发明概述
本发明提供了用于简单、准确和有效地诊断HBV感染的免疫反应性高的单克隆抗体。该抗体由兔杂交瘤产生,对各种突变的HBV毒株具有免疫反应性。因此,采用兔单克隆抗体的测定方法更准确,并且降低了用其它血清学测试获得的假阴性的数量。因此,采用该抗体的试验能够检测各种HBV突变体引起的HBV感染,如果检测到感染,可在足够时间中适当地治疗该个体,以帮助预防干损伤和死亡。
因此,在一个实施方式中,本发明涉及能识别在“a”决定区中具有突变的HBsAg突变体的抗-HBV兔单克隆抗体,或其免疫反应性片段,如Fab、F(ab′)2、Fv或sFv片段。在某些实施方式中,该抗体能识别一种以上“a”决定区中具有突变的HBsAg突变体。在其它实施方式中,该抗体也能识别野生型HBsAg。在又一实施方式中,HBsAg突变体是突变的sAg,如含有“a”决定区F134A、F134S、G145R、S143L、P142S或Q129R/M133T的序列的突变体。在其它实施方式中,该抗体能识别HBsAg和/或选自F134A、F134S、G145R、S143L、P142S和Q129R/M133T的一种或至少两种突变的HBSAg。任何上述抗体均可用兔-兔杂交瘤或兔-小鼠杂交瘤产生。
在其它实施方式中,本发明涉及杂交瘤99S6(ATCC登录号PTA-6015)和99S9(ATCC登录号PTA-6014),以及这些杂交瘤产生的抗体。在其它实施方式中,本发明涉及能识别与杂交瘤99S6和/或99S9产生的抗体所识别表位相同的表位的兔单克隆抗体。
在其它实施方式中,本发明涉及检测生物样品中HBV表面抗原的方法。该方法包括:
将该生物样品与上述任一项实施方式所述的至少一种兔单克隆抗体接触,该接触条件应该能使HBV抗原(当其存在于生物样品中时)结合于该抗体,形成抗体/抗原复合物;
检测是否存在抗体/抗原复合物,从而检测样品中是否存在HBV表面抗原。
在上述方法的优选实施方式中,所述至少一种兔单克隆抗体是杂交瘤99S6或杂交瘤99S9产生的抗体。在某些实施方式中,所述至少一种兔单克隆抗体被可检测地标记。在某些实施方式中,该方法还包括使该生物样品与抗野生型HBsAg或“a”决定区中含有突变的HBsAg突变体的另外一种或多种抗体反应。所述另外一种或多种抗体可包括另一种单克隆抗体,如小鼠单克隆抗体。
在其它实施方式中,本发明涉及用于检测HBV感染的免疫诊断测试试剂盒。该测试试剂盒包括:
上述任一项实施方式所述的至少一种兔单克隆抗体,或其免疫反应性片段;和
进行所述免疫诊断测试的说明书。
在上述方法的优选实施方式中,所述至少一种兔单克隆抗体是杂交瘤99S6或杂交瘤99S9产生的抗体。在某些实施方式中,所述测试试剂盒还包括抗野生型HBsAg或“a”决定区中含有突变的HBsAg突变体的另外一种或多种抗体。所述另外一种或多种抗体可包括另一种单克隆抗体,如小鼠单克隆抗体。
在其它实施方式中,本发明涉及包含上述任一项实施方式所述的至少一种兔单克隆抗体或其免疫反应性片段的固体支持物。在所述固体支持物的优选实施方式中,所述至少一种兔单克隆抗体是杂交瘤99S6或杂交瘤99S9产生的抗体。在某些实施方式中,该支持物还包含抗野生型HBsAg或“a”决定区中含有突变的HBsAg突变体的另外一种或多种抗体。所述另外一种或多种抗体可包括另一种单克隆抗体,如小鼠单克隆抗体。在其它实施方式中,所述固体支持物还包括至少两种内部对照,其中一种对照限定了采用固体支持物的免疫试验中阳性结果的检测下限,另一对照确定了采用固体支持物的免疫试验中的高度阳性结果。在一些实施方式中,所述固体支持物是硝酸纤维素条带。
在又一实施方式中,本发明涉及用于检测HBV的免疫诊断测试试剂盒。该测试试剂盒包括:
(a)如上述任一项实施方式所述的固体支持物;和
(b)进行所述免疫诊断测试的说明书。
在另一实施方式中,本发明涉及检测生物样品中是否存在HBV表面抗原的方法。该方法包括:
(a)提供生物样品;
(b)提供上述固体支持物;
(c)将所述生物样品与所述固体支持物相接触,该接触条件应该能使HBV表面抗原(如果存在于生物样品中)结合于至少一种兔单克隆抗体,形成抗体/抗原复合物;和
(d)检测是否存在抗体/抗原复合物,从而检测生物样品中是否存在HBV表面抗原。
在某些实施方式中,该方法还包括:
(e)去除未结合的HBV抗原;
(f)提供能够连接于所述抗体/抗原复合物一种或多种部分;和
(g)检测是否存在一种或多种部分,从而检测生物样品中是否存在HBV表面抗原。
在该方法的其它实施方式中,所述一种或多种部分包含可检测标记的HBV抗体,如能识别“a”决定区中含有突变的HBsAg突变体的可检测标记的兔单克隆抗体,或其免疫反应性片段。可检测标记可以是酶。此外,所述生物样品可以来自人血样品。
在其它实施方式中,本发明涉及检测生物样品中是否存在抗HBsAg抗体的方法。该方法包括:
(a)提供上述固体支持物;
(b)将该固体支持物与一种或多种HBsAg相接触,该接触条件应该能使一种或多种HBsAg结合于至少一种兔单克隆抗体,形成抗体/抗原复合物;
(d)将包含抗体/抗原复合物的固体支持物与生物样品相接触,该接触条件应该能使抗HBsAg抗体(如果存在于生物样品中)结合于抗体/抗原复合物,形成抗体/抗原/抗体复合物;和
(e)检测是否存在抗体/抗原/抗体复合物,从而检测生物样品中是否存在抗HBsAg抗体。
在其它实施方式中,该方法还包括:
(f)去除未结合抗体;
(g)提供能够连接于该抗体/抗原/抗体复合物的一种或多种部分,如包含可检测标记的免疫球蛋白分子的一种或多种部分;和
(h)检测是否存在一种或多种部分,从而检测该生物样品中是否存在抗HBsAg抗体。
在其它实施方式中,本发明涉及制备基本不含HBV的血液供给品,包括全血、血小板、血浆或血清的方法。该方法包括:
(a)用上述方法筛选收集的血液样品中的全血、血小板、血浆或血清等份;
(b)清除检测到有HBV抗原的任何样品;和
(c)混合没有检测到HBV抗原的样品,以提供基本不含HBV的血液供给品。
在其它实施方式中,本发明涉及制备基本不含HBV的血液供给品,包括全血、血小板、血浆或血清的方法。该方法包括:
(a)用上述方法筛选收集的血液样品中的全血、血小板、血浆或血清等份;
(b)清除检测到有抗HBsAg抗体的任何样品;和
(c)混合没有检测到有抗HBsAg抗体的样品,以提供基本不含HBV的血液供给品。
在又一实施方式中,本发明涉及在移植前筛选捐赠的组织或器官的方法,以提供基本不含HBV的组织或器官。该方法包括:
(a)用上述方法筛选组织或器官中的样品;
(b)清除检测到有HBV抗原的组织或器官,以提供基本不含HBV的组织或器官。
在其它实施方式中,本发明涉及在移植前筛选捐赠的组织或器官,以提供基本不含HBV的组织或器官的方法。该方法包括:
(a)用上述方法筛选组织或器官中的样品;
(b)清除检测到有抗HBsAg抗体的组织或器官,以提供基本不含HBV的组织或器官。
在又一实施方式中,本发明涉及制备抗-HBV兔单克隆抗体的方法。该方法包括:
(a)用“a”决定区中含有突变的HBsAg突变体免疫兔;
(b)将产生抗HBsAg突变体的抗体的兔细胞与永生化细胞系的细胞融合产生杂交瘤;
(c)选择杂交瘤;
(d)培养所选择的杂交瘤;和
(e)收集培养的杂交瘤分泌的抗体。
在某些实施方式中,所述免疫步骤包括用一种以上HBsAg突变体免疫兔。在某些实施方式中,产生抗体的细胞是兔脾细胞。脾细胞可与永生化兔细胞系如兔浆细胞瘤的细胞融合,产生兔-兔杂交瘤;或与永生化小鼠细胞系融合,产生兔-小鼠杂交瘤。
在上述方法的某些实施方式中,所述HBsAg突变体是突变的sAg,如含有F134A、F134S、G145R、S143L、P142S或Q129R/M133T的“a”决定区序列的突变体。在其它实施方式中,所述HBsAg突变体包括F134A、F134S、G145R、S143L、P142S或Q129R/M133T。在其它实施方式中,用“a”决定区中含有不同突变的至少两种HBsAg突变体,如选自F134A、F134S、G145R、S143L、P142S或Q129R/M133T的至少两种HBsAg突变体免疫兔。在其它实施方式中,用HBsAg突变体F134A、F134S、G145R、S143L、P142S和Q129R/M133T免疫兔。在其它实施方式中,再用野生型HBsAg免疫兔。
