MXPA06013933A - Anticuerpos monoclonales de conejo a antigenos de superficie de hepatitis b y metodos de uso de los mismos. - Google Patents

Abstract

Se describen reactivos, metodos y equipos de prueba de inmunodiagnostico para la deteccion exacta de infeccion por virus de hepatitis B (HBV). Los metodos y equipos emplean nuevos anticuerpos monoclonales de conejo dirigidos contra antigenos y superficie de HBV (HBsAg) con mutaciones en la region determinante "a" de HBsAg.

Description

ANTICUERPOS MONOCLONALES DE CONEJO A ANTIGENOS DE SUPERFICIE DE HEPATITIS B Y MÉTODOS DE USO DE LOS MISMOS Campo de la Invención La presente invención se refiere en general a virus de hepatitis B (HBV, por sus siglas en inglés) . En particular, la invención se refiere a anticuerpos monoclonales de conejo dirigidos contra antígenos de superficie de HBV y métodos de uso de los mismos para diagnosis de infección de HBV.

Antecedentes de la Invención El virus de hepatitis B (HBV) es un miembro de un grupo de virus pequeños que contienen ADN que provocan infecciones no citopáticas persistentes del hígado. La infección por HBV en humanos puede provocar ictericia severa, degeneración hepática y muerte. El HBV entra predominantemente por la ruta parenteral, tiene un periodo característico de incubación de 60 a 160 días, y puede persistir en la sangre durante años en portadores crónicos. El HBV es de gran importancia médica debido a que es una de las causas más comunes de enfermedad hepática crónica, tal como carcinoma hepatocelular, en humanos. Los hepatocitos infectados segregan de forma continua partículas virales que se acumulan a altos niveles en la sangre. Además, se estima que aproximadamente 6 a 7 % de la población humana está REF:177895 infectada, con el nivel de infección que es tan alto como 20 % de la población en ciertas regiones del sudeste Asiático y África sub-Sahariana. Se han desarrollado varias pruebas para detectar la presencia de los constituyentes de HBV en suero y otros fluidos corporales. Estas pruebas son predominantemente de principio inmunológico y dependen de la presencia de anticuerpos producidos en humanos o animales para detectar proteínas virales específicas tal como el antígeno de superficie de hepatitis B (HBsAg) , antígeno de núcleo (nucleocápsida) de hepatitis B (HBcAg) o antígeno "E" de hepatitis B (HBeAg) . Sin embargo, existen intereses crecientes acerca de la contribución de los HBsAg variantes con relación a la producción de negativos falsos en ensayos de detección sanguínea o de diagnosis serológica de HBsAg. En particular, el HBV, debido a su modo de replicación por trascripción inversa en su ARN pre-genómico, tiene una alta velocidad de mutación con relación a otros virus de ADN. Se han descrito sustituciones de aminoácidos en todas las proteínas virales codificadas por ADN de HBV tal como polimerasa, HBcAg y HBsAg. La región determinante "a" específica del grupo del HBV (aminoácidos 127-147, numerada con relación a la porción S de HBsAg) ha atraído la mayor atención, debido a que se han encontrado mutaciones en esta región en 10-20 % de las evasiones de vacuna y han dado por resultado malos diagnósticos de los HBV variantes, aún usando los ensayos serológicos más actuales en el mercado. De esta manera, existe la necesidad del desarrollo de pruebas confiables de diagnóstico para detectar HBV en muestras virémicas, a fin de prevenir la transmisión del virus a través de derivados de plasma y sangre o por contacto personal cercano. Se han usado hibridomas de conejo-conejo y conejo-ratón en un intento para generar anticuerpos monoclonales con inmunorreactividad incrementada. Ver, por ejemplo, patentes de los Estados Unidos números 4,977,081; 4,859,595; 5,472,868; 5,675,063; Spieker-Polet et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA (1995) 92:9348-9352. Son deseables anticuerpos monoclonales de conejo por varias razones. Primero, los conejos pueden reconocer antígenos y epítopos que no son inmunogénicos en ratones o ratas, las dos especies de las cuales se generan usualmente los anticuerpos monoclonales. Adicionalmente, los anticuerpos de conejo en general son de alta afinidad. La patente de los Estados Unidos número 4,859,595 describe la producción de anticuerpos monoclonales de conejo a HBsAg usando fusiones de conejo-conejo. Sin embargo, permanece la necesidad de inmunoensayos generados que usen anticuerpos monoclonales con inmunorreactividad más amplia contra los varios mutantes de HBsAg. Sería altamente deseable la disponibilidad ampliamente extendida de reactivos para el uso en un ensayo exacto y eficiente para infección de HBV.

Breve Descripción de la Invención La presente invención proporciona anticuerpos monoclonales altamente inmunorreactivos para la diagnosis simple, exacta y eficiente de infección de HBV. Los anticuerpos se producen a partir de hibridomas de conejo y son inmunorreactivos contra varias cepas mutantes de HBV. De esta manera, los métodos de ensayo que usan los anticuerpos monoclonales de -conejo son más exactos y se reduce el número de negativos falsos vistos con otras pruebas serológicas. Los ensayos que usan los anticuerpos permiten por lo tanto la detección de la infección de HBV provocada por una variedad de mutantes de HBV y, si se detecta infección, al individuo se le puede dar tratamiento apropiado en tiempo adecuado para ayudar a prevenir daño hepático y muerte. Por consiguiente, en una modalidad, la invención se refiere a un anticuerpo monoclonal de conejo anti-HBV reconocen mutantes de HBsAg con una mutación en la región determinante "a", o fragmento inmunorreactivo del mismo, tal como un fragmento Fab, F(ab')2, Fv o un sFv. En ciertas modalidades, el anticuerpo reconoce más de un mutante de HBsAg con una mutación en la región determinante "a" . En modalidades adicionales, el anticuerpo también reconoce un HBsAg tipo silvestre. En aún modalidades adicionales, el mutante de HBsAg es un sAg mutante, tal como un mutante que comprende la secuencia de la región determinante "a" de F134A, F134S, G145R, S143L, P142S o Q129R/M133T. En modalidades adicionales, el anticuerpo reconoce un HBsAg y/o uno o al menos dos HBSAg mutantes seleccionados del grupo que consiste de F134A, F134S, G145R, S143L, P142S y Q129R/M133T. Cualquiera de los anticuerpos anteriores se puede producir usando un hibridoma de conejo-conejo o un hibridoma de conejo-ratón. En modalidades adicionales, la invención se refiere a hibridomas 99S6 (ATCC número de acceso PTA-6015) y 99S9 (ATCC número de acceso PTA-6014) , y anticuerpos producidos por estos hibridomas. En modalidades adicionales, la invención se refiere a un anticuerpo monoclonal de conejo que reconoce el mismo epítopo como un anticuerpo producido por el hibridoma 99S6 y/o 99S9. En modalidades adicionales, la invención se refiere a un método para detectar antígenos de superficie de HBV en una muestra biológica. El método comprende: poner en contacto una muestra biológica con al menos un anticuerpo monoclonal de conejo de acuerdo a cualquiera de las modalidades anteriores, bajo condiciones que permiten que los antígenos de HBV, cuando están presentes en la muestra biológica, se unan al anticuerpo para formar un complejo de anticuerpo/antígeno; y detectar la presencia o ausencia del complejo de anticuerpo/antígeno, detectando de este modo la presencia o ausencia de los antígenos de superficie de HBV en la muestra. En modalidades preferidas del método anterior, al menos un anticuerpo monoclonal de conejo es el anticuerpo producido por el hibridoma 99S6 o el hibridoma 99S9. En ciertas modalidades, al menos un anticuerpo monoclonal de conejo se marca de forma detectable. En ciertas modalidades, el método comprende además hacer reaccionar la muestra biológica con uno o más anticuerpos adicionales dirigidos contra HBsAg tipo silvestre o un mutante de HBsAg con una mutación en la región determinante "a" . El uno o más anticuerpos adicionales pueden comprender un anticuerpo monoclonal adicional, tal como un anticuerpo monoclonal de ratón. En modalidades adicionales, la invención se refiere a un equipo de prueba de diagnóstico para detectar infección de HBV. El equipo de prueba comprende: al menos un anticuerpo monoclonal de conejo, o fragmento inmunorreactivo del mismo de acuerdo a cualquiera de las modalidades anteriores; y instrucciones para llevar a cabo la prueba de inmunodiagnóstico . En modalidades preferidas del método anterior, al menos un anticuerpo monoclonal de conejo es el anticuerpo producido por el hibridoma 99S6 o el hibridoma 99S9. En ciertas modalidades, el equipo de prueba comprende además uno o más anticuerpos adicionales dirigidos contra un HBsAg tipo silvestre o un mutante de HBsAg con una mutación en la región determinante "a" . El uno o más anticuerpos adicionales pueden comprender un anticuerpo monoclonal adicional, tal como un anticuerpo monoclonal de conejo. En modalidades adicionales, la invención se refiere a un soporte sólido que comprende al menos un anticuerpo monoclonal de conejo o un fragmento inmunorreactivo del mismo de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores. En modalidades preferidas del soporte sólido, el al menos un anticuerpo monoclonal de conejo es el anticuerpo producido por el hibridoma 99S6 o el hibridoma 99S9. En ciertas modalidades, el soporte comprende además uno o más anticuerpos adicionales dirigidos contra un HBsAg tipo silvestre o un mutante de HBsAg con una mutación de la reacción determinante "a" . El uno o más anticuerpos adicionales pueden comprender un anticuerpo monoclonal adicional, tal como un anticuerpo monoclonal de ratón. En modalidades adicionales, el soporte sólido comprende además al menos dos controles internos, en donde uno de los controles define el límite de detección inferior para un resultado positivo en un inmunoensayo usando el soporte sólido y el otro control define un resultado altamente positivo en un inmunoensayo usando el soporte sólido. En algunas modalidades, el soporte sólido es una tira de nicrocelulosa . En aún modalidades adicionales, la invención se refiere a un equipo de prueba de inmunodiagnóstico para detectar HBV. El equipo de prueba comprende: (a) un soporte sólido de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores; y (b) instrucciones para llevar a cabo la prueba de inmunodiagnós ico . En una modalidad adicional, la invención se refiere a un método para detectar la presencia de antígenos de superficie de HBV en una muestra biológica. El método comprende: (a) proporcionar una muestra biológica; (b) proporciona un soporte sólido como se describe anteriormente ; (c) poner en contacto la muestra biológica con el soporte sólido, bajo condiciones que permitan que los antígenos de superficie de HBV, si están presentes en la muestra biológica, se unan con al menos uno de los anticuerpos monoclonales de conejo para formar un complejo de anticuerpo/antígeno; y (d) detectar la presencia del complejo de anticuerpo/antígeno, detectando de este modo la presencia de los antígenos de superficie de HBV en la muestra biológica. En ciertas modalidades, el método comprende además : (e) remover los antígenos de HBV no unidos; (f) proporcionar una o más porciones capaces de asociarse con el complejo de anticuerpo/antígeno; y (g) detectar la presencia de una o más porciones, detectando de este modo la presencia de antígenos de superficie HBV en la muestra biológica. En modalidades adicionales del método, la una o más porciones comprenden un anticuerpo de HBV detectable marcado, tal como un anticuerpo monoclonal de conejo detectablemente marcado que reconoce un mutante de HBsAg con una mutación en la región "a", o un fragmento inmunorreactivo del mismo. La marca detectable puede ser una enzima. Adicionalmente, la muestra biológica puede ser de una muestra sanguínea humana. En modalidades adicionales, la invención se refiere a un método para detectar la presencia de anticuerpos anti-HBsAg en una muestra biológica. El método comprend : (a) proporcionar un soporte sólido como se describe anteriormente; (b) poner en contacto el soporte sólido con uno o más HBsAg, bajo condiciones que permitan que uno o más HBsAg se unan a al menos uno de los anticuerpos monoclonales de conejo para formar un complejo de anticuerpo/antígeno; (d) poner el contacto el soporte sólido que tiene el complejo de anticuerpo/antígeno con una muestra biológica, bajo condiciones que permitan que los anticuerpos anti-HBsAg, si están presentes en la muestra biológica, se unan con el complejo de anticuerpo/antígeno para formar un complejo de anticuerpo/antígeno/anticuerpo; y (e) detectar la presencia del complejo de anticuerpo/antígeno/anticuerpo, detectando de este modo la presencia de anticuerpos anti-HBsAg en la muestra biológica. En modalidades adicionales, el método comprende además : (f) remover anticuerpos no unidos; (g) proporcionar una o más porciones capaces de asociarse con el complejo de anticuerpo/antígeno/anticuerpo, tal como una o más porciones que comprenden una molécula de inmunoglobulina detectablemente marcada; y (h) detectar la presencia de una o más porciones, detectando de este modo la presencia de anticuerpos anti-HBsAg en la muestra biológica. En modalidades adicionales, la invención se refiere a un método para preparar un suministro sanguíneo que comprende sangre entera, plaquetas, plasma o suero, sustancialmente libre de HBV. El método comprende: (a) detectar alícuotas de sangre entera, plaquetas, plasma o suero de las muestras sanguíneas recolectadas por un método anterior; (b) eliminar cualquiera de las muestras en las cuales se detecte un antígeno de HBV; y (c) combinar muestras en las cuales no se detecten antígenos de HBV para proporcionar un suministro sanguíneo sustancialmente libre de HBV. En modalidades adicionales, la invención se refiere a un método para preparar un suministro sanguíneo que comprende sangre entera, plaquetas, plasma o suero, sustancialmente libres de HBV. El método comprende : (a) detectar alícuotas de sangre entera, plaquetas, plasma o suero de las muestras sanguíneas recolectadas por un método anterior; (b) eliminar cualquier muestra en la cual se detecte un anticuerpo anti-HBsAg; y (c) combinar muestras en las cuales no se detecte anticuerpo anti-HBsAg para proporcionar un suministro sanguíneo sustancialmente libre de HBV. En aún modalidades adicionales, la invención se refiere a un método para detectar un tejido u órgano donados antes del trasplante para proporcionar un tejido u órgano sustancialmente libre de HBV. El método comprende: (a) detectar una muestra del tejido u órgano por un método anterior; (b) eliminar un tejido u órgano en el cual se detecte un antígeno de HBV para proporcionar un tejido u órgano sustancialmente libre de HBV. En modalidades adicionales, la invención se refiere a un método para detectar un tejido u órgano donado antes del trasplante para proporcionar un tejido u órgano sustancialmente libre de HBV. El método comprende: (a) detectar una muestra del tejido u órgano por un método anterior; (b) eliminar un tejido u órgano en el cual se detecte un anticuerpo anti-HBsAg para proporcionar un tejido u órgano sustancialmente libre de HBV. En aún modalidades adicionales, la invención se refiere a un método para preparar un anticuerpo monoclonal de conejo anti-HBV. El método comprende: (a) inmunizar un conejo con un mutante de HBsAg con una mutación en la región determinante "a"; (b) fusionar células que produzcan anticuerpos contra el mutante de HBsAg del conejo con una célula de una línea de células inmortalizadas para producir un hibridoma; (c) seleccionar el hibridoma; (d) cultivar el hibridoma seleccionado; y (e) recolectar el anticuerpo segregado por el hibridoma cultivado. En ciertas modalidades, el paso de inmunizar comprende inmunizar un conejo con más de un mutante de HBsAg. En ciertas modalidades, las células productoras de anticuerpo son esplenocitos de conejo. Los esplenocitos se pueden fusionar con una célula de una línea de células inmortalizadas de conejo, tal como un plasmacitoma de conejo, para producir un hibridoma de conejo-conejo, o con una célula de una línea de células inmortalizadas de ratón, para producir un hibridoma de conejo-ratón. En ciertas modalidades, del método anterior, el mutante HBsAg es un mutante de sAg, tal como un mutante que comprende la secuencia de la región determinante "a" de F134A, F134S, G145R, S143L, P142S o Q129R/M133T. En otras modalidades, el mutante de HBsAg comprende F134A, F134S, G145R, S143L, P142S o Q129R/M133T. En aún modalidades adicionales, el conejo se inmuniza con al menos dos mutantes de HBsAg con diferentes mutaciones en la región determinante "a", tal como al menos dos mutantes de HBsAg seleccionados del grupo que consiste de F134A, F134S, G145R, S143L, P142S o Q129R/M133T. En modalidades adicionales, el conejo se inmuniza con los mutantes de HBsAg F134A, F134S, G145R, S143L, P142S y Q129R/M133T. En modalidades adicionales, el conejo se inmuniza adicionalmente con un HBsAg tipo silvestre. En modalidades adicionales, la invención se refiere a un anticuerpo monoclonal de conejo anti-HBV producido por los métodos anteriores. En aún modalidades adicionales, la invención se refiere a un método para preparar un hibridoma de conejo-conejo. El método comprende: (a) inmunizar un conejo con un mutante de HBsAg con una mutación en la región determinante "a" ; (b) fusionar esplenocitos que producen anticuerpos contra el mutante de HBsAg del conejo con células de un plas acitoma de conejo; (c) seleccionar células que secreten los anticuerpos . En modalidades adicionales, la invención se refiere a un polinucleótido que codifica para un anticuerpo monoclonal de conejo o un fragmento inmunorreactivo del mismo tal como un fragmento Fab, F(ab')2, Fv o sFv, como se describe anteriormente . Estas y otras modalidades de la presente invención se presentarán fácilmente para aquellos expertos en la técnica en vista de la descripción de la presente.

