CN105017415A - 针对乙肝表面蛋白全人源单克隆抗体的制备及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种针对乙肝表面蛋白全人源单克隆抗体B5H6及编码的该抗体的基因。实验表明抗体B5H6能够特异性结合HBsAg蛋白,有较好的HBV中和活性,进而可能阻止HBV的感染相关的肝炎、肝硬化及肝癌的进程。同时,由于该抗体是从接种乙肝疫苗的志愿者外周血中HBsAg特异的记忆性B细胞中克隆获得的全人源抗体,其具有较鼠源、嵌合及人源化抗体更低的免疫原性,可用于制备预防或治疗乙肝病毒相关肝病的药物或诊断试剂。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,更具体地,本发明公开了抗乙肝表面蛋白抗体的制备技术及其在预防HBV感染和治疗HBV相关肝细胞肝癌中的用途。
背景技术
乙肝病毒(Hepatitis B virus,HBV)是双链DNA病毒,人体被感染后易引起慢性乙型肝炎,进而导致肝硬化和(或)肝癌。据统计近年来全球约有3.5亿HBV感染者,每年约有100万~150万人死于急性或慢性HBV感染导致的肝功能衰竭,肝硬化和(或)肝癌,因而预防HBV感染成为世界公共健康问题[1]。肝细胞癌(Hepatocellularcarcinoma,HCC,简称肝癌)与病毒性肝炎的关系密切,是病毒性肝炎所引起的最重要死亡原因之一,亦是临床上最常见的恶性肿瘤之一,在世界范围内是位居第三的肿瘤相关致死原因,每年新发病例中我国占全球42.5%,已成为我国第二位的肿瘤病因。
研究表明,HBV感染相关HCC患者中,HBV DNA载量高者(>105copies/ml)的HCC发生率达10.1%,而HBV DNA载量低者(<104copies/ml)的HCC发生率仅为3.8%,基线高病毒载量与HCC发生率升高有关。高病毒载量(HBV DNA≥0.7mEq/ml)时,HCC复发危险比为5.13,切口缘阳性的HCC复发危险比为2.14。因此,对乙肝患者进行抗病毒治疗,有助于延缓疾病向HCC的进展。对HBV相关HCC患者进行抗病毒治疗,可通过改善肝功能而提高生存率。近年的研究显示,高HBV DNA载量与高HCC复发率及预后不良有关。对HBV感染相关HCC术后患者进行抗病毒治疗可能是除肝移植以外的另一种治疗选择,该治疗可通过改善肝功能而提高生存率。
目前针对HBV感染主要采用α-干扰素和核苷酸类似物等药物抗病毒治疗,但该两类药物长期使用疗效欠佳,易于导致病毒突变,给治疗带来极大困难[2]。
相对于抗病毒感染的药物,乙肝特异性的免疫球蛋白(HBIG)的抗病毒效果好很多。给予病人乙肝特异性的免疫球蛋白(HBIG)治疗已给被各国的学者广泛关注。诸如,HBIG在乙肝来源的肝癌后肝移植后的研究已达到很好的效果。HBIG是一种高效价的多克隆外源性抗体,其是从健康献血员中筛选出来,经过生物浓缩工艺制成。当人体感染HBV时被动地接受这种被动免疫制剂,可使机体能短期内迅速中和并清除血清中游离的乙肝病毒,避免乙肝病毒定位感染。
然而,当前HBIG作为治疗性抗体的来源存在诸多非安全因素。同时,乙肝免疫球蛋白成分复杂,危险因素相对不确定,生产方式受限,这些因素制约着乙肝治疗性抗体的临床使用[3]。
因此迫切需要研发一种安全有效及危险因素相对可控的生物制品替代人乙肝免疫球蛋白,所以研发乙肝特异性人源基因工程抗体越来越受到关注。因单克隆抗体具有特异性强、灵敏度高且易大规模生产等优点,故研发针对乙肝表面抗原(Hepatitis B surface Ag,HBsAg)的单克隆抗体,以期能够安全有效地中和HBV病毒,阻止HBV感染及其相关的肝炎、肝硬化及肝癌的进程。
发明内容
本发明利用Single cell RT-PCR单细胞抗体技术开发一株了抗乙肝表面蛋白的全人源单克隆抗体B5H6,采用了以下技术方案:
本发明提供的针对乙肝表面蛋白全人源单克隆抗体B5H6具有这样的特征,包括:重链可变结构域,包含高变区CDR1、CDR2、CDR3;以及轻链可变结构域,包含高变区CDR1'、CDR2'、CDR3',其中,CDR1的氨基酸序列为:Ser-Ser-Ala-Ile-Leu;CDR2的氨基酸序列为:Trp-Ile-Val-Val-Gly-Ser-Gly-Asn-Ala-Lys-Tyr-Ala-Gln-Arg-Phe-Gln-Glu;CDR3的氨基酸序列为:Arg-Gly-His-Ser-Phe-Thr-Ser-Pro-Phe-Asp-Ser;CDR1'的氨基酸序列为:Arg-Ala-Ser-Gln-Ser-Val-Gly-Ser-Asn-Tyr-Leu-Ala;CDR2'的氨基酸序列为:Gly-Ala-Ser-Thr-Arg-Ala-Thr;CDR3'的氨基酸序列为:Gln-Lys-Tyr-Gly-Ser-Ser-Leu-Thr。
重链可变结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示,轻链可变结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
同时,抗体B5H6选自抗乙肝表面抗原的单克隆抗体以及单克隆抗体片段中的任意一种,该单克隆抗体片段为单克隆抗体的Fab片段或F(ab’)2片段。
进一步的,本发明还提供了一种针对乙肝表面蛋白的抗体片段,该抗体片段为抗体B5H6的Fab片段或F(ab’)2片段。
进一步的,本发明提供了一种编码抗体B5H6的基因,编码重链可变结构域的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示,编码轻链可变结构域的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
进一步的,本发明提供了一种含有至少一个拷贝的上述基因的表达载体。
进一步的,本发明提供了一种含有至少一个上述的表达载体的宿主细胞。
进一步的,本发明提供了抗体B5H6或其Fab片段或F(ab’)2片段在制备预防或治疗乙肝病毒相关肝病的药物或诊断试剂中的用途。所述药物或诊断试剂除包含抗体或抗体片段外,还包含可药用赋形剂、稀释剂与载体中的任意一种。
发明作用与效果
本发明提供了一种针对乙肝表面蛋白全人源单克隆抗体B5H6,实验表明其能够特异性结合HBsAg蛋白,有较好的HBV中和活性,进而可能阻止HBV感染及其相关的肝炎、肝硬化及肝癌的进程。同时,由于该抗体是从接种乙肝疫苗的志愿者外周血中HBsAg特异的记忆性B细胞中克隆获得的全人源抗体,其具有较鼠源、嵌合及人源化抗体更低的免疫原性。
附图说明
图1是本发明的本发明全人源抗体B5H6特异性结合乙肝病毒表面抗原检测结果图;
图2是本发明的合成肽在乙肝表面抗原(HBsAg)的位置示意图;
图3是本发明的抗体B5H6在HBsAg结合表位结果图;
图4是本发明的抗体B5H6影响HBsAg表达的定量检测结果图;
图5是本发明的抗体B5H6影响HBV DNA拷贝数定量检测结果图;图6是本发明的抗体B5H6抑制肝癌细胞HBsAg的释放的结果图。
具体实施方式
以下结合实施例来对本发明进行进一步的说明,但不应理解为对本发明的限制。
实施例不包括对传统方法的详细描述,如:Overlapping PCR反应,限制性酶切反应,将基因插入到质粒载体,将质粒引入宿主细胞的方法等。这样的方法对于本领域中具有普通技术的人员是众所周知的,并且在许多出版物中都有所描述,例如Sambrook,J.Fritsch,E.F.and Maniais,T.(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2ndedition,Cold spring Harbor Laboratory Press。且下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