在其它实施方式中,本发明涉及上述方法产生的抗-HBV兔单克隆抗体。在其它实施方式中,本发明涉及制备兔-兔杂交瘤的方法。该方法包括:
(a)用“a”决定区中含有突变的HBsAg突变体免疫兔;
(b)将产生抗HBsAg突变体的抗体的兔脾细胞与兔浆细胞瘤细胞融合;
(c)选择分泌抗体的细胞。
在其它实施方式中,本发明涉及编码兔单克隆抗体或其免疫反应性片段如上述Fab、F(ab′)2、Fv或sFv片段的多核苷酸。
本领域技术人员根据本文公开内容不难理解本发明的这些和其它实施方式。
发明详述
除非另有说明,实施本发明将采用病毒学、化学、生物化学、重组DNA技术和免疫学各领域技术人员所知的常规方法。文献中充分解释了这些技术。参见例如,《基础病毒学》(Fundamental Virology),第三版,第I和II卷(B.N.Fields和D.M.Knipe编);《实验免疫学手册》(Handbook of Experimental Immunology),第I-IV卷(D.M.Weir和CC.Blackwell编,Blackwell Scientific Publications);T.E.Creighton,《蛋白质:结构和分子特性》(Proteins:Structures and Molecular Properties)(W.H.Freeman和Company,1993);A.L.Lehninger,《生物化学》(Biochemistry)(Worth Publishers,Inc.,当前加入);Sambrook等,《分子克隆:实验室手册》(Molecular Cloning:A LaboratoryManual)(第二版,1989);《酶学方法》(Methods In Enzymology)(S.Colowick和N.Kaplan编,Academic Press,Inc.)。
通篇采用以下氨基酸缩写:
丙氨酸:Ala(A) 精氨酸:Arg(R)
天冬酰胺:Asn(N) 天冬氨酸:Asp(D)
半胱氨酸:Cys(C) 谷胺酰胺:Gln(Q)
谷氨酸:Glu(E) 甘氨酸:GIy(G)
组氨酸:His(H) 异亮氨酸:He(I)
亮氨酸:Leu(L) 赖氨酸:Lys(K)
甲硫氨酸:Met(M) 苯丙氨酸:Phe(F)
脯氨酸:Pro(P) 丝氨酸:Ser(S)
苏氨酸:Thr(T) 色氨酸:Trp(W)
酪氨酸:Tyr(Y) 缬氨酸:Val(V)
I.定义
在表述本发明的过程中,采用以下术语,这些术语的定义如下。
必须注意,本说明书和所附权利要求书中所用的单数形式“一个”、“一种”和“这种”包括复数含义,除非内容中明确指出不是这样。因此,例如,提到"一种兔单克隆抗体"包括两种或多种这样的多肽的混合物等。
术语"多肽"和"蛋白质"指氨基酸残基的聚合物,不受产物最小产毒的限制。因此,此定义包括肽、寡肽、二聚体、多聚体等。此定义包括全长蛋白质和其片段。该术语也包括多肽的表达后修饰,例如糖基化、乙酰化、磷酸化等。而且,为了本发明目的,"多肽"指包含对天然序列的修饰,如缺失、加入和取代(通常在性质上保守)的蛋白质,只要该蛋白质维持所需活性。这些修饰可以是有意修饰,如定位诱变;或者可以是偶然修饰,如产生该蛋白的宿主突变或由于PCR扩增出错。
术语"抗原"指天然、重组或合成的多肽,它包括能够识别抗体的一个或多个表位。所研究的抗原不需要包括参比分子的全长氨基酸序列,可仅包括产生免疫反应所必需的那段分子(即当该抗原用于产生抗体时)或能与感兴趣的HBV抗体发生反应的那段分子(即当在试验中检测该抗原时)。因此,仅需要存在参比分子的一个或几个表位。而且,抗原可包括全长参比分子或参比分子的片段与另一种蛋白如另一种HBV抗原和/或不破坏HBV抗原反应活性的蛋白的融合蛋白。不难明了,该抗原因此可包括参比分子的全长序列、片段、截短和部分序列、以及其类似物、突变蛋白和前体形式。该术语也包括参比序列的缺失、加入和取代,只要该抗原保持刺激抗体产生和/或与HBV抗体反应的能力。
在这个方面,在特定HBV毒株中分离物之间存在天然变异。因此,该术语旨在包括这些变异,具体是与参比抗原抗原相比氨基酸组成的不同之处不多于约20数量%、更优选不多于约10-15数量%、最优选不多于约5数量%的抗原。因此,参比多肽的定义也包括氨基酸序列与参比分子基本相同,但具有基本不影响该抗原的抗体结合能力的少量氨基酸取代的蛋白质。
"衍生自"HBV毒株或分离物的抗原指包含序列参比HBV基因组编码抗原区域的一个或多个区域或部分的序列的抗原。该抗原一般由包括表位的区域的区域或部分组成,通常具有基本与参比多肽同源的氨基酸序列,如下所述。因此,用术语"衍生自"确定分子的初始来源,但不旨在限制该分子的制备方法,所述制备方法可以是(例如)化学合成或重组方法。
术语"类似物"和"突变蛋白"指在本文所述试验中保持所需活性如免疫反应性的参比分子的生物活性衍生物。通常,术语"类似物"指具有相对于天然分子含有一个或多个氨基酸加入、取代(通常是性质上保守的取代)和/或缺失的天然多肽序列和结构的化合物(只要该修饰不破坏免疫原性活性)以及与参比分子"基本同源"的化合物,如下所述。已知各种分离物之间有许多保守区和可变区,通常,衍生自这些区域的表位的氨基酸序列在对两个序列进行比对时具有高度序列同源性,如氨基酸序列同源性大于50%,通常大于60%-70%。术语"突变蛋白"指含有一种或多种肽模拟物(如"类肽")的肽。优选地,该类似物或突变蛋白至少免疫反应性与天然分子相同。本领域已知制备多肽类似物和突变蛋白的方法,以下作进一步描述。
术语"类似物"和"突变蛋白"也包括对参比分子进行的有目的的突变。尤其优选的类似物包括特性上保守的取代,即其侧链相关的氨基酸家族中发生的取代。具体说,氨基酸通常分为四个家族:(1)酸性—天冬氨酸和谷氨酸;(2)碱性—赖氨酸、精氨酸、组氨酸;(3)非极性—丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸;和(4)不带电的极性—甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时被分类为芳族氨基酸。例如,可合理地预测,分别用异亮氨酸或缬氨酸取代亮氨酸,用谷氨酸取代天冬氨酸,用丝氨酸取代苏氨酸,或者类似地用结构相关的氨基酸保守取代氨基酸,这些取代对生物学活性没有大影响。例如,感兴趣的抗原可包括多达约5-10个保守性或非保守性氨基酸取代,或甚至多达约15-25、50或75个(或5-75个)保守性或非保守性氨基酸取代,只要该分子的所需功能保持不变。参照本领域熟知的Hopp/Woods和Kyte-Doolittle曲线,本领域技术人员不难确定可耐受改变的感兴趣分子的区域。
"抗原片段"指仅由完整的全长抗原多肽序列和结构的一部分组成的抗原。该片段可包括天然多肽的C-末端缺失、N末端缺失和/或内部缺失。"免疫原性片段"指包含一个或多个表位,从而能引发一种或多种本文所述免疫应答的多肽片段。具体的HBV蛋白的"免疫原性片段"通常包括能限定表位的全长分子的至少约5-10个毗连氨基酸残基,优选全长分子的至少约15-25个毗连氨基酸残基,最优选全长分子的至少约20-50或更多个毗连氨基酸残基,或者5个氨基酸-全长序列的毗连氨基酸残基,只要待研究片段保持了引发本文所述免疫应答的能力。
"HBsAg"指衍生自各种HBV毒株和分离物的HBV表面抗原。该术语指包含HBsAg多肽的基本完整的S结构域(本文称为"sAg")的表面抗原,及其免疫原性片段。如果HBsAg的S结构域含有该多肽的天然序列,其N-末端或C-末端区域或多肽内没有或仅有一个或几个氨基酸的小缺失,那么它是"基本完整的"。例如,HBsAg S结构域可被截短几个氨基酸,即至多约3、5、7或10个氨基酸,而不显著影响其抗原性。本发明所用HBsAg抗原通常包括在氨基酸位置124-147(相对于sAg编号)上发现的对应于"a"决定簇的区域。以下进一步描述此区域。该术语也指除S结构域外还包含preS2(以前称为preS)的抗原,或除S结构域外还包含HBsAg的preS2和preS1结构域的抗原。Valenzuela等(1982)Nature 298:347-350描述了代表性HBsAg的基因。也参见Valenzuela等(1979)Nature 280:815-819。