Breve Descripción de las Figuras La Figura 1 muestra una vista esquemática de un antígeno de superficie de HBV que representa la estructura altamente conformacional de la proteína (panel inferior, línea sólida) y la secuencia de aminoácido (SEQ ID NO: 1) alrededor del determinante "a" (desde aa 121-147, panel superior, en círculos) . Las flechas indican la posición y sustitución de varias variantes de HBsAg conocidas. Las Figuras 2A y 2B (SEQ ID NOS: 2 y 3) muestran la secuencia de aminoácidos para los antígenos adw y ayw tipo silvestre de sAg, respectivamente. Las Figuras 3A-3D muestran las inmunorreactividades de los anticuerpos monoclonales de conejo de 99S6 (Figura 3B) y 99S9 (Figura 3D) , en comparación con los anticuerpos de ratón mMAbl (Figura 3C) y mMAb2 (Figura 3A) contra el panel de mutante de HBV descrito anteriormente.

Descripción Detallada de la Invención La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique de otro modo, métodos convencionales de virología, química, bioquímica, técnicas de ADN recombinante e inmunología, dentro de la habilidad de la técnica. Estas técnicas se explican completamente en la literatura. Ver, por ejemplo, Fundamental Virology, 3rd Edition, vol. I y II (B.N. Fields y D.M. Knipe, eds.); Handbook of Experimental I munology, Vols. I-IV (D.M. Weir y C.C. Blackwell eds., Blackwell Scientific Publications) ; T.E. Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W.H. Freeman y Company, 1993) ; A.L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., current addition) ; Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989); Methods in Enzymology (S. Colowick y N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.). Las siguientes abreviaciones de aminoácidos se usan a todo lo largo del texto: Alanina: Ala (A) Arginina: Arg (R) Asparagina: Asn (N) Ácido aspártico: Asp (D) Cisteína: Cys (C) Glutamina: Gln (Q) Ácido glutámico: Glu (E) Glicina: Gly (G) Histidina: His (H) Isoleucina: lie (I) Leucina: Leu (L) Lisina: Lys (I) Metionina: Met (M) Fenilalanina: Phe (F) Prolina: Pro (P) Serina: Ser (S) Treonina: Thr (T) Triptofano: Trp (W) Tirosina: Tyr (Y) Valina: Val (V) I. Definiciones Al describir la presente invención, se emplearán los siguientes términos, y se propone que se definan como se indica más adelante. Se debe señalar, como se usa en esta especificación y las reivindicaciones anexas, las formas singulares "un", "una", y "el o ella" incluyen referencias plurales a menos que el texto dicte claramente lo contrario. De esta manera, por ejemplo, la referencia a "un anticuerpo monoclonal de conejo" incluye una mezcla de dos o más de estos polipéptidos, y similares. Los términos "polipéptido" y "proteína" se refieren a un polímero de residuos de aminoácidos y no se limitan a una longitud mínima del producto. De esta manera, péptidos, oligopéptidos, dímeros, multímeros y similares, se incluyen dentro de la definición. Se abarcan por esta definición proteínas tanto de longitud completa como fragmentos de las mismas. Los términos también incluyen modificaciones pos-expresión del polipéptido, por ejemplo, glicosilación, acetilación, fosforilación y similares. Adicionalmente, para propósitos de la presente invención, un "polipéptido" se refiere a una proteína que incluye modificaciones, tal como supresiones, adiciones o sustituciones (en general de naturaleza conservadora) , a la secuencia nativa, en tanto que la proteína mantenga la actividad deseada. Estas modificaciones se pueden distribuir, como a través de mutagénesis dirigida al sitio, o pueden ser accidentales, tal como a través de mutaciones de hospedadores que producen las proteínas o errores debido a la amplificación por PCR. El término "antígeno" se refiere a un polipéptido, ya sea nativo, recombinante o sintético, que incluye uno o más epítopos que reconocen un anticuerpo. El antígeno en cuestión no necesita incluir la secuencia de aminoácidos de longitud completa de la molécula de referencia sino que puede incluir sólo tanto de la molécula como sea necesario a fin de generar una reacción inmunológica (es decir, cuando el antígeno se use para generar anticuerpos) o para reaccionar con el anticuerpo de HBV de interés (es decir, si el antígeno se está detectando en un ensayo) . De esta manera, sólo necesitan estar presentes uno o pocos epítopos de la molécula de referencia. Adicionalmente, el antígeno puede comprender una proteína de fusión entre la molécula de referencia de longitud completa o un fragmento de la molécula de referencia, y otra proteína tal como otro antígeno de HBV y/o una proteína que no interrumpa la reactividad del antígeno de HBV. Es fácilmente evidente que el antígeno puede comprender por lo tanto la secuencia de longitud completa, fragmentos, secuencias truncadas y parciales, así como análogos, muteínas y formas precursoras de la molécula de referencia. El término también incluye supresiones, adiciones y sustituciones a la secuencia de referencia, en tanto que el antígeno retenga la capacidad para estimular la producción de anticuerpos y/o para reaccionar con anticuerpos de HBV. A este respecto, la variación natural se presentará de aislado a aislado dentro de una cepa particular de HBV. De esta manera, el término se propone que abarque esta variación y, en particular, un antígeno que varía en su composición de aminoácidos por no más de aproximadamente 20 por ciento en número, de manera más preferente por no más de aproximadamente 10 a 15 por ciento en número, y de manera más preferente por no más de aproximadamente 5 por ciento en número, del antígeno de referencia. Las proteínas que tienen sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos como la molécula de referencia, pero que poseen sustituciones menores de aminoácidos que no afectan de forma sustancial las capacidades de unión del anticuerpo del antígeno, por lo tanto están dentro de la definición del polipéptido de referencia. Un antígeno "derivado de" una cepa o aislado de HBV se propone un antígeno que comprende una secuencia de una o más regiones o porciones de las regiones de un antígeno codificado por el genoma HBV de referencia.

Típicamente, el antígeno está compuesto de regiones o porciones de regiones que incluyen epítopos, y que tiene en general una secuencia de aminoácidos sustancialmente homologa al péptido de referencia, como se define más adelante. De esta manera, el término "derivado de" se usa para identificar la fuente original de una molécula pero no se propone para limitar el método por el cual se elabora la molécula que puede ser, por ejemplo, por medio recombinante o de síntesis química. Los términos "análogo" y "muteína" se refieren a derivados biológicamente activos de la molécula de referencia, que retiene la actividad deseada, tal como inmunorreactividad en ensayos descritos en la presente. En general, el término "análogo" se refiere a compuestos que tienen una secuencia y estructura nativa de polipéptido con una o más supresiones, sustituciones (en general de naturaleza conservadora) y/o supresiones de aminoácidos, con relación a la molécula nativa, en tanto que las modificaciones no destruyan la actividad inmunogénica y que sean "sustancialmente homologas" a la molécula de referencia como se define más adelante. Se conocen varias regiones conservadas y variables entre los varios aislados y, en general, la secuencia de aminoácidos de epítopos derivados de estas regiones tendrán un alto grado de homología de secuencia, por ejemplo, homología de secuencia de aminoácidos de más de 50 %, en general más de 60 %-70 %, cuando se alineen las dos secuencias. El término "muteína" se refiere a péptidos que tienen uno más imitadores de péptidos (por ejemplo, "peptoides") . De manera preferente, el análogo o muteína tiene al menos la misma inmunorreactividad como la molécula nativa. Las moléculas para elaborar análogos y muteínas de polipéptido se conocen en la técnica y se describen más delante de forma adicional . Los términos "análogo" y "muteína" también abarcan mutaciones determinadas que se hacen a la molécula de referencia. Los análogos particularmente preferidos incluyen sustituciones que son de naturaleza conservadora, es decir, aquellas sustituciones que toman lugar dentro de una familia de aminoácidos que están relacionados en sus cadenas laterales. Específicamente, los aminoácidos se dividen en general en cuatro familias: (1) ácidos. -aspartato y glutamato; (2) básicos.- lisina, arginina, histidina; (3) no polares.- alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano; y (4) polares no cargados.- glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina-treonina, tirosina. La fenilalanina, triptofano y tirosina algunas veces se clasifican como aminoácidos aromáticos. Por ejemplo, es predecible de forma razonable que un reemplazo aislado del leucina con isoleucina o valina, un aspartato con un glutamato, o una treonina con una serina, o un reemplazo conservador similar de un aminoácido con un aminoácido estructuralmente relacionado, no tendrá un efecto mayor en actividad biológica. Por ejemplo, el antígeno de interés puede incluir hasta aproximadamente 5-10 sustituciones conservadoras o no conservadoras de aminoácidos, o aún hasta aproximadamente 15-25, 50 ó 75 sustituciones conservadoras o no conservadoras de aminoácidos, o cualquier número entero entre 5-75, en tanto que permanezca intacta la función deseada de la molécula. Un experto en la técnica puede determinar fácilmente regiones de la molécula de interés que pueden tolerar cambio por referencia a las gráficas de Hopp/Woods y Kyte-Doolittle, bien conocidas en la técnica. Por "fragmento de antígeno" se propone un antígeno que consiste de sólo una parte de la secuencia y estructura de polipéptido del antígeno intacto de longitud completa. Un fragmento puede incluir una supresión C-terminal, una supresión N-terminal, y/o una supresión interna del polipéptido nativo. Por "fragmento inmunogénico" se quiere decir un fragmento y un polipéptido que incluye uno o más epítopos y de esta manera produce una o más de las respuestas inmunológicas descritas- en la presente. Un "fragmento inmunogénico" de una proteína de HBV particular incluirá en general al menos aproximadamente 5-10 residuos contiguos de aminoácidos de la molécula de longitud completa, de manera preferente al menos aproximadamente 15-25 residuos contiguos de aminoácidos de la molécula de longitud completa, y de manera más preferente al menos aproximadamente 20-50 o más residuos contiguos de aminoácidos de la molécula de longitud completa, que define un epítopo, o cualquier número interno entre 5 aminoácidos y la secuencia de longitud completa, con la condición en que el fragmento en cuestión mantenga la capacidad para producir una respuesta inmunológica como se define en la presente . Por "HBsAg" se propone un antígeno de superficie de HBV derivado de cualquiera de las varias cepas y aislados de HBV. El método propone antígenos de superficie que incluyen un dominio S sustancialmente completo de un polipéptido de HBsAg llamado "sAg" en la presente, así como fragmentos inmunogénicos del mismo. Un dominio S de HBsAg está "sustancialmente completo" si contiene la secuencia nativa del polipéptido con o sin supresiones menores de uno o unos pocos aminoácidos de ya sea las regiones N-terminal o C-terminal o dentro del polipéptido. Por ejemplo, el dominio S de HBsAg puede estar truncado por unos pocos aminoácidos, es decir, hasta aproximadamente 3, 5, 7, ó 10 aminoácidos, sin afectar en gran parte su antigenicidad. Un antígeno de HBsAg para el uso en la presente incluirá en general una región que corresponde al determinante "a" , encontrado en las posiciones 124-147 de aminoácidos, numeradas con relación al sAg. Esta región se describe más delante de forma adicional. El término también propone un antígeno que incluye el dominio preS2 (anteriormente llamado preS) además del dominio S, o tanto los dominios preS2 como preSl de HBsAg, además del dominio S. Valenzuela, et al. (1982) Nature 298 :347-350, describe el gen para un HBsAg representativo. Ver también Valenzuela, et al. (1979) Nature 280:815-819. Una molécula "mutante" de HBsAg, como se usa en la presente, se refiere a análogos de HBsAg tipo silvestre, como se define anteriormente, para el propósito de esta invención, por "HBsAg tipo silvestre" se proponen los HBsAg de los subtipos ayw y adw. Estos análogos pueden surgir por eventos naturales de mutación, por ejemplo, en el caso de mutantes de escape, o pueden ser creados a propósito. Las secuencias de HBsAg mutantes representativas se muestran en la Figura 1 de la presente. Se conocen en la técnica, mutantes adicionales que se presentan de forma natural y las secuencias de nucleótidos y las secuencias correspondientes de aminoácidos para los antígenos de superficie de estos mutantes se han depositado con el GenBank. Ver, por ejemplo, NCBI números de acceso AY341335 (mutante de superficie que se presenta de forma natural con múltiples mutaciones en el determinante "a" de sAg) , X59795 (mutante que se presenta de forma natural del subtipo ayw) ; AF01369 y AF013629 (mutantes que se presentan de forma natural para el subtipo adw) y Zuckerman et al. 1999 (J. Med Virol . 58:193). Por secuencias "inmunogénicas" de un HBsAg se quiere decir una molécula de HBsAg que incluye una secuencia de aminoácidos con al menos un epítopo tal que la molécula es capaz de estimular la producción de anticuerpos de un hospedador apropiado. Por "epítopos" se quiere decir un sitio de un antígeno al cual responden las células B y/o células T específicas, volviendo al epítopo de HBV en cuestión capaz de estimular la producción de anticuerpos. El término también se usa de forma indistinta con "determinante antigénico" o "sitio determinante antigénico" . Un epítopo puede comprender 3 o más aminoácidos en una conformación espacial única al epítopo. En general, un epítopo consiste de al menos 5 de estos aminoácidos y de manera más usual, consiste de al menos 8-10 aminoácidos o más. Las regiones de un polipéptido determinado que incluye en un epítopo se puede identificar usando cualquier número de técnicas de correlación de epítopos, bien conocidas en la técnica. Ver, por ejemplo Epitope Mapping Protocole in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed. , 1996) Humana Press, Totowa, New Jersey. Por ejemplo, se pueden determinar epítopos lineales al sintetizar, por ejemplo de forma concurrente grandes números de péptidos en soportes sólidos, los péptidos que corresponden a porciones de la molécula de la proteína, y al hacer reaccionar los péptidos con anticuerpos en tanto que los péptidos aun están unidos a los soportes. Estas técnicas son bien conocidas y se describen por ejemplo en las patentes de los Estados Unidos Nos. 4,708,871; Geysen et al. (1984) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 81:3998-4002; Geysen et al. (1985) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 82:178.182; Geysen et al. (1986) Molec. Immunol . 2_3: 709-715. De manera similar, se identifican fácilmente epítopos conformacionales al determinar la conformación espacial de los aminoácidos tal como por ejemplo por cristalografía de rayos x y resonancia magnética nuclear bidimensional. Ver, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols, supra. Las regiones antigénicas de las proteínas también se pueden identificar usando gráficas de hidropatía y antigenicidad normales, tal como aquellas calculadas usando por ejemplo el programa de cómputo Omiga versión 1.0 disponible del Oxford Molecular Group. Este programa de computadora emplea el método de Hopp/Woods, Hopp et al., Proc. Nati Acad. Sci USA (1981) 78:3824-3828 para determinar los perfiles de antigenicidad, y la técnica de Kyte-Doolittle, Kyte et al., J. Mol. Biol. (1982) 157:105-132 para gráficas de hidropatía. Una "composición inmunogénica" es una composición que comprende al menos un polipéptido inmunogénico (por ejemplo, un anticuerpo o antígeno de HBsAg) . "Sustancialmente purificado" se refiere en general al aislamiento de una sustancia (compuesto, polinucleótido, proteína, polipéptido, composición de polipéptido) tal que la sustancia comprenda la mayoría del por ciento de la muestra en la cual reside. Típicamente en una muestra, un componente sustancialmente purificado comprende 50 %, de manera preferente 80 % - 85 %, de manera más preferente 90 -95 % de la muestra. Son bien conocidas las técnicas para purificar polinucleótidos y polipéptidos de interés e incluyen, por ejemplo, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad y sedimentación de acuerdo a densidad. Por "aislado" se quiere decir, cuando se refiere a un polipéptido, que la molécula indicada se separa y es discreta del organismo completo con el cual la molécula se encuentra en la naturaleza o está presente en la ausencia sustancial de otras macromoléculas biológicas del mismo tipo. El término "aislado" con respecto a un polinucleótido es una molécula de ácido nucleico desprovista de, en parte o totalidad, secuencias normalmente asociadas con la misma en la naturaleza; una secuencia, como existen en la naturaleza, pero que tiene secuencias heterólogas en asociación con la misma; o una molécula desasociada del cromosoma. Por "determinante antigénico equivalente" se propone un determinante antigénico de diferentes aislados o sepas de HBV, determinantes antigénicos que no son necesariamente idénticos debido a la variación de la. secuencia, pero que se presentan en posiciones equivalentes en la secuencia de HBV en cuestión. En general, la secuencia de aminoácidos de los determinantes antigénicos y equivalentes tendrán un alto grado de homología de secuencia, por ejemplo, una homología de secuencia de aminoácidos de más de 30 %, usualmente más de 40 %, tal como más de 60 %, y aun más de 80-90 % de homología, cuando se alinean las dos secuencias. "Homología" se refiere al % de identidad entre dos polinucleótidos o dos porciones de polipéptido. Dos secuencias de ácido nucleico o dos secuencias de polipéptido son "sustancialmente homologas" entre sí cuando las secuencias se exhiben al menos aproximadamente 50 %, de manera preferente al menos aproximadamente 75 %, de manera más preferente al menos aproximadamente 80 % - 85 %, de manera preferente al menos aproximadamente 90 %, de manera más preferente al menos de aproximadamente 95 % - 98 % de identidad de secuencia sobre una longitud definida de las moléculas. Como se usa en la presente, sustancialmente homólogo también se refiere a secuencias que muestran identidad completa a la secuencia especificada. En general "identidad" se refiere a una correspondencia exacta de nucleótido a nucleótido o de aminoácido a aminoácido de dos polinucleótidos o secuencias de polipéptido, respectivamente. El por ciento de identidad se puede determinar por una comparación directa de la información de secuencia entre dos moléculas (la secuencia de referencia y una secuencia con % desconocido de identidad de la secuencia de referencia, al .alinear las secuencias, contando el número exacto de correspondencias entre las dos secuencias alineadas, dividiendo por la longitud de la secuencia de referencia, y multiplicando el resultado por 100. Los programas de computadora fácilmente disponibles se pueden usar para ayudar en el análisis, tal como ALIGN, Dayhoff, M.O. in Atlas of Protein and Structure M.O. Dayhoff ed., 5 Suppl . 2: 353-358, Nacional biomedical Research Foundation, Washington, DC, que adapta el algoritmo de homología local de Smith y Waterman . Advances in Appl. Math. 2^:482-489, 1981 para análisis de péptidos. Los programas para determinar la identidad de secuencias de nucleótidos están disponibles en el Paquete de Análisis de Secuencias Wisconsin, Versión 8 (disponible de Genetics Computer Group, por ejemplo, los programas BESTFIT, FASTA y GAP, que también dependen del algoritmo de Smith y Waterman. Estos programas se utilizan fácilmente por los parámetros de comisión recomendados por el fabricante y descritos en el Paquete de Análisis de Secuencia Wisconsin referido anteriormente, por ejemplo el por ciento de identidad de una secuencia particular de nucleótidos a una secuencia de referencia se puede determinar usando el algoritmo de homología de Smith y Waterman con una tabla de puntuación por defecto y una penalidad de separación de seis posiciones de nucleótidos.

