KR101547788B1

KR101547788B1 - Ｃｔｌ 유도제 조성물

Info

Publication number: KR101547788B1
Application number: KR1020147025893A
Authority: KR
Inventors: 교고 이토; 시게키 시치조; 아키라 야마다
Original assignee: 가부시키가이샤 그린 펩티드
Priority date: 2007-09-18
Filing date: 2008-09-12
Publication date: 2015-08-26
Also published as: CN101854945B; CN104922650A; WO2009038026A1; JP5568309B2; ES2624879T3; US20170202913A1; KR20100047894A; CA2697896C; CN108478780B; CA2927770A1; EP2801367B1; EP3156061A1; US20150343041A1; EP3494981A1; ES2714200T3; CN104922650B; EP2196209A1; CA2697896A1; KR101294514B1; KR20140117699A

Abstract

서열목록의 서열번호: 1 내지 서열번호: 27 로 나타난 펩티드로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 펩티드를 포함하는 조성물로서, HLA-A2 양성 환자군, HLA-A24 양성 환자군, HLA-A26 양성 환자군, 및 HLA-A3 슈퍼타입 양성 환자군으로 이루어진 군에서 선택되는 둘 이상의 환자군에서의 암 또는 C형 간염 바이러스 관련 질환의 치료 또는 예방에 사용가능한 CTL 유도제 조성물이 개시된다.

Description

ＣＴＬ 유도제 조성물 {CTL INDUCER COMPOSITION}

본 발명은 상이한 HLA 타입을 갖는 복수의 환자군에 있어서 암 또는 C형 간염 바이러스 관련 질환의 치료 또는 예방에 유용한 펩티드를 포함한 CTL 유도제 조성물에 관한 것이다.

악성 종양은 일본인의 사망 원인의 1 위로서 사망 인원이 연간 약 310,000 명에 달한다. 세계에서는 연간 약 6 백만명이 암으로 사망하고 있다. 암 치료에 있어서는, 외과적 절제, 항암제 및 방사선요법 등이 행해지고 있다. 그러나, 이러한 치료 요법에는 재발, QOL 의 문제, 및 나아가, 이들 치료를 받지 못하는 진행암인 경우 선택할 수 있는 치료가 없는 등의 문제가 있다. 암에 대한 면역요법 (백신 요법) 은 오랫동안 제 4 의 치료 요법으로서 크게 기대되어 왔다. 인간 암 항원 펩티드가 동정가능하게 된 1990 년부터 전 세계에서 펩티드 백신 임상 연구가 시작되었다. 그러나, 펩티드 단독 투여 또는 병용 요법에서의 임상 연구 결과의 정리에 따르면, 1,000 사례 이상에서 효과율이 2.7% (Nature Immunology, 2004) 이어서, 이들을 약학 제제로 제형화하는 것은 곤란한 것으로 나타나고 있다.

한편, 본 발명자들은 환자의 HLA 타입 및 특이적 면역 반응을 미리 검사하여 투여할 펩티드 백신을 선택하는 맞춤형의 펩티드 백신 요법을 실시해, 상기 펩티드 백신이 안전하며 유효함을 확인하였다. 구체적으로, 맞춤형 펩티드 백신의 단독 투여에 의해 뇌 종양 및 자궁경부암에 대한 임상 효과를 관찰하였다(비(非)-특허 문헌 1 내지 3). 나아가, 이들을항암제와 병용한 결과, 전립선암 및 췌장암에 있어서 이들의 약학 제제로의 제형화를 가능하게 하는 수준의 우수한 임상 효과 및 안전성이 달성되었다(비(非)-특허 문헌 4 및 5).

암 펩티드 백신 요법에 있어서의 주요한 효과기로 여겨지는 특이적 T-세포에 의한 세포성 면역은 인간 백혈구 항원 (HLA) 구속성이며, 특정 HLA 타입 (HLA-A2 및 HLA-A24) 을 가진 환자들만을 대상으로 한 백신 개발이 본 발명자들을 포함한 전 세계 연구자들에 의해 실시되어 왔다. 그러나 이들 2 가지의 HLA 타입을 가진 환자의 비율은 40 내지 75% 정도이며, 나머지의 빈도가 더 적은 HLA 타입을 가진 25 내지 60%의 환자들은 펩티드 백신의 효과로부터 유익을 얻을 수 없다. 따라서, 전 세계의 암 환자들에게 적용가능한 펩티드 백신 개발 연구에 대한 필요성이 존재한다.

이미 HLA-A24, -A2, -A26 및 HLA-A3 슈퍼타입 (HLA-A3, -A11, -A31 , -A33 및―A68.1) 중 어느 하나에 결합하여, 각각의 HLA 에 대한 HLA 구속성 CTL 을 유도할 수 있는 펩티드가 동정되어 있다. 이러한 펩티드는 암에 대항한 펩티드 백신으로서 유용한 것으로 보고되어 있다(특허 문헌 1 내지 13 및 비(非)-특허 문헌 1 내지 17).

본 발명자들에 의해 수행되고 있는 맞춤형 펩티드를 이용한 암 백신 임상 시험에서는 이들 발견에 근거해, 미리 환자의 HLA 타입을 검사하고, 환자의 HLA 타입에 따라 후보 펩티드 중에서 최대 4 가지의 펩티드를 선별하여 투여하고 있다. 즉, 환자의 HLA 타입이 HLA-A2-A24 이면, HLA-A2 및 HLA-A24 각각에 대해 8 가지씩의 세트, 즉 16 가지 펩티드 중에서 펩티드를 선별한다. 그러나, 환자가 HLA-A24 에 대해 동형접합인 경우에는 A24 에 대한 8 가지 펩티드 중에서 펩티드를 선택해야 한다. 암 백신이 될 수 있는 추가적인 유형의 펩티드를 도입하는 것은 매우 어렵다. 따라서, 펩티드가 상이한 군들 사이에서 HLA 구속성 CTL 을 유도할 수 있는지 조사함으로써, 특정 HLA 타입의 환자에 대해 펩티드의 선택을 확대해 나갈 수 있다.

한편, C형 간염 바이러스 (HCV) 감염 후의 간세포 장애의 병리학적 메커니즘은 아직 잘 규명되어 있지 않지만, 많은 노선의 증거들은 바이러스-특이적 세포독성 T 림프구 (CTL) 가 HCV 감염 후의 간 장애에 중요한 역할을 하는 것일 수 있다는 것을 나타내고 있다(비(非)-특허 문헌 6). 또한, CTL 은 바이러스 감염 동안 바이러스의 확대를 제한하고, 바이러스를 제거하는데 유효하다는 것이 제안되고 있다(비(非)-특허 문헌 7). 따라서, 백신에 의한 CTL 유도는 HCV 감염에 관련된 질환의 관리의 유망한 전략일 것이다. 따라서, 비용 절감 및 보존의 용이함으로 인해, CTL 유도를 지향하는 펩티드 백신의 개발이 요구되고 있다.

본 발명자들은 이전에, 서열이 YLLPRRGPRL (서열번호: 25) 인 HCV 코어 단백질의 서열에서 유래한 펩티드인 C35-44 펩티드가 HLA-A24 또는 -A3 슈퍼타입 양성의 환자에서 CTL 을 유도할 수 있는 것을 확인하였다(특허 문헌 14). 상기 관찰 이전에, 상기 C35-44 펩티드는 또한 HLA-A2 양성인 자들의 말초혈액으로부터 바이러스를 제거함에 있어 유용한 CTL 을 강력하게 유도할 수 있는 것으로 보고되었다(비(非)-특허 문헌 8 및 특허 문헌 15).

본 발명에서 인용된 문헌은 하기 열거된 바와 같다. 하기 기재한 문헌들은 본 특허 출원에 참조로 포함된다.

