluminio con vacuna
pertussis) por vía subcutánea, intravenosa o intraperitoneal. Tras
la primera administración, el antígeno se administra repetidamente
5 a 10 veces a intervalos de 1 a 2 semanas. Tres a 7 días después de
cada administración se recoge una muestra de sangre del plexo
venoso del fondo del ojo y el suero derivado de la muestra de sangre
se somete a ensayo, por ejemplo mediante inmunoensayo enzimático
(ensayo de inmunosorción ligada a enzima (ELISA), publicado por
Igaku Shoin, 1976) con el fin de determinar si se une al antígeno.
Se utiliza como fuente de células productoras de anticuerpo un
ratón o rata cuyo suero mostrase un título de anticuerpos suficiente
contra el péptido utilizado para la inmunización. Para la fusión
entre esplenocitos y células de mieloma, se extirpa el bazo del
ratón o rata inmunizado 3 a 7 días después de la administración
final de la sustancia antigénica y se recolectan los esplenocitos
del bazo. El bazo se corta en trozos en un medio basal libre de
suero (en lo sucesivo denominado "medio de lavado") y se
centrifuga, y las células recuperadas se tratan con tampón
Tris-cloruro amónico (pH 7,65) durante 1 a 2 minutos
para eliminar los eritrocitos. Seguidamente se lavan las células
restantes con el medio de lavado y se utilizan como esplenocitos
para la fusión celular.
Las líneas celulares establecidas derivadas de
ratón se utilizan como células de mieloma. De esta manera, pueden
utilizarse, por ejemplo, las líneas celulares de mieloma de ratón
resistentes a la 8-azaguanina (derivados de BALB/c)
P3-X63Ag8-U1 (P3-U1)
(Current Topics in Microbiology and Immunology-1;
European Journal of Immunology 6:511-519,
1976), SP2/O-Ag14 (SP-2) (Nature,
276, 269-270 (1978)],
P3-X63-Ag8653 (653) (Journal of
Immunology 123:1548-1550, 1979) y
P3-X63-Ag8 (X63) (Nature
256:495-497, 1975). Estas líneas celulares se
subcultivan en un medio de 8-azaguanina (preparado
mediante la suplementación de medio RPMI-1640 con
glutamina (1,5 mM), 2-mercaptoetanol (5 x 10^{-5}
M), gentamicina (10 \mug/ml) y suero de feto bovino (FCS) (al 10%)
y suplementación adicional del medio resultante (en lo sucesivo
denominado "medio normal") con 8-azaguanina (15
\mug/ml). Tres a cuatro días antes de la fusión celular se lleva
a cabo un subcultivo en medio normal para garantizar de esta manera
un número celular no inferior a 2 x 10^{7} células en el día de la
fusión celular.
Las células productoras de anticuerpo obtenidas
tal como se describe en (2) y las células de mieloma obtenidas tal
como se describe en (3) se lavan cuidadosamente con el medio de
lavado o con PBS respectivamente (1,83 g de fosfato disódico, 0,21
g de fosfato monopotásico y 7,65 g de cloruro sódico por litro de
agua destilada, pH 7,2) y se mezclan en una proporción de 5 a 10
células productoras de anticuerpo por célula de mieloma. Tras
recuperar las células mediante centrifugación, las células se
resuspenden uniformemente, se añade a las células una mezcla de 2 g
de polietilenglicol-1.000
(PEG-1.000), 2 ml del medio de lavado y 0,7 ml de
dimetil sulfóxido, y se agitan en una cantidad comprendida entre 0,2
y 1 ml/10^{8} células productoras de anticuerpos a 37ºC,
seguidamente se añaden porciones de 1 a 2 ml del medio de lavado a
intervalos de 1 a 2 minutos y se enrasa a 50 ml la cantidad
completa mediante lavados adicionales. Tras la centrifugación, las
células recuperadas se resuspenden suavemente y después se suspenden
en 100 ml de medio HAT (preparado mediante la suplementación de
medio normal con hipoxantina (10^{-4} M), timidina (1,5 x
10^{-5} M) y aminopterina (4 x 10^{-7} M). Esta suspensión se
distribuye en porciones de 100 \mul en cada pocillo de placas de
cultivo de 96 pocillos y la incubación se lleva a cabo en un
incubador de 5% de CO_{2} a 37ºC durante 7 a 14 días. Tras la
incubación, se extrae una porción del sobrenadante del cultivo de
cada pocillo y se somete, por ejemplo, a inmunoensayo enzimático,
que se describe posteriormente en (5), o a FACS (separador celular
activado por fluorescencia), seleccionando de esta manera un
anticuerpo que se une específicamente al péptido parcial
FGF-8. A continuación, se repite dos veces el
clonado mediante el procedimiento de dilución limitante (utilizando
medio HT (medio HAT sin aminopterina) para el primer clonado y medio
normal para el segundo). Las líneas celulares para las que se
observa un título de anticuerpos elevado constantemente se
seleccionan como líneas de hibridoma celular productoras de
anticuerpo monoclonal
anti-FGF-8.