Otro método para establecer el por ciento de identidad en el contexto de la presente invención es usar el paquete de programas MPSRCH poseído por la University of Edinburgh, desarrollado por John F. Collins y Shane S. Sturrok y distribuido por IntelliGenetics, Inc. (Mountain View, CA) . De esta suite de paquetes, el algoritmo de Smith-Waterman se puede emplear donde se usan parámetros por defecto para la tabla de puntuación (por ejemplo, penalidad de abertura de separación de 12, penalidad de extensión de separación de uno, y una separación de seis) . De los datos generados el valor "Correspondido" refleja "identidad de secuencia" . Se conocen en general en la técnica otros programas adecuados para calcular el por ciento de identidad o similitud, por ejemplo, otro programa de alineaciones BLAST, usado con los parámetros por defecto. Por ejemplo, se pueden usar BLASTN y BLASTP usando lo siguientes parámetros por defecto: código genético = normal; triple = ninguno; hebra = ambas; corte = 60; excepción = 10; Matriz BLOSUM62; Descripciones = 50 secuencias; clasificado por = ALTA PUNTUACIÓN; Base de datos = no redundante, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + traducciones de CDS GenBank + Swiss protein + Spupdate + PIR. Los detalles de estos programas son fácilmente disponibles. De manera alternativa, se puede determinar la homología por hibridación de polinucleótidos bajo condiciones que forman dúplex estables, entre regiones homologas, seguido por digestión con nucleasas específicas, de hebra individual y determinación de tamaño de los fragmentos digeridos . Las secuencias de ADN que son sustancialmente homologas se pueden identificar en un experimento de hibridación Southern bajo, por ejemplo condiciones severas, como se define para este sistema particular. Las definiciones de las regiones de hibridación apropiadas están dentro de la habilidad de la técnica. Ver, por ejemplo Sambrook et al., supra; DNA Cloning, supra; Nucleic Acid Hybridization, supra. "Recombinante" como se usa en la presente describe una molécula de ácido nucleico que significa un polinucleótido de origen genómico, de ADNc, viral, semisintético o sintético que, en virtud de su origen o manipulación no esta asociado con todo o una porción del polinucleótido con el cual está asociada a la naturaleza. El término "recombinante" como se usa con respecto a una proteína o polipéptido significa un polipéptido producido por la expresión de un polinucleótido recombinante. En general, el gen de interés se clona y entonces se expresa en organismos transformados, como se describe más adelante de forma adicional. El organismo hospedador expresa el gen extraño para producir la proteína bajo condiciones de expresión. Un "anticuerpo" propone una molécula que "reconoce" es decir, se une de forma específica a un epítopo de interés presente en un antígeno. Por "se une de forma específica" se propone que el anticuerpo interactúe con el epítopo en un tipo de interacción de "candado y llave" para formar un complejo entre el antígeno y el anticuerpo, como lo opuesto a la unión no específica y que puede presentarse entre el anticuerpo y por ejemplo los componentes en una mezcla que incluye la sustancia de prueba con la cual se hace reaccionar el anticuerpo. De esta manera, un anticuerpo anti-HBV es una molécula que se une de forma específica a un epítopo de una proteína de HBV. El término "anticuerpo" como se usa en la presente incluye anticuerpos obtenidos tanto de preparaciones policlonales como monoclonales, así como, los siguientes: moléculas de anticuerpo híbridos (quiméricos) (ver, por ejemplo, Winter et al., Nature (1991) 349:293-299; y Patente de los Estados Unidos No. 4,816,567); fragmentos F(ab')2 y F(ab); moléculas Fv (heterodímeros no covalentes, ver, por ejemplo, Inbar et al., Proc Nati Acad Sci USA (1972) 69:2659-2662; y Ehrlch et al., Biochem (1989) 19:4091-4096); moléculas Fv de cadena individual (sFv) (ver, por ejemplo, Huston et al., Proc Nati Acad Sci USA (1988) 85_: 5879-5883) ; construcciones de fragmentos de anticuerpo diméricos y triméricos; minicuerpos (ver, por ejemplo, Pack et al., Biochem (1992) 31: 1579-1584 ; Cumber et al., J Immunology (1992) 149B: 120-126) ; moléculas de anticuerpo humanizado (ver, por ejemplo, Riechmann et al., Nature (1988) 332:323-327; Verhoeyan et al., Science (1988) 239 : 1534-1536; y Publicación de Patente del Reino Unido No. GB 2,276,169, publicada el 21 de Septiembre de 1994); y cualquier fragmento funcional obtenido de estas moléculas, en donde estos fragmentos retengan propiedades de unión inmunológica de la molécula de anticuerpo de origen. Como se usa en la presente, el término "anticuerpo monoclonal" se refiere a una composición de anticuerpo que tiene una población de anticuerpos homogéneos. El término no se limita con respecto a la especie o fuente del anticuerpo, ni se propone que se limite por la manera en la cual se elabora. El término abarca inmunoglobulinas enteras así como fragmentos tal como Fab, F(ab')2, Fv, y otros fragmentos, así como poblaciones de anticuerpos homogéneos quiméricos y humanizados, que exhiben propiedades de unión inmunológica de la molécula de anticuerpo monoclonal de origen. Como se usa en la presente, el término "anticuerpo monoclonal de conejo" se refiere a un anticuerpo monoclonal, como se define anteriormente, producido al inmunizar un conejo con un antígeno de interés (por ejemplo, un HBsAg mutante) . Un "anticuerpo monoclonal de conejo" se puede producir usando hibridomas de conejo-conejo (es decir, fusiones entre una célula productora de anticuerpos a partir del conejo inmunizado con una célula inmortalizada de un conejo) , hibridomas de conejo-ratón (es decir, fusiones entre una célula productora de anticuerpos del conejo inmunizado con una célula inmortalizada de un ratón) , y similares, descrito más completamente más adelante. Un "anticuerpo monoclonal de ratón" se refiere a un anticuerpo monoclonal, como se define anteriormente, producido al inmunizar un ratón, con un antígeno de interés (por ejemplo un HBsAg) . Un "anticuerpo monoclonal de ratón" se produce usando métodos convencionales bien conocidos en la técnica, a partir de hibridomas de ratón-ratón, descrito más adelante. Como se usa en la presente, un "soporte sólido" se refiere a un soporte sólido al cual se puede unir una macromolécula, por ejemplo, un anticuerpo, proteína, polipéptido, péptido, polinucleótido, tal como una cuenta magnética, cuenta de látex, cavidad de placa de microtítulo, placa de vidrio, nylón, agarosa, poliacrilamida, partícula de sílice, membrana de nicrocelulosa y similares. "Inmunológicamente reactivo" significa que el anticuerpo en cuestión reaccionara de forma específica con antígenos de HBV presentes en una muestra biológica de un individuo infectado con HBV. Por "fragmento inmunorreactivo" de un anticuerpo, es una molécula que consiste de solo una porción de la secuencia y estructura intacta de anticuerpo, y que es inmunológicamente reactivo como se define anteriormente. Los ejemplos no limitantes de estos fragmentos inmunorreactivos incluyen moléculas de F(ab')2, Fv y sFv, que son capaces de exhibir propiedades de unión inmunológica de la molécula de anticuerpo de origen de la cual se derivan. "Complejo in unitario" significa la combinación formada cuando un anticuerpo se uñe a un epítopo en un antígeno. Como se usa en la presente, una "muestra biológica" se refiere a una muestra de tejido o fluido aislado de un sujeto tal como, de manera enunciativa y sin limitación, sangre, plasma, plaquetas, suero, materia fecal, orina, médula ósea, bilis, fluido espinal, fluido linfático, fluido cerebroespinal, muestras de piel, secreciones de la piel, tracto respiratorio, intestinal y genitourinario, lagrimas, saliva, leche, células sanguíneas, órganos, biopsias y también muestras de constituyente de cultivo celular in vitro que incluye de manera enunciativa y sin limitación medios acondicionados que resultan del crecimiento de células y tejidos en medio de cultivo, por ejemplo, células recombinantes, y componentes celulares. Las muestras detalladas anteriormente no necesitan estar necesariamente en la forma obtenida directamente de la fuente. Por ejemplo, la muestra se puede tratar antes del uso, tal como por ejemplo, por calentamiento, centrifugación, etc., antes del análisis. Como se usa en la presente, los términos "marca" y "marca detectable" se refiere a una molécula capaz de detección, incluyendo de manera enunciativa y sin limitación, isótopos radioactivos, agentes fluorescentes, nanocristales semiconductores, agentes quimioluminiscentes, cromóforos, enzimas, sustratos enzimáticos, con factores enzimáticos, inhibidores enzimáticos, inhibidores enzimáticos, tintes, iones metálicos, soluciones coloidales de metales, ligandos (por ejemplo biotina, estreptavidina o haptenos) y similares. El término "agente fluorescente", se refiere a una sustancia o una porción de la misma que es capaz de exhibir fluorescencia en el intervalo detectable. Los ejemplos particulares de marcas que se pueden usar de acuerdo con la invención incluyen, de manera enunciativa y sin limitación, peroxidasa de rábano (HRP) , fluoresceína, FITC, rodamina, dansilo, umbeliferoma, éster de dimetil-acridinio (DMAE) , Rojo de Texas, luminol, NADPH y a-ß-galactosidasa .