本文所用"突变的"HBsAg分子指野生型HBsAg的类似物,如上所述。为了本发明目的,"野生型HBsAg"指来自ayw和adw亚型的HBsAg。这些类似物可通过天然突变事件产生(如在逃避中和突变体的情况下),或可有目的地建立。代表性突变HBsAg序列见本文图1。其它天然产生的突变体是本领域已知的,GenBank中记录了这些突变体的核苷酸序列和来自这些突变体的表面抗原的相应氨基酸序列。参见例如,NCBI登录号AY341335(在sAg的"a"决定簇中含有多个突变的天然产生的表面突变体),X59795(来自ayw亚型的天然产生的突变体);AF01360和AF013629(来自adw亚型的天然产生的突变体)和Zuckerman等,1999(J.Med Virol.58:193)。
HBsAg的"免疫原性"序列指包括包含至少一个表位的氨基酸序列的HBsAg分子,以致于该分子能够在合适宿主中刺激产生抗体。"表位"指能与特定B细胞和/或T细胞起反应,使待研究HBV表位能够刺激抗体产生的抗原上的位点。该术语也可与"抗原决定簇"或"抗原决定位点"互换使用。表位可包含空间构象独特的3个或多个氨基酸。通常,表位由至少5个这种氨基酸组成,更通常由至少8-10个这种氨基酸或更多氨基酸组成。
可用本领域熟知的任何表位作图技术鉴定包含表位的给定多肽区域。参见例如,《分子生物学中的表位作图法》(Epitope Mapping Protocols in Methods in MolecularBiology),第66卷(Glenn E.Morris编,1996)Humana Press,Totowa,New Jersey。例如,可通过(例如)以下方法测定线性表位:在固体支持物上同时合成大量肽,这些肽对应于蛋白质分子的部分,在这些肽仍然连接于支持物的情况下使这些肽与抗体反应。这些技术是本领域已知的,参见例如,美国专利号4,708,871;Geysen等,(1984)Proc.Natl.Acad.Sd.USA81:3998-4002;Geysen等,(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:178-182;Geysen等,(1986)Molec.Immunol.23:709-715。类似地,通过(例如)x-射线晶体衍射和2-维核磁共振测定氨基酸的空间构象,从而不难鉴定构象表位。参见例如,《表位作图法》(Epitope Mapping Protocols),同上。也可用标准的抗原性和亲水性图鉴定蛋白质的抗原区,如用(例如)购自Oxford Molecular Group的Omiga 1.0版软件程序计算。此计算机程序采用Hopp/Woods法(Hopp等,Proc.Natl.Acad.SciUSA(1981)78:3824-3828)测定抗原性特征,并采用Kyte-Doolittle技术(Kyte等,J.MoI.Biol.(1982)157:105-132)作亲水性图。
"免疫原性组合物"是包含至少一种免疫原性多肽(如HBsAg抗原或抗体)的组合物。
"基本上纯化的"通常指分离物质(化合物、多核苷酸、蛋白质、多肽、多肽组合物),使该物质构成它存在的样品的大部分。样品中基本上纯化的组分一般占样品的50%,优选80%-85%,更优选90-95%。纯化感兴趣的多核苷酸和多肽的技术是本领域熟知的,包括(例如)离子交换色谱、亲和色谱和根据密度沉降。
提到多肽时,"分离"指所示分子与天然情况下发现该分子的完整生物体分离,或者基本不含相同类型的其它生物大分子。提到多核苷酸时,术语"分离"是指核酸分子完全或部分缺少通常在天然情况下与其相连的序列;或者象天然存在时那样只是连接了异源序列的序列;或者与染色体分离的分子。
"等效抗原决定簇"指来自HBV的不同分离物或毒株的抗原决定簇,由于序列变异抗原决定簇不必相同,但其出现在待研究HBV序列的等效位置中。通常,在比对两个序列时,等效抗原决定簇的氨基酸序列具有高度序列同源性,如氨基酸序列同源性大于30%,通常大于40%,如大于60%,甚至大于80-90%同源性。
"同源性"指两个多核苷酸或两个多肽部分的相同性百分数。当在指定的分子长度上序列相同性至少约50%、优选至少约75%、更优选至少约80%-85%、优选至少约90%、最优选至少约95%-98%时,称两个核酸或两个多肽序列互相"基本同源"。本文所用基本同源也指与特定序列完全相同的序列。
通常,"相同性"指两个多核苷酸或多肽序列之间准确的核苷酸-核苷酸或氨基酸-氨基酸对应。可通过比对序列、计数两条比对序列之间匹配的准确数量、除以参比序列的长度、将结果乘以100的方法来直接比较两个分子(参比序列和与参比序列的相同性%未知的序列)之间的序列信息,从而确定相同性百分数。可用容易获得的计算机程序辅助分析,如ALIGN,Dayhoff,M.O.《蛋白质序列和结构图》(Atlas of ProteinSequence and Structure)M.O.Dayhoff编,增刊5.3:353-358,National biomedicalResearch Foundation,Washington,DC,该程序改编了Smith和Waterman的用于肽分析的局部同源性算法(Advances in Appl.Math.2:482-489,1981)。测定核苷酸序列相同性的程序可来自Wisconsin Sequence Analysis Package,第8版(获自GeneticsComputer Group,Madison,WI),例如BESTFIT、FASTA和GAP程序,这些程序也依赖Smith和Waterman算法。采用生产商推荐和上述Wisconsin Sequence AnalysisPackage描述的默认参数,不难使用这些程序。例如,可用Smith和Waterman的同源性算法(默认评分表和六个核苷酸位置的缺口罚分)测定具体核苷酸序列与参比序列的相同性百分数。
在本发明内容中建立相同性百分数的另一方法是采用著作权属于University ofEdinburgh、由John F.Collins和Shane S.Sturrok开发并由IntelliGenetics,Inc.(MountainView,CA)分销的MPSRCH程序包。可使用此软件包中的Smith-Waterman算法,其中评分表采用默认参数(例如,缺口开放罚12分,缺口延伸罚1分,缺口6分)。从产生的数据可以看出,"匹配"值反映了"序列相同性"。计算序列之间相同性或相似性百分数的其它合适程序通常是本领域已知的,例如,另一比对程序是BLAST(采用默认参数)。例如,BLASTN和BLASTP可采用以下默认参数:遗传密码=标准;过滤=无;链=双链;截止值=60;期望值=10;矩阵=BLOSUM62;描述=50个序列;分选=HIGH SCORE;数据库=非冗余,GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS翻译+Swiss蛋白+Spupdate+PIR。不难获得这些程序的详情。
或者,可通过在同源区之间形成稳定双链体的条件下杂交多核苷酸,然后用单链特异性核酸酶消化,测定消化片段的大小,从而确定同源性。可用Southern杂交实验在(例如)严谨条件,如为具体系统定义的条件下鉴定基本同源的DNA序列。本领域技术人员能够定义合适的杂交条件。参见例如,Sambrook等,同上;DNA Cloning,同上;Nucleic Acid Hybridization,同上。
描述核酸分子时本文所述"重组"指基因组、cDNA、病毒、半合成或合成来源的多核苷酸,由于其来源和操作不连接于它在天然情况下连接的多核苷酸的整体或一部分。提到蛋白质或多肽时,术语"重组"指通过表达重组多核苷酸产生的多肽。通常,感兴趣基因被克隆,然后在转化的生物体中表达,如以下所述。宿主生物体在表达条件下表达外来基因产生蛋白质。
