CN109021098A - 全人源化单克隆抗体及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种全人源化单克隆抗体及其制备方法和应用，公开了可与乙肝病毒表面抗原特异性结合全人源化单克隆抗体，并且其能有效地抑制乙肝病毒感染肝细胞。还公开了本发明所述的全人源化单克隆抗体的编码基因以及全人源化单克隆抗体在预防或治疗乙型肝炎病毒感染的应用。

Description

全人源化单克隆抗体及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物医药和基因工程技术领域，具体涉及一种全人源化单克隆抗体及其制备方法和应用，尤其是涉及一种乙型肝炎病毒表面抗原特异性的全人源化单克隆抗体及其制备方法和应用。
背景技术
慢性乙型肝炎病毒感染是一种世界范围内普遍流行的病毒传染性疾病，全球约有2.4亿的慢性乙肝病毒携带者。尽管由于成功的疫苗接种，我国一般人群的表面抗原的携带率有了较为明显的下降。据推算，我国目前仍有约9300万慢性乙肝病毒感染者，其中慢性乙型肝炎患者约2000万。因此，在相当长的时间内，如何预防和治疗慢性乙型肝炎仍是我们面临的严峻挑战。
慢性乙型肝炎病毒感染是导致肝硬化及肝癌的最主要的原因之一。HBV感染者发展为严重肝脏疾病如肝功能不全、肝硬化、肝癌的风险较高。慢性HBV感染现有治疗方法仍有不足，如干扰素免疫调节治疗策略仅能使一小部分的患者获得临床治愈；核苷(酸)类似物治疗能抑制病毒复制，但是停药后很难达到持续病毒学应答且临床治愈率极低。
建立在人单克隆抗体基础上的免疫疗法至今取得了令人瞩目的成功，特别是在治疗某些肿瘤和自身免疫疾病及感染性疾病方面。更多的近期研究显示慢性病毒感染疾病可以通过单抗相关的免疫疗法治疗，中和抗体能通过抗原结合部位识别病毒，特异性阻断病毒入侵。除此之外，中和抗体还有免疫“效应”功能，包括清除循环的病毒，介导细胞毒作用或介导吞噬受感染细胞，甚至可能使机体获得持续的免疫反应。所以虽然慢性乙肝病毒的免疫治疗进展不尽如人意，但是基于中和抗体的免疫疗法可能是治愈慢性乙肝感染的新的方法。
表面抗体是针对乙型肝炎病毒表面抗原的中和性抗体，中和表面抗原并清除循环的乙肝病毒，健康者接种乙型肝炎疫苗后或患者在乙肝病毒感染的自然进程以及治疗过程中，若出现表面抗体则一般认为机体已获得保护或已经清除表面抗原。大量研究表明表面抗体能使健康人群获得长期保护。表面抗体的保护作用体现在主动免疫和被动免疫两方面。一方面，健康者特别是新生儿通过接种乙型肝炎疫苗的主动免疫方式，诱导产生表面抗体，能为机体提供体液免疫保护。另一方面，被动免疫通过注射乙肝免疫球蛋白清除乙型肝炎病毒。另外，注射乙肝免疫球蛋白是“乙肝疫苗无应答者”在乙肝病毒暴露后的首选保护方式。对于慢性乙肝感染患者，表面抗原血清学转换被认为是疾病痊愈的标志。综上所述，表面抗体能清除循环的表面抗原和抑制乙肝病毒复制，具有强大的保护作用。目前市场中的乙肝免疫球蛋白是从血清学检测表面抗体高水平者血浆中制备的多克隆的表面抗体，并不是一个理想的抗体来源，受限于供体，特异性低，不良反应，并且可能有致病原污染。单克隆抗体半衰期长，毒性低，亲和力高，特异性高等优点，因此可能成为乙肝免疫球蛋白的替代品。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种全人源化单克隆抗体及其制备方法和应用，尤其是涉及一种乙型肝炎病毒表面抗原特异性的全人源化单克隆抗体，结合单克隆抗体半衰期长、毒性低、亲和力高、特异性高等优点，实现优异的HBV中和能力。
为实现上述目的，本发明提供如下方案：
一方面，本发明提供一种全人源化单克隆抗体，其包括重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)；
所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:5所示；
所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:7所示。
优选地，所述全人源化单克隆抗体，其重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；其轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
优选地，所述全人源化单克隆抗体，其重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；其轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示
另一方面，本发明提供一种上述全人源化单克隆抗体的编码DNA，其包括重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)；
所述重链可变区的编码DNA序列如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:6所示；
所述轻链可变区的编码DNA序列如SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:8所示。
优选地，所述全人源化单克隆抗体的编码DNA，其重链可变区的编码DNA序列如SEQID NO:2所示；其轻链可变区的编码DNA序列如SEQ ID NO:4所示。
优选地，所述全人源化单克隆抗体的编码DNA，其重链可变区的编码DNA序列如SEQID NO:6所示；其轻链可变区的编码DNA序列如SEQ ID NO:8所示。
又一方面，本发明提供一种上述全人源化单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：
1)取近六个月内接种过乙肝疫苗的健康者外周肝素抗凝血，分离获得人淋巴细胞，进一步分离得到B淋巴细胞；
2)通过流式细胞技术从B淋巴细胞中获得能特异性识别乙型肝炎病毒表面抗原B细胞，并将其与饲养细胞EL40CD40L进行共培养，获得分泌表面抗体的B细胞；
3)将分泌表面抗体的B细胞进行亚克隆，获得抗体重链和轻链的可变区编码的基因序列；
4)获得的可变区编码序列进行重组、转染、纯化后获得全人源化单克隆抗体，即功能性乙型肝炎病毒表面抗原特异性单克隆抗体。
再又一方面，本发明提供一种药物组合物，其包括上述全人源化单克隆抗体和药学上可接受的载体。
进一步地，还包括抗病毒药物，所述抗病毒药物包括干扰素、抗HBV单克隆抗体、抗HBV多克隆抗体、核苷类似物、DNA聚合酶抑制剂、siRNA药物或治疗性疫苗等。
一方面，本发明提供一种表达载体，包含上述编码DNA，用于表达全人源化单克隆抗体。
一方面，本发明提供一种原核或真核宿主细胞，包含上述表达载体。
一方面，本发明提供一种上述全人源化单克隆抗体在制备治疗或预防人乙型肝炎病毒感染及相关肝脏疾病药物中的用途。
一方面，本发明提供一种用于检测乙型肝炎病毒表面抗原的试剂盒，其包括本发明所述的全人源化单克隆抗体。
有益效果：
本发明提供一种全人源化单克隆抗体及其制备方法和应用，其能特异性地与乙型肝炎病毒表面抗原结合，能有效抑制乙型肝炎病毒侵入肝细胞，具有中和病毒的功能，为通过基因工程方法诊断或治疗或预防乙型肝炎病毒感染或相关肝脏疾病建立基础。
附图说明
图1：近期接种过乙肝疫苗的健康者外周血特异性B细胞ELISPOT检测结果图；近期接种过乙肝疫苗的健康者外周血中存在大量能够分泌表面抗体的B细胞斑点图。总IgG检测孔加入2500个和5000个细胞，阴性对照孔加入100,000个细胞，HBsAb分泌细胞检测孔加入100,000个、200,000个和400,000个单个核细胞。
图2：全人源化单克隆抗体与乙型肝炎表面抗原结合结果图。
图3：纯化单克隆抗体能够特异性中和乙型肝炎病毒的结果图。
图中，antibody concentration抗体浓度；inhibition抑制率。
具体实施方式
本发明涉及具有功能性的乙肝病毒表面抗原特异性的全人源化单克隆抗体及其制备方法，下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。除非另有说明，本发明所用的技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术员通常所理解的含义相同。除非另有说明，下文描述的实施例的方法和材料均可以通过市场购买获得的常规产品。本发明所属领域技术员将会理解，下文描述的方法和材料，仅是示例性的，而不应视为限定本发明的范围。
实施例1：乙型肝炎病毒表面抗原特异性单克隆抗体的制备
1)取近期六个月内接种过乙肝疫苗的健康者外周血20mL，获得分泌表面抗体的B淋巴细胞。
取20mL新鲜抗凝血，并分离外周血中单个核细胞。利用Pharmingen IMag TM(BD)阴性筛选B淋巴细胞，具体操作如下：用1x BD IMagTM缓冲液重悬单个核细胞；加入生物素化抗体Hunan B Lymphocyte Enrichment Cocktail，室温孵育15分钟；用10倍体积的1xBDIMagTM缓冲液洗涤细胞，300×g，离心7分钟，吸出全部上清；涡旋振荡磁珠BDIMagTMStreptavidin Particles Plus-DM，加磁珠至细胞悬液中；彻底混匀，室温孵育30分钟；加入1XBD IMagTM缓冲液重悬细胞；将细胞悬液转移至12×75mm的无菌圆底管中，每管最大体积不超过1.5ml。将圆底管静置于细胞分离磁体中8分钟；小心吸出磁体中圆底管内的上清至一个新的圆底管内，将新的圆底管置于磁体中静置8分钟，吸出圆底管内的上清至无菌的离心管中，300×g，离心5分钟即可得到外周血单个核细胞(PBMC)中的B淋巴细胞。
2)筛选分泌表面抗体的单个B淋巴细胞
使用Lighting-Link R-Phycoerythrin(R-PE)Conjugation Kit(InnovaBiosciences公司)标记乙肝表面抗原。准备乙肝表面抗原：将HBsAg浓度调整至不超过1mg/ml；加1ul的LL-modifier试剂至10ul HBsAg中混匀；将混合物加入Lighting-Link mix中的干粉状物中，重悬粉状物；室温放置至少3小时或者过夜；向混合物中加入1ul的LL-quencher试剂，30分钟后R-PE标记的HBsAg即可使用。
利用流式细胞技术来分选表面抗原特异性B细胞，具体操作如下：500ul的1X BDIMagTM缓冲液重悬磁珠分选出的外周血B细胞，并加入下列荧光标记抗体及抗原：①PE-Cy7标记抗人CD19抗体5ul；②PE-Cy7标记抗人CD27抗体5ul；③APC标记抗人IgD抗体5ul；④APC标记抗人IgM抗体20ul；⑤FITC标记抗人IgG抗体20ul；⑥R-PE标记HBsAg 2ul。振荡混匀；随后4℃避光孵育20分钟；用1mL的1X BD IMagTM缓冲液洗涤，洗去多余未结合的抗体；500ul的1X BD IMagTM缓冲液重悬细胞，用流式细胞仪分选收集CD19+CD27+HBsAg+IgD-IgM-细胞。
培养筛选得到的特异性B细胞。将分选出的HBsAg特异性B细胞用RPMI培养基重悬，加入上述96孔板中，使每孔至多1个HBsAg特异性B细胞；同时加入50戈瑞(Gy)X射线照射30分钟后的104个EL4 CD40L细胞与B细胞共培养。将96孔板放入37℃、5％CO2细胞培养箱中培养7天，经EL4 CD40L细胞的刺激，获得特异性功能B细胞，即能分泌表面抗体的B细胞。
3)ELISA结合检测方法
使用乙型肝炎病毒表面抗体检测试剂盒(酶联免疫法)(北京万泰生物药业股份有限公司)进行HBsAb检测。根据厂家说明书，分别在相应孔中加入B细胞培养上清及阴、阳性对照各50ul；加酶：每孔加入酶标试剂50ul，空白孔除外，轻轻振荡混匀；用封板膜封板后，置37℃孵育箱中温育30分钟；小心揭掉封板膜，用洗板机洗涤5遍，最后一次尽量扣干；显色：每孔加入50ul显色剂A和50ul显色剂B，轻轻振荡混匀，37℃避光显色15分钟；每孔加终止液50ul，轻轻振荡混匀，10分钟内测定结果。设定酶标仪双波长为450nm/610nm，用空白孔调零点后测定各孔OD值。培养上清孔OD值高于空白孔5倍时，则视为阳性孔，并进行后续的特异性B细胞的亚克隆。
4)特异性B细胞亚克隆
提取分泌表面抗原特异性抗体的B细胞的RNA。使用RNA提取试剂盒Neasy miniKit(Qiagen)。使用Primer Premier5软件设计PCR引物，对特异性B细胞的RNA分别扩增人抗体重链可变区VH和κ链可变区VK或者λ链可变区VL基因序列，将其逆转录为cDNA并扩增人免疫球蛋白重链和轻链V-区域片段。其中在抗体重链可变区基因5’端及3’端分别引入EcoRI和NheI酶切位点，正向和反向引物分别为：5’-GTGCGGAATTCGTACATTCCCAGGTGCAGCTGGTACAGTC-3’和5’-TGCGAAGCTAGCGCTGAGGAGACGGTGACCAGG-3’，在抗体轻链可变区基因5’端及3’端分别引入AgeI和BsiWl酶切位点，正向和反向引物分别为：5’-CTCAGACCGGTGTCCACTGTGaCATCCAGaTGACCCAGTCTC-3’和5’-GCCACCGTACGTTTGATcTCCACCTTGGTCCC-3’。采用SuperScriptⅢOne-Step RT-PCR Systemwith Platinum Taq DNAPolymerase(Invitrogen公司)进行RT-PCR反应，条件为：50℃30min,94℃2min,随后进行94℃30s,57℃30s,68℃1min 35次循环，68℃延伸5min,4℃5min。PCR扩增后，将PCR产物经琼脂糖凝胶电泳回收纯化。
实施例2：单克隆抗体的可变区测序及抗体重组生产
重链可变区基因片段加入限制性内切酶EcoRI和NheI进行酶切，轻链可变区基因片段加入限制性内切酶AgeI和BsiWl进行酶切，酶切后经DNA纯化试剂盒进行纯化，并与相同限制性内切酶消化的重链表达载体pFUSEss-CHIg-hG1和轻链表达载体pFUSE2ss-CLIg-hk(invivogen公司)。重链和轻链连接产物转化到感受态细胞DH5α大肠杆菌，分别涂布在含有Zeo+平板和Blas+LB平板中。获得的阳性克隆送至南京擎科公司进行测序。最终获得NJDT001和NJDT002的独特V-区域核苷酸/蛋白序列。
序列信息：
NJDT001重链可变区氨基酸序列：如SEQ ID NO.1所示；
MYRMQLLSCIALSLALVTNSYIEVQLVESGGGVVQPGMSLTLSCAASGFTFSSFGLHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSLQFYAESVKGRFTISRDNSRNTVFLQMTSLRAEDTAIYFCAKGTIAATSVLASWGQGTLVTVSS
NJDT001重链可变区DNA序列：如SEQ ID NO.2所示；
ATGTACAGGATGCAACTCCTGTCTTGCATTGCACTAAGTCTTGCACTTGTCACGAATTCGTACATTGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGGGGCGTGGTCCAGCCTGGGATGTCCCTCACACTCTCCTGTGCAGCGTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTTTGGCCTTCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTTGAGTGGGTGGCAGTTATTTGGTATGATGGAAGTCTTCAATTCTACGCAGAATCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAGAAACACGGTGTTTCTGCAAATGACCAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCAATATATTTCTGTGCCAAGGGGACCATAGCAGCAACTTCTGTCCTTGCCTCCTGGGGCCAGGGGACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
NJDT001轻链可变区氨基酸序列：如SEQ ID NO.3所示
MYRMQLLSCIALSLALVTNSPVSTDIVMTQTPATLSVSPGGRATLSCRASQNIGTHLAWYQQKPGQAPRLLIYLASTRATGIPARFSGSGSGTEFSLTISSLQSEDFAVYYCQHYNAWPVTFGGGTKLEIK
NJDT001轻链可变区DNA序列：如SEQ ID NO.4所示
ATGTACAGGATGCAACTCCTGTCTTGCATTGCACTAAGTCTTGCACTTGTCACGAATTCACCGGTGTCCACTGATATTGTGATGACCCAGACTCCAGCCACCCTGTCTGTGTCTCCAGGGGGAAGGGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAACATTGGTACCCACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCCGGCTCCTCATCTATCTTGCATCCACCAGGGCCACTGGTATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGAGTTTTCTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGTCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCACTACAATGCCTGGCCGGTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGGAGATCAAA
NJDT002重链可变区氨基酸序列：如SEQ ID NO.5所示
MYRMQLLSCIALSLALVTNSYIQVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAMHWVRQSPGQGLEWVASISYDGTYSYYVDSMKGRFTISRDNSRNTLYLHIRGLGAEDTAVYYCARENFPSYLDYW
NJDT002重链可变区DNA序列：如SEQ ID NO.6所示
ATGTACAGGATGCAACTCCTGTCTTGCATTGCACTAAGTCTTGCACTTGTCACGAATTCGTACATTCAGGTGCAGCTGGTACAGTCTGGGGGAGGCGTTGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGTTTCACCTTCAGTAGTTATGCCATGCACTGGGTCCGCCAGTCTCCAGGCCAGGGGCTGGAGTGGGTGGCATCTATCTCCTATGATGGGACTTATAGTTACTACGTCGACTCTATGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAGGAATACACTGTATTTGCATATTAGAGGCCTGGGAGCTGAGGACACGGCTGTCTATTACTGTGCGAGAGAAAACTTCCCCTCTTACCTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
NJDT002轻链可变区氨基酸序列：如SEQ ID NO.7所示
MYRMQLLSCIALSLALVTNSPVSTEIVLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQTMGTSLNWYQQKRGEAPKLLIYGASTLQRGVPSRFSGSGSGTDFTLTIAGLEPTDYATYYCQQFFQMPRSFGQGTKVDIK
NJDT002轻链可变区DNA序列：如SEQ ID NO.8所示
ATGTACAGGATGCAACTCCTGTCTTGCATTGCACTAAGTCTTGCACTTGTCACGAATTCACCGGTGTCCACTGAAATTGTGCTGACTCAGTCTCCTTCGTCCCTGTCTGCCTCTGTCGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGACCATGGGTACTTCTCTAAATTGGTATCAACAAAAGCGAGGGGAGGCCCCTAAGTTGCTGATCTATGGTGCATCCACTTTGCAACGTGGGGTCCCATCGAGGTTCAGTGGCAGCGGCTCGGGGACAGATTTCACCCTCACCATCGCCGGTCTGGAGCCTACAGACTATGCGACTTACTACTGTCAACAGTTCTTCCAAATGCCTCGGTCGTTCGGCCAAGGGACCAAAGTGGATATCAAA
经过测序验证后，将表达单克隆抗体重链和轻链的质粒共转染293F细胞，并在37℃摇瓶中培养4天，采用ProteinA亲和层析柱从细胞培养上清中分离纯化目的抗体。
实施例3:单克隆抗体对表面抗原重组蛋白的结合
用PBS等比稀释纯化后的单克隆抗体，在样品孔中按浓度由高至低分别加入50ul等比稀释的相应浓度的抗体溶液，并设置3个复孔，加入阴、阳性对照各50ul；每孔加入酶标试剂50ul，空白孔除外，轻轻振荡混匀；用封板膜封板后，置37℃孵育箱中温育30分钟；小心揭掉封板膜，用洗板机洗涤5遍，最后一次尽量扣干；每孔先加入50u显色剂A，后加50ul显色剂B，轻轻振荡混匀，37℃避光显色15分钟；每孔加终止液50ul，轻轻振荡混匀，10分钟内测定结果。设定酶标仪双波长为450nm/610nm，用空白孔调零点后测定各孔OD值。结果如图2所示，纯化后的单克隆抗体能够特异性结合乙型肝炎表面抗原重组蛋白。随着抗体浓度的增加，OD450读数也呈显著增加的趋势。
实施例4:单克隆抗体抑制乙肝病毒在肝细胞内的复制
制备乙肝病毒:由于HepG2.2.15细胞能产生并分泌乙肝病毒，将HepG2.2.15细胞加入75cm2细胞培养瓶中，加入D10培养基，37℃，5％CO2细胞培养箱中培养；当细胞汇合度大于95％时，开始收集细胞培养上清，1500rpm，离心5分钟,收集上清，0.45um滤器过滤上清；将过滤后的细胞培养上清加入Millpore Ultra 100K超滤离心管中，4000×g，4℃，离心60分钟，吸出超滤浓缩后的液体，测定乙肝病毒DNA量，-80℃保存。
抗体中和试验：将乙肝病毒与单克隆抗体混匀，设置PBS作为阴性对照组，混合液置于37℃，孵育30分钟。HepG2-hNTCP细胞是稳定表达转染的钠离子/牛磺胆酸协同转运多肽(Na+/taurocholate cotransporting polypeptide，NTCP)的HepG2肝癌细胞株。将HepG2-hNTCP细胞接种于24孔板中，加入孵育后的混合物及100ul 20％PEG8000，用EMEM培养基补足至500ul，37℃，5％CO2细胞培养箱中过夜培养；次日用EMEM培养基洗涤细胞，重新加入500ul含2％DMSO和10％FBS的新EMEM培养基，37℃，5％CO2细胞培养箱中继续培养；培养至第4、7、10、13天时收集培养上清，1500rpm离心5分钟后，上清液检测HBeAg；所有实验均重复三次，单克隆抗体的HBV感染抑制率按如下方法计算：
HBV感染抑制率(％)＝(阴性对照组三次HBeAg检测结果平均值-单克隆抗体组三次HBeAg检测结果平均值)/阴性对照组三次HBeAg检测结果平均值×100。
结果如图3所示，纯化单克隆抗体能够有效地特异性中和乙肝病毒，并抑制乙肝病毒感染肝细胞。图3A中显示，单克隆抗体NJDT001和NJDT002与乙肝病毒孵育，乙肝病毒感染的HepG2-NTCP细胞在3、6、9、12天后细胞上清HBeAg定量，能有效抑制其进一步感染；图3B中显示，单克隆抗体NJDT001和NJDT002对HBV感染的抑制率达到60％以上，甚至接近80％。
以上所述仅为本发明的优选实施例，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的相关技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，其中所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 南京鼓楼医院
<120> 全人源化单克隆抗体及其制备方法和应用
<130> 2018
<141> 2018-08-03
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 142
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus)
<400> 1
Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu
1 5 10 15
Val Thr Asn Ser Tyr Ile Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
20 25 30
Val Val Gln Pro Gly Met Ser Leu Thr Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
35 40 45
Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
50 55 60
Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Leu Gln
65 70 75 80
Phe Tyr Ala Glu Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
85 90 95
Ser Arg Asn Thr Val Phe Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ala Glu Asp
100 105 110
Thr Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Lys Gly Thr Ile Ala Ala Thr Ser Val
115 120 125
Leu Ala Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
130 135 140
<210> 2
<211> 426
<212> DNA
<213> 乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus)
<400> 2
atgtacagga tgcaactcct gtcttgcatt gcactaagtc ttgcacttgt cacgaattcg 60
tacattgagg tgcagctggt ggagtctggg gggggcgtgg tccagcctgg gatgtccctc 120
acactctcct gtgcagcgtc tggattcacc ttcagtagct ttggccttca ctgggtccgc 180
caggctccag gcaaggggct tgagtgggtg gcagttattt ggtatgatgg aagtcttcaa 240
ttctacgcag aatccgtgaa gggccgattc accatctcca gagacaattc cagaaacacg 300
gtgtttctgc aaatgaccag cctgagagcc gaggacacgg caatatattt ctgtgccaag 360
gggaccatag cagcaacttc tgtccttgcc tcctggggcc aggggaccct ggtcaccgtc 420
tcctca 426
<210> 3
<211> 131
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus)
<400> 3
Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu
1 5 10 15
Val Thr Asn Ser Pro Val Ser Thr Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro
20 25 30
Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly Gly Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg
35 40 45
Ala Ser Gln Asn Ile Gly Thr His Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
50 55 60
Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Thr Arg Ala Thr
65 70 75 80
Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Ser
85 90 95
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys
100 105 110
Gln His Tyr Asn Ala Trp Pro Val Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
115 120 125
Glu Ile Lys
130
<210> 4
<211> 393
<212> DNA
<213> 乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus)
<400> 4
atgtacagga tgcaactcct gtcttgcatt gcactaagtc ttgcacttgt cacgaattca 60
ccggtgtcca ctgatattgt gatgacccag actccagcca ccctgtctgt gtctccaggg 120
ggaagggcca ccctctcctg cagggccagt cagaacattg gtacccactt agcctggtac 180
cagcagaaac ctggccaggc tccccggctc ctcatctatc ttgcatccac cagggccact 240
ggtatcccag ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag agttttctct caccatcagc 300
agcctgcagt ctgaagattt tgcagtttat tactgtcagc actacaatgc ctggccggtc 360
actttcggcg gagggaccaa gctggagatc aaa 393
<210> 5
<211> 130
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus)
<400> 5
Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu
1 5 10 15
Val Thr Asn Ser Tyr Ile Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly
20 25 30
Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
35 40 45
Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly
50 55 60
Gln Gly Leu Glu Trp Val Ala Ser Ile Ser Tyr Asp Gly Thr Tyr Ser
65 70 75 80
Tyr Tyr Val Asp Ser Met Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
85 90 95
Ser Arg Asn Thr Leu Tyr Leu His Ile Arg Gly Leu Gly Ala Glu Asp
100 105 110
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Asn Phe Pro Ser Tyr Leu Asp
115 120 125
Tyr Trp
130
<210> 6
<211> 420
<212> DNA
<213> 乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus)
<400> 6
atgtacagga tgcaactcct gtcttgcatt gcactaagtc ttgcacttgt cacgaattcg 60
tacattcagg tgcagctggt acagtctggg ggaggcgttg tccagcctgg gaggtccctg 120
agactctcct gtgcagcctc tggtttcacc ttcagtagtt atgccatgca ctgggtccgc 180
cagtctccag gccaggggct ggagtgggtg gcatctatct cctatgatgg gacttatagt 240
tactacgtcg actctatgaa gggccgattc accatctcca gagacaattc caggaataca 300
ctgtatttgc atattagagg cctgggagct gaggacacgg ctgtctatta ctgtgcgaga 360
gaaaacttcc cctcttacct tgactactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca 420
<210> 7
<211> 131
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus)
<400> 7
Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu
1 5 10 15
Val Thr Asn Ser Pro Val Ser Thr Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro
20 25 30
Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg
35 40 45
Ala Ser Gln Thr Met Gly Thr Ser Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Arg
50 55 60
Gly Glu Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Leu Gln Arg
65 70 75 80
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
85 90 95
Leu Thr Ile Ala Gly Leu Glu Pro Thr Asp Tyr Ala Thr Tyr Tyr Cys
100 105 110
Gln Gln Phe Phe Gln Met Pro Arg Ser Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val
115 120 125
Asp Ile Lys
130
<210> 8
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<212> DNA
<213> 乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus)
<400> 8
atgtacagga tgcaactcct gtcttgcatt gcactaagtc ttgcacttgt cacgaattca 60
ccggtgtcca ctgaaattgt gctgactcag tctccttcgt ccctgtctgc ctctgtcgga 120
gacagagtca ccatcacttg ccgggcaagt cagaccatgg gtacttctct aaattggtat 180
caacaaaagc gaggggaggc ccctaagttg ctgatctatg gtgcatccac tttgcaacgt 240
ggggtcccat cgaggttcag tggcagcggc tcggggacag atttcaccct caccatcgcc 300
ggtctggagc ctacagacta tgcgacttac tactgtcaac agttcttcca aatgcctcgg 360
tcgttcggcc aagggaccaa agtggatatc aaa 393

Claims (9)

1.一种全人源化单克隆抗体，其特征在于，包括重链可变区和轻链可变区；
所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:5所示；
所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:7所示。
2.一种如权利要求1所述的全人源化单克隆抗体的编码DNA，其特征在于，包括重链可变区和轻链可变区；
所述重链可变区的编码DNA序列如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:6所示；
所述轻链可变区的编码DNA序列如SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:8所示。
3.一种如权利要求1所述的全人源化单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)取近六个月内接种过乙肝疫苗的健康者外周肝素抗凝血，分离获得人淋巴细胞，进一步分离得到B淋巴细胞；
2)通过流式细胞技术从B淋巴细胞中获得能特异性识别乙型肝炎病毒表面抗原B细
胞，并将其与饲养细胞EL40CD40L进行共培养，获得分泌表面抗体的B细胞；
3)将分泌表面抗体的B细胞进行亚克隆，获得抗体重链和轻链的可变区编码序列；
4)获得的可变区编码序列进行重组、转染、纯化后获得全人源化单克隆抗体，即功能性乙型肝炎病毒表面抗原特异性单克隆抗体。
4.药物组合物，其特征在于，包括如权利要求1所述的全人源化单克隆抗体和药学上可接受的载体。
5.如权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，还包括抗病毒药物。
6.一种表达载体，其特征在于，包含如权利要求2所述的编码DNA，用于表达如权利要求1所述的全人源化单克隆抗体。
7.一种原核或真核宿主细胞，其特征在于，包含如权利要求6所述的表达载体。
8.一种如权利要求1所述的全人源化单克隆抗体在制备治疗或预防人乙型肝炎病毒感染及相关肝脏疾病药物中的用途。
9.一种用于检测乙型肝炎病毒表面抗原的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的全人源化单克隆抗体。
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