Entre los ejemplos de inmunoensayo enzimático
para medir anticuerpos se incluyen el procedimiento sandwich, una
técnica inmunoenzimática, un procedimiento en fase sólida en el que
se utiliza un segundo anticuerpo marcado con enzima, un
procedimiento en el que se utiliza un segundo anticuerpo
inmovilizado y un procedimiento en fase sólida en el que se utiliza
un sistema de enzima/anticuerpo antienzima (Protein, Nucleic Acid
and Enzyme, suplemento nº 31:23, 1987). A continuación se
describe el procedimiento en el que se utiliza un segundo anticuerpo
marcado con enzima.
Mediante la utilización de un agente de
reticulación se une previamente el péptido antigénico a una proteína
transportadora que es diferente de la utilizada en la inmunización.
Se unen un péptido parcial FGF-8 y un péptido que
presenta una secuencia de aminoácidos diferente de la del péptido
parcial a una proteína transportadora y se utilizan como péptidos
de control. El péptido a una concentración comprendida entre 1 y 50
\mug/ml se distribuye en porciones de 10 a 100 \mul en cada
pocillo de placas EIA de 96 pocillos y se deja reposar durante la
noche a 4ºC para llevar a cabo el recubrimiento. Tras realizar el
bloqueo con solución BSA o similar, se utiliza un sobrenadante de
cultivo de hibridoma o un anticuerpo purificado preparado de acuerdo
con el procedimiento siguiente (6) como primer anticuerpo y se
distribuye en porciones de 50 a 100 \mul en cada pocillos de las
placas EIA y la reacción se lleva a cabo durante 2 horas a
temperatura ambiente o durante la noche a 4ºC. Tras lavar con PBS o
con una solución preparada mediante la suplementación de PBS con
Tween-20 al 0,05% (en lo sucesivo denominada
"Tween-PBS"), se utiliza una solución de 1 a 50
\mug/ml de un anticuerpo inmunoglobulina antiratón o antirata
marcado con biotina, con un enzima, con una sustancia
quimioluminiscente, con un compuesto radioactivo o similar, como
segundo anticuerpo, y se distribuye en porciones de 50 a 100 \mul
en cada pocillo de la placa EIA y la reacción se lleva a cabo a
temperatura ambiente durante 1 a 2 horas. Tras un lavado cuidadoso,
se lleva a cabo cada reacción correspondiente a las sustancias de
marcaje respectivas del segundo anticuerpo, y se seleccionan como
fuente de anticuerpo monoclonal
anti-FGF-8 los pocillos que muestran
una unión específica al péptido parcial FGF-8
humano.