특허 문헌 1: 국제 공개공보 제 WO 2005/071075 호

특허 문헌 2: 국제 공개공보 제 WO 01/011044 호

특허 문헌 3: 일본 미심사 특허 공보 (Kokai) 제 2003-270 호

특허 문헌 4: 국제 공개공보 제 WO 2003/050140 호

특허 문헌 5: 일본 미심사 특허 공보 (Kokai) 제 Hei 11-318455 (1999) 호

특허 문헌 6: 국제 공개공보 제 WO 00/12701 호

특허 문헌 7: 국제 공개공보 제 WO 02/010369 호

특허 문헌 8: 국제 공개공보 제 WO 99/67288 호

특허 문헌 9: 일본 특허 출원 제 2007-2127179 호

특허 문헌 10: 일본 미심사 특허 공보 (Kokai) 제 2004-216 호

특허 문헌 11: 국제 공개공보 제 WO 2007/000935 호

특허 문헌 12: 국제 공개공보 제 WO 2005/075646 호

특허 문헌 13: 국제 공개공보 제 WO 2008/007711 호

특허 문헌 14: 국제 공개공보 제 WO 2007/083807 호

특허 문헌 15: 국제 공개공보 제 WO 2007/049394 호

비(非)-특허 문헌 1: Yajima N 등, Clin Cancer Res. 2005 Aug 15; 11(16):5900-11

비(非)-특허 문헌 2: Mochizuki K 등, Int J Oncol. 2004 Jul; 25(1):121-31

비(非)-특허 문헌 3: Tsuda N 등, J Immunother. 2004 Jan-Feb; 27(1):60-72

비(非)-특허 문헌 4: Inoue Y 등, J Urol. 2001 Oct; 166(4):1508-13. Erratum in: J Urol. 2002 May; 167(5):2146

비(非)-특허 문헌 5: Yanagimoto H 등, Cancer Sci. 2007 Apr; 98(4): 605-11. Epub 2007 Feb 19

비(非)-특허 문헌 6: Chang KM 등, Springer Semin Immunopathol. 1997; 19:57-68

비(非)-특허 문헌 7: Kurokohchi K 등, J. Virol. 1996; 70:232-240

비(非)-특허 문헌 8: Takao Y. 등, Microbiol. Immunol., 48(7), 507-517, 2004

비(非)-특허 문헌 9: Yamada A 등, Cancer Res. 2001 Sep 1; 61(17):6459-66

비(非)-특허 문헌 10: Kobayashi K 등, Cancer Sci. 2003 Jul; 94(7):622-7

비(非)-특허 문헌 11: Nakao M 등, J Immunol. 2000 Mar 1; 164(5):2565-74

비(非)-특허 문헌 12: Harashima N 등, Eur J Immunol. 2001 Feb; 31(2):323-32

비(非)-특허 문헌 13: Minami T 등, Cancer Immunol. Immunother. 2007, May 56(5) 689-98

비(非)-특허 문헌 14: Matsueda S 등, Clin Cancer Res. 2005 Oct 1; 11(19 Pt 1):6933-43

비(非)-특허 문헌 15: Takedatsu H 등, Clin Cancer Res. 2004 Feb 1; 10(3):1112-20

비(非)-특허 문헌 16: Naito M 등, Br J Cancer. 2007 Dec 17; 97(12):1648-54. Epub 2007 Nov 27

본 발명의 목적은 복수의 HLA 타입에 대해 HLA 구속성 CTL 을 유도할 수 있는 펩티드를 제공하는 것이다.

본 발명의 목적은, HLA-A24, HLA-A2 또는 HLA-A3 슈퍼타입에 대해 HLA 구속성 CTL 을 유도하는 능력을 가진 것으로 보고된 공지의 펩티드로서, 이미 보고된 것 이외의 HLA 타입(들)을 포함한 둘 이상의 HLA 타입에 대해 HLA 구속성 CTL 을 유도할 수 있는 펩티드를 포함한 CTL 유도제 조성물을 제공하는 것이다.

따라서, 본 발명은, EGFR-800 (서열번호: 1), Lck-208 (서열번호: 2), Lck-488 (서열번호: 3), MRP3-1293 (서열번호: 4), PAP-213 (서열번호: 5), PSA-248 (서열번호: 6), SART2-93 (서열번호: 7), SART3-109 (서열번호: 8), SART3-302 (서열번호: 9), Lck-246 (서열번호: 10), ppMAPkkk-432 (서열번호: 11), WHSC2-103 (서열번호: 12), UBE-43 (서열번호: 13), HNRPL-501 (서열번호: 14), CypB-129 (서열번호: 15), Lck-422 (서열번호: 16), Lck-449 (서열번호: 17), β-tubulin5-154 (서열번호: 18), Lck-90 (서열번호: 19), PSA-16 (서열번호: 20), PAP-248 (서열번호: 21), IEX1-47 (서열번호: 22), SART3-511 (서열번호: 23), SART3-734 (서열번호: 24), C35-44 (서열번호: 25), PAP-155 (서열번호: 26), 및 β-tubuline-309 (서열번호: 27) 로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 펩티드를 포함한 조성물로서, HLA-A2 양성 환자군, HLA-A24 양성 환자군, HLA-A26 양성 환자군, 및 HLA-A3 슈퍼타입 양성 환자군으로 이루어진 군에서 선택되는 둘 이상의 환자군에서 암 및/또는 C형 간염 바이러스에 의해 유발되는 질환의 치료 또는 예방에 사용가능한 CTL 유도제 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, EGFR-800 (서열번호: 1), Lck-208 (서열번호: 2), Lck-488 (서열번호: 3), MRP3-1293 (서열번호: 4), PAP-213 (서열번호: 5), PSA-248 (서열번호: 6), SART2-93 (서열번호: 7), SART3-109 (서열번호: 8), SART3-302 (서열번호: 9), Lck-246 (서열번호: 10), ppMAPkkk-432 (서열번호: 11), WHSC2-103 (서열번호: 12), UBE-43 (서열번호: 13), HNRPL-501 (서열번호: 14), CypB-129 (서열번호: 15), Lck-422 (서열번호: 16), Lck-449 (서열번호: 17), β-tubulin5-154 (서열번호: 18), Lck-90 (서열번호: 19), PSA-16 (서열번호: 20), PAP-248 (서열번호: 21), IEX1-47 (서열번호: 22), SART3-511 (서열번호: 23), SART3-734 (서열번호: 24), PAP-155 (서열번호: 26), 및 β-tubuline-309 (서열번호: 27) 로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 펩티드를 포함한 조성물로서, HLA-A2 양성 환자군, HLA-A24 양성 환자군, HLA-A26 양성 환자군, 및 HLA-A3 슈퍼타입 양성 환자군으로 이루어진 군에서 선택되는 둘 이상의 환자군에서 암의 치료 또는 예방에 사용될 수 있는 약학 조성물을 제공한다.

EGFR-800 (서열번호: 1), Lck-488 (서열번호: 3), SART2-93 (서열번호: 7), SART3-109 (서열번호: 8), WHSC2-103 (서열번호: 12), UBE-43 (서열번호: 13), HNRPL-501 (서열번호: 14), CypB-129 (서열번호: 15), 및 PAP-155 (서열번호: 26) 로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 펩티드를 포함한 본 발명의 조성물은 HLA-A24 및 HLA-A2 양자에 대해 HLA 구속성 CTL 을 유도할 수 있어, HLA-A24 양성 암 환자군 및 HLA-A2 양성 암 환자군의 치료 또는 예방에 사용가능하다.