试剂与材料
淋巴细胞分离液,购自北京鼎国生物技术有限责任公司;Trizol试剂,购自Invitrogen公司;无血清培养基EX-CELL 302,购自SIGMA-ALDRICH公司;Goat anti-human kappa-HRP购自Invivogen公司;
实施例一:抗乙肝表面表面抗原的全人源抗体B5H6的制备
一、抗体轻链恒定区、重链恒定区基因的克隆及其载体的构建
用淋巴细胞分离液分离健康人淋巴细胞,用Trizol试剂提取总RNA,根据文献[4]和文献[5]报道的序列分别设计引物采用QIAGENOneStep RT-PCR Kit扩增人抗体的重链和轻链恒定区基因。将人抗体的重链和轻链恒定区基因分别连接到表达载体AbVec质粒中,分别构建了抗体重链恒定区核苷酸载体IgG-AbVec质粒以及抗体轻链恒定区核苷酸载体Igκ-AbVec质粒,测序验证后确认获得了正确的克隆。其中,人抗体重链恒定区核苷酸序列及氨基酸序列分别为SEQ IDNO:1和SEQ ID NO:2,人抗体轻链恒定区核苷酸序列及氨基酸序列分别为SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4。
二、抗体重链可变区、轻链可变区序列获得以及重组表达载体的构建
具体地,采用超高速流式分选系统分离接种乙肝疫苗的志愿者外周血中HBsAg特异的记忆性B细胞(HBsAg+IgG+CD19),并制备成单细胞样本。紧接着,采用Single Cell RT-PCR技术克隆每个样本中抗体轻链和重链可变区序列,由于单个细胞合成的cDNA特别稀少,必须采用巢氏PCR的方法扩增其含有的抗体基因。
两轮PCR后可见明显的PCR条带扩增(大小约400bp)。分析其序列后特异性PCR扩增抗体可变区条带,并引入限制性酶切位点。将抗体重链和轻链可变区基因分别克隆入IgG-AbVec质粒和Igκ-AbVec质粒,构成分别含有B5H6完整重轻链的重组表达载体,分别记为IgG-AbVec-B5H6和Igκ-AbVec-B5H6。其中抗体B5H6重链可变区核苷酸序列及氨基酸序列分别为SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6;轻链可变区核苷酸序列及氨基酸序列分别为SEQ ID NO:7和SEQ IDNO:8。
三、抗乙肝表面蛋白的全人源抗体B5H6表达及纯化
于3.5cm细胞培养皿中接种5×105CHO-K1细胞,将细胞培养至90%-95%融合时进行转染,具体步骤如下:取5μg质粒
IgG-AbVec-B5H6、5μg质粒Igκ-AbVec-B5H6及20μLLipofectamine2000Reagent,按Lipofectamine 2000Reagent试剂盒说明书进行转染。转染进行24h后,将细胞培养基换为含600μg/mL G418的DMEM培养基筛选抗性克隆。
将筛选得到的稳定表达抗体的CHO-K1细胞株用无血清培养基EX-CELL 302扩大培养,用Protein A Sepharose 4Fast Flow纯化系统,按说明书亲和纯化得到抗体B5H6。将纯化得到的抗乙肝表面蛋白全人源单克隆抗体B5H6用PBS进行透析,最后用紫外吸收法测定B5H6抗体的含量。
采用聚丙烯酰氨凝胶电泳方法,鉴定抗体的结构。纯化后的抗体分别在非还原和还原条件下用聚丙烯酰氨凝胶电泳检测其分子量大小。电泳结果显示:在还原条件下,B5H6抗体呈现为分子量大小约55KDa和25KDa的重链和轻链条带。在非还原条件下,B5H6抗体呈现出分子量约为150KDa的单一条带。
