JP6900610B2 - ＨＬＡ−Ａ２４分子に結合でき、かつ細胞性免疫に認識されるＨＩＦ−１α由来ペプチド、及びそれを含む腎細胞癌ワクチン - Google Patents

Description

本発明は、癌疾患とりわけ腎細胞癌の予防又は治療のための有効成分として好適でそれの細胞性免疫に認識されるペプチド、それをコードする核酸分子及びそれのベクター、癌疾患とりわけ腎細胞癌の予防又は治療に用いられる医薬製剤、並びに前記ペプチドとヒト白血球抗原−Ａ２４との複合体を細胞表面に提示した抗原提示細胞又は腎性細胞癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞が含有された生物製剤に関するものである。

より具体的には、本発明はＨＬＡ−Ａ２４陽性腎細胞癌患者の処置又は予防に有用な、ＨＬＡ−Ａ２４分子に結合でき、かつ細胞性免疫に認識されるＨＩＦ−１α由来ペプチド、及びそれを含む腎細胞癌ワクチン等の医薬製剤に関するものである。

腎細胞癌（renal cell carcinoma：以下、ＲＣＣともいう）は、高齢者ほど罹患し易く、尿細管の細胞が癌化したものであり、初期段階で特徴的な症状が認められ難いので、しばしば転移してから他の疾患の精密検査のときに偶然に見つかる。

転移性腎細胞癌（metastatic RCC：以下、ｍＲＣＣともいう）の治療方法として、癌原発巣の摘出治療法や化学療法や放射線療法のような汎用の癌治療法のほか、癌の血管新生を目的とする分子治療法が、一般的になってきている。しかし、これらの治療方法では、ある程度の抗癌効果があるにも関わらず、十分な治療効果が得られないので完治に至らない。そのため、癌の進行に応じ、免疫療法などの他の治療方法と併用することが、不可欠となっている。インターロイキン（以下、ＩＬともいう）−２のようなＩＬ類やインターフェロン（以下、ＩＦＮともいう）−αのようなＩＦＮ類などのサイトカインを用いた免疫療法が、これら転移性腎細胞癌患者に施されているが、依然として限定的な治療効果しか得られていない。

このような状況下、腎細胞癌関連抗原と、ヒト白血球抗原（human leukocyte antigen：以下、ＨＬＡともいう）クラスＩ制限性及び腎細胞癌反応性の細胞傷害性Ｔ細胞（細胞傷害性Ｔリンパ球：cytotoxic T lymphocytes：以下、ＣＴＬｓともいう）を誘導する可能性があるそれらのペプチドは、今までに幾つか同定されており、既に臨床試験に用いられている。これらの抗原のうち、カルボニックアンヒドラーゼ９（以下、ＣＡ９ともいう）は、全腎細胞癌タイプの略９０％で過剰発現しているので、癌ワクチン候補として注目を集めている。本発明者らは、非特許文献１及び２で、腎細胞癌に対するペプチドワクチンとして、ＣＡ９抗原由来ペプチド、血管内皮細胞増殖因子受容体（vascular endothelial growth factor receptor 1：以下、ＶＥＧＦＲ１ともいう）由来ペプチドを、提案している。さらに、腎癌に対して、そのペプチドを用いたワクチン開発に着手し、そのペプチドワクチンであるＣＡ９ワクチン及びＶＥＧＦＲ１ワクチンを利用した臨床研究を行い、その安全性、有用性について報告している。

これらペプチドワクチンによるワクチン療法の臨床経験から、個々の患者の免疫状態の多様性と治療ターゲットである癌の多様性との所為で、癌反応性の細胞傷害性Ｔ細胞反応などの免疫応答が多彩であること、一旦有効であっても免疫逃避又は寛容により無効になる症例があることが、明らかとなった。ワクチン接種された腎細胞癌患者の一部にのみ臨床効果が認められ、限定的であるが臨床症例での有効性を示したが、このワクチン療法のような治療方法は、さらに改良が必要であることが、示唆された。

このような現状を鑑みると、１つの決まった抗原をターゲットにするのではなく、腎癌の発生、分化、増殖に立脚した複数の分子をターゲットにし、それぞれ異なった性質の癌を担癌した宿主に合ったテーラーメイドワクチン療法のような治療方法が求められている。

現に、本発明者等は、エリスロポエチン（以下、Ｅｐｏと略すことあり）とエリスロポエチン受容体（以下、ＥｐｏＲと略すことあり）との反応をペプチドの投与で遮断することによって、癌細胞の生存における最重要因子である酸素を断つことで死滅させる治療法に有用なＥｐｏＲ由来ペプチドを見出しており（特許文献１）、テーラーメイドワクチン療法に一歩前進した。

このように、テーラーメイドワクチン療法の普及を目指して、腎細胞癌患者に対する癌ワクチン療法に有用なペプチドの更なる開発が強く求められている。

H Uemura, K Fujimoto, M Tanaka, et al.、 "A phase I trial of vaccination of CA9-derived peptides for HLA-A24-positive patients with cytokine-refractory metastatic renal cell carcinoma."、Clinical Cancer Research、 2006;12(6) March 15、 2006、 p.1768-1775 K Yoshimura, T Minami, M Nozawa, H Uemura、 "Phase I clinical trial of human vascular endothelial growth factor receptor 1 peptide vaccines for patients with metastatic renal cell carcinoma."、British Journal of Cancer、 (2013) 108、 p.1260-1266

特開２０１５−１３６２９３号

本発明者らは、ＨＬＡ−Ａ２４陽性（陽性を「^＋」と表記することもある）腎性細胞癌患者のための抗癌ワクチンとして適用可能なＨＩＦ−１α（低酸素誘導因子（Hypoxia Inducible Factor）-1α）由来ペプチド（腫瘍の悪性化及び治療抵抗性に関与する低酸素誘導因子の酸素依存的分解に関与するペプチド）を探索して、活性の強いペプチドを見出し、その有効性を検討して、本発明を完成させた。

本発明は前記の課題を解決するためになされたもので、ＨＩＦ−１α由来ペプチドやそれの改変ペプチドであってＨＬＡ−Ａ２４分子に結合し細胞性免疫に認識され簡便に調製でき腎性細胞癌のような癌疾患の治療や予防に有用なペプチド、それをコードする核酸分子及びそれのベクター及びその形質変換体、腎細胞癌等の癌疾患の予防用又は治療用の医薬製剤、並びに前記ペプチドとヒトＨＬＡ−Ａ２４との複合体を細胞表面に提示した抗原提示細胞又は腎性細胞癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞が含有された腎細胞癌予防用又は治療用の生物製剤を提供することを目的とする。

前記の目的を達成するためになされたペプチドは、ＨＩＦ−１α_{２７８−２８７}に示すアミノ酸配列からなるペプチド、及びＨＩＦ−１α_{２７８−２８７}に示すアミノ酸配列において１又は２個のアミノ酸置換、欠失、及び／又は付加が導入されたアミノ酸配列からなり、かつＨＩＦ−１α_{２７８−２８７}に示すアミノ酸配列からなるペプチドと機能的に同等の性質を有するその誘導体である。即ち、本発明のペプチドは、三文字表記で示している配列表の配列番号５のアミノ酸配列（一文字表記ではＹＹＨＡＬＤＳＤＨＬ：ＨＩＦ−１αの２７８〜２８７番目のアミノ酸配列に相当）と、それらの配列のうち１個又は２個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加した改変アミノ酸配列との何れかで示される骨格からなり、細胞性免疫に認識されるものである。

このペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２４分子に結合して、例えば腎細胞癌の前記細胞性免疫に認識されるものである。

また、このペプチドは、プログラム死リガンド１誘導ペプチドとして機能するものである。

本発明のために、前記ペプチドをコードする塩基配列を有する核酸分子を用いてもよい。

また、前記核酸分子が、組み込まれているベクターを用いてもよい。

また、前記ベクターが宿主細胞に導入されて成る形質転換体を用いてもよい。

本発明の医薬製剤は、配列番号５のアミノ酸配列と、それらの配列のうち１個又は２個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加した改変アミノ酸配列との少なくとも何れかで示されるペプチドを有効成分として含有するものである。

この医薬製剤は、腎細胞癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞への誘導剤として用いられてもよい。