EGFR-800 (서열번호: 1), SART2-93 (서열번호: 7), SART3-109 (서열번호: 8), WHSC2-103 (서열번호: 12), UBE-43 (서열번호: 13), HNRPL-501 (서열번호: 14), β-tubulin5-154 (서열번호: 18), Lck-90 (서열번호: 19), 및 IEX1-47 (서열번호: 22), PAP-155 (서열번호: 26) 및 β-tubuline-309 (서열번호: 27) 로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 펩티드를 포함한 본 발명의 조성물은 HLA-A24 및 HLA-A3 슈퍼타입 양자에 대해 HLA 구속성 CTL 을 유도할 수 있어, HLA-A24 양성 암 환자군 및 HLA-A3 슈퍼타입 양성 암 환자군의 치료 또는 예방에 사용가능하다.

SART2-93 (서열번호: 7), SART3-109 (서열번호: 8), Lck-246 (서열번호: 10), ppMAPkkk-432 (서열번호: 11), WHSC2-103 (서열번호: 12), UBE-43 (서열번호: 13), HNRPL-501 (서열번호: 14), Lck-422 (서열번호: 16), Lck-90 (서열번호: 19), 및 SART3-511 (서열번호: 23) 로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 펩티드를 포함한 본 발명의 조성물은 HLA-A2 및 HLA-A3 슈퍼타입 양자에 대해 HLA 구속성 CTL 을 유도할 수 있어, HLA-A2 양성 암 환자군 및 HLA-A3 슈퍼타입 양성 암 환자군의 치료 또는 예방에 사용가능하다.

SART2-93 (서열번호: 7), SART3-109 (서열번호: 8), WHSC2-103 (서열번호: 12), UBE-43 (서열번호: 13), 및 HNRPL-501 (서열번호: 14) 로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 펩티드를 포함한 본 발명의 조성물은 HLA-A2, HLA-A24, 및 HLA-A3 슈퍼타입에 대해 HLA 구속성 CTL 을 유도할 수 있어, HLA-A2 양성 암 환자군, HLA-A24 양성 암 환자군, 및 HLA-A3 슈퍼타입 양성 암 환자군의 치료 또는 예방에 사용가능하다.

EGFR-800 (서열번호: 1), ppMAPkkk-432 (서열번호: 11), HNRPL-501 (서열번호: 14), 및 SART3-109 (서열번호: 8) 로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 펩티드를 포함한 본 발명의 조성물은 HLA-A26 에 대해 HLA 구속성 CTL 을 유도할 수 있어, 상기 기술한 환자군에 더하여, HLA-A26 양성 암 환자군의 치료 또는 예방에도 또한 사용가능하다.

펩티드 C35-44 (서열번호: 25) 를 포함한 본 발명의 조성물은 HLA-A24 양성 환자, HLA-A2 양성 환자, HLA-A3 슈퍼타입 양성 환자, 및 HLA-A26 양성 환자에서 C형 간염 바이러스 관련 질환의 치료 또는 예방, 즉, HCV 감염에 관련된 간염, 간경변, 및 간암 환자군의 치료 또는 예방에 사용가능하다.

본 발명의 CTL 유도제 조성물에 포함된 펩티드는 복수의 HLA 타입에 대해 HLA 구속성 CTL 을 유도하는 능력을 가지며, 따라서 HLA 구속성 CTL 을 유도하는 것으로 기존에 알려진 펩티드에 대한 HLA 타입 이외의 HLA 타입을 가진 환자에서 암 및 C형 간염 감염-관련 질환의 치료 또는 예방에 사용가능하다. 본 발명은 각 HLA 타입의 환자에 대한 펩티드 선택의 폭을 넓혀, 맞춤형 암 백신 요법에 있어서 더욱 효율적인 치료의 실시를 가능하게 한다.

또한, C35-44 (서열번호: 25) 로 표시되는 펩티드를 포함한 CTL 유도제 조성물은 HLA-A24 양성 환자, HLA-A2 양성 환자, HLA-A3 슈퍼타입 양성 환자, 및 HLA-A26 양성 환자 중 임의의 환자에서 CTL 을 유도할 수 있고, C형 간염 바이러스 관련 질환의 치료 또는 예방에 사용가능하다.

도 1 은 HLA-A24-결합성 SART3-109 를 이용하여 HLA-A11 양성 암 환자로부터의 PBMC 를 자극하여 수득한 CTL 의 세포독성 활성을 나타낸다.
도 2 는 상이한 결합 특성을 가진 상이한 펩티드의 HLA-A26 양성 세포에 대한 결합 활성을 나타낸다.
도 3 은 HLA-A3 슈퍼타입 대립유전자-양성 전립선암 환자로부터의 펩티드-자극된 PBMC 의 세포독성 활성을 나타낸다. HLA-A3 슈퍼타입 대립유전자-양성 전립선암 환자로부터의 PBMC 를 펩티드로 자극하고, 상기 PBMC 의 복수의 표적 세포에 대한 세포독성 활성을 6-시간 ⁵¹Cr 방출 측정법 (release assay) 으로 측정하였다. 대조군으로서는 HLA-A3 슈퍼타입 대립유전자-양성의 건강한 자원자들로부터의 PHA-자극된, 아세포(blast)-형성성 T-세포 아세포를 사용하였다. * p < 0.05.

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

"HLA-A24, HLA-A2, HLA-A3 슈퍼타입 및 HLA-A26 으로 이루어진 군에서 선택되는 둘 이상의 HLA 분자에 대한 결합성"이란, 펩티드가 HLA-A24, HLA-A2, HLA-A3 슈퍼타입, HLA-A26 분자에 포함되는 분자로 이루어진 군에서 선택되는 둘 이상의 HLA 분자와 복합체를 형성하여 세포 표면에 제시될 수 있는 것을 의미한다.

*본 발명에 있어서, 펩티드-특이적 CTL 을 유도하는 능력은, 예를 들어, 말초혈액 단핵세포 (PBMC) 를 펩티드로 자극하고, 상기 펩티드-자극된 PBMC 가 대응 펩티드를 펄스 전송한 항원 제시 세포에 반응해 사이토카인 (예를 들어, IFN-γ) 을 생성하는지의 여부를 ELISA 법 등에 의해 측정함으로써, 조사할 수 있다. 또한, 유도된 CTL 의 세포독성 활성은 ⁵¹Cr 방출 측정법 등에 의해 확인할 수 있다.

본 발명의 펩티드는 통상의 펩티드 합성에 의해 제조가능하다. 이러한 목적의 방법으로서는, 예를 들어, 문헌 [Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966]; [The Proteins, Vol. 2, Academic Press Inc., New York, 1976]; [Peptide Synthesis (일본어), MARUZEN Co., Ltd., 1975]; [Basics And Experiments In Peptide Synthesis (일본어)], MARUZEN Co., Ltd., 1985]; 및 [Development Of Pharmaceuticals, Second Series, Vol. 14, Peptide Synthesis (일본어), Hirokawa Shoten Co., 1991] 에 기재된 방법을 들 수 있다.

본 발명의 CTL 유도제 조성물에 함유되는 펩티드는 본 발명의 펩티드의 아미노산 서열을 포함한 폴리펩티드의 세포내 절편화에 의해 생성될 수 있다. 본 발명은 또한 그러한 구현예로 본 발명의 펩티드를 이용하는 것도 포함한다. 폴리펩티드가 본 발명의 펩티드를 제공할 수 있는 한, 상기 폴리펩티드의 아미노산 잔기의 수 및 아미노산 서열은 아무 제한없이 원하는 대로 선택가능하다.

본 발명의 CTL 유도제 조성물에 함유되는 펩티드는 HLA-A24, HLA-A2, HLA-A3 슈퍼타입, 및 HLA-A26 양성 환자군으로 이루어진 군에서 선택되는 둘 이상의 환자군에서 암 세포를 특이적으로 살상하는 CTL 을 효율적으로 유도 및 증식시킬 수 있어, 폭넓은 암환자들을 치료하는데 유용하다.