"抗体"指"识别"(即特异性结合)于抗原中存在的感兴趣表位的分子。"特异性结合"指该抗体以"锁钥"型相互作用与表位相互作用,形成抗原和抗体复合物,这与非特异性结合相反,非特异性结合可能在抗体与(例如)包含抗体能与之反应的受试物质的混合物的组分之间发生。因此,抗-HBV抗体是特异性结合于HBV蛋白表位的分子。本文所用术语"抗体"包括获自多克隆和单克隆制备的抗体,以及以下物质:杂交(嵌合)抗体分子(参见例如,Winter等,Nature(1991)349:293-299和美国专利号4,816,567);F(ab′)2和F(ab)片段;Fv分子(非共价异二聚体,参见例如,Inbar等,ProcNatl Acad Sci USA(1972)69:2659-2662和Ehrlich等,Biochem(1980)19:4091-4096);单链Fv分子(sFv)(参见例如,Huston等,Proc Natl Acad Sci USA(1988)85:5879-5883);二聚和三聚抗体片段构建物;小抗体(minibody)(参见例如,Pack等,Biochem(1992)31:1579-1584;Cumber等,J Immunology(1992)149B:120-126);人源化抗体分子(参见例如,Riechmann等,Nature(1988)332:323-327;Verhoeyan等,Science(1988)239:1534-1536和1994年9月21日公开的英国专利出版物GB2,276,169);以及获自这些分子的任何功能片段,其中这些片段保持了母体抗体分子的免疫结合特性。
本文所用术语"单克隆抗体"指具有均一的抗体群体的抗体组成。该术语不限制抗体的种类或来源,也不旨在限制制备抗体的方式。该术语包括整个免疫球蛋白以及片段如Fab、F(ab′)2、Fv和其它片段,以及具有母体单克隆抗体分子的免疫结合特性的嵌合和人源化均一抗体群体。
本文所用术语"兔单克隆抗体"指用感兴趣的抗原(如突变的HBsAg)免疫兔产生的上述单克隆抗体。可用兔-兔杂交瘤(即免疫兔的产抗体细胞与兔的永生化细胞的融合物)、兔-小鼠杂交瘤(即免疫兔的产抗体细胞与小鼠的永生化细胞的融合物)等产生"兔单克隆抗体",下面有更详尽的描述。
"小鼠单克隆抗体"指用感兴趣抗原(如突变的HBsAg)免疫小鼠产生的上述单克隆抗体。用本领域熟知的常规方法由小鼠-小鼠杂交瘤产生"小鼠单克隆抗体",下面有更详尽的描述。
本文所用"固体支持物"指可连接大分子如抗体、蛋白质、多肽、肽、多核苷酸的固体表面,如磁性珠、胶乳珠、微量滴定板孔、玻璃平板、尼龙、琼脂糖、聚丙烯酰胺、二氧化硅颗粒、硝酸纤维素膜等。
"免疫反应性"指待研究抗体能与来自HBV感染个体的生物样品中存在的HBV抗原特异性反应。
抗体的"免疫反应性片段"是仅由完整抗体序列和结构的一部分组成,并具有上述免疫反应性的分子。这些免疫反应性片段的非限制性例子包括能够显示出衍生出它们的母体抗体分子的免疫结合特性的F(ab′)2、Fv和sFv分子。
"免疫复合物"指抗体结合于抗原上的表位时形成的组合。
本文所用"生物样品"指分离自对象的组织或液体样品,例如但不限于:血液、血浆、血小板、血清、粪便、尿、骨髓、胆汁、脊髓液、淋巴液、脑脊髓液、皮肤样品;皮肤、呼吸道、肠道和泌尿生殖道分泌物;眼泪、唾液、乳汁、血细胞、器官、活组织检查样品,以及体外细胞培养组分的样品,包括但不限于:细胞和组织在培养基中生长产生的条件培养物如重组细胞,和细胞组分。上面详述的样品不必是直接获自该来源的形式。例如,在分析前,可临用前通过(例如)加热、离心等处理样品。
本文所用术语"标记"和"可检测标记"指能够检测的分子,其包括但不限于:放射性同位素、荧光剂、半导体纳米晶体、化学发光剂、生色团、酶、酶底物、酶辅因子、酶抑制剂、染料、金属离子、金属溶胶、配体(如生物素、链霉抗生物素蛋白或半抗原)。术语"荧光剂"指能够在可检测范围内产生荧光的物质或其部分。可用于本发明的标记的具体例子包括但不限于:辣根过氧化物酶(HRP)、荧光素、FITC、罗丹明、丹酰基、7-羟基香豆素、二甲基吖啶鎓酯(dimethyl acridinium ester,DMAE)、得克萨斯红、鲁米诺、NADPH和α-β-半乳糖苷酶。
II.实施本发明的方式
在详述本发明之前,应理解本发明不限于具体配方或方法参数,它们当然可以改变。也应理解,本文所用术语只是为了描述本发明的具体实施方式,不旨在限制。
虽然与本文所述方法和材料相似或等效的许多方法和材料可用于实施本发明,但本文描述了优选的材料和方法。
本发明基于以下发现:在检测HBV感染的试验中,抗突变HBsAg的新型兔单克隆抗体的免疫反应性比常规小鼠单克隆抗体高得多。本发明兔单克隆抗体能够反应的HBsAg突变体范围比常规小鼠单克隆抗体宽。而且,本发明兔单克隆抗体一般也与野生型HBsAg反应。实际上,在检测HBV抗原的存在(可以说明HBV感染)中,一种本发明兔单克隆抗体与使用多种小鼠单克隆抗体同样有效。因此,本发明兔单克隆抗体降低了采用(例如)小鼠单克隆抗体的试验获得假阴性结果的数量,从而可用于准确检测HBV感染的诊断方法。本发明试验也可利用其它抗体如其它小鼠单克隆抗体来提供从各种分离物和逃避中和突变体诊断HBV感染的能力。
该方法可用于检测人HBV感染,以及检测血样(包括但不限于全血、血清、血小板和血浆)以及用于移植的组织和器官中的HBV感染,尤其是检测HBV抗原或HBV抗体的存在。因此,该方法可用于诊断对象如人对象的HBV感染,以及检测捐献血样的HBV污染。可筛选个体捐献样品或集合样品的等份中是否存在HBV。可在混合之前清除被HBV污染的样品或集合样品。以此方式,可提供基本不含HBV污染的血液供给品。类似地,也可筛选用于移植的组织和器官的样品,以去除污染样品。
为了进一步理解本发明,下面提供了关于本发明所用HBV抗原、抗体和诊断方法的更详细讨论。
HBV表面抗原
乙肝表面抗原由共享羧基端序列的以大小分类的三种蛋白质组成。这些蛋白质包括大(L,preS2结构域)、中(M,preS1结构域)和小(S,sAg结构域)蛋白。在从感染患者血清中回收的呈42nm球状物的感染性毒粒(常常称为Dane颗粒)中发现了所有三种蛋白质,。血清样品也含有平均为22nm的空球形颗粒,它主要含有S类蛋白(sAg)。仅用编码sAg蛋白的DNA转染的哺乳动物细胞系释放类似于感染细胞释放的20nm空球。而且,用相同基因转化的酵母细胞形成类似球状物,发现它的免疫原性与来自感染细胞的22nm球状物相同。参见例如,"HBV疫苗-从实验室到许可使用:案例研究"(HBV vaccine-from the laboratory to license:a case study),Mackett,M.和Williamson,J.D.,《人类疫苗和疫苗接种》(Human Vaccine and Vaccination),159-176页,其中讨论了HBV结构;美国专利号4,722,840、5,098,704、5,324,513、5,965,140,Beames等,J.Virol.(1995)69:6833-6838,Birnbaum等,J.Virol.(1990)64:3319-3330,Zhou等,J.Virol.(1991)65:5457-5464,其中描述了各种HBV颗粒的重组生产。
因此,如上所述,用于产生本发明兔单克隆抗体的HBsAg可包括sAg、preS1和/或preS2的免疫原性区,以及上组的任何组合如sAg/preS1、sAg/preS2和sAg/preS1/preS2的免疫原性区。任选地,HBsAg多肽可包括sAg、preS1或preS2多肽中的一种以上。此外,sAg、preS1和preS2多肽可衍生自HBV的相同或不同分离物。提供的这些多肽也可以是融合蛋白或分离的多肽。已知来自几百种不同HBV分离物的HBsAg序列,这些序列不难获自NCBI数据库。