また、この医薬製剤は、ＣＤ８陽性Ｔ細胞への誘導剤として用いられてもよい。

さらに、この医薬製剤は、ＨＬＡ−Ａ２４陽性腎細胞癌の治療薬又は予防薬として用いられてもよい。

この医薬製剤は、前記有効成分が、前記ペプチドであることによって、癌ワクチンとして用いられてもよい。

本発明の抗原提示細胞は、配列番号５のアミノ酸配列と、それらの配列のうち１個又は２個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加した改変アミノ酸配列との少なくとも何れかで示されるペプチドを、ＨＬＡ−Ａ２４陽性の腎細胞癌の患者から採取された抗原提示能を有する細胞に導入して誘導し、前記ペプチドとＨＬＡ−Ａ２４との複合体を細胞表面に提示したものである。

本発明の腎細胞癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞は、配列番号５のアミノ酸配列と、それらの配列のうち１個又は２個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加した改変アミノ酸配列との少なくとも何れかで示されるペプチドを、ＨＬＡ−Ａ２４陽性の腎細胞癌の患者から採取された末梢血単核細胞に、接触させて誘導したものである。

本発明の生物製剤は、配列番号５のアミノ酸配列と、それらの配列のうち１個又は２個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加した改変アミノ酸配列との少なくとも何れかで示されるペプチドを、ＨＬＡ−Ａ２４陽性の腎細胞癌の患者から採取された末梢血単核細胞に、導入させて誘導し、前記ペプチドとＨＬＡ−Ａ２４との複合体を細胞表面に提示した抗原提示細胞からなる誘導細胞と、前記ペプチドを、前記採取細胞に、接触させて誘導した腎細胞癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞からなる誘導細胞とから選ばれる少なくとも何れかの誘導細胞が、含有されているものである。

本発明のペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２４アレルに結合できそれにより癌患者とりわけＨＬＡ−Ａ２４陽性腎細胞癌患者の細胞性免疫に認識されるので、癌疾患とりわけ腎細胞癌の治療や予防に有用である。このペプチドによれば、ＨＬＡ拘束性に腎細胞癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞を誘導することができる。このペプチドは、生体に存するＨＩＦ−１αに由来し又はその骨格に基づいて改変し又は誘導されたもので、生体内での所望のバインドサイトに結合し作用効果を発現するものであるから、副作用が少なくて信頼性が高く、安全である。

このペプチドの配列を利用し、それをコードする核酸分子及びそれのベクター及びその形質変換体を作製して、ペプチドを生体外で製造したり生体内で産生したりするのに用いることができる。

また、このペプチドやそれをコードする核酸分子を利用して、腎細胞癌の予防用又は治療用の医薬製剤、例えば腎細胞癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞への誘導剤、ＣＤ８陽性Ｔ細胞への誘導剤、ＨＬＡ−Ａ２４陽性腎細胞癌の治療薬又は予防薬、癌ワクチンとして、癌治療、とりわけＨＬＡ−Ａ２４陽性腎細胞癌治療に供することができる。

さらにこのペプチドとヒトＨＬＡ−Ａ２４との複合体を細胞表面に提示した抗原提示細胞又は腎性細胞癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞が含有された腎細胞癌予防用又は治療用の生物製剤を調製したりして、ＨＬＡ−Ａ２４陽性腎細胞癌患者の治療に役立てることができる。

これら本発明により、ＨＬＡ−Ａ２４陽性腎細胞癌患者に対するペプチド基盤免疫療法、特に癌ワクチン療法の選択肢が広がった。本発明により、現在までいくつかの癌ワクチン候補ペプチドが同定されているＨＬＡ−Ａ２４陽性腎細胞癌患者の治療において、癌増殖に関与しているＨＩＦ−１αをターゲットに加えることにより、さらなる治療効果の向上に寄与することが期待される。

図１は、本発明を適用するＲＣＣ（腎細胞癌）細胞株中でのＨＩＦ−１αの発現を示す。 同図１Ａは、ＲＣＣ癌細胞株及びＬＮＣａＰ（ヒト前立腺癌）細胞株をＤＦＯ（デフェロキサミン）の存在又は非存在下に２４時間培養し、全細胞溶解物中でのＨＩＦ−１αの発現を免疫ブロッティングによって試験した結果を示す。β−アクチンは対照例である。 同図１Ｂは、ＫＰＫ−１３、ＫＫ−ＲＣＣ６及びＬＮＣａＰ細胞株を正常酸素下（２０％Ｏ_２）又は低酸素下（１％Ｏ_２）で２４時間培養し、全細胞溶解物中及び核酸抽出物中でのＨＩＦ−１αの発現を免疫ブロッティングによって試験した結果を示す。β−アクチン及びＥ２Ｆ−１は対照例である。 同図１Ｃは、フローサイトメトリーで分析したＨＬＡ−Ａ２４分子の細胞表面発現を示す。白抜きは抗ＨＬＡ−Ａ２４モノクローナル抗体を用いずに染色した結果を示す。 図２は、本発明を適用するＨＩＦ−１α由来ペプチドで刺激されたＨＬＡ−Ａ２４^＋腎細胞癌患者からのＣＴＬ（細胞傷害性Ｔ細胞）の細胞傷害性を示す。 同図２Ａは、患者＃５のペプチドで刺激された末梢血単核球細胞が、ターゲットに対するその細胞傷害性を５時間の^５１Ｃｒ放出アッセイで分析された結果を示す。これらのペプチドで刺激された末梢血単核球細胞はまた、ＫＰＫ−１３細胞に対する細胞傷害性を指定されたコールドターゲット細胞の存在又は非存在下で、ペプチド特異的細胞障害で試験された。 図２Ｂは同様に、ＨＬＡ−Ａ２４^＋患者（＃１５）のペプチドで刺激されたＰＢＭＣ（末梢血単核球）からのＣＤ８^＋Ｔ細胞がその細胞傷害性の観点で試験された結果を示す。これらのペプチドで刺激された末梢血単核球細胞はまた、ＫＰＫ−１３細胞に対する細胞傷害性を指定されたコールドターゲット細胞の存在又は非存在下で、ペプチド特異的細胞障害で試験された。

以下、本発明を実施するための形態を詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらの形態に限定されるものではない。

〔本発明のペプチド〕
本発明を適用するペプチドの詳細は、以下の通りである。

本発明の好ましい形態のペプチドは、ＨＩＦ−１α由来ペプチドであり、配列表の配列番号５のアミノ酸配列で示されるもので、細胞性免疫に認識されるものである。このペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２４アレルに結合できるものである。

「細胞性免疫に認識される」とは、ペプチドが特異的な細胞傷害性Ｔ細胞に認識されること、即ち、ペプチド特異的細胞傷害性Ｔ細胞を誘導することができることを意味する。「ペプチドがＨＬＡ−Ａ２４分子に結合できる」とは、ペプチドがＨＬＡ−Ａ２４分子と複合体を形成し細胞表面に提示され得ることを意味する。

配列番号５のアミノ酸配列で示されるペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２４陽性腎細胞癌患者に対する新たな、ＨＩＦ−１αペプチド候補としてスクリーニングされたものである。そのスクリーニングの結果、ＨＬＡ−Ａ２４陽性腎細胞癌患者の末梢血単核細胞（以下、ＰＢＭＣｓともいう）からペプチド特異的で腎細胞癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞を誘導する可能性を有する、ＨＩＦ−１αペプチドであるＨＩＦ−１α_{２７８−２８７}（一文字表記でＹＹＨＡＬＤＳＤＨＬ：配列番号５）を同定した。このペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２４分子に結合するアミノ酸予測モチーフ、即ち、Ｎ末端側から第二位配列位置でのアミノ酸残基がＹ残基であり、Ｎ末端側から第十位配列位置若しくはＣ末端配列位置でのアミノ酸残基がＬ残基であると極めて相性が良い。

このことから、これらＨＩＦ−１α由来ペプチドが、ＨＬＡ−Ａ２４陽性腎細胞癌患者に対するペプチド由来抗癌ワクチンの有効成分として、応用可能である。

ＨＩＦ−１αは、腎細胞癌を含む幾つかのタイプの癌に発現するので、この分子が癌免疫療法の有益なターゲットとなり得る。実際、ＨＩＦ−１α由来ペプチドのうちＨＩＦ−１α_{２７８−２８７}（配列番号５）は、様々なタイプの癌にも有効であることが示唆され、とりわけ腎細胞癌に有効である。