본 발명은, 상기에 특정한 펩티드를 포함한, 암의 치료 또는 예방을 위한 약학 조성물을 제공한다. 본 발명에 따른 암의 치료 또는 예방을 위한 약학 조성물은, 1 종의 펩티드를 포함할 수도 있고, 또는 2 종 이상의 펩티드 및/또는 이들의 유도체를 조합하여 포함할 수도 있다. 암 환자로부터의 CTL 은 상이한 암-항원 펩티드를 인식하는 세포의 하위집합이므로, 복수의 암-항원 펩티드 및/또는 이들의 유도체를 조합하여 사용하는 것이 더욱 효과적이다. 본 발명의 펩티드는 또한 본 발명의 펩티드 이외의 암 항원 펩티드와 조합가능하다.

본 발명에 따른 암의 치료 또는 예방을 위한 약학 조성물은, 맞춤형 요법에 사용할 수 있도록 하기 위해, 본 발명의 펩티드(들)를 포함한 복수의 펩티드, 예를 들어, 8 종의 펩티드를 개별적으로 포함한 약학 제제를 포함할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 펩티드(들)에 더하여, 약학적으로 허용가능한 담체 등을 포함할 수 있다. 담체로서는 셀룰로오스, 중합체화 아미노산, 알부민, 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물에는 리포솜 제형물, 직경이 수 마이크로미터인 비드에 결합시킨 미립자 제형물, 지질에 결합시킨 제형물 등이 포함될 수 있다. 또한 면역 반응이 효과적으로 성립하도록, 본 발명의 약학 조성물을 백신 투여에 사용되는 것으로 이전에 공지된 애주번트와 함께 투여할 수도 있다. 투여 방법에는, 예를 들어, 피내 또는 피하 투여, 등이 있다.

본 발명에 따른 암의 치료 또는 예방을 위한 약학 조성물은 암 백신으로 사용가능하다. 투여량은 질환 상태, 개별 환자의 연령 및 체중 등에 따라 적절히 조정가능하다. 통상, 약학 조성물 중의 펩티드의 양은, 보통 0.0001 내지 1000 mg, 바람직하게는 0.001 내지 100 mg, 더욱 바람직하게는 0.01 내지 10 mg, 더욱 더 바람직하게는 0.1 내지 5 mg 또는 0.5 내지 3 mg 범위이며, 이를 수일, 수주 또는 수개월에 1 회 반복하여 투여하는 것이 바람직하다.

본 발명은 또한 HLA-A24, HLA-A2, HLA-A26, 또는 HLA-A3 슈퍼타입에 양성인 암 환자군에서 채취한 말초혈액 단핵세포 (PBMC) 를 본 발명의 펩티드와 접촉시키는 것을 포함하는, 암-반응성 CTL 을 유도하는 방법을 제공한다. 본 발명의 펩티드는 상기 기술한 암 환자군 중 둘 이상에서 유래한 PBMC 로부터 CTL 을 유도할 수 있다. CTL 에 있어서 "암-반응성"이란, CTL 이 표적 암 세포 상의 암 항원 펩티드와 HLA 분자와의 복합체를 인식하여, 그 암 세포를 살상할 수 있는 것을 의미한다. CTL 의 유도는, 예를 들어, HLA-A24 에 양성인 악성 뇌-종양 환자에서 채취한 PBMC 를, 시험관내에서 본 발명의 펩티드의 존재하에서 배양함으로써 실시한다. 본 발명에 따른 CTL 유도 방법은, 상기 유도한 CTL 을 PBMC 를 채취한 환자의 체내에 되돌려 암 세포를 살상하는 입양 면역 요법에 유용하다.

본 발명은 또한, 상기 CTL 유도 방법을 실시하기 위해서 사용되는 CTL 유도 키트를 제공한다. 본 발명의 키트는, 1 종 이상의 본 발명의 펩티드를 포함하고, 추가로 적절한 완충액, 배지 등을 포함할 수도 있다.

본 발명은 또한 HLA-A24 양성 암 세포, HLA-A2 양성 암 세포, HLA-A26 양성 암 세포, 및 HLA-A3 슈퍼타입 양성 암 세포로 이루어진 군에서 선택되는 암 세포에 대해 세포독성인 CTL 을 유도할 수 있는 항원 제시 세포를 조제하는 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 항원 제시 세포 조제 방법은, 예를 들어, HLA-A24 양성 암 환자 유래의 항원 제시 능력을 갖는 세포를 본 발명의 펩티드와 함께 배양하여, 상기 펩티드가 HLA-A24 분자에 결합 및 제시되도록 함으로써 실시한다. 대안적으로는, 그러한 펩티드를 발현할 수 있는 벡터를, HLA-A24 양성 암 환자 유래의 항원 제시 능력을 갖는 세포에 도입하여 상기 펩티드를 발현시킬 수도 있다. 항원 제시 능력을 갖는 세포에는, 예를 들어 수지상 세포가 포함된다. 환자 유래의 수지상 세포는, 예를 들어, 환자로부터 채취한 PBMC 로부터 배양 플레이트 접착 세포를 분리하고, 상기 접착 세포를 IL-4 및 GM-CSF 의 존재하에서 약 1 주간 배양함에 의해 수득가능하다. 본 발명의 방법에 의해 조제된 항원 제시 세포는, HLA-A24 양성 암 세포, HLA-A2 양성 암 세포, 및 HLA-A3 슈퍼타입 양성 암 세포로 이루어진 군에서 선택되는 둘 이상의 세포에서 세포 표면에 제시되는 펩티드와 HLA 분자의 복합체를 특이적으로 인식하는 CTL 을 유도할 수 있고, 암 환자에게 투여시 상기 암 환자 체내에서 암-반응성 CTL 의 유도를 촉진할 수 있다. 즉, 본 발명의 방법에 의해 조제되는 항원 제시 세포는, 암의 치료 또는 예방을 위한 의약 용도로 사용가능하다.

본 발명은 또한, 상기 항원 제시 세포 조제 방법을 실시하기 위해서 사용되는 항원 제시 세포 조제 키트를 제공한다. 본 발명의 키트는, 1 종 이상의 본 발명의 펩티드 및/또는 그의 유도체를 포함하고, 나아가 적절한 완충액, 배지 등을 포함할 수도 있다.

본 발명은 또한 펩티드 C35-44 (서열번호: 25) 를 포함한 조성물로서, HLA-A24 양성 환자, HLA-A2 양성 환자, 및 HLA-A3 슈퍼타입 양성 환자에서의 C형 간염 바이러스 관련 질환의 치료 또는 예방에 유용한 CTL 유도제 조성물을 제공한다. 본 발명에서, "C형 간염 바이러스 관련 질환"이란 C형 간염 뿐만 아니라, 간경변 및 간암 등의 HCV 감염에 기인하여 유발되는 모든 질환을 포함하는 것으로 한다.

본 발명을 이하의 실시예에 의해 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명은 어떠한 방식으로도 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

본 발명자들은 HLA-A24, HLA-A2, HLA-A26, 및 HLA-A3 슈퍼타입 중 어느 하나에 대해 HLA 구속성 CTL 을 유도할 수 있는 것으로 알려진 총 34 개의 펩티드 (각각, 13, 9, 및 12 개씩의 펩티드) 에 대해, 다른 HLA 타입에 대한 결합 능력을 조사했다.

표 1 은 본 발명자들에 의해 조사된 펩티드 및 이들의 공지된 HLA-결합 특성을 나타낸다.

[표 1]

펩티드

표 1 에 열거된 펩티드들을 준비하였다.

