CN109535231B - 人T细胞病毒抗原蛋白Tax的CTL特异性识别表位及其应用 - Google Patents

人T细胞病毒抗原蛋白Tax的CTL特异性识别表位及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了人T细胞病毒抗原蛋白Tax的CTL(细胞毒性T淋巴细胞)特异性识别表位及其应用，表位肽以抗原蛋白Tax为靶标设计，为抗原蛋白Tax的HLA‑A*0201限制性CTL识别表位肽，该表位肽具有特异性诱导CTL细胞增殖和杀伤能力的特点，可用于制备抗原蛋白Tax特异性DC细胞以及CTL细胞，该表位肽、抗原蛋白Tax特异性DC细胞以及CTL细胞可用于制备治疗具有抗原蛋白Tax表达的相关疾病的生物制剂。

Description

人T细胞病毒抗原蛋白Tax的CTL特异性识别表位及其应用
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及人T细胞病毒抗原蛋白Tax的CTL特异性识别表位及其应用。
背景技术
人T淋巴细胞病毒1型(HTLV-1)是一种持续性逆转录病毒，感染全球10至2000万人。大多数感染者仍然是病毒的终身无症状携带者。然而，2％至3％的感染者发展为中枢神经系统的进行性炎症，称为HTLV-1相关的脊髓病/热带痉挛性下肢轻瘫(HAM/TSP)。HTLV-1导致约4％的血清阳性个体患有白血病或淋巴瘤。
HTLV-1Tax蛋白对于病毒的复制，开始导致人T细胞白血病发展为恶性转化是至关重要的。目前已证明Tax是致癌的，因为它能转化人T淋巴细胞并使其永生化。通过CREB，NF-κB和SRF途径激活Tax基因启动子，包括细胞因子(IL-13，IL-15)、细胞因子受体(IL-2R的α链)和共刺激表面受体(OX40/OX40L)等，导致蛋白质表达上调和激活的信号级联(例如Jak/STAT，PI3激酶，JNK)。癌细胞可能有超过10万个突变(Perucho，1996)，一些对于启动转化至关重要，另一些对于恶性进展至关重要。由Tax启动的基因改变可能是HTLV-1感染细胞恶性转化的触发器。
过继性免疫治疗是指向肿瘤患者转输具有抗肿瘤活性的免疫细胞直接杀伤肿瘤或激发机体免疫杀伤肿瘤细胞，以达到治疗肿瘤的目的，包括DC(树突状细胞)、CIK(细胞因子诱导的杀伤细胞)、CTL(cytotoxic lymphocyte，细胞毒性T淋巴细胞)和TIL(肿瘤浸润淋巴细胞)等，其中，CTL表现出较好的靶向性和特异性，拥有更强的清除病毒效果。随着对HTLV-1病毒和免疫系统的不断了解，免疫细胞治疗具有巨大的临床潜力。HTLV-1感染会引起强烈的CTL反应(Bangham,2005)。体内HTLV-1的有效控制取决于CTL裂解效率和抗原识别的CTL亲合力。CTL质量决定持续性HTLV-1感染中病毒-宿主平衡位置(Tarek，2009)。
免疫细胞通常识别抗原肽分子上的一个特定部分即表位(Epitope)，又称为抗原决定簇。它是位于抗原物质分子表面或者其他部位具有一定组成和结构的特殊化学基团，是免疫原引起免疫应答以及与抗体产生特异反应的基本结构单位。抗原表位的研究对疾病的诊断及预后判定、设计疫苗分子结构及免疫干预治疗等具有重要意义。
发明内容
针对上述存在的问题，以及HTLV-1感染会引起强烈的CTL反应的背景，本发明人进行了锐意研究，以HTLV-1Tax蛋白为靶标，提供了特异性HTLV-1Tax蛋白的CTL识别表位肽，以及利用该表位肽制备具有Tax蛋白表达的疾病的治疗性多肽疫苗的应用，且该表位肽具有特异性诱导CTL细胞增殖和杀伤能力的特点，从而完成本发明。
本发明的目的在于提供以下方面：
(1)人T细胞病毒的CTL特异性识别表位肽，其中，所述表位肽以抗原蛋白Tax为靶标设计，为抗原蛋白Tax的HLA-A*0201限制性CTL识别表位肽；
在一种优选的实施方式中，所述表位肽的氨基酸序列如SEQ ID NO 1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO 3、SEQ ID NO 4、SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 6、SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 8、SEQID NO 9、或SEQ ID NO 10所示；
在进一步优选的实施方式中，所述表位肽的氨基酸序列如SEQ ID NO 1、SEQ IDNO 3、SEQ ID NO 4、或SEQ ID NO 7所示。
在更进一步优选的实施方式中，所述表位肽的氨基酸序列如SEQ ID NO 4所示。
(2)一种抗原蛋白Tax特异性DC细胞的制备方法，其中，所述制备方法包括在DC细胞中加入上述(1)所述表位肽进行培养的步骤。
(3)一种抗原蛋白Tax特异性CTL细胞的制备方法，其中，所述制备方法包括利用上述(2)所述的制备方法获得的特异性DC细胞与CTL细胞共培养的步骤。
(4)上述(1)所述的表位肽在制备具有抗原蛋白Tax表达的相关疾病如HTLV-1相关的脊髓病/热带痉挛性下肢轻瘫、HTLV-1相关白血病或淋巴瘤的多肽疫苗中的应用。
(5)上述(2)所述的制备方法制备得到的特异性DC细胞在制备治疗具有抗原蛋白Tax表达的相关疾病药物中的应用。
(6)上述(3)所述的制备方法制备得到的特异性CTL细胞在制备治疗具有抗原蛋白Tax表达的相关疾病药物中的应用。
根据本发明提供的人T细胞病毒抗原蛋白Tax的CTL特异性识别表位及其应用，具有以下有益效果：
(1)本发明以HTLV-1 Tax蛋白作为强特异性抗原，设计得到抗原的CTL特异性识别表位肽，为研制治疗具有抗原蛋白Tax表达的相关疾病的生物制剂提供了有利条件；
(2)本发明制备得到的表位肽诱导得到的特异性CTL细胞对Tax蛋白表达的疾病如HTLV-1相关的脊髓病/热带痉挛性下肢轻瘫(HAM/TSP)、白血病或淋巴瘤具有极好的杀伤力，意味着研制的生物制剂在疗效上的利好性。
附图说明
图1示出十种表位肽诱导的特异性CTL细胞分泌的IFN-γ图；
图2示出P1、P3、P4、P7表位肽诱导得到的特异性CTL细胞对人淋巴瘤细胞MT-2杀伤能力图。
具体实施方式
下面通过对本发明进行详细说明，本发明的特点和优点将随着这些说明而变得更为清楚、明确。在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其他实施例。
本发明的目的在于基于抗原蛋白Tax对HTLV-1相关疾病恶性转化的触发作用，发现并制备能够高效刺激病毒特异性CTL的抗原表位肽，以解决人T淋巴细胞病毒1型(HTLV-1)导致的相关严重疾病的问题。
一方面，本发明人进行了锐意研究，以抗原蛋白Tax为靶标，设计抗原蛋白Tax的HLA-A*0201限制性CTL识别表位肽。其中，抗原蛋白Tax的氨基酸序列如SEQ ID NO 11所示。
目前，用于有效诱导CTL细胞的抗原十分有限，发现以及制备能够高效刺激病毒特异性CTL的抗原表位将会提高相关医疗的可实现性。本发明以在线表位预测数据库SYFPEITHI为主，NetCTL、HLA-Bind为辅助，对HTLV-1 HLA-A*0201限制性CTL识别表位肽进行综合预测。选取特定的多肽序列并进行后期试验筛选。其中，所述评分较前的多肽序列为10个，依次命名为P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7、P8、P9和P10，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO 1、SEQ ID NO 2、SEQ ID NO 3、SEQ ID NO 4、SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 6、SEQ ID NO 7、SEQID NO 8、SEQ ID NO 9、和SEQ ID NO 10所示。
在一种优选的实施方式中，通过将上述表位肽分别负载至DC细胞中，对CTL细胞(即激活的T细胞)进行诱导，以评价诱导出的特异性CTL细胞的活性。其中，表位肽P1、P3、P4、P7负载的DC细胞能够诱导出活性更高(以分泌的IFN-γ量评价)的特异性CTL细胞，因而，所述表位肽优选为P1、P3、P4、P7。
在一种优选的实施方式中，通过研究发现，表位肽P4负载的DC细胞诱导出的特异性CTL细胞对人淋巴瘤细胞MT-2表现出更高的杀伤率，因而，所述表位肽更优选为P4。
在一种优选的实施方式中，所述HTLV-1 HLA-A*0201限制性CTL识别表位的肽段采用标准固相肽合成Fmo方案进行合成。具体地，基本流程是：氯甲基聚乙烯树脂作为不溶性的固相载体，首先将一个氨基被封闭基团保护的氨基酸共价连接在固相载体上。在三氟乙酸的作用下，脱掉氨基的保护基，这样第一个氨基酸就连接到了固相载体上了。然后氨基被封闭的第二个氨基酸的羧基通过N,N’-二环己基碳二亚胺(DCC)活化，羧基被DCC活化的第二个氨基酸再与已接在固相载体的第一个氨基酸的氨基反应形成肽键，这样在固体载体上就生成了一个带有保护基的二肽。重复上述肽键形成反应，使肽键从C端向N端生长，直到达到所需要的肽链长度。最后脱去保护基，用HF水解肽链和固相载体之间的酯键，就得到了合成好的肽。将目的表位肽粗品经高效液相色谱法HPLC纯化后，获得纯度高于98％的产物，通过离子交换的方式将多肽中的平衡离子三氟乙酸根置换为其他离子形式，可用于后续的细胞培养。
再一方面，本发明提供了上述表位肽在用于制备具有抗原蛋白Tax表达的相关疾病的多肽疫苗中的应用。
多肽疫苗是按照病原体抗原基因中已知或预测的某段抗原表位的氨基酸序列，通过化学合成技术制备的疫苗。本发明中的表位肽P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7、P8、P9、P10为相应疫苗的有效成分。
优选地，具有抗原蛋白Tax表达的相关疾病包括但不限于HTLV-1相关的脊髓病/热带痉挛性下肢轻瘫、HTLV-1相关白血病或淋巴瘤。
再一方面，本发明提供了一种抗原蛋白Tax特异性DC细胞的制备方法，所述方法通过获取人外周血，经梯度分离获得外周血单个核细胞(PBMCs)，通过细胞因子I培养得到DC细胞，经向DC细胞中加入上述表位肽进行培养，获得抗原蛋白Tax特异性DC细胞。
其中，所述细胞因子I包括GM-CSF(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)和IL-4(白细胞介素4)。
再一方面，本发明提供了一种抗原蛋白Tax特异性CTL细胞的制备方法，所述方法通过获取人外周血，经梯度分离获得外周血单个核细胞(PBMCs)，分别利用细胞因子I和细胞因子II培养得到DC细胞和CTL细胞(即激活的T细胞)，经向DC细胞中加入上述表位肽进行培养，获得抗原蛋白Tax特异性DC细胞，特异性DC细胞与CTL细胞共培养，并加入细胞因子III，刺激特异的CTL细胞扩增，得到特异性CTL细胞。
优选地，所述细胞因子I包括GM-CSF(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)和IL-4(白细胞介素4)。
所述细胞因子II包括anti-CD3 IgG(抗CD3免疫球蛋白G)和anti-CD28 IgG(抗CD28免疫球蛋白G)。
所述细胞因子III包括IL-2(白细胞介素2)和IL-15(白细胞介素15)。
本发明还提出了上述制备方法制备得到的特异性DC细胞在制备治疗具有抗原蛋白Tax表达的相关疾病药物中的应用。
以及，制备得到的特异性CTL细胞在制备治疗具有抗原蛋白Tax表达的相关疾病药物中的应用。
优选地，具有抗原蛋白Tax表达的相关疾病包括但不限于HTLV-1相关的脊髓病/热带痉挛性下肢轻瘫、HTLV-1相关白血病或淋巴瘤。
实施例
实施例1合成表位肽
本发明以在线表位预测数据库SYFPEITHI为主，NetCTL、HLA-Bind为辅助，对HTLV-1 HLA-A*0201限制性CTL识别表位肽进行综合预测。选取评分较前的多肽序列进行试验筛选，依次命名为P1、P2、P3……P10。
肽段制备采用标准固相肽合成Fmo方案进行合成。以表位肽P4(Ala Leu Gln PheLeu Ile Pro Arg Leu)为例，合成流程为是：氯甲基聚乙烯树脂作为不溶性的固相载体，首先将一个氨基被封闭基团保护的氨基酸Leu共价连接在固相载体上。在三氟乙酸的作用下，脱掉氨基的保护基，这样第一个氨基酸就连接到了固相载体上了。然后氨基被封闭的第二个氨基酸Arg的羧基通过DCC活化，羧基被DCC活化的第二个氨基酸再与已接在固相载体的第一个氨基酸的氨基反应形成肽键，这样在固体载体上就生成了一个带有保护基的二肽。重复上述肽键形成反应，使肽键从C端向N端生长，直到达到所需要的肽链长度。最后脱去保护基，用HF水解肽链和固相载体之间的酯键，就得到了合成好的肽。将目的表位肽粗品经高效液相色谱法HPLC纯化后，获得纯度高于98％的九肽产物，通过离子交换的方式将多肽中的平衡离子三氟乙酸根置换为其他离子形式。
实施例2抗原特异的CTL细胞的制备
(1)在50ml离心管中加入适量淋巴细胞分离液。
(2)取肝素钠抗凝静脉血与等量0.01M PBS充分混匀，用滴管沿管壁缓慢加于分层液面上，保持清楚的界面，水平离心1800rpm，20min。
(3)离心后管内分为三层，上层为血浆，下层主要为红细胞和粒细胞，中层为淋巴细胞分离液，在上、中层界面处有一以单个核细胞(PBMCs)为主的灰白色云雾层，用滴管吸取单核细胞层置入另一个50ml离心管中，加满0.01M PBS，以1500rpm，12min离心，洗涤细胞2次。
(4)弃上清，加入适量含有10％胎牛血清的RPMI-1640，重悬细胞，置于50ml培养瓶中，37℃，5％CO2孵育贴壁1小时，取一滴细胞悬液与一滴0.2％台盼兰混合，于血球计数板上，计数。
(5)计数后用PBS(或者RPMI-1640)调整细胞至所需浓度供实验使用，其余冻存备用。
将细胞以5×106/ml接种到6孔板内，2h后，回收未贴壁的细胞，用预包被anti-CD3IgG和anti-CD28 IgG的培养板进行激活培养，获得激活的T细胞(即CTL细胞)。
(6)步骤(4)中贴壁的细胞加入GM-CSF和IL-4刺激培养5天诱导成DC细胞，第三天半换液。
(7)第5天，收集DC细胞，将10μg Tax抗原肽加入DC细胞，1h后，将DC细胞与激活的T细胞共培养，同时加入IL-2及IL-15。
(8)继续培养5天后，得到抗原特异的CTL细胞进行细胞因子分泌及对肿瘤细胞的杀伤实验。
采用Elisa(enzyme linked immunosorbent assay酶联免疫吸附测定)、LDH(乳酸脱氢酶)等体外实验检测CTL细胞活性和特异性杀伤能力。
实施例3特异性CTL细胞分泌IFN-γ检测
采用IFN-γ细胞因子检测试剂盒(IFN gamma Human ELISA Kit，Invitrogen，目录号：KHC4022)进行IFN-γ检测。
样品的获得：实施例2中抗原特异的CTL细胞培养上清液—1000g离心10分钟，取上清液。
(1)从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。
(2)设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μl。
(3)样本孔中加入待测样本50μl；空白孔不加。
(4)除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体100μl，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。
(5)弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液(350μl)，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次(也可用洗板机洗板)。
(6)每孔加入底物A、B各50μl，37℃避光孵育15min。
(7)每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。
采用ELISA检测上清中IFN-γ的表达，结果如图1所示，P1、P3、P4、P7负载的DC细胞均能够较好诱导出特异性CTL细胞，分泌较高量的IFN-γ。
实施例4 LDH实验检测细胞杀伤能力
采用LDH检测试剂盒(Promega，目录号：G1780，CytoTox
Figure BDA0001874036600000101
Non-RadioactiveCytotoxicity Assay)对P1、P3、P4、P7各自诱导得到的特异性CTL细胞进行杀伤能力检测。
(1)设立检测培养板，以人淋巴瘤细胞MT-2为靶细胞，按效应细胞(特异性CTL细胞)和靶细胞(数量)比为5：1、10：1、20：1加入特异性CTL细胞，其中，5×104/孔、1×105/孔、2×105/孔；靶细胞数1×104/孔。同时设立效应细胞和靶细胞的自发释放组、靶细胞最大释放组、培养基对照组。
效应细胞和靶细胞的自发释放组设立的原因在于：本实验最终检测的是OD值，效应细胞和靶细胞在490nm检测下，肯定有一定背景值，这需要减去。靶细胞最大释放组设立的原因在于：靶细胞最大释放值是指在靶细胞完全裂解时所检OD值，作为阳性对照，由于此时靶细胞都完全裂解了，因此OD值是最大的。
(2)置于37℃，5％CO2共培养5h。
(3)靶细胞最大释放组加入裂解液，45min后，所有孔均收集上清。
(4)将各孔上清转移50μl至另一个96孔板，加入50μl稀释的底物混合物，避光孵育30min。
(5)每孔加入50μl终止液，在490nm下检测吸光值。
(6)杀伤率(％)＝(实验孔-靶细胞自发释放-效应细胞自发释放+培养基对照)/(靶细胞最大释放-体积校正-靶细胞自发释放+培养基对照)×100％。
其中，体积校正为裂解液与培养基混合物(没有细胞)所测得OD值，因为靶细胞最大释放值中含有裂解液，需要把这个背景值减去。
结果如图2所示，本发明所得P1、P3、P4、P7各自诱导得到的特异性CTL细胞对人淋巴瘤细胞MT-2杀伤能力对比图，其中con代表培养基对照组，由图2可知P4诱导的CTL细胞对人淋巴瘤细胞MT-2杀伤效果更好。
以上结合具体实施方式和范例性实例对本发明进行了详细说明，不过这些说明并不能理解为对本发明的限制。本领域技术人员理解，在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明技术方案及其实施方式进行多种等价替换、修饰或改进，这些均落入本发明的范围内。本发明的保护范围以所附权利要求为准。
序列表
<110> 温州医科大学附属第一医院
<120> 人T细胞病毒抗原蛋白Tax的CTL特异性识别表位及其应用
<130> 2010
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> 表位肽P1(Homo sapiens)
<400> 1
Ala Leu Gln Phe Leu Ile Pro Arg Leu
1 5
<210> 2
<211> 9
<212> PRT
<213> 表位肽P2(Homo sapiens)
<400> 2
Leu Leu Tyr Lys Ile Ser Leu Thr Thr
1 5
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> 表位肽P3(Homo sapiens)
<400> 3
Tyr Leu Tyr Gln Leu Ser Pro Pro Ile
1 5
<210> 4
<211> 9
<212> PRT
<213> 表位肽P4(Homo sapiens)
<400> 4
Thr Leu Gly Gln His Leu Pro Thr Leu
1 5
<210> 5
<211> 9
<212> PRT
<213> 表位肽P5(Homo sapiens)
<400> 5
Val Leu Thr Pro Pro Ile Thr His Thr
1 5
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> 表位肽P6(Homo sapiens)
<400> 6
Leu Ile Trp Thr Phe Thr Asp Gly Thr
1 5
<210> 7
<211> 9
<212> PRT
<213> 表位肽P7(Homo sapiens)
<400> 7
Ile Leu Pro Glu Asp Cys Leu Pro Thr
1 5
<210> 8
<211> 9
<212> PRT
<213> 表位肽P8(Homo sapiens)
<400> 8
Gln Leu Gly Ala Phe Leu Thr Asn Val
1 5
<210> 9
<211> 9
<212> PRT
<213> 表位肽P9(Homo sapiens)
<400> 9
Leu Leu Phe Glu Glu Tyr Thr Asn Ile
1 5
<210> 10
<211> 9
<212> PRT
<213> 表位肽P10(Homo sapiens)
<400> 10
Gly Leu Leu Pro Phe His Ser Thr Leu
1 5
<210> 11
<211> 353
<212> PRT
<213> 抗原蛋白Tax的氨基酸序列(Homo sapiens)
<400> 11
Met Ala His Phe Pro Gly Phe Gly Gln Ser Leu Leu Phe Gly Tyr Pro
1 5 10 15
Val Tyr Val Phe Gly Asp Cys Val Gln Gly Asp Trp Cys Pro Ile Ser
20 25 30
Gly Gly Leu Cys Ser Ala Arg Leu His Arg His Ala Leu Leu Ala Thr
35 40 45
Cys Pro Glu His Gln Ile Thr Trp Asp Pro Ile Asp Gly Arg Val Ile
50 55 60
Gly Ser Ala Leu Gln Phe Leu Ile Pro Arg Leu Pro Ser Phe Pro Thr
65 70 75 80
Gln Arg Thr Ser Lys Thr Leu Lys Val Leu Thr Pro Pro Ile Thr His
85 90 95
Thr Thr Pro Asn Ile Pro Pro Ser Phe Leu Gln Ala Met Arg Lys Tyr
100 105 110
Ser Pro Phe Arg Asn Gly Tyr Met Glu Pro Thr Leu Gly Gln His Leu
115 120 125
Pro Thr Leu Ser Phe Pro Asp Pro Gly Leu Arg Pro Gln Asn Leu Tyr
130 135 140
Thr Leu Trp Gly Gly Ser Val Val Cys Met Tyr Leu Tyr Gln Leu Ser
145 150 155 160
Pro Pro Ile Thr Trp Pro Leu Leu Pro His Val Ile Phe Cys His Pro
165 170 175
Gly Gln Leu Gly Ala Phe Leu Thr Asn Val Pro Tyr Lys Arg Ile Glu
180 185 190
Glu Leu Leu Tyr Lys Ile Ser Leu Thr Thr Gly Ala Leu Ile Ile Leu
195 200 205
Pro Glu Asp Cys Leu Pro Thr Thr Leu Phe Gln Pro Val Arg Ala Pro
210 215 220
Val Thr Leu Thr Ala Trp Gln Asn Gly Leu Leu Pro Phe His Ser Thr
225 230 235 240
Leu Thr Thr Pro Gly Leu Ile Trp Thr Phe Thr Asp Gly Thr Pro Met
245 250 255
Ile Ser Gly Pro Cys Pro Lys Asp Gly Gln Pro Ser Leu Val Leu Gln
260 265 270
Ser Ser Ser Phe Ile Phe His Lys Phe Gln Thr Lys Ala Tyr His Pro
275 280 285
Ser Phe Leu Leu Ser His Gly Leu Ile Gln Tyr Ser Ser Phe His Asn
290 295 300
Leu His Leu Leu Phe Glu Glu Tyr Thr Asn Ile Pro Ile Ser Leu Leu
305 310 315 320
Phe Asn Lys Lys Glu Ala Asp Asp Asn Asp His Glu Pro Gln Ile Ser
325 330 335
Pro Gly Gly Leu Glu Pro Pro Ser Glu Lys His Phe Arg Glu Thr Glu
340 345 350
Val

Claims (1)

1.一种抗原蛋白Tax特异性CTL细胞的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：制备抗原蛋白Tax特异性DC细胞，和利用所获得的特异性DC细胞与CTL细胞共培养的步骤，
所述抗原蛋白Tax特异性DC细胞的制备包括在DC细胞中加入人T细胞病毒的CTL特异性识别表位肽进行培养的步骤，
所述DC细胞通过获取人外周血，经梯度分离获得外周血单个核细胞，经细胞因子I培养获得；
所述表位肽以抗原蛋白Tax为靶标设计，为抗原蛋白Tax的HLA-A*0201限制性CTL识别表位肽，所述表位肽的氨基酸序列如SEQ ID NO 4所示；所述CTL细胞通过获取人外周血，经梯度分离获得外周血单个核细胞，利用细胞因子II培养得到；
将获得的特异性DC细胞与CTL细胞共培养，并加入细胞因子III，刺激特异的CTL细胞扩增，得到特异性CTL细胞；
所述细胞因子I包括GM-CSF和IL-4；
细胞因子II包括anti-CD3 IgG和anti-CD28 IgG；
所述细胞因子III包括IL-2和IL-15。
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