用于本发明的优选HBsAg至少包含HBV“a”决定区(氨基酸124-147,相对于sAg编号)的氨基酸序列。此区域的代表性野生型序列是CTTPAQGNSMFPSCCCTKPSDGNC(SEQ ID NO:4,adw野生型);CMTTAQGTSMYPSCCCTKPSDGNC(SEQ ID NO:5,ayw野生型)。在大量HBV逃避疫苗中和者中发现sAg的此区域中有突变。关于大量HBsAg变异的描述可参见Ashton-Richardt PG,Murray K.(1989)《乙肝病毒表面抗原的突变体并定义免疫显性“a”区域中一些抗原必要残基》(Mutants of the hepatitis B virus surface antigen anddefine some antigenically essential residues in the immunodominant"a"region).J.Medical Virology29:196-203;Norder H.Courouce A_M,Magnius L(1992)《四种主要亚型中乙肝病毒血清型变异的分子基础》(Molecular basis of the hepatitis B virusserotype variation within the four major subtype).J.General Virology 73:3141-3145;Carman WF,Zanetti AR等(1990),《疫苗-诱导的乙肝病毒逃避中和突变体》(Vaccine-induced escape mutant of hepatitis B virus).Lancet 336:325-329;Fujii H.Moriyama K等,《乙肝病毒的免疫逃避中和突变体HBs抗原中的Gly 145Arg取代》(Gly 145 to Arg substitution in HBs antigen of immune escape mutant of hepatitis B virus).Biochem.Biophys Res Comm 184:1152-1157;Carman,W.乙肝病毒的疫苗-相关型突变体(Vaccine-associated mutants of hepatitis B virus).《病毒型肝炎和肝病》(ViralHepatitis and Liver Disease)(1945)243-247页,K.Nishioka,H.Suzuki,S.Mishiro T.Oda编)
因此,此区域中包含突变的HBsAg尤其可用于本发明。此区域的代表性突变体包括F134A、F134S、G145R、S143L、P142S和Q129R/M133T。在各突变名称中,数字表示取代氨基酸的位置,数字之前的字母表示野生型序列中该位置上的氨基酸,数字之后的字母表示突变体中该位置上的氨基酸。这些突变体仅仅是代表性的,应理解,存在大量其它天然产生突变体,这些突变体可用于本发明。此外,“a”决定区中有突变的合成突变体也可用于本发明。上述“a”决定区以外的区域中有突变的变体也可用于本发明。例如,在氨基酸位置120上Q取代P的突变体(P120Q)可用作产生单克隆抗体的抗原。
可用标准技术获得用于本发明的抗原。用本领域熟知的重组方法能方便地产生HBV抗原。参见例如,美国专利号4,722,840、5098,704、5324,513、5,965,140和6,306,625,它们描述了用重组方法产生HBV抗原。例如,可通过本领域已知方法(如美国专利号4,710,463所述)从感染人血清中存在的Dane颗粒中酚抽提DNA,分离HBsAg S蛋白编码序列。然后可用限制性核酸内切酶消化分离的DNA。核酸内切酶的选择部分取决于具体Dane颗粒。例如,adw血清型中某些Dane颗粒的HBV DNA的HBsAg编码序列可分离成单个BamHI片段;ayw血清型中某些Dane颗粒的HBVDNA的HBsAg编码序列可分离成HhaI片段。相同血清型的Dane颗粒的HBV DNA也可具有不同的限制性位点图。
可根据HBV基因组的已知序列设计寡核苷酸探针,用该探针检测基因组文库或cDNA文库以寻找编码用于本发明的抗原的HBV基因。然后,还可用标准技术分离基因,如果需要,可用限制性酶使全长序列上所需部分的基因突变。参见例如,Sambrook等,同上,它描述了用于获得和分离DNA的技术。
最后,可根据已知序列合成产生编码HBV抗原的基因。可用所需具体氨基酸序列的合适密码子设计核苷酸序列。通常选择表达该序列的指定宿主的优选密码子。通常由用标准方法制备的重叠寡核苷酸组装完整序列,并组装成完整的编码序列。参见例如,Edge,Nature(1981)292:756;Nambair等,Science(1984)223:1299;Jay等,J.Biol.Chem.(1984)259:6311。
多核苷酸可包括各种多肽的编码序列,这些多肽是天然存在的或可包括天然情况下不存在的人工序列。如果需要,可用标准分子生物学技术将这些多核苷酸连接形成融合蛋白的编码序列。
一旦制备或分离了编码序列后,可将这种序列克隆入任何合适的载体或复制子。本领域技术人员知道许多克隆载体,选择合适的克隆载体是选择问题。合适的载体包括但不限于:当连接于合适的控制元件时能够复制的质粒、噬菌体、转座子、粘粒、染色体或病毒。然后将编码序列置于合适控制元件的控制下,控制元件取决于用于表达的系统。因此,可将编码序列置于启动子、核糖体结合位点(用于细菌表达)和(任选地)操纵子的控制下,以便将感兴趣的DNA序列通过合适的转录物转录成RNA。编码序列可以含有或不含可以随后在翻译后加工中被宿主去除的信号肽或前导序列。参见例如,美国专利号4,431,739;4,425,437;4,338,397。
如果存在,信号序列可以是与感兴趣HBV抗原相连的天然前导物。或者,可存在可提高分泌效率的异源信号序列。本领域已知许多代表性前导序列,包括但不限于:酵母α-因子前导物、TPA信号肽、Ig信号肽等。本领域已知这些和其它前导序列的序列。
除了控制序列以外,可能需要加入可以相对于宿主细胞生长调节序列表达的调控序列。本领域技术人员熟知调控序列,例子包括由于化学或物理刺激(包括存在调控化合物)引起基因表达被打开或关闭的序列。载体中也可存在其它类型的调控元件。例如,本文可用增强子元件提高构建物的表达水平。例子包括SV40早期基因增强子(Dijkema等,(1985)EMBO J.4:761)、衍生自劳氏肉瘤病毒的长末端重复序列(LTR)的增强子/启动子(Gorman等,(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA79:6777)和衍生自人CMV的元件(Boshart等,(1985)Cell 41:521)如CMV内含子A序列中包括的元件(美国专利号5,688,688)。表达盒还可包括在合适宿主细胞中自动复制的复制起点、一个或多个可选择标记、一个或多个限制性位点、高拷贝数和强启动子的可能。
构建表达载体,使具体编码序列位于具有合适调控序列的载体中,编码序列相对于控制序列的位置和方向应该能使编码序列在控制序列的“控制”下转录(即结合于控制序列的DNA分子的RNA聚合酶转录编码序列)。可能需要对编码感兴趣分子的序列加以修饰来实现此目的。例如,在一些情况下,可能需要修饰序列,以使其以合适方向连接于控制序列;即以维持阅读框。控制序列和其它调控序列可在插入载体前连接于编码序列。或者,可将编码序列直接克隆入已含有控制序列和合适的限制性位点的表达载体。
可构建任何合适的表达载体,或用其表达任何形式的本发明HBsAg。示范性载体是pCMVII,一种基于pUC19的设计用于在哺乳动物细胞中表达的克隆载体。pCMVII包括以下元件:人CMV IE增强子/启动子、人CMV内含子A、人组织纤溶酶原激活物(tPA)前导物、牛生长激素聚腺苷酸终止子(BGHt)、ColE1复制起点和AmpR氨苄青霉素抗性基因。例如,pCMVII-pS2-sAg可用于表达preS2-sAg。在此载体中,已将HBsAg的sAg和preS2结构域的编码序列插入pCMVII中的CMV内含子A和BGHt之间。也可通过(例如)去除preS2结构域或加入preS1结构域的编码序列修饰此载体。以举例方式提供这些载体,它们不旨在限制本发明范围。美国专利号6,740,323中详细描述了上述载体。
如上所述,也可能需要产生感兴趣多肽的突变体或类似物。可通过缺失编码感兴趣分子的序列的一部分、插入序列和/或取代该序列中的一个或多个核苷酸,来制备用于本发明组成的HBV多肽的突变体或类似物。本领域技术人员熟知修饰核苷酸序列的技术,如定位诱变等。参见例如,Sambrook等,同上;Kunkel,T.A.(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1985)82:448;Geisselsoder等,(1987)BioTechniques5:786;Zoller和Smith(1983)Methods Enzymol.100:468;Dalbie-McFarland等,(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA79:6409。
可在以下各种系统中表达分子:包括本领域熟知的昆虫、哺乳动物、细菌、病毒和酵母表达系统。例如,昆虫细胞表达系统如杆状病毒系统是本领域技术人员熟知的,参见例如Summers和Smith,Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No.1555(1987)。杆状病毒/昆虫细胞表达系统的材料和方法可以试剂盒形式购自Invitrogen,San Diego CA("MaxBac"试剂盒)等。类似地,细菌和哺乳动物细胞表达系统是本领域熟知的,参见例如Sambrook等,同上。酵母表达系统也是本领域熟知的,参见例如《酵母遗传工程》(Yeast Genetic Engineering)(Barr等编,1989)Butterworths,London。
用于上述系统的许多合适宿主细胞也是已知的。例如,本领域已知哺乳动物细胞系,包括获自美国典型培养物保藏中心(ATCC)的永生化细胞系,例如但不限于:中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人胚肾细胞、人肝细胞癌细胞(如Hep G2)、Madin-Darby牛肾("MDBK")细胞等。类似地,细菌宿主如大肠杆菌(E.coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和链球菌属(Streptococcus spp.)可用于本发明表达构建物。用于本发明的酵母宿主包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、白假丝酵母(Candida albicans)、麦芽糖假丝酵母(Candidamaltosa)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、脆弱克鲁维酵母菌(Kluyveromycesfragilis)、乳糖克鲁维酵母菌(Kluyveromyces lactis)、Pichia guillerimondii、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)和解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)等。与杆状病毒表达载体一起使用的昆虫细胞包括埃及伊蚊(Aedes aegypti)、苜蓿夜蛾(Autographa californica)、桑蚕(Bombyx mori)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)、草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)和粉纹夜蛾(Trichoplusiani)等。
可用本领域熟知的各种基因递送技术将包含感兴趣核苷酸序列的核酸分子稳定地整合到宿主细胞基因组中或维持在合适宿主细胞中的稳定附加型元件上。参见例如,美国专利号5,399,346。
根据所选的表达系统和宿主,通过在能够表达蛋白质的条件下培养用上述表达载体转化的宿主细胞,产生该分子。然后从宿主细胞中分离表达蛋白并纯化。如果表达系统将蛋白质分泌到生长培养基中,可直接从培养基中纯化产物。如果没有分泌,可从细胞裂解物中分离产物。本领域技术人员能够选择合适的培养条件和回收方法。
也可用化学聚合物合成如固相肽合成方法来合成HBV抗原。本领域技术人员已知这种方法。固相肽合成技术参见例如,J.M.Stewart和J.D.Young,《固相肽合成》(Solid Phase Peptide Synthesis),第二版,Pierce Chemical Co.,Rockford,IL(1984)和G.Barany和R.B.Merrifield,《肽:分析、合成、生物学》(The Peptides:Analysis,Synthesis,Biology),E.Gross和J.Meienhofer编,第2卷,Academic Press,New York,(1980),3-254页。
然后用如上所述获得的HBV抗原产生用于诊断的兔单克隆抗体。
抗-HBV抗体
然后用HBV抗原产生用于诊断和检测试验的HBV-特异性多克隆和单克隆抗体。HBV-特异性多克隆和单克隆抗体特异性结合于HBV抗原。具体说,可通过将HBV抗原给予哺乳动物,如小鼠、大鼠、兔、羊或马,用HBV抗原产生多克隆抗体。收集免疫动物的血清,通过(例如)用硫酸铵沉淀、然后进行色谱(优选亲和色谱),从而纯化血浆中的抗体。本领域已知产生和加工多克隆抗血清的技术。
也不难产生针对蛋白质中存在的抗HBV-特异性表位的兔和小鼠单克隆抗体。为了产生这些单克隆抗体,通过(例如)以下方法免疫感兴趣的哺乳动物如兔或小鼠:在盐水、优选佐剂如弗氏完全佐剂("FCA")中混合或乳化抗原,并通过胃肠道外(通常是皮下或肌肉内)注射该混合物或乳液。通常在2-6周后,用盐水、优选采用弗氏不完全佐剂("FIA")注射该抗原一次或多次,从而加强免疫动物。在一个实施方式中,用一种或多种HBsAg突变体,优选2-5种不同HBsAg突变体的混合物免疫动物。免疫原中也可包括野生型HBsAg。在优选方案中,起初用野生型HBsAg免疫动物(优选兔),然后用一种或多种HBsAg突变体加强免疫。尤其可用作免疫原的是天然存在的HBsAg突变体,如D3、D2、D1、Y1、Y2,如下所述。也可用本领域已知方法通过体外免疫产生抗体。参见例如,James等,J.Immunol.Meth.(1987)100:5-40。
然后获得免疫动物的多克隆抗血清。然而,并非使动物放血以提取血清,取出脾脏(和任选的几个大淋巴结)并分离成单细胞。如果需要,可通过将细胞悬液施加于用抗原包被的板或孔,筛选脾细胞(去除非特异性粘附的细胞后)。表达对抗原特异的膜结合免疫球蛋白的B-细胞能结合于该板,用其余悬液不能将其冲走。然后,诱导得到的B细胞或所有分离的脾细胞与来自永生化细胞系的细胞(也称为"融合伙伴")融合,形成杂交瘤。融合伙伴一般具有能够用特定培养基选择得到的杂交瘤的特性。例如,融合伙伴可以是次黄嘌呤/氨基蝶呤/胸苷(HAT)-敏感型。
如果需要兔-兔杂交瘤,永生化细胞系来自兔。本领域已知这种兔衍生的融合伙伴,包括例如:淋巴来源的细胞,如兔浆细胞瘤细胞(如Spieker-Polet等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1995)92:9348-9352和美国专利号5,675,063所述)或美国专利号4,859,595所述的TP-3融合伙伴。如果需要兔-小鼠杂交瘤或大鼠-小鼠或小鼠-小鼠杂交瘤等,小鼠融合伙伴可衍生自小鼠的永生化细胞系,如淋巴来源的细胞,一般来自小鼠骨髓瘤细胞系。本领域已知许多这种细胞系,可从ATCC获得。
用本领域已知技术完成融合。促进融合的化学物质通常称为促融剂。这些物质极度亲水,有利于接触膜。用于细胞融合的一种尤其优选的方法采用聚乙二醇(PEG)。细胞融合的另一种方法是电融合。在此方法中,使细胞接触改变细胞膜电位的预定放电。用于细胞融合的其它方法包括桥接-融合法(bridged-infusion method)。在此方法中,使抗原生物素化,使融合伙伴亲和素化。当细胞加在一起时,形成抗原反应性B细胞-抗原-生物素-亲和素-融合伙伴的桥。这能够将抗原-反应性细胞与永生化细胞特异性融合。该方法还可采用化学或电学方法来帮助细胞融合。
融合后,用选择性培养基(如HAT培养基)培养细胞。为了增加抗体分泌,可任选地采用具有分泌刺激作用的物质,如IL-6。参见例如,Liguori等,Hybridoma(2001)20:189-198。可通过有限稀释接种得到的杂交瘤,并测定其产生的能够特异性结合于免疫抗原(不结合不相关抗原)的抗体。然后,在体外(如用组织培养瓶或中空的纤维反应器)或体内(如作为小鼠腹水瘤)培养所选择的分泌单克隆抗体的杂交瘤。例如,可用RIA或ELISA鉴定产生HBV特异性抗体的杂交瘤,并通过在半固体琼脂中克隆或有限稀释分离。可用另一轮筛选分离产生HBV特异性抗体的克隆。