Las células de hibridoma obtenidas en (4) capaces
de producir anticuerpo monoclonal
anti-FGF-8 se inyectan
intraperitonealmente en ratones de 8 a 10 semanas de edad o ratones
desnudos tratados con pristano (mediante administración
intraperitoneal de 0,5 ml de
2,6,10,14-tetrametilpentadecano (pristano) seguido
de 3 a 10 días de cultivo) a una dosis comprendida entre 2 x
10^{7} y 5 x 10^{6} células por animal. El hibridoma provoca un
tumor ascites en 10 a 21 días. Se recoge el líquido ascítico de los
ratones, se centrifuga (3.000 rpm, 5 minutos) para eliminar la
materia sólida y tras precipitación salina con sulfato amónico a una
saturación comprendida entre el 40 y el 50%, se somete a un
procedimiento de precipitación con ácido caprílico o se pasa a
través de una columna DEAE-sefarosa, una columna de
proteína A o una columna de filtración en gel. Las fracciones
recogidas de IgG o IgM se agrupan para proporcionar un anticuerpo
monoclonal purificado. La subclase de anticuerpo puede determinarse
utilizando un kit de tipaje de anticuerpo monoclonal de ratón o un
kit de tipaje de anticuerpo monoclonal de rata. La cantidad de
proteína puede determinarse mediante el procedimiento Lowry o
calcularse basándose en la densidad óptica a 280 nm.
La capacidad de unión del anticuerpo monoclonal
anti-FGF-8 seleccionado en (5) con
la proteína FGF-8 se examina mediante transferencia
Western. Se purifica un caldo de cultivo de una línea celular
SC-3 de cáncer de mama de ratón en el momento de la
estimulación con testosterona o de proteína FGF-8 en
el caldo de cultivo o proteína FGF-8 expresada en
células CHO, se fracciona mediante SDS-PAGE y
después se transfiere a una membrana de nitrocelulosa o a una
membrana de PVDF. Tras bloquear con una solución de BSA, se lleva a
cabo una reacción con un sobrenadante de cultivo que contiene el
anticuerpo monoclonal anti-FGF-8 o 1
a 10 \mug/ml de anticuerpo purificado a temperatura ambiente
durante 2 horas o durante la noche a 4ºC. Tras lavar con PBS o
PBS-Tween, se utiliza una solución de 1 a 50
\mug/ml de un anticuerpo inmunoglobulina antiratón o antirata
marcado con biotina, con un enzima, con una sustancia
quimioluminiscente, con un compuesto radioactivo o similar, como
segundo anticuerpo y la reacción se lleva a cabo a temperatura
ambiente durante 1 a 2 horas. Tras un lavado cuidadoso, se lleva a
cabo cada reacción correspondiente a la sustancia de marcaje
respectiva del segundo anticuerpo para confirmar que el anticuerpo
monoclonal anti-FGF-8 podía unirse a
la banda que coincide con el peso molecular de la proteína
FGF-8.
La capacidad del anticuerpo monoclonal
anti-FGF-8 seleccionado en (5) de
inhibir la actividad del FGF se examinó mediante un ensayo de
inhibición del crecimiento utilizando una línea celular
SC-3 de cáncer de mama de ratón o una línea celular
derivada de cáncer prostático humano o cáncer de mama como células
diana. De acuerdo con este procedimiento, se cultivaron las células
diana en un medio que contenía FGF-8 (1 a
100 ng/ml) o testosterona, suplementando previamente con un
sobrenadante de cultivo que contiene el anticuerpo monoclonal
anti-FGF-8 o anticuerpo purificado
diluido en serie hasta una concentración final de 0,1 a 100
\mug/ml. Tras 24 a 72 horas de cultivo, se mide el número de
células viables utilizando una solución MTT (bromuro de
3-(4,5-dimetil-2-tiazonil)-2,5-difenil-2H-tetrazolio)
o un kit de contaje de células, confirmando de esta manera la
inhibición de la actividad de FGF-8 por el
anticuerpo monoclonal
anti-FGF-8.
A continuación se ilustra la presente invención
en mayor detalle mediante Ejemplos, debiendo entenderse que la
invención no se considera limitada a los mismos.
Se sintetizó un péptido mediante el diseño de una
secuencia de aminoácidos (secuencia ID nº 1) en la que se ha
añadido cisteína al extremo C-terminal de una
secuencia aminoácida parcial de FGF-8 humana, la
secuencia entre el residuo de la posición 23 y el residuo de la
posición 46 contando desde el extremo N-terminal,
con el fin de llevar a cabo su unión con una proteína
transportadora. La síntesis del péptido se llevó a cabo utilizando
un sintetizador automático múltiple simultáneo de péptidos en fase
sólida PSSM-8 (fabricado por Shimadzu Corp.). Con
el fin de mejorar la antigenicidad, se preparó un conjugado del
péptido sintetizado y KLH (fabricado por Calbiochem Co.) y se
utiliza como inmunógeno. Es decir, se disolvió KLH en PBS hasta una
concentración de 10 mg/ml y se añadió gota a gota a la solución de
KLH un 1/10 de volumen de MBS 25 mg/ml (Nakalai Tesque), seguido de
30 minutos de reacción con agitación. Se extrajo el MBS libre
pasando la solución de reacción a través de una columna de
filtración en gel, tal como una columna Sephadex
G-25 (Pharmacia) o similar que había sido
previamente equilibrada con PBS, obteniendo de esta manera 2,5 mg de
un conjugado KLH-MBS. Este conjugado se mezcló
adicionalmente con 1 mg del péptido disuelto en tampón de fosfato
sódico 0,1 M (pH 7,0) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente
durante 3 horas para llevar a cabo la reacción. Tras la reacción,
la solución de reacción se dializó frente a PBS-NaCl
0,5 M y se utilizó como el inmunógeno.
Se administró una porción de 100 \mug del
conjugado péptido-KLH preparado mediante el
procedimiento descrito en el Ejemplo 1 (1) junto con 2 mg de gel de
aluminio y 1 x 10^{9} células de vacuna pertussis (preparada por
Chiba Serum Institute) a ratones de 5 semanas de edad (Balb/c). A
partir de las 2 semanas de la administración, se administraron 100
\mug del conjugado péptido-KLH una vez por semana
un total de 4 veces. Se recogió una muestra de sangre del plexo
venoso del fondo del ojo, se examinó el título de anticuerpos del
suero derivado de la muestra de sangre mediante un inmunoensayo
enzimático que se describirá en el Ejemplo 1 (3) y se extirpó el
bazo de los ratones que mostraban suficiente título de anticuerpos 3
días después de la inmunización final. El bazo se cortó en trozos
en medio MEM (preparado por Nissui Pharmaceutical), se suspendió
utilizando un par de fórceps y después se sometió a 5 minutos de
centrifugación a 1.200 rpm. A continuación, se descartó el
sobrenadante, el precipitado obtenido se trató con tampón
Tris-cloruro amónico (pH 7,65) durante 1 a 2
minutos con el fin de eliminar los eritrocitos y seguidamente las
células restantes se lavaron tres veces con medio MEM y se
utilizaron para la fusión celular.
El conjugado obtenido mediante reticulación del
péptido parcial FGF-8 humano que se muestra en la
secuencia ID nº 1 y tiroglobulina se utilizó de la manera siguiente
como antígeno para el ensayo. Es decir, se disolvió 1 mg del
péptido en tampón de acetato amónico 0,1 M y la solución se enrasó a
1 ml mediante adición de 5 mg de THY que había sido disuelto
previamente en el mismo tampón. A la mezcla bajo agitación se le
añadieron gota a gota 540 \mugl de glutaraldehído 0,02 M, seguido
de 5 horas de agitación a temperatura ambiente para llevar a cabo
la reacción. Tras la reacción, la solución de reacción se dializó
durante la noche frente a PBS y se utilizó como el antígeno. Se
utilizó como antígeno de referencia el conjugado obtenido de la
misma manera, mediante reticulación del péptido mostrado en la
secuencia ID nº 2 con THY. Se distribuyó una solución 10 \mug/ml
del conjugado preparado en porciones de 50 \mul en pocillos de una
placa de 96 pocillos para EIA (fabricado por Greiner) y la placa se
dejó reposar durante la noche a 4ºC para llevar a cabo el
recubrimiento. Tras el lavado, se distribuyó
BSA-PBS al 1% en porciones de 100 \mul en pocillos
de la placa, que posteriormente se sometieron a 1 hora de reacción
a temperatura ambiente con el fin de bloquear los grupos activos
restantes. A continuación se descartó la solución de
BSA-PBS al 1% y se distribuyó el sobrenadante del
cultivo de hibridoma o un antisuero de ratón inmunizado, en
porciones de 50 \mul en pocillos de la placa, llevando a cabo
seguidamente 2 horas de reacción. Tras el lavado con
Tween-PBS, se distribuyó una inmunoglobulina de
conejo antiratón marcada con peroxidasa (preparada por DAKO) en
porciones de 50 \mul en pocillos de la placa con el fin de llevar
a cabo 1 hora de reacción a temperatura ambiente, la placa se lavó
nuevamente con Tween-PBS y después se llevó a cabo
el desarrollo de color utilizando una solución de sustrato ABTS
[ácido
2,2-azinobis(3-etilbenzotiazol-6-sulfónico
amonio] y se midió la absorbancia a OD_{415} (NJ 2001; Japan
Intermed).
Se cultivó la línea celular P3-U1
de mieloma de ratón resistente a la 8-azaguanina en
el medio normal y seguidamente se recolectó un número no inferior a
2 x 10^{7} células en el momento de la fusión celular y se
sometieron a fusión celular como línea parental.
Los esplenocitos de ratón obtenidos en el Ejemplo
1 (2) y las células de mieloma obtenidas en el Ejemplo 1 (4) se
mezclaron en una proporción de 10:1 y la mezcla se centrifugó (1.200
rpm, 5 minutos). El sobrenadante se descartó y las células
precipitadas se suspendieron uniformemente. Se añadió una solución
compuesta de una mezcla de 2 g de
polietilenglicol-1.000 (PEG-1.000),
2 ml de medio MEM y 0,7 ml de dimetil sulfóxido a las células con
agitación a 37ºC en una cantidad de 0,2 a 1 ml por cada 10^{8}
esplenocitos de ratón, seguido de la adición de varias porciones de
1 a 2 ml de medio MEM a intervalos de 1 a 2 minutos. A continuación,
se enrasó el volumen total a 50 ml mediante la adición de medio
MEM. Tras la centrifugación (900 rpm, 5 minutos), se descartó el
sobrenadante y las células se suspendieron suavemente y después se
resuspendieron suavemente en 100 ml de medio HAT mediante pipeteado
repetido con una pipeta graduada. La suspensión se distribuyó en
porciones de 100 \mul en pocillos de una placa de cultivo de 96
pocillos y la incubación se llevó a cabo en un incubador de 5% de
CO_{2} a 37ºC durante 10 a 14 días. Se examinó cada sobrenadante
de cultivo mediante el inmunoensayo enzimático descrito en el
Ejemplo 1 (3) con el fin de seleccionar los pocillos que mostraban
una reacción específica con el péptido FGF-8.
Utilizando los pocillos seleccionados, se repitió el clonado dos
veces utilizando medio HT y el medio normal, respectivamente,
estableciendo de esta manera líneas celulares de hibridoma capaces
de producir el anticuerpo monoclonal
anti-FGF-8. El anticuerpo monoclonal
KM 1334 mostrado en la figura 1 es un ejemplo de estas líneas
celulares de hibridoma. El hibridoma KM 1334 se depositó el 7 de
marzo de 1996 en el National Institute of Bioscience and
Human-Technology, Agency of Industrial Science and
Technology (1-3, Higashi 1-chome,
Tsukuba-shi, Ibaraki, Japón) con el número de acceso
FERM BP-5451. A este respecto, su clase de
anticuerpos era IgG1, determinada mediante un inmunoensayo
enzimático utilizando un kit de tipaje de subclase.
La línea celular de hibridoma obtenida en el
Ejemplo 1 (3) se administró intraperitonealmente a ratones desnudos
hembra (Balb/c) de 8 semanas de edad tratados con pristano a una
dosis comprendida entre 5 y 20 x 10^{6} células por animal. El
hibridoma provocó un tumor ascites en 10 a 21 días. Se recogió el
líquido ascítico de cada ratón portador de líquido ascítico (1 a 8
ml por animal), se centrifugó (3.000 rpm, 5 minutos) para eliminar
la materia sólida y después se purificó mediante el procedimiento de
precipitación con ácido caprílico (Antibodies - A Laboratory
Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988) con el fin de obtener
anticuerpo monoclonal purificado.
La proteína FGF-8 purificada a
partir de un caldo de cultivo de la línea celular
SC-3 de cáncer de mama de ratón en el momento de la
estimulación con testosterona se fraccionó mediante
SDS-PAGE en una cantidad de 0,1 \mug por pista y
después se transfirió sobre una película de PVDF de la manera
habitual. Tras el bloqueo con BSA-PBS al 1%, se
llevó a cabo la reacción con el anticuerpo monoclonal KM 1334
anti-FGF-8 (10 \mug/ml) o con
suero normal de ratón utilizado como anticuerpo de control (x 500),
a temperatura ambiente durante 2 horas o durante la noche a 4ºC.
Tras lavar cuidadosamente con Tween-PBS, se llevó a
cabo la reacción con un anticuerpo inmunoglobulina antiratón
marcado con peroxidasa (preparado por DAKO) a temperatura ambiente
durante 1 hora. Tras un lavado cuidado con
Tween-PBS, se llevó a cabo la reacción con reactivo
ECL (preparado por Amersham) durante 1 minuto, se eliminó el exceso
de reactivo y después se llevó a cabo la detección mediante la
sensibilización de la película tratada durante aproximadamente 10
segundos a 2 minutos. Tal como se muestra en la figura 2, KM 1334
se unió a FGF-8. Aunque FGF-8
presenta un valor teórico de 22 kdaltons, se observó como una banda
de aproximadamente 30 kdaltons debido a la adición de cadenas de
azúcar y similares.
Se examinó la capacidad del anticuerpo monoclonal
anti-FGF-8 de inhibir la actividad
de FGF-8 mediante un ensayo de inhibición del
crecimiento utilizando la línea celular SC3 de cáncer de mama de
ratón como células diana. Las células SC3 se cultivaron en un medio
que contenía FGF-8 (50 ng/ml), testosterona (10 nM,
preparada por Nakalai Tesque) o factor básico de crecimiento
fibroblástico (en lo sucesivo denominado "bFGF" (1 ng/ml,
preparado por Pepro Tech Inc.)). En este caso, el medio se
suplementó previamente con el anticuerpo monoclonal
anti-FGF-8 KM 1334 diluido en serie
hasta una concentración final de 0,1 a 100 \mug/ml. Como
anticuerpo de control se utilizó IgG de ratón purificado (preparado
por Sigma). Tras 72 horas de cultivo, se midió el número de células
viables mediante un procedimiento MTT. Es decir, se distribuyó una
solución 5 mg/ml de MTT (bromuro de
3-(4,5-dimetil-2-tiazonil)-2,5-difenil-2H-tetrazolio)
en PBS en porciones de 10 \mul en pocillos de placa de cultivo y
se incubó a 37ºC durante 4 a 5 horas, se distribuyó
HCl-isopropanol 0,04 N en porciones de 150 \mul
en los pocillos resultantes y después la placa se agitó a 37ºC
durante 1 a 2 horas. A continuación, el pigmento formado se
solubilizó y se midió su absorbancia a DO_{540} nm. Los resultados
de inhibición de la actividad de FGF-8, bFGF y
testosterona se muestran en las figuras 3, 4 y 5, respectivamente.