이들 펩티드는 모두 순도 >90% 이며, Biologica Co. (Nagoya, Japan) 로부터 구입하였다. HLA-A2 타입에 결합하는 대조 펩티드로서는 Gag77-85 (SLYNTVATL) (서열번호: 35) 를, HLA-A24 타입에 결합하는 대조 펩티드로서는 env-GP (RYLRDQQLL) (서열번호: 36) 를, HLA-A26 타입에 결합하는 대조 펩티드로서는 HIV-Gag167-175 (EVIPMFSAL) (서열번호: 37) 를, 및 HLA-A3 슈퍼타입 대립유전자 분자에 결합하는 대조 펩티드로서는 HIV-유래 펩티드 (RLRDLLLIVTR) (서열번호: 38) 를 사용하였다. 상기 펩티드들은 모두 디메틸 술폭시드를 이용하여 10 μg/ml 의 용량으로 용해하였다.

HLA-A3 슈퍼타입에 포함되는 5 가지의 HLA-A 대립유전자들은 결합 모티프를 공유하지만, HLA-A3 또는 HLA-A68.1 양성의 일본인은 매우 드물다. 본 연구에서는, 따라서, 상기 펩티드들에 대해 HLA-A11, -A31, 및 -A33 분자에 대한 결합 능력을 조사하였다.

환자 (PT)

HLA-A2, HLA-A24, HLA-A26, HLA-A11, HLA-A31, 및 HLA-A33 중 어느 하나의 HLA 에 대해 양성인 암 환자들이 포함되었다.

건강한 공여자 (HD)

건강한 공여자들에는, HLA-A2 양성, HLA-A24 양성, HLA-A26 양성, HLA-A11 양성, HLA-A31 양성, 및 HLA-A33 양성 환자가 포함되었다.

PBMC 를 채취한 환자 및 건강한 공여자들은 모두 HIV 에 감염되지 않은 사람들이었다. 환자/건강한 공여자로부터 말초 혈액 20 밀리리터를 채취하여 Ficoll-Conray 구배 원심분리로 PBMC 를 조제하였다. 시료는 모두 실험에 사용할 때까지 저온에서 보관하였다. PBMC 상의 HLA-A2, HLA-A24, HLA-A11, -A31, 및 -A33 분자의 발현은, 이하의 항체를 이용하여 유세포 분석기로 확인하였다: 항-HLA-A24 단일클론 항체 (mAb), 항-HLA-A2 mAb, 항-HLA-A26 mAb, 항-HLA-A11 mAb, 항-HLA-A31 mAb, 항-HLA-A33 mAb (모두 One Lambda, CA, USA 로부터 입수가능); 및 FITC-결합 항-마우스 면역글로불린 G (IgG) mAb.

세포주

HLA-A2 를 발현하는 T2 세포는 ATCC (CRL-1992) 로부터 입수하였다. C1R-A24, C1R-A26, C1R-A11, C1R-A31, 및 C1R-A33 은 C1R 모 세포주를 HLA-A24, HLA-A26, HLA-A11, HLA-A31, 및 HLA-A33 유전자로 트랜스펙션하여 각각 대응 HLA 분자를 발현하도록 생성한 세포이다(Takedatsu 등, Clin Cancer Res 2004; 10:111220). C1R 모 세포는 인간 B-림프모세포 (HMy2.CIR: Human B lymphoblast; ATCC CRL-1993) 로서, HMy.2 B 림프모구양 세포주에 γ-선을 조사하고 MHC 클래스 I-Cw4 는 발현하지만 HLA 클래스 I-A 및 -B 는 결여된 세포를 항체 및 보체에 의해 선별하여 수득한 세포주이다(Storkus WJ, Alexander J, Payne JA, Dawson JR, 및 Cresswell P, Procnatl acad sci USA, 86:2361-2364, 1989).

RMA-S-A2601 은 RMA-S 세포 (세포막 상에서의 MHC 클래스-I 분자의 발현이 낮은 변이 RMA 세포로서 분리된 세포: Karre K, Ljunggren H-G, Piontek G, 및 Kiessling R. 1986, Selective rejection of H-2-deficient lymphoma variants suggest alternative immune defence strategy. Nature (Lond) 319: 675) 에 HLA-A2601 유전자를 도입하여 생성한 안정한 유전자이입 (transfectant) 세포이다.

PC-93 은 전립선 육종 세포주로서, HLA-A11 에 대해 음성이다. TSU-PR 은 전립선암 세포주로서, HLA-A11 에 대해 양성이다. SQ-1 은 폐암 세포주로서, HLA-A11 에 대해 음성이다. COLO-201 은 대장암 세포주로서, HLA-A11 에 대해 양성이다. LC-1 은 폐암 세포주로서, HLA-A31/HLA-A33 에 대해 양성이다. 이들 종양 세포주들은 모두 10% FCS 함유 RPMI 1640 (Invitrogen) 에서 배양되었다.

PBMC 로부터 펩티드-반응성 CTL 의 유도

펩티드-반응성 CTL 을 이전에 보고된 방법을 일부 변경하여 검출하였다(Hida N, Maeda Y, Katagiri K, Takasu H, Harada M, Itoh K., Cancer Immunol Immunother 2002; 51:219-28). 각 환자 (PT) 및 건강한 공여자 (HD) 로부터 통상적인 절차로 수득한 PBMC 를 시험관내에서 각각의 펩티드 또는 대조 펩티드로 자극하였다. 수득한 펩티드-자극된 PBMC 를, PBMC 에 대한 펩티드 자극에 사용한 것과 동일한 펩티드를 펄스 전송한 T2, C1R-A24, -A26, -A11, C1R-A31, 또는 C1R-A33 세포와 함께 배양하고, 생성된 IFN-γ 의 양을 측정하여, 이를 CTL 유도의 지표로 사용하였다.

구체적으로, PBMC (1 x 10⁵ 세포/웰) 를 U-바닥 96-웰 마이크로-배양 플레이트 (Nunc, Roskilde, Denmark) 에서 200 μl 의 배양 배지 중에서 각 펩티드 (10 μl/ml) 와 함께 4 웰 세트에서 인큐베이션하였다. 상기 배양 배지는 45% RPMI 1640, 45% AIM-V 배지 (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD), 10% FCS, 100 U/ml 인터루킨-2 (IL-2), 및 0.1 mM 의 MEM 비(非)-필수 아미노산 용액 (Gibco-BRL) 으로 구성되었다. 3 일마다 배양 배지의 절반을 제거하고, 대응 펩티드 (10 μg/ml) 를 함유한 새로운 배양 배지로 교체하였다. 배양 후 제 15 일에, 배양 세포의 절반을 대응 펩티드를 펄스 전송한 T2, C1R-A24, -A26, -A11, C1R-A31, 또는 C1R-A33 세포와 혼합하고, 나머지 절반은 대응 대조 펩티드를 펄스 전송한 T2, C1R-A24, -A26, -A11, C1R-A31, 또는 C1R-A33 세포와 혼합하였다. 각각의 혼합 배양물을 추가로 18 시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 상청액을 회수하고, 상청액 중의 인터페론 (IFN)-γ 의 수준을 효소 결합 면역흡착 분석법 (ELISA) 으로 측정하였다. 펩티드-반응성 CTL 의 유도는, P 값이 0.05 미만이고, 각각의 대조 펩티드를 펄스 전송한 세포와 비교하여 대응 펩티드를 펄스 전송한 세포에 반응하여 50 pg/ml 초과의 IFN-γ 가 생성된 경우, 양성인 것으로 결정하였다.

세포독성 활성의 측정

HLA-A11 양성 세포주 TSU-PR 및 HLA-A11 음성 세포주 PC93 에 대한 펩티드-자극된 PBMC 의 세포독성 활성은, 표준 6-시간 ⁵¹Cr 방출 측정법으로 측정하였다. 음성 대조 세포로서는 HLA-A11 양성의 건강한 공여자로부터 유래한 피토헤마글루티닌 (PHA)-활성화 T 세포를 사용하였다. 둥근바닥 96-웰 플레이트에서, 웰당 2,000 개의 ⁵¹Cr-표지된 표적 세포를, 지시된 효과기 세포/표적 세포의 비율로 효과기 세포와 함께 배양하였다. 효과기 세포로서는, 펩티드 자극 PBMC 로부터의 CD8 양성 T 세포를 세포독성 활성 측정 실험의 직전에 CD8 Positive Isolation Kit (Dynal, Oslo, Norway) 를 이용하여 단리하여 수득한 세포를 사용하였다. 특이적 ⁵¹Cr-방출은 실험에서 수득한 c.p.m. 으로부터 자연 방출에 의한 c.p.m. 을 제하여 계산하였다. 자연 방출은 효과기 세포없이 인큐베이션한 시료의 상청액으로부터 결정하였고, 그 후 상기 시료를 1% Triton X (Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japan) 와 함께 인큐베이션하여 전체 방출을 결정하였다.

HLA-A26 분자에 대한 펩티드들의 결합성 시험

HLA-A2601 유전자로 트랜스펙션한 RMA-S 세포 (RMA-S-A2601) 를 26 ℃ 에서 20 시간 동안 배양한 후, 0.1 내지 100 μM 농도의 각 펩티드 및 인간 β2-마이크로글로불린과 함께 26 ℃ 에서 2 시간 동안, 및 그 후 37 ℃ 에서 추가 3 시간 동안 배양하였다. 세포를 PBS 로 세정한 후, 상기 세포에 최적 농도의 항-인간 MHC 클래스-I 항체 또는 HLA-타입-특이적 항체를 첨가하고, 얼음 중에 30 분간 방치하였다. 세포를 PBS 로 2 회 세정 후, Alexa Fluor 488 표지 염소 항-마우스 IgG 를 첨가하고, 얼음 중에 30 분간 방치하였다. 유세포 분석기를 이용하여 측정한 후, 형광 강도를 비교하였다.

펩티드가 복수의 HLA 타입에 대해 HLA 구속성 CTL 을 유도할 수 있는지에 대한 조사

과거에 이미 동정된 암 펩티드 백신을 위한 후보 펩티드 중에서, HLA-A2, -A24, 및 -A3 슈퍼타입에 결합하는 총 34 개의 펩티드 (각각, 9, 13, 및 10 개씩의 펩티드) 를 선택하고, 각 펩티드가 본래 결합하는 것으로 증명된 HLA 와는 상이한 타입의 HLA 에 대해 HLA 구속성 CTL 을 유도하는 능력을 조사하였다. 상이한 HLA 타입을 가진 환자로부터의 말초 혈액을 각각의 펩티드로 자극하고, 각 타입에 대한 HLA 유전자를 이입하여 생성한 C1R 유전자이입체 (transfectant) 에 대응하는 펩티드를 펄스 전송한 세포를 표적으로 이용하여 CTL 을 유도하는 능력을 측정하였다.

HLA-A24 결합성 펩티드 중에서 서열번호: 1 내지 서열번호: 8 의 펩티드에 대해 먼저 교차반응성을 조사하였다. EGFR-800 (서열번호: 1), Lck-488 (서열번호: 3), SART2-93 (서열번호: 7), 및 SART3-109 (서열번호: 8) 는 각각 HLA-A11 에 대해, HLA-A2 에 대해, HLA-A2 및 -A11 에 대해, 및 HLA-A2, -A11, 및 -A31 에 대해 HLA 구속성 CTL 을 유도하였다(표 2). 표 2 에서, 숫자는 IFN-γ 의 수준 (ng/ml) 을 나타내는 것으로, 50 ng/ml 이상의 수준을 유의한 것으로 간주하였다. 공란 (blank entry) 은 실험을 실시하지 않은 것을 나타내며, 마이너스 부호 (-) 는 IFN-γ 가 검출 한계 미만의 수준인 것을 의미한다.

[표 2]

유사하게, HLA-A2 결합성 펩티드 중에서 서열번호: 9 내지 서열번호: 16 의 펩티드에 대해 교차반응성을 조사하였다. CypB-128 (서열번호: 15), Lck-246 (서열번호: 10), Lck-422 (서열번호: 16), ppMAPkkk (서열번호: 11), WHSC2-103 (서열번호: 12), UBE-43 (서열번호: 13), 및 HNRPL-501 (서열번호: 14) 은 각각 HLA-A24 에 대해, HLA-A11 및 -31 에 대해, HLA-A31 에 대해, HLA-11 및 HLA-A31 에 대해, HLA-A24 및 -A31 에 대해, HLA-A24 및 -A31 에 대해, 및 HLA- A24 및 -A11 에 대해 HLA 구속성 CTL 을 유도할 수 있는 것으로 나타났다(표 3). 하기 표에서, 숫자는 IFN-γ 의 수준 (ng/ml) 을 나타내는 것으로, 50 ng/ml 이상의 수준을 유의한 것으로 간주하였다.

[표 3]

또한, HLA-A3 슈퍼타입 결합성 펩티드 중에서 서열번호: 17 내지 서열번호: 27 의 펩티드에 대해 교차반응성을 조사하였다. β-tubulin5-154 (서열번호: 18), Lck-90 (서열번호: 19), IEX1-47 (서열번호: 22), 및 SART3-511 (서열번호: 23) 은 각각 A24, A2, A24, 및 A2 에 대해 HLA 구속성 CTL 을 유도할 수 있는 것으로 나타났다(표 4). 하기 표에서, 숫자는 IFN-γ 의 수준 (ng/ml) 을 나타내는 것으로, 50 ng/ml 이상의 수준을 유의한 것으로 간주하였다.

[표 4]

상이한 HLA-A3-슈퍼타입-구속성 세포독성 활성

HLA-24 에 결합하는 것으로 공지된 펩티드인 SART3-109 (서열번호: 8) 를 이용하여, HLA-A11 양성 전립선암 환자로부터의 PBMC 를 자극하여 CTL 을 유도하였다. 생성된 CTL 의 세포독성 활성을 크롬 방출 반응에서 확인하였다. HLA-A11 양성 세포주 TSU-PR 에 대한 세포독성 활성에 대해서, 크롬 방출율은 HLA-A11 음성 세포주 PC93 및 HLA-A11 양성의 건강한 공여자로부터의 PHA 자극 림프모세포와 비교하여 상기 세포주에 대해 유의하게 높은 것으로 나타났다(도 1).

HLA-A26 에 대한 펩티드들의 결합성 시험

RMA-S-A2601 에 대한 각종 펩티드들의 결합 능력을 조사하였다. 펩티드들은 DMSO 에 용해하여 사용하였다. 음성 대조군으로서는 DMSO 단독을 사용하였다. 이 실험 결과로부터, HLA-A24-구속성 CTL 을 유도할 수 있는 SART3-109 (서열번호: 8) 는 완전히 상이한 HLA 슈퍼타입에 속하는 HLA-A26 에도 결합하는 것으로 나타났다. 또한, 유사하게 HLA-A24 에 구속성인 EGFR-800 (서열번호: 1) 도 또한, 약한 수준이긴 하지만, HLA-A26 분자에 결합하는 것이 시사되었다(도 2).

HLA-A3 슈퍼타입 대립유전자들에 대한 Lck-90 및 Lck-449 펩티드들의 결합 능력

특허 문헌 9 에 개시된 Lck-90 (서열번호: 19) 및 Lck-449 (서열번호: 17) 펩티드들의 HLA-A3 슈퍼타입 대립유전자들에 대한 결합 능력을 나타내는 자료는 하기와 같다.

Lck-90 및 Lck-449 펩티드들에 있어서, HLA-A3 양성 전립선암 환자의 혈장 중에 펩티드 반응성 IgG 가 고빈도로 관찰되는 것을 확인하였다. 또한, HLA-A3 슈퍼타입 대립유전자 양성 전립선암 환자 유래의 PBMC 로부터 Lck-90 및 Lck-449 펩티드-특이적 CTL 을 유도하는 능력을 상기 기술한 방법으로 확인하였다. Lck-90 및 Lck-449 펩티드는, 7 명의 HLA-A11 양성 암 환자 중 각각 5 및 2 명, 5 명의 HLA-A31 양성 암 환자 중 각각 3 및 3 명, 5 명의 HLA-A33 양성 암 환자 중 각각 2 및 3 명에서 유래한 PBMC 로부터, 대응 펩티드에 반응성인 CTL 을 유도하였다.

HLA-A3 슈퍼타입 대립유전자 양성 전립선암 환자로부터의 PBMC 를 시험관내에서 Lck-90 (서열번호: 19) 또는 Lck-449 (서열번호: 17) 펩티드로 자극하여 그에 의해 유도된 펩티드-반응성 CTL 이 암 세포에 대해 세포독성 활성을 나타내는지를 조사하였다. Lck-90 및 Lck-449 펩티드 각각으로 자극한 HLA-A11 양성 환자 유래의 PBMC는, HLA-Al1 음성 COLO 201 세포 및 음성 대조군인 HLA-Al1 양성의 건강한 공여자 유래의 PHA 자극된 아세포-형성 T-세포 아세포에 대한 것에 비해, HLA-Al1 양성 SQ-1 세포에 대해 더 높은 수준의 세포독성 활성을 나타내었다. 유사하게, 이들 펩티드는, HLA-A31 양성 환자 및 HLA-A33 양성 환자 유래의 PBMC 로부터 LC-1 (HLA-A31⁺/-A33⁺) 반응성 CTL 을 유도할 수 있는 것으로 나타났다. 각 펩티드에 특이적인 CTL 은 COLO 201 세포 또는 아세포-형성 T-세포에 대한 것보다, LC-1 세포에 대해 더 강한 세포독성 활성을 나타내었다. 따라서, 시험관내에서 Lck-90 및 Lck-449 펩티드로 자극된 PBMC 는 암 세포에 대해 HLA-A11, -A31, 및-A33 에 구속성인 방식으로 세포독성 활성을 발휘하는 것으로 나타났다.

세포독성 활성의 측정

각종 HLA 타입을 가진 암 환자 유래의 PBMC 를 펩티드로 자극하여, 상기 펩티드의 각 HLA 타입에 대한 CTL 유도 능력을 조사하였다. 각각의 환자의 HLA 타입에 대응하는 HLA 타입을 갖는 암 세포주를 표적 세포로서 이용하여, 각 표적 세포에 대한 세포독성 활성을 표준 6-시간 ⁵¹Cr 방출 측정법에 의해 측정하였다.

본 측정에 사용된 표적 세포는 하기 암 세포주들이었다: PC93 (A68), KE4 (A24/A26), KE5 (A1101/), PC93-A24 (A24/A68), PC93-A33 (A33/A68), PC93-A31 (A31/A68), COLO 201 (A0101/0201), 11-18 (A0201/A2402), TSU-PR (A11), LC-1 (A3101/A3303), Panc-1 (A0201/A1101), LC-1 (A3101/A3303), LC65A (1101/2402), LNCap-A11 (A11/A0101/0201), KNS42 (A2402/2601), LNCap-A24 (A24/A0101/0201), 및 LNCap-A31 (A31/A0101/0201). 음성 대조군으로서는 QG56 (A2601), PC93 (A68), LNCap (A0101/0201), LC-1 (A3101/A3303), COLO 201 (A0101/0201), COLO 320 (A2402/), 및 K562 를 사용하였다. 괄호 안은 각 세포주의 HLA 타입을 나타낸다. 상기와 관련하여, PC93(WT) 는 HLA-A68 을 발현하는 것, 예를 들어 표적 세포가 PC93-A24 로 표시된 경우, 이는 HLA-A24 를 암호화하는 유전자를 도입하여 생성한 안정한 유전자이입체인 것을 의미한다. 모든 종양 세포주는 10% FCS 함유 RPMI 1640 (Invitrogen) 중에 배양되었다. 이의 결과를 나타내는 표 5 에서, HLA 는 유전자이입체에 대해서만 기재되어 있으며, 유전자이입체가 아닌 것에 대해서는 "(WT)"로 기재되어 있다.

상기 결과를 나타내는 표 5 에서, PBMC 가 유래한 암 환자의 HLA 타입과는 상이한 HLA 타입을 가진 종양 세포주를 음성 대조 표적 세포로서 사용하여 동일한 방식으로 펩티드 활성화 PBMC 에 의한 세포독성 활성을 조사하여, 음성 대조 표적 세포에 대한 세포독성 활성과 비교해 HLA-매칭 (HLA-matched) 표적 세포에 대해 통계학적으로 유의한 세포독성 활성이 발견되었을 경우에, 상기 HLA 타입에 대한 HLA 구속성 세포독성 활성의 유도가 일어났다는 것을 인식하여, "+"을 표하였다. 표 5 에는 시험에 사용한 HLA-매칭 표적 세포와 대조 표적 세포가 기재되어 있다. 표 중에 그러한 세포에 대한 기재가 없고, "+"이 주어져 있는 경우, 이는 이미 당해 펩티드에 있어서 표시한 HLA 타입에 대해 HLA 구속성 CTL 유도 활성이 알려져 있는 것을 의미한다.

HCV-유래 펩티드인 C35-44 (서열번호: 25) 의 펩티드-특이적 CTL 활성에 있어서, 이의 활성은, HCV 감염 환자 유래 PBMC 를 C35-44 펩티드로 자극하여 수득한 세포를 이용하고, 대응 HLA 유전자 각각으로 안정적으로 트랜스펙션된 것으로서 C35-44 를 펄스 전송한 C1R 세포를 HLA-매칭 표적 세포로서 및 C1R(WT) 을 음성 대조 표적 세포로 이용하여, 통상적인 절차에 따라 크롬 방출 반응으로 측정하였다.

둥근바닥 96-웰 플레이트에서, 웰당 2,000 개의 ⁵¹Cr-표지 표적 세포를 효과기-세포-대-표적-세포 비 40 으로 효과기 세포와 함께 배양하였다. 효과기 세포로서는 펩티드 활성화 PBMC 로부터의 CD8 양성 T 세포를 세포독성 활성 측정 실험 직전에 CD8 Positive Isolation Kit (Dynal, Oslo, Norway) 에 의해 단리하여 수득한 세포를 사용하였다. 특이적 ⁵¹Cr-방출은 본 실험에서 수득한 c.p.m.에서 자연 방출에 의한 c.p.m.을 공제하여 계산하였다. 효과기 세포없이 인큐베이션한 시료의 상청액으로부터 자연 방출을 결정하고, 이어서 시료를 1% Triton X (Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japan) 와 인큐베이션하여 전체 방출을 결정하였다.

유도된 HLA 구속성 CTL 의 HLA 타입 및 펩티드 특이성은, HLA 클래스-I 및 CD8 에 대한 단일클론 항체를 이용한 특이적 억제 실험 및 비표지 표적 세포를 사용한 콜드-타겟 (cold-target) 억제 실험에서, 각각 확인하였다. 이들 실험은 3 벌로 실시하여, 음성 대조군과 비교해 유의 수준 (P < 0.05) 에서 항체 또는 콜드 타겟 (동위원소로 표지되지 않은 표적 세포) 으로 억제가 관찰되지 않은 경우 양성인 것으로 간주하고, + 로 나타내었다.

결과

HLA-A2 결합성 펩티드

C35-44 (서열번호: 25) 는 HLA-A2402, A2601, A3101, A3303, 및 A1101 에 대해 HLA 구속성 CTL 유도 능력을 갖는 것으로 나타났다.

CypB-129 (서열번호: 15), Lck-422 (서열번호: 16), SART3-302 (서열번호: 9), UBE-43 (서열번호: 13), 및 WHSC2-103 (서열번호: 13) 는 HLA-A3101 에 대해 HLA 구속성 CTL 유도 능력을 갖는 것으로 나타났다.

HNRPL-501 (서열번호: 14) 및 ppMAPkkk-432 (서열번호: 11) 는 HLA-2601 에 대해 HLA 구속성 CTL 유도 능력을 갖는 것으로 나타났다.

HLA-A24 결합성 펩티드

SART3-109, Lck208, EGRF-800, 및 SART2-93 은 각각 HLA-A3101, A3303, 및 A1101 에 대해, HLA-A1101 에 대해, HLA-A0201 에 대해, 및 HLA-A0201 및 A0207 에 대해 HLA 구속성 CTL 유도 능력을 갖는 것이 확인되었다.

HLA-A3 결합성 펩티드

PAP-155, β-tubline-309, 및 Lck-90 은 각각 HLA-A0201 및 -A2402 에 대해, 및 HLA-A2402 에 대해 HLA 구속성 CTL 유도 능력을 갖는 것으로 나타났다. 이들 결과는 표 5 에 요약되어 있다.

[표 5-1]

[표 5-2]

상기 기술한 결과로부터 알 수 있듯이, 본 발명에 있어서 특정되는 서열번호: 1 내지 27 의 펩티드는 HLA-A2 양성 환자군, HLA-A24 양성 환자군, HLA-A26 양성 환자군, 및 HLA-A3 슈퍼타입 양성 환자군으로 이루어진 군에서 선택되는 둘 이상의 환자군의 환자들에 있어서 HLA 특이적 CTL 을 유도할 수 있고, 따라서 이러한 환자들의 치료 또는 예방에 적절히 사용된다. 본 발명의 서열번호: 1 내지 24 및 서열번호: 26 내지 27 의 펩티드는 암 펩티드 백신의 활성 성분으로서 특히 적절히 사용되며, 본 발명의 서열번호: 25 의 펩티드는 C형 간염 바이러스 관련 질환의 치료 또는 예방에 적절히 사용된다.

<110> KURUME UNIVERSITY <120> CTL Inducer Composition <130> 668587 <150> JP2007-241161 <151> 2007-09-18 <160> 38 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFR-800 peptide <400> 1 Asp Tyr Val Arg Glu His Lys Asp Asn Ile 1 5 10 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Lck-208 peptide <400> 2 His Tyr Thr Asn Ala Ser Asp Gly Leu 1 5 <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Lck-488 peptide <400> 3 Asp Tyr Leu Arg Ser Val Leu Glu Asp Phe 1 5 10 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MRP3-1293 peptide <400> 4 Asn Tyr Ser Val Arg Tyr Arg Pro Gly Leu 1 5 10 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PAP-213 peptide <400> 5 Leu Tyr Cys Glu Ser Val His Asn Phe 1 5 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PSA-248 peptide <400> 6 His Tyr Arg Lys Trp Ile Lys Asp Thr Ile 1 5 10 <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SART2-93 peptide <400> 7 Asp Tyr Ser Ala Arg Trp Asn Glu Ile 1 5 <210> 8 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SART3-109 peptide <400> 8 Val Tyr Asp Tyr Asn Cys His Val Asp Leu 1 5 10 <210> 9 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SART3-302 peptide <400> 9 Leu Leu Gln Ala Glu Ala Pro Arg Leu 1 5 <210> 10 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Lck-246 peptide <400> 10 Lys Leu Val Glu Arg Leu Gly Ala Ala 1 5 <210> 11 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ppMAPkkk-432 peptide <400> 11 Asp Leu Leu Ser His Ala Phe Phe Ala 1 5 <210> 12 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> WHSC2-103 peptide <400> 12 Ala Ser Leu Asp Ser Asp Pro Trp Val 1 5 <210> 13 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> UBE-43 peptide <400> 13 Arg Leu Gln Glu Trp Cys Ser Val Ile 1 5 <210> 14 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HNRPL-501 peptide <400> 14 Asn Val Leu His Phe Phe Asn Ala Pro Leu 1 5 10 <210> 15 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CypB-129 peptide <400> 15 Lys Leu Lys His Tyr Gly Pro Gly Trp Val 1 5 10 <210> 16 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Lck-422 peptide <400> 16 Asp Val Trp Ser Phe Gly Ile Leu Leu 1 5 <210> 17 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Lck-449 peptide <400> 17 Val Ile Gln Asn Leu Glu Arg Gly Tyr Arg 1 5 10 <210> 18 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-tubulin 5-154 peptide <400> 18 Lys Ile Arg Glu Glu Tyr Pro Asp Arg 1 5 <210> 19 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Lck-90 peptide <400> 19 Ile Leu Glu Gln Ser Gly Glu Trp Trp Lys 1 5 10 <210> 20 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PSA-16 peptide <400> 20 Gly Ala Ala Pro Leu Ile Leu Ser Arg 1 5 <210> 21 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PAP-248 peptide <400> 21 Gly Ile His Lys Gln Lys Glu Lys Ser Arg 1 5 10 <210> 22 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IEX1-47 peptide <400> 22 Ala Pro Ala Gly Arg Pro Ser Ala Ser Arg 1 5 10 <210> 23 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SART3-511 peptide <400> 23 Trp Leu Glu Tyr Tyr Asn Leu Glu Arg 1 5 <210> 24 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SART3-734 peptide <400> 24 Gln Ile Arg Pro Ile Phe Ser Asn Arg 1 5 <210> 25 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C35-44 peptide <400> 25 Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu 1 5 10 <210> 26 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PAP-155 protein <400> 26 Tyr Leu Pro Phe Arg Asn Cys Pro Arg 1 5 <210> 27 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Beta-tubline 309 peptide <400> 27 Lys Ile Arg Glu Glu Tyr Pro Asp Arg 1 5 <210> 28 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MRP503 peptide <400> 28 Leu Tyr Ala Trp Glu Pro Ser Phe Leu 1 5 <210> 29 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PSM624 peptide <400> 29 Thr Tyr Ser Val Ser Phe Asp Ser Leu 1 5 <210> 30 <211> 9 <212> PRT <213> PAP 213 peptide <400> 30 Leu Tyr Cys Glu Ser Val His Asn Phe 1 5 <210> 31 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SART2 161 peptide <400> 31 Ala Tyr Asp Phe Leu Tyr Asn Tyr Leu 1 5 <210> 32 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Lck 486 peptide <400> 32 Thr Phe Asp Tyr Leu Arg Ser Val Leu 1 5 <210> 33 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCk 450 peptide <400> 33 Ile Gln Asn Leu Glu Arg Gly Tyr Arg 1 5 <210> 34 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CGI 37 peptide <400> 34 Lys Phe Thr Lys Thr His Lys Phe Arg 1 5 <210> 35 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Gag 77-85 peptide <400> 35 Ser Leu Tyr Asn Thr Val Ala Thr Leu 1 5 <210> 36 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> env-GP peptide <400> 36 Arg Tyr Leu Arg Asp Gln Gln Leu Leu 1 5 <210> 37 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HIV-Gag167-175 peptide <400> 37 Glu Val Ile Pro Met Phe Ser Ala Leu 1 5 <210> 38 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MRP503 peptide <400> 38 Arg Leu Arg Asp Leu Leu Leu Ile Val Thr Arg 1 5 10

Claims

HNRPL-501 (서열번호: 14) 를 포함하고, HLA-A3 슈퍼타입 양성 환자군에서 암의 치료 또는 예방에 사용되는 세포독성 T 림프구(CTL) 유도제 조성물.
HNRPL-501 (서열번호: 14) 를 포함하고, HLA-A24 양성 환자군에서 암의 치료 또는 예방에 사용되는 CTL 유도제 조성물.
HNRPL-501 (서열번호: 14) 를 포함하고, HLA-A26 양성 환자군에서 암의 치료 또는 예방에 사용되는 CTL 유도제 조성물.