产生本发明兔单克隆抗体的另一种技术是选择性淋巴细胞抗体法(SLAM)。此方法包括在一大群淋巴细胞中鉴定产生具有所需特异性和功能的抗体的一种淋巴细胞。然后,拯救并克隆编码该抗体特异性的遗传信息(即免疫球蛋白VH和VL DNA)。参见例如,Babcook等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1996)93:7843-7848,它描述了此方法。
关于兔单克隆抗体以及从兔-兔和兔-小鼠融和细胞制备该单抗的方法的进一步描述可参见例如,美国专利号5,675,063(兔-兔);4,859,595(兔-兔);5,472,868(兔-小鼠)和4,977,081(兔-小鼠)。对产生常规小鼠单克隆抗体的描述,参见例如,Kohler和Milstein,Nature(1975)256:495-497。
可能需要提供嵌合抗体。可由上述单克隆抗体分子形成由人和非人氨基酸序列组成的嵌合抗体,以降低它们在人中的免疫原性(Winter等,(1991)Nature 349:293;Lobuglio等,(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:4220;Shaw等,(1987)J Immunol.138:4534;和Brown等,(1987)Cancer Res.47:3577;Riechmann等,(1988)Nature332:323;Verhoeyen等,(1988)Science 239:1534;和Jones等,(1986)Nature 321:522;1992年12月23日公开的EP公开号519,596;和1994年9月21日公开的英国专利公开号GB2,276,169)。
可用已知技术产生能够表现母体单克隆抗体分子的免疫结合特性的抗体分子片段,如F(ab′)2、Fv和sFv分子。Inbar等,(1972)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 69:2659;Hochman等,(1976)Biochem 15:2706;Ehrlich等,(1980)Biochem 19:4091;Huston等,(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85(16):5879;和Huston等的美国专利号5,091,513和5,132,405;和Ladner等的4,946,778。
在其它实施方式中,可用噬菌体展示系统在体外扩展单克隆抗体分子群体。Saiki等,(1986)Nature 324:163;Scharf等,(1986)Science 233:1076;美国专利号4,683,195和4,683,202;Yang等,(1995)J.Mol.Biol.254:392;Barbas,III等,(1995)Methods:Comp.Meth Enzymol 8:94;Barbas,III等,(1991)Proc Natl Acad Sci USA 88:7978。
一旦产生后,可用已知技术以噬菌体展示文库提高Fab分子的免疫结合亲和力。参见例如,Figini等,(1994)J.Mol.Biol.239:68。可分离或合成选自噬菌体展示文库的Fab分子重链和轻链部分的编码序列,并将其克隆入任何合适载体或表达复制子以进行表达。可采用任何合适的表达系统,包括上述表达系统。
不难用本领域熟知的标准技术,如关于HBsAg的上述技术获得上述编码兔单克隆抗体及其免疫反应性片段的多核苷酸序列。
抗HBV表位的抗体尤其可用于检测样品(如来自感染HBV的人的血清样品)中存在的HBV或HBV抗原。用于测定HBV抗原的免疫实验可单独或与HBV抗原联合使用一种抗体或几种抗体。用于测定HBV抗原的免疫实验可采用(例如)抗HBV表位的单克隆抗体、抗一种HBV多肽的表位的单克隆抗体组合、抗不同HBV多肽表位的单克隆抗体、抗相同HBV抗原的多克隆抗体、抗不同HBV抗原的多克隆抗体、或者单克隆和多克隆抗体的组合。例如,兔和小鼠单克隆抗体均可用于所述试验。免疫试验方法可基于(例如)竞争、直接反应或采用(例如)标记抗体的夹心型试验(以下进行进一步描述)。标记可以是(例如)荧光标记、化学发光标记或放射性标记。
抗-HBV抗体还可用于以免疫亲和柱分离HBV颗粒或抗原。该抗体可通过(例如)吸附或共价连接附着于固体支持物,以便使该抗体保留其免疫选择活性。任选地,可包括间隔基团,以使抗体的抗原结合位点保持可及。然后,可用固定的抗体结合生物样品(如血液或血浆)的HBV颗粒或抗原。通过(例如)pH改变从柱基质上回收结合的HBV颗粒或抗原。
优选的抗-HBV抗体是杂交瘤细胞系99S9(CMCC#12336)和99S6(CMCC#12337)(ATCC登录号分别为PTA-6014和PTA-6015)产生的抗体以及其衍生的抗体片段(如Fab、F(ab′)2、Fv、sFv)和嵌合或人源化抗体。
HBV诊断试验
如上所述,如上所述产生的抗-HBV抗体可用于鉴定HBV感染的试验。抗-HBV抗体可用作该试验的捕获组分和/或检测组分,如下所述。因此,可用存在HBV抗原和/或抗-HBV抗体作为样品中存在HBV的指标,测定生物样品中存在HBV。单克隆抗体可用于检测血样中的HBV,血样包括但不限于:全血、血清、血小板和血浆。根据所用试验,可通过检测HBV抗原(尤其是HBsAg)和HBV抗体的存在,用抗体检测对象如人对象的HBV感染,以及检测捐献血样的HBV污染。因此,可筛选个体捐献样品或集合样品的等分中是否存在HBV,可在混合这些样品之前清除被HBV污染的样品或集合样品。以此方式,可提供基本不含HBV污染的血液供给品。"基本不含HBV"指用本文所述试验不能检测到HBV的存在。相似地,可用本发明方法筛选可能用于移植的组织和器官样品,并可丢弃污染的组织和器官。
本文所用试验包括Western印迹;凝集试验;酶-标记和介导的免疫试验,如ELISA;生物素/亲和素和生物素-链霉抗生物素蛋白型试验;蛋白A-或蛋白G-介导的免疫试验;放射性免疫试验;免疫电泳;免疫沉淀,条带免疫印迹试验等。该反应通常包括可检测标记,如荧光标记、化学发光标记、放射性标记、酶学标记或染料分子,或者用于检测样品中存在的HBV抗原和与其接触的抗体之间形成复合物的其它方法。
上述试验通常包括将液相中未结合的抗体或抗原与结合了抗原-抗体复合物的固相支持物分离。可用于实施本发明的固体支持物包括基片如硝酸纤维素(如膜或微量滴定孔形式的硝酸纤维素);聚氯乙烯(如片层或微量滴定孔);聚苯乙烯胶乳(如珠或微量滴定板);聚偏氟乙烯;重氮化纸;尼龙膜;活化珠,磁反应珠等。
在本发明的一个方面,抗-HBsAg抗体,如本文所述兔单克隆抗体,可用于捕获或检测或捕获和检测样品中的HBV抗原,尤其是HBsAg。如上所述产生的HBsAg的抗体可用于捕获或检测或捕获和检测样品中的HBV抗原。"捕获"分析物(这里是样品中的HBV抗原)指可根据捕获分子的结合从其它样品组分中分离分析物。捕获分子一般直接或间接连接于固体支持物。检测分子一般可直接或间接连接于检测标记。
一般地,固体支持物首先在合适的结合条件下与固相组分(如一种或多种抗-HBV抗体)反应,以使该组分充分固定在支持物上。有时,可通过先偶联于结合特性更好的蛋白质来增强与支持物的固定。合适的偶联蛋白包括但不限于:蛋白A或蛋白G,大分子如血清白蛋白,包括牛血清白蛋白(BSA),钥孔血蓝素,免疫球蛋白分子,甲状腺球蛋白,卵清蛋白和本领域技术人员熟知的其它蛋白。或者,可用链霉抗生物素蛋白-或亲和素-包被的固体支持物固定生物素化的抗体。可用于将抗体结合在支持物上的其它分子包括多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、多聚氨基酸、氨基酸共聚物等。这些分子和偶联这些分子的方法是本领域普通技术人员熟知的。参见例如,Brinkley,M.A.Bioconjugate Chem.(1992)3:2-13;Hashida等,J.Appl.Biochem.(1984)6:56-63;Anjaneyulu和Staros,International J.of Peptide and Protein Res.(1987)30:117-124。
固体支持物与固相组分反应后,通过洗涤从支持物上去除任何未固定的固相组分,然后,在合适的结合条件下将结合于支持物的组分与怀疑含有分析物(如HBV抗原)的生物样品相接触。洗涤去除未结合的分析物后,可在合适的结合条件下加入第二种结合物部分,其中第二种结合物能够选择性连接结合配体。然后,可用本领域熟知方法检测第二种结合物的存在。
更具体说,可采用ELISA法,其中用本发明的兔抗-HBV抗体直接或间接包被微量滴定板的孔。可采用如本文所述抗一种或多种HBV突变体的兔抗-HBV抗体。优选采用杂交瘤品系99S9或99S6产生的兔单克隆抗体。此外,也可存在抗野生型HBsAg的其它抗-HBV抗体,以及抗野生型HBsAg或HBsAg突变体的其它小鼠单克隆抗体。然后,将含有或怀疑含有HBV抗原的生物样品加入包被孔中。孵育足以使抗原-抗体结合的一段时间后,可洗涤该板,以去除未结合部分,加入可检测标记的第二结合分子。使第二结合分子与任何捕获样品反应,洗涤板,用本领域熟知方法检测第二结合分子的存在。
在一个具体形式中,采用ELISA抗原夹心形式。在这种情况下,用如上所述抗一种或多种HBV突变体的抗-HBV抗体包被固体支持物。也可存在抗野生型HBsAg的抗-HBV抗体。然后,在允许HBV抗原(如果存在)结合一种或多种抗体以形成抗原/抗体复合物的条件下,使样品接触支持物。去除未结合抗原,加入能与结合的抗原/抗体复合物反应的酶标记的抗体,如标记的抗HBsAg抗体。用酶底物产生信号。在此具体实施方式中,包被在固体支持物上的抗-HBV抗体可以是本发明的兔单克隆抗体,优选为杂交瘤99S9或杂交瘤99S6或二者产生的抗体。或者,或此外,可检测标记的抗体可以是本发明的兔单克隆抗体,优选为杂交瘤99S9或杂交瘤99S6或二者产生的抗体。
在另一实施方式中,不难用含有抗原配体的抗体的第二结合物检测生物样品中存在的结合的HBV分析物。本领域已知许多抗-人免疫球蛋白(Ig)分子,不难用本领域技术人员已知的方法将其偶联于可检测的酶标记,如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或脲酶。然后用合适的酶底物产生可检测信号。在其它相关实施方式中,可用本领域技术人员已知的方法实施竞争型ELISA技术。
本发明的兔抗-HBV抗体也可用于间接ELISA,例如下述的间接IgG ELISA。将对HBV表面抗原特异的抗体连接于固体支持物。可用蛋白A或蛋白G将抗体固定在固体支持物上。然后,在能够与结合于支持物的抗-HBV抗体结合形成抗体/抗原复合物的条件下使该支持物接触HBsAg。去除未结合抗原,在允许人抗-HBV IgG(如果存在)结合于抗体/抗原复合物中的抗原的条件下使该支持物接触准备检测是否存在HBV的人IgG抗体的样品。可用可检测标记的抗-人IgG抗体检测是否存在结合的抗-HBV IgG。以类似方式,可用标记的抗-人IgM结合抗体/抗原复合物来检测是否存在HBV的人IgM抗体。
本发明兔抗-HBV抗体也可用于捕获ELISA,例如下述的IgM捕获ELISA。将抗-人IgM抗体(如山羊抗-人IgM抗体)连接于固体支持物,在允许抗-HBV IgM(如果存在)结合于连接于固体支持物的一种或多种抗-人IgM抗体以形成抗体/抗体复合物的条件下,使该支持物接触准备测定是否存在HBV的人IgM抗体的样品。在允许结合于抗体/抗体复合物中的抗-HBV IgM形成抗体/抗体/抗原复合物的条件下,加入HBsAg(如突变体和/或野生型)。去除未结合抗原,在允许结合于结合抗原的条件下加入如上所述产生的可检测标记的抗-HBV抗体。通过测定连接于固体支持物的结合的抗-人IgM抗体/人抗-HBV IgM/抗原复合物上是否存在可检测标记的抗-HBV抗体,确定样品中是否存在HBV的IgM抗体。
虽然上述试验形式中的一些称为"ELISA"(酶联免疫吸附试验)试验,但本领域技术人员将明白,可采用除"酶联"结合部分以外的可检测标记,这在许多情况下都是有利的。本文描述了其它合适的可检测标记,它们是本领域熟知的。
也可在融液中进行试验,以便HBV抗原或抗体和对这些分子特异的配体在沉淀条件下形成复合物。在一个具体实施方式中,可用本领域已知的偶联技术,如直接化学方法或间接偶联技术将分子连接于固相颗粒(如琼脂糖珠等)。然后,在合适的结合条件下使包被的颗粒接触怀疑含有HBV抗体或抗原的生物样品。结合抗体之间的交叉连接使得形成了可用洗涤和/或离心从样品中沉淀和分离的复合聚集体。可分析该反应混合物,用许多标准方法中的任一种,如上述免疫诊断方法确定是否存在复合物。
在又一实施方式中,可提供免疫亲和基质,其中(例如)将来自怀疑含有HBV抗体的生物样品的多克隆抗体群体固定在基片上。可用固定抗原进行该样品的初始亲和纯化。因此,得到的样品制剂仅含有抗-HBV部分,避免了亲和支持物中可能的非特异性结合特性。本领域已知以高产率和能够良好保留抗原结合活性的方式固定免疫球蛋白(完整或特异性片段)的许多方法。例如,可用蛋白A或蛋白G将免疫球蛋白分子固定于固体支持物。一旦固定了免疫球蛋白分子而提供了免疫亲和基质后,在合适的结合条件下使HBV抗原如HBsAg接触结合抗体。从免疫亲和支持物上洗掉任何非特异性结合的HBV抗原后,可用本领域已知方法测定标记,以确定是否存在结合抗原。例如,加入能与结合的抗原/抗体复合物反应的酶学标记的抗体,如标记的抗HBsAg抗体,该抗体是如上所述产生的。用酶底物产生信号。
在本发明的另一实施方式中,用条带免疫印迹试验(SIA)检测生物样品中的HBV抗原。例如,可将上述一种或多种兔单克隆抗体和任选的抗HBsAg的小鼠单克隆抗体固定在测试条带上作为捕获试剂。SIA技术是本领域熟知的,它组合了传统的Western和点印迹技术,如RIBA
(Chiron Corp.,Emeryville,CA)SIA。在这些试验中,将抗体作为单独抗体、分离部分如条带或点,固定在膜状支持物上,或可作为混合物固定在单个部分中。因此,在膜状支持物上"分离固定"指该抗体以分离组分存在,并未混合,以致于可评价与存在的各捕获试剂是否具有反应性。然后,将怀疑含有HBV抗原的生物样品与测试膜反应。可将抗-HBV抗体酶-偶联物与发色酶底物联用,使生物样品中的反应性可视化。或者,上述兔单克隆抗体可用于显示结合的抗体-抗原复合物。可用(例如)抗HBsAg的小鼠单克隆抗体制备此互换实施方式的测试条。可手工进行该试验,或以自动化形式使用该试验。
可用于实施条带免疫印迹试验的固体支持物包括但不限于:衍生自许多初级(primary)聚合物的膜状支持物,所述聚合物包括纤维素、聚酰胺(尼龙)、聚丙烯腈、聚偏二氟乙烯、聚砜、聚丙烯、聚酯、聚乙烯和由上述物质的组合或衍生物构成的复合树脂。尤其优选的是衍生自纤维素的支持物如硝酸纤维素膜,以及尼龙膜。该基片通常包括所需的膜,并具有惰性塑料衬背作为支持物。
可在试剂盒中提供上述试验试剂,包括本文所述兔单克隆抗体和/或HBsAg、具有结合试剂的固体支持物、以及其它检测试剂,该试剂盒还包括合适的说明书和其它必需试剂,以进行上述试验。该试剂盒也可包括对照制剂(阳性和/或阴性)、标记试剂(该试验需要时)和信号产生试剂(如酶底物)(如果标记不直接产生信号)。试剂盒中通常包括用于进行该试验的说明书(如手写、磁带、VCR、CD-ROM等)。根据所用具体试验,该试剂盒也可包括其它包装试剂和材料(即洗涤缓冲液等)。可用这些试剂盒进行如上所述的标准试验。
将以下品系的生物纯培养物保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)(10801University Boulevard,Manassas,VA)。在成功地进行存活检测后,指定了所示登录号,申请人已经缴纳了必需的费用。该保藏是根据国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约和其(布达佩斯条约)细则进行的。其保证从保藏日起三十(30)年内和保藏单位最近一次请求提供保藏样品后至少五(5)年内维持存活的培养物。可根据布达佩斯条约从ATCC获得该有机体,其保证了由美国专利商标局局长依据35U.S.C.§122及相关局长令(包括37C.F.R.§1.12)所确定的人有权永久地无限制地获得该培养物。授予专利权后,将不可返回地取消对公众获得保藏培养物的所有限制。
提供这些保藏物仅仅为了方便本领域技术人员,而并非是承认需要按照35U.S.C.§112进行保藏。这些质粒的核酸序列以及它们编码的多肽的氨基酸序列纳入本文作参考,在与本说明书相抵触时用于核对。需要许可才能制备、使用或出售保藏材料,迄今并未提供这种许可。