由此可以推测出抗乙肝表面蛋白的全人源抗体B5H6的结构:该抗体由两条相同的轻链和两条相同的重链组成,轻链由轻链可变区和轻链恒定区组成,重链由重链可变区和重链恒定区组成,其中一条轻链分别与一条重链通过二硫键连接,形成两个半分子,两个半分子的两条重链之间通过二硫键连接形成所述抗体。至此,我们构建并表达出完整的全人源单克隆抗体B5H6。
实施例二、抗乙肝表面蛋白的全人源抗体B5H6的特异性
用Elisa方法检测全人源单克隆抗体B5H6特异性结合HBsAg蛋白。
将重组HBsAg蛋白及对照蛋白cIg包被酶联免疫板,经封闭液封闭后,分别加入空白组、不同浓度的对照蛋白cIg及表达纯化的不同浓度的B5H6抗体孵育,洗板后加入Goat anti-human kappa-HRP,TMB显色液显色,酶标仪在450nm波长下读值。
依据抗体浓度及对应的OD值绘制图1,由图1分析可得,随着抗体浓度的增高,其包被HBsAg蛋白组对应读值也相应增高。而包被对照蛋白组读值与空白组读值相近且不随抗体浓度变化而变化,且对照蛋白cIg组读值并未依赖自身浓度变化而发生变化,故抗体B5H6能够特异性结合HBsAg蛋白。
实施例三、抗乙肝表面蛋白的全人源抗体B5H6结合抗原表位鉴定
综合以往文献报道的乙肝表面抗原(HBsAg)具有中和活性的抗原性表位区域,合成了生物素标记的乙肝表面抗原短肽,来测定全人源乙肝表面蛋白单克隆抗体在HBsAg上的结合区域。如图2中的HBsAg模式图所示,合成的四条生物素标记乙肝表面抗原短肽P1
(aa:104-120)、P2(aa:121-137)、P3(aa:139-148)、P4(aa:149-163),P1-P4的氨基酸序列如SEQ ID NO.9~SEQ ID NO.12所示。其中,抗原短肽P1和P4为线性结构,P2和P3为环状结构[6]。
采用ELISA的方法分析了B5H6单克隆抗体的结合抗原表位,由图3可知,B5H6抗体结合于P2位置。
实施例四、抗乙肝表面蛋白的全人源抗体B5H6体外中和HBV活性的鉴定
近几十年,对HBV体外感染模型研究进展缓慢,主要以黑猩猩为宿主的HBV体内感染模型因价格昂贵和较难获得,一直阻碍HBV深入研究[7]。近年来,随着HepaRG细胞系的建立,对HBV的研究有较大进展[8]。HepaRG细胞系是当前唯一被公认的HBV体外感染模型。因此,我们采用HepaRG细胞测定B5H6单克隆抗体的中和HBV感染HepaRG细胞的能力,综合HBsAg及HBV DNA拷贝数定量检测分析了B5H6单克隆抗体的中和HBV能力。
一、抗体B5H6影响HBsAg定量检测
用William’s E medium培养HepaRG细胞,加入2%DMSO培养四周,每三天换液。四周后,诱导分化好的HepaRG细胞呈现典型的肝细胞样小簇,并从非分化的HepaRG细胞中分离出来,DMSO诱导继续培养两周后,细胞约有一半呈现肝细胞样变化。诱导分化好的HepaRG细胞继续用含有10%胎牛血清William’s E medium 100units/mL青霉素、100μg/mL链霉素、5g/mL重组人胰岛素、5×105mol/L氢化可的松钠盐继续培养,备用。
纯化并除菌的抗HBsAg单克隆抗体(1μg/mL)与2×106HBVDNA拷贝数的病毒量室温孵育1小时。加入DMSO诱导分化好的HepaRG细胞中,并加入PEG8000,终浓度为4%,37℃孵育过夜。第二天换液,用磷酸盐缓冲液洗涤三次,加入新鲜的配制好的William’s E medium,继续培养。收集感染后第6天的细胞上清,采用罗氏公司生产的电化学发光免疫分析仪及其配套试剂产品定量检测HBsAg。