II. Modos para Llevar a Cabo la Invención Antes de describir la presente invención en detalle, se va a entender que esta invención no se limita a las formulaciones particulares o parámetros particulares de proceso tal que estos pueden variar, por supuesto. También se va a entender que la terminología usada en la presente es para el propósito de describir modalidades particulares de la invención únicamente y no se propone que sea limitante. Aunque se pueden usar varios métodos y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos en la presente, en la práctica de la invención, los materiales y métodos preferidos se describen en la presente. La presente invención se basa en el descubrimiento que nuevos anticuerpos monoclonales de conejo, dirigidos contra HBsAg mutantes, son más inmunorreactivos en ensayos para detectar infección de HBV que los anticuerpos monoclonales convencionales de ratón. Los anticuerpos monoclonales de conejo de la presente invención son reactivos con una variedad más amplia de mutantes de HBsAg que los anticuerpos monoclonales convencionales de ratón. Además, los anticuerpos monoclonales de conejo de la presente invención son también típicamente reactivos con los HBsAg tipo silvestre. En realidad, un anticuerpo monoclonal de conejo individual de acuerdo a la presente invención es tan efectivo como el uso de múltiples anticuerpos monoclonales de ratón para detectar . la presencia de antígenos de HBV, que será indicativo de infección de HBV. De esta manera, los anticuerpos monoclonales de conejo de la presente invención disminuyen el número de negativos falsos obtenidos con ensayos que usan, por ejemplo, anticuerpos monoclonales de ratón y por lo tanto son útiles en los métodos de diagnóstico para detectar exactamente infección de HBV. Los ensayos de la presente invención también pueden utilizar anticuerpos adicionales, tal como anticuerpos monoclonales adicionales de ratón, para proporcionar la capacidad para diagnosticar infección de HBV para una amplia variedad de aislados y mutantes evasivos. Los métodos son útiles para detectar infección de HBV en humanos, así como para detectar infección de HBV en muestras sanguíneas, incluyendo sin limitación, en sangre entera, suero, plaquetas y plasma, así como en tejidos y órganos para transplante, en particular al detectar la presencia de antígenos de HBV o anticuerpos de HBV. De esta manera, los métodos se pueden usar para diagnosticar infección de HBV en un sujeto, tal' como un sujeto humano, así como para detectar contaminación de HBV en muestras sanguíneas donadas. Se pueden detectar alícuotas de muestras donadas individuales o muestras mezcladas para la presencia de HBV u otras muestras o muestras mezcladas contaminadas con HBV se pueden eliminar antes de que se combinen. Esta manera, se puede proporcionar un suministro sanguíneo sustancialmente libre de contaminación de HBV. De manera similar, las muestras de tejidos y órganos que se van a usar en el transplante también se pueden detectar a fin de eliminar especímenes contaminados. A fin de entender adicionalmente la invención, se proporciona un análisis más detallado a continuación con respecto a los antígenos de HBV, anticuerpos y métodos de diagnóstico para el uso con la presente invención.

Antígenos de Superficie de HBV Los antígenos de superficie de hepatitis B están constituidos de tres clases de tamaños de proteínas que comparten las secuencias carboxi-terminales . Estas proteínas incluyen grande (L, el dominio preS2) , medio (M, el dominio preSl) , y pequeño (S, el dominio sAg) . Las tres proteínas se encuentran en viriones infecciosos (frecuentemente referidos como partículas Dañe) recuperados como esferas de 42 nm del suero de pacientes infectados. Las muestras de suero también contienen partículas esféricas vacías que promedian 22 nm, que contienen principalmente la clase S de proteínas (sAg) . Las líneas de células de mamífero transfectadas exclusivamente con ADN que codifica para la proteína de sAg liberan esferas vacías de 20 nm similares a aquellas de las células infectadas. Además, las células de levadura transformadas con el mismo gen forman esferas análogas, que se encuentra que son igualmente inmunogénicas como las esferas de 22 nm de células infectadas. Ver, por ejemplo, "HBV Vaccines - from the laboratory to license: a case study" in Mackett, M. and Williamson, J.D., Human Vaccines and Vaccination, pp. 159-176, para un análisis de la estructura de HBV; y Patentes de los Estados Unidos Nos. 4,722,840, 5,098,704, 5,324,513, 5,965,140, Beames et al., J. Virol. (1995) 69:6833-6838, Birnbaum et al., J. Virol . (1990) 64:3319-3330, Zhou et al., J. Virol. (1991) 65:5457-5464, para descripciones de la producción recombinante de varias partículas de HBV. De esta manera, como se explica anteriormente, los HBsAg para el uso en la producción de anticuerpos monoclonales de conejo de la presente invención pueden incluir regiones inmunogénicas de sAg, preSl y/o preS2, así como regiones inmunogénicas de cualquier combinación de los anteriores, tal como sAg/preSl, sAg/preS2 y sAg/preSl/preS2. Opcionalmente, un polipéptido de HBsAg puede contener más de un polipéptido de sAg, preSl, o preS2. Adicionalmente, los polipéptidos de sAg, preSl y preS2 se pueden derivar de los mismos o diferentes aislados de HBV. Estos polipéptidos también se pueden proporcionar como una proteína de fusión o como polipéptidos separados. Las secuencias de los HBsAg de cientos de diferentes aislados de HBV se conocen y se pueden obtener fácilmente de la base de datos NCBI . Un HBsAg preferido para el uso en la invención comprende al menos la secuencia de aminoácidos de la región determinante "a" de HBV (aminoácidos 124-147, numerados con relación al sAg) . Las secuencias representativas tipo silvestre para esta región son CTTPAQGNSMFPSCCCTKPSDGNC (SEQ ID NO: 4, adw tipo silvestre); y CMTTAQGTSMYPSCCCTKPSDGNC (SEQ ID NO:5, ayw tipo silvestre). Las mutaciones en esta región de sAg se han encontrado en un gran número de evasores de vacuna de HBV. Para descripciones de varias variantes de HBsAg, ver, Ashton-Richardt PG, Murray K. (1989) Mutants of the hepatitis B virus surface antigen and define some antigenically essential residues in the immunodominant "a" región, J. Medical Virologu 29: 196-203; Norder H. Courouce A_M, Magnius L (1992) Molecular basis of hepatitis B virus serotype variation within the four major subtype. J. General Virology 73: 3141 - 3145; Carman WF, Zanetti AR, et al. (1999) Vaccine-induced escape mutant of hepatitis B virus. Lancet 336-329; Fujii H. Moriyama K. et al. Gly 145 to Arg substitution in HBs antigen of immune escape mutant of hepatitis B virus. Biochem. Biophys Res Comm 184; 1152-2257; Carman, W. Vaccine-associated mutants of hepatitis B virus. Viral Hepatitis and Liver Desease (1945) pp:243-247, Eds : K. Nishioka, H. Suzuki, S. Mushiro T. Oda) . De esta manera, los HBsAg que incluyen mutaciones en esta región son particularmente útiles en la presente. Los mutantes representativos para esta región incluyen F134A, G134S, G145R, S143L, P142S y Q129R/M133T. En cada una de las designaciones mutantes, el número indica la posición del aminoácido sustituido, la letra antes del número indica el aminoácido en esa posición en la secuencia de WT y la letra después del número indica el aminoácido en esa posición en el mutante. Estos mutantes son solo representativos y se va a entender que existe un gran número de mutantes adicionales que se presentan de forma natural, mutantes que encontraran uso con la presente invención. Adicionalmente, los mutantes sintéticos con mutaciones en la región de terminante "a" también encontrarán uso en la presente. Las variantes que tienen mutaciones en as regiones diferentes de la región determinante "a" como se define anteriormente, también puede encontrar uso con la presente invención. Por ejemplo, la variante que tiene una sustitución de Q por P en la posición 120 de aminoácido (P120Q) , encuentra uso como antígeno para generar anticuerpos monoclonales. Se pueden obtener, usando técnicas normales, antígenos para el uso con la presente invención. Los antígenos de HBV se pueden generar de manera conveniente usando métodos recombinantes, bien conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, patentes de los Estados Unidos números 4,772,840; 5,098,704; 5,324,513; 5,965,140 y 6,306,625, para descripciones de la producción recombinante de antígenos de HBV. Por ejemplo, se puede aislar la secuencia codificante de la proteína S de HBsAg por extracción con fenol del ADN de las partículas Dañe presentes en suero humano infectado, usando métodos conocidos en la técnica, tal como se describe en la patente de los Estados Unidos número 4,710,463. El ADN aislado se puede digerir entonces con una endonucleasa de restricción. La elección de endonucleasa dependerá, en parte, de las partículas Dañe particulares. Por ejemplo, la secuencia codificante de HBsAg del ADN de HBV de ciertas partículas Dañe del serotipo adw se pueden aislar como un fragmento de BamHI individual; la secuencia codificante de HBsAg del ADN de HBV de ciertas partículas Dañe del serotipo ayw se puede aislar como un fragmento de Hhal. El ADN de HBV de las partículas Dañe del mismo serotipo también puede exhibir diferentes patrones de sitios de restricción. Se pueden contemplar sondas de oligonucleótidos en base a secuencias conocidas del genoma de HBV y usar para sondear bibliotecas genómicas o de ADNc para genes de HBV que codifican para los antígenos útiles en la presente invención. Los genes entonces se pueden aislar adicionalmente usando técnicas normales, y si se desea, enzimas de restricción empleadas para mutar el gen en porciones deseadas de la secuencia de longitud completa. Ver, por ejemplo, Sambrook et al., supra, para una descripción de las técnicas usadas para obtener y aislar el ADN. Finalmente, se pueden producir de forma sintética los genes que codifican para los antígenos de HBV, en base a secuencias conocidas. La secuencia de nucleótidos se puede diseñar con los codones apropiados para la secuencia particular de aminoácidos deseada. En general, se seleccionarán codones preferidos para el hospedador propuesto en el cual se expondrá la secuencia. La secuencia completa se monta en general de los oligonucleótidos de traslape preparados por métodos normales y montados en una secuencia codificante completa. Ver, por ejemplo, Edge, Nature (1981) 292:756; Nambair et al., Science (1984) 223:1299; Jay et al., J. Biol. Chem. (1984) 259:6311. Los polinucleótidos pueden comprender secuencias codificantes para los varios polipéptidos que se presentan de forma natural o pueden incluir secuencias artificiales que no se presentan en la naturaleza. Estos polinucleótidos se pueden ligar para formar una secuencia codificante para una proteína de fusión, si se desea, usando técnica normales de biología molecular. Una vez que se han preparado o aislado secuencias codificantes, estas secuencias se pueden clonar en cualquier vector o replicón adecuado. Se conocen por aquellos expertos en la técnica numerosos vectores de clonación, y es una materia de elección la selección de un vector de clonación apropiado. Los vectores adecuados incluyen, de manera enunciativa y sin limitación, plásmidos, fagos, transposones, cósmidos, cromosomas o virus que son capaces de la replicación cuando se asocian con los elementos de control apropiados. Las secuencias codificantes entonces se colocan bajo el control de elementos adecuados de control, dependiendo del sistema que se va a usar para la expresión.

De esta manera, la secuencia codificante se puede colocar bajo el control de un promotor, sitio de unión a ribosoma (para expresión bacteriana) y, opcionalmente, un operador, de modo que la secuencia de ADN de interés se transcriba en ARN por una transformante adecuada. La secuencia codificante puede contener o no un péptido de señal o secuencia guía que se puede remover más adelante por el hospedador en el procesamiento pos-transduccional . Ver, por ejemplo, patentes de los Estados Unidos números 4,431,739; 4,425,437; 4,338,397. Si está presente, la secuencia de señal puede ser la guía nativa encontrada en asociación con el antígeno de interés de HBV. De manera alternativa, puede estar presente una secuencia de señal heteróloga que puede incrementar la eficiencia de la secreción. Se conocen en la técnica varias secuencias guía representativas e incluyen, sin limitación, la guía del a-factor de levadura, el péptido de señal de TPA, el péptido de señal de Ig y similares. Son bien conocidas las secuencias para éstas y otras secuencias guía. Además de controlar las secuencias, puede ser deseable adicionar secuencias reguladoras que permitan la regulación de la expresión de las secuencias con relación al crecimiento de la célula hospedadora. Las secuencias reguladoras se conocen por aquellos expertos en la técnica, los ejemplos incluyen aquellas que provocan que se active c desactive la expresión de un gen en respuesta a un estímulo químico o físico, incluyendo la presencia de un compuesto regulador. También pueden estar presentes otros tipos de elementos reguladores en el vector. Por ejemplo, se pueden usar en la presente elementos intensificadores para incrementar los niveles de expresión de las construcciones. Los ejemplos incluyen el intensificador de gen temprano de SV40 (Dijkema et al. (1985) EMBO J. 4:761), el intensificador/promotor derivado de la repetición terminal larga (LTR) del Virus de Sarcoma de Rous (Gorman et al. (1982) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 7_9:6777) y elementos derivados de CMV humano (Boshart et al. (1985) Cell 41:521), tal como elementos incluidos en la secuencia del intrón A de CMV (patente de los Estados Unidos número 5,688,688). El cartucho de expresión puede incluir además un origen de replicación para replicación autónoma en una célula hospedadora adecuada, uno o más marcadores seleccionables, uno o más sitios de restricción, un potencial para un alto número de copia y un promotor fuerte. Se construye un vector de expresión de modo que la secuencia de codificación particular se localiza en el vector con las secuencias reguladoras apropiadas, la colocación y orientación de la secuencia codificante con respecto a las secuencias de control que es tal que la secuencia codificante se transcribe bajo el "control" de las secuencias de control (es decir, la ARN-polimerasa que se une a la molécula de ADN en las secuencias de control transcribe la secuencia codificante) . Puede ser deseable para lograr este fin la modificación de las secuencias que codifican para la molécula de interés. Por ejemplo, en algunos casos puede ser necesario modificar la secuencia de modo que se pueda unir a las secuencias de control en la orientación apropiada; es decir, para mantener el cuadro de lectura. Las secuencias de control y otras secuencias reguladoras se pueden ligar a la secuencia codificante antes de la inserción en un vector. De manera alternativa, la secuencia codificante se puede clonar directamente en un vector de expresión que contenga ya la secuencia de control y un sitio apropiado de restricción. Se puede construir o utilizar cualquier vector de expresión adecuado para expresar cualquier forma de HBsAg de la invención. Un vector de ejemplo es pCMVII, un vector de clonación basado en pUC19 diseñado para la expresión en células de mamífero. pCMVII comprende los siguientes elementos: intensificador/promotor IE de CMV humano, intrón A de CMV humano, una guía del activador de plasminógeno de tejido humano (tPA) , un terminador de poli A de hormona de crecimiento bovina (BGHt) , origen de replicación de ColEl, y el gen de resistencia a ampicilina Amp R. Por ejemplo, pCMVII-pS2-sAg se puede usar para la expresión de preS2-sAg. En este vector, la secuencia codificante para los dominios sAg y preS2 de HBsAg se ha insertado en pCMVII entre el intrón A de CMV y BGHt. Este vector también se puede modificar al remover, por ejemplo el dominio preS2 o al adicionar la secuencia codificante para el dominio preSl. Estos vectores se proporcionan a manera de ejemplo y no se propone que limiten el alcance de la invención. Los vectores anteriores se describen en detalle en la patente de los Estados Unidos número 6,740,323. Como se explica anteriormente, también puede ser deseable producir mutantes o análogos del polipéptido de interés. Los mutantes o análogos de los polipéptido de HBV para el uso en las presentes composiciones se pueden preparar por la supresión de una porción de la secuencia que codifica para la molécula de interés, por inserción de una secuencia, y/o por sustitución de uno o más nucleótidos dentro de la secuencia. Las técnicas para modificar secuencias de nucleótidos, tal como mutagénesis dirigida al sitio, y similares, son bien conocidas por aquellos expertos en la técnica. Ver, por ejemplo, Sambrook et al., supra; Kunkel, T.A. (1985) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA (1985) 82^:448; Geisselsoder et al. (1987) BioTechniques 5:786; Zoller y Smith (1983) Methods Enzymol . 100:468; Dalbie-McFarland et al. (1982) Proc. Nati. Acad. Sci EUA 79:6409. Las moléculas se pueden expresar en una amplia variedad de sistemas, incluyendo sistemas de expresión de insecto, mamífero, bacteriano, viral y de levadura, todos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, los sistemas de expresión en células de insecto, tal como sistemas de baculovirus, se conocen por aquellos expertos en la técnica y se describen en, por ejemplo, Summers y Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555 (1987) . Los materiales y métodos para los sistemas de expresión en células de insecto/baculovirus están comercialmente disponibles en forma de equipo inter alia, de Invitrogen, San Diego CA (equipo "MaxBac"). De manera similar, los sistemas de expresión en células bacterianas y de mamífero son bien conocidos en la técnica y se describen en, por ejemplo, Sambrook et al., supra. Los sistemas de expresión de levadura también se conocen en la técnica y se describen en, por ejemplo, Yeast Genetic Engineering (Barr et al., eds., 1989) Butterworths, Londres. También se conocen varias células hospedadoras apropiadas para el uso con los sistemas anteriores. Por ejemplo, se conocen en la técnica líneas de células de mamífero e incluyen líneas de células inmortalizadas disponibles de la American Type Culture Collection (ATCC) , tal como de manera enunciativa y sin limitación, células de ovario de hámster Chino (CHO) , células HeLa, células de riñon de hámster neonato (BHK) , células de riñon de mono (COS) , células de riñon embriónico humano, células de carcinoma hepatocelular humano (por ejemplo, Hep G2) , células de riñon bovino de Madin-Darby ( "MDBK" ) , así como otras. De manera similar, los hospedadores bacterianos tal como E. coli, Bacillus subtilis, y Streptococcus spp., encontrarán uso con las presentes construcciones de expresión. Los hospedadores de levadura útiles en la presente invención incluyen, inter alia, Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Candida maltosa, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lactis, Pichia guillerimondii, Pichia pastoris, Schizosaccharomyces pombe y Yarrowia lipolytica. Las células de insecto para el uso con los vectores de expresión de los baculovirus incluyen, inter alia, Aedes aegypti, Autographa californica, Bombyx mori, Drosophila melanogaster, Spodoptera frugiperda, y Trichoplusia ni. Las moléculas de ácido nucleico que comprenden secuencias de nucleótidos de interés se pueden integrar de manera estable en un genoma de célula hospedadora o mantener en un elemento episomal estable en una célula hospedadora adecuada usando varias técnicas de distribución técnica bien conocidas. Ver, por ejemplo, patente de los Estados Unidos número 5,399,346. Dependiendo del sistema de expresión en el hospedador seleccionado, las moléculas se producen al cultivar células hospedadoras, transformadas por un vector de expresión descrito anteriormente bajo condiciones con las cuales se exprese la proteína. La proteína expresada entonces se aisla de las células hospedadoras y se purifica.

Si el sistema de expresión segrega la proteína del medio de crecimiento, el producto se puede purificar directamente del medio. Si no se segrega, se puede aislar de los lisados celulares. La selección de las condiciones apropiadas de crecimiento y los métodos de recuperación están dentro de la habilidad de la técnica. Los antígenos de HBV también se pueden sintetizar usando síntesis química de polímeros tal como síntesis de péptidos en fase sólida. Estos métodos se conocen por aquellos expertos en la técnica. Ver, por ejemplo, J. M. Stewart y J. D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd Ed. , Pierce Chemical Co., Rockford, IL (1984) y G. Barany y R. B. Merrifield, The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, edotors E. Gross y J. Meienhofer, Vol. 2, Academia Press, Nueva York, (1989), pág. 3-254, para técnicas de síntesis de péptidos en fase sólida. Los antígenos de HBV, obtenidos como se describe anteriormente, entonces se usan para producir anticuerpos monoclonales de conejo para el uso en diagnóstico.

Anticuerpos anti-HBV Los antígenos de HBV se pueden usar para producir anticuerpos policlonales y monoclonales específicos de HBV para el uso en ensayos de detección y de diagnóstico. Los anticuerpos policlonales y monoclonales específicos de HBV se unen en forma específica a antígenos de HBV. En particular, los antígenos de HBV se pueden usar para producir anticuerpos policlonales al administrar el antígeno de HBV a un mamífero, tal como un ratón, una rata, un conejo, una cabra o un caballo. El suero del animal inmunizado se recolecta y los anticuerpos se purifican del plasma por ejemplo, por precipitación con sulfato de amonio, seguido por cromatografía, de manera preferente cromatografía de afinidad. Son bien conocidas las técnicas para producir y procesar antisueros policlonales. Los anticuerpos monoclonales de conejo y ratón dirigidos contra epítopos específicos de HBV presentes en las proteínas también se pueden introducir fácilmente. A fin de producir anticuerpos monoclonales, el mamífero de interés, tal como un conejo o ratón, se inmuniza, tal como al mezclar o emulsionar el antígeno en solución salina, de manera preferente en un adyuvante tal como el adyuvante completo de Freund ("FCA"), y al inyectar la mezcla o emulsión de forma parenteral (en general de forma subcutánea o intramuscular) . El animal se refuerza en general 2-6 semanas después con una o más inyecciones del antígeno en solución salina, de manera preferente usando el adyuvante incompleto de Freund ("FIA"). En una modalidad, el animal se inmuniza con uno o más mutantes de HBsAg, de manera preferente se usa una mezcla de 2 a 5 de diferentes mutantes de HBsAg. Los HBsAg tipo silvestre también se pueden incluir en el inmunógeno. En un régimen preferido, el animal, de manera preferente un conejo, se inmuniza de forma inicial con un HBsAg tipo silvestre, y posteriormente se refuerza con uno o más mutantes de HBsAg. Particularmente útiles como inmunógenos son los mutantes de HBsAg que se han encontrado que se presentan de forma natural, por ejemplo, D3, D2, DI, Yl, Y2, descritos más delante de forma adicional . Los anticuerpos también se pueden generar por inmunización in vi tro, usando métodos conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, James et al., J. Immunol . Meth (1987) 100:5-40. Entonces se obtienen antisueros policlonales del animal inmunizado. Sin embargo, en lugar de sangrar al animal para extraer el suero, se remueve el bazo (y opcionalmente varios nodulos linfáticos grandes) y se desasocia en células individuales. Si se desea, las células del bazo (esplenocitos) se pueden detectar (después de la remoción de células no específicamente adherente) al aplicar una suspensión celular a una placa o cavidad revestida con el antígeno. Las células B, que expresan inmunoglobulina unida a membrana específica para el antígeno, se unirán a la placa, y no se enjuagan con el resto de la suspensión. Las células B resultantes, o todos los splenocitos disociados, entonces se inducen a fusionarse con las células de una línea de células inmortalizadas (también llamada un "compañero de fusión"), para formar hibridomas. Típicamente, el compañero de fusión incluye una propiedad que permite la selección de los hibridomas resultantes usando medios específicos. Por ejemplo, los compañeros de fusión pueden ser sensibles a hipoxantina/aminopterina/timidita (HAT) . Si se desean hibridomas de conejo-conejo, la línea de células inmortalizadas será de un conejo. Estos compañeros de fusión derivados de conejo se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo, células de origen linfoide, tal como células de un plasmacitoma de conejo como se describe en Spieker-Polet et al., Proc. Nati. Acad. Sci EUA (1995) 92:9348-9352 y en la patente de los Estados Unidos número 5,675,063 o el compañero de fusión TP-3 descrito en la patente de los Estados Unidos número 4,859,595. Si se desea un hibridoma de conejo-ratón o un hibridoma de rata-ratón o ratón-ratón, o similar, el compañero de fusión de ratón se derivará de una línea de células inmortalizadas de un ratón, tal como una célula de origen linfoide, típicamente de una línea de células de mieloma de ratón. Se conocen en la técnica varias de estas líneas celulares y están disponibles de la ATCC. La fusión se logra usando técnicas bien conocidas. Los productos químicos que promueven la fusión se refieren comúnmente como fusógenos . Estos agentes son extremadamente hidrófilos y facilitan el contacto con la membrana. Un método particularmente preferido de fusión celular usa polietilenglicol (PEG) . Otro método de fusión celular es electrofusión. En este método, se exponen las células a una descarga eléctrica predeterminada que altera el potencial de la membrana celular. Los métodos adicionales para fusión celular incluyen métodos de fusión en puente. En este método, el antígeno se biotinila y se trata con avidina el compañero de fusión. Cuando se adicionan conjuntamente las células, se forma un puente de célula B reactiva a antígeno-antígeno-biotina-avidina-compañero de fusión. Esto permite la fusión específica de una célula reactiva a antígeno con una célula inmortalizada. 'El método puede emplear adicionalmente medios químicos o eléctricos para facilitar la fusión celular. Después de la fusión, las células se cultivan en un medio selectivo (por ejemplo, medio HAT) . A fin de mejorar la secreción del anticuerpo, se puede usar de forma opcional un agente que tiene efectos de estimulación secretoria, tal como IL-6. Ver, por ejemplo, Liguori et al., Hybridoma (2001) 2_0: 189-198. Los hibridomas resultantes se pueden colocar en placa al limitar la dilución, y valorar para la producción de anticuerpos que se unen de forma específica al antígeno inmunizador (y que no se unen a antígenos no relacionados) . Los hibridomas seleccionados que segregan anticuerpos monoclonales entonces se cultivan ya sea in vi tro (por ejemplo, en botellas de cultivo de tejido o reactores de fibra hueca), o in vivo (por ejemplo, como ascitis en ratón) . Por ejemplo, se pueden identificar hibridomas que producen anticuerpos específicos de HBV usando RÍA o ELISA y aislar al clonar en agar semisólido o al limitar la dilución. Se pueden aislar clones que producen anticuerpos específicos de HBV por otra ronda de detección. Una técnica alternativa para generar los anticuerpos monoclonales de conejo de la presente invención es el método seleccionado de anticuerpos-linfocito (SLAM) . Este método comprende identificar un linfocito individual que está produciendo un anticuerpo con la especificidad deseada o función deseada dentro de una gran población de células linfoides. La información genética que codifica para la especificidad del anticuerpo (es decir, el ADN de la inmunoglobulina VH y VL) entonces se rescata y clona. Ver, por ejemplo, Babcook et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA (1996) 93:7843-7848, para una descripción de este método. Para descripciones adicionales de anticuerpos monoclonales de conejo y métodos para elaborar los mismos a partir de fusiones de conejo-conejo y conejo-ratón, ver, por ejemplo, patente de los Estados Unidos número 5,675,063 (conejo-conejo); 4,859,595 (conejo-conejo); 5,472,868 (conejo-ratón), y 4,977,081 (conejo-ratón). Para una descripción de la producción de anticuerpos monoclonales convencionales de ratón, ver, por ejemplo, Kohler y Milstein, Nature (1975) 256:495-497. Puede ser deseable proporcionar anticuerpos quiméricos. Se pueden formar anticuerpos quiméricos compuestos de secuencias de aminoácidos humanas y no humanas a partir de las moléculas de anticuerpos monoclonales descritas anteriormente para reducir su inmunogenicidad en humanos (Winter et al. (1991) Nature 349:293, Lobuglio et al. (1989) Proc. Nati. Acad. Sci EUA 86:4220; Shaw et al. (1987) J Immunol. 138 :4534; y Brown et al. (1987) Cáncer Res. 47:3577; Riechmann et al. (1988) Nature 332:323; Verhoeyen et al. (1988) Science 239:1534; y Jones et al. (1986) Nature 321:522; publicación EP no. 519,596, publicada el 23 de diciembre de 1992; y publicación de patente del Reino Unido número GB 2,276,179, publicada el 21 de septiembre de 1994) . Los fragmentos de moléculas de anticuerpo, por ejemplo, las moléculas de F(ab')2, Fv, y sFv, que son capaces de exhibir propiedades de unión inmunológica de la molécula de anticuerpo monoclonal de origen se pueden producir usando técnicas conocidas. Inbar et al. (1972) Proc. Nat. Acad. Sci EUA 69:2659; • Hochman et al. (1976) Biochem 15:2706; Ehrlich et al. (1980) Biochem 19:4091; Huston et al. (1988) Proc. Nat. Acad. Sci. EUA 85 (16) : 5879; y patentes de los Estados Unidos números 5,091,513 y 5,132,405, de Houston et al.; y 4,946,778, de Ladner et al. En la alternativa, se puede usar un sistema de exhibición en fagos para expandir las poblaciones de moléculas de anticuerpos monoclonales in vitro. Saiki, et al. (1986) Nature 324 :163; Scharf et al. (1986) Science 233:1076; patentes de los Estados Unidos números 4,683,195 y 4,683,202; Yang et al. (1995) J Mol Biol 254:392; Barbas, III et al. (1985) Methods: Comp. Meth Enzymol 8:94; Barbas, III et al. (1991) Proc Nati Acad Sci EUA 88:7978. Una vez generada, la biblioteca de exhibición en fagos se puede usar para mejorar la afinidad de unión inmunológica de las moléculas de Fab usando técnicas conocidas. Ver, por ejemplo, Figini et al. (1994) J. Mol. Biol. 239:68. Las secuencias codificantes para las porciones de cadena pesada y ligera de las moléculas de Fab seleccionadas de la biblioteca de exhibición en fagos se pueden aislar o sintetizar, y clonar en cualquier vector o replicón adecuado para expresión. Se puede usar cualquier sistema de expresión adecuado, incluyendo aquellos descritos anteriormente . Las secuencias de polinucleótido que codifican para los anticuerpos monoclonales de conejo y los fragmentos inmunorreactivos de los mismos, descritos anteriormente, se obtiene fácilmente usando técnicas normales, bien conocidas, tal como aquellas técnicas descritas anteriormente con respecto a los HBsAg. Los anticuerpos que se dirigen contra epítopos de HBV, son particularmente útiles para detectar la presencia de HBV o antígenos de HBV en una muestra, tal como una muestra de suero de un humano infectado con HBV. Un inmunoensayo para un antígeno de HBV puede utilizar un anticuerpo o varios anticuerpos ya sea solos o en combinación con antígenos de HBV. Un inmunoensayo para un antígeno de HBV puede usar, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal dirigido hacia un epítopo de HBV, una combinación de anticuerpos monoclonales dirigidos hacia epítopos de un polipéptido de HBV, anticuerpos monoclonales dirigidos hacia epítopos de diferentes polipéptidos de HBV, anticuerpos policlonales dirigidos hacia el mismo antígeno de HBV, anticuerpos policlonales dirigidos hacia diferentes antígenos de HBV, o una combinación de anticuerpos monoclonales y policlonales. Por ejemplo, se pueden usar tanto anticuerpos monoclonales de conejo como de ratón en los presentes ensayos . Los protocolos de inmunoensayos se pueden basar, por ejemplo, en ensayos de competición, de reacción directa, o tipo intercalación, por ejemplo, el anticuerpo marcado, y se describen más delante de forma adicional. Las marcas pueden ser, por ejemplo, fluorescentes, quimioluminescentes o radioactivas. Los anticuerpos anti-HBV se pueden usar adicionalmente para aislar partículas de HBV o antígenos por columnas de inmunoafinidad. Los anticuerpos se pueden fijar a un soporte sólido por ejemplo por adsorción o por enlace covalente de modo que los anticuerpos retengan su actividad inmunoselectiva. Opcionalmente, se pueden incluir grupos separadores de modo que permanezca accesible el sitio de unión a antígeno del anticuerpo. Los anticuerpos inmovilizados entonces se pueden usar para unirse a partículas o antígenos de HBV de una muestra biológica, tal como sangre o plasma. Las partículas o antígenos de HBV unidos se recuperan de la matriz de columna por ejemplo por un cambio en el pH. Los anticuerpos anti-HBV preferidos son aquellos producidos por las líneas de células de hibridoma 99S9 (CMCC #12336) y 99S6 (CMCC #12337) (ATCC números de acceso PTA-6014 y PTA-6015, respectivamente) así como fragmentos de anticuerpo (por ejemplo, Fab, F(ab')2, Fv, sFv) y anticuerpos quiméricos y humanizados derivados de los mismos.

Ensayos de diagnóstico de HBV Como se explica anteriormente, los anticuerpos anti-HBV producidos como se describe anteriormente, se pueden usar en ensayos para identificar infección de HBV. Los anticuerpos anti-HBV se pueden usar ya sea como el componente de captura y/o el componente de detección en los ensayos, como se describe más delante de forma adicional. De esta manera, la presencia del HBV en una muestra biológica se puede determinar por la presencia de antígenos de HBV y/o anticuerpos anti-HBV como un indicador del HBV en la muestra. Los anticuerpos monoclonales se pueden usar para detectar HBV en muestras sanguíneas, incluyendo sin limitación, en sangre entera, suero, plaquetas y plasma. Los anticuerpos se pueden usar para detectar infección de HBV en un sujeto, tal como un sujeto humano, así como para detectar contaminación de HBV en muestras sanguíneas donadas al detectar la presencia de antígenos de HBV, particularmente HBsAg, y anticuerpos de HBV, dependiendo del ensayo usado. De esta manera, las- alícuotas de muestras donadas individuales o muestras mezcladas se pueden detectar para la presencia de HBV y se pueden eliminar aquellas muestras o muestras mezcladas contaminadas con HBV antes que se combinen. De esta manera, se puede proporcionar un suministro sanguíneo sustancialmente libre de contaminación de HBV. Por "sustancialmente libre de HBV" se quiere decir que la presencia del HBV no se detecta usando los ensayos descritos en la presente. De manera similar, los métodos de la presente invención se pueden usar para detectar muestras potenciales de tejidos y órganos para el trasplante y se pueden descartar tejidos y órganos contaminados. Los ensayos para el uso en la presente incluyen transferencia Western; pruebas de aglutinación; inmunoensayos mediados y marcados con enzimas, tal como ELISA; ensayos tipo biotina/avidita y biotina/estreptavidina; inmunoensayos mediados por proteína A o proteína G; radioinmunoensayos; inmunoelectroforesis; inmunoprecipitación, ensayos de inmunotransferencia en tira, y similares. Las reacciones incluyen en general marcas detectables tal como marcas fluorescentes, quimioluminiscentes, radioactivas, enzimáticas o moléculas de tinte, u otros métodos para detectar la formación de un complejo entre el antígeno de HBV presente en la muestra y el anticuerpo o anticuerpos puestos en contacto con la misma. Los ensayos mencionados anteriormente comprenden en general separación de anticuerpos no unidos, o antígeno en una fase líquida de un soporte de fase sólida al cual se unen los complejos de antígeno-anticuerpo. Los soportes sólidos que se pueden usar en la práctica de la invención incluyen sustratos tal como nitrocelulosa (por ejemplo, en forma de membrana o cavidad de microtítulo) ; cloruro de polivinilo (por ejemplo, hojas o cavidades de microtítulo) ; látex de poliestireno (por ejemplo, cuentas o placas de microtítulo) ; fluoruro de polivinilideno; papel diazotizado; membranas de nylon; cuentas activas, cuentas magnéticamente sensibles, y similares. En un aspecto de la invención, los anticuerpos anti-HBsAg, tal como los anticuerpos monoclonales de conejo descritos en la presente, se usan para capturar o para la detección o ambos de antígenos de HBV, particularmente HBsAg, en una muestra. Los anticuerpos a los HBsAg producidos como se describe anteriormente, se pueden usar para la captura o detección o ambos de antígenos de HBV en una muestra. Por "captura" de un analito (aquí antígenos de HBV en una muestra) se quiere decir que el analito se puede separar de los otros componentes de la muestra en virtud de la unión de la molécula de captura. Típicamente, la molécula de captura está asociada con un soporte sólido, ya sea de forma directa o indirecta. Típicamente, la molécula de detección se asocia con una marca detectable, ya sea de manera directa o indirecta. Típicamente, se hace reaccionar primero un soporte sólido con un componente de fase sólida (por ejemplo, uno o más de los anticuerpos anti-HBV) bajo condiciones adecuadas de unión tal que se inmovilice de forma suficiente al soporte el componente. En unas veces, se puede mejorar la inmovilización al soporte al acoplar primero a una proteína con mejores propiedades de unión. Las proteínas de acoplamiento adecuadas incluyen, de manera enunciativa y sin limitación, proteína A o proteína G, macromoléculas tal como albúminas de suero incluyendo albúmina de suero bovino (BSA) , hemocianina de lapa, moléculas de inmunoglobulina, tiroglobulina, ovalbúmina, y otras proteínas bien conocidas por aquellos expertos en la técnica. De manera alternativa, se puede usar un soporte sólido revestido con estreptavidina o avidita para inmovilizar un anticuerpo biotimilado. Otras moléculas que se pueden usar para unir el anticuerpo al soporte incluyen polisacáridos, áciso polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos y similares. Estas moléculas y métodos de acoplamiento de estas moléculas son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica. Ver, por ejemplo, Brinkley, M.A. Bioconjugate Chem. (1992) 3:2-13; Hashida et al., J. Appl. Biochem. (1984) 6:56-63; y Anjaneyulu y Staros, International J. of Peptide and Protein Res. (1987) 30:117-124. Después de hacer reaccionar él soporte sólido con el componente de fase sólida, se remueven cualquiera de los componentes no inmovilizados de fase sólida de soporte por lavado, y el componente unido al soporte entonces se pone en contacto con una muestra biológica que se sospecha que contiene el analito (por ejemplo, antígeno de HBV) bajo condiciones adecuadas de unión. Después del lavado para remover cualquier analito no unido, se puede adicionar una porción aglutinante secundaria bajo condiciones adecuadas de unión, en donde el aglutinante secundario es capaz de asociarse selectivamente con el ligando unido. La presencia del aglutinante secundario entonces se puede detectar usando técnicas bien conocidas. De manera más particular, se puede usar un método de ELISA, en tanto que las cavidades de una placa de microtítulo estén revestidas, directa o indirectamente, con los anticuerpos de conejo anti-HBV de acuerdo a la presente invención. Los anticuerpos anti-HBV de conejo dirigidos contra uno o más mutantes de HBV como se describe anteriormente se pueden usar. De manera preferente, se usan los anticuerpos monoclonales de conejo producidos por la línea de hibridoma 99S9 ó 99S6. Adicionalmente, también pueden estar presentes otros anticuerpos anti-HBV dirigidos contra HBsAg tipo silvestre, como pueden ser anticuerpos monoclonales adicionales de ratón dirigidos contra un HBsAg tipo silvestre o un mutante de HBsAg. Entonces se adiciona a las cavidades revestidas una muestra biológica que contiene o se sospecha que contiene antígenos de HBV. Después de un periodo de incubación suficiente para permitir la unión antígeno-anticuerpo, la placa se puede lavar para remover porciones no unidas y una molécula adicionada de unión secundaria detectablemente marcada. La molécula de unión secundaria se deja reaccionar con cualquier muestra capturada, la placa se lava y la presencia de la molécula de unión secundaria se detecta usando métodos bien conocidos en la técnica. En un formato particular, se usa un formato de intercalación de antígeno de ELISA. En este caso, el soporte sólido se reviste con anticuerpos anti-HBV dirigidos contra uno o más mutantes de HBV como se describe anteriormente. También pueden estar presentes anticuerpos anti-HBV dirigidos contra HBsAg tipo silvestre. La muestra entonces se pone en contacto con el soporte bajo condiciones que permiten que los antígenos de HBV, si están presentes, se unan a uno o más de los anticuerpos para formar un complejo de antígeno/anticuerpo. Se remueven antígenos no unidos y se adiciona un anticuerpo marcado con enzima que reacciona con el complejo de antígeno/anticuerpo unido, tal como un anticuerpo marcado anti-HBsAg. Se usa un sustrato de enzima para generar una señal. En esta modalidad particular, los anticuerpos anti-HBV que se revisten en el soporte sólido pueden ser anticuerpos monoclonales de conejo de la presente invención, de manera preferente los anticuerpos producidos por el hibridoma 99S9 o hibridoma 99S6, o ambos. De manera alternativa, o además, el anticuerpo detectablemente marcado puede ser un anticuerpo monoclonal de conejo de la presente invención, de manera preferente los anticuerpos producidos por hibridoma 99S9 o hibridoma 99S6, o ambos. En otra modalidad, se puede detectar fácilmente la presencia de analitss de HBV unidos de una muestra biológica usando un aglutinante secundario que comprende un anticuerpo dirigido contra los ligandos de antígeno. Se conocen en la técnica varias moléculas de inmunoglobulina anti-humanas (Ig) que se pueden conjugar fácilmente a una marca enzimática detectable, tal como peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina o ureasa, usando métodos conocidos por aquellos expertos en la técnica. Entonces se usa un sustrato de enzima apropiado para generar una señal detectable. En otras modalidades relacionadas, se pueden practicar técnicas ELISA tipo competitivo usando métodos conocidos por aquellos expertos en la técnica. Los anticuerpos anti-HBV de conejo de la invención también se pueden usar en un ELISA indirecto, por ejemplo, un ELISA de IgG indirecto como sigue. Los anticuerpos específicos para antígeno de superficie de HBV se unen a un soporte sólido. Se puede usar proteína A o proteína G para inmovilizar los anticuerpos en el soporte sólido. El soporte entonces se pone en contacto con HBsAg bajo condiciones que permiten la unión a los anticuerpos anti-HBV unidos al soporte para formar complejos de anticuerpo/antígeno. Se remueven los antígenos no unidos y el soporte se pone en contacto con una muestra que se va a probar para la presencia de IgG humana a HBV bajo condiciones que permiten la unión de la IgG humana anti-HBV, si está presente, a los antígenos en los complejos de anticuerpo/antígeno. La presencia de la IgG unida a anti-HBV se puede detectar usando un anticuerpo anti-IgG humana detectablemente marcada. De igual manera, se puede detectar la presencia de IgM humana a HBV al usar IgM anti-humana marcada para la unión a los complejos de anticuerpo/antígeno. Los anticuerpos de conejo anti-HBV de la invención también se pueden usar en un ELISA de captura, por ejemplo, un ELISA de captura de IgM, como sigue. Se unen anticuerpos anti-IgM humana (por ejemplo, anticuerpos de cabra anti-IgM humana) a un soporte sólido, el soporte se pone en contacto con una muestra que se va a probar para la presencia de IgM humana a HBV, bajo condiciones que permitirán la unión de la IgM anti-HBV, si está presente, a uno o más de los anticuerpos anti-IgM humana unidos al soporte sólido, para formar complejos de anticuerpo/anticuerpo. Los HBsAg (por ejemplo, mutantes y/o tipo silvestre) se adicionan bajo condiciones que permitirán la unión a la IgM anti-HBV en los complejos de anticuerpo/anticuerpo formando un complejo de anticuerpo/anticuerpo/antígeno. Los antígenos no unidos se remueven y los anticuerpos anti-HBV detectablemente marcados, producidos como se describe anteriormente, se adicionan bajo condiciones que permiten la unión a los antígenos unidos. La presencia de IgM a HBV en la muestra se determina con la presencia de los anticuerpos anti-HBV detectablemente marcados a los complejos Ab anti-IgM humana/IgM humana anti-HBV/antígeno unido al soporte sólido. En tanto que algunos de los formatos de ensayo anteriores se llaman ensayos "ELISA" (Ensayo Inmunosolvente Enlazado a Enzima) , será evidente para un experto en la técnica que es posible el uso de la marca detectable diferente de una porción de unión "enlazada a enzima" y puede ser deseable en muchas situaciones. Otras marcas detectables adecuadas se describen en la presente y son bien conocidas en la técnica. Los ensayos también se pueden llevar a cabo en solución, tal que los antígenos o anticuerpos de HBV y los ligandos específicos para estas moléculas ponen complejos bajo condiciones de precipitación. En una modalidad particular, las moléculas se pueden unir a una partícula de fase sólida (por ejemplo, una cuenta de azarosa o similar, usando técnicas de acoplamiento conocidas, tal como por acoplamiento indirecto o químico directo. La partícula revestida entonces se puede poner en contacto bajo condiciones adecuadas de unión con una muestra biológica que se sospecha que contiene anticuerpos o antígenos de HBV. La reticulación entre anticuerpos unidos provoca la formación de agregados complejos que se pueden precipitar y separar de la muestra usando el lavado y/o centrifugación. La mezcla de reacción se puede analizar para determinar la presencia o ausencia de complejos usando cualquiera de varios métodos normales, tal como aquellos métodos de inmunodiagnóstico descritos anteriormente. En aún una modalidad adicionalmente, se pueden preferentemente una matriz de inmunoafinidad, en donde, por ejemplo, una población policlonal de anticuerpos de una muestra biológica sospecha de contener anticuerpos de HBV se inmoviliza a un substrato. Se puede llevar a cabo una purificación por afinidad inicial de la muestra usando antígenos inmovilizados. La preparación resultante de la muestra de esta manera contendrá sólo anticuerpos anti-HBV, evitando propiedades potenciales de unión no específica en el soporte de afinidad. Varios métodos para inmovilizar in unoglobulinas (ya sea fragmentos intactos o en fragmentos específicos) a alto rendimiento y buena retención de. actividad de unión a antígenos se conocen en la técnica. Por ejemplo, se puede usar proteína A o proteína G para inmovilizar moléculas de inmunoglobulina al soporte sólido. Una vez que se han inmovilizado las moléculas de inmunoglobulina para proporcionar una matriz de inmonoafinidad, se ponen en contacto antígenos de HBV, tal como HBsAg con los anticuerpos unidos bajo condiciones adecuadas de unión. Después de que se ha lavado cualquier antígeno de HBV no específicamente unido del soporte de inmunoafinidad, se puede determinar la presencia del antígeno unido al valorar la marca usando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, se adiciona un anticuerpo enzimáticamente marcado que reaccione con el complejo de antígeno/anticuerpo unido, tal como un anticuerpo marcado anti-HBsAg, producido como se describe anteriormente. Se usa un substrato de enzima para generar una señal . En otra modalidad de la invención, se usa un ensayo de inmunotransferencia en tira (SIA) para detectar antígenos de HBV en una muestra biológica. Por ejemplo, uno o más de los anticuerpos monoclonales de conejo descritos anteriormente, y opcionalmente anticuerpos monoclonales de ratón dirigidos contra un HBsAg, se puede inmovilizar en la tira de prueba como reactivos de captura. Las técnicas de SIA son bien conocidas y combinan técnicas tradicionales de transferencia western y punto, por ejemplo, RIBAMR (Chiron Corp., Emeryville, CA) SIA. En estos ensayos, los anticuerpos se inmovilizan como porciones discretas, individuales, por ejemplo, como bandas o puntos, en un soporte membranoso, o se pueden inmovilizar como una mezcla en una porción individual. De esta manera, por "discretamente inmovilizado" en un soporte de membrana se quiere decir que los anticuerpos están presentes como componentes separados y no mezclados, tal que se pueda valorar la reactividad o carencia de la misma con cada uno de los reactivos de captura presentes. Entonces se hace reaccionar una muestra biológica que se sospecha que contiene antígenos de HBV con la membrana de prueba. La visualización de la reactividad en la muestra biológica se puede lograr usando conjugados de enzima y anticuerpo anti-HBV en unión con un substrato colorimétrico de enzima. De manera alternativa, los anticuerpos monoclonales de conejo descritos anteriormente se pueden usar para visualización de los complejos unidos de anticuerpo-antígeno. La tira de prueba para esta modalidad alternativa se puede preparar usando, por ejemplo, anticuerpos monoclonales de ratón dirigidos contra HBsAg. El ensayo se puede realizar manualmente o usar en un formato automatizado. Los soportes sólidos que se pueden usar en la práctica de los ensayos de inmunotransferencia en tira incluyen, de manera enunciativa y sin limitación, soportes de membrana derivados de varios polímeros primarios incluyendo celulosa, poliamida (nylon) , poliacrilonitrilo, difluoruro de polivinilideno, polisulfona, polipropileno, poliéster, polietileno y resinas compuestas que contienen combinaciones o derivados de los anteriores.

Particularmente preferidos son los soportes derivados de celulosa, tal como membranas de nitrocelulosa, así como membranas de nylon. El substrato incluye en general la membrana deseada con un respaldo de plástico inerte como un soporte . Los reactivos de ensayo descritos anteriormente, incluyendo los anticuerpos monoclonales de conejo y/o los HBsAg descritos en la presente, los soportes sólidos con reactivos unidos, así como otros reactivos de detección, se pueden proporcionar en equipos, con instrucciones adecuadas y otros reactivos necesarios, a fin de llevar a cabo los ensayos como se describe anteriormente. El equipo también puede incluir formulaciones de control (positivas y/o negativas) , reactivos marcados cuando el formato de ensayo requiere los mismos y reactivos de generación de señal (por ejemplo, substratos de enzima) si la marca no genera una señal directamente. Las instrucciones (por ejemplo, escritas, en cinta, VCR, CD-ROM, etc.) para llevar a cabo el ensayo usualmente se incluirán en el equipo. El equipo también contendrá, dependiendo del ensayo particular usado, otros reactivos y materiales empacados (es decir, amortiguadores de lavado y similares) . Los ensayos normales, tal como aquellos descritos anteriormente, se puede llevar a cabo usando estos equipos.

III. Parte experimental Más adelante están los ejemplos de modalidades específicas para llevar a cabo la presente invención. Los ejemplos se ofrecen sólo para propósitos ilustrativos, y no se propone que limiten el alcance de la presente invención de ninguna manera. Se han hecho esfuerzos para asegurar la exactitud con respecto a números usados (por ejemplo, cantidades, temperaturas, etc.), pero por supuesto se permitirá algún error y desviación experimental.

Ejemplo 1 Preparación de anticuerpos monoclonales de conejo Para producir anticuerpos monoclonales que confieren inmunorreactividades suficientes a los varios mutantes de interés así como al HBsAg tipo silvestre, se inmunizaron tres conejos adultos hembra Nueva Zelanda con HBsAg tipo silvestre (adw) y antígenos (ayw) (mostrado en las Figuras 2A y 2B, respectivamente) , seguido por refuerzos cada dos semanas con un cóctel de los antígenos tipo silvestre y cinco antígenos principales de mutante recombinantes de HBV, designados DI (que tiene una substitución de A por F en la posición 134 de aminoácidos) , D2 (que tiene una substitución de S por F en la posición 134 de aminoácidos) , D3 (que tiene una substitución de R por G en el aminoácido 145) , Yl (que tiene una substitución de L por S en el aminoácido 143) , y Y2 (que tiene una substitución de R por Q en el aminoácido 129 y una substitución de Tm por M en el aminoácido 133) . Las células B inmunitarias del bazo de la mayoría de los conejos inmunorreactivos se fusionaron a células de plasmacitoma de conejo para producir hibridomas, esencialmente como se describe en Spieker-Polet et al., Proc . Nati . Acad . Sci . USA (1995) 92:9348-9352. De forma breve, se fusionaron 1.5-3 x 108 linfocitos en conejo inmunizado con un compañero de fusión derivado de una línea de células de plasmacitoma de conejo (por ejemplo, 240E 1-1-2, descrito en la Patente de los Estados Unidos No. 5,675,063; Spieker-polet et al., Proc . Nati . Acad. Sci . EUA (1995) 92:9348-9352) a una relación de 2:1 con PEG 4000 al 50% a 37°C en medio libre de suero. Las células se distribuyeron en placas de cultivo de tejido de 96 cavidades a aproximadamente 1 x 105 linfocitos por cavidad, en el medio con FBS al 15% (o FCS) . Después de 48 horas, se adicionó el medio HAT. El medio se cambió a 2-3 veces de la detección. Usualmente, en las colónicas de hibridomas estuvieron listas para la detección en 3-5 semanas. Se probaron los sobrenadantes para la presencia de anticuerpo específico para el inmunógeno, por ELISA. Se usó inmunohistóquimica como un ensayo de detección secundario. Los hibridomas se sub-clonaron al limitar la dilución. Para células alimentadoras, se usó el compañero de fusión a 2 x 104 células por cavidad. Se detectaron un total de 3000 clones, y se identificaron 38 clones (Tabla 1) como candidatos potenciales para estudio adicional . Estos clones entonces se sub-clonaron y probaron para la producción de anticuerpos con la mejor reactividad contra siete antígenos de superficie de HBV usadas para el cóctel de antígenos, tanto mutantes como tipos silvestre (ver Tabla 1) . Los resultados indican que de los 38 clones evaluados, 4 clones (como resaltados en la Tabla 1) tienen las inmunorreactividades más amplias a los mutantes de HBsAg. De esta manera, estos 4 hibridomas de conejo de HBV se subieron en escala, se purificaron y evaluaron adicionalmente . Después de los análisis extensivos de los 38 clones de hibridoma de HBV seleccionados, dos clones, el 99S9 (ATCC No. de Acceso PTA-6014) y 99S6 (ATCC No. de Acceso PTA 6015) , se demostró que producen anticuerpos con inmunorreactividades muy amplias contra el panel de mutantes de Ag de superficie de HBV. En particular, se usó un ELISA para comparar la inmunorreactividad de los dos anticuerpos monoclonales de ratón, el mMAbl y el mMab2 (anticuerpos monoclonales de ratón dirigidos contra HBsAg) y los anticuerpos monoclonales de conejo producidos por las líneas de células de hibridoma 99S9 y 99S6 con los varios HBsAg descritos anteriormente. Adicionalmente, los anticuerpos monoclonales de ratón y los anticuerpos monoclonales de conejo de los hibridomas 99S6 y 99S9 se probaron usando un sistema BIACORE 3000 (Biacore AB, Piscataway, NJ) . Este sistema proporciona análisis de interacción biomolecular (BIA, por sus siglas en inglés) en tiempo real usando tecnología de resonancia de plasmón superficial (SPR, por sus siglas en inglés) . Los biosensores basados en SPR monitorizan las interacciones al medir la concentración másica de las biomoléculas cercanas a una superficie. La superficie se hace específica por la unión de uno de los compañeros de interacción. La muestra que contiene el(s) otro(s) compañero (s) fluye sobre la superficie. Cuando las moléculas de la muestra se unen al interactuante unido a la superficie, cambia la concentración local y se mide una respuesta de SPR. La respuesta es directamente proporcional a la masa de las moléculas que se unen a la superficie. En este caso, se inmoviliza un anticuerpo de cabra anti-IgG de conejo (para probar la inmunorreactividad de los anticuerpos monoclonales de conejo) o un anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón (para probar la inmunorreactividad de los anticuerpos monoclonales de ratón) en un pedazo de censor para proporcionar los anticuerpos de captura en superficie. Los anticuerpos monoclonales de conejo o ratón descritos anteriormente (ligandos) entonces se capturaron por los anticuerpos de captura en superficie. Los HBsAg mutantes y tipo silvestre (analistas) entonces se hicieron pasar a través de esa superficie y se detectaron las interacciones anticuerpo/antígeno y se midieron usando un dispositivo óptico BIACORE SPR. Las Figuras 3A-3D y la Tabla 2 resumen los resultados del análisis BIACORE de los anticuerpos monoclonales de conejo de 99S6 (Figura 3B) y 99S9 (Figura 3D) , en comparación con los anticuerpos de ratón mMabl (Figura 3C) y mMab2 (Figura 3A) . Para estos y los siguientes estudios, se usaron varios diferentes anticuerpos monoclonales de ratón a HBsAg (mMabl, mMab2 , mMab3, mMab4, mMab5 y mMab6) . También se usaron varios anticuerpos monoclonales de ratón comercialmente disponibles (como se muestra en las Figuras 3A-3D, en tanto que el anticuerpo monoclonal de ratón mMab2 fue deficiente en la unión cl D3 mutante, el mMabl fue deficiente en la unión a los mutantes D3 y Yl, ambos clones de hibridoma de conejo 99S9 y 99S6 produjeron anticuerpos con actividades significativas de unión a todos los siete antígenos, incluyendo a D3 y Yl . Además, los resultados de BIACORE también evidenciaron que fue muy estable (Figura 3) la unión de los anticuerpos monoclonales de conejo (de los clones de hibridoma 99S9 y 99S6) a los mutantes D3 y Yl . Estos resultados mostraron que los anticuerpos monoclonales de conejo de los clones 99S9 y 99S6 tienen inmunorreactividades más fuertes contra los antígenos mutantes D3 y Yl en tanto que retienen las inmunorreactividades para los otros antígenos, y de esta manera se demuestra que los anticuerpos de conejo tienen inmunorreactividades mucho más amplias para los varios mutantes de HBsAg en comparación a los dos anticuerpos monoclonales de ratón. Para demostrar adicionalmente la ventaja de los anticuerpos monoclonales de conejo para la detección de variantes de HBsAg (es decir, mutantes) , el anticuerpo monoclonal de conejo de 99S9 se probó en comparación con los anticuerpos monoclonales de ratón como el anticuerpo de captura o como el anticuerpo de detección en ensayos de ELISA de intercalación para la detección del tipo silvestre y variantes de HBsAg. En estos experimentos, se revistieron dos conjuntos de placas de ELISA con ya sea anticuerpo monoclonal de ratón individual (99S9) o un cóctel de dos anticuerpos monoclonales anti-HBsAg, mMab2 y 160S11 (BD Biosciences Pharmingen (San Diego, CA) . Estos dos conjuntos de placas y capturas se aparearon con un sistema de detección de peroxidasa de rábano (HRP) de 99S9 individual, o se aparearon con un cóctel de cuatro anticuerpos anti-HBsAg marcados con HRP (mMabl, M01077 (Fitzgerald Industries International, Concord, MA) , M01079 (Fitzgerald Industries International, Concord, MA) y mMab3) . Los resultados fueron consistentes con los resultados del estudio de análisis BIACORE. El anticuerpo monoclonal de conejo de 99S9 tiene inmunorreactividades más amplias en comparación con los anticuerpos monoclonales de ratón. Cuando 99S9 se probó como el único anticuerpo de captura y detección (99S9 como el anticuerpo de captura y HRP-99S9 como el anticuerpo de detección) , fue capaz de detectar los 7 antígenos, en tanto que los cócteles de anticuerpos monoclonales de ratón (mMab2/160Sll como el anticuerpo de captura y HRP-mMabl/M77/M79/2Dll como el anticuerpo de detección) fallaron en detectar el antígeno D3 (Tabla 3) . Estos resultados muestran que un anticuerpo monoclonal de conejo individual puede reemplazar de forma suficiente los múltiples anticuerpos monoclonales de ratón en ensayos de ELISA usados para la detección de algunos mutantes evadidos principales. Para resumir los experimentos anteriores, el anticuerpos 99S9 monoclonal de conejo tiene afinidad a los 7 probados se mostró constante disociación mucho más lentas para todos, especialmente para D3 y Yl (Figura 3 y Tabla 2) . Aunque el mMabl monoclonal de ratón pareció tener afinidad significativamente mayor para el mutante DI, D2 y adw y ayw tipo silvestre, fue capaz de la unión a los antígenos mutantes D3 y Yl (Figura 3 y Tabla 2) . El anticuerpo monoclonal mMab2 de ratón tiene afinidades totales menores para la mayoría de los antígenos mutantes de HBV y fue incapaz de la unión al antígeno mutante D3 (Figura 3 y Tabla 2) . El anticuerpo monoclonal 99S9 de conejo solo fue suficiente para reemplazar las combinaciones de múltiples anticuerpos monoclonales de ratón para la captura y/o detección más efectiva del guante D3 (Tabla 3) . Para probar la capacidad de los anticuerpos monoclonales de conejo para detectar otras variantes de HBsAg, se llevaron a cabo ELISA adicionales usando ya sea sólo anticuerpos monoclonales de ratón contra HBsAg (ELISA) de mMab) o una combinación de anticuerpos monoclonales de ratón y anticuerpos monoclonales de conejo contra HBsAg (ELISA de mMab) . Para la ELISA de Mab, se usaron 5 diferentes anticuerpos monoclonales de ratón anti-HBsAg para la captura (mMab2 y mMab4) y para la detección de 3 (mMabl, mMab5 y mMab6) . Para el ELISA de rMAb, se reemplazaron dos de los anticuerpos monoclonales de ratón usados par ala detección (mMab5 y mMab6) por un anticuerpo monoclonal individual de conejo (99S9) . Los anticuerpos de captura se biotinilaron e inmovilizaron en cavidades revestidas con estreptavidina. Los anticuerpos de detección se conjugaron con peroxidasa de rábano (HRP) . La Tabla 4 muestra los resultados con varias variantes de HBsAg. El ELISA de rMAb detectó todas las variantes que se detectaron en el ELISA de mMAb, y adicionalmente, detectaron 2 variantes que no se detectaron en el ELISA de mMab, la variante P120Q y la variante P142S. De esta manera, el ELISA que usa el anticuerpo monoclonal de conejo (99S9) fue capaz de detectar al variante de HBsAg usando menos anticuerpos que el ELISA que usó sólo los anticuerpos monoclonales de conejo. Por lo tanto, los anticuerpos monoclonales de conejo proporcionan una herramienta poderosa para una mejor detección de antígenos variantes de HBV. De esta manera, se describen nuevos anticuerpos monoclonales y métodos para detectar infección de HBV. Aunque se han descrito en algún detalle modalidades preferidas de la presente invención, se entiende que se pueden hacer v ariaciones obvias sin apartarse del espíritu y alcance de la invención como se describe en la presente .

Tabla 1 Captura: Placas de ELISA se revistieron con los 7 diferentes antígenos . Tamaño de muestra: 200 µl (dilución 1:100 de cultivo celular en el diluyente del espécimen) . Detección: Conjugado de cabra anti-conejo (fab)'2-HRP.

Tabla 2 Tabla 3 Tabla 4 Depósitos de variedades útiles en la práctica de la invención Se hizo un depósito de cultivos biológicamente puros de las siguientes variedades con la American Type Cultura Collection (ATCC) , 10801 University Boulevard, Manassas, VA. El número de acceso indicado se asignó después de la prueba exitosa de viabilidad, y se pagaron las tasas necesarias. Los depósitos se hicieron de acuerdo con las provisiones del tratado de Budapest en el reconocimiento internacional del depósito de microorganismos para el propósito de procedimiento de patente y las regulaciones de acuerdo con las mismas (Tratado de Budapest) . Esto asume el mantenimiento de cultivos viables durante un periodo de treinta (30) años desde la fecha de depósito y al menos cinco (5) años después de la petición más reciente para la presentación de la muestra de depósito por el depositario. Los organismos estarán disponibles por la ATCC de acuerdo con los términos el tratado de Budapest, que asume disponibilidad permanente y no restringida de los cultivos a uno determinado por el Comisionado Norteamericano de Patentes y Marcas para estar facultado a lo mismo de acuerdo con 35 U.S.C §122 y las reglas del Comisionado de acuerdo a lo mismo (incluyendo 37 C.F.R. § 1.12). En la otorgación de una patente, se removerán irrevocablemente todas las restricciones de la disponibilidad al público de los cultivos depositados. Estos depósitos se proporcionarán sólo como conveniencia para aquellos expertos en la técnica, y no son una admisión que se requerirá un depósito de acuerdo con 35 U.S.C. § 112. La secuencia de ácido nucleico de estos plásmidos, así como las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos codificados por los mismos, se incorporan en la presente como referencia y son de control en el caso de cualquier conflicto con la descripción de la presente. Se puede requerir una licencia para hacer, usar o vender los materiales depositados, y no se otorga de este modo esta licencia. Hibridoma Fecha de depósito ATCC No . 99S6 (CMCC #12337) 26 de mayo de 2004 PTA-6015 99S9 (CMCC #12336) 26 de mayo de 2004 PTA-6014 Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la presente invención, es el que resulta claro a partir de la presente descripción de la invención.

Claims (66)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Anticuerpo monoclonal de conejo de virus de hepatitis B (HBV) , caracterizado porque reconoce un mutante de HBsAg con una mutación en la región determinante "a" , o un fragmento inmunorreactivo del mismo.
2. 2. Anticuerpo monoclonal ' de conejo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo reconoce más de un mutante de HBsAg con una mutación en la región determinante "a" .
3. 3. Anticuerpo monoclonal de conejo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo también reconoce un HBsAg tipo silvestre.
4. 4. Anticuerpo monoclonal de conejo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el mutante de HBsAg es un sAg mutante.
5. 5. Anticuerpo monoclonal de conejo de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el mutante de HBsAg comprende la secuencia de la región determinante "a" de F134A, F134S, G145R, S143L, P142S ó Q129R/M133T.
6. 6. Anticuerpo monoclonal de conejo de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque el anticuerpo reconoce un HBsAg seleccionado del grupo que consiste de F134A, F134S, G145R, S143L, P142S y Q129R/M133T.
7. 7. Anticuerpo monoclonal de conejo de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque el anticuerpo reconoce al menos dos HBsAg mutantes seleccionados del grupo que consiste de F134A, F134S, G145R, S143L, P142S y Q129R/M133T.
8. 8. Anticuerpo monoclonal de conejo de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque el anticuerpo reconoce los HBsAg mutantes F134A, F134S, G145R, S143L, P142S y Q129R/M133T.
9. 9. Anticuerpo monoclonal de conejo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, caracterizado porque el anticuerpo se produce usando un hibridoma de conejo-conejo.
10. 10. Anticuerpo monoclonal de conejo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, caracterizado porque el anticuerpo se produce usando un hibridoma de conejo-ratón.
11. 11. Hibridoma, caracterizado porque es el hibridoma 99S6 (ATCC Número de acceso PTA-6015) .
12. 12. Hibridoma, caracterizado porque es el hibridoma 99S9 (ATCC Número de acceso PTA-6014) .
13. 13. Anticuerpo, caracterizado porque se produce por el hibridoma 99S6 (ATCC Número de acceso PTA-6015) .
14. 14. Anticuerpo, caracterizado porque se produce por el hibridoma 99S9 (ATCC Número de acceso PTA-6014) .
15. 15. Fragmento de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el fragmento es un fragmento Fab, F(ab')2, Fv o un sFv.
16. 16. Anticuerpo monoclonal de conejo, caracterizado porque reconoce el mismo epítopo como un anticuerpo producido por el hibridoma 99S6 (ATCC No. de Acceso PTA-6015) o 99S9 (ATCC No. de Acceso PTA6014) .
17. 17. Método para detectar antígenos de superficie de HBV en una muestra biológica, caracterizado porque comprende : (a) poner en contacto la muestra biológica con al menos un anticuerpo monoclonal de conejo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-10, 13, 14, 16 ó 59, bajo condiciones que permitan a los antígenos de HBV, cuando están presentes en la muestra biológica, unirse al anticuerpo para formar un complejo de anticuerpo/antígeno; y (b) detectar la presencia o ausencia del complejo de anticuerpo/antígeno, detectar de este modo la presencia o ausencia de antígenos de superficie de HBV en la muestra.
18. 18. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque al menos un anticuerpo monoclonal de conejo se marca de forma detectable.
19. 19. Método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el método comprende además hacer reaccionar la muestra biológica con uno o más anticuerpos adicionales dirigidos contra un HBsAg tipo silvestre o un mutante de HBsAg con una mutación en la región determinante "a" .
20. 20. Método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque uno o más anticuerpos adicionales comprenden un anticuerpo monoclonal adicional .
21. 21. Método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque uno o más anticuerpos adicionales comprenden un anticuerpo monoclonal de ratón.
22. 22. Equipo de prueba de inmunodiagnóstico para detectar infección de HBV, caracterizado porque comprende : (a) al menos un anticuerpo monoclonal de conejo, o un fragmento inmunorreactivo del mismo, de conformidad con la reivindicación 1; e (b) instrucciones para llevar a cabo la prueba de inmunodiagnóstico.4
23. 23. Equipo de prueba de inmunodiagnóstico de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el equipo de prueba comprende además uno o más anticuerpos adicionales dirigidos contra un HBsAg tipo silvestre o un mutante de HBsAg con una mutación en la región determinante
24. 24. Equipo de prueba de inmunodiagnóstico de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque uno o más anticuerpos adicionales comprenden un anticuerpo monoclonal adicional .
25. 25. Equipo de prueba de inmunodiagnóstico de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque uno o más anticuerpos adicionales comprenden un anticuerpo monoclonal de ratón.
26. 26. Soporte sólido, caracterizado porque comprende al menos un anticuerpo monoclonal de conejo o un fragmento inmunorreactivo del mismo de conformidad con la reivindicación 1.
27. 27. Soporte sólido de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque el soporte comprende además uno o más anticuerpos adicionales dirigidos contra un HBsAg tipo silvestre o un mutante de HBsAg con una mutación en la región determinante "a" .
28. 28. Soporte sólido de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque el uno o más anticuerpos adicionales comprenden un anticuerpo monoclonal adicional .
29. 29. Soporte sólido de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque el uno o más anticuerpos adicionales comprenden un anticuerpo monoclonal de ratón.
30. 30. Soporte sólido de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque además comprende al menos dos controles internos, en donde uno de los controles define el límite de detección inferior para un resultado positivo en un inmunoensayo usando el soporte sólido y el otro control define un resultado altamente positivo en un inmunoensayo usando el soporte sólido.
31. 31. Soporte sólido de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porgue el soporte sólido es una tira de nitrocelulosa.
32. 32. Equipo de prueba de inmunodiagnóstico para detectar HBV, el equipo de prueba está caracterizado porque comprende : (a) un soporte sólido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 26-31; e (b) instrucciones para llevar a cabo la prueba de inmunodiagnóstico .
33. 33. Método para detectar la presencia de antígenos de superficie de HBV en una muestra biológica, caracterizado porque comprende: (a) proporcionar una muestra biológica, (b) proporcionar un soporte sólido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 26-31; (c) poner en contacto la muestra biológica con el soporte sólido, bajo condiciones que permitan que los antígenos de superficie de HBV, si están presentes en la muestra biológica, se unan con al menos uno de los anticuerpos monoclonales de conejo para formar un complejo de anticuerpo/antígeno; y (d) detectar la presencia del complejo de anticuerpo/antígeno, detectando de este modo la presencia de antígenos de superficie de HBV en la muestra biológica.
34. 34. Método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque además comprende: (e) remover los antígenos de HBV no unidos; (f) proporciona una o más porciones capaces de asociarse con el complejo de anticuerpo/antígeno; y (g) detectar la presencia de una o más porciones, detectando de este modo la presencia de antígenos de superficie de HBV en la muestra biológica.
35. 35. Método de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque una o más porciones comprenden un anticuerpo de HBV marcado de forma detectable.
36. 36. Método de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque el anticuerpo de HBV marcado de forma detectable es un anticuerpo monoclonal de conejo que reconoce un mutante de HBsAg con una mutación en la región determinante "a", o un fragmento inmunorreactivo del mismo.
37. 37. Método de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque la marca detectable es una enzima.
38. 38. Método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque la muestra biológica es de una muestra sanguínea humana.
39. 39. Método para detectar la presencia de anticuerpos anti-HBsAg en una muestra biológica, el método esta caracterizado porque comprende: (a) proporcionar un soporte sólido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 26-31; (b) poner en contacto el soporte sólido con uno o más HBsAg, bajo condiciones que permitan que uno o más de los HBsAg se unan al menos uno de los anticuerpos monoclonales de conejo para formar un complejo de anticuerpo/antígeno; (d) poner en contacto el soporte sólido que tiene el complejo de anticuerpo/antígeno con una muestra biológica, bajo condiciones que permitan que los anticuerpos de anti-HBsAg, si están presentes en la muestra biológica, se unan al complejo de anticuerpo/antígeno para formar un complejo de anticuerpo/antígeno/anticuerpo y (e) detectar la presencia del complejo de anticuerpo/antígeno/anticuerpo, detectando de este modo la presencia de anticuerpos anti-HBsAg en la muestra biológica.
40. 40. Método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque además comprende: (f) remover anticuerpos no unidos; (g) proporcionar una o más porciones capaces de asociarse con el complejo de anticuerpo/antígeno/anticuerpo; y (h) detectar la presencia de uno o más anticuerpos, detectando de este modo la presencia de anticuerpos anti-HBsAg de una muestra biológica.
41. 41. Método de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque una o más porciones comprenden una molécula de inmunoglobulina marcada de forma detectable.
42. 42. Método para preparar un suministro sanguíneo que comprende sangre entera, plaquetas, plasma o suero, sustancialmente libre de HBV, caracterizado porque comprende : (a) detectar alícuotas de sangre entera, plaquetas, plasma o suero de las muestras sanguíneas recolectadas por el método de conformidad con la reivindicación 38; (b) eliminar cualquier muestra en la cual se detecte un antígeno de HBV; (c) combinar las muestras en las cuales no se detecte antígeno de HBV para proporcionar un suministro sanguíneo sustancialmente libre de HBV.
43. 43. Método para preparar un suministro sanguíneo, caracterizado porque comprende sangre entera, plaquetas, plasma o suero, sustancialmente libre de HBV, caracterizado porque comprende: (a) detectar alícuotas de sangre entera, plaquetas, plasma o suero de muestras sanguíneas recolectadas por el método de conformidad con la reivindicación 39; (b) eliminar cualquiera de las muestras en las cuales se detecte un antígeno anti-HBsAg; y (c) combinar las muestras en las cuales no se detecte anticuerpo anti-HBsAg para proporcionar un suministro sanguíneo sustancialmente libre de HBV.
44. 44. Método para detectar un tejido u órgano donado antes del transplante para proporcionar un tejido u órgano sustancialmente libre de HBV, caracterizado porque comprende : (a) detectar una muestra del tejido u órgano por el método de conformidad con la reivindicación 17 ; (b) eliminar un tejido u órgano en el cual se detecte un anfígeno de HBV para proporcionar un tejido u órgano sustancialmente libre de HBV.
45. 45. Método para detectar un tejido u órgano donado antes del transplante para proporcionar un tejido u órgano sustancialmente libre de HBV, caracterizado porque comprende : (a) detectar una muestra del tejido u órgano por el método de conformidad con la reivindicación 39; (b) eliminar un tejido u órgano en el cual se detecta un anticuerpo anti-HBsAg para proporcionar un tejido u órgano sustancialmente libre de HBV.
46. 46. Método para preparar un anticuerpo monoclonal de conejo anti-HBV, caracterizado porque comprende : (a) inmunizar un conejo con un mutante de HBsAg con una mutación en la región determinante "a"; (b) fusionar células que producen anticuerpos contra el mutante de HBsAg del conejo con una célula de una línea de células inmortalizadas para producir un hibridoma; (c) seleccionar el hibridoma; (d) cultivar el hibridoma seleccionado; y (e) recolectar el anticuerpo segregado del hibridoma cultivado.
47. 47. Método de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado porque el paso de inmunización comprende inmunizar un conejo con más de un mutante de HbsAg.
48. 48. Método de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado porque las células productoras de anticuerpo son esplenocitos de conejo.
49. 49. Método de conformidad con la reivindicación 48, caracterizado porque los esplenocitos se fusionan con una célula de una línea de células inmortalizadas de conejo para producir un hibridoma de conejo-conejo.
50. 50. Método de conformidad con la reivindicación 49, caracterizado porque la línea de células inmortalizadas de conejo es un plasmacitoma de conejo.
51. 51. Método de conformidad con la reivindicación 48, caracterizado porque se fusionan esplenocitos con una célula de una línea de células inmortalizadas de ratón, para producir un hibridoma de conejo-ratón.
52. 52. Método de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado porque el mutante de HBsAg es un sAg mutante.
53. 53. Método de conformidad con la reivindicación 52, caracterizado porque el mutante de HBsAg comprende la secuencia de la región determinante "a" de F134A, F134S, G145R, S143L, P142S ó Q129R/M133T.
54. 54. Método de conformidad con la reivindicación 53, caracterizado porque el mutante de HBsAg comprende F134A, F134S, G145R, S143L, P142S y Q129R/M133T.
55. 55. Método de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado porque el conejo se inmuniza con al menos dos mutantes de HBsAg con diferentes mutaciones en la región determinante "a" .
56. 56. Método de conformidad con la reivindicación 53, caracterizado porque el conejo se inmuniza con al menos dos mutantes de HBsAg seleccionados del grupo que consiste de F134A, F134S, G145R, S143L, P142S y Q129R/M133T.
57. 57. Método de conformidad con la reivindicación 53, caracterizado porque el conejo se inmuniza con los mutantes de HBsAg, F134A, F134S, G145R, S143L, P142S y Q129R/M133T.
58. 58. Método de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado porque el conejo se inmuniza adicionalmente con un HBsAg tipo silvestre.
59. 59. Anticuerpo monoclonal de conejo anti-HBV caracterizado porque se produce por un método de conformidad con la reivindicación 46.
60. 60. Método para preparar un hibridoma de conejo-conejo, caracterizado porque comprende: (a) inmunizar un conejo con un mutante de HBsAg con una mutación de la región determinante wa"; (b) fusionar esplenocitos que producen anticuerpos contra el mutante de HBsAg del conejo con células de un plasmacitoma de conejo; (c) seleccionar células que segreguen los anticuerpos .
61. 61. Polipéptido, caracterizado porque codifica para un anticuerpo monoclonal de conejo o un fragmento inmunorreactivo del mismo, de conformidad con la reivindicación 1,
62. 62. Polinucleótido de conformidad con la reivindicación 61, caracterizado porque el fragmento inmunorreactivo codificado por el polinucleótido se un fragmento. Fab, F(ab')2, Fv o un sFv.
63. 63. Uso de un anticuerpo monoclonal de conejo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-10, 13, 14, 16 ó 59, en un método para detectar antígenos de superficie de HBV en una muestra biológica.
64. 64. Uso de un soporte sólido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 26-31 en un método para detectar la presencia de antígenos de superficie de HBV y/o anticuerpos de HBsAg en una muestra biológica.
65. 65. Uso de un anticuerpo monoclonal de conejo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-10, 13, 14, 16 ó 59, en un método para un preparar un suministro sanguíneo que comprende sangre entera, plaquetas, plasma o suero, sustancialmente libre de HBV
66. 66. Uso de un anticuerpo monoclonal de conejo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-10, 13, 14, 16 ó 59 en un método para detectar un tejido u órgano donado antes del transplante para proporcionar un tejido u órgano sustancialmente libre de HBV.