配列番号５のアミノ酸配列で示されるＨＩＦ−１α由来ペプチドは、数多のペプチドの中から、ペプチドワクチン療法に用いることができるように、ＨＬＡ−Ａ２４陽性腎細胞癌患者に対する癌ワクチン療法に有用なＨＩＦ−１α由来ペプチドとして、具体的には、以下のようにして選択され、同定された。

一般に、ＨＬＡ−Ａ２４分子に結合するペプチドは、ＨＬＡの型に依存する規則性ある特有のアミノ酸配列を有することが知られている。このような規則性ある特有のアミノ酸配列は、結合モチーフと呼ばれる。ＨＬＡ−Ａ２４分子に対し、任意のペプチドが結合できるか否かは、例えば、ウェブサイトＢＩＭＡＳ(Bioinformatics and Molecular Analysis Section、 Computational Bioscience and Engineering Laboratory、 Division of Computer Research & Technology、 NIH、http://www-bimas.cit.nih.gov/)を用いたコンピュータ解析により予測することができる。

ペプチド特異的細胞傷害性Ｔ細胞を誘導することができるか否かを確認する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。例えば、ＨＬＡ−Ａ２４陽性腎細胞癌患者から採取した血液から、末梢血単核細胞を取り出し、ペプチドで刺激した末梢血単核細胞が、このペプチドをパルスした抗原提示細胞に反応してＩＦＮ−γなどのサイトカインを産生するか否かを測定することにより確認する方法などが挙げられる。このサイトカインを測定する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、酵素結合免疫吸着測定法（Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay：ＥＬＩＳＡ）などで測定することができる。

また、誘導された細胞傷害性Ｔ細胞の細胞傷害活性を確認する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、^５１Ｃｒ放出試験により確認する方法などが挙げられる。

本発明のペプチドは、配列番号５のアミノ酸配列で示されるＨＩＦ−１α由来ペプチドであることが好ましいが、それらの配列のうち１個又は２個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加した改変アミノ酸配列との何れかで示される骨格からなり、細胞性免疫に認識され、ＨＬＡ−Ａ２４アレルに結合できるＨＩＦ−１α由来ペプチドの誘導体であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。

１個又は２個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加する位置としては、特に制限がなく、目的に応じて適宜選択することができる。

前記置換としては、ペプチドの性質を変化させない点で、同族アミノ酸の間で置換することが好ましい。同族アミノ酸は、例えば、極性アミノ酸、非極性アミノ酸、疎水性アミノ酸、親水性アミノ酸、陽性荷電アミノ酸、陰性荷電アミノ酸、芳香族アミノ酸などの観点で、適宜選択することができる。

前記ペプチドを構成するための置換又は付加するアミノ酸は、天然のアミノ酸であってもよく、アミノ酸アナログであってもよい。即ち、前記ペプチド骨格を有し細胞性免疫に認識されるという効果を損なわない限り、アミノ酸アナログによって、アミノ基やカルボキシル基等の官能基が修飾又は保護されていてもよい。アミノ酸アナログとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、アミノ酸のＮ−アシル化物、Ｏ−アシル化物、エステル化物、酸アミド化物、アルキル化物などが挙げられる。例えば、Ｎ末端や遊離のアミノ基にホルミル基、アセチル基、ｔ−ブトキシカルボニル基等を結合するものや、Ｃ末端や遊離のカルボキシル基にメチル基、エチル基、ｔ−ブチル基、ベンジル基等を結合したものなどが挙げられる。

前記ペプチドは、細胞性免疫と液性免疫の両方に認識されるペプチドであることが好ましい。このペプチドは、免疫原性が高く、細胞傷害性Ｔ細胞誘導能、とりわけ腎性細胞癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞誘導能に優れると期待される点で、液性免疫にも認識されることが好ましい。「液性免疫に認識される」とは、ペプチドに特異的な免疫グロブリン（Ｉｇ）Ｇが生体内に存在する、即ち、ペプチド特異的ＩｇＧが血漿から検出されることをいう。血漿中の特異的ＩｇＧを測定する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＥＬＩＳＡなどで測定することができる。

さらに、前記ペプチドは、前記ペプチドとＨＬＡ−Ａ２４との複合体を細胞表面に提示した抗原提示細胞誘導能にも優れている。そのため、癌ワクチン、とりわけＨＬＡ−Ａ２４陽性腎性細胞癌ワクチンの有効成分として、有用である。

前記ペプチドの製造方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができる。例えば、アミノ酸のアミノ保護基（Fmoc基：9-fluorenylmethyloxycarbonyl基）を用いるＦｍｏｃ法によるペプチド固相合成法、バッチ式で保護アミノ酸同士を縮合剤でカップリングしていくペプチド液相合成法、それらを利用した市販の自動ペプチド合成装置を用いた合成法などが、挙げられる。

前記ペプチドは、そのアミノ酸配列を含むポリペプチドが細胞内で断片化されることで生じるものであってもよい。前記ポリペプチドとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。

前記ペプチドは、癌増殖やプログラム死１に関与するとされるＨＩＦ−１α由来ペプチドであり、ＨＬＡ−Ａ２４分子に結合でき、かつ細胞性免疫に認識されるので、例えば、ＨＬＡ−Ａ２４分子陽性腎細胞癌患者の癌ワクチン療法に好適に用いることができる。このペプチドは、プログラム死リガンド１誘導ペプチドである。

〔本発明の核酸分子〕
本発明を適用する核酸分子の詳細は、以下の通りである。

その核酸分子は、核酸分子としては、配列番号５の前記ペプチドをコードする塩基配列からなるものであれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。前記ペプチドをコードする本発明の核酸分子により、生体内で産生されるものであってもよい。

この核酸分子は、形質変換体を形成するためのベクターに好適に利用可能である。

この核酸分子は、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができる。例えば、ホスホロアミダイト法を利用した市販の核酸合成装置を用いた化学的合成法や、ポリメラーゼによる複製や転写反応を利用した酵素的合成法などが、挙げられる。

〔本発明のベクター〕
本発明を適用するベクターの詳細は、以下の通りである。

本発明のベクターは、配列番号５のペプチドをコードする核酸分子を少なくとも組み込んで含み、必要に応じて更にその他の要素を含む。

前記ベクターとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、プラスミド、ウイルスベクターなどが挙げられる。前記ウイルスベクターの具体例としては、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクターなどが挙げられる。

前記ベクターの調製方法としては、特に制限はなく、遺伝子組み換えなどの公知の方法を適宜選択して調製することができる。

〔本発明の形質転換体〕
本発明を適用する形質転換体の詳細は、以下の通りである。

前記ベクターは、抗原提示細胞のような宿主細胞に導入されると、前記ペプチドを発現する。そして、前記抗原提示細胞は、前記ペプチドと、ＨＬＡ−Ａ２４分子との複合体を細胞表面に提示する。前記抗原提示細胞は、ペプチド特異的に腎細胞癌細胞を傷害する細胞傷害性Ｔ細胞を効率的に増殖させることができる。

前記ペプチドや前記ベクターは、腎細胞癌の予防又は治療用医薬製剤や、抗原提示細胞又は腎性細胞癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞へと誘導された誘導細胞を含有する生物製剤に、好適に利用可能である。

〔本発明の医薬製剤〕
本発明を適用する医薬製剤の詳細は、以下の通りである。

この医薬製剤は、癌、とりわけ腎細胞癌の予防用又は治療用医薬組成物であり、前記ペプチド、前記核酸分子、及び前記ベクターの少なくとも何れかを含み、必要に応じて更にその他の添加成分を含む。

この医薬製剤における前記ペプチド、前記核酸分子、及び前記ベクターの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。この医薬製剤中、前記ペプチド、及び前記ベクターの何れかの有効成分のみからなるものであってもよい。この医薬製剤中、前記ペプチド、前記核酸分子、及び前記ベクターは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。また、前記ペプチド、及び前記ベクターのそれぞれについても、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。

前記医薬製剤における、前記添加成分としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、医薬上許容され得る担体などが挙げられる。前記添加成分は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。前記担体の具体例としては、セルロース、重合アミノ酸、アルブミンなどが挙げられる。前記添加成分の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。

この医薬製剤は、他の有効成分を共存させた態様で使用されてもよい。また、この医薬製剤は、他の成分を有効成分とする医薬中に、配合された状態で使用されてもよい。

腎細胞癌患者の細胞傷害性Ｔ細胞は、様々な癌抗原ペプチドを認識する細胞の集合であるため、前記医薬製剤は、例えば、ＣＡ９抗原由来ペプチド、ＶＥＧＦＲ１由来ペプチドと組み合わせて使用してもよい。

この医薬製剤の剤形としては、特に制限はなく、公知の剤形を適宜選択することができ、例えば、固形剤、半固形剤、液剤などが挙げられる。これらの剤形の医薬製剤は、常法に従い製造することができる。

この医薬製剤は、癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞、とりわけ腎細胞癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞への誘導剤として、又はＣＤ８陽性Ｔ細胞への誘導剤として、癌の予防・治療に用いてもよい。

この医薬製剤は、癌ワクチンとして使用することが好ましい。

この医薬製剤は、癌とりわけ腎細胞癌の予防又は治療用として、その投与方法、投与量、投与時期、投与間隔、及び投与対象に、特段制限がなく、目的に応じて適宜選択することができる。

この医薬製剤は、免疫応答が効果的に成立するように、従来からワクチン投与に用いられることが知られているアジュバントとともに投与することが好ましく、投与方法としては、例えば、皮内投与、皮下投与などが挙げられる。

前記投与量としては、特に制限はなく、投与対象の個体の疾患の状態、年齢、体重、体質、他の成分を有効成分とする医薬製剤の投与の有無などを考慮して適宜選択することができる。

この医薬製剤が、前記ペプチドを含む場合の投与量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ペプチド量として、０．０００１ｍｇ〜１，０００ｍｇで例示される。

この医薬製剤が、前記核酸分子又は前記ベクターを含む場合の投与量としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＤＮＡ量として、０．１μｇ〜１００ｍｇなどが挙げられる。投与方法としては、静脈注射、皮下投与、皮内投与などが挙げられる。

前記投与時期、及び投与間隔としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、単回投与してもよく、数日おきに１回、数週から数ヶ月に１回、１年間〜３年間継続して投与するなどが挙げられる。

前記投与対象としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒトが挙げられる。

〔本発明の抗原提示細胞〕
本発明を適用する抗原提示細胞の詳細は、以下の通りである。

この抗原提示細胞は、前記ペプチド、及び／又は前記ベクターを、ＨＬＡ−Ａ２４陽性の腎性細胞癌の患者から採取された抗原提示能を有する細胞に、in vitroで導入して誘導したもので、前記ペプチドとＨＬＡ−Ａ２４との複合体を細胞表面に提示したものである。

なお、前記ペプチドを有する前記医薬製剤を、患者、とりわけ腎性細胞癌患者に投与して、前記ペプチドとＨＬＡ−Ａ２４との複合体を細胞表面に提示するように、抗原提示細胞を誘導する治療法として、用いてもよい。

〔抗原提示細胞の誘導方法〕
前記抗原提示細胞を誘導する方法は、前記ペプチド、及び／又は前記ベクターを、ＨＬＡ−Ａ２４陽性の腎性細胞癌の患者から採取された抗原提示能を有する細胞に、接触工程により接触させて、前記ペプチドとＨＬＡ−Ａ２４との複合体を細胞表面に提示するというものである。前記抗原提示細胞を誘導する方法は、例えば、接触工程により、及びペプチド及び／又は前記ベクターを導入する工程を少なくとも含み、必要に応じて更にその他の工程を含む。より具体的には、その接触工程は、採取された抗原提示能を有する細胞に、in vitroで、直に接触させてもよく、遺伝子導入して接触させてもよく、前記ペプチドの存在下でその細胞を培養してもよい。その接触工程により、抗原提示細胞へと誘導される。この方法は、接触工程を少なくとも含み、必要に応じて更にその他の工程を含んでいてもよい。その他の工程としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。

前記接触工程により調製された、前記ペプチドとＨＬＡ−Ａ２４分子との複合体を細胞表面に提示する抗原提示細胞は、ＨＬＡ−Ａ２４分子陽性腎細胞癌細胞を傷害する細胞傷害性Ｔ細胞を誘導し得る。

前記抗原提示細胞を誘導する方法には、前記ペプチドのみを有効成分とし、又はさらに必要に応じて他の成分を含んでいる抗原提示細胞誘導剤が医薬製剤として、用いられる。前記抗原提示細胞を誘導する方法には、前記ベクターのみを有効成分とし、又はさらに必要に応じて他の成分を含んでいる抗原提示細胞誘導剤が医薬製剤として、用いられてもよい。

前記抗原提示細胞を誘導する方法中、前記ペプチド及び前記ベクターの少なくとも何れかを前記抗原提示能を有する細胞導入する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。

前記抗原提示細胞は、例えば、ＨＬＡ−Ａ２４分子陽性腎細胞癌患者由来の抗原提示能を有する細胞を前記ペプチドと共に培養することにより得られる。または、例えば、前記ベクターをＨＬＡ−Ａ２４分子陽性腎細胞癌患者由来の抗原提示能を有する細胞に導入し、前記ペプチドを発現させることにより得られる。

前記抗原提示能を有する細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、樹状細胞などが挙げられる。前記樹状細胞の調製方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、患者より採取した末梢血単核細胞から培養プレートに接着する細胞を分離し、その細胞をインターフェロン（ＩＬ）−４及び顆粒球単球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）の存在下で約１週間培養する方法などが挙げられる。

前記抗原提示細胞の調製方法で得られた抗原提示細胞は、例えば、末梢血単核細胞を採取した個体の体内に戻し、体内での腎細胞癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞の誘導を促進し、腎性細胞癌を抑制するために好適に用いることができる。

〔抗原提示細胞誘導剤〕
この抗原提示細胞誘導剤は、前記ペプチド及び／又は前記ベクターを少なくとも含み、必要に応じて更にその他の成分を含む。前記ペプチド、及び前記ベクターは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。また、前記ペプチド、及び前記ベクターのそれぞれについても、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。この抗原提示細胞誘導剤は、前記ペプチドと、ＨＬＡ−Ａ２４分子との複合体を細胞表面に提示する抗原提示細胞を調製するためのものである。

前記抗原提示細胞誘導剤における前記ペプチド、及び前記ベクターの少なくとも何れかの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。前記抗原提示細胞誘導剤は、前記ペプチド、及び前記ベクターの少なくとも何れかのみからなるものであってもよい。

前記抗原提示細胞誘導剤におけるその他の成分としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、培地、緩衝液などが挙げられる。前記その他の成分は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。前記抗原提示細胞誘導剤における前記その他の成分の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。

〔抗原提示細胞誘導用キット〕
前記抗原提示細胞の誘導方法は、抗原提示細胞誘導用キットを用いて行われてもよい。この抗原提示細胞誘導用キットは、前記ペプチドとＨＬＡ−Ａ２４分子との複合体を細胞表面に提示する抗原提示細胞を調製するための抗原提示細胞誘導用キットであって、前記腎細胞癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞誘導剤を少なくとも含み、必要に応じて更にその他の要素を含む前記その他の要素としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、培地、緩衝液などが挙げられる。前記その他の要素は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。前記抗原提示細胞誘導用キットは、上述した抗原提示細胞の調製方法に好適に用いることができる。

前記抗原提示細胞の誘導方法で得られた前記抗原提示細胞は、例えば、抗原提示能を有する細胞を採取した個体の体内に戻し、体内で前記抗原提示細胞によって腎細胞癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞の誘導を促進し、腎性細胞癌を抑制するために好適に用いることができる。

〔本発明の腎細胞癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞〕
本発明を適用する腎細胞癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞の詳細は、以下の通りである。

この腎性細胞癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞は、前記ペプチドを、ＨＬＡ−Ａ２４陽性の腎性細胞癌の患者から採取された末梢血単核細胞に、接触させて誘導したものである。

なお、前記ペプチドを有する前記医薬製剤を、患者、とりわけ腎性細胞癌患者に投与して、生体内の末梢血単核細胞に接触させて、腎性細胞癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞を誘導する治療法として、用いてもよい。

〔腎細胞癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞の誘導方法〕
前記腎細胞癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞を誘導する方法は、前記ペプチドを、ＨＬＡ−Ａ２４陽性の腎性細胞癌の患者から採取された末梢血単核細胞に、接触工程により接触させて、腎細胞癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するというものである。前記腎細胞癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞を誘導する方法は、例えば、その接触工程により、採取された末梢血単核細胞を有する細胞に、in vitroで、直に接触させてもよく、前記ペプチドの存在下で細胞を培養してもよい。その接触工程により、ＨＬＡ−Ａ２４分子陽性腎細胞癌細胞を傷害する細胞傷害性Ｔ細胞を誘導することができる。この方法は、接触工程を少なくとも含み、必要に応じて更にその他の工程を含んでいてもよい。その他の工程としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。

前記細胞傷害性Ｔ細胞が「腎細胞癌反応性」であるとは、前記細胞傷害性Ｔ細胞が、腎細胞癌細胞上の癌抗原ペプチドと、ＨＬＡ分子との複合体を認識し、その細胞を傷害する能力を有することをいう。

前記腎細胞癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞を誘導する方法には、前記ペプチドのみを有効成分とし、又はさらに必要に応じて他の成分を含んでいる腎細胞癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞誘導剤である医薬製剤が、用いられる。

得られた前記腎細胞癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞は、例えば、末梢血単核細胞を採取したＨＬＡ−Ａ２４陽性の腎細胞癌の個体の体内に戻し、腎細胞癌を抑制するために好適に用いることができる。

〔腎細胞癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞誘導剤〕
この腎細胞癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞誘導剤は、前記ペプチドを少なくとも含み、必要に応じて更にその他の成分を含む。前記ペプチドは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。

前記腎細胞癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞誘導剤における前記ペプチドの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。前記腎細胞癌反応性傷害性Ｔ細胞誘導剤は、前記ペプチドのみからなるものであってもよい。

前記腎細胞癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞誘導剤におけるその他の成分としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、培地、緩衝液などが挙げられる。前記その他の成分は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。前記腎細胞癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞誘導剤における前記その他の成分の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。

〔腎細胞癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞誘導用キット〕
前記腎細胞癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞の誘導方法は、腎細胞癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞誘導用キットを用いて行われてもよい。この腎細胞癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞誘導用キットは、前記腎細胞癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞誘導剤を少なくとも含み、必要に応じて更にその他の要素を含む。前記その他の要素としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、培地、緩衝液などが挙げられる。前記その他の要素は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。前記腎細胞癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞誘導用キットは、前記腎細胞癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞の誘導方法に好適に用いることができる。

前記腎細胞癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞の誘導方法で得られた腎細胞癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞は、例えば、末梢血単核細胞を採取した個体の体内に戻して腎細胞癌細胞を傷害する養子免疫療法に好適に用いることができる。

〔本発明の生物製剤〕
本発明を適用する生物製剤は、前記の抗原提示細胞及び／又は腎細胞癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞からなる誘導細胞を、含有するもので、患者、とりわけ腎細胞癌患者に投与して、癌予防や癌治療に用いられる。

〔本発明の医薬製剤・抗原提示細胞／腎性細胞癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞を含有する生物製剤を用いた癌の予防又は治療方法〕
前記ペプチド、前記核酸分子並びに前記ベクター、及びそれらのいずれかを含有する医薬製剤は、個体に投与することにより、個体における癌とりわけ腎細胞癌の発症を予防したり、腎細胞癌を患っている個体を治療したりすることができる。したがって、この医薬製剤を用いて癌とりわけ腎細胞癌を予防又は治療する方法は、個体に、前記ペプチド、及び前記ベクターの少なくともいずれかを、投与することにより行われる。

また、前記腎細胞癌の予防又は治療方法は、誘導して調製した前記腎細胞癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞や抗原提示細胞を含む生物製剤を、個体に投与することにより行ってもよい。

以下、本発明を適用する実施例について詳細に説明する。

（試験例１：ＨＩＦ−１α由来ペプチドの結合モチーフからの探索）
先ず、ペプチドワクチン療法の選択肢を増やすためにＨＬＡ−Ａ２４陽性腎細胞癌患者に対する癌ワクチン療法に有用なＨＩＦ−１α由来ペプチドを探索した。具体的には、ＨＩＦ−１α由来ペプチドであって、ＨＬＡ−Ａ２４分子に結合でき、かつ細胞性免疫に認識されるペプチドを探索した。

Parker KC, Bednarek MA, Coligan JE. “Scheme for ranking potential HLA-A2 binding peptides based on independent binding of individual peptide side-chains.”、Journal of Immunology 1994 (152), p.163-175、及びAbiko K, Mandai M, Hamanishi J, Yoshioka Y, Matsumura N, Baba T, et al. “PD-L1 on tumor cells is induced in ascites and promotes peritoneal dissemination of ovarian cancer through CTL dysfunction.”、Clinical Cancer Research 2012 (19), p.1363-1374の記載に準拠してＨＬＡ−Ａ２４アレルに対する結合モチーフに基づき、コンピュータ解析を行った。その概要を略記する。ＢＩＭＡＳを用いて、ＨＬＡクラスＩ分子から解離予測半減期に基づき計算された結合スコアを基準に、結合スコアの最も高い５種類のペプチドを選択した。結合スコアが高い程、コンピュータ解析上、結合モチーフに強く結合し活性を発現する可能性があると、予測される。その計算結果を表１に示す。

（試験例２：末梢血単核細胞から細胞傷害性Ｔ細胞の誘導）
表１の５種類のＨＩＦ−１α由来ペプチドが、ＨＬＡ−Ａ２４陽性腎細胞癌患者の末梢血単核細胞からペプチド特異的細胞傷害性Ｔ細胞を誘導できるかについて調べた。

〔患者と健常人との提供者からの試料〕
この試験のための末梢血単核細胞は、同意書を提出してもらった腎細胞癌患者と健常人との提供者から得た。提供者には、ＨＬＡ−Ａ２４陽性患者が含まれているが、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染者はいなかった。３０ｍｌの末梢血を採血し、末梢血単核細胞は、フィコール−コンライ密度勾配遠心分離法により、調製した。全試料は、使用するまで凍結保存した。この試験は、近畿大学の研究倫理審査委員会の承認を受けて行った。

〔細胞株〕
Ｃ１Ｒ−Ａ２４は、ＨＬＡ−Ａ^＊２４：０２遺伝子を安定に発現するＣ１Ｒリンパ腫亜系細胞株である。ＳＫＲＣ−１細胞、ＳＫＲＣ−４４細胞、ＳＫＲＣ−５２細胞は、全てＲＣＣ細胞株あり、愛知医科大学の吉川和宏博士から快く提供されたものである。ＫＰＫ−１３細胞、及びＫＫ−ＲＣＣ６細胞は、大分大学医学部の三股浩光博士及び香川大学医学系研究科の筧善行博士から、夫々快く提供されたものである。ＬＮＣａＰはヒト前立腺癌細胞株であり、ＬＮＣａＰ−Ａ２４はＨＬＡ−Ａ２４を発現している安定なトランスフェクタントである^(１)。全てのＲＣＣ細胞株は、清澄な細胞癌であり、ＲＰＭＩ １６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）中で培養した。
(1) Yao A, Harada M, Matsueda S, et al. Identification of parathyroid hormone-related protein-derived peptides immunogenic in human histocompatibility leukocyte antigen-A24⁺ prostate cancer patients. Brit J Cancer, 91: 287-296, 2004.

〔ペプチド〕
表１の５種類のペプチドを用いた。なお、エプスタイン・バー・ウイルス（ＥＢＶ）由来ペプチド（一文字表記でＴＹＧＰＶＦＭＳＬ：配列番号６）と、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）由来ペプチド（同表記ＲＹＬＲＤＱＱＬＬ：配列番号７）とを、ＨＬＡ−Ａ２４分子に結合した対照群ペプチドとして用いた。なお、表１の５種類のペプチドと対照群ペプチドとの全ペプチドは、夫々、ユーロフィンジェノミクス株式会社で作製したものを購入し、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解して１０ｍｇ／ｍｌ溶液として用いた。

〔末梢血単核細胞からのペプチド特異的細胞傷害性Ｔ細胞の誘導方法〕
ＨＬＡ−Ａ２４分子に対する結合モチーフに基づいて作製した表１中の５種のＨＩＦ−１α由来ペプチドのうち何れが、ＨＬＡ−Ａ２４陽性腎細胞癌患者から採取した末梢血単核細胞からペプチド特異的細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するか測定した。被験ペプチドとしてこれら５種類のＨＩＦ−１α由来ペプチド及び対照ペプチドとしてＥＢＶ由来ペプチドを用いたペプチド特異的細胞傷害性Ｔ細胞の検出方法は、Brahmer JR, Tykodi SS, Chow LQM, Hwu WJ, Topalian SL, Hwu P, et al. “Safety and activity of anti-PD-L1 antibody in patients with advanced cancer.”、The New England Journal of Medicine, 2012 (366), p.2455-2464に準拠しつつ次のように改良して行った。

Ｕ底型の９６ウェル（穴）マイクロ培養プレート（Ｎｕｎｃ社製）中で、末梢血単核細胞（５×１０^４細胞／ウェル）を各ＨＩＦ−１α由来ペプチドの１０μｇ／ｍｌと共に、１００μｌ培養培地中で、インキュベートした。培養培地は、４５％ ＲＰＭＩ １６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、４５％ ＡＩＭ−Ｖ培地（Ｇｉｂｃｏ社製）、１０％ウシ胎児血清、ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（ＧｉｂｃｏＢＲＬ社製）の１００倍希釈液、及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンからなる。８ウェルを各ペプチド用とした。培養開始の翌日に、５０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を含む培養培地１００μｌを添加した。培養８日目に、１００μｌの培地を取り去り、対応するＨＩＦ−１α由来ペプチド（１０μｇ／ｍｌ）を含む新たな培地を１００μｌ補充し、培養９日目に、５０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を含む培地１００μｌを添加した。培養１７日目に、新たな培地に入れ替えて培養された細胞を、１ウェルから４ウェルに取り分けた。うち２ウェルは対応するＨＩＦ−１α由来ペプチドでパルス処理したＣ１Ｒ−Ａ２４細胞用、他の２ウェルは、ＨＩＶペプチドでパルス処理したＣ１Ｒ−Ａ２４細胞（対照）用である。１８時間インキュベートした後、上清を集め、ＩＦＮ−γ産生レベルを、ＥＬＩＳＡ法で測定した。ペプチド特異的細胞傷害性Ｔ細胞の誘導は、次の二つの基準を満たすときにのみ、活性発現ありと判断した。基準（ｉ）は、対応するＨＩＦ−１αペプチドで刺激した二つのウェルとも５０ｐｇ／ｍｌ以上であることであり、基準（ｉｉ）は、対応する各ＨＩＦ−１αペプチドで刺激した二つのウェルとも、対照のＨＩＶペプチドで刺激した二つのウェルの平均値よりも１．２倍以上であるというものである。

このように末梢血単核細胞を、in vitroにて、ＨＩＦ−１α由来ペプチドの夫々で刺激し、又はＥＢＶ由来ペプチドで刺激し、末梢血単核細胞が、対応するペプチドをパルスしたＣ１Ｒ−Ａ２４細胞に反応してＩＦＮ−γを産生するかについて、検討した。これによるＨＬＡ−Ａ２４陽性腎細胞癌患者の末梢血単核細胞からのペプチド特異的細胞傷害性Ｔ細胞の誘導結果を、活性発現ありと判断したものについて、下記表２に示す。

表２に示すように、ＨＩＦ−１α_{３７−４６}とＨＩＦ−１α_{６５−７３}とＨＩＦ−１α_{９１−９９}とＨＩＦ−１α_{１１８−１２７}とＨＩＦ−１α_{２７８−２８７}の各ＨＩＦ−１α由来ペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２４陽性腎細胞癌患者１２人からの検体中、夫々２検体、１検体、２検体、２検体及び４検体で末梢血単核細胞からの対応ペプチド反応性細胞傷害性Ｔ細胞を誘導した。対照であるＥＢＶペプチドは、同患者１２人からの検体中、３検体で末梢血単核細胞からペプチド特異的細胞傷害性Ｔ細胞を誘導した。ＨＩＦ−１α_{２７８−２８７}ペプチド（配列番号５に対応）が、ＩＦＮ−γを産生する活性発現比率４／１２と多かった。この知見に基づき、このＨＩＦ−１α_{２７８−２８７}ペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２４陽性腎細胞癌患者の末梢血単核細胞からペプチド特異的細胞傷害性Ｔ細胞を最も産生する可能性が極めて高いと判断した。なお、ＨＬＡクラスＩ分子から解離予測半減期に基づき計算された結合スコアが高いものが、活性が高いというわけではないことが分かった。

（試験３：ＨＩＦ−１α発現検討のためのフローサイトメトリー(ＦＡＣＳ)分析）
細胞傷害活性試験を行うに先立ち、ＲＣＣ細胞株でのＨＩＦ−１αの発現を検討した。その細胞を、ポリエチレン（ＰＥ）担持抗ＨＩＦ−１αモノクローナル抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）で染色した。イソタイプ適合ＰＥ担持マウスＩｇＧ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を、対照として用いた。ＨＬＡ−Ａ２４分子の発現を検討するために、細胞を、抗ＨＬＡ−Ａ２４モノクローナル抗体（Ｏｎｅ Ｌａｍｂｄａ社製）に引き続きＦＩＴＣ担持ヤギ抗マウスＩｇＧ （Ｈ＋Ｌ）抗体（ＫＰＬ社製）で染色した。ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いて分析した。その結果を図１に示す。

図１は、本発明を適用するＲＣＣ（腎細胞癌）細胞株中でのＨＩＦ−１αの発現を示す。同図１Ａは、ＲＣＣ癌細胞株及びＬＮＣａＰ（ヒト前立腺癌）細胞株をＤＦＯ（デフェロキサミン）の存在又は非存在下に２４時間培養し、全細胞溶解物中でのＨＩＦ−１αの発現を免疫ブロッティングによって試験した結果を示す。β−アクチンは対照例である。同図１Ｂは、ＫＰＫ−１３、ＫＫ−ＲＣＣ６及びＬＮＣａＰ細胞株を正常酸素条件下（２０％Ｏ_２）又は低酸素条件下（１％Ｏ_２）で２４時間培養し、全細胞溶解物中及び核酸抽出物中でのＨＩＦ−１αの発現を免疫ブロッティングによって試験した結果を示す。β−アクチン及びＥ２Ｆ−１は対照例である。同図１Ｃは、フローサイトメトリーで分析したＨＬＡ−Ａ２４分子の細胞表面発現を示す。白抜き背景は抗ＨＬＡ−Ａ２４モノクローナル抗体を用いずに染色した結果を示す。

その結果、図１Ａに示すように、２０％Ｏ_２の正常酸素条件下であっても、ＳＫＲＣ−４４細胞は、強くＨＩＦ−１α陽性であり、ＫＰＫ−１３及びＫＫ−ＲＣＣ６細胞でのＨＩＦ−１α発現は低度であった。癌細胞がＤＦＯで処理されたときは、ＤＦＯが鉄キレート剤であって、ＨＩＦ−１αをタンパク質分解反応（proteolysis）に対して安定化することもあり^（２）、全てのＲＣＣ細胞株はそのＨＩＦ−１α発現を全細胞溶解物中で増加させた。このことは、ＬＮＣａｐ（ヒト前立腺癌）でも同様であった。更に、同図１Ｂに示すように、１％Ｏ_２の低酸素条件下、ＨＩＦ−１α発現はＫＰＫ−１３及びＫＫ−ＲＣＣ６の全細胞溶解物中で増加した。それらの細胞核中での発現については、ＨＩＦ−１α発現は、正常酸素条件下か低酸素条件下かに拘らず、全ての３つの細胞株中で検出された。ＨＩＦがプロテアソーム依存性で分解することを勘案すれば^（３）、またＨＬＡクラスＩ分子及び処理されたペプチドが細胞表面に提示されること^（４）を勘案すれば、これらの結果は、ＨＩＦ−１αがＲＣＣ細胞株中で確実にプロセッシングされること、及びＨＩＦ−１αから誘導されたペプチドが細胞表面上にＨＬＡ−Ａ２４分子と一緒に提示され得ることを示唆している。一方、同図１Ｃのフローサイトメトリーに示すように、ＫＰＫ−１３細胞はＨＬＡ−Ａ２４分子を発現し、ＫＫ−ＲＣＣ６細胞はこれらの分子に対して陰性であった。更に我々は、ペプチドから誘導されたＲＣＣ反応性Ｔ細胞のＨＬＡ−２４拘束性を試験する前に、確認試験として、ＬＮＣａＰ及びＬＮＣａＰ−Ａ２４（ＨＬＡ−２４を発現しているＬＮＣａＰトランスフェクタント^（１）上へのＨＬＡ−Ａ２４分子の発現を試験した。
(1) Yao A, Harada M, Matsueda S, et al. Identification of parathyroid hormone-related protein-derived peptides immunogenic in human histocompatibility leukocyte antigen-A24⁺ prostate cancer patients. Brit J Cancer, 91: 287-296, 2004.
(2) Triantafyllou A, Liakos P, Tsakalof A, Georgatsou E, Simos G, Bonanou S. Cobalt induces hypoxia-inducible factor-1alpha (HIF-1alpha) in HeLa cells by an iron-independent, but ROS-, PI-3K- and MAPK-dependent mechanism. Free Radic Res, 40: 847-56, 2006.
(3) Cockman ME, Masson N, Mole DR, et al. Hypoxia inducing factor-alpha binding and ubiquitylation by the von Hipple-Lindau tumor suppressor protein. J Biol Cehm, 275: 25733-41, 2000.
(4) Rammensee HG, Flak K, Rotzschke O. Peptides naturally presented by MHC class I molecules. Annu Rev Immunol 1993;11:213-244.

（試験４：ＨＬＡ−Ａ２４^＋ＲＣＣ細胞に対するＨＩＦ−１α_{２７８−２８７}ペプチドで刺激されたＴ細胞の細胞傷害活性試験）
次に、in vitroでＨＩＦ−１α_{２７８−２８７}ペプチド刺激によって誘導した細胞傷害性Ｔ細胞が、ＨＬＡ−Ａ２４陽性細胞（ＫＰＫ−１３）及びＨＬＡ−Ａ２４陰性細胞（ＫＫ−ＲＣＣ６）、並びに、前立腺癌由来細胞株細胞（ＬＮＣａＰ）及びＨＬＡ−Ａ２４陽性ＬＮＣａＰ細胞（ＬＮＣａＰ−Ａ２４）に対して細胞傷害活性を示すかについて、測定した。７人のＨＬＡ−Ａ２４陽性腎細胞癌患者からの末梢血単核細胞を、in vitroに於いてＨＩＦ−１α_{２７８−２８７}ペプチドで刺激し、ＣＤ８陽性Ｔ細胞の精製後、各細胞に対する細胞傷害活性について、検討した。

具体的には、標準的な５時間^５１Ｃｒリリースアッセイ（放出試験）による細胞傷害性Ｔ細胞の細胞傷害活性試験を行うために、全部又は精製されたＣＤ８陽性Ｔ細胞をエフェクター細胞として用いた。以下のようにして、ペプチド刺激末梢血単核細胞から、ＣＤ８陽性Ｔ細胞を、ネガティブ群として調製した。ペプチド刺激末梢血単核細胞を、先ず抗ＣＤ５６モノクローナル抗体（ｍＩｇＧ１：ＤＩＡＣＬＯＮＥ， Ｂｅｓａｎｃｏｖ Ｃｅｄｅｘ社製）で染色し、引き続きＤｙｎａｂｅａｄｓ抗マウスＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ抗ＣＤ１９（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、及びＤｙｎａｂｅａｄｓ抗ＣＤ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で処理した。Ｄｙｎａｂｅａｄｓ結合細胞は、磁化し、及びネガティブ分離した。ＣＤ４陽性Ｔ細胞、Ｂ細胞、及びＮＫ細胞を取り除いた後、ＣＤ８陽性Ｔ細胞の百分率は、試験中、約８０〜８５％であった（データ示さず）。ターゲット細胞は細胞傷害性試験の直前に、１％Ｏ_２下、２４時間培養した。

ターゲット細胞として、ＨＬＡ−Ａ２４分子陽性腎細胞癌細胞株であるＫＰＫ−１３細胞と、ＨＬＡ−Ａ２４分子陰性腎細胞癌細胞株であるＫＫ−ＲＣＣ６細胞とを用い、あるいは、ＨＬＡ−Ａ２４を発現しているヒト前立腺癌細胞株であるＬＮＣａＰ−Ａ２４細胞と、ＨＬＡ−Ａ２４分子陰性であるＬＮＣａＰ細胞とを用い、これらに対する前記ＣＤ８陽性Ｔ細胞（エフェクター細胞ともいう）の細胞傷害活性を以下のようにして、試験した。丸底型９６ウェルのプレートで、１ウェル当たり２０００個の^５１Ｃｒターゲット細胞を、エフェクター細胞と共に、所定のエフェクター細胞／ターゲット細胞比で、培養した。^５１Ｃｒ放出は、次式に従って算出した。
特異的溶解（％）＝（被検体での放出−自然放出）×１００／（最大放出−自然放出）
「自然放出」は、エフェクター細胞なしで^５１Ｃｒ標識したターゲット細胞をインキュベートした場合の上清から決定し、「最大放出」は、エフェクター細胞なしで、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ（和光純薬工業株式会社製）と^５１Ｃｒ標識したターゲット細胞とをインキュベートした場合の上清から決定した。

なお、細胞傷害活性試験の統計学的有意性は、両側スチューデントｔ検定を用いて判断した。Ｐ値が０．０５未満であると、統計学的に有意差ありと見做した（^＊Ｐ＜０．０５）。細胞傷害活性試験が陽性である結果のみをまとめて図２に示す。図２中、縦軸は溶解（％）を示し、横軸はエフェクター細胞と、ターゲット細胞との比（Ｅ／Ｔ：エフェクター細胞／ターゲット細胞）を示す。

図２Ａ１は、ＨＬＡ−Ａ２４陽性腎細胞癌患者のＨＩＦ−１α_{２７８−２８７}ペプチド刺激末梢血単核細胞からの精製ＣＤ８陽性Ｔ細胞について、５時間^５１Ｃｒ放出試験による前記４種の異なるターゲットに対する細胞傷害活性の試験結果である。その後、ＨＬＡ−Ａ２４陽性腎細胞癌患者の末梢血単核細胞には入手の限度があることから、追加のＨＬＡ−Ａ２４陽性腎細胞癌患者から末梢血単核細胞を入手した。同様に、ＨＬＡ−Ａ２４を発現しているヒト前立腺癌細胞株であるＬＮＣａＰ−Ａ２４細胞と、ＨＬＡ−Ａ２４分子陰性であるＬＮＣａＰ細胞についても追加の細胞を入手した。これらの試験では、in vitroで刺激した末梢血単核細胞を細胞傷害性試験の前にＣＤ８陽性細胞としてネガティブ精製した。図２Ｂ１はそのＨＬＡ−Ａ２４陽性腎細胞癌患者のＨＩＦ−１α_{２７８−２８７}ペプチド刺激末梢血単核細胞からの精製ＣＤ８陽性Ｔ細胞について、５時間^５１Ｃｒ放出試験による前記４種の異なるターゲットに対する細胞傷害活性の試験結果である。即ち、図２Ｂ１は図２Ａ１の再現性試験とも言える。

図２Ａ１から明らかな通り、ＨＬＡ−Ａ２４陽性腎細胞癌患者からのＨＩＦ−１α_{２７８−２８７}ペプチド刺激末梢血単核細胞由来のＣＤ８陽性Ｔ細胞は、ＫＫ−ＲＣＣ６細胞に対してよりも、ＫＰＫ−１３細胞に対しての方が、細胞傷害活性のレベルが高かった。同様に、ＨＬＡ−Ａ２４陽性腎細胞癌患者からのＨＩＦ−１α_{２７８−２８７}ペプチド刺激末梢血単核細胞由来のＣＤ８陽性Ｔ細胞は、ＨＬＡ−Ａ２４を発現しているヒト前立腺癌細胞株であるＬＮＣａＰ−Ａ２４細胞に対しての方が、ＨＬＡ−Ａ２４分子陰性であるＬＮＣａＰ細胞に対してよりも、細胞傷害活性のレベルが高かった。

さらに追加したＨＬＡ−Ａ２４陽性腎細胞癌患者からのＨＩＦ−１α_{２７８−２８７}ペプチド刺激末梢血単核細胞由来のＣＤ８陽性Ｔ細胞も同様に、他のターゲット細胞よりもＫＰＫ−１３細胞に対しての方が、並びに、ＬＮＣａＰ−Ａ２４細胞に対しての方が、それぞれ細胞傷害活性のレベルが高く、本試験の再現性が確認された（図２Ｂ１参照）。

これらの結果は、ＨＩＦ−１α_{２７８−２８７}ペプチドが、ＨＬＡ−Ａ２４陽性ＨＩＦ−１α_{２７８−２８７}発現ＲＣＣ細胞に対して特異的に細胞傷害性Ｔ細胞を誘導する能力があることを示している。したがって、これらＨＩＦ−１α_{２７８−２８７}由来ペプチド又はその等価体誘導体にて刺激された末梢血単核細胞は、腎細胞癌細胞に対してＨＬＡ−Ａ２４拘束性に細胞傷害活性を発揮することを示す。また、これらＨＩＦ−１α_{２７８−２８７}由来ペプチド又はその等価体誘導体が、ＨＬＡ−Ａ２４陽性腎細胞癌患者において腎細胞癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞を誘導でき特異的免疫療法、特に癌ワクチン療法に有用であることを示す。

（試験５：ＨＬＡ−Ａ２４^＋ＲＣＣ細胞に対するＨＩＦ−１α_{２７８−２８７}ペプチドで刺激されたＴ細胞のコールド阻害試験）
ペプチド刺激ＣＴＬ（細胞傷害性Ｔ細胞）のペプチド依存性細胞傷害活性をコールド阻害試験により検査した。コールド阻害試験は以下の様にして行った。

丸底９６ウェルプレートにおいて、^５１Ｃｒ標識したターゲット細胞（ＫＰＫ−１３細胞；２，０００ｃｅｌｌｓ／ウェル）と、上述したエフェクター細胞（２×１０^４ｃｅｌｌｓ／ウェル）とを、下記のいずれかの^５１Ｃｒ標識していないコールドターゲット細胞（４×１０^４ｃｅｌｌｓ／ウェル）と共に培養し、前記試験例４と同様にして、特異的溶解（％）を求めた。なお、コントロールとして、前記^５１Ｃｒ標識していないコールドターゲット細胞を用いなかった場合についても同様にして、特異的溶解（％）を求めた。結果を図Ａ２及び同Ｂ２に示す。
−^５１Ｃｒ標識していないコールドターゲット細胞−
（１） 前記ＨＩＶ由来ペプチドをパルスしたＣ１Ｒ−Ａ２４細胞
（２） 前記ＨＩＦ−１α_{２７８−２８７}ペプチドをパルスしたＣ１Ｒ−Ａ２４細胞
なお、本試験では、ＨＬＡ−Ａ２４分子陽性腎細胞癌患者から調製した末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を用いて得られたエフェクター細胞について調べた。

図Ａ２及び同Ｂ２の横軸は、「特異的溶解（％）」（％ ｌｙｓｉｓ）を示し、縦軸は、上から順に、「コントロール」（ｎｏｎｅ）、^５１Ｃｒ標識していないコールドターゲット細胞として「ＨＩＶ由来ペプチドをパルスしたＣ１Ｒ−Ａ２４細胞」を用いた場合（Ｃ１Ｒ−Ａ２４／ＨＩＶ）、^５１Ｃｒ標識していないコールドターゲット細胞として「ＨＩＦ−１α_{２７８−２８７}ペプチドをパルスしたＣ１Ｒ−Ａ２４細胞」を用いた場合（Ｃ１Ｒ−Ａ２４／ＨＩＦ−１_２７８）の結果を示す。

図Ａ２に示されるように、ＨＩＦ−１α_{２７８−２８７}ペプチドにて刺激したＨＬＡ−Ａ２４分子陽性患者由来のＰＢＭＣのＫＰＫ１３細胞に対する細胞障害活性は、ＨＩＦ−１α_{２７８−２８７}ペプチドをパルスした非標識のＣ１Ｒ−Ａ２４細胞の添加によって有意に抑制されたが、ＨＩＶ由来ペプチドをパルスした非標識のＣ１Ｒ−Ａ２４細胞によっては抑制されなかった。同様に、追加したＨＬＡ−Ａ２４分子陽性患者由来のＰＢＭＣのＫＰＫ１３細胞に対する細胞障害活性についても同一の結果を再現した（同図Ｂ２）。このコールド阻害試験の結果は、ペプチド刺激ＰＢＭＣのＨＬＡ−Ａ２４分子陽性腎細胞癌細胞株に対する細胞障害活性が、ペプチド特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞による可能性が高いことを示す。

以上の結果は、本発明のＨＩＦ−１α由来ペプチドがＨＬＡ−Ａ２４分子陽性腎細胞癌において腎細胞癌反応性細胞障害性Ｔ細胞を誘導でき、特異的免疫療法、特に癌ワクチン療法に有用であることを示す。本発明のＨＩＦ−１α由来ペプチドにより、ペプチドワクチン療法の選択肢を増やすことが可能となると考えられる。

本発明のＨＩＦ−１αペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２４陽性腎細胞癌患者に対するペプチド由来抗癌ワクチンのような医薬製剤の有効成分として有用である。これらＨＩＦ−１αペプチドは、腎細胞癌患者のペプチド由来抗癌ワクチンのような治療乃至予防の一助になり得る。ＨＩＦ−１αの発現が、様々なタイプの上皮癌に広く認められるので、これらＨＩＦ−１αペプチドが、腎細胞癌に対してのみならず、他のタイプの悪性腫瘍に対しても、治療乃至予防に適用できる。

本発明のＨＩＦ−１α由来ペプチドやその等価体誘導体、それをコードする核酸分子及びそれのベクター、腎細胞癌の予防又は治療に用いられる医薬製剤、並びに前記ペプチドとＨＬＡ−Ａ２４との複合体を細胞表面に提示した抗原提示細胞又は腎性細胞癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞が含有された生物製剤は、腎細胞癌の予防又は治療に好適で、特にＨＬＡ−Ａ２４陽性腎細胞癌患者において腎細胞癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞を誘導でき特異的免疫療法、特に癌ワクチン療法に有用であることを示す。

本発明により、ＨＬＡ−Ａ２４陽性腎細胞癌患者に対するペプチド基盤免疫療法、特に癌ワクチン療法の選択肢が広がった。本発明により、現在までいくつかの癌ワクチン候補ペプチドが同定されているＨＬＡ−Ａ２４陽性腎細胞癌患者の治療において癌増殖に関与するとされるＨＩＦ−１αをターゲットに加えることによりさらなる治療効果の向上に寄与することが期待される。

Claims (7)

1. ヒト白血球抗原−Ａ２４分子に結合して、腎細胞癌の細胞性免疫に認識される配列番号５のアミノ酸配列からなるペプチドを含有し、前記ペプチドがＨＩＦ−１α由来ペプチドであることを特徴とする、ヒト白血球抗原−Ａ２４陽性腎細胞癌の治療用又は予防用医薬製剤。
2. 前記製剤が、腎細胞癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞への誘導剤であることを特徴とする請求項１に記載の医薬製剤。
3. 前記製剤が、ＣＤ８陽性Ｔ細胞への誘導剤であることを特徴とする請求項１に記載の医薬製剤。
4. 前記製剤が、ヒト白血球抗原−Ａ２４陽性腎細胞癌用ワクチンである、請求項１〜３のいずれか1つに記載の医薬製剤。
5. （原請求項９）
   配列番号５のアミノ酸配列で示されるペプチドを、ヒト白血球抗原−Ａ２４陽性の腎細胞癌の患者から採取された抗原提示能を有する細胞に、導入して誘導し、前記ペプチドとヒト白血球抗原−Ａ２４との複合体を細胞表面に提示したものであることを特徴とする抗原提示細胞。
6. （原請求項１０）
   配列番号５のアミノ酸配列で示されるペプチドを、ヒト白血球抗原−Ａ２４陽性の腎細胞癌の患者から採取された末梢血単核細胞に、接触させて誘導したものであることを特徴とする腎細胞癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞。
7. （原請求項１１）
   配列番号５のアミノ酸配列で示されるペプチドを、ヒト白血球抗原−Ａ２４陽性の腎細胞癌の患者から採取された末梢血単核細胞に、導入させて誘導し、前記ペプチドとヒト白血球抗原−Ａ２４との複合体を細胞表面に提示した抗原提示細胞からなる誘導細胞と、
   前記ペプチドを、前記採取細胞に、接触させて誘導した腎細胞癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞からなる誘導細胞とから選ばれる少なくとも何れかの誘導細胞が、含有されていることを特徴とする生物製剤。
   

Images