如图4所示,感染第6天,同对照组(cIgG组)以及与抗体B5H6采用相同的方法制备的抗体F2E5、抗体B2E5、抗体D3F6相比:抗体F2E5处理组中细胞上清中HBsAg表达量与对照组几乎无差别;抗体B2E5、抗体D3F6及抗体B5H6组处理组与对照组(cIgG组)相比细胞上清中HBsAg表达量出现下降,但B5H6抗体较其他处理组,HBsAg表达量出现明显下降(*P<0.05),故抗体B5H6较其他抗体更具有较好的HBV中和活性。
二、抗体B5H6影响HBV DNA拷贝数定量检测
按照HBV DNA荧光定量PCR试剂盒说明书检测感染后第6天的细胞中HBV DNA拷贝数,步骤如下:
(1)准备工作:将样品处理液A置于70℃加热5-10min,融化后混匀备用;在样品处理液B中加无水乙醇6mL,混匀备用;在样品处理液C中加无水乙醇16mL,混匀备用;在去抑制剂中加入700μL灭菌DEPC处理水,溶解后混匀备用;
(2)核酸提取:吸取20μL去抑制剂于0.5mL离心管中;加入100μL样品,用带滤芯吸嘴反复吹打3次;加入100μL样品处理液A,振荡混匀,瞬时离心数秒后置于70℃条件下反应10min;将作好标记的核酸提取柱放入2ml离心管中,将上一步中所有液体移入核酸提取柱。离心10000rpm×1min;将提取柱放入一新的2mL离心管中,加入500μL样品处理液B,离心10000rpm×1min;将提取柱放入一新的2mL离心管中,加入500μL样品处理液C,离心10000rpm×1min;将提取柱放入一新的2mL离心管中,离心14000rpm x 1min;将提取柱放入一新的2mL离心管中,小心将50uL灭菌纯水加在柱面中央,静置1min;离心10000rpm×1min。取2mL离心管中的收集液12μL做PCR反应模板。按照HBV DNA荧光定量PCR试剂盒说明书检测检测荧光值。
如图5所示,感染第6天,抗体F2E5、抗体B2E5、抗体D3F6处理组细胞中HBV-DNA拷贝数与对照组(cIgG组)几乎无差别,但B5H6抗体组处理组较其他处理组细胞中HBV-DNA拷贝数出现明显下降(*P<0.05),说明B5H6抗体具有较好的抑制HBV DNA复制的能力。
实施例五、抗体B5H6抑制肝癌细胞HBsAg的释放
HBV病毒感染与原发性肝细胞癌发生之间的关系日益受到关注。1976年Alexander等从莫桑比克一名原发性肝癌男性患者分离到一株人肝癌细胞系,命名为PLC/PRF/5(以下简称PLC),该细胞系能够持续稳定产生HBsAg,自报道以来,PLC已成为国际上研究HBV与肝癌关系的一个重要实验模型。
以此肝癌细胞模型研究抗体是否能够抑制肝癌细胞中HBsAg释放。cIgG、B5H6、B2E5、D3F6及F2E5抗体组分别处理PLC/RPF/5细胞,24小时后撤除抗体,代以新鲜的培养基。3、6、12、24小时时间点,检测细胞上清中的HBsAg的含量。如图6所示,抗体撤除后,随时间推移抗体D3F6及F2E5两处理组中细胞上清中HBsAg与对照组(cIgG组)上升速率几乎无差别。抗体B5H6及B2E5处理组细胞上清中的HBsAg的含量上升速率明显低于cIg组、D3F6及F2E5处理组,但B5H6抗体抑制HBsAg释放效果明显优于B2E5抗体组(*p<0.05),B5H6抗体能够有效抑制肝癌细胞HBsAg释放。
实施例的作用与效果
实施例提供了一种针对乙肝表面蛋白的全人源抗体B5H6,实验表明其能够特异性结合HBsAg蛋白,有较好的HBV中和活性,进而可能阻止HBV感染及其相关的肝炎、肝硬化及肝癌的进程。同时,由于该抗体是从接种乙肝疫苗的志愿者外周血中HBsAg特异的记忆性B细胞中克隆获得的全人源抗体,其具有较鼠源、嵌合及人源化抗体更低的免疫原性。