Tal como se muestra en la figura 3, KM 1334 inhibió el crecimiento
de las células SC-3 por parte de
FGF-8 de manera dosis-dependiente,
aunque, tal como se muestra en la figura 4, KM 1334 no mostró una
inhibición dosis-dependiente de las células
SC-3 por parte de bFGF. En consecuencia, se confirmó
que KM 1334 inhibe específicamente la actividad de
FGF-8. Además, tal como se muestra en la figura 5,
KM 1334 inhibe parcialmente el crecimiento de las células
SC-3 estimulado por testosterona, pero no de manera
completa a una concentración de anticuerpo de 100 \mug/ml.
La presente invención proporciona un anticuerpo
monoclonal que se une específicamente a FGF-8 e
inhibe su actividad. El anticuerpo monoclonal de la presente
invención resulta útil en el análisis del papel y función
biológicos de FGF-8 en las células tumorales y puede
utilizarse para diagnosticar cáncer prostático, cáncer de mama y
similares mediante detección inmunológica.
Aunque la invención se ha descrito en detalle y
con referencia a las formas de realización específicas de la misma,
resultará evidente a un experto en la materia que pueden llevarse a
cabo diversos cambios y modificaciones de la misma sin apartarse
del alcance de la invención según se define en las
reivindicaciones.
La presente solicitud se basa en la solicitud nº
Hei-8-81754 presentada en Japón.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Anticuerpo monoclonal anti-factor de crecimiento fibroblástico 8
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 2
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN POSTAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- DIRECCIÓN: 6-1, Ohtemachi 1-chome, Chiyoda-ku
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Tokyo
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Japón
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: PC IBM compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release 1.0, versión 1.25
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS ACTUALES DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: EP 97105601.5
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 3 de abril de 1997
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- DATOS DEL ABOGADO/AGENTE
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Kinzebach, Werner, Dr.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- REFERENCIA/NÚMERO DE EXPEDIENTE: M/38072
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: (089) 998397-0
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: (089) 987304
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Val Thr Val Gln Ser Ser Pro Asn Phe Thr
Gln His Val Arg Glu}
\sac{Gln Ser Leu Val Thr Asp Gln Leu Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 15 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Ala Thr Ala Ala Asp Gln Glu Lys Asn Pro
Glu Gly Asp Gly}
Claims (11)
1. Anticuerpo monoclonal que reconoce
específicamente el péptido que presenta la secuencia de aminoácidos
SEC ID nº 1 como epítopo y que inhibe la actividad del factor de
crecimiento fibroblástico 8.
2. Anticuerpo monoclonal según la
reivindicación 1, que se une específicamente al factor de
crecimiento fibroblástico 8, pudiendo obtenerse dicho anticuerpo
mediante inmunización de un animal con un inmunógeno que comprende
el péptido que presenta la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 1.
3. Anticuerpo monoclonal según la
reivindicación 1 ó 2, que es KM1334 de la subclase IgG1 producida
mediante el hibridoma FERM BP-5451.
4. Hibridoma que produce el anticuerpo
monoclonal según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
5. Hibridoma según la reivindicación 4, que
presenta el número de acceso FERM BP-5451.
6. Procedimiento para la producción de un
anticuerpo monoclonal según cualquiera de las reivindicaciones 1 a
3, que comprende cultivar un hibridoma según la reivindicación 4 o
la reivindicación 5 y recuperar el anticuerpo monoclonal producido
de esta manera.
7. Anticuerpo monoclonal según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 3 para su utilización en el diagnóstico o
terapia.
8. Utilización del anticuerpo monoclonal según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para la preparación de un
agente diagnóstico destinado a la detección inmunológica del factor
de crecimiento fibroblástico 8.
9. Utilización del anticuerpo monoclonal según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para la preparación de un
agente destinado al diagnóstico del cáncer.
10. Utilización del anticuerpo monoclonal según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para la preparación de un
agente destinado al tratamiento del cáncer.
11. Utilización según la reivindicación 9 ó 10,
en la que el cáncer es cáncer prostático o cáncer de mama.
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