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本发明不限于具体实施方式的范围,对本技术领域的普通技术人员来讲,只要各种变化在所述的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内,这些变化是显而易见的,一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。
Claims (11)
1.一种针对乙肝表面蛋白全人源单克隆抗体B5H6,其特征在于,具有:
重链可变结构域,包含高变区CDR1、CDR2、CDR3;以及
轻链可变结构域,包含高变区CDR1'、CDR2'、CDR3',
其中,所述CDR1的氨基酸序列为:Ser-Ser-Ala-Ile-Leu;
所述CDR2的氨基酸序列为:Trp-Ile-Val-Val-Gly-Ser-Gly-Asn-Ala-Lys-Tyr-Ala-Gln-Arg-Phe-Gln-Glu;
所述CDR3的氨基酸序列为:Arg-Gly-His-Ser-Phe-Thr-Ser-Pro-Phe-Asp-Ser;
所述CDR1'的氨基酸序列为:Arg-Ala-Ser-Gln-Ser-Val-Gly-Ser-Asn-Tyr-Leu-Ala;
所述CDR2'的氨基酸序列为:Gly-Ala-Ser-Thr-Arg-Ala-Thr;
所述CDR3'的氨基酸序列为:Gln-Lys-Tyr-Gly-Ser-Ser-Leu-Thr。
2.根据权利要求1所述的针对乙肝表面蛋白全人源单克隆抗体B5H6,其特征在于:
其中,所述重链可变结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示,所述轻链可变结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
3.根据权利要求2所述的针对乙肝表面蛋白全人源单克隆抗体B5H6,其特征在于:
其中,所述抗体B5H6选自抗乙肝病毒表面抗原的单克隆抗体以及所述单克隆抗体片段中的任意一种,
所述单克隆抗体片段为所述单克隆抗体的Fab片段或F(ab’)2片段。
4.一种针对乙肝表面蛋白全人源单克隆抗体片段,其特征在于:
所述抗体片段为权利要求1或2所述的抗乙肝病毒表面抗原的全人源抗体B5H6的Fab片段或F(ab’)2片段。
5.一种编码权利要求1或2所述的针对乙肝表面蛋白全人源单克隆抗体B5H6的基因,其特征在于:
编码所述重链可变结构域的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示,编码所述轻链可变结构域的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
6.一种表达载体,其特征在于:
所述表达载体含有至少一个拷贝的权利要求5所述的基因。
7.一种宿主细胞,其特征在于:
所述宿主细胞含有至少一个权利要求6所述的表达载体。
8.权利要求1~3任一项所述的针对乙肝表面蛋白全人源单克隆抗体B5H6在制备预防或治疗乙肝病毒相关肝病的药物或诊断试剂中的用途。
9.权利要求4所述的针对乙肝表面蛋白全人源单克隆抗体片段在制备预防或治疗乙肝病毒相关肝病的药物或诊断试剂中的用途。
10.一种含有权利要求1~3任一项所述的针对乙肝表面蛋白全人源单克隆抗体B5H6的药物或诊断试剂,其特征在于:
其中,所述药物或诊断试剂还包含可药用赋形剂、稀释剂与载体中的任意一种。
11.一种含有权利要求4所述的针对乙肝表面蛋白全人源单克隆抗体片段的药物或诊断试剂,其特征在于:
其中,所述药物或诊断试剂还包含可药用赋形剂、稀释剂与载体中的任意一